CZ20031872A3 - Ječmen s nízkou aktivitou lipoxygenázy-1 - Google Patents

Ječmen s nízkou aktivitou lipoxygenázy-1 Download PDF

Info

Publication number
CZ20031872A3
CZ20031872A3 CZ20031872A CZ20031872A CZ20031872A3 CZ 20031872 A3 CZ20031872 A3 CZ 20031872A3 CZ 20031872 A CZ20031872 A CZ 20031872A CZ 20031872 A CZ20031872 A CZ 20031872A CZ 20031872 A3 CZ20031872 A3 CZ 20031872A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
lox
barley
amino acid
gene
Prior art date
Application number
CZ20031872A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298689B6 (cs
Inventor
Anneke Christiana Douma
Albert Doderer
Varena Cameron-Mills
Birgitte Skadhauge
Lene Molskov Bech
Nathalie Schmitt
Jolanda Carolina Heistek
Mechelen Johannes Reinier Van
Original Assignee
Carlsberg Research Laboratory
Heineken Technical Services Bv
Brasseries Kronenbourg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/751,687 external-priority patent/US6660915B2/en
Priority claimed from PCT/IB2000/002045 external-priority patent/WO2002053720A1/en
Application filed by Carlsberg Research Laboratory, Heineken Technical Services Bv, Brasseries Kronenbourg filed Critical Carlsberg Research Laboratory
Publication of CZ20031872A3 publication Critical patent/CZ20031872A3/cs
Publication of CZ298689B6 publication Critical patent/CZ298689B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C2200/00—Special features
    • C12C2200/01—Use of specific genetic variants of barley or other sources of fermentable carbohydrates for beer brewing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)

Description

Tento vynález spočívá v oblasti biotechnologie rostlin. Podrobněji se tento vynález týká mutantního genu lipoxygenázy-1 ječmene (lox-1), který kóduje enzym se silně sníženou aktivitou tvorby 9-hydroperoxyoktadekanové kyseliny. Tento vynález se také týká použití kultivarů ječmene, homozygotních pokud jde o lox-1, při způsobech vaření pro snížení tvorby nestandardních vůní v produktech vaření, jako je pivo, během skladování.
Dosavadní stav techniky
Lipoxygenázy jsou rodinou enzymů (EC 1.13.11.12), které katalyzují dioxidaci volných esterifikovaných polynenasycených mastných kyselin vykazujících 1(Z),4(Z)-pentadienovou konfiguraci. Produkty lipoxygenázou katalyzovaných reakcí byly dlouho podezřívány, žp jsou hlavním viníkem pro výskyt vůně zatuchliny v rostlinných zrnech/semenech a v potravinářských výrobcích odvozených ze zrn/semen (Robinson a kol., Food Chem., 54, 33 až 43 (1995). Lipoxygenázy jsou zapojeny do tvorby těkavých hexanalových aldehydů tvořících se během zpracování sojových bobů, které mají nežádoucí vůni a tak omezují použití proteinů ze sojových bobů v potravinářských výrobcích. Věří se, že tři isozymy lipoxygenázy exprímované v sojových bobech přispívají k oxidaci lipidů a • ·· · tvorbě hexanalu. Mutanty sóji postrádající jeden nebo více z těchto isozymů byly vytvořeny s cílem snížit tvorbu hexanalu a zlepšení stability aroma sojových bobů. Úspěch tohoto přístupu ocenil Hildebrand a kol., J. Agric. Food Chem., 38, 1934 až 1936 (1990). Mutanty postrádající lipoxygenázu-3 sóji produkovaly vyšší hladiny hexanalu, což naznačuje, že tento isozym převádí 13-hydroxyperoxyoktadekanoidy, vytvářené oxidací lipidů na netěkavé produkty. Oblast funkční charakteristiky třínulových linií sóji, postrádajících v semeni všechny tři lipoxygenázy, ukazuje, že tyto enzymy
nejsou podstatné pro agronomické a normální charakteristické
vlastnosti semen (Narvel a kol., Corp Sci., 38, 926 až 928
(1998) .
Lipoxygenázy ma j i také být zapojeny při tvorbě
nestandardních vůní rýže , které se mohou vyskytovat během
skladování zrna. V skladovaném zrní může být zjištěno uvolňování volných mastných kyselin, které je průkazem látkové přeměny zásob trigliceridů. Bylo zjištěno, že odrůda rýže Daw Dam hromadí nižší hladiny pentanalů a hexanalů, což poskytuje lepší stabilitu chuti a aroma při skladování (Susuki a kol., J. Agric. Food Chem., 47, 1119 až 1124 (1999)) . Tento žádoucí fenotyp byl připisován absenci lipoxygenázy-3 rýže, která oxiduje nenasycené acylové řetězce lipidu za tvorby 9-hydroxyperoxyoktadekanových polohových isomerů.
Uznává se, že způsob činnosti lipoxygenázy je komplexem s mnoha variacemi a jeho úloha v četných aspektech růstu rostliny a fyziologii není plně pochopena. Modifikace způsobu působení lipoxygenázy, které mění účinnost 9-hydroperoxidace ve sklizených semenech, jsou navrhovány pro regulaci jejich náchylnosti ke mykotoxinové kontaminaci, kterou způsobuje Aspergillus spp. (WO 97/26 364), a které jsou v souladu se • · • · • · · · • « · · * · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
99 999999 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 9 99 99 9 9 zapojením tohoto způsobu do patogenní resistence rostliny, ale nevztahují se k cílům tohoto vynálezu zde popsaným.
Mezi mnoha těkavými složkami aroma, které přispívají k vůni piva, vyšší nenasycené aldehyhdy s řetězci o 6 až 12 atomech uhlíku vykazují zvláště nízké organoleptické prahy vůně (Meilgaard, MBAA Tech. Quart. , 12, 151 až 168 (1975)). Trans-2-nonenal, který je členem této skupiny, vykazuje jak extrémně nízký práh vůně o hodnotě 0,11 dílů na miliardu (0,11 ppb), tak vnáší do piva nepříjemnou jakoby slámovou, „lepenkovou vůni. Tato nestandardní charakteristická vůně způsobovaná trans-2-nonenalem je běžnou charakteristickou
vlastností piv skladovaných po 1 až 3 měsíce nebo déle a je
zvláště škodlivá pro vůni ležáku, který je vařen s lehkými
slady a má jemnou vůni.
0 sulfitu je dlouho známo, že zlepšuj e stabilitu vůně
piv$, nejen vázáním kyslíku a působením jako antioxidant, ale také pomocí tvorby těkavých adičních sloučenin bisulfitu s aldehydy a ketony přítomnými v pivu. Dvěmi hlavními zdroji sulfitu v pivu jsou sulfit produkovaný kvasnicemi během fermentace prostřednictvím způsobu asimilace síry a sulfit přidávaný k pivu před jeho plněním do obalů. Podmínky fermentace, které zvyšují produkci a vylučování sulfitu kvasnicemi umožňují tvorbu produktů adice sulfit-karbonyl z karbonylů přítomných v mladině a zabraňují jejich další látkové přeměně kvasnicemi (Dufour, Proč. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisabon, 209 až 216 (1991)). Tímto způsobem mohou být do piva převedeny karbonyly, jako je acetaldehyd a biacetyl. Schopnost sulfitu zabránit výskytu karbonylové sloučeniny trans-2-nonenalu během stárnutí piva byla demonstrována pomocí vaření piva s kmenem kvasnic blokovaným při způsobu asimilace síry (Johannesen a kol., Proč. Eur. Brew. Conv. Congr., Nice,
655 až 662 (1999) ) . Po plnění do lahví bylo pivo vystaveno nucenému stárnutí skladováním při 37 °C po 7 dní, po kteréžto době byly zjištěny hladiny trans-2-nonenalu hodně nad mezní hodnotou zjistitelnosti chutí. Jestliže k pivu s nízkým obsahem sulfitu bylo přidáno 10 dílů na milion sulfitu bezprostředně před plněním do lahví, výskyt trans-2-nonenalu během nuceného stárnutí byl výrazně snížen. Reakce mezi sulfitem a karbonylovými sloučeninami je vratná a je termodynamicky a kineticky řízena. Zdánlivé rovnovážné konstanty pro bisulfitové sloučeniny se pohybují od 10_6M pro karbonylové sloučeniny, jako jsou acetaldehyd, hexanal a dekanal, do 10_3M pro biacetyl a pyruvát (Dufour, 1991, viz výše) . Během skladování piva, výměna plynu přes obal umožní kyslíku proniknout do piva a tak se sulfit ztratí, takže slabší bisulfitové produkty adice budou disociovat, což umožňuje, aby se v pivu objevily volné karbonyly. Zatímco sulfit neoddiskutovatelně zvyšuje chuťovou a aromatickou stabilitu piva, zvláště krátkodobě, jeho nahromadění v baleném pivu silně závisí na výměně plynu přes obal a teplotě. V hotovém pivu jsou hladiny sulfitu vytvořené během fermentace proměnné a přídavek sulfitu před stáčením do lahví není všeobecně přijatou praxí. Z těchto důvodu sulfit samotný neposkytuje spolehlivý způsob zvýšení dlouhodobé stability chuti a aroma piva za různých podmínek skladování piva používaných po celé zeměkouli.
Obecně je přijímáno, že trans-2-nonenal nalezený v pivě, pochází z oxidace polynenasycených mastných kyselin odvozených z lipidů zrna ječmene, kde 18-uhlíkový řetězec mastné kyseliny, linolové kyseliny [klasifikované jako 18,2n-6-polynenasycená mastná kyselina (Broun, Gettner a Sommerville, Annu. Rev. Nutr., 19, 197 až 216 (1999)] je nejhojnější. Avšak v literatuře je malá shoda pokud jde o mechanismus jímž je trans-2-nonenal vytvářen. Byla navržena podoba enzymatických způsobů vedoucích k tvorbě trans-2-nonenalu z polynenasycených mastných kyselin, ale jednotlivé enzymatické kroky v zrně ječmene nebyly nikdy demonstrovány experimentálně nebo během procesu výroby sladu (Gardner, Adv. Cereal Sci. Technol,, 9_, 161 až 215 (1988)). Koncepce používání antimediátorové nebo ko-supresorové genové technologie pro snížení hladin lipoxygenázy-1 v zrně ječmene, a tudíž regulaci 9-hydroperoxidace a snížení hladin aldehydů a alkoholů v modifikovaném zrně ječmene, byla navržena jako prostředek pro regulaci tvorby nestandardních chutí a vůní, ale o výsledcích takového přístupu není podána zpráva (McElroy a Jacobsen, Bio/Technology, 13, 245 až 249 (1995)).
Zkouška nuceným stárnutím byla vyvinuta jako způsob pro hodnocení trans-2-nonenalového potenciálu piva, kde tvorba trans-2-nonenalu v mladině nebo pivu je vyvolána vystavením vzorků zvýšeným teplotám při sníženém pH (100 °C, při pH 4,0 po 2 hodiny). Pokusy korelovat trans-2-nonenalový potenciál v mladině a hotovém pivu s celkovou úrovní aktivity lipoxygenázy ve vysušeném sladu naznačují, že lipoxygenáza může přispívat k výskytu trans-2-nonenalu v uleželém pivu (Drost a kol., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124 až 131 (1990)). Závěry, které mohou být dedukovány z této studie, však jsou silně omezeny skutečností, že aktivita lipoxygenázy v ječmenném sladu je regulována v závěru procesu výroby sladu stupněm inaktivace enzymu během sušení na humně. Tudíž byl zkoumán pouze účinek aktivity zbytkové sladové lipoxygenázy na trans-2-nonenalový potenciál v odvozené mladině a hotovém stanovení lipoxygenáz, které enzymatickém způsobu působení lipoxygenázy v zrně ječmene během vývoje a výroby sladu, a jejich úlohy jako determinantu hladin trans-2-nonenalu pivu. Studie neuspěla při katalýzují první krok při • · · ·
nalezených v pivě. Skutečně nepřítomnost kultivarů ječmene vykazujících deficitní obsah jednoho nebo více isožymů lipoxygenáz činí nemožným poskytnout přesvědčivý důkaz pokud jde o úlohu způsobu působení lipoxygenázy v ječmenném sladu při regulaci tvorby trans-2-nonenalu. Takové pokusy jsou potřebné pro zhodnocení příspěvku enzymatických způsobů, ve srovnání s autooxidačními/chemickými způsoby, k tvorbě trans-2-nonenalu v pivě. Proces vaření zahrnuje krok vaření mladiny za vysoké teploty, kde se předpokládá, že tyto neenzymatické reakce nastávají (Noél a kol., Agric. Food Chem., 47, 4323 až
4326 (1999)).
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje kultivar ječmene vykazující značně sníženou aktivitu lipoxygenázy-1. V jednom ztělesnění, rostliny ječmene podle tohoto vynálezu obsahují mutantní gen lox-1 exprimující značně snížené hladiny isozymu lipoxygenázy-1. V alternativním ztělesnění, rostliny ječmene obsahují heterologní sekvenci nukleové kyseliny exprimující antimediátorovou sekvenci do lox-1 standardního typu, a tudíž snižující aktivitu enzymu.
Jak je zde naznačeno, slad a mladina vyrobená z ječmene podle tohoto vynálezu se sníženou hladinou aktivity lipoxygenázy, například z kultivarů ječmene homozygotních pokud jde o mutantní gen lox-1, jsou užitečné pro výrobu piva s výrazně zesílenou stabilitou chuti a vůně a sníženými hladinami trans-2-nonenalu, zvláště za podmínek o kterých je známo, že podporují výskyt T2N. Tento vynálezu demonstruje vzájemný vztah mezi aktivitou lipoxygenázy-1 z ječmeného sladu pro produkci 9-hydroxyperoxyoktadekadienových kyselin (9Ί ·· ·· Φ Φ ·· ···· • Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦ • Φ · Φ Φ φ φ φ · φ Φ φ
Φ φ Φ Φ · ΦΦΦΦ
ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ
-HOPD), a přítomností trans-2-nonenalu v pivě. Tento vynález dále demonstruje, že použití ječmene homozygotního pokud jde o mutantní gen lox-1 při procesech vaření zlepšuje stabilitu chuti a aroma piva, jak během skladování, tak při vystavení zvýšeným skladovacím teplotám. Tyto vlastnosti zvyšují kvalitu piva a jsou užitečné pro zvětšení jeho skladovací životnosti a snižují potřebu chladit pivo během dopravy a skladování.
Tento vynález poskytuje rostliny ječmene a jejich části, které vykazují sníženou aktivitu lipoxygenázy-1, včetně rostlin ječmene exprimujících, jak je zde popsáno, mutantní protein LOX-1, stejně jako způsoby přípravy takových rostlin ječmene, částí rostlin, produktů z rostlin a zvláště sladu a pivních produktů vyrobených z rostlin ječmene podle tohoto vynálezu.
Popis obrazů na výkrese
Obr. 1 je graf zobrazující účinek inhibitorové nordihydroguajaretové kyseliny (NDGA) na imunoafinitu čištěné lipoxyggnázy 1 a 2 ze zárodků ze 3 dny klíčeného ječmenného zrna.
Obr. 2 je graf zobrazující hmotnost v čerstvém stavu vyvíjejícího se zrna linie G a kultivaru Vintage od 5 dní po květu do plné zralosti (FM). Každé stanovení je průměrná váha jednoho zrna ze 6-ti klasů.
Obr. 3 je graf zobrazující suchou hmotnost vyvíjejícího se zrna linie G a kultivaru Vintage od 5 dní po květu do plné zralosti (FM) . Každé stanovení je průměrná váha jednoho zrna ze 3 vzorků po 5 zrnech.
• · · · · · · · ·
9 99 9999*9 9 · ·9 · · 9 ·
999 9999 99 99 99 99
Obr. 4 je graf zobrazující celkovou aktivitu lipoxygenázy ve vyvíjejícím se zrnu linie G a kultivaru Vintage od 5 dní po květu do plné zralosti (FM).
Obr. 5 je graf zobrazující 9- a 13-HOPD produkty oxidace linolové kyseliny působením lipoxygenázy ve vyvíjejícím se zrnu linie G.
Obr. 6 je graf zobrazující celkovou aktivitu lipoxygenázy v zárodcích z klíčícího ?rria linie G a kultivaru Vintage vyjádřenou jako pmol/min/10 zárodků (jednotka/10 zárodků).
Obr. 7 je graf ukazující 9-HOPD a 13-HOPD produkty oxidace linolové kyseliny působením lipoxygenázy v zárodcích z klíčícího zrna linie G a kultivaru Vintage, zobrazující hladiny 9-HOPD a 13-HOPD.
Obr. 8 je Western blot zobrazení imunodetekce lipoxygenázy-1 v zárodcích vyvíjejícího se zrna linie G a kultivaru Vintage [standardní typ (wt)] od 5 dnů po květu do plné zralosti (FM).
Obr. 9 je Western blot zobrazení imunodetekce lipoxygenázy-1 v zárodcích ze zrna linie G a kultivaru Vintage [standardní typ] klíčených po dobu od 0 do 6 dní.
Obr. 10 je Northern blot zkoušený s 3'nepřepisovanou oblastí cDNA lox-1 a zobrazující přepisy lipoxygenázy-1 zjištěné ve vyvíjejícím zrnu linie G a kultivaru Vintage [standardní typ] od 5 dní po květu do plné zralosti (FM).
Obr. 11 je Northern blot zkoušený s 3'nepřepisovanou oblastí cDNA lox-1 a zobrazující přepisy lipoxygenázy-1
• φ φ · · ·· · • · · ΦΦΦ··· · φ φ · · φφφφ zjištěné v zárodcích ze zrna linie G a kultivaru Vintage [standardní typ] klíčených po dobu od 0 do 6 dní.
Obr. 12A až 12G jsou seřazením nukleotidové sekvence promotorové a přepisované oblasti lox-1 alely standardního typu kultivaru Vintage (WT) a alely linie G (LG) . Výchozí místo přepisu (+1), výchozí kodon ATG ( + 69) a koncový kodon přepisu (+4231) jsou v genových sekvencích podtrženy. Nukleotidové mutace identifikované v alele linie G jsou zobrazeny v polotučných kurzívách a označeny hvězdičkou.
Obr. 13 je schematickou prezentací genu lox-1 kultivaru Vintage (standardní typ) a mutantního genu lox-1 linie G. Přepis od +1 do +4375 je složen ze 7 exonů (tečkované rámečky) a 6 intronů (bílé rámečky) . Obě mutace v genu lox-1 jsou označeny.
Obr. 14 je schematickým nákresem kazet genu pro dočasnou expresi cDNA lox-1 standardního typu a genu lox-1 a mutantního genu lox-1 z linie G. Lipoxygenázu kódující sekvence jsou klonovány mezi konstitutivním kukuřičným ubichitinovým promotorem s intronem 1 (Ubi-l)a nos terminátorem.
Obr. 15 je histogram zobrazující aktivitu lipoxygenázy-1 v aleuronových protoplastech ječmene transfekovaných genovými kazetami obsahujícími standardní typ cDNA lox-1, mutantní gen lox-1 z linie G, gen lox-1 standardního typu (WT lox-1) a reporterový gen GUS kontrolního. Aktivita lipoxygenázy v extraktech z transfekovaných protoplastů je zkoušena na mikrotitračních plotnách pomocí oxidace jodidu draselného (KI) a kvantifikována spektrofotometricky. Aktivita lipoxygenázy-1 je vyjadřována jako jednotky na pg proteinu • ·· ·* ·* • · · · ···· · · · • · · · · · · · 4 • 4 · · 444444 · >
1A ·· ······· iu ··· ··♦· ·· ·· ·· ·· v extraktu a je zobrazena jako průměr ze 3 měření ze dvou duplicitních zkoušek.
Obr. 16 je seřazením sekvence demonstrujícím, že polymorfie délky restriktů (RFLP) mezi standardním typem a mutantním genem lox-1 odpovídá bodu mutace v nukleotidu 2347> vytvářejícím dodatečné restrikční místo AatlI.
Obr. 17 je schematickou prezentací PCR fragmentů lox-1 amplifikovaných a odštěpených při reakci řetězce polymerázy zkouška rozštěpením amplifikovaného polymorfního místa (PCR-CAPS). Pozice PCR primerů jsou označeny šipkami a AatlI místa jsou uvedena nad genem (polohou sekvence). Exonové a intronové oblasti v PCR produktu jsou rozlišeny pomocí tečkovaných a bílých rámečků, a jsou uvedeny velikosti fragmentů z digerace AatlI.
Obr. 18 je zobrazení pomocí elektroforetického agarózového gelu PCR fragmentů lox-1 (652 párů bází), amplifikovaných při prvním kroku zkoušky PCR-CAPS, z genomické DNA linie G a kultivaru Vintage.
Obr. 19 je zobrazení pomocí elektroforetického agarózového gelu polymorfie délky restriktů (RFLP) zjištěné pomocí PCR-CAPS ve standardním typu a mutantním genu lox-1. Fragmenty z digerce AatlI z mutantního genu zahrnují zvláštní restrikční fragment o 313 párech bází, označený hvězdičkou.
Obr. 20 je tabulka zobrazující program zpětného křížení pro jednoduchou dvojici recesivního genu 11 (nízká aktivita lipoxygenázy jako vlastnost) linie G s kultivarem Alexis. Genotyp LL jsou rostliny exprimující standardní typ aktivity lipoxygenázy (dominantní alela), genotyp 11 jsou rostliny ·· ···· • 4 · 4
444 444· ·· •444 4 · 4 4 44 4 4 4 · 4 4 4 444
4 44 444444 4 4 . . 44 4444444
444 4444 44 44 44 44 exprimující nízkou aktivitu lipoxygenázy (recesivní alela). LI jsou heterozygotní rostliny obsahující jak standardní, tak alelu s nízkou aktivitou lipoxygenázy. Jelikož vlastnost nízké aktivity lipoxygenázy je recesivní vlastností, LI rostliny vykazují standardní typ aktivity lipoxygenázy. Po každém kole zpětného křížení (včetně samoopylení) , je očekáváno, že potomstvo 11 bude představovat 25 % potomstva. Pozorované četnosti nízké aktivity lipoxygenázy jsou měřeny. Vypočítaný procentický obsah genetického základu z kultivaru Alexis, který obsahuje homozygotní alelu s nízkou aktivitou lipoxygenázy je udáván jako % Alexis.
Obr. 21 je zobrazení detekcé pomocí elektroforetického agarosového gelu mutantního genu lox-1 v 11 potomstvou z programu zpětného křížení linie G - Alexis. Zkouška PCR-CAPS na genomickou DNA z linie G (čára 2), kultivaru Vintage (čára 3), potomstva 11 z 3. (čára 4) a 4. zpětného křížení (čáry 5 až 9) . Žebřík čar DNA (DNA ladder) (čára 1) . Kontrolní zpětně křížená linie s vysokým obsahem lox (čára 10).
Obr. 22A až 22B jsou komparativním seřazením sekvencí aminokyseliny sojových lipoxygenáz LOX-1 (Gml), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) a lipoxygenáz ječmene LOX-1 (Hvl) a LOX-2 (Hv2).
Dále následuje podrobný popis vynálezu.
V souladu s předmětným vynálezem, jsou poskytovány rostlinné materiály, rostlinné produkty a způsoby pro výrobu nápojů, jako je pivo, nápojů, které mají snížený obsah sloučeniny s nestandardní vůní trans-2-nonenalu, takže stabilita vůně piva, např. piva během skladování a při vystavení zvýšeným teplotám je zlepšena, ve vztahu ke kontrolnímu nápoji. Podrobněji, tento vynález poskytuje druhy klíčící zrno produkuje enzymu lipoxygenáza-1, když jsou používány při ječmene, jejichž vyvíjející se a značně snížené hladiny aktivity označovaného LOX-1, které, například procesu vaření piva, mají za výsledek pivo, která má snížené hladiny trans-2-nonenalu, ve srovnání s kontrolní odrůdou j ečmene.
Způsoby použité pro vytvoření, popis a schválení odrůdy ječmene, která má značně sníženou aktivitu LOX-1, a použití tohoto typu ječmene pro výrobu piva se stabilní vůní jsou popsány níže.
Dále následují definice.
Jak jsou používány zde následující termíny mají uvedené definice:
„Část rostliny znamená rostlinu nebo specifickou část rostliny, jako je stonek, listy, kořeny, květy, semena, zrna, plody nebo pupeny.
„LOX-1 znamená protein lipoxygenázy-1; „lox-1 znamená
gen kódující LOX-1.
Výraz „lox-1 mutantního ječmene znamená gen
mutagenizovaného ječmene kódující mutantní polypeptid lipoxygenázy-1.
„Nemutovaná(ý) kontrolní znamená rostlinu, nukleovou kyselinu, gen, polypeptid, část rostliny nebo rostlinný produkt obsahující standardní typ genu nebo proteinu.
• 4 ·· ♦» ·· ·«·· * · · · · · « · • · · · · · · · • · · 4 ··· «44 4 • · ♦ ····· ·«· ·« ·4 ·· ·· „Heterologní znamená nenativní sekvenci, např. sekvenci odvozenou z jiných druhů nebo vytvořenou rekombinantně nebo syntetickou sekvenci, která se liší od nativní sekvence.
„Rostlinný produkt znamená produkt, který je výsledkem zpracování rostliny nebo části rostliny a zahrnuje, například slad a mladinu.
„Kyselá aminokyselina znamená aspartovou nebo glutamovou kyselinu.
„Bazická aminokyselina znamená histidin, lysin nebo arginin.
„Polární aminokyselina znamená threonin, serin, tyrosin, tryptofan, asparagin nebo glutamin.
„Organoleptické vlastnosti znamená vlastnosti apelující na smysly čichu a chuti, které jsou analyzovány, například zkušenou skupinou degustátorů.
„Produkt získaný vařením znamená produkt připravený pomocí vystírání, vaření a kvašení např. pivo.
„Snížená hladina trans-2-nonenalu znamená méně než asi 50 % ve srovnání se stavy standardního typu (kontrolními).
2. Aktivita lipoxygenázy
Lipoxygenázové enzymy katalýzují oxidaci polynenasycených mastných kyselin. V ječmeni jsou známé isozymy LOX-1 a LOX-2.
LOX-1 v prvé řadě katalyzuje 9-hydroperoxidaci, zatímco LOX-2 v prvé řadě katalyzuje 13-hydroperoxidaci polynenasycených ·» »*·· • ·* ·· ·· *· » · ··«>· * · · • ·····»·» * · · · ··*·«♦ · · • · · · ♦ 4 · e « ·«« ···· ·· «· ·« ·« oktadekanových mastných, kyselin. Údaje uvedené v příkladech níže demonstrují vztah mezi 9-hydroperoxidačním působením LOX-1 ječmene a přítomností trans-2-nonenalu v pivě. Podle toho, ječmen vykazující sníženou aktivitu LOX-1 je užitečný pro výrobu piva, které má sníženou hladinu trans-2-nonenalu a/nebo potenciál ve srovnání s kontrolním.
Tvorba ječmene s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Řada známých genetických přístupů může k vytvoření rostlin podle tohoto vynálezu, k snížení úrovně aktivity enzymu lipoxygenáza-1 být použita což znamená exprimovaného v rostlině ječmene při stabilním, dědičném způsobu. Tyto přístupy zahrnují, ale nejsou omezeny na, antimediátorovou technologii a mutagenezi, jako je chemicky a ozářením způsobená mutageneze, stejně jako místně cílená mutageneze.
Transformace ječmene.
Ječmen může být přeměněn pomocí různých molekul nukleových kyselin zkonstruovaných pro ovlivňování exprese genu lox-1 nebo změnu architektury genu lox-1. Různé způsoby, například přenos zprostředkovaný bakterií Agrobacterium tumofaciens (Tingay a kol., Plant J., 11, 1369 až 1376 (1997)), bombardování částicemi (Wan a Lemaux, Plant Physiol., 104, 37 až 48(1994)), nebo polyethylenglykolem (PEG) - zprostředkované zvětšení DNA (Funatsuki a Kihara, Theor. Appl. Genet., 91, 707 až 712 (1995)) mohou být použity pro úspěšné zavedení nukleových kyselin do buněk ječmene, například do protoplastu, kalusu nebo zárodku.
K řízení exprese genu, který je předmětem zájmu mohou být použity různé promotory. Pro expresi vektorů obsahujících lox— ♦· ···· * · « • · * * « • · < ♦ · e · · η «··
« ♦ · • 9 • 99 99
-1, včetně antimediátorových sekvencí, může být použita nativní promotorově oblast lox-1. Tato promotorově sekvence lox-1 je obsažena v nukleotidech 2602 až 3511, které obsahují 5'UTR z příspěvku EMBL č. U83904. Alternativně mohou být použity promotory, které konstitutivně řídí expresi genu, který je předmětem zájmu, například kukuřičného ubichitinového promotoru Ubi. 1 (Wan a Lemaux, viz výše; Kjaerulff a kol., ve vydání od P. Mathias, Photosynthesis: from Light to Biosphere, sv. II, 151 až 154 (1995)). Vektory exprese mohou také obsahovat oblast terminace transkripce, například 3'terminátor genu nopalinové syntázy (3'-nos)(Bevan a kol., Nucl. Acids Res. , 11, 369 až 385 (1983)) byl fúzován ke genům exprimovaným v transgenickém ječmeni (Wan a Lemaux, viz výšé; Funatsuki a Kihara, viz výše).
Vektory exprese mohou také obsahovat gen, který umožňuje selekci transformovaných buněk tam, kde byl vektor úspěšně integrován do buňky. Tyto geny mohou kódovat geny resistence vůči antibiotikům a herbicidům, například gen neomycinové fosfotransferázy (npt) nebo gen fosfinothricin-acetylové transferázy (tyčkový). Když jsou exprimovány, takové geny resistence umožňují růst transformované buňky v jednom z prostředí obsahujícím buď neomycin nebo bialafos (viz například Wan a Lemaux, viz výše; Funatsuki a Kihara, viz výše; Kjaerulff a kol., ve vydání od P. Mathis, viz výše).
Po transformaci, mohou buňky být pěstovány v selektivním prostředí a potom mohou být kultivovány pro umožnění tvorby výhonků, následovaných kořenovým systémem a potom sazenicemi. Úspěšný postup transformace ječmene vyvinuli Funatsuki a Kihara (viz výše), kde transformace protoplastů ječmene pomocí PEG s neomycinovou fosfotransferázou obsahující vektory exprese a následující selekcí v neomycinu získaných plodících
* · · · · · rostlin obsahujících transgen. Ukázalo se, že transgen je integrován do genomu a většina transgenických rostlin exprimovala protein kódovaný transgenem. Tyto transgenické rostliny byly také schopné přenášet a exprimovat transgen pocházející z křížení.
Rozumí se, že řada způsobů transformace, vektorů exprese, promotorů, sledovatelných značkovačů a podobných jsou známé a užitečné pro transformaci ječmene.
Mutageneze ječmene
Gen lox-1 může být zaměřen na místně specifickou mutagenezí za použití oligonukleotidů chimérické RNA/DNA. Ukázalo se, že tyto oligonukleotidy chimérické RNA/DNA úspěšně zavádějí mutace do buněk rostliny (Zhu a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 96, 8786 až 8773 (1999) a Beetham a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 96, 8774 až 8778 (1999)) a buněk savců (Yoon a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 93, 2071 až 2076 (1999)) v požadovaných polohách. Tyto oligonukleotidy chimérické RNA/DNA mohou být převedeny do protoplastů nebo buněk ječmene, které jsou předmětem zájmu, řadou způsobů, například za použití způsobů transformace zprostředkovaných PEG nebo bombardováním částicemi popsanými výše. Jednotlivé protoplasty nebo buňky mohou potom být znovu přenášeny pomocí tkáňové kultury do všech plodících rostlinách a jev mutace může být potvrzen a sledován, například za použití přístupu založeného na PCR, jak je podrobně vysvětleno v níže uvedených příkladech.
Tento způsob místně cílené mutageneze může být uplatněn pro mutování specifických zbytků v genu lox-1. Gen lox-1 může být mutován v jedné nebo více pozicích nukleotidu ·· ·· 4 4 · · · • 4 4 4 4 4 9 4 · 44 449444 4
44 4494
9444444 49 94 44 v promotorové oblasti pro snížení nebo zrušení transkripce lox-1. Specifická mutageneze může také být uplatněna pro vnesení změn do kódující oblasti lox-1, což například snižuje aktivitu enzymu. Takové mutace zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, inserce, delece a substituce, které mají za výsledek posun, zkomolení proteinu LOX-1 a/nebo změnu neutrální nebo hydrofóbní povahy kavity substrátu enzymu.
Antimediátorová exprese
Redukce v expresi lox-1 může také být doprovázena expresí antimediátorové struktury lox-1 v buňkách ječmene. Způsoby pro expresi antimediátorové struktury v ječmeni pro snížení exprese cílového proteinu byly popsány, například v Gilpin M. J. a kol., ve: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, vydavatel G. Garab, sv. IV, 2983 až 2986 (1998); Kjaerulff a kol., ve: Photosynthesis: from Light to Biosphere, vydavatel P.Mathis, sv. II, 151 až 154 (1995).
Buňky ječmene mohou být transformovány pomocí struktury vytvořené expresí, která obsahuje antimediátorovou sekvenci nukleové kyseliny. Tato struktura vytvořená expresí produkuje molekulu antimediátorové RNA schopnou specifického vázání k při nejmenším části mediátorové RNA (mRNA) produkované ze standardního typu genu lox-1, prostřednictvím komplementárního párování báze a schopné přerušit sestřih prekurzorové-mRNA (pre-mRNA) nebo translaci této mRNA. Konstitutivní nebo tkáňový/dočasný specifický promotor, například promotor lox-1 ječmene popsaný výše může řídit expresi sekvence antimediátorové nukleové kyseliny.
Chemická mutageneze • ·
Chemický mutagen azid sodný (NaN3) byl běžně používán pro mutagenezi ječmene a je o něm známo, že vyvolává stabilní mutace v DNA (deoxyribonukleová kyselina) sekvenci genomu ječmene (Olsen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 90, 8043 až 8047 (1993)). Jiné chemické mutageny, například ethylmethansulfonát (EMS), azidoglycerol (AG, 3-azido-l,2-propandiol), methyl-nitrosomoČovina (MNU) a hydrazid maleinové kyseliny (MH) mohou také být použity pro vyvolání mutací DNA (Rank J. a kol., Mutat. Res., 390, 121 až 127 (1997)), jaké může vyvolat ultrafialové záření.
Jak je ukázáno na příkladech uvedených dále, zrno kultivarů ječmene Vintage a Caruso bylo zpracováno s azidem sodným a množeno pomocí samoopylení až do 3. generace (M3).
4. Identifikace a selekce ječmene s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Identifikace a selekce rostlin ječmene, které mají sníženou aktivitu isozymu lipoxygenázy v zrnu může být dosažena, například pomocí analýzy aktivity lipoxygenázy. Mohou být použity enzymatické zkoušky ke stanovení aktivity dvou hlavních lipoxygenáz, LOX-1 a LOX-2, o kterých je známo, že jsou přítomné buď v zralém nebo klíčícím zrnu,. Takové zkoušky by měly rozlišit aktivitu LOX-1 od aktivity LOX—2.
Jedna selektivní zkouška LOX-1 a LOX-2 je založena na oxidaci polynenasycené mastné kyseliny lipoxygenázou a spektrofotometrické detekci hydroperoxidového produktu z takové oxidace. Specifičnost této zkoušky pokud jde o LOX-1 využívá výhody komparativní necitlivosti LOX-1 na inhibitor, například NDGA, vztaženo k LOX-2.
· 4 · «· 4
I · · · »· · 4« · · · 4 ·
Selektivní zkoušky může také být dosaženo využitím imunoprecipitace k selektivnímu odstranění LOX-1 nebo LOX-2 z látky podrobované zkoušce. Specifické protilátky anti-LOX-1 a anti-LOX-2, například monoklonální protilátky, mohou být připraveny z čištěné LOX-1 nebo LOX-2 jak popsal Holtman a kol., 1996, viz výše.
Tyto zkušební metody mohou být upraveny pro postupy zkoušek na mikrotitrových plotnách nebo pro jiné známé opakovatelné zkoušky vysoce výkonné povahy, které umožňují rychlé vyšetření mnoha vzorků. Tyto zkoušky mohou být schváleny pro vyšetření špiček listů klíčícího zrna v nedestruktivním způsobu tak, že sazenice vybrané při třídění mohou být dále rozmnožovány.
Úbytek aktivity LOX-1 v domnělých mutantech může být potvrzen zkouškou enzymatické aktivity. Například extrakt ze zrn může být inkubován s linolovou kyselinou a produkty oxidace linolové kyseliny analyzovány, například vysoko účinnou kapalinovou chromatografií s reverzními fázemi. Poměrná množství 9-HOPD a 13-HOPD vytvořená z linolové kyseliny poskytují měřítka aktivity LOX-1, jejímž hlavním produktem je 9-HOPD.
Jak je ukázáno v dále uvedených příkladech, přibližně 20 000 zrn z generace M3 mutagenizovaného kultivaru Vintage a kultivaru Caruso bylo vyšetřeno na aktivitu LOX-1 a LOX-2 oxidační zkouškou za přítomnosti inhibitoru a také imunoprecipitačními zkouškami. Použitím těchto zkušebních metod byl nalezen mutant v kultivaru Vintage, který má větší snížení aktivity LOX-1 a byl označen linie G. Fenotyp mutantu byl děděn v generacích M4 a M5.
C · · 9
999 9999
9 « 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 999 999 9
9 9 9 9 9 9 • 9 99 99 99
Semena vyprodukovaná z ječmene linie G byla deponována 4. ledna 2001, v Národních sbírkách průmyslových, potravinářských a mořských bakterií (National Collections of Industrial, Food and Marině Bacteria (NCIMB)), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY, Skotsko, Spojené království, za podmínek Budapešťské Dohody, jako přírůstek číslo: NCIMB 41078.
5. Genetické sekvence
Přesný popis genotypické změny, která odpovídá fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy v rostlinách ječmene podle tohoto vynálezu je užitečný pro identifikaci rostlin, které vykazují tuto genetickou změnu a pro nakřížení této genetické vlastnosti do jiných kultivarů ječmene v rámci pěstebního programu. Řada známých molekulárních a biochemických metod může být použita pro vymezení genetického základu pokud jde o fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy.
Je obecně uznáváno, že jak cis-působící tak trans-působící genetické sekvence mohou vymezit expresi daného genu v genomu a aktivitu genového produktu. Kontrolní body při expresi genu zahrnují řízení časování, specifičnost tkáně a rychlost transkripce genu, stabilitu transkriptu a rychlost přenosu transkriptu. Jak úroveň exprese genu, tak stabilita a specifická aktivita kódovaného enzymu určí úroveň aktivity enzymu zjištěnou v tkáni.
Změny v sekvencích genu rostliny mohou být stanoveny pomocí sekvencování DNA podle známých relevantních částí genomu, zatímco analýza Northern poskytuje nástroj pro sledování stabilních úrovní transkripce v dané rostlinné tkáni. Enzym exprimovaný v tkáni rostliny může být vyhodnocen pomocí extrakce enzymu z tkáně a měřením enzymatické aktivity.
« · · · · · ·· ···· • · · · ······ · · • · · · · · · · · ··· ···* ·· ·· ·· ··
Jak je ukázáno dále v příkladech, identita genetických změn, které vymezují fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy mutantu linie G indukovaný v kultivaru Vintage byla určena následujícím způsobem. Strukturní gen kódující protein LOX-1, jak v mateřském kultivaru Vintage, tak v linii G, byl amplifikován pomocí reakce řetězce polymerázy (PCR) a promotorových sekvencí proti směru exprese genu, které řídí expresi genu, stejně jako byly sekvencovány vnitřní kódující sekvence obsahující intronové a exonové sekvence,.
Srovnání nukleotidových sekvencí genu lox-1 z linie G a ze standardního typu kultivaru Vintage odhalilo 2 nukleotidové substituce ve 2 exonech, z kterých jeden (v poloze +2347) vede v exprimovaném proteinu k nekonzervativní substituci aminokyseliny (Glycin -> Aspartát) .
Obr. 22 zobrazuje seřazení ze sojových bobů (Gm: Glycin max. délka řetězce) lipoxygenáz LOX-1 (přírůstkové číslo P08170), LOX-2 (přírůstkové číslo P08170), LOX-3 (přírůstkové číslo AAB41272) a ječmene (hv: Hordeum vulgare), lipoxygenáz LOX-1 (přírůstkové číslo P29114) a LOX-2 (přírůstkové číslo AAB70865.1). Konzervované zbytky aminokyseliny a konzervativní substituce elektricky nabitých zbytků jsou zobrazeny polotučně. Přiřazení sekundární struktury sojové LOX-3 Glycin max., kde H = alfa helikasy a E = beta řetězce, jsou zobrazeny nad seřazením, a zbytky mající vztah k funkci enzymu (označené pomocí hvězdičky nebo plného kroužku) jsou zobrazeny, podle popisu v práci od Skzypczak-Jakun a kol., Proteins, 29, 15 až 31 (1997).
Zbytky aminokyseliny, které se účastní v nehemoglobinovém vázání železa nebo jsou nezbytné pro katalýzu (*) v LOX-3 sojových bobů zahrnují: H518, H523, H709 [3 atomy dusíku]; N713, • · · · ·· ·· ··· · ·· · · · · · · « • · · · · · · ·
9 9 9 99999 V · • · · · · · · · • ·· » · 99 « · · * « ·
1857 . Odpovídajícími zbytky v LOX-1 ječmene jsou H517, H522, H708, N712 a 1862. Zbytky v LOX-3 sojových bobů s předpovídanou úlohou při katalýze (·) jsou: H266, H513, H776, F264, F272, F714, W519, R552, R726, D766, D779 a K278. Odpovídající zbytky v LOX-1 ječmene jsou:
H261, H512, H775, F259, F267, F713, W518, R551, R?25, Ů778 a K273 ·
Prolinové (P86, 109, 167, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382,
486, 541, 548, 600, 616, 627, 685, 726, 734, 788 , 829, 833, 839, 857) a glycinové
(G49, 67, 68, 70, 91 , 107, 137, 187, 192, 210, 217 , 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458,
474, 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 855) zbytky (+) umístěné
v sekundárních strukturách proteinu ve smyčkách a v pozicích čepiček šroubovice, mohou usnadňovat ostré ohyby a svinutí hlavního řetězce peptidu.
Uspořádání lipoxygenáz příbuzných rostlin naznačuje, že Glycin-368 v LOX-1 ječmene je silně konzervován. Mimoto tento zbytek, který odpovídá Glycinu-353 v LOX-1 sóji, je jedním z 35 vysoce konzervovaných zbytků ze všech 58 zbytků, které vyplňují kavitu substrátu enzymu II, jak je vidět z jeho krystalické struktury. Tyto konzervované zbytky jsou ve středu pozornosti (rámečky) v uspořádání sekvencí rostlinné
lipoxygenázy zobrazeném na obr 22 (Minor a kol.,
Biochemistry, 35, 10 687 až 10 701 (1996)), a zahrnuj í
následující zbytky LOX-1 j ečmene: Y224, L268, W355, E364, G368,
V369, N370, I374, L424ř L499, K501, A502, V504, D508, S509, H512, Q513,
L514, H517, W518, H522, I556, L559, A560, L564, 1565, 1570, T574, S585,
Q715, Y718ř N724, R725, P726, T727, L772 a 1862 . Všechny až na 7 z 35
konzervovaných zbytků jsou neutrální nebo hydrofóbní zbytky. Substituce elektricky nabitých zbytků v pozici Glycin-368 v ječmeni nebo v jiném konzervovaném neutrálním nebo hydrofóbním zbytku vyplňujícím kavitu substrátu II, je pravděpodobně vhodná pro narušení strukturálních a funkčních ·· ···· » · · · ··♦ · · ·· ·· vlastností enzymu. Mutace G -> D368 v LOX-1 ječmene linie G (♦) je umístěna mezi alfa-šroubovicí H6 a beta-řetězcem E12.
Jak je zobrazeno v obr. 22, rodina lipoxygenázových enzymů sdílí vysoký stupeň konzervace sekvencí, která se odráží v jejich konzervované sekundární struktuře, stanovené pro několik členů rodiny rostlinných lipoxygenáz včetně LOX-1 a LOX-3 sóji (Skrypczak-Jankun a kol., 1997, viz výše). LOX-1 ječmene sdílí 56,9% totožnost sekvencí a 67,8% podobnost sekvencí s LOX-3 sóji. Několik zbytků aminokyseliny v isozymu LOX-3 sóji bylo identifikováno jako ligandy pro nehemoglobinově vázané železo nebo se naznačuje, že jsou hlavní pro jeho aktivitu (označení *·). Z pohledu vysoké konzervace sekvence uprostřed LOX-1 ječmene a LOX-3 spji, je přiměřené předpovídat, že zbytky v sekvenci LOX-1 ječmene, které jsou homologní k těm sekvencím identifikovaným jako důležité pro funkci LOX-3, mohou být také podstatné pro enzymatickou aktivitu. Tudíž nekonzervativňí substituce aminokyseliny v jakékoliv z těchto pozic, včetně substitucí těchto zbytků v LOX-1 ječmene odpovídajících 35 vysoce zakonzervovaným zbytkům z LOX-3 sóji, které vyplňují kavitu substrátu, a v ostatních polohách podstatných pro aktivitu enzymu, pravděpodobně snižují aktivitu lipoxygenázy.
zbytcích aminokyselin prolinu a glycinu je známo, že usnadňují ohýbání dovnitř hlavního řetězce peptidu, kde jsou umístěny dovoluj i
Zbytky prolinu mezi sekundárními proteinu zaujmout strukturními elementy, které svinutou terciární strukturu, glycinu jsou také běžné v motivech upravujících šroubovicí čepičkou (Parker a Hefford, Protein Eng., 10, 487 až 496 (1997), http://www.expasy.ch) . Jednoduchá nekonzervativní substituce v LOX-1 linie G, kde glycin umístěný mezi dvěmi předvídanými strukturálními elementy byl
nahrazen aspartátem, vede k významnému úbytku aktivity enzymu. Tudíž se předpovídá, že mutace v genu LOX-1 způsobující nekonzervativní substituce aminokyselin v jednom nebo více zbytcích prolinu nebo glycinu v LOX-1 ječmene, položených v oblastech vně strukturálních elementů, mohou podobně zabraňovat svinutí přírodního proteinu a následovně snížení aktivity kódovaného enzymu.
Tudíž v jednom ztělesnění užitečný mutant rostliny ječmene podle tohoto vynálezu, který vykazuje sníženou aktivitu lipoxygenázy-1 obsahuje mutovanou sekvenci nukleové kyseliny, která mění neutrální nebo hydrofóbní povahu kavity substrátu enzymu vložením jedné nebo více kyselých, bazických nebo polárních aminokyselin. Například užitečná sekvence nukleové kyseliny [sekvence identifikační číslo: 11] kóduje protein LOX-1 ječmene [sekvence identifikační číslo: 12], který má substituci v aminokyselině 368 od Glycinu k Xaa, kde Xaa je kyselá, bazická nebo polární aminokyselina. Jednou specifickou sekvencí aminokyseliny LOX-1 mutantu ječmene podle tohoto vynálezu je ta, kde Xaa je aspartovou kyselinou, např. linie G.
Jak je ukázáno v příkladech uvedených níže, genotypické změny v linii G mají nezjistitelný vliv na expresi genu lox-1, ale aktivita LOX-1 zjištěná ve zralém a klíčícím zrnu linie G byla přibližně 9 % aktivity zjištěné v zrnu mateřské linie, kultivaru Vintage. Pro poskytnutí přímého důkazu, že mutace aminokyseliny v LOX-1 linie G je zodpovědná za fenotyp s nízkou aktivitou LOX-1, kódující sekvence lox-1 linie G a lox-1 kultivaru byly dočasně exprimovány v protoplastech z auleronu ječmene, a ukázalo se, že aktivita mutantního enzymu LOX-1 je silně snížená ve srovnání se standardním typem enzymu LOX-1.
9
9 9 9 • · · 9
9 9 9
6. Přenos mezi šlechtitelskými liniemi
Zjištění změn v genetickém charakteru rostlin ječmene genotypu podle tohoto vynálezu je užitečné pro identifikaci přítomnosti specifického genetického charakteru v linii ječmene, a pro usnadnění přenosu tohoto charakteru mezi šlechtitelskými liniemi při programu šlechtění. Řada molekulárních nástrojů je dostupná pro zjištění změn v genomické sekvenci. Takové metody zahrnují, ale nejsou omezeny na, zjištění polymorfismu délek restrikčního fragmentu (Gebhardt a Salamini, Int. Rev. Cytology., 135, 201 až 237 (1992)) a kvantitativní na PCR založené metody detekce, jako je amplifikační použití fluorescenčních primerů např. systémy příměrové zkoušky TaqMan (Ibraham a kol., Anal. Chem., 70, 2013 až 2017 (1998)). Výběr detekčních metod bude záviset na specifickém genetickém charakteru, ale výhodně by měl být rychlý a poskytovat zřetelně interpretovatelné údaje.
Jak je ukázáno v níže uvedených příkladech, PCR-zkouška štěpením amplifikovaného polymorfního místa (PCR-CAPS) byla vzata v úvahu pro detekci mutantního genu lipoxygénázy-1 linie G. Nukleotidové substituce v genu lox-1 v linii G v pozici +2347 vnesla další místo rozlišení pomocí restrikční endonukleázy AatlI, které může být zjištěno pomocí zkoušky PCR-CAPS. Vhodné metody detekce pro lox-1 nejsou omezeny na tuto zkoušku, ale mohou stejně dobře být založeny na TaqManově technologii a ostatních známých způsobech detekce.
Příklady uvedené níže také ukazují, že zkouška PCR-CAPS byla aplikována na 4 generace šlechtitelského materiálu z programu zpětného křížení, kde fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy v linii G byl systematicky zpětně nakřížen do kultivaru Alexis. Ukazuje se, že dědičnost fenotypu s nízkou • · · · • · * · » · « • » · · · · · • ····*· 9 9
9 9 9 9 9 9 aktivitou lipoxygenázy sleduje dědičnost podle genu lox-1 a fenotyp byl identifikován jako recesivní a byl pozorován pouze v liniích homozygotních pokud jde o gen lox-1.
Podle toho, potomstvo rostliny podle tohoto vynálezu zahrnuje šlechtitelské linie, například odvozené v programu zpětného křížení, které obsahují mutantní lox-1 a exprimují fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy.
7. Proces vaření
Rostliny ječmehe podle tohoto vynálezu, včetně částí rostlin, potomstva rostlin, zrna a rostlinných produktů jako je slad a mladina, které vykazují nízkou aktivitu lipoxygenázy-1, jsou zde představeny jako užitečné pro výrobu nápojů, kteté vykazují snížené hladiny volného trans-2-nonenalu po měřený časový úsek nebo za podmínek skladování za zvýšené teploty, ve srovnání s nápoji vyráběnými ze standardního typu kontrolní odrůdy ječmene. Za účelem tohoto srovnání je obsah sulfitu v pivě upraven do 5 dílů na milion nebo méně, jelikož je uznáváno, že vyšší hladiny sulfitu v době plnění do lahví dočasně zdržují výskyt trans-2-nonenalu. Například pivo vařené ze sladu pocházejícího z mutovaného ječmene linie G popsané zde, mají stabilizované organoleptické vlastnosti po měřený časový úsek ve srovnání s pivem vařeným ze sladu pocházejícího z kontrolního nemutovaného ječmene.
Zkušební vaření a hodnocení lahvového piva poskytují nej lepší způsob pro hodnocení vlivu různých přísad na kvalitu a stabilitu hotového piva. Pro zkoušku vlivu sladů z různých ječmenů, je potřeba dostatečné množství zrn ječmene pro provedení zkušebních sladování a vaření v poloprovozním a • 4 • · 4 4 · · 4 ·· ····
44 poloprůmyslovém měřítku. Během doby růstu ječmene, může být hodnocena pěstební charakteristika linie ječmene. Vlastnosti linie ječmene pro výrobu sladu mohou být hodnoceny během výroby sladu v poloprovozním nebo průmyslovém měřítku a měly by se nacházet v rámci doporučení pro národní kvalitu výroby sladu, např. doporučení Evropského sdružení výrobců piva (European Brewing Convention) pro kvalitu výroby sladu (Analytika-EBC/European Brewing Convention, 1998, publikace Hans Carl Getránke-Fachverlag, Norimberk, Německo). Po vaření v poloprovozním nebo poloprůmyslovém měřítku je pivo plněno do hnědých lahví a ochlazeno na 5 °C pro skladování v optimálním režimu. V tomto stadiu může být čerstvě uvařené pivo analyzováno zkušenými skupinami ochutnávačů pro zjištění specifických chutí a vůní piva, včetně nestandardní chuti a vůně sloučeniny trans-2-nonenalu. Navíc je pivo chemicky analyzováno na hlavní složky chuti a vůně, včetně trans-2-nonenalu. Tyto metody analýzy kvality piva známé tím, že ukáží dlouhodobou stabilitu piva, například po zpracování nuceným stárnutím, jsou potom na pivo opakovaně uplatňovány po různých podmínkách skladování.
Jak je ukázáno v níže uvedených příkladech, linie G ječmene byla pěstována na poli po několik období, aby bylo možné sladovat 10 tun této linie v průmyslové sladovně. Z kontrolních odrůd ječmene kultivar Vintage a kultivar Nevada, které obě obsahují fenotyp se standardním typem LOX-1, byl slad vyráběn za podobných podmínek. Sušený slad z linie G a kontrolních kultivarů ječmene se nacházel v rámci technických podmínek vyžadovaných pro poloprůmyslová zkušební vaření.
Zkušební vaření byla prováděna v 30-hektolitrovém měřítku a hodnocení čerstvě do lahví plněných piv ukázalo, že piva vařená ze sladu, jak linie G, tak kontrolních kultivarů mají • 9 444 4 • 4» ·* ·· ·· ♦ · · · · « « · « • ···♦···» • · 4 · 444444 4 4
OO * · 4 · 4 4 44 4
-40 4444444 44 44 44 44 obsah trans-2-nonenalu pod prahem Zjistitelným chutí a byly skupinou ochutnávačů pokládány za uspokojivé. Dvě zpracování nugeným stárnutím, buď skladováním při 37 °C po 7 dní nebo skladováním od 6 do 12 týdnů při 30 °C, byla použita pro hodnocení chuťové a aromatické Stability piva. Bylo zjištěno, že chuťová a aromatická stabilita piva uvařeného ze sladu z linie G je vyšší než piva z kontrolního sladu, jak vzhledem k hodnocení skupinou ochutnávačů, tak stejně jako pokud jde o hladinu trans-2-nonenalu a bylo zjištěno, že zlepšení je statisticky významné.
Příklady použití vynálezu
Předkládaný vynález se dále blíže vymezuje v níže uvedených příkladech. Mělo by se rozumět, že tyto příklady, zatímco naznačují výhodná ztělesnění, se uvádějí pouze ilustrativním způsobem.
Příklad 1
Zjištění a selekce mutantů isozymu lipoxygenázy z mutagenizovaného ječmene
1. Mutageneze ječmene
Zrna ječmene, Hordeum vulgare kultivar Vintage a kultivar Caruso, se mutagenizují azidem sodným podle publikovaného postupu (Kleinhofs a kol., Mutation Research, 51, 29 až 35 (1978) . Mutageneze vnáší body mutace do genomické DNA, které například mohou mít za následek změny aminokyseliny v kódovaných proteinech. Mutovaná zrna Ml se po dvě generace pěstují ve skleníku a zrno M3 se sklidí pro třídění, Pozorovaná četnost mutantů v jednom povahovém rysu genu v generaci M2, podle Kleinhofs a kol., 1978, viz výše, je 1,0 » · ··· 9 • 9 9 99 9 až 2,7 mutantů na 10 000 zrn z generace M2. Jelikož většina genových mutací je recesivní a je zjistitelná pouze v homozygotním stavu, mutagenizovaná populace se vytřiďuje z M3 generace, kde se očekává, že podíl homozygotních mutantů zrna je vyšší. Očekává se, že četnost mutace v mutagenizovaném materiálu z M3 je od 0,9 do 2,3 na 10 000 zrn.
2. Nedestruktivní zkouška aktivity lipoxygenázy-1 (LOX-1) a lipoxygenázy-2 (LOX-2) v mutagenizovaném zrnu M3
Postup rychlého vyšetření pokud jde o zjištění zrn mutantů ječmene se sníženou aktivitou LOX-1 se vyvinula podle následujících kriterií:
postup vyšetření nemá bránit růstu zrn/sazenic; tkáň vybraných zrn/sazenic by měla exprimovat kvantifikovatelné úrovně lipoxygenázové aktivity; zkouška by měla odlišit aktivitu LOX-1 od aktivity LOX-2; a postup zkoušky by měl obsáhnout mnohočetné vzorky.
Úrovně celkové aktivity lipoxygenázy v různých tkáních klíčícího zrna, jmenovitě výhoncích, kořenech a skutelové tkáni zárodku a endospermu se zkouší následovně: extrakty ze tkáně sazenic ječmene se připraví homogenizací tkáně v ledové 20mM tris-chlorovodíkové kyselině (tris-HCl), pH 7,5, obsahující 2 mM azidu sodného a 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF), načež nálseduje odstranění nerozpustných látek odstředěním při 1000 g po 10 minut. Aktivita lipoxygenázy ve 100 μΐ extraktu se zkouší při 25 °C přidáním 2,9 ml 20mM substrátu kyseliny linoleové, připraveného disperzí 35 μΐ linoleové kyseliny (volná kyselina, L-1376, Sigma, USA) v 5 ml vody obsahující 1 % Tween 20. Reakce se sleduje spektrofotometricky, kde rychlost zvýšení v absorbanci při 2 34 nm (A234nm) , z důvodu tvorby «4 • 4 4···
4 • 4
4 4 4·
4
4
4 • 4 · konjugovaného dienu v hydroperoxidovém produktu, je úměrná aktivitě přítomného enzymu. Jedna jednotka lipoxygenázové aktivity je definována jako ΔΑ234 = 0,001 za minutu v 3-ml reakční směsi, což odpovídá oxidaci 0,12 pmol linoleové kyseliny.
Listová tkáň ze zrna, které se klíčí po 4 dny ve tmě vykazuje nejvyšší zjištěné úrovně lipoxygenázové aktivity (Holtman a kol., Plant Physiology, 111, 569 až 576 (1996)).
Špičky listů ze 4-denních sazenic se tudíž vybírají pro zkoušku nedestruktivním vyšetřením na lipoxygenázu. Optimální pH z celkové aktivity lipoxygenázy ječmene se zkouší mezi pH 4,5 a pH 9,0 a zjistí se, že je jím hodnota pH 6,5. Tudíž 25mM HEPES pufer (pH 6,5) obsahující 0,2 M orthoborité kyseliny se vybere pro vyšetřovací zkoušku.
Jelikož jak LOX-1, tak LOX-2 enzymy se immunologicky zjišťují ve výhoncích 4-denních sazenic (Holtman a kol., 1996, viz výše) používají se specifické zkoušky na LOX-1 a LOX-2. Zjistilo se, že inhibitor lipoxygenázy nordihydroguajaretová kyselina (NDGA), kterou identifikoval Eskin a kol., Crit. Rev. Food, Science and Nutrition, 9, 1 až 40 (1997), je selektivním inhibitorem lipoxygenáz ječmene. NDGA v koncentraci 1 x ΙΟ5 M silně inhibuje čištěnou LOX-2 ječmene, zatímco LOX-1 si zachovává 47 % aktivity (obr. 1) . Selektivita tohoto inhibitoru se testuje při zkoušce špiček listů, pomocí stanovení poměru 9-hydroperoxyoktadekanoidu (9-HOPD) k 13-hydroperoxydekanoidu (13-HOPD), které jsou výsledkem oxidace linolové kyseliny LOX-1 a LOX-2. Při lipoxygenázové zkoušce špiček listů kultivaru Vintage, podíl vytvořeného 13-HOPD klesl z 24,5 % na 9,5 % na základě přidání 1 x 1CJ5 M NDGA.
• A A AA A • A • * · A Α φ
A AAA A A A A
A A A A A A ► ·» AA AA
Selektivní zkouška na aktivitu LOX-2 v extraktech ze špiček listů se zakládá na použití specifické monoklonální 5D2) (Holtman a kol., 1996, viz výše) pro LOX-1 přítomné v extraktech. Zbytková protilátky LOX-1 imunoprecipitaci aktivita lipoxygenázy zjištěná v extraktech po precipitaci
LOX-1 poskytuje imunoprecipitace zbytkové LOX-1 a míru aktivity LOX-2. Účinnost této (popsaná níže) se hodnotí kvantifikací LOX-2 v kapalině extraktu nad sraženinou pomocí zkoušky ELISA, využívající specifické monoklonální a LOX-2 (označené 5,8) Imunoprecipitace LOX-1 protilátky proti LOX-1 (označené 5D2 (Holtman a kol., 1996, viz výše), z extraktů z konečků listů kultivaru Vintage odstraní 85 proteinu LOX-1 a 15 % proteinu LOX-2.
Imunoprecipitace se provádí v 96-jamkové plotně s V-dnem přidáním 5 μϊ 5D2 povlečených Dynakuliček (Dynal) a 75 μϊ pufru [20mM tris-HCl, pH 7,5, 1% objem/objem séra z telat skotu (HyClone)] do 20 μϊ každého extraktu ze špiček listů. Plotna se inkubuje na protřepávačce titrovacích ploten (MTS4, IKA, Labor Technik) po 1 hodinu při 4 °C. Imunoprecipitát se peletuje odstředěním při 4 °C v odstředivce Sigma 302-K po 10 minut při frekvenci otáček 2000 za minutu. Kapalina nad sraženinou (70 μϊ) z každého vzorku se zkouší na aktivitu lipoxygenázy v 96-jamkové plotně s plochým dnem, jak je popsáno níže, ale s přídavkem 100 μϊ zkušebního pufru (25 mM HEPES, 0,2 M borité kyseliny, pH 6,5).
Zkoušky LOX-1 a LOX-2 se upraví pro zjišťovací metodu o vysokém výkonu. Špičky listů (1 cm) ? osmi 4 dny klíčených zrn se jednotlivě homogenizují v 150 μϊ ledového pufru (20 mM tris-HCl, pH 7,5) po 2 x 30 sekund v multijamkovém homogenizéru (Berg a kol., Electrophoresis, 13, 76 až 81 (1992)). Po odstředění po 15 minut frekvencí 3000 otáček za ·· ·Μ* ·· * · · · * · · · · ····«· « * • ♦ · · * » 4 ·
9999 44 99 99 99 minutu, se 40 μΐ kápaliny extraktu nad sraženinou převede do 96-jamkové plotny s plochým dnem. Do každé jamky se přidá 170 μΐ pufru (25 mM HEPES, 0,2 M borité kyseliny, pH 6,5, 1 x 10-5 M NDGA) a 10 μΐ substrátu (20 mM linolové kyseliny) a potom se inkubuje 20 minut při 25 °C. Reakce se ukončí přidáním 20 μΐ nasyceného roztoku jodidu draselného (Kl) a inkubuje se dalších 8 minut při 25 °C. Redox reakcí mezi hydroperoxydieny a jodidem draselným vzniká jod (I2), který se sleduje pomocí jeho extinkčního maxima při 350 nm v čtecím zařízeríí mikroploten (Multiskan MCC/340).
3. Identifikace potenciálních mutantů lipoxygenázy-1 v M3 a M4 zrnu mutagenizovaného ječmene
Zrno z generace M3 kultivaru Vintage a kultivaru Caruso se skladuje při 45 °C po 6,5 dne pro zrušení klidového stavu, což zajišťuje 95% klíčivost. Zrno M3 kultivaru Vintage (9318) a kultivaru Caruso (9633) se klíčí a třídí na linie, jejichž aktivita LOX-1 je 15% nebo nižší než zrna standardního typu. Domnělé mutantní linie (linie 50 kultivaru Vintage a 42 kultivaru Cařuso) se pěstují do generace M4, sklidí se a naklíčené zrno se znovu vyšetří. Fenotyp mutantu LOX-1 se potvrdil v jedné linii kultivaru Vintage a šesti liniích kultivaru Caruso, po měření aktivity lipoxygenázy v extraktech z 5 špiček listů z každé linie. Když se aktivity LOX-1 a LOX-2 v klíčících zárodcích z těchto 7 domnělých mutantů podrobí zkoušce, pouze mutant kultivaru Vintage (označený linie G) vykazuje větší snížení aktivity LOX-1. V zralém zrnu v klidovém stadiu je lipoxygenázová aktivita přítomná v zárodku téměř výlučně aktivitou LOX-1, z důvodu odlišujících se vlastností těchto dvou isozymů (Schmitt a van Mechelen, Plant Sci., 128, 141 až 150 (1997)) . Celková aktivita lipoxygenázy v extraktech ze zárodků ze suchého zralého zrna »4 4444 • ·* 4« 4»
4 4 4 4444 44 4
4 4444 444 · *44· 444 4 4 4 * · 4 4 4 4 4 4
444 4 4 · 4 44 44 44 44 linie G (generace M5) je 0,06±0,04 jednotek/mg proteinu ve srovnání s 0,7410,44 jednotek/mg proteinu v extraktech ze zárodku z kultivaru Vintage, jak se určí pomocí spektrofotometrické zkoušky na lipoxygenázu, která popsána v části 2 příkladu 1. Zjistilo se, že aktivita zbytkové lipoxygenázy ve zárodcích ze zralého zrna linie G jak v M4 tak M5 generacích je přibližně 9 % mateřské linie.
Příklad 2
Linie G je mutantem kultivaru Vintage s fénotypem o nízké aktivitě lipoxygenázy
Agronomické vlastnosti mutantního fenotypu linie G se analyzují v materiálu z generace M5. Počáteční analýzy se provádějí pro potvrzení, že analyzovaný materiál M5 je homozygotní pokud jde o mutantní fenotyp. Fenotyp s nízkou aktivitou LOX-1 v linii G, zjištěný v generaci M3, může pocházet z dominantní nebo recesivní mutace. Jestliže linie G vybraná v generaci M3 je homozygotní pro dominantní mutaci, potom následující generace budou vykazovat segregaci pokud jde o fenotyp. Aktivita lipoxygenázy v 26 jednotlivých zárodcích linie G ze zrna ve stavu klidu generace M5 se měří a srovnává se zárodky standardního typu kultivaru Vintage. Aktivita lipoxygenázy ve všech zárodcích linie G je velmi nízká, s průměrem 0,06±0,04 jednotek lipoxygenázy na mg proteinu ve srovnání s 0,74±0,44 jednotek lipoxygenázy na mg proteinu v zárodcích ze standardního typu kultivaru Vintage. Tyto údaje potvrzují, že linie G v generaci M5 je homozygotní pokud jde b vlastnost, kterou je nízká aktivita lipoxygenázy.
1. Linie G vykazuje fyziologii růstu a vývoje zrna standardního typu rostliny
Μ ·*»» «4 ·»
V 9 8 9 8 9 9 9 4 • 8 8 8 8 9 9 9
899 9 888 9 8 8 9
34 8 9 9 8 9 8 8 9 4 988 9999 88 89 89 88
Zrno linie G a kultivaru Vintage klíčí a roste
v klimatické komoře při 16 hodinách světla při 15 °C a 8
hodinách tmy při 12 °C a relativní vlhkosti 80 %. Růstové
charakteristiky rostlin linie G a kultivaru Vintage jsog podobné vzhledem k výšce rostliny, počtu výhonků na rostlinu, začátku květu a počtu zrn na klas. Hmotnost v čerstvém stavu (obr. 2) a suchá hmotnost (obr. 3) zrna linie G a standardního typu kultivaru Vintage během vývoje od 5 dní po květu (DAF) do plné zralosti, přibližně 90 DAF, jsou velmi podobné.
2. Zrno linie G vykazuje fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy po celý vývoj
Aktivita lipoxygenázy se měří v extraktech vyvíjejícího se zrna ječmene linie G (generace M5) a standardního typu kultivaru Vintage. Zrna se homogenizují v pufru z 20 mM ledové tris-HCl o pH 7,5, který obsahuje Nonidet P-40 0,1 % (objem/objem), neiontový detergent, který zvyšuje extrakci lipoxygenázy, a odstředí se při 15 000 g po 20 minut pro odstranění nerozpustných látek. Aktivita v extraktech se měří polarografřeky v 200 nasyceného pufru (0,2 M borité kyseliny, 25 mM HEPES, pH 6,5), který obsahuje 1,2 mM linolové kyseliny při 25 °C, přičemž se pro měření spotřeby kyslíku používá Clarkův typ elektrody. Aktivita lipoxygenázy se zvýší během prvních 20 dní vývoje zrna jak v linii G, tak v zrně standardního typu, ale pouze v linii G skutečně úroveň aktivity klesne během zrání zrna (obr. 4).
lipoxygenázy μΐ kyslíkem
Relativní množství 9-HOPD a 13-HOPD, které se vytvoří během oxidace linolové kyseliny poskytuje míru úrovní aktivity
LOX-1 a LOX-2 v extraktech ze zrna. V tomto případě se Nonidet
P-40 vynechá z pufru extraktu ze zrna, aby se vyloučila ko·* ·· * · » · ·· ···« * · · • · · • · · • · · · • ·>·· • · · · · • · · ··· · t
-extrakce hydroperoxid spotřebovávajících enzymů. Extrakty (100 μΐ) smíchané s 10 ml 50mM fosfátového pufru, pH 6,5, který obsahuje 200 μΜ linolové kyseliny se inkubují po 20 minut. Reakce se ukončí úpravou pH na 3,5 a přidá se vnitřní standard. Hydroperoxidy vytvořené při zkoušce se váží na oktadecylové koloně bez kapalné fáze (Bakerbond, Baker) a eluují se methanolem. 9-HOPD a 13-HOPD se potom oddělí pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi na koloně C-18 s isokratickým elučním rozpouštědlem (tetrahydrofuran : methanol : voda : octová kyselina, 25 : 30 : 44,9 : 0,1 (objem/objem) upraveným na pH 5,5 koncentrovaným amoniakem) při rychlosti průtoku 0,5 ml/min jak popisuje Aarle a kol., FEBS Letters, 280, 159 až 162 (1991). Hydroperoxidy se zjišťují při 234 nm a píky HOPD se upraví vůči vnitřnímu standardu, prostaglandinu B2.
Obr. 5 ukazuje, že 13-HOPD je hlavním produktem aktivity lipoxygenázy přítomné v zrnu během prvních 20 dnů po květu (20 DAF) , zatímco 9-HOPD vytváří lipoxygenáza aktivní během zrání zrna. Zatímco extrakty jak ze zrna linie G, tak ze zrna standardního typu sdílejí podobný profil syntetizační aktivity 13-HOPD, linie G nevykazuje zvýšení syntetizační aktivity 9-HOPD standardního typu. Tyto údaje jsou shodné s úbytkem aktivity LOX-1 při zrání zrna linie G ječmene.
3. Zrno linie G vykazuje fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy-1 při klíčení
Celková aktivita lipoxygenázy v extraktech ze zárodků zrna klíčeného při 15 °C se zkouší podle popisu v příkladu 1. Aktivita lipoxygenázy přítomné v standardním typu zrna v klidovém stavu klesá během prvních 4 dnů klíčení a potom se • · · · · · · · • ·· ······ · · • · · · ···· ··· ·· ·· ·· ·· zvyšuje (obr. 6). V linii G, aktivita lipoxygenázy v zrnu v klidovém stavu je velmi nízká, ale zvyšuje se po 4 dnech.
Analýza hydroperoxidů vytvořených aktivitou lipoxygenázy v klíčících zárodcích ukazuje, že 9-HOPD je hlavním produktem lipoxygenáz přítomných v zrnu standardního typu v klidovém stavu (obr. 7). Úroveň tvorby 9-HOPD klesá s poklesem aktivity lipoxygenázy v extraktech. Zvýšení aktivity lipoxygenázy po 4 dnech je doprovázeno tvorbou jak 9-HOPD, tak 13-HOPD. Nízká aktivita lipoxygenázy v zrnu linie G v klidovém stavu se spojuje s nepřítomností tvorby HOPD, zatímco zvýšení aktivity po 4 dnech produkuje hlavně 13-HOPD. Tyto údaje poskytují důkaz, že aktivita LOX-1, která vede k tvorbě 9-HOPD je velice snížená v zárodcích jak vyvíjejícího se zrna, zrna v klidovém stavu, tak klíčícího zrna ječmene linie G, zatímco aktivita LOX-2, která vede k tvorbě 13-HOPD se v linii G nemění.
Příklad 3
Linie G obsahuje mutantní gen lipoxygenázy-1 (lox-1) způsobující fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Molekulární základ pokud jde o fenotyp linie G s nízkou aktivitou LOX-1 se zkoumá pro získání úplného popisu mutantu. Pro získání úplné charakteristiky fenotypu se provádějí následující analýzy:
1. Lipoxygenáza-1 se syntetizuje ve vyvíjejícím se a klíčícím zrnu linie G
Western blot analýzy extraktů ze zárodků z vyvíjejícího se a klíčícího zrna ječmene se provádí paralelně s měřením aktivity lipoxygenázy, podle popisu v příkladu 2. Surové extrakty se separují pomocí elektroforézy gelu dodecylsulfát
« · sodný-polyakrylamid (SDS-PAGE) podle Laemmli, Nátuře, 227, 680 až 685 (1970) . Separované proteiny se převedou do nitrocelulózy pomocí polosuchého přenosu, podle Towbin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, Ί_6, 4350 až 4354 (1979). Přenos se zkoumá pomocí specifické monoklonální protilátky LOX-1, 5D2, jak popisuje Holtman a kol., Plant Physiology, 111, 569 až 576 (1996), v 500-násobném zředění, po kterém následuje inkubace s kozí anti-myší protilátkou kondenzované k alkalické fosfatáze, a zjišťuje se pomocí substrátů alkalické fosfatázy nitro-tetrazoliové modři a 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu jak popisuje Holtman a kol., Plant Physiol., 111, 569 až 576 (1996). Western analýza odhalila, že protein LOX-1 se zjistí v zárodcích kultivaru Vintage v zrnu vyvíjejícím se od 10 DAF a hladina se zvýšuje během zrání zrna {obr. 8). Protein je také přítomný v zárodku ze zrna v klidovém stavu kultivaru Vintage, ale pomalu se snižuje během klíčení (obr. 9). Ačkoliv LÓX-1 se zjistí v extraktech ze zárodků linie G a migrátech v SDS-PAGE jako protein velikosti podobné k LOX-1 kultivaru Vintage, imunologicky zjistitelné hladiny proteinu v linii G jsou mírně nižší než v kultivaru Vintage.
2. Gen lox-1 se exprimuje ve vyvíjejícím se a klíčícím zrnu linie G
Celá RNA se izoluje ze zárodků vyvíjejících se a klíčících zrn ječmene, podle postupu od autorů Hengsens a van Os-Ruygrok, Rice Genet. Newslett., já, 163 až 168 (1989), souběžně s měřením aktivity lipoxygenázy, které je popsáno v příkladu 2. Vzorky RNA (7 pg) se separují na denaturujících agarových gelech a přenášejí se Northern blott jak popisuje Sambrook a kol., v Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Přenosy se hybridisují s 32P-označenou sondou vytvořenou »φ φφφφ • » · · · • «φ · φφφφ φφφ φφφφ ζ 3'netranslatované oblasti, nukleotidy 2659 až 2801 [sekvence identifikační číslo: 1], z cDNA lox-1 (EMBL přírůstek č. L35931) podle popisu od Holtman a kol., Plant Physiol., 111, 569 až 576 (1996), za použití soupravy Amersham Random Prime
Kit.
Přepisy lox-1 kódující LOX-1 se zjistili v zárodcích z vyvíjejícího se a zralého zrna kultivaru Vintage a linie G od 30 DAF (obr. 10). Hladina přepisů lox-1 se zvyšuje během klíčení v zárodcích jak kultivaru Vintage, tak linie G, což naznačuje novou (de novo) expresi genu lox-1 (obr. 11) . Jelikož zjistitelné hladiny přepisů lox-1 jsou podobné v zárodcích linie G a kultivaru Vintage, ani snížený přepis lox-1 ani stabilita přepisu se nemůže přičítat fenotypu linie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy.
3. Gen lox-1 linie G kóduje mutantní formu lipoxygenázy-1
Nukleotidová sekvence genu lox-1 linie G a kultivaru Vintage se analyzují a porovnávají pro určení molekulárního základu pro fenotyp linie G s nízko aktivní LOX-1, který je charakterizován pomocí normální transkripce genu lox-1, a v neposlední řadě sníženou akumulací a aktivitou exprimovaného lipoxygenázového enzymu v zrnu.
Genomická DNA z linie G a standardního typu kultivaru Vintage se izoluje z tkáně listů sazenic podle způsobu, který popsali Pich a Schubert, Nucleic Acids Res., 21, 3328 (1993).
Gen lox-1 v preparátech genomické DNA se amplifikuje pomocí reakce řetězce polymerázy (PCR) za použití primerů založených na sekvenci genu lox-1 ječmene (van Mechelen a kol., BBA, 1254, 221 až 225 (1995); Rouster a kol., Plant J., 11, 513 až 523 (1997). Pozice a sekvence oligonukleotidových primerů,
které se používají pro amplifikaci promotoru lox-1 a kódujících oblastí, označené na obr. 12 jsou následující:
Původní primer 5'-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC-3' [sekvence identifikační číslo: 2] a reverzní primer 5'-TAT AGG ATC CTT GTT CTT GGC CTC CTC TCC TCG-3' [sekvence identifikační číslo: 3] se používají k PCR amplifikaci promotorové domény lox—1 (-361 až +68) z linie G a kultivaru Vintage.
Původní primep 5'-AGT GAA AAA CAG TGT GCT GGT G-3' [identifikační číslo sekvence: 4] a reverzní primer 5'-GGC TTA AAG AGC AAC TGC TGA-3' [identifikační číslo sekvence: 5] se používají pro PCR amplifikaci kódující oblasti lox-1 linie G.
Původní primer 5'-CAA GAT GCA TAT GCT GCT GGG AG-3' [identifikační číslo sekvence: 6] a reverzní primer 5'-CGA TGG TTT AAA TTA GAT GGA GAT GCT GT-3' [identifikační číslo sekvence: 7] PCR amplifikují kódující oblast lox-1 kultivaru Vintage.
Reakční směsi PCR (reakce řetězce polymerázy) se skládají z 250 ng genomické DNA v 50 μΐ objemu, který obsahuje 50 pmol primeru a 2 jednotky Pfu DNA polymerázy (Promega) podle dodavatelových instrukcí k enzymu. Amplifikace pomocí PCR se provádějí v zařízení Stratagene Robocycler: 1 minuta při 94 °C, cyklus; 1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 62 °C a 5 minut při 72 °C, 30 cyklů; 10 minut při 72 °C, 1 cyklus. Produkty PCR se separují na 1,2% agarosových gelech. Fragmenty DNA odpovídající v délce amplifikované oblasti se čistí za použití gelové extrakční soupravy Qiax II (Qiagen) a klonují se do plasmidu pcDNA2.1 (Invitrogen). Nukleotidové sekvence jak z řetězů klonovaného promotoru lox-1, tak kódujících oblastí se určí za použití terminační reakce dideoxynukleotidového
• ·· · • · · · · · · • · · · · · · • *····« · · • · · · · · · ·· *· ·· ·· řetězce se specifickými oligonukleotidovými primery a analyzují se na genetickém analyzátoru ABI PRISM® 310 (PE Biosystems). Srovnání sekvencí se provádějí za použití balíčku softwaru pro analýzu sekvencí DNA STAR (DNA STAR lne., USA).
Rromotorová oblast a struktura intron-exon z kódující oblasti lox-1 ječmene jsou zobrazeny na obr. 13 a odvozují se ze srovnání nukleotidové sekvence z genomických a cDNA sekvencí lox-1 ze standardního typu (obr. 12). Sekvencovaná oblast z promotorové oblasti lox-1 od -363 do +68, (číslováno relativně k stanovenému počátečnímu místu transkripce; van Mechelen a kol., BBA, 1254, 221 až 225 (1995)), je dostatečná pro řízení charakteristiky pro embryo specifické a dočasně řízené genové exprese nativního genu (Rouster a kol., Plant J., 15, 435 až 440 (1998)). Promotorové a přepisovaná oblast genu lox-1 standardního typu [sekvence identifikační číslo: 8] je 4663 nt v délce a obsahuje 6 intronů mezi 82 nt a 634 nt v délce, které nejsou přítomné z příslušné cDNA [sekvence identifikační číslo: 10] a musí se proto odstranit během úpravy přepisu sestřihem.
Srovnání nukleotidové sekvence z lox-1 linie G s nukleotidovou sekvencí standardního typu (obr. 12) ukazuje, že alela lox-1 linie G vykazuje mutace ve dvou bodech. Jednou je tichá substituce C-+T v pozici 221 v exonu 1 a druhou je substituce G->A v pozici 2347 v exonu 3 (obr. 13) . Gen lox-1 standardního typu ječmene kóduje protein z 862 zbytků aminokyseliny [sekvence identifikační číslo: 9], zatímco mutace v pozici 2347 v alele lox-1 linie G způsobuje substituci aminokyseliny z glycinu na aspartovou kyselinou v zbytku 368 v kódovaném proteinu.
• ·
Seřazení příbuzných rostlinných lipoxygenáz naznačuje, že glycin-368 v LOX-1 ječmene, je silně konzervován. Mimoto tento zbytek, který odpovídá glycinu-353 V LOX-1 sóji, je jedním z 51 neutrálních nebo hydrofóbních zbytků, které vyplňují kavitu substrátu enzymu, jak je vidět z jeho krystalické struktury (Minor a kol., Biochemistry, 35, 10 687 až 10 701 (1996)) a je zobrazen na (obr. 22). Vložení elektricky nabitého zbytku aminokyseliny v této pozici tudíž pravděpodobně narušuje strukturální a funkční vlastnosti enzymu.
4. Mutovaný protein LOX-1 kódovaný alelou lox-1 linie G vykazuje nízkou enzymatickou aktivitu a je zodpovědný za fenotyp linie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Mutageneze zrna kultivaru Vintage azidem sodným, který způsobí mutovanou alelu lox-1 v linii G, může vyvolat dodatečné mutace v genomu linie G. Dva experimentální přístupy se přijímají pro demonstraci, že mutantní alela lox-1 v linii G je zodpovědná za její fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy, spíše než jiné mutace v genomu. Enzymatická aktivita LOX-1 kódovaná mutantem a alelou lox-1 standardního typu se stanovuje pro ověření, že substituce glycin-»aspartová kyselina v mutantním enzymu způsobuje sníženou stabilitu a aktivitu. Dva geny lox-1 se dočasně exprimují v aleuronových protoplastech izolovaných z nasáknutého zralého zrna, jelikož se očekává, že úroveň endogenní exprese lipoxygenázy v těchto buňkách je pod limity zjistitelnosti. Žádný z identifikovaných lipoxygenázových genů ječmene, které se exprimují v klíčícím ječmeni, se nezjistí v aleuronové tkáni (van Mechelen a kol., 1999, viz výše). Pro řízení dočasné exprese genu lox-1 v aleuronových protoplastech, se jejich kódující oblasti ·· · ··· · · · ··< • · · • · · * » ·· · * v místě translačně fúzují ke konstitutivnímu promotoru, o kterém je známo, že je v těchto protoplastech aktivní.
Kódující oblasti z mutantu (pozice sekvence od +1 do +4350) a standardního typu genu lox-1 (pozice sekvence od +69 do +4230) a standardního typu cDNA lox-1 (pozice sekvence od +69 do +2654) každý klonovaný v plasmidu pcDNA2.1 (viz část 3), se excizují digerací míst Kpnl a EcoRV v polyspojovníku vektoru. Kódující oblasti se klonují v plasmidu pUBARN (Jensen a kol., Hereditas, 129, 215 až 225 (1998)) mezi konstitutivně aktivním kukuřičným ubichitinovým Ubi promotorem (jak se popisuje v US patentu č. 05510474A) tyčového genu, který kóduje a Nos termihátorem, fosfinotricinacetyltransferázu (obr. 14'
Protoplasty se izolují z aleuronové tkáně nasáknutého Hordeum vulgare (ječmen obecný) kultivar Himalaya podle protokolu z práce od Skriver a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 7266 až 7270 (1991) . Stejné díly z 2 x 105 protoplastů se transfekují při 0 °C s přibližně 100 pg plasmidu DNA (ekvimolární množství z každého plasmidu) pomocí polyethylenglykolem (PEG) zprostředkované absorpce DNA (Lee a kol., Plant. Mol. Biol., 13, 21 až 29 (1997)) a potom se inkUbují v prostředí kultury aleuronových protoplastů při 25 °C jak dříve popsal (Skriver a kol., 1991, viz výše). Po 48 hodinách inkubace se prostředí kultivace opatrně odstraní a protoplasty se resuspendují a homogenizují v 300 μΐ pufru ze zkoušky na lipoxygenázu (0,2 mM borité kyseliny, 25 mM HEPES, pH 6,5).
000 po 5 minut pro
Homogenáty se odstřeďují při 15 peletizaci nerozpustného materiálu a kapaliny nad sedlinou (10 μΐ) se následně zkouší na celkovou aktivitu lipoxygenázy za použití rychlé vyšetřovací zkoušky popsané v příkladu 1, část 1, ale s vynecháním inhibitoru NDGA. Obsah proteinu • · · ·
v protoplastových extraktech se měří pomocí Bradfordova testu vázání barviva (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)), který dodávají Βίο-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornie, USA, a aktivita lipoxygenázy se vyjadřuje na mg proteinu v extraktu.
Protoplasty transfekované s kontrolním plasmidem, pUBI-GUS, kde kukuřičný promotor z ubichiťinu-1 řídí expresi reportérového genu β-glukoronidázy, vykazují nezjistitelndu aktivitu lipoxygenázy. Dočasné exprese standardního typu genu lox-1 a cDNA v protoplastech poskytují obě vysoké úrovně aktivity lipoxygenázy v protoplastových extraktech (obr. 15) . Vyšší exprese cDNA standardního typu lox-1 ve srovnání s genomickou sekvencí se může uskutečnit z důvodu vyšší četnosti transfekce pokud jde o menší plasmid exprese cDNA lox-1 (4929 párů bází proti 6505 párům bází konstruktu genu lox-1). Dočasná exprese mutantu genu lox-1 poskytuje nízké hladiny aktivity lipoxygenázy, přibližně 10 % aktivity lipoxygenázy standardního typu. Tyto údaje jasně demonstrují, že mutantní gen lox-1 v linii G kóduje lipoxygenázu se značně sníženou aktivitou, která odpovídá fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy.
Příklad 4
PCR-zkouška štěpením amplifikovaného polymorfního místa (PCR-CAPS): Metoda používaná pro identifikaci mutantu genu lox-1
Analytická metoda umožňující identifikaci mutantního genu lox-1 linie G v jakémkoliv genetickém profilu se vyvinula na základě zkoušky PCR-CAPS. Zkouška zahrnuje PCR amplifikaci genomických fragmentů DNA, po které následuje digerace amplifikovaných sekvencí specifickou restrikční endonukleázou pro znázornění polymorfie délky restriktů (RFLP).
·· ·· • · · ♦
Kódující sekvence z mutantního genu lox-1 přechovává dvou bodové mutace (viz příklad 3), kde mutace v pozici 2347 (obr. 12) zavádí dodatečné místo štěpení restrikční endonukleázou Aat II, které se nezjistí v genu lox-1 standardního typu (obr. 16). Ukazuje se, že podle zkoušky PCR-CAPS, založené na polymorfismu vytvořeném přítomností tohoto restrikčního místa v genu lox-1, se rozlišuje mezi standardním typem genu lox-1 a mutovaným genem lox-1.
Genomická DNA se izoluje z mladých listů sadby M6 Hordeum vulgare, L. kultivaru Vintage a linie G podle postupu od autorů Pich a Schubert (1993, viz výše). Sekvence DNA obsahující pozici 2347 (místo mutace genu lox-1 linie G) se amplifikuje pomocí PCR, za použití primerů specifických pro gen lox-1 [sekvence identifikační číslo: 8] . Fragmenty DNA amplifikované vybraným původním primerem 5'—CGCTACGACGTCTACAACGA-3' [sekvence identifikační číslo: 13] a reverzním primerem 5'—CAGACTACTTTTTGGCGGGA-3' [sekvence identifikační číslo: 14] jsou zobrazeny na obr. 17. PCR reakce se provádějí s 250 ng genomické DNA v 50-μ1 objemu obsahujícím 50 pmol každého primeru a 1 jednotku Taq DNA polymerázy (Promega) podle instrukcí dodavatele. PCR amplifikace se provádějí na přístroji Stratagene Robocykler následovně: 1 minuta při 94 °C, cyklus; 1 minuta při 94 °C, 1,5 minuty při 60 °C a 2 minuty při 72 °C, 30 cyklů; 10 minut při 72 °C, 1 cyklus. Amplifikované fragmenty mutantu a standardního typu genu lox-1 jsou přibližně 650 párů bází
17) .
se restrikční endonukleázy Aat II po 24 hodin při 37 °C a analyzují se na 1,2% agarovém gelu.
(obr. 18), odpovídajících Produkty PCR, čištěné na digerují s 25 jednotkami očekávané velikosti (obr. spinové koloně (Qiagen), • ·· ·
y|C ; · · · * ··· 9 9 9 λ »4 · · · · · < »
999 9999 99 99 99 99
Digerací PCR produktu standardního typu lox-1 získané fragmenty DNA z 10, 179 a 462 párů bází, a fragmenty z PCR produktu mutantního lox-1 jsou 10, 149, 179 a 313 párů bází, kde další fragmenty DNA jsou způsobeny částečnou digerací PCR produktu lox-1 (obr. 19). Fragmentový model odpovídá očekávané polymorfii délky restriktů (RFLP) pocházející z této mutace, kde fragment z 313 párů bází je jedinečný vzhledem k mutantu lox-1. Tato zkouška PCR-CAPS poskytuje reprodukovatelný a specifický nástroj pro identifikaci alely lox-1 v ječmeni a může tudíž být využita v šlechtitelských programech ječmene zaměřených na zavedení tohoto genu do nových odrůd ječmene.
Příklad 5
Zpětné křížení fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy z linie G s kultivarem Alexis demonstruje genetické spojení s mutantním genem lox-1
Opakované zpětné křížení se používá k přenosu fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy z linie G do opakujícího se rodiče (v tomto případě kultivaru Alexis). Program zpětného křížení zobrazený na obr. 20, kombinovaný se selekcí pokud jde o fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy, progresivně substituuje genom linie G pomocí opakujícího se mateřského genomu. Mimoto sé odstraní další mutace zavedené do genomu linie G během mutagenního působení azidu sodného. V prvním zpětném křížení homozygotní linie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy (označené genotyp 11) s kultivarem Alexis (označeném genotyp LL) jsou linie potomstva heterozygotní (označené genotyp Ll). Fenotyp s nízkou aktivitou lipoxygenázy z důvodu recesivní mutace není zjistitelný v liniích heterozygotních pokud jde o mutaci. Potomstva jsou samoopylovaná a dávají normální mendeliánské rozdělení populace, totiž 1 LL : 2 Ll : 1 11. Homozygotní genotyp 11 • 99 ·· 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ♦ ••♦•9 99»
AS · ···· 9·· 9 9 9 9
4θ ·· ·· 9 9 9 9 9 • 99 9999 99 ·« 99 9· s nízkou aktivitou lox pocházející z prvního křížení bude vykazovat 50 % genetického profilu kultivaru Alexis. Po 10 kolech zpětného křížení, tvoří opakující se mateřský profil přibližně 99,9 %.
Hordeum vulgare, L. kultivar Alexis a linie G se během programu zpětného křížení pěstují ve skleníku. Zrna zpětně kříženého potomstva se klíčí v Petriho miskách na filtračním papíru, nasáklém 4 ml vody po 3 dny při 22 °C ve tmě. Linie s nízkou aktivitou Lipoxygenázy se zjišťují pomocí měření celkové aktivity lipoxygenázy v extraktech ze špiček listů (coleoptile) (špička 7 mm) z klíčících sazenic, jak se popisuje v příkladu 1. Potomstvo z 3. a 4. zpětného křížení se také analyzuje pokud jde o dědičnost mutantního genu lox-1 za použití zkoušky PCR-CAPS popsané v příkladu 4.
Očekávaná četnost fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy v rozdělení potomstva ze čtyř generací zpětného křížení je 25 % pokud jde o recesivní mutaci. Pozorovaná četnost nízké aktivity lipoxygenázy v potomstvu (24 zrn) ze čtyř generací zpětného křížení je v souladu s očekávanou četností (obr. 20). Když se analyzuje potomstvo z 3. a 4. zpětného křížení, které vykazuje homozygotní genotyp 11 s nízkou aktivitou lox, pomocí zkoušky PCR-CAPS, zjistí se, že všechno obsahuje diagnostiqký fragment o 313 párech bází, zatímco v potomstvu, které vykazuje standardní typ aktivity lipoxygenázy tento fragment chybí (obr. 21).
Program zpětného křížení demonstruje, že mutantní alela lox-1 může být převedena do nového genetického profilu a je zděděna v recesivním monofaktoriálním způsobu, který sleduje mendeliánské rozdělení. Jelikož opakující se mateřský základ je 93,8 % v potomstvu ze 4. zpětného křížení, společná ·* ·· • 9 * · • · · ·
9 999
9 9
9 9« dědičnost mutantního genu lox-1 a fenotypu s nízkou aktivitou lipoxygenázy poskytuje potvrzení jejich genetického spojení.
Příklad 6
Pivo vařené z ječmenného sladu z linie G akumuluje během skladování méně trans-2—nonenalu, což poskytuje zlepšenou stabilitu chuti a vůně
Hordeum vulgare, L. kultivar Vintage a linie G se pěstují na poli po několik sezón pro získání dostatku zrna pro průmyslové sladování. Provádějí se následující zkušební sladování a vaření v průmyslovém měřítku stejně jako analýza hotového piva pro demonstraci hodnoty ječmene linie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy pro zlepšenou stabilitu chuti a vůně.
1. Průmyslové sladování a hvozdění linie G a kultivaru
Vintage
Sladování se prdvádí v 10-tunovém měřítku v průmyslových sladovnách ve dvou zkušebních sladováních podle následujícího:
Zkušební sladování 1: Zrno ječmene linie G (sklizeň 1996)
Podmínky máčení: 8 hodin zvlhčování; 14 hodin sušení; 8 hodin zvlhčování; 10 hodin sušení; 4 hodiny zvlhčování při teplotě zvlhčovači vody 16 °C. Podmínky sladování: 12 hodin při 18 °C; 24 hodin při 16 °C; 24 hodin při 14 °C; 60 hodin při 12 °C. Podmínky hvozdění: 12 hodin při 60 °C; 3 hodiny při 68 °C;
hodiny při 74 °C; 3 hodiny při 80 °C.
Zkušební sladování 2: Kultivar Vintage a linie G (sklizeň
1996/1997)
Podmínky máčení: 8 hodin zvlhčování; 10 hodin sušení; 6 hodin zvlhčování; 15 hodin sušení; 4 hodiny zvlhčování při teplotě zvlhčovači vody 15 °C. Podmínky sladování: 5 dní s přívodem vzduchu při 15 °C a sprejováním pro udržení hladiny vlhkosti. Podmínky hvozdění: 10 hodin při 50 °C; 2,5 hodiny při 80 °C.
Analýzy sladování ze 2 vzorků sladu z linie G ze zkušebního sladování 1 ve srovnání s kontrolním sladem, kultivar Nevada (tabulka 1) a ze zkušebního sladování 2 ve srovnání s kultivarem Vintage (tabulka 2) potvrzuje, že slad z linie G je vhodný pro zkušební vaření.
Tabulka 1
Zkoušební sladování 1
Odrůda ječmene kultivar Nevada linie G linie G
Rok sklizně 1996 1996 1996
Analýza sladu
Obsah vlhkosti o. o 4,7 4,3 4,4
Čistota extraktu jako is. % ai. 76, 9 76,1 75,3
Čistota extraktu d .m. % dm. 81,4 79,5 78,7
Čas zcukernatění min. <10 <10 <10
• ·· · • · • 9 • ·««·
Tabulka 1 - pokračování tabulky
Diastatická mohutnost % WK 252 373 365
Barva EBC 2,8 4,4 3,8
pH 6,16 5, 97 5,99
Turbidita EBC 9,0 2,5 2,4
Celkový obsah proteinu d.m. Q. 6 10,35 10,74 12,03
Rozpustný dusík mg/1 647 787 765
Rozpustný protein % d.m. sladu % dm. 3,7 4,4 4,3
Kolbach 35,3 40, 8 35, 4
Volný aminový dusík mg/1 97 125 118
Sypkost o o 89,5 85, 6 89,5
Celkově neupravovaná zrna 0, O 1,1 0,6 0,5
Částečně neupravovaná zrna % 2,3 1,0 0, 6
Beta-glukan v mladině mg/1 114 66 36
Beta-glukan ve sladu % obj em/obj em 0,24 0,11 0, 05
• ·
44 4
Tabulka 1 - pokračování
S-methyl- methionin/ ekv. DMS pg/g 2,4 6, 4 8,4
Volný DMS pg/g 1,0 6, 6 4,7
NDMA pg/kg nezjištěno 0,3/0,6 0,3/0,3
Tabulka 2
Zkoušební sladování 2
Odrůda ječmene Vintage linie G linie G
Rok sklizně 1996 1996 1997
Obsah vlhkosti % 4,1 4,1 4,3
Čistota extraktu jako is. % ai. 77,0 75, 6 77,5
Čistota extraktu d.m. % dm. 80,3 78,8 80, 9
Čistota/rozdíl od surového % dm. 0,7 1,6 1,7
Doba zcukernatění min. <10
Diastatická mohutnost % WK 343 342 268
Barva EBC 2,5 2,8 3,4
PH 6, 05 6, 01 6,12
Turbidita EBC 1,5 1,3 2, 5
Celkový protein d.m. O O 10, 98 12,22 9, 82
•4 · 44 4 • · 4 4 · · 9 9 4 • 44·· 44 · • 4 4 4 44« 444 4
44 4 4444 • 444 44 44 44 4«
Tabulka 2 - pokračování
Rozpustný dusík mg/1 696 741 610
Rozpustný protein % d.m. sladu % dm. 3,9 4,1 3,4
Kolbach 35, 2 33,7 34,6
Volný aminový dusík mg/1 110 117 100
Sypkost g, *o 91,3 81,8 89,5
Celkově neupravovaná zrna o ~o 0,7 1,1 1,3
Částečně neupravovaná zrna o. o 1,0 2,7 2,7
Beta-glukan v mladině mg/1 97 172 117
Beta-glukan ve sladu o. o obj em/obj em 93
S-methyl- methionin/ekv. DMS pg/g
Volný DMS pg/g - -
2. Průmyslové vaření se sladem z linie G, kultivaru Vintage a kontrolním sladem z kultivaru Nevada
Provedou se dvě zkušební vaření za použití mladiny připravené z linie G a kontrolního sladu z kultivaru Nevada při pokusu 1 a z linie G a kontrolního sladu z kultivaru
Vintage při pokusu 2.
·· ····
Pivo se vaří v 30-hl průmyslovém měřítku se 475 kg sladu podle následujícího schématu: vystírání při 50 °C; 30 minut při 50 °C; 30 minut zahřívání z 50 na 70 °C; 15 minut při 70 °C. Část mladiny se zahřívá po 20 minut ze 70 na 100 °C a 5 minut při 100 °C, zatímco hlavní část rmutu se udržuje na 70 °C po dalších 25 minut a potom se obě části rmutu spojí a udržují se 10 minut na 70 °C. Kroky procesu vaření při vaření mladiny, separace spotřebovaného zrna vířením, chlazení, fermentace, dokvášení a plnění do lahví z hnědého skla se provádějí podle standardní praxe při procesu vaření.
3. Stabilita chuti a aroma a obsah T2N v pivu vařeném z linie G, ze sladu z kultivaru Vintage a kontrolního sladu z kultivaru Nevada
Čerstvě uvařené pivo se skladuje při 5 °C a analyzuje se V průběhu 2 měsíců od výroby. Chuťová a aromatická stabilita čerstvého a skladovaného piva se hodnotí ve dvou nezávislých laboratořích a sledují se dva různé typy podmínek skladování piva. V laboratoři A se pivo vystaví procesu nuceného stárnutí, kde se pivo skladuje při 37 °C po dobu 7 dní, zatímco v laboratoři B se pivo skladuje při 30 °C po 6 až 12 týdnů. Hladiny trans-2-nonenalu v pivu se stanovují pomocí plynové chromatografie a detekcí hmotovou spektrometrií, které sledují derivatizaci karbonylů s O-(2,3,4,5,β-pentafluorbenzyl)hydroxylaminem, který v podstatě popisuje Grónguist a kol., Proceedings of 24th EBC Congress, Oslo, 421 až 428 (1993). Zkušená skupina· degustátorů piva hodnotí celkové chuťové a aromatické skóre piva, což zahrnuje zjištění příchuti a vůně zatuchliny, naznačující přítomnost trans-2-nonenalu v pivu.
Laboratoř A: Přípustná odchylka při stárnutí piva • · ·* ··«· » *» ·* ···* · · · · · · · cl · * * · ♦ ··· · * · ·
JJ * · ·· 9 9 9 9 9
999 9999 99 ·« 99 ·«
Srovnání piva vařeného z linie G a piva z kontrolního sladu z kultivaru Nevada, při prvním zkušebním vaření (tabulka 3) demonstruje, že pivo z linie G vykazuje vyšší chuťovou a aromatickou stabilitu a nižší obsah trans-2-nonenalu při sledování piva nucené stárnoucího ve srovnání s kontrolními. Při druhém pokusu srovnání piva vařeného ze sladu z linie G s pivem vařeným ze sladu z kultivaru Vintage, mateřského kultivaru, potvrzuje počáteční hodnoty (tabulka 4).
Tabulka 3
Zkušební vaření 1
Slad z ječmene kultivar Nevada Linie G
Oxid siřičitý, obsah (mg/ml) 1 1
T2N*’ (částí na miliardu (ppb)) - čerstvě uvařené pivo 0,009 0, 005
T2N” (částí na miliardu (ppb)) - nucené stárnoucí pivo (37 °C/7 dní) 0,117 0,025
Chuť a vůně* - čerstvé pivo 5,9 5, 3
Chuť a vůně - nucené stárnuté pivo (37 °C/7 dní) 1,3 5,1
★ ' r - 1 O -T- ' ' 1 ... - - _ , „ . . ,
Stupnice hodnocení chuti a vůně 1 až 10 podle zvyšující se kvality;
** trans-2~nonenal »· 4 44 4 ·· 44 4«
4444 *4 4 » · « *·· 4 4« 4
4« 4 444«
44*4 44 4« 44 44
Tabulka 4
Zkušehní vaření 2
Slad z ječmene kultivar Vintage Linie G
Obsah oxidu siřičitého (mg/ml) 2 2,5
T2N** (částí ná miliardu (ppb)) - čerstvě uvařené pivo 0,023 0,019
T2N** (částí na miliardu (ppb)) - nuceně stárnuté pivo (37 °C/7 dní) 0,078 0,035
Chuť a vůně* - čerstvé pivo 5, 5 6,1
Chuť a vůně* - nuceně stárnuté pivo (37 °C/7 dní) 2,9 5,9
Stupnice hodnocení chuti a vůně 1 až 10 podle zvyšující se kvality;
** trans-2-nonenal
Laboratoř B: Přípustná odchylka při skladování při 30 °C
Pivo vařené ze sladu z linie G vykazuje nižší hladiny trans-2-nonenalu po 6 a 12 týdnech skladování při zvýšené teplotě 30 °C, když se srovnává s pivem vařeným z jednoho z referenčnícho sladů (tabulka 5 a 6) a má lepší chťovou a aromatickou stabilitu jak soudí degustační skupina. Práh chuťové zjistitelnosti pro trans-2-nonenal v těchto analyzovaných pivech leží blízko 0,08 částí na miliardu (ppb).
Φ· φφ φφφφ ♦ · •
φ φ φ
φφφφφ
5« φφ φφφφ φ φφφφ « φ φ φφφ · · • · « φ φ
φφ
Tabulka 5
Zkušební vaření 1
Slad z ječmene kultivar Nevada linie G
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - čerstvě uvařené pivo 0, 050 0,044
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - 30 °C/6 týdnů 0, 072 0, 037
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - 30 °C/12 týdnů 0, 095 0, 046
Trans-2-nonenal chuť a aroma* - čerstvě uvařčné pivo 0, 6 0,3
Trans-2'-nonenal* - 30 °C/6 týdnů 3,7 1,4
Trans-2-nonenal’ - 30 °C/12 týdnů 2,5 0, 6
* ·· 1 ο skoré z detekce chuti a vune trans-2-nonenalu na stupnici 1 až 10
9 9 ·· · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 999999 9 ·
9 · · 9 9999
9999999 99 99 9 9 99
Tabulka 6
Zkušební vaření 1
Slad z ječmene kultivar Vintage linie G
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - čerstvě uvařené pivo 0,070 0, 062
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - 30 °C/6 týdnů 0,093 0, 070
Trans-2-nonenal (částí na miliardu) - 30 °C/12 týdnů 0,133 0, 080
Trans-2-nonenal chuť a aroma* - čerstvě uvařené pivo 0,3 0,9
Trans-2-nonenal* - 30 °C/6 týdnů 2,5 1,7
Trans-2-nonenal - 30 °C/12 týdnů 2,2 1,3
skóre z detekce chuti a vůně trans-2-nonenalu na stupnici 1 až 10
Zlepšená stabilita aroma a chuti piva uvařeného ze sladu z linie G, jak se změří pomocí hladin trans-2-nonenalu zjištěných v pivu po skladování při 30 °C ze zkušebního vaření z kombinovaného sladu, se ukazuje jako statisticky významná (tabulka 7) .
Tabulka 7
Trans-2-nonenal v skladovaném pivě
Čerstvé Průměr Standardní odchylka Rozdíl 2-chvostý protein Významný (p<0,05)
Referenční 0,060 0,012 0,007 0,34 ne
Linie G 0, 053 0, 011
6 týdnů, 30 °C Průměr Standardní odchylka Rozdíl 2-chvostý protein Významný (p<0,05)
Referenční 0,083 0,013 0,029 0,003 ano
Linie G 0,054 0,021
12 týdnů, 30 °C Průměr Standardní odchylka Rozdíl 2-chvostý protein Významný (p<0,05)
Referenční 0,114 0, 023 0, 051 0, 003 ano
Linie G 0,063 0, 020
Jelikož přírodní hladiny sulfitu jsou nízké v obou zkušebních vařeních, hladiny volného trans-2-nonenalu v pivě podrobeném stárnutí velmi věrně odrážejí trans-2-nonenalový potenciál různých piv, hlavně hladinu produktů adice trans-2-nonenalu přítomných v čerstvém pivě. Přidání sulfitu může dočasně pozdržet postup zvětrávání, pomocí zabudování trans-2-nonenalu do komplexu, dokud hladiny sulfitu nesníží oxidace způsobená výměnou plynů skrz obal.
Popsaná zkušební vaření se sladem z ječmene s nízkou aktivitou LOX-1 poskytují první nepochybný důkaz, že aktivita LOX-1 v ječmeni během sladování a procesu vaření je klíčovým determinantem výskytu sloučeniny s nestandardní chutí a vůní trans-2-nonenalu v pivě podrobeném stárnutí.
Výše uvedené popisy zahrnují citace z řady publikací.
Každá publikace je zde pro všechny případy zahrnuta formou odkazu, jakoby byla plně vyložena.

Claims (36)

1. Rostlina ječmene nebo její část, která obsahuje mutantní protein LOX-1, rostlina nebo její část charakterizovaná snížením nebo absencí aktivity lipoxygenázy ve srovnání s nemutovanou kontrolní rostlinou nebo její částí.
Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 1, vyznác u j x c x se katalýzu oxidace tím, že aktivita lipoxygenázy zahrnuje volných nebo esterifikovaných polynenasycených mastných kyselin a polynenasycených oktadekanových mastných kyselin na formu derivátů 9-hydroperoxy mastné kyseliny.
3. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein LOX-1 je kódován mutovanou sekvencí nukleové kyseliny lox-1, která obsahuje jednu nebo více mutací.
4. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená jedna nebo více mutací jsou způsobené chemickou mutagenezí nebo ozařováním.
5. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená jedna nebo více mutací jsou způsobené místně cílenou mutagenezí.
6. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená jedna nebo více mutací jsou umístěny v promotorové nebo přepisované oblasti sekvence nukleové kyseliny lox-1.
• · · · cn · · ·· ····«* « · · · 99 9 9999 ··· ···· 9* 99 99 99
7. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený mutantní protein LOX-1 obsahuje kyselé, bazické nebo polární substituce aminokyseliny v jednom nebo více konzervovaných neutrálních nebo hydrofóbních zbytků aminokyseliny vyplňujících kavitu substrátu LOX-1 standardního typu ječmene.
8. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený mutantní protein LOX-1 obsahuje sekvenci aminokyseliny identifikačního čísla sekvence: 12, ve které Xaa je kyselá, bazická nebo polární aminokyselina.
9. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 8, vyznačující se tím, že Xaa je glutamová kyselina nebo aspartová kyselina.
10. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 9, vyznačující se tím, že Xaa je aspartová kyselina.
11. Transgenická rostlina ječmene nebo její část obsahující heterologní sekvenci nukleové kyseliny exprimující antimediátorovou sekvenci do při nejmenším části přepisované oblasti genu lox-1 ječmene, přičemž heterologní sekvence je nahodile připojena k promotorové sekvenci genu a terminátorové sekvenci transkripce.
12. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený promotorový gen řídí konstitutivní expresi antimediátorové sekvence.
9 9 • · • · · ·
13. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku
11, vyznačující se tím, že uvedený promotorový gen řídí tkáňově-specifřekou nebo dočasně-regulovanou expresi nahodile připojené antimediátorové sekvence v tkáních rostliny.
14. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená tkáň je vyvíjející se, klíčící nebo plně vyvinutou zárodečnou tkání.
15. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku
11, vyznačující se tím, že uvedená promotorova sekvence genu je promotorový gen lox-1 ječmene nebo jeho část.
16. Zrno nebo rostlina z potomstva vyprodukovaná z rostliny ječmene nebo její části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
17. Rostlinný produkt vyrobený z rostliny ječmene nebo její části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 nebo ze zrna nebo rostliny z potomstva podle nároku 16.
18. Rostlinný produkt podle nároku 17, vyznačuj ící se t í m, že produktem je slad.
19. Nápoj připravený za použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 17 až 18.
20. Pivo vyrobené za použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 17 až 18.
21. Použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 17 až 18 pro přípravu nápoje, který představuje organoleptické kvality, které zůstávají stabilní po měřené časové období nebo při zvýšených teplotách skladování ve srovnání s nápojem připraveným z rostlinného produktu z nemutované kontrolní rostliny nebo její části.
22. Použití rostliny j ečmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 pro přípravu nápoje. 23. Použití rostliny j ečmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 pro výrobu sladu nebo piva. 24. Použití rostliny j ečmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 pro stabilizaci organoleptických
vlastností produktu získaného vařením po měřené časové období ve srovnání s kontrolním produktem získaným vařením vyrobeným za použití nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
25. Použití rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 pro výrobu produktu získaného vařením, který po měřené časové období nebo za podmínek zvýšené skladovací teploty vykazuje snížené hladiny volného trans-2-nonenalu ve srovnání s kontrolním produktem získaným vařením vyrobeným za použití nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
·· 44 44 44 • 4 4 4 4 4 4 • · 4 4 444 44 4 • · 4 4 4 4 ··· 44 44 4»
26. Nápoj vyrobený z rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že po měřené časové období nebo za podmínek zvýšené skladovací teploty vykazuje snížený obsah trans-2-nonenalu ve srovnání s kontrolním nápojem vyrobeným z nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
27. Nápoj podle nároku 26, vyznačující se tím, že nápojem je pivo.
• ·· ·
63 .
• 9 ·« 4 ♦ · · · * • · · < · · · · · · 9 • · · · •» ·· «
NÁROKY část obsahující mutovaný c í se t í m, že nebo části rostliny je s nemutovanou kontrolní podle nároku 1, vyznáDOPLNĚNÉ PATENTOVÉ
1. Rostlina ječmene nebo její protein LOX-1, vyznačují aktivita LOX-1 v uvedené rostlině snížena nebo chybí ve srovnání rostlinou nebo její částí.
2. Rostlina ječmene nebo její část čující se tím, že aktivita LOX-1 zahrnuje katalýzu oxidace volných nebo esterifikovaných polynenasycených mastných kyselin a polynenasycených oktadekanových mastných kyselin na formu derivátů 9-hydroperoxy mastné kyseliny.
3. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že protein LOX-1 je kódován pomocí mutované sekvence nukleové kyseliny lox-1, která obsahuje jednu nebo více mutací.
4. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3, vyznačující se tím, že jedna nebo více mutací je způsobena chemickou mutagenezí nebo ozařováním.
5. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že uvedená jedna nebo více mutací je/jsou způsobené místně cílenou mutagenezí.
6. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že jedna nebo více mutací • · · · jsou umístěny v promotorové nebo přepisované oblasti sekvence nukleové kyseliny lox-1.
7. Rostlina ječmene nebo její část podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že mutace je nukleotidovou substitucí v pozici +2347 genu lox-1.
8. Rostlina ječmene nebo její část podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje kyselé, bazické nebo polární substituce aminokyseliny v jedné nebo více konzervovaných neutrálních nebo hydrofóbních zbytcích aminokyseliny, které vyplňují kavitu substrátu LOX-1 ze standardního typu ječmene.
9. Rostlina ječmene nebo její část podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekónzervativní substituce aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytků aminokyseliny z LOX-1 standardního typu ječmene: Y224, L268, W355, E364 , G368, V369, N370, 1374, L424, L499, K5OI, A502, V504,
D5O8, 3509, H512, 0513, L514, H517, W518, H522, 1556, L559, A56O, L564,
1565, 1570, T574, S585, Q?15, Y718, N724, R725, P?26z T727, L772 a Ιθ62.
10. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje sekvenci aminokyseliny zobrazenou jako sekvence identifikační číslo: 12, ve které Xaa je kyselá, bazická nebo polární aminokyselina.
11. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 10, vyznačující se tím, že Xaa je glutamová kyselina nebo aspartová kyselina.
• ·* · • ·
12. Rostlina ječmene nebo její část podle nároku 11, vyznačující se t í m, že Xaa je aspartová kyselina.
13. Rostlina ječmene nebo její část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekonzervativní substituci aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytků aminokyseliny z LOX-1 standardního typu ječmene: H517, H522,
H7O8, N712 a Í862 .
14. Rostlina ječmene nebo její část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekonzervativní substituci aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytků aminokyseliny z LOX-1 standardního typu ječmene: H261, H512,
H775, F259, F267, F713, W518, R551, R725, D778 a K273.
15. Transgenická rostlina ječmene nebo její část obsahující heterologní sekvenci nukleové kyseliny exprimující antimediátorovou sekvenci do při nejmenším části přepisované oblasti genu lox-1 ječmene, přičemž heterologní sekvence je nahodile připojena k promotorové sekvenci genu a terminátorové sekvenci transkripce.
16. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku
15, vyznačující se tím, že uvedený promotorový gen řídí konstitutivní expresi antimediátorové sekvence.
17. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že uvedený promotorový gen řídí tkáňově-specifickou nebo dočasně regulovanou expresi nahodile připojené antimediátorové sekvence v tkáních rostliny.
18. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedená tkáň je vyvíjející se, klíčící nebo plně vyvinutou zárodečnou tkání.
19. Transgenická rostlina ječmene nebo její část podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedená promotorové sekvence genu je promotorovy· gen lox-1 ječmene nebo jeho část.
20. Zrno nebo rostlina z potomstva vyprodukovaná z rostliny ječmene nebo její části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19.
21. Rostlinný produkt vyprodukovaný z rostliny ječmene nebo její části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 nebo ze zrna nebo rostliny z potomstva podle nároku 20.
22. Rostlinný produkt podle nároku 21, vyznačuj ící se t í m, že produktem je slad.
23. Nápoj připravený za použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 21 až 22.
24. Pivo vyrobené za použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 21 až 22.
25. Použití rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 21 až 22 pro přípravu nápoje, který předvádí organoleptické kvality, které zůstávají stabilní po měřené časové období nebo při zvýšených teplotách skladování ve srovnání s nápojem ·· ····
67 ·ί· ·:λ připraveným z rostlinného produktu z nemutované kontrolní rostliny nebo její části.
26. Použití rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22 pro přípravu nápoje. 27. Použití rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků : 1 až 22 pro výrobu sladu nebo piva. 28. Použití rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22 pro stabilizaci organoleptických vlastností uvařeného produktu po měřené časové období ve srovnání s kontrolním vařeným produktem vyrobeným za použití
nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
29. Použití rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22 pro výrobu produktu získávaného vařením, který po měřené časové období nebo za podmínek zvýšené skladovací teploty vykazuje snížené hladiny volného trans-2-nonenalu ve srovnání s kontrolním produktem získávaným vařením vyrobeným za použití nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
30. Nápoj vyrobený z rostliny ječmene nebo její části, zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, vyznačující se tím, že po měřené časové období nebo za podmínek zvýšené ·· ··· ·
9 9
9 9 • 99 9 9 skladovací teploty vykazuje snížený obsah trans-2-nonenalu ve srovnání s kontrolním nápojem vyrobeným z nemutované rostliny ječmene nebo její části, nemutovaného zrna nebo rostliny z potomstva nebo rostlinného produktu.
31. Nápoj podle nároku 26, vyznačující se tím, že nápojpm je pivo.
32. Způsob pro výrobu piva z ječmene, vyznačuj ící se t í m, že ječmen nebo jeho část obsahuje mutovaný protein LOX-1, ve kterém aktivita LOX-1 uvedené rostliny nebo její části je snížená nebo chybí ve srovnání s nemutovaným kontrolním ječmenem nebo jeho částí.
33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje kyselou, bazickou nebo polární substituci aminokyseliny v jednom nebo více konzervovaných neutrálních nebo hydrofóbních zbytcích aminokyseliny vyplňujících kavitu substrátu LOX-1 standardního typu ječmene.
34. Způsob podle nároku 32 nebo 33, vyznačuj ici se t í m, že uvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekonzervativní substituce aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytku aitnnoky ječmene: Y224, L268, W355, E304,
K501, A502, V504, D508, S509, H512, L559, A56O, L564, 1565, 1570, T574, T727, L772 a 1862 -
eliny z LOX-1 standardního typu
G368, V369, N370, 1374 , L424 , L499 £>513, L514, H517, W518, H522, 1556 S585, Q715, Y718, N724, R725, P726
35. Způsob podle kteréhokoliv čující se tím, že nároků 32 až 34, vyznáuvedený mutovaný protein LOX-1 obsahuje sekvenci aminokyseliny zobrazenou jako sekvence »· «9* · ** 9« • · · · · · *9 • · · · · · · • * · · ·«« · 9 9 • · · · 9 · • ··«<> ·9 <a identifikační číslo: 12, ve které Xaa je kyselá, bazická nebo polární aminokyselina.
36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že Xaa je glutamová kyselina nebo aspartová kyselina.
37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že Xaa je aspartová kyselina.
38. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekonzervativní substituci aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytků aminokyseliny z LOX-1 standardního typu ječmene: H517, H522, H708, N712 a 1862 .
39. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že mutovaný protein LOX-1 obsahuje nekonzervativní substituci aminokyseliny v jednom nebo více z následujících zbytků aminokyseliny z LOX-1 standardního typu ječmene: H261, H512, H775, F259, F267, F713, W518, R551, R725, D778 a K273.
CZ20031872A 2000-12-29 2001-01-22 Jecmen s nízkou aktivitou lipoxygenázy-1 CZ298689B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/751,687 US6660915B2 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Low lipoxygenase 1 barley
PCT/IB2000/002045 WO2002053720A1 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Low-lipoxygenase 1 barley

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20031872A3 true CZ20031872A3 (cs) 2003-11-12
CZ298689B6 CZ298689B6 (cs) 2007-12-19

Family

ID=26318622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031872A CZ298689B6 (cs) 2000-12-29 2001-01-22 Jecmen s nízkou aktivitou lipoxygenázy-1

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP2305797A3 (cs)
JP (1) JP5004402B2 (cs)
CN (1) CN100372930C (cs)
AT (1) ATE531794T1 (cs)
BG (1) BG66243B1 (cs)
BR (1) BR0116579A (cs)
CA (1) CA2433250C (cs)
CZ (1) CZ298689B6 (cs)
DK (1) DK1346030T3 (cs)
EA (1) EA007955B1 (cs)
EE (1) EE05567B1 (cs)
ES (1) ES2376415T3 (cs)
HU (1) HUP0401290A3 (cs)
NZ (1) NZ527171A (cs)
PL (1) PL208246B1 (cs)
PT (1) PT1346030E (cs)
SK (1) SK9372003A3 (cs)
UA (1) UA88130C2 (cs)
WO (1) WO2002053721A1 (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4113795B2 (ja) * 2003-03-25 2008-07-09 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
US7420105B2 (en) * 2004-03-11 2008-09-02 Carlsberg A/S Barley for production of flavor-stable beverage
US9587210B2 (en) 2008-12-03 2017-03-07 Carlsberg Breweries A/S Energy saving brewing method
MX2011005619A (es) 2008-12-03 2011-09-09 Carlsberg Breweries As Bebidas derivadas de cebada y malta con niveles bajos de sulfuro de dimetilo.
SA109310019B1 (ar) 2008-12-30 2014-09-10 Carlsberg Breweries As شعير له نشاط ليبوأوكسجيناز منخفض
WO2011074964A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Keygene N.V. Improved bulked mutant analysis
CN103209584B (zh) 2010-06-03 2014-10-29 嘉士伯酿酒有限公司 节能酿造方法
JP2017205038A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP2017205036A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP6691826B2 (ja) * 2016-06-01 2020-05-13 サッポロビール株式会社 蒸留酒類
RS67705B1 (sr) 2016-07-01 2026-02-27 Carlsberg Breweries As Prerađena pića zasnovana na žitaricama
CN106405024B (zh) * 2016-08-25 2018-08-24 青岛啤酒股份有限公司 一种评价麦芽脂质氧化程度的方法
ES2986024T3 (es) 2017-12-28 2024-11-08 Carlsberg As Métodos rápidos para preparar extractos de cereales
UA128208C2 (uk) 2017-12-28 2024-05-08 Карлсберг А/С Спосіб одержання водного екстракту зернової культури та спосіб одержання напою
EP3784058A1 (en) 2018-04-25 2021-03-03 Carlsberg A/S Barley based beverages
CN111718974B (zh) * 2020-06-29 2021-09-24 中食都庆（山东）生物技术有限公司 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
AU7443596A (en) * 1995-10-13 1997-04-30 Purdue Research Foundation Improvement of fruit quality by inhibiting production of lipoxygenase in fruits
US5844121A (en) 1996-01-19 1998-12-01 The Texas A & M University System Method of inhibiting mycotoxin production in seed crops by modifying lipoxygenase pathway genes

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0401290A2 (hu) 2004-09-28
WO2002053721A1 (en) 2002-07-11
DK1346030T3 (da) 2012-02-13
EP1346030B1 (en) 2011-11-02
UA88130C2 (uk) 2009-09-25
PT1346030E (pt) 2012-02-08
NZ527171A (en) 2005-07-29
CA2433250A1 (en) 2002-07-11
HUP0401290A3 (en) 2005-06-28
CA2433250C (en) 2015-08-11
EP2305797A3 (en) 2011-07-13
CZ298689B6 (cs) 2007-12-19
BR0116579A (pt) 2004-04-20
ES2376415T3 (es) 2012-03-13
PL363480A1 (en) 2004-11-15
EA200300743A1 (ru) 2004-02-26
CN1487995A (zh) 2004-04-07
JP2004522434A (ja) 2004-07-29
CN100372930C (zh) 2008-03-05
EE200300257A (et) 2003-10-15
PL208246B1 (pl) 2011-04-29
ATE531794T1 (de) 2011-11-15
BG107971A (bg) 2004-09-30
SK9372003A3 (en) 2004-05-04
EA007955B1 (ru) 2007-02-27
EP2305797A2 (en) 2011-04-06
EE05567B1 (et) 2012-08-15
JP5004402B2 (ja) 2012-08-22
BG66243B1 (bg) 2012-08-31
EP1346030A1 (en) 2003-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1981041B (zh) 产生风味稳定饮料的大麦
CN102333440B (zh) 脂加氧酶活性降低的大麦
KR101769525B1 (ko) Ｄｍｓ 수준이 낮은 보리 및 맥아-유래 음료
JP6007174B2 (ja) エネルギーを節約した醸造法
CA2433250C (en) Low-lipoxygenase 1 barley
US20170183611A1 (en) Energy saving brewing method
US6660915B2 (en) Low lipoxygenase 1 barley
AU2001230454B2 (en) Low-lipoxygenase 1 Barley
WO2002053720A1 (en) Low-lipoxygenase 1 barley
AU2001230454A1 (en) Low-lipoxygenase 1 Barley
LI et al. GERSTE MIT REDUZIERTER LIPOXYGENASE AKTIVITÄT UND EIN DAMIT HERGESTELLTES GETRÄNK ORGE À ACTIVITÉ RÉDUITE EN LIPOXYGÉNASE ET UNE BOISSON PRODUITE À PARTIR DE CETTE ORGE

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140122