PT1346030E

PT1346030E - Cevada com nível baixo de lipoxigenase-1

Info

Publication number: PT1346030E
Application number: PT01902597T
Authority: PT
Inventors: Varena Cameron-Mills; Anna Christiana Douma; Albert Doderer; Birgitte Skadhauge; Lene Molskov Bech; Nathalie Schmitt; Jolanda Carolina Heistek; Johannes Reinier Van Mechelen
Original assignee: Carlsberg As; Heineken Tech Services; Brasseries Kronenbourg Soc S A
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2012-02-08
Also published as: UA88130C2; CN1487995A; WO2002053721A1; PL363480A1; CA2433250A1; CZ20031872A3; EA007955B1; EE200300257A; NZ527171A; PL208246B1; EE05567B1; BG107971A; EP2305797A3; EP1346030A1; EP1346030B1; HUP0401290A3; HUP0401290A2; CN100372930C; DK1346030T3; CZ298689B6

Description

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DESCRIÇÃO "CEVADA COM NÍVEL BAIXO DE LIPOXIGENASE-1"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção enquadra-se no campo da biotecnologia vegetal. Mais especificamente, a invenção refere-se a um gene mutante lipoxigenase 1 de cevada (lox-1) que codifica para uma enzima com atividade de formação do ácido 9-hidroperoxioctadecanóico seriamente reduzida. A invenção também se refere ao uso de culturas homozigóticas de cevada para o lox-1 em processos de fermentação para reduzir a formação de sabores alterados nos produtos fermentados, tais como a cerveja, durante o armazenamento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As lipoxigenases são uma família de enzimas (EC 1.13.11.12) que catalisam a dioxidação de ácidos gordos poli-insaturados livres e esterifiçados contendo uma configuração 1 (Z), 4(Z)-pentadieno. Os produtos de reações catalisadas pela lipoxigenase têm sido suspeitos de serem os principais responsáveis pelo aparecimento de sabores stale em grãos/sementes de plantas e em produtos alimentares derivados de grãos/sementes (Robinson et al, 1995, Food Chem, 54:33-43). As lipoxigenases têm sido implicadas na produção de aldeídos voláteis de hexanal gerados durante o processamento de soja, que têm um aroma indesejável, limitando o uso de proteínas de soja nos produtos alimentares. Acredita-se que três isoenzimas de lipoxigenase expressos nas sementes de soja contribuem para a oxidação lipídica e para a formação de hexanal. Os mutantes de soja que carecem de um ou mais destes 2 isoenzimas foram gerados com o objetivo de reduzir a formação de hexanal e melhorar a estabilidade do seu sabor. 0 sucesso desta abordagem foi avaliada por Hildebrand et al. , 1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936. Os mutantes que carecem de lipoxigenase 3 de de soja produziram níveis mais elevados de hexanal, sugerindo que este isoenzima desvia 13 hidroxiperoxioctadecanóides, produzidos por oxidação lipídica, na direção de produtos não-voláteis. O desempenho no campo de linhas de soja triplamente-nulas, carecendo de todas as três lipoxigenases de sementes demonstrou que estas enzimas não são essenciais para as características normais agronómicas e das sementes (Narvel et al, 1998, Crop Sei. 38: 926-928).

As lipoxigenases também foram implicadas na geração de sabores alterados no arroz, que podem ocorrer durante o armazenamento dos grãos. A libertação de ácidos gordos livres pode ser detetada em grãos armazenados, o que é indicativo do metabolismo das reservas de triglicéridos. Verificou-se que a variedade de arroz Daw Dam acumulou níveis mais reduzidos de pentanais e hexanais conferindo uma estabilidade melhor do sabor aquando do armazenamento (Susuki et al., 1999, J. Agric. Food Chem, 47:. 1119-1124). Este fenótipo desejável foi atribuído à ausência da lipoxigenase-3 do arroz, que oxida cadeias acilo de lípidos insaturados para formar isómeros posicionais 9-hidroxiperoxioctadecanóicos. É reconhecido que a via da lipoxigenase é complexa, com muitas ramificações e o seu papel em numerosos aspetos do crescimento da planta e fisiologia não é totalmente compreendido. As modificações da via lipoxigenase que alteram a atividade da 9 hidroperoxidação em culturas de sementes são propostas para regular a sua suscetibilidade à 3 contaminação de micotoxinas por Aspergillus spp. (WO 9726364), o que é consistente com o envolvimento desta via na resistência a patógenos de plantas, mas não está relacionado com os objetivos da invenção aqui descrita.

Entre os vários aromas voláteis que contribuem para o sabor da cerveja, os aldeídos superiores insaturados com uma cadeia de 6-12 carbonos têm limiares de sabor organoléticos particularmente baixos (Meilgaard 1975, MBAA Tech. Quart. 12. 151-168). 0 trans-2-nonenal, que é membro deste grupo, tem ambos um limiar de sabor extremamente reduzido de 0,11 ppb e contribui para um sabor desagradável "papelão" semelhante a palha, da cerveja. A característica off-flavor causada pelo trans-2-nonenal é uma característica comum em cervejas armazenadas durante 1-3 meses ou mais e é particularmente prejudicial para o sabord e cerveja lager, que é fermentada com maltes leves e tem um sabor delicado. Há muito tempo que o sulfito é conhecido por melhorar a estabilidade do sabor da cerveja, não só pela ligação ao oxigénio e atuando como um anti-oxidante, mas também através da formação de compostos voláteis de adição de bissulfito com aldeídos e cetonas presentes na cerveja. As duas principais fontes de sulfito na cerveja são o sulfito produzido pela levedura durante a fermentação através da via de assimilação do enxofre e o sulfito adicionado à cerveja antes de ser embalado. As condições de fermentação que potenciam a produção de sulfito pelas leveduras e sua secreção permitem a formação de aductos de sulfito-carbonilo a partir de carbonilos presentes no mosto e previnem o seu posterior metabolismo pela levedura (Dufour 1991, Proc.Eur. Brew. Conv. Congr., Lisbon, pp 209-216). Deste modo, os carbonilos tais como o acetaldeído e o diacetilo podem ser transferidos para a cerveja. A capacidade do sulfito para prevenir o aparecimento do 4 composto carbonilo trans-2-nonenal durante o envelhecimento da cerveja foi demonstrada através da fermentação de cerveja com uma estirpe de levedura bloqueada na via de assimilação de enxofre (Johannesen et al. 1999, Proc.Eur.

Brew. Conv. Congr., Nice, pp.655-662). Após o engarrafamento, a cerveja foi sujeita a um envelhecimento forçado, por armazenamento a 37 ° C durante 7 dias, após o que os níveis de trans-2-nonenal foram verificados como estando muito acima do limiar de sabor. Se 10 ppm de sulfito forem adicionados à cerveja de baixo sulfito pouco antes de iniciar o engarrafamento, o aparecimento do trans-2-nonenal durante o envelhecimento forçado foi significativamente reduzido. A reação entre os compostos sulfito e carbonilo é reversível e ocorre sob controlo termodinâmico e cinético. As constantes de equilíbrio aparentes para os compostos bissulfito estão compreendidos entre 1CT6 M para compostos carbonilo, tais como o acetaldeído, hexanal, e decanal, para 10“3 para diacetil e piruvato (Dufour 1991, supra).Durante o armazenamento de cerveja, as trocas gasosas através da embalagem permitem a entrada de oxigénio na cerveja e o sulfito é perdido, de tal forma que os aductos de bissulfito mais fracos vão dissociar, permitindo que os carbonilos livres apareçam na cerveja. Enquanto o sulfito, inquestionavelmente, realça a estabilidade do sabor da cerveja, particularmente a curto prazo, a retenção na cerveja embalada é fortemente dependente das trocas gasosas através da embalagem e da temperatura. Numa cerveja concluída os níveis naturais de sulfito produzido durante a fermentação são variáveis e a adição de sulfito antes do engarrafamento não é uma prática universalmente aceite. Por estas razões o sulfito por si só não fornece um método fiável para melhorar a longo prazo a estabilidade do sabor da cerveja nas condições de 5 armazenamento da cerveja diferentes das utilizadas em todo o mundo. É geralmente aceite que o trans-2-nonenal encontrado na cerveja resulta da oxidação de ácidos gordos poli-insaturados derivados de lipidos dos grãos de cevada, onde o ácido gordo com cadeia de 18 carbonos, o ácido linoléico [classificado como um ácido gordo poli-insaturado 18:2, n-6 (Broun, Gettner e Sommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216)] é o mais abundante.

No entanto, há pouco consenso na bibliografia quanto ao mecanismo pelo qual o trans-2-nonenal é formado. A presença de vias enzimáticas que levam à formação do trans-2-nonenal a partir de ácidos gordos poli-insaturados foi proposta, mas as vias enzimáticas individuais nunca foram demonstradas experimentalmente em grãos de cevada ou durante o processo de maltagem (Gardner 1988, Adv. Cereal Sei. Technol. 9: 161-215). 0 conceito de utilização da tecnologia de genes anti-sense ou de co-supressão genética para reduzir os níveis da lipoxigenase-1 em grãos de cevada, e, assim, controlar a 9 hidroperoxidação e reduzir os níveis de aldeído e de álcool no grão de cevada acabado, foi proposto como um meio para controlar a formação de off flavor, mas os resultados de tal abordagem não são descritos (McElroy e Jacobsen, 1995, Bio / Technology 13: 245-249).

Foi desenvolvido um teste de força como um método para avaliar o potencial do trans-2-nonenal de uma cerveja, em que a formação do trans-2-nonenal em mosto ou cerveja é induzida pela submissão de amostras a temperaturas elevadas em pH reduzido, (100 °C, em pH 4,0 durante 2 horas) . As tentativas de correlacionar o potencial trans-2-nonenal no 6 mosto e da cerveja terminada com o nivel total de atividade das lipoxigenases no malte seco indicaram que a lipoxigenase pode contribuir para o aparecimento de trans-2-nonenal em cerveja envelhecida (Drost et al. , 1990, J.

Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124-131). As conclusões que podem ser extraídas deste estudo, no entanto, são severamente limitadas pelo fato da atividade da lipoxigenase no malte de cevada ser regulada no final do processo de maltagem pelo grau de inativação enzimática durante a secagem kiln. Assim, apenas o efeito da atividade de lipoxigenase residual de malte sobre o trans-2-nonenal potencial no mosto derivado e na cerveja acabada foi examinado. O estudo falhou na avaliação das lipoxigenases que catalisam o primeiro passo da via da lipoxigenase enzimática no grão de cevada durante o desenvolvimento e maltagem e o seu papel como determinantes dos níveis do trans-2-nonenal encontrado na cerveja. De fato, a ausência de culturas de cevada deficiente em um ou mais isoenzimas da lipoxigenase tornou impossível fornecer evidências convincentes para o papel da via das lipoxigenases em malte de cevada no controlo da formação do trans-2-nonenal. Tais experiências são necessárias para avaliar a contribuição da via enzimática, em comparação com a via química/auto-oxidativa, para a formação do trans-2-nonenal na cerveja. O processo de fermentação envolve um passo com temperatura de ebulição elevada do mosto onde a ocorrência destas reações não enzimáticas é proposta (Noêl et al., 1999, J. Agric.

Food Chem. 47: 4323-4326).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona uma planta de cevada contendo atividade da lipoxigenase-1 grandemente reduzida.Numa forma de realização, as plantas de cevada da invenção contêm um gene lox-1 mutante que expressa níveis muito reduzidos da 7 isoenzima lipoxigenase-1 , em que a referida proteína mutada LOX-1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, em que o Xaa é ácido aspártico, ácido glutâmico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptofano, asparagina ou glutamina.

Tal como aqui apresentado, o malte e o mosto produzidos a partir da cevada com lipoxigenase reduzida da invenção são úteis para produzir cerveja com estabilidade do sabor significativamente melhorada e níveis reduzidos do trans-2-nonenal, especialmente sob condições conhecidas por promover o aparecimento de T2N. A invenção demonstra uma correlação entre a atividade de lipoxigenase-1 do malte de cevada para produzir ácidos 9-hidroxiperoxioctadecadienóicos (9-HPOD) e a presença do trans-2-nonenal na cerveja. 0 uso de cevada homozigótica para o gene lox-1 mutante no processo de fermentação melhora a estabilidade do sabor da cerveja, tanto durante o armazenamento como na exposição a temperaturas de armazenamento elevadas. Estas propriedades melhoram a qualidade da a cerveja e são úteis para prolongar a sua validade e reduzir a necessidade de arrefecer a cerveja durante o transporte e armazenamento. A invenção fornece plantas e porções de cevada tendo assim atividade de lipoxigenase-1 reduzida, expressando proteína mutante LOX-1 como aqui descritos. Os métodos para a produção de plantas de cevada, porções de plantas, produtos de plantas e, particularmente de malte e mosto produzidos a partir da plantas de cevada da invenção são aqui descritas. 8

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um gráfico que apresenta o efeito do ácido nordi-hidroguaiarético inibidor (NDGA) nas lipoxigenase 1 e 2 purificadas por imuno-afinidade a partir de embriões de grão de cevada com 3 dias de germinação. A Figura 2 é um gráfico que apresenta o peso fresco de grãos em desenvolvimento da Linhagem G e Vintage cv com 5 dias após o florescimento até à plena maturidade (FM). Cada determinação é o peso médio de grãos singulares de 6 espigões. A Figura 3 é um gráfico que apresenta o peso seco de grãos em desenvolvimento da Linhagem G e Vintage cv a partir de 5 dias após o florescimento até à plena maturidade (FM). Cada determinação é o peso médio de um grão de 3 amostras de 5 grãos. A Figura 4 é um gráfico que mostra a atividade da lipoxigenase total nos grãos em desenvolvimento da Linhagem G e Vintage cv desde 5 dias após o florescimento até à plena maturidade (FM). A Figura 5 é um gráfico que mostra os produtos 9 - e 13-HPOD da oxidação do ácido linoléico pela atividade da lipoxigenase em grãos de Linhagem G em desenvolvimento. A Figura 6 é um gráfico que mostra a atividade da lipoxigenase total em embriões de grãos em germinação da Linhagem G e Vintage cv expressa como P mol/min/10 embriões (U/10 embriões). A Figura 7 é um gráfico que mostra os produtos 9 - HPOD e 13-HPOD da oxidação do ácido linoléico pela atividade da 9 lipoxigenase em embriões de grãos em germinação da Linhagem G e Vintage cv, mostrando os níveis de 9 - HPOD e 13-HPOD. A Figura 8 é um Western blot que mostra a imunodeteção da lipoxigenase 1 em embriões de grãos em desenvolvimento da Linhagem G e Vintage cv [wt] desde 5 dias após o florescimento até à plena maturidade(FM). A Figura 9 é um Western blot mostrando a imunodeteção da lipoxigenase 1 em embriões de grãos da Linhagem G e Vintage cv [estirpe nativa] germinadas durante 0-6 dias. A Figura 10 é um Northern blot sondado com a região 3 'não transcrita do cDNA do lox-1 e apresentando transcritos de lipoxigenase 1 detetados nos grãos em desenvolvimento da Linhagem G e Vintage cv [estirpe nativa] desde 5 dias após o florescimento até à plena maturidade(FM). A Figura 11 é um Northern blot sondado com a região 3 'não transcrita do cDNA do lox-1 e apresentando transcritos da lipoxigenase 1 detetados em embriões de grãos da Linhagem G e Vintage cv [pt] germinadas durante 0-6 dias.

As Figuras 12A-12G são um alinhamento de sequências de nucleótidos da região promotora e transcrita do alelo Vintage cv (WT) e do alelo Linhagem G (LG) da estirpe nativa do lox-1. O local de início da transcrição (+1), o codão de início ATG ( + 69) e o codão stop da tradução (+4231) nas sequências de gene encontram-se sublinhados. As mutações nucleotídicas identificadas no alelo da Linhagem G são apresentadas em negrito e itálico e indicadas com um asterisco. 10 A Figura 13 é uma apresentação esquemática do gene lox-1 de Vintage cv (estirpe nativa) e o gene mutante lox-1 da Linhagem G. 0 transcrito desde +1 a +4375 é composto por 7 exões (caixas pontilhadas) e 6 intrões (caixas brancas). São indicadas duas mutações no gene lox-1. A Figura 14 é um desenho esquemático de cassetes do gene para a expressão transiente do cDNA do lox-1 de estirpe nativa e do gene lox-1 e do gene mutante lox-1 da linha G. As sequências codificantes da lipoxigenase foram clonadas entre o promotor de ubiquitina maize constitutivo com o int~rão 1 (Ubi-1) e o terminador nos. A Figura 15 é um gráfico de barras que mostra a atividade da lipoxigenase 1 em protoplastos de aleurona de cevada transfetados com cassetes do gene contendo o cDNA do lox-1 estirpe nativa; o gene lox-1 mutante a partir da linha G; o gene lox-1 WT; e um gene repórter GUS de controlo. A atividade da lipoxigenase em extratos de protoplastos transfetados foi testada em placas de microtitulação pela oxidação de Kl e quantificada espetrofotometricamente. A atividade de lipoxigenase 1 foi expressa em unidades por P g de proteína no extrato e é apresentada como a média de três medições de dois ensaios replicados. A Figura 16 é um alinhamento de sequências demonstrando que um RFLP entre o gene lox-1 de estirpe nativa e o gene lox-1 mutante é devido a uma mutação pontual no nucleótido 2347, criando um local de restrição adicional AatlI. A Figura 17 é uma apresentação esquemática dos fragmentos lox-1 de PCR amplificados e clivados na reação em cadeia da polimerase- ensaio de local polimórfico amplificado de clivagem (PCR-CAPS). As posições dos iniciadores PCR são 11 indicadas por setas e os locais Aatll são mostrados acima do gene (posição na sequência) . As regiões exão e intrão dentro do produto PCR são distinguidas por caixas pontilhadas e brancas, respetivamente e os tamanhos dos fragmentos da digestão com Aatll são dados. A Figura 18 é um gel de agarose eletroforético mostrando fragmentos da PCR do lox-1 (652 pb) amplificados no primeiro passo do ensaio PCR-CAPS da Linhagem G e do ADN genómico Vintage cv. A Figura 19 é um gel de agarose eletroforético mostrando o RFLP detetado por PCR-CAPS no gene lox-1 de estirpe nativa e mutante.Os fragmentos da digestão por Aatll do gene mutante incluem um único fragmento de restrição com 313 pb, indicado por um asterisco. A Figura 2 0 é uma tabela mostrando um programa de back-crossing para o único par de genes recessivo 11 (caractér lipoxigenase baixa) da Linhagem G para Alexis cv. O genótipo LL são plantas expressando atividade lipoxigenase estirpe nativa (alelo dominante), o genótipo 11 são plantas expressando a lipoxigenase baixa (alelo recessivo). As plantas LI são plantas heterozigóticas que contêm ambos os alelos lipoxigenase de estirpe nativa e lipoxigenase baixa. Uma vez que a caracteristica de lipoxigenase baixa é uma caracteristica recessiva, as plantas LI apresentam atividade de lipoxigenase estirpe nativa. Após cada ronda de back-crossing (incluindo a auto-polinização), é esperado que a progenia 11 represente 25% da progenia. As frequências observadas da atividade de lipoxigenase baixa são indicadas. 12 A percentagem calculada dos antecedentes genéticos Alexis cv contendo o alelo homozigótico de lipoxigenase baixa é indicado como % Alexis. A Figura 21 é um gel de agarose eletroforético apresentando a deteção por PCR-CAPS do gene lox-1 mutante na progenia 11 do programa Linhagem G - Alexis back-cross. 0 ensaio PCR-CAPS do ADN genómico da Linhagem G (Faixa 2), Vintage cv (Faixa 3) progenia 11 de 3 a (Faixa 4) e 4 a back-cross (Faixas 5-9) .Graduação ADN (Faixa 1) . Controlo, linha lox altamente backcrossed (faixa 10).

As Figuras 22A 22B são um alinhamento comparativo das sequências de aminoácidos de lipoxigenases de soja LOX-1 (Gml), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) e lipoxigenases de cevada LOX-1 (Hvl) e LOX-2 (Hv2) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os materiais vegetais, produtos vegetais e métodos são fornecidos para a produção de uma bebida, tal como a cerveja, a referida bebida contendo um teor reduzido do composto de alteração de sabor trans-2-nonenal, de tal forma que a estabilidade do sabor da bebida, por exemplo, a cerveja, durante o armazenamento e exposição a temperaturas elevadas é melhorado, relativamente a uma bebida de controlo. Mais particularmente, a invenção fornece plantas de cevada, cujo desenvolvimento e germinação de grãos produzem niveis de atividade muito reduzidos da enzima lipoxigenase-1, denotada LOX-1, que, por exemplo, quando usada num processo de fermentação de cerveja, resulta numa cerveja tendo reduzido os niveis de trans-2-nonenal, em comparação com uma planta de cevada controlo. 13

Os métodos utilizados para gerar, caracterizar e validar uma planta de cevada tendo atividade LOX-1 muito reduzida, e utilização deste tipo de cevada para a produção de cerveja com sabor estável são descritos abaixo. 1. Definições

Tal como usado aqui, os seguintes termos têm as definições indicadas: "Porção Vegetal" significa uma unidade ou uma parte especifica de uma planta, como o caule, folhas, raízes, flores, sementes, grãos, frutos ou rebentos. "LOX-1" significa proteína lipoxigenase-1 ; "lox-1" significa o gene que codifica para a LOX-1. A "cevada mutante lox-1" significa um gene de cevada mutagenizado que codifica para um polipéptido de lipoxigenase 1 mutante. 0 "controlo não-mutado" significa uma planta, ácido nucleico, gene, polipéptido, porção de planta ou produto vegetal contendo o gene ou a proteína de estirpe nativa. "Heteróloga" significa uma sequência não-nativa, por exemplo, uma sequência derivada de outra espécie, ou uma sequência concebida recombinantemente ou sintética que difere da sequência nativa. "Produto vegetal" significa um produto resultante do processamento de uma planta ou porção de planta e inclui, por exemplo, malte e mosto. "0 aminoácido acídico" significa ácido aspártico ou glutâmico. 14 "Aminoácido básico" significa histidina, lisina, ou arginina. "0 aminoácido polar" significa treonina, serina, tirosina, triptofano, asparagina, ou glutamina. "As caracteristicas organoléticas" significam propriedades que apelam aos olfato e paladar, que são analisadas, por exemplo, por um painel treinado para degustação. "Produto fermentado" significa um produto preparado por maceração, ebulição e fermentação, por exemplo, a cerveja. 0 "trans-2-nonenal" reduzido significa menos de cerca de 50%, quando em comparação com as condições (controlo) originais. 2. Atividade de lipoxigenase

As enzimas lipoxigenase catalisam a oxidação de ácidos gordos poli-insaturados.Na cevada, as isoenzimas LOX-1 e LOX-2 são conhecidas. A LOX-1 catalisa primariamente a 9-hidroperoxidação, enquanto que a LOX-2 catalisa primariamente a 13-hidroperoxidação de ácidos gordos poli-insaturados octadecanóicos. Os dados apresentados nos exemplos abaixo demonstram uma correlação entre a atividade da 9 hidroperoxidação na LOX-1 de cevada e a presença do trans-2-nonenal na cerveja. De um modo concordante, a cevada ter reduzido a atividade LOX-1 é útil para produzir cerveja com um grau de trans-2-nonenal reduzido e/ou potencial em comparação com um controlo. 3. Produção de cevada com lipoxigenase baixa

Podem ser usadas várias abordagens genéticas conhecidas para produzir as plantas da invenção, isto é, para reduzir 15 o nível de atividade da enzima lipoxigenase 1, expresso numa planta de cevada, de forma estável e hereditária. Estas abordagens incluem, mas não restringem a, tecnologia antisenso e mutagénese, tais como a mutagénese induzida quimicamente e por radiação, assim como mutagénese dirigida ao local.

Transformação da cevada. A cevada pode ser transformada com várias moléculas de ácido nucleico concebido para manipular a expressão do gene lox-1 ou alterar a arquitetura do gene lox-1. Vários métodos, por exemplo, a transferência de Agrobacterium tumofaciens mediada (Tingay et al, 1997, Plant J., 11: 1369-1376), bombardeamento de partículas (Wan e Lemaux, 1994, Planta Physiol, 104:. 37-48, ou recolha de ADN mediada por polietilenoglicol (PEG) (Funatsuki e Kihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91:707-712), podem ser usados para introduzir com sucesso ácidos nucleicos numa célula de cevada, por exemplo num protoplasto, calo ou num embrião. Vários promotores podem ser usados para dirigir a expressão do gene de interesse. Para a expressão de vetores contendo lox-1, incluindo sequências antisenso, a região promotora do lox-1 nativo pode ser usada. A sequência promotora do lox-1 está contida nos nucleótidos 2602-3511, que incluem a 5 'UTR do EMBL n° de acesso U83904. Alternativamente, os promotores que dirigem a expressão do gene de interesse constitutivamente, por exemplo, o promotor ubiquitina de milho Ubi.l, podem ser usados (Wan e Lemaux, Supra; Kjasrulff et al, em P. Mathis, Ed, 1995, Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol. II, 151-154). Os vetores de expressão também podem conter uma região de terminação da transcrição, por exemplo, o terminador 3' do gene nopalina sintase (3'-nos) (Bevan, et al, 1983, Nucl. Acids Res, 11:. 16 369-385) foi fundido com genes expressos em cevada transgénica (Wan e Lemaux, Supra; Funatsuki e Kihara, Supra).

Os vetores de expressão também podem conter um gene que permite a seleção de células transformadas quando o vetor foi integrado com sucesso na célula. Estes genes podem codificar para os genes de resistência a antibióticos ou herbicidas, por exemplo, o gene da neomicina-fosfotransferase (npt) ou da fosfinotricina acetiltransferase (bar). Quando expressos, tais genes de resistência permitem o crescimento da célula transformada em meios contendo neomicina - ou bialafos, respetivamente (Ver, por exemplo, Wan e Lemaux, Supra; Funatsuki e Kihara, Supra; Kjasrulff et al, em P. Mathis, Supra) .

Após a transformação, as células podem ser cultivadas em meios seletivos durante um período de tempo e então cultivadas para permitir a formação de rebentos, seguido por sistemas de raízes e depois plântulas. Um procedimento de transformação da cevada bem sucedido foi desenvolvido por Funatsuki e Kihara, (Supra), onde a transformação de protoplastos de cevada por PEG com vetores de expressão contendo neomicina fosfotransferase e a subsequente seleção em neomicina originou plantas férteis contendo o transgene. 0 transgene foi demonstrado integrar-se no genoma e a maioria das plantas transgénicas expressaram a proteína codificada pelo transgene. Estas plantas transgénicas também foram capazes de transmitir e expressar os seguintes cruzamentos transgénicos. É entendido que uma variedade de métodos de transformação, vetores de expressão, promotores, marcadores seletivos e 17 semelhantes são conhecidos e úteis para a transformação da cevada.

Mutagénese da Cevada 0 gene lox-1 pode ser alvo de mutagénese especifica do local usando oligonucleótidos ARN / ADN quiméricos. Estes oligonucleótidos quiméricos de ARN / ADN demonstraram introduzir com sucesso mutações em células de plantas (Zhu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. 96: 8768-8773, e Beetham et al, 1999, Proc.. Natl. Acad. Sei. 96:8774-8778) e células de mamíferos (Yoon et al. , 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. 93:2071-2076) em locais desejados. Os oligonucleótidos de ARN /ADN quiméricos podem ser transformados em protoplastos de cevada ou células de interesse numa variedade de maneiras, por exemplo usando os métodos de transformação mediados por PEG ou mediados por bombardeamento de partículas descrito acima. Os protoplastos individuais ou células podem entãoser regenerados por cultura de tecidos para plantas totalmente férteis e o evento mutacional pode ser confirmado e seguido, por exemplo, usando uma abordagem baseada em PCR, conforme descrito nos exemplos abaixo.

Esta mutagénese dirigida ao local pode ser aplicada a resíduos específicos mutados no gene lox-1.O gene lox-1 pode ser mutado em uma ou mais posições de nucleótidos na região promotora para subregular ou abolir a transcrição do lox-1. A mutagénese específica também pode ser aplicada para introduzir alterações na região codificante do lox-1 que, por exemplo, reduzam a atividade enzimática. Tais mutações incluem, mas não se limitam a, inserções, deleções e substituições resultando numa estrutura, truncagem da poteína LOX-1 e/ou alteração da natureza neutra e hidrófoba da cavidade do substrato enzimático. 18

Expressão Antisenso A redução na expressão do lox-1 também pode ser conseguida pela expressão de um constructo antisenso lox-1 nas células de cevada. Os métodos para a expressão dos constructos antisenso em cevada para reduzir a expressão de uma proteina-alvo foram descritos, por exemplo, em Gilpin, MJ et al, 1998, In:. Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Garab, ed., vol. IV, 2983-2986; Kjasrulff et al, 1995, In: Photosynthesis: from Light to Biosphere. P. Mathis, Ed., Vol. II, 151-154.

As células de cevada podem ser transformadas com um constructo de expressão contendo uma sequência de ácido nucleico antisenso. 0 constructo de expressão produz uma molécula de ARN antisenso capaz de ligar especificamente a pelo menos uma porção de mRNA produzido a partir do gene lox-1 tipo nativo, através do emparelhamento de bases complementares e capaz de disromper o splicing do pré-mRNA ou a tradução deste mRNA. Um promotor especifico constitutivo ou de tecido/temporal, por exemplo, o promotor lox-1 de cevada descrito acima, pode dirigir a expressão da sequência de ácidos nucleicos antisenso.

Mutagénese química.0 produto mutagénico químico de azida de sódio (NaN 3) tem sido comumente usado para mutagénese da cevada e é conhecido por induzir mutações estáveis na sequência de ADN (ácido desoxirribonucleico) do genoma de cevada (Olsen et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90: 8.043-8.047). Outros agentes mutagénicos químicos, por exemplo, o etilmetanossulfonato (EMS), azidoglicerol (AG, 3-azido-l,2-propanodiol), metilnitrosuréia (MNU), e hidrazida maleica (MH) também pode ser usados para induzir mutações no ADN (Rank, J. et al. 1997, Mutat. Res. 390:121-7), tal como pode a radiação UV. 19

Tal como mostrado nos exemplos abaixo, os grãos das culturas de cevada (cv) Vintage e Caruso foram tratados com azida de sódio e propagadas por auto-fertilização até à 3 a geração (M3). 4. Identificação e Seleção de Cevada com Baixo Nivel de Lipoxigenase A identificação e seleção de plantas de cevada com atividade reduzida do isoenzima lipoxigenase nos grãos pode ser conseguida, por exemplo, por análise da atividade da lipoxigenase. Os ensaios enzimáticos podem ser usados para determinar a atividade das duais principais lipoxigenases conhecidas por estarem presentes quer nos grãos maduros ou germinantes, LOX-1 e LOX-2. Tais ensaios devem distinguir a atividade da LOX-1 da da LOX-2. Um ensaio seletivo de LOX-1 e LOX-2 é baseado na oxidação de um ácido gordo poli-insaturado pela lipoxigenase e deteção espetrofotométrica do produto hidroperóxido de tal oxidação. A especificidade deste ensaio para a LOX-1 aproveita a insensibilidade comparativa da LOX-1 a um inibidor, por exemplo, NDGA, em relação a LOX-2. 0 ensaio seletivo também pode ser conseguido usando imunoprecipitação para remover seletivamente a LOX-1 ou a LOX-2 do ensaio. Anticorpos específicos anti-LOX-1 e anti-LOX-2 , por exemplo, anticorpos monoclonais, podem ser preparados a partir de LOX-1 ou LOX-2 purificadas, conforme descrito em Holtman et. al, 1996, Supra.

Estes métodos de ensaio podem ser adaptados aos procedimentos de ensaio em placas de microtitulação, ou outros formatos de ensaio conhecidos, repetitivos, de rendimento elevado, permitindo a avaliação rápida de muitas amostras. Estes ensaios podem ser validados para analisar pedaçoes de folha de grão germinante de um modo não- 20 destrutivo, de tal forma que as plântulas selecionadas na análise podem ser adicionalmente propagadas. A perda de atividade da LOX-1 em mutantes putativos pode ser confirmada através de ensaio da atividade enzimática. Por exemplo, extratos de grão podem ser incubados com ácido linoléico e os produtos de oxidação do ácido linoleico analisados, por exemplo, por HPLC de fase inversa. As quantidades relativas de 9-HPOD e 13 -HPOD formados a partir do ácido linoléico fornecem uma medida da atividade LOX-1, cujo principal produto é o 9-HPOD.

Tal como mostrado nos exemplos abaixo, aproximadamente 20.000 grãos da geração M3 de cv Vintage e cv Caruso mutagenizados foram analisados relativamente à atividade LOX-1 e LOX-2 pelo ensaio de oxidação na presença de um inibidor e também por ensaios de imunoprecipitação. Usando esses métodos de análise, foi encontrado um mutante cv Vintage com uma grande redução na atividade LOX-1 e foi designado linha G. O fenótipo mutante foi herdado nas gerações M4 e M5.

As sementes produzidas a partir da cevada de Linhagem G foram depositadas em 4 de Janeiro de 2001 no National Collections of Industrial, Food and Marine Bactéria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY, Escócia,

Reino Unido, sob a termos do Tratado de Budapeste, com o número de Acesso: NCIMB 41078. 5. Sequências genéticas

Uma descrição precisa da alteração genotipica que contribui para o fenótipo de baixo nivel de lipoxigenase nas plantas de cevada da invenção é útil para identificar plantas contendo esta alteração genética e para atravessar esse 21 caracter genético em outras culturas de cevada num programa de reprodução. Podem ser usados vários métodos conhecidos, moleculares e bioquímicos, para determinar a base genética para o fenótipo com baixo nível de lipoxigenase. É geralmente reconhecido que ambas as sequências genéticas de ação cis- e ação trans- podem determinar a expressão de um determinado gene no genoma e a atividade do produto do gene. Os pontos de controlo da expressão genética incluem a regulação do tempo, especificidade do tecido e taxa de transcrição do gene, a estabilidade do transcrito e a taxa de tradução do transcrito. Tanto o nível da expressão génica como a estabilidade e atividade específica da enzima codificada irão determinar o nível de atividade enzimática detetada num tecido.

As alterações numa sequência genética de plantas podem ser determinadas por sequenciação de ADN de partes relevantes conhecidas do genoma, enquanto a análise Northern fornece uma ferramenta para monitorar os níveis de transcrito estável num determinado tecido da planta. A enzima expressa no tecido da planta pode ser avaliada através da extração da enzima a partir do tecido e da medição da atividade enzimática.

Como mostrado nos exemplos abaixo, a identidade das alterações genéticas que determinam o fenótipo de baixa-lipoxigenase da Linhagem G mutante induzido em cv Vintage foram determinadas da seguinte maneira. 0 gene estrutural que codifica para a proteína LOX-1, em ambos cv Vintage progenitor e na Linhagem G, foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e as foram sequenciadas sequências promotoras a montante, as quais regulam a 22 expressão do gene, assim como toda a sequência codificante, compreendendo sequências de intrão e exão. A comparação das sequências de nucleótidos do gene lox-1 da Linhagem G e do tipo nativo cv Vintage revelou 2 substituições de nucleótidos em dois exões, dos quais um (na posição + 2347) levou a uma substituição não conservadora de aminoácidos (Glicina 368 -> Aspartato) na proteína expressa. A Figura 22 mostra um alinhamento de lipoxigenases L0X1 de soja (Gm: Glicina max L) (Acc.N 0 P08170), L0X2 (Acc. N ° P08170), L0X3 (Acc. No. AAB41272) e cevada (hv: Hordeum vulgare) lipoxigenases L0X1 (Acc.No. P2 9114) e L0X2 (Acc. No. AAB70865.1). Resíduos de aminoácidos conservados e substituições conservadoras de resíduos carregados são mostradas em negrito. Atribuições de estrutura secundária para a L0X3 de Glicina max, de soja onde H = hélices alfa e E = cadeias Beta, são apresentados acima do alinhamento, e os resíduos relevantes para a função enzimática (identificados por um asterisco ou círculo preenchido) são apresentados, como descrito na Skrzypczak-Jankun et.al., 1997, Proteins 29:15-31.

Resíduos de aminoácidos que participam em ferro não-heme ligado ou essencial para a catálise (*) em soja L0X3 incluem: H5i8, H 523, H 709 [3 átomos de N] ; N 713, I 847 -Os resíduos equivalentes em cevada LOX 1 são H 517, H 522, H 708, N ii2, e I 862a Resíduos em L0X3 de soja com um papel previsto em catálise (·) são: H266, H513, H776, F264/ F272, F714, W519, R552, R726, D766, D779, K278 . Os resíduos equivalentes em L0X1 de cevada são: H26i/ H512, H775/ F259/ F267/ F713/ W518, R551/ R725/ D778 , e K273. 23

Resíduos de Prolina (Ρββ/ 109, 167, ni, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 486, 541, 548, 600, 616, 627, 685, 726, 734, 788, 829, 833, 839, 857) β de Glicina (G 49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474 , 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 855 ) (+) localizados em loops e posições a cobrir a hélice em estruturas secundárias de proteínas, podem facilitar voltas e dobras angulosas no esqueleto peptídico. O alinhamento de lipoxigenases de plantas relacionadas indicou que a Glicina-368 em LOX-1 de cevada é fortemente conservada. Adicionalmente, este resíduo, que corresponde a Glicina-353 em LOX-1 de soja 1, é um dos 35 resíduos altamente conservados de um total de 58 resíduos que alinham a cavidade II do subtrato da enzima, tal como pode ser visto a partir da sua estrutura cristalina. Estes resíduos conservados são destacados (caixas) no alinhamento de sequências de lipoxigenase vegetal apresentadas na Figura 22 (Minor et.al., 1996, Bioquímica 35:10687-10701), e incluem OS seguintes resíduos da LOX-1 de cevada: Y 224/ L 268 / W 355, E 364 / G 368/ V 369/ N 370/ I 374/ L 424 / L 499/ K 501/ A 502 / V 504 / D 508 / S 509/ H 512/ Q 513/ L 514/ H 517, W 518/ H 522/ I 556 / L 559 / A 560 / L 564/ I 565/ I 570/ T 574/ S 585/ Q 715 f Y 718/ N 724/ R 725/ P 726/ T 727/ I 772 β 1862 . Todos, menos 7 dos 35 resíduos conservados são neutros ou resíduos hidrófobos. A substituição de um resíduo carregado na posição da Glicina 368 em cevada ou noutro alinhamento conservado de resíduos neutros ou hidrófobos na cavidade II do subtrato, é provável que seja suscetível de perturbar as propriedades estruturais e funcionais da enzima.A G -> D 368 na LOX1 da cevada de Linhagem G(4) está localizada entre a hélice alfa H6 e a cadeia beta E12.

Tal como apresentado na Figura 22, a família lipoxigenase de enzimas partilha um grau elevado de conservação das 24 sequências, que se reflete na sua estrutura secundária conservada, determinada por vários membros da família de lipoxiqenases vegetais, incluindo L0X1 e L0X3 de soja (Skrzypczak-Jankun et al., 1997, supra) . A L0X1 de cevada partilha 56,9% de identidade de sequências e 67,8% de semelhança de sequências com a L0X3 de soja. Vários resíduos de aminoácidos na isoenzima L0X3 de soja têm sido identificados como ligandos para o ferro não-heme, ou são sugeridos como sendo essenciais para a sua atividade (indicados com * ·) ·

Tendo em vista a elevada conservação da sequência entre a L0X1 de cevada a L0X3 de soja, é razoável prever que os resíduos na sequência L0X1 da cevada que são homólogas aqueles identificados como sendo importantes para a função da L0X3 também podem ser essenciais para a atividade enzimática. Assim, as substituições não conservadoras de aminoácidos em qualquer uma destas posições, incluindo as substituições desses resíduos na L0X1 de cevada correspondentes aos 35 resíduos altamente conservados da L0X3 de soja que alinham na cavidade do substrato e em outras posições essenciais para a atividade enzimática, são susceptíveis de reduzir a atividade da lipoxigenase.

Os resíduos de aminoácidos prolina e glicina são conhecidos por facilitar as voltas num esqueleto peptídico quando são localizados entre os elementos estruturais secundários, que permitem que uma proteína assuma uma estrutura terciária dobrada. Os resíduos de prolina e glicina também são comuns em motivos de cobertura da hélice (Parker e Hefford, 1997, Protein Eng, 10:. 487-496, http://www.expasy.ch.) A única substituição não conservadora na LOX1 de Linhagem G, onde uma glicina localizada entre dois elementos estruturais previstos foi substituída por aspartato, levou a uma perda 25 significativa da atividade enzimática. É, portanto, previsto que a mutação no gene LOX-1 causando substituições não-conservadoras de aminoácidos em um ou mais dos resíduos de prolina ou glicina na L0X1 de cevada, localizados em regiões fora dos elementos estruturais poderão, igualmente, prevenir a dobragem da proteína nativa e, consequentemente, reduzir a atividade da enzima codificada.

Assim, numa forma de realização, uma planta de cevada mutante útil da invenção com atividade de lipoxigenase 1 reduzida contém uma sequência de ácido nucleico mutada que altera a natureza neutra ou hidrófoba da cavidade do substrato da enzima por inserção de um ou mais aminoácidos acídicos, básicos ou polares. A sequência de ácido nucleico útil [SEQ ID NO: 11] codifica para uma proteína LOX-1 de cevada [SEQ ID NO: 12] contendo uma substituição no aminoácido 368 da Glicina para Xaa, em que Xaa é o ácido aspártico, ácido glutâmico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptofano, asparagina ou glutamina. Uma sequência específica de aminoácidos da LOX-1 mutante de cevada da invenção é aquela em que o Xaa é ácido aspártico, por exemplo, Linhagem G.

Tal como demonstrado nos exemplos abaixo, as alterações genotípicas na Linhagem G não tiveram influência detetável na expressão do hene lox-1, mas a atividade da LOX-1 detetada em grãos maduros e em germinação da Linhagem G foi de aproximadamente 9% da detetada em grãos da linhagem parental, cv Vintage. A fim de fornecer evidências diretas de que a mutação de aminoácidos em LOX-1 da Linhagem G é responsável pela fenótipo reduzido de LOX-1, a sequência de codificação do lox-1 de Linhagem G e lox-1 de cv Vintage foram expressas transitoriamente em protoplastos de aleurona de cevada e a atividade da enzima LOX-1 mutante 26 foi demonstrada como sendo fortemente reduzida quando em comparação com o tipo nativo da enzima LOX-1. 6. Transferência entre linhagens A deteção de alterações no caracter genético das plantas de cevada do genótipo da invenção é útil para identificar a presença de um caracter genético especifico numa linhagem de cevada e para facilitar a transferência deste caracter entre linhagens num programa de reprodução e melhoramento. Uma variedade de ferramentas moleculares estão disponíveis para a deteção de alterações na sequência genómica. Tais métodos incluem, mas não restringem a, deteção de polimorfismos do comprimento de fragmentos de restrição (Gebhardt e Salamini 1992, Int. Rev. Cytology, 135: 201- 237) e métodos de deteção baseados em PCR quantitativo, tais como a amplificação utilizando iniciadores fluorescentes, p.ex., os sistemas de sonda iniciador TaqMan (Ibraham et al., 1998, Anal. Chem 70, 2013-2017). A escolha do método de deteção dependerá do caracter genético específico, mas deve preferencialmente ser rápido e fornecer dados claramente interpretáveis.

Tal como mostrado nos exemplos abaixo, o ensaio do Local Polimórfico Amplificado por clivagem com PCR (PCR-CAPS) foi fornecido para a deteção do gene lipoxigenase-1 mutante da Linhagem G. A substituição de nucleótidos no gene lox-1 na Linhagem G na posição +2347 introduziu um local adicional de reconhecimento pela endonuclease de restrição Aatll que pode ser detetado pelo ensaio PCR-CAPS. Os métodos de deteção adequados para o lox-1 não se restringem a este ensaio, mas podem igualmente ser baseados na tecnologia TaqMan, e noutros métodos de deteção conhecidos. 27

Também é mostrado nos exemplos abaixo, o ensaio de PCR-CAPS foi aplicado a 4 gerações de material de reprodução e melhoramento de um programa de retrocruzamento, onde o fenótipo de lipoxigenase baixa na Linhagem G foi sistematicamente retrocruzado em cv Alexis. A herança do fenótipo baixa lipoxigenase foi demonstrada como seguindo a herança do gene lox-1 e os fenótipos foram identificados como recessivos e vistos apenas em linhagens homozigóticas para o gene lox-1.

De um modo concordante, a progenia das plantas da invenção inclui linhagens de reprodução e melhoramento, por exemplo, derivadas de um programa de retrocruzamento, que contém o mutante lox-1 e expressa um fenótipo de lipoxigenase baixa. 7. Fermentação da cerveja

As plantas de cevada da invenção, incluindo partes de plantas, a progenia de plantas, grãos e malte e mosto, tendo baixa atividade de lipoxigenase, são aqui demonstrados como sendo úteis para a produção de uma bebida alcoólica com níveis reduzidos de trans-2-nonenal livre durante um período de tempo medido, ou sob condições de elevada temperatura de armazenamento, em comparação com uma bebida controlo, produzida a partir da variedade nativa de cevada. Para efeitos destas comparações, o conteúdo em sulfito da cerveja é controlado para 5ppm ou inferior, uma vez que é reconhecido que níveis elevados de sulfito no momento do engarrafamento vai temporariamente retardar o aparecimento de trans-2-nonenal livre. Por exemplo, a cerveja produzida a partir de malte derivado da cevada mutada de Linhagem G aqui descrita, possuía propriedades organoléticas estabilizadas durante um período de tempo medido, em comparação com cerveja produzida a partir de malte derivado de um controlo, cevada não mutada. 28

Os ensaios de produção e avaliação de cerveja engarrafada fornecem o melhor método para avaliar a influência dos diferentes ingredientes na qualidade e estabilidade da cerveja terminada. A fim de testar a influência de maltes de cevada diferentes, foram necessários grãos de cavada suficientes para executar os ensaios de maltagem e produção da cerveja à escala piloto e à escala semi-industrial. Durante o período de propagação da cevada, o desempenho em campo da linhagem de cevada pode ser avaliado. As propriedades de maltagem da linhagem de cevada podem ser avaliadas durante a maltagem à escala piloto ou industrial e, de preferência enquadrarem-se nas recomendações de qualidade nacionais de maltagem, p.ex., as recomendações da Convenção Europeia de Fabricação de Cerveja para a qualidade de maltagem (Analytica-EBC/European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Cari Getránke-Fachverlag, Niirnberg, Alemanha) . A seguir à produção à escala piloto ou semi-industrial, a cerveja é embalada em garrafas castanhas e arrefecida a 5o C para um armazenamento ideal. Nesta fase, a cerveja fresca pode ser analisada por painéis de degustação treinados, capazes de detetar sabores específicos de cerveja, incluindo o composto alterador do sabor trans-2-nonenal. Adicionalmente, a cerveja é analisada quimicamente no que diz respeito aos componentes principais do sabor, incluindo o alterador do sabor trans-2-nonenal. Estes métodos de análise da qualidade da cerveja são, então, repetidos nas condições seguintes de armazenamento diferentes da cerveja, conhecidas por revelar a estabilidade da cerveja no armazenamento a longo prazo, por exemplo, tratamentos de envelhecimento forçado.

Tal como mostrado nos exemplos abaixo, a cevada de Linhagem G foi propagada no campo ao longo de várias temporadas, a 29 fim de conseguir a maltagem de 10 toneladas desta linhagem numa fábrica de maltagem industrial. As variedades controlo da cevada cv Vintage e cv Nevada, ambas contendo a LOX-1 com fenótipo do tipo nativo, foram submetidas a maltagem sob condições semelhantes. O malte curado da Linhagem G e as culturas de cevada controlo estavam enqudrados nas especificações necessárias para os ensaios semi-industrial de produção de cerveja.

Os ensaios de produção de cerveja foram realizados à escala de 30 hl e a avaliação das cervejas recém engarrafadas, revelou que as cervejas produzidas a partir do malte de ambas Linhagem G e as culturas de controlo tinham um conteúdo em trans-2-nonenal abaixo do limiar de sabor e foram considerados satisfatórios por um painel de degustação. Dois tratamentos de envelhecimento forçado, quer por armazenamento a 37 ° C durante 7 dias ou armazenamento durante 6 a 12 semanas a 30° C, foram utilizados para avaliar a estabilidade do sabor da cerveja. O sabor e a estabilidade da cerveja produzida a partir do malte da Linhagem G foram considerados superiores aos do malte controlo, tanto no que diz respeito à avaliação pelo apinel de testes como ao nivel do trans-2-nonenal livre e a melhoria foi estatisticamente significativa. EXEMPLOS Exemplo 1

Triagem e seleção de Mutantes da Isoenzima Lipoxigenase de Cevada Mutada 1. Mutagénese da cevada

Os grãos de cevada, Hordeum vulgare e cv Vintage e cv Caruso, foram mutados com azida de sódio de acordo com um procedimento publicado (Kleinhofs et al, 1978 Mutation 30

Research 51:. 29-35). A mutagénese introduz mutações pontuais no ADN genómico que, por exemplo, pode resultar em alterações dos aminoácidos nas proteínas codificadas. Os grãos Ml mutados foram propagados na estufa através de duas gerações e os grãos M3 recolhidos para triagem. A frequência observada de mutantes com caracteres genéticos únicos na geração M2, de acordo com Kleinhofs et al., 1978, supra, são 1,0-2,7 mutantes por 10.000 grãos da geração M2. Uma vez que a maioria das mutações genéticas são recessivas e apenas são detetáveis no estado homozigótico, a população mutada foi analisada na geração M3, onde a proporção esperada de grãos mutantes homozigóticos seria maior. A frequência de mutação de 0,9-2,3 por 10.000 grãos foi esperada no material mutado em M3. 2. Um ensaio não-destrutivo da atividade da lipoxigenase 1 (LOX-1) e lipoxigenase-2 (LOX-2) em grãos M3 mutados

Foi desenvolvido um procedimento rápido de rastreio para a deteção de grãos de cevada mutante com atividade reduzida da LOX-1 com os seguintes critérios: O procedimento de triagem não deve impedir a propagação dos grãos / plântulas; o tecido selecionado de grãos/plântulas deve expressar níveis quantificáveis da atividade da lipoxigenase; o ensaio deve distinguir a atividade da LOX-1 da atividade da LOX-2; e o procedimento do ensaio deve abranger várias amostras.

Os níveis de atividade total de lipoxigenase em tecidos diferentes do grão germinante, nomeadamente o rebento, a raiz e o tecido escutelo do embrião e o endosperma foram analisados da seguinte forma: Extratos de tecido de plântulas de cevada foram preparados por homogeneização do tecido em Tris-HCl gelado 20 mM, pH 7,5, contendo NaN3 2 mM e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 0,5 mM, seguida da 31 remoção do material insolúvel por centrifugação a 1000 g durante 10 minutos. A atividade da lipoxigenase em 100 μΐ de extrato foi testada a 25° C, por adição de 2,9 mL de substrato do ácido linoleico 20 mM, preparados por dispersão de 35 μΐ de ácido linoleico (ácido livre, L-1376, Sigma, EUA) em 5 mL de H20 contendo Tween 20 1%. A reação foi acompanhada espetrofotometricamente, onde a taxa de aumento da absorvância a 234 nm (A234 nm) , devida à formação de dienos conjugados no produto hidroperóxido, é proporcional à atividade da enzima presente. Uma unidade da atividade da lipoxigenase é definida como ΔΑ 234 = 0, 001 por minuto numa reação de 3 mL, equivalente à oxidação de 0,12 pmol do ácido linoleico. O tecido da folha de grãos germinados durante 4 dias no escuro teve os níveis detetados de atividade da lipoxigenase mais elevados (Holtman et al, 1996, Plant P hysiology 111: 569-576). As pontas das folhas de plântulas com 4 dias foram, portanto, selecionadas para o ensaio não-destrutivo de rastreio da lipoxigenase. O pH ótimo para a atividade total da lipoxigenase na cevada foi testado entre pH 4,5 e pH 9,0 e verificado como sendo pH 6,5. Portanto, um tampão HEPES 25 mM (pH 6,5) contendo ácido bórico 0,2 M foi selecionado para o ensaio de triagem.

Uma vez que ambas as enzimas LOX-1 e LOX-2 foram imuno-detetadas em rebentos de plântulas com 4 dias (Holtman et ai. 1996, supra), foi usado um ensaio específico da LOX-1 e LOX-2. O inibidor da lipoxigenase, ácido nordi-hidroguaiarético (NDGA), identificado por Eskin et al. 1977, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1-40, foi verificado como sendo um inibidor seletivo das lipoxigenases de cevada. O NDGA a lxlO-5 M inibe fortemente a LOX-2 purificada de cevada, enquanto a LOX-1 manteve 47% 32 da atividade (Figura 1). A seletividade deste inibidor foi testada no ensaio com a ponta da folha, por determinação da razão entre o 9-hidroperoxioctadecanóide(9-HPOD) e o 13-hidroperoxioctadecanóide (13-HPOD), que resultam da oxidação do ácido linoléico pela LOX-1 e pela LOX-2, respetivamente. No ensaio da lipoxigenase em pontas de folhas cv Vintage, a proporção de 13 HPOD formada caiu de 24,5% para 9,5% em adição ao 5 NDGA lxlO-5 M.

Um ensaio seletivo para a atividade da LOX-2 nos extratos de ponta de folha foi baseado no uso do anticorpo monoclonal especifico para a LOX-1 (5D2) (Holtman et al., 1996, supra) para a LOX-1 imunoprecipitada, presente nos extratos. A atividade da lipoxigenase residual detetada nos extratos após a precipitação da LOX-1 proporcionou uma medida da atividade da LOX-2. A eficiência desta imunoprecipitação (descrita abaixo) foi avaliada pela quantificação das LOX-1 e LOX-2 residuais no extrato sobrenadante por um ensaio ELISA, utilizando anticorpos monoclonais específicos contra a LOX-1 (denotado 5D2) e LOX-2 (denotado 5.8) (Holtman et al., 1996, supra). A imunoprecipitação da LOX-1 a partir de extratos de pontas de folhas cv Vintage removeu 85% da proteína (LOX-1) e 15% da proteína LOX-2. A imunoprecipitação foi realizada numa placa de 96 poços com fundo em V, adicionando 5 pL de Dynabeads (Dynal) revestidas com 5D2 e 75 pL de tampão [Tris-HCl 20 mM pH 7,5, Soro Bovino Fetal 1% v/v (HyClone)] para 20 pL de cada extrato de ponta da folha. A placa foi incubada num agitador de placas de titulação (MTS4 IKA, Labor Technik) durante 1 hora, a 4o C. 0 imunoprecipitado foi sedimentado por centrifugação a 4 o C numa centrífuga Sigma 302 K durante 10 minutos a 2000 rpm. O sobrenadante (70 pL) de 33 cada amostra foi analisado relativamente à atividade da lipoxigenase numa placa de 96 poços de fundo plano, tal como descrito abaixo, mas com a adição de 100 pL de tampão de ensaio (HEPES 25 mM, ácido bórico 0,2 M, pH 6,5) .

Os ensaios LOX-1 e LOX-2 foram adaptados para um método de análise com alto rendimento. As pontas das folhas (1 cm) de 8 grãos com 4 dias de germinação foram individualmente homogeneizados em 150 pL de tampão gelado (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) 2 x 30 segundos num homogeneizador multi-poços (Berg et al, 1992, Electrophoresis 13:.76-81). Após a centrifugação durante 15 minutos a 3000 rpm, 40 pL do sobrenadante de cada extrato foi transferido para uma placa de 96 poços de fundo plano. A cada poço, foram adicionados 170 pL de tampão (HEPES 25 mM, ácido bórico 0,2 M e pH 6,5, NDGA lxlO-5) e 10 pL de substrato (ácido linoleico 20 mM) e, em seguida, incubados durante 20 minutos a 25° C. A reação foi terminada pela adição de 20 pL solução de iodeto de potássio saturada (Kl) e incubada durante mais 8 minutos a 25° C. A reação redox entre os hidroperoxidienos e Kl origina I2, que foi monitorizado pelo seu máximo de extinção a 350 nm num leitor de microplacas (Multiskan MCC/340). 3. Identificação de potenciais mutantes da lipoxigenase 1 nos grãos M3 e M4 de cevada mutada

Os grãos da geração M3 de cv Vintage e cv Caruso foram armazenados a 45° C durante 6,5 dias para quebrar a dormência, assegurando uma frequência de germinação de 95%. Os grãos M3 de cv Vintage (9318) e cv Caruso (9633) foram germinados e selecionados para as linhas cuja atividade da LOX-1 foi de 15% ou menos dos grãos do tipo nativo. As linhas mutantes putativas (50 linhagens cv Vintage e 42 linhagens cv Caruso) foram propagadas para a geração M4, 34 colhidas e os grãos germinados foram re-analisados. 0 fenótipo mutante LOX-1 foi confirmado numa linhagem cv Vintage e seis linhagens cv Caruso, após a medição da atividade da lipoxigenase em extratos de 5 pontas de folhas de cada linhagem. Quando as atividades LOX-1 e LOX-2 em embriões germinantes destas 7 mutantes putativas foram examinadas, apenas a mutante cv Vintage (denotada Linhagem G) mostrou uma redução significativa na LOX-1. Em grãos quiescentes maduros, a atividade da lipoxigenase presente no embrião é quase exclusivamente atividade LOX-1, devido ao padrão diferencial de expressão das duas isoenzimas (Schmitt e van Mechelen, 1997, Plant Sei. 128:. 141-150). A atividade de lipoxigenase total em extratos de embriões a partir de grãos secos maduros da linhagem G (geração M5) foi de 0,06±0,04 U / mg de proteína, em comparação com 0,74 ±0,44 U/mg de proteína em extratos de embrião cv Vintage, conforme determinado pelo ensaio espetrofotométrico da lipoxigenase, descrito na secção 2 do Exemplo 1. A atividade de lipoxigenase residual nos embriões maduros de Linhagem G em ambas as gerações M4 e M5 foi verificada como sendo aproximadamente 9% da linhagem progenitora.

Exemplo 2 A Linhagem G é uma Mutante cv Vintage com vim Fenótipo de Baixa Lipoxigenase

As propriedades agronómicas e o fenótipo mutante da Linhagem G foram analisadas em material da geração M5. As análises iniciais foram conduzidas para confirmar que o material M5 analisado era homozigótico para o fenótipo mutante. O fenótipo LOX-1 reduzido na Linhagem G, detetado na geração M3, poderia resultar de uma mutação dominante ou recessiva. Se a linhagem G selecionada na geração M3 fosse heterozigótica para uma mutação dominante, então, as gerações subsequentes iriam apresentar segregação para o 35 fenótipo. A atividade da lipoxigenase em 26 embriões individuais de Linhagem G de grãos quiescentes da geração M5 foi medida e comparada com a de embriões cv Vintage do tipo nativo. A atividade de lipoxigenase em todos os embriões da Linhagem G foi muito reduzida, com uma média de 0. 06.0,04 U de lipoxigenase por mg de proteína, em comparação com 0,7410,44 U lipoxigenase por mg de proteína em embriões cv Vintage do tipo nativo. Estes dados confirmaram que a Linhagem G na geração M5 era homozigótica para a característica nível de lipoxigenase baixo. 1. A linhagem 6 tem uma fisiologia de crescimento da planta do tipo nativo e desenvolvimento dos grãos.

Os grãos da linhagem G e cv Vintage foram germinados e cultivados numa câmara climatizada sob 16 horas de luz a 15° Ce 8 horas às escuras a 12° C e uma humidade relativa de 80%. As características de crescimento das plantas de Linhagem G e cv Vintage foram semelhantes em relação à altura da planta, número de rebentos por planta, o início do florescimento e o número de grãos por espiga. O peso fresco (Figura 2) e peso seco (Figura 3) dos grãos de Linhagem G e do tipo nativo cv Vintage durante o desenvolvimento de 5 dias após o florescimento (DAF) até a plena maturidade, aproximadamente 90 DAF, foram muito semelhantes. 2. Grão de Linhagem G têm um fenótipo de baixo nivel de lipoxigenase ao longo do desenvolvimento A atividade da lipoxigenase foi medida em extratos de grãos em desenvolvimento de cevada da Linhagem G (geração M5) e do tipo nativo cv Vintage. Os grãos foram homogeneizados em tampão Tris-HCl gelado 20 mM, pH 7,5 contendo Nonidet P-40 0,1% (v/v), um detergente não iónico que aumenta a extração de lipoxigenase, e centrifugados a 15.000 g durante 20 36 minutos para remover o material insolúvel. A atividade da lipoxigenase nos extratos foi medida polarograficamente em 200 pL de tampão saturado com oxigénio (ácido bórico 0,2 M, HEPES 25 mM, pH 6,5) contendo ácido linoleico 1,2 mM a 25° C, usando um elétrodo do tipo Clark para medir o consumo de oxigénio. A atividade da lipoxigenase aumentou durante os primeiros 20 dias do desenvolvimento dos grãos em ambos os grãos de Linhagem G e do tipo nativo, mas apenas na Linhagem G ocorreu a queda do nível de atividade durante a maturação dos grãos (Figura 4).

As quantidades relativas do 9-HPOD e do 13-HPOD formados durante a oxidação do ácido linoleico fornece uma medida dos níveis de atividade da LOX-1 e LOX-2 nos extratos dos grãos. Neste caso o Nonidet P-40 foi omitido do tampão de extração dos grãos para evitar a co-extração de enzimas consumidoras hidroperóxido. Os extratos (100 pL) , misturados com 10 mL de tampão fosfato 50 mM pH 6,5 contendo 200 pM de ácido linoléico, foram incubados durante 20 minutos. A reação foi terminada pelo ajuste do pH para 3,5 e por adição de um padrão interno. Os hidroperóxidos formados no ensaio foram ligados a uma coluna de fase sólida octadecilo (Bakerbond, Baker) e eluídos com metanol. O 9-HPOD e o 13-HPOD foram então separados por HPLC de fase inversa numa coluna C-18 com um solvente de eluição isocrático (tetraidrofurano:Metanol:H20:ácido acético; 25:30:44,9:0,1 (v/v) ajustado para pH 5,5 com amónia concentrada) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/minuto, tal como descrito por Aarle et al, 1991, FEBS Letters 280:. 159-162. Os hidroperóxidos foram detetados a 234 nm e os picos HPOD foram corrigidos contra o padrão interno, prostaglandina B2. 37 A Figura 5 mostra que o 13-HPOD foi o principal produto da atividade da lipoxigenase presente nos grãos durante o primeiro 20 DAF, enquanto o 9-HPOD foi formado por lipoxigenases ativas durante a maturação dos grãos. Embora ambos os extratos de grãos da Linhagem G e do tipo nativo partilhem um perfil similar de atividade de síntese do 13-HPOD, a Linhagem G não evidenciou o aumento do tipo nativo na atividade de síntese do 9-HPOD. Estes dados são consistentes com uma perda de atividade da LOX-1 em grãos de cevada da Linhagem G em maturação. 3. Grãos de linhagem G têm um fenótipo de baixa-lipoxigenase na germinação A atividade total da lipoxigenase em extratos de embriões de grãos germinados a 15° C foi testada como descrito no Exemplo 1 A atividade da lipoxigenase presente nos grãos do tipo nativo quiescentes diminuiu durante os primeiros 4 dias de germinação e depois aumentou (Figura 6). Na linhagem G, a atividade da lipoxigenase em grãos quiescentes foi muito baixa, mas aumentou após 4 dias. A análise dos HPODs formados pela atividade de lipoxigenase em embriões germinantes mostrou que o 9-HPOD foi o principal produto de lipoxigenases presentes em grãos do tipo nativo, quiescentes (Figura 7). O nível de formação do 9-HPOD caiu com o declínio na atividade da lipoxigenase nos extratos. O aumento na atividade da lipoxigenase após 4 dias foi acompanhado da formação de ambos os 9-HPOD e o 13-HPOD. A atividade reduzida da lipoxigenase em grãos de Linhagem G quiescentes foi associado à ausência de formação do HPOD, enquanto o aumento na atividade depois de 4 dias, produziu principalmente o 13-HPOD. Estes dados fornecem evidências de que a atividade da LOX-1 que leva à formação do 9-HPOD é muito reduzida nos embriões de ambos os grãos 38 de cevada de Linhagem G em desenvolvimento, quiescentes e em germinação, enquanto a atividade da LOX-2 que leva à formação do 13-HPOD é inalterada na Linhagem G.

Exemplo 3 A linhagem G tem um Gene Mutante para a Lipoxigenase 1 (lox-1) Causando um Fenótipo com Lipoxigenase Baixa A base molecular para o fenótipo com LOX-1 reduzida da Linhagem G foi investigada, a fim de fornecer uma descrição completa do mutante. As seguintes análises foram realizadas para fornecer uma caracterização completa do fenótipo: 1. A lipoxigenase-1 é sintetizada nos grãos da Linhagem G em desenvolvimento e em germinação A análise de Western blot de extratos de embriões de grãos de cevada em desenvolvimento e germinação foi realizada em paralelo com a medição da atividade da lipoxigenase, tal como descrito no Exemplo 2. Os extratos brutos foram separados por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de acordo com Laemmli, 1970, Nature 227:680-685. As proteínas separadas foram transferidas para nitrocelulose por blotting semi-seco, de acordo com Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 76: 4350-4354. 0 blot foi sujeito a uma sonda com o anticorpo monoclonal específico para a LOX-1, 5D2, tal como descrito por Holtman et al, 1996, Plant Physiology 111:. 569-576, numa diluição de 500x, seguido de incubação com anticorpo de cabra anti-rato acoplado a fosfatase alcalina e detetado com os substratos da fosfatase alcalina azul nitroso de tetrazólio e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, como descrito por Holtman et al., 1996, Plant Physiol. 111: 569-576. As análises Western revelaram que a proteína LOX-1 foi detetada em grãos em desenvolvimento a partir de 10 DAF em embriões cv Vintage e nível aumentou durante a maturação 39 dos grãos (Figura 8).A proteína também estava presente no embrião de cv Vintage de grãos quiescentes, mas diminuiu lentamente durante a germinação (Figura 9). Apesar da LOX-1 ser reconhecida em extratos de embriões de Linhagem G e migrar no SDS-PAGE como uma proteína de tamanho semelhante à cv Vintage LOX-1, os níveis imunodetetáveis da proteína na Linhagem G foram ligeiramente menores do que em cv Vintage.

2. 0 gene lox-1 é expresso nos grãos em desenvolvimento e germinativos da Linhagem G 0 ARN total foi isolado a partir de embriões de grãos de cevada em desenvolvimento e germinação, de acordo com o procedimento de Hensgens e van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163-168, em paralelo com a medição da atividade da lipoxigenase, descrita no Exemplo 2. As amostras de ARN (7,5 pg) foram separadas em geis de agarose desnaturantes e submetidas a Northern blot, como descrito por Sambrook et al., 1989 em Molecular Cloning, a

Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY. Os blots foram hibridados com uma sonda marcada com 32P gerada a partir da região 3'não traduzida da cevada, os nucleótidos 2659-2801 [SEQ ID NO: 1], do cADN do lox 1 (EMBL N° Acesso. L35931) tal como descrito por Holtman et al. , 1996 Physiol Plant. 111: 569-576, usando o Amersham

Random Prime Kit.

As transcrições Lox-1 que codificam para a LOX-1 foram detetadas em embriões de grãos em desenvolvimento e amadurecimento cv Vintage e de Linhagem G a partir de 30 DAF (Figura 10) . O nível de transcritos do lox-1 aumentou durante a germinação em ambos os embriões cv Vintage e Linhagem G, indicando a expressão de novo do gene lox-1 (Figura 11) . Como os níveis detetáveis de transcritos do 40 foram semelhantes nos embriões de Linhagem G e embriões cv Vintage, nem a transcrição reduzida do lox-1 nem a estabilidade do transcrito podem ser responsáveis pelo fenótipo de baixa lipoxigenase da linhagem G. 3. O gene lox-1 da Linhagem G codifica para uma forma mutante da lipoxigenase-1

As sequências de nucleótidos do gene lox-1 da Linhagem G e Vintage cv foram analisadas e comparadas, a fim de determinar a base molecular para o fenótipo de baixa LOX-1 da Linhagem G, que se caracteriza por transcrição normal do gene lox-1, mas por uma acumulação e atividade reduzida da enzima lipoxigenase expressa nos grãos. O ADN genómico de Linhagem G e do tipo nativo cv Vintage foi isolado a partir do tecido foliar de plântulas de acordo com um método descrito por Pitch e Schubert 1993, Nucleic Acids. Res 21: 3328. O gene lox-1 nas preparações de ADN genómico foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores baseados na sequência do gene lox-1 da cevada (van Mechelen et al. 1995, BBA 1254: 221-225; Rouster et al, 1997, Plant J. 11: 513-523). A posição e a sequência dos oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar o promotor lox-1 e as regiões codificantes, indicadas na Figura 12 foram as seguintes:

Iniciador direto 5'-GAA AAG GGA CTT AGA CGC GGT TGC-3 '[SEQ ID NO: 2] e iniciador inverso 5'-TAT AGG CTT ATC GTT CTT GGC TCC CTC CTC TCG-3 ' [SEQ ID NO: 3] foram usados para amplificar o domínio promotor lox-1 por PCR (-361 a +68) do lox-1 de Linhagem G e cv Vintage. 41

Iniciador direto 5' -ACT GAA TGT CAG GCT AAA GGT G-3 ' [SEQ ID NO: 4] e iniciador inverso 5'-GGC ATT AAG AGC AAC TGC TGA-3 '[SEQ ID NO: 5] foram usados para amplificar por PCR a região codificante do lox-1 da Linhagem G.

Iniciador direto 5'-CAA GAT GCA GCT GCT TAT GGG AG-3 '[SEQ ID NO: 6] e iniciador inverso 5'-TGG CGA TTT AAA TTA GAT GAT GGA GCT GT-3 ' [SEQ ID NO: 7] amplificaram por PCR a região codificante do lox-1 cv Vintage.

As reações de PCR consistiram em 250 ng de ADN genómico em 50 pL de volume contendo 50 pmol de iniciadores e 2 U Pfu de ADN polimerase (Promega) de acordo com as instruções dos fornecedores de enzimas. As amplificações por PCR foram realizadas num Robocycler Stratagene: 1 minuto a 94° C, 1 ciclo; 1 minuto a 94° C, 2 minutos a 62° C e 5 minutos a 72° C, 30 ciclos; 10 minutos a 72° C, 1 ciclo. Os produtos da PCR foram separados em geis de agarose 1,2%. Os fragmentos de ADN, correspondentes em comprimento à região amplificada, foram purificados usando o kit de extração de Gel Qiax (Qiagen) e clonado no plasmídeo pcDNA2.1 (Invitrogen). A sequência de nucleótidos em ambas as cadeias do promotor lox-1 clonado e regiões codificantes foi determinada usando a reação de terminação de cadeia didesoxinucleótido com iniciadores oligonucleótidos específicos e analisada num ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (PE Biosystems). As comparações de sequência foram realizadas utilizando o pacote de software de análise de sequência DNA STAR (DNA STAR Inc., EUA). A região promotora e a estrutura intrão-exão da região codificante do lox-1 da cevada são apresentadas na Figura 13, e foram deduzidas a partir de uma comparação da sequência de nucleótidos do lox-1 genómico do tipo nativo e 42 sequências de cADN (Figura 12) . A região sequenciada da região promotora do lox-1 de -363 a +68, (numeradas em relação ao local de inicio da transcrição; van Mechelen et al, 1995, BBA 1254:. 221-225), é suficiente para dirigir a expressão dos genes especifica para os embriões e temporalmente regulada, caracteristica do gene nativo (Rouster et al, 1998, Plant J 15: 435-440) . O promotor e a região transcrita do tipo nativo do gene lox-1 [SEQ ID NO: 8] é 46 63 nt de comprimento e contém 6 intrões de entre 82 nt e 634 nt de comprimento, que estão ausentes do respetivo cADN [SEQ ID NO: 10] e devem, portanto, ser removidos durante o splicing do transcrito de ARN. A comparação da sequência de nucleótidos do lox-1 da Linhagem G com a do tipo nativo (Figura 12) mostrou que o alelo do lox-1 da Linhagem G tem duas mutações pontuais. Uma delas é uma substituição silenciosa C -> T na posição 221 no exão 1 e a segunda é uma substituição G -> A na posição 2347 no exão 3 (Figura 13).0 gene lox-1 do tipo nativo de cevada codifica para uma proteína de 862 resíduos de ácido amino [SEQ ID NO: 9] , enquanto que a mutação na posição 2347 no alelo do lox-1 da Linhagem G causa a substituição de um aminoácido glicina por ácido aspártico no resíduo 368 da proteína codificada. 0 alinhamento de lipoxigenases de plantas relacionadas indicou que a glicina-368 em LOX-1 de cevada é fortemente conservada. Além disso, este resíduo, que corresponde a glicina-353 na LOX-1 de soja, é um dos 51 resíduos neutros ou hidrófobos que se alinham na cavidade do substrato da enzima, como pode ser visto a partir de sua estrutura cristalina (Minor et al., 1996, Biochemistry 35: 10.687- 10.701) e é apresentado na (Figura 22). A inserção de um resíduo de ácidoamino carregado nesta posição é, portanto, 43 susceptivel de perturbar as propriedades estruturais e funcionais da enzima. 4. A proteína LOX-1 mutante codificada pelo alelo lox-1 de Linhagem G tem atividade enzimática baixa e é responsável pelo fenótipo de lipoxigenase baixa da linhagem G. A mutagénese por azida de sódio de grãos cv Vintage, que induziu o alelo lox-1 mutado na Linhagem G, pode ter induzido mutações adicionais no genoma da Linhagem G. Foram assumidas duas abordagens experimentais para demonstrar que o alelo lox-1 mutante na linhagem G é responsável pelo seu fenótipo de lipoxigenase baixa, ao invés de outras mutações no genoma. A atividade enzimática da LOX-1 codificada pelo alelo lox-1 mutante e do tipo nativo, foi determinada a fim de provar que a substituição glicina -> ácido aspártico na enzima mutante provoca a redução da estabilidade e da atividade.

Os dois genes lox-1 genes foram transitoriamente expressos em protoplastos de aleurona isolados a partir de grãos maduros embebidos, pois o nível de expressão da lipoxigenase endógena esperado nestas células era inferior aos limites de deteção. Nenhum dos genes identificados de lipoxigenase de cevada, que são expressos em cevada germinante, são detetados no tecido de aleurona (Van Mechelen et ai., 1999 supra). A fim de direcionar a expressão transitória do gene lox-1 em protoplastos de aleurona, as suas regiões codificadoras foram traducionalmente fundidas com um promotor constitutivo conhecido por ser ativo nestes protoplastos.

As regiões de codificação do gene lox-1 mutante (posições na sequência +1 a +4350) e do tipo nativo (posições na sequência +69 a +4230) e o cDNA do lox-1 do tipo nativo 44 (posições na sequência + 69 a +2654) cada um clonado no plasmídeo pcDNA2.1 (ver secção 3), foram excisadas por digestão dos locais Kpnl e EcoRV num vetor poliligante. As regiões de codificação foram clonadas no plasmídeo pUBARN (Jensen et al, 1998, Hereditas 129:. 215-225) entre o promotor Ubi de ubiquitina de milho constitutivamente ativo (tal como descrito na Patente dos EUA N° 005510474A) e do terminador Nos, no lugar do gene bar que codifica para a fosfinotricina acetil transferase (Figura 14).

Os protoplastos foram isolados a partir do tecido de aleurona de Hordeum vulgare embebidos cv Himalaya de acordo com o protocolo de Skriver et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88:7266-7270. As alíquotas de 2xl05 protoplastos foram transfetadas a 0o C com ~100 pg de ADN plasmídico (quantidades equimolares de cada plasmídeo) por captação de ADN mediada por polietileno glicol (PEG) (Lee et al., 1997, Plant Mol. Biol. 13: 21-29) e depois incubadas em meio de cultura de protoplastos de aleurona a 25° C e descrita anteriormente (Skriver et ai., 1991 supra) . Após incubação durante 48 horas, o meio de cultura foi cuidadosamente removido e os protoplastos foram ressuspensos e homogeneizados em 300 pL de tampão de ensaio de lipoxigenase (ácido bórico 0,2 mM, HEPES 25 mM, pH 6,5). Os homogenatos foram centrifugados a 15.000 g durante 5 minutos para sedimentar o material insolúvel e os sobrenadantes (10 pL) foram posteriormente analisados para a atividade total da lipoxigenase usando o teste rápido de rastreio descrito no Exemplo 1, seção 1, mas com omissão do inibidor NDGA. O conteúdo em proteína dos extratos de protoplastos foi medido por um ensaio de Bradford de ligação ao corante (Bradford 1976, Anal. Biochem, 72:. 248) fornecido pela Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, 45 EUA e a atividade das lipoxigenases foi expressa por mg de proteína no extrato.

Os protoplastos transfetados com o plasmídeo de controlo, pUBI-GUS, onde o promotor da ubiquitina-1 de milho dirige a expressão do gene repórter β-glucuronidase, não deu nenhuma atividade de lipoxigenase detetável. A expressão transitória do gene lox-1 do tipo nativo e cADN em protoplastos deram ambos níveis elevados de atividade da lipoxigenase nos extratos de protoplastos (Figura 15) . A expressão maior do cADN do tipo nativo do lox-1 em comparação com a sequência genómica pode ser devida a uma frequência de transfecção maior para o plasmídeo de expressão do cADN do lox-1 (4929 pb versus o constructo do gene lox-1 de 6505 bp) . A expressão transitória do gene mutante lox-1 deu níveis baixos da atividade das lipoxigenases, ~ 10% da atividade de lipoxigenase do tipo nativo. Estes dados demonstram claramente que o gene lox-1 mutante na Linhagem G codifica para uma lipoxigenase com atividade muito reduzida, o que contribui para o fenótipo de lipoxigenase baixa.

Exemplo 4

Ensaio do Local Polimórfico Amplificado por Clivagem-PCR (PCR-CAPS): Um Método Usado para Identificação do Gene lox-1 Mutante

Um método analítico que permite a identificação do gene lox-1 mutante da Linhagem G em qualquer base genética foi desenvolvido com base no ensaio de PCR-CAPS. 0 ensaio envolve a amplificação por PCR de fragmentos de ADN genómico, seguida por digestão das sequências amplificadas com uma endonuclease de restrição específica para expor um polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição (RFLP). 46 A sequência de codificação do gene lox-1 mutante abriga duas mutações pontuais (ver Exemplo 3) , onde a mutação na posição 2347 (Figura 12) introduz um local de clivagem para a endonulease de restrição Aat II, não encontrado no gene lox-1 do tipo nativo (Figura 16) . 0 ensaio de PCR-CAPS seguinte, com base no polimorfismo criado pela presença deste local de restrição no gene lox-1, mostra discriminar entre um gene lox-1 do tipo nativo e um gene mutado lox-1. 0 ADN genómico foi isolado a partir de folhas jovens de plântulas M6 de Hordeum vulgare , L. cv Vintage e Linhagem G de acordo com o procedimento de Pitch e Schubert (1993, supra) . A sequência de ADN que engloba a posição 2347 (local de mutação do gene lox-1 de Linhagem G) foi amplificada por PCR, utilizando iniciadores específicos para o gene lox-1 [SEQ ID NO: 8] . Os fragmentos de ADN amplificado pelo iniciador direto selecionado 5'-CGCTACGACGTCTACAACGA-3 '[SEQ ID NO: 13] e iniciador inverso 5'-CAGACTACTTTTTGGCGGGA-3 '[SEQ ID NO: 14] são apresentados na Figura 17. As reações de PCR foram realizadas com 250 ng de ADN genómico num volume de 50 pL contendo 50 pmol de cada iniciador e 1 unidade de Taq ADN polimerase (Promega) de acordo com as instruções dos fornecedores. As amplificações por PCR foram realizadas num Robocycler Stratagene como se segue: 1 minuto a 94° C, 1 ciclo; 1 minuto a 94° C, 1,5 minutos a 60° C e 2 minutos a 72° C, 30 ciclos; 10 minutos a 72° C, 1 ciclo. Os fragmentos amplificados do mutante e do gene lox-1 do tipo nativo foram ~ 650 pb (Figura 18) , correspondendo ao tamanho esperado (Figura 17) . Os produtos de PCR, purificados numa coluna de rotação (Qiagen), foram digeridos com 25 unidades de endonuclease de restrição Aat II durante 24 horas a 37° C e analisadas num gel de agarose 1,2%. 47 A digestão do lox-1 do tipo nativo num produto PCR produziu fragmentos de ADN de 10, 179 e 462 pb e os fragmentos do produto da PCR mutante lox-1 foram 10, 149, 179 e 313 pb, onde os fragmentos de ADN adicionais foram devidos à digestão parcial do produto lox-1 da PCR (Figura 19) . O padrão de fragmentos corresponde ao RFLP esperado resultante desta mutação, onde o fragmento de 313 pb é exclusivo para o mutante lox-1. Este ensaio PCR-CAPS proporciona uma ferramenta reprodutível e especifica para a identificação do alelo lox-1 em cevada e pode, assim, ser explorada em programas de reprodução e melhoramento da cevada, que visam introduzir este gene em variedades de cevada novas.

Exemplo 5

Retrocruzamento do Fenótipo de Lipoxigenase Baixa da Linhagem G com cv Alexis Demonstra uma ligação genética ao Gene lox-1 Mutante O retrocruzamento repetido foi usado para transferir o fenótipo de lipoxigenase baixa de linhagem G numa progenitora recorrente (neste caso, a cv Alexis). O programa de retrocruzamento apresentado na Figura 20, combinado com a seleção para o fenótipo de lipoxigenase baixa, progressivamente substitui o genoma da Linhagem G pelo genoma progenitor recorrente. Além disso, outras mutações introduzidas no genoma da Linhagem G durante o tratamento de mutagénese com azida de sódio serão eliminadas. No primeiro retrocruzamento da Linhagem G homozigótica para a lipoxigenase baixa (genótipo denotado 11) para cv Alexis (genótipo denotado LL) as linhagens de progenia serão heterozigóticas (genótipo denotado Ll) . Um fenótipo de lipoxigenase baixa devido a uma mutação recessiva não será detetável em linhagens heterozigóticas 48 para a mutação. As progenias são auto-polinizáveis e dão origem a uma população mendeliana normal de segregação, nomeadamente, 1LL: 2 Ll: 1 11. 0 genótipo homozigótico de baixa lox 11 resultante do primeiro retrocruzamento dará origem a uma base genética de 50% cv Alexis. Depois de dez retrocruzamentos, a base progenitora recorrente será de aproximadamente 99,9%.

As Hordeum vulgare , L. cv Alexis e a Linhagem G foram propagadas numa estufa através do programa de retrocruzamento Os grãos das progenias retrocruzadas foram germinados em placas de Petri com papeis de filtro embebidos em 4 mL de H2O, durante 3 dias a 22° C no escuro. As linhagens de baixa-lipoxigenase foram tríadas por medição da atividade total da lipoxigenase em extratos do coleóptilo (7 mm superiores) a partir das plântulas germinantes, como descrito no Exemplo 1. As progenias do 3o e 4o retrocruzamento também foram analisadas relativamente à herança do gene lox-1 mutante utilizando o ensaio de PCR-CAPS descrito no Exemplo 4. A frequência esperada do fenótipo de lipoxigenase baixa na progenia segregante das quatro gerações do retrocruzamento foi de 25% para uma mutação recessiva. A frequência observada da atividade da lipoxigenase baixa na progenia (24 grãos) das quatro gerações do retrocruzamento está de acordo com a frequência esperada (Figura 20).Quando a 3a e A 4a progenia do retrocruzamento contendo o genótipo homozigótico de baixa lox 11 foram analisadas com o ensaio de PCR-CAPS, foram todos verificados como tendo o fragmento de diagnóstico com 313 pb, enquanto a progenia contendo a atividade de lipoxigenase do tipo nativo carecia deste fragmento (Figura 21). 49 0 programa de retrocruzamento demonstra que o alelo lox-1 mutante pode ser transferido para uma nova base genética de fundo e é herdado de forma recessiva monofatorial seguindo a segregação Mendeliana. Uma vez que o progenitor recorrente de base é 93,8% na 4a progenia de retrocruzamento, a co-herança do gene lox-1 mutante e o fenótipo de lipoxigenase baixa fornece a confirmação da sua ligação genética.

Exemplo 6

Cerveja fabricada a partir do Malte de Cevada da Linhagem G Acumula Menos trans-2-nonenal Durante o armazenamento, Originando uma Melhoria na Estabilidade do Sabor

As Hordeum vulgare L cv Vintage e Linhagem G foram propagadas no campo durante várias temporadas, a fim de fornecer grãos suficientes para maltagem industrial. A escala industrial seguinte e ensaios de produção de cerveja, bem como as análises da cerveja terminada foram realizados para demonstrar o valor da cevada de Linhagem G com lipoxigenase baixa para a melhoria na estabilidade do sabor. 1. Maltagem industrial e secagem da Linhagem G e cv Vintage A maltagem foi realizada numa escala de 10 toneladas numa fábrica de maltagem, em dois ensaios como se segue:

Ensaio 1: Grãos de Cevada de Linhagem G (Colheita de 1996)

Condições de Maceração: 8 horas de imersão; 14 horas de secagem; 8 horas de imersão; 10 horas de secagem; 4 horas de imersão em água de maceração a 16° C. Condições de Maltagem: 12 horas a 18° C; 24 horas a 16° C; 24 horas a 14° C; 60 horas a 12° C. Condições de Secagem: 12 horas a 60° C; 3 horas a 68° C, 4 horas a 74° C; 3 horas a 80° C. 50

Ensaio 2: cv Vintage e Linhagem G (Colheita de 1996/1997)

Condições de Maceração: 8 horas de imersão; 10 horas de secagem; 6 horas de imersão; 15 horas de secagem; 4 horas de imersão em água de maceração a 15° C. Condições de Maltagem: 5 dias, com entrada de ar a 15° C e pulverização para manter o nivel de humidade. Condições de Secagem: 10 horas a 50° C; 2 horas a 60° C, 2,5 horas a 80° C.

Análises de maltagem de 2 amostras do malte da Linhagem G do Ensaio 1 comparadas com as do malte de controlo, cv Nevada (Tabela 1) e do Ensaio 2 comparadas com as da cv Vintage (Tabela 2) confirmaram que o malte da Linhagem G é adequado para ensaios de produção de cerveja. TABELA 1 ENSAIO DE MALTAGEM 1 Variedade de Cevada Cv Nevada Linhagem G Linhagem G Ano da Colheita 1996 1996 1996 Análises do Malte Conteúdo em humidade % 4,7 4,3 4,4 Extrato fino %ai. 76, 9 76,1 75,3 Extrato fino d.m. %dm. 81, 4 79, 5 78,7 Tempo de sacarificação Min <10 <10 <10 Pó diastático %WK 252 373 365 Cor EBC 2,8 4,4 3,8 PH 6,16 5, 97 5, 99 Turbidez EBC 9,0 2,5 2,4 Proteína total d.m. % 10, 35 10, 74 12,03 Azoto solúvel Mg/L 647 787 765 Sol. Proteína % malte d.m. %d.m. 3,7 4,4 4,3 Kolbach 35,3 40,8 35,4 Azoto aminado Livre Mg/L 97 125 118 Friabilidade % 89, 5 85, 6 89,5 Grãos não modificados inteiros % 1,1 0, 6 0, 5 Grãos não modificados parciais % 2,3 1,0 0, 6 β-glucana em mosto mg/L 114 66 36 β-glucana em malte % p/p 0,24 0,11 0, 05 S-metilmetionina/DMS eq. pg/g 2,4 6,4 8,4 DMS livre pg/g 1,0 6, 6 4,7 NDMA pg/kg n.d. 0,3/0,6 0,3/0,3 51 TABELA 2 ENSAIO DE MALTAGEM 2 Variedade de Cevada Vintage Linhagem G Linhagem G Ano da Colheita 1996 1996 1996 Conteúdo em humidade % 4,1 4,1 4,3 Extrato fino %ai. 77,0 75, 6 77,5 Extrato fino d.m. %dm. 80,3 78,8 80,9 Diferença fino/grosseiro %dm. 0,7 1,6 1,7 Tempo de sacarificação min " <10 Pó diastático %WK 343 342 268 Cor EBC 2,5 2,8 3,4 PH 6, 05 6, 01 6,12 Turbidez EBC 1,5 1,3 2,5 Proteína total d.m. % 10, 98 12,22 9, 82 Azoto solúvel mg/L 696 741 610 Sol. Proteína % malte d.m. %d.m. 3,9 4,1 3,4 Kolbach 35,2 33, 7 34,6 Azoto aminado Livre mg/L 110 117 100 Friabilidade % 91, 3 81, 8 89,5 Grãos não modificados inteiros % 0,7 1,1 1,3 Grãos não modificados parciais % 1,0 2,7 2,7 β-glucana em mosto mg/L 97 172 117 β-glucana em malte % p/p - - 0, 3 S-metilmetionina/DMS eq. pg/g — — DMS livre pg/g - - - 2. Produção de cerveja industrial com malte de Linhagem G, cv Vintage, e malte de controlo cv Nevada

Dois ensaios de produção de cerveja foram realizados, usando mosto preparado a partir da Linhagem G e malte de controlo cv Nevada no Ensaio 1 e malte controlo cv Vintage no Ensaio 2. A cerveja foi fabricada à escala industrial 30 hl com 475 kg de malte de acordo com o seguinte esquema: Empastagem a 50° C; 30 minutos a 50° C; 30 minutos de aquecimento 50-70° C; 15 minutos a 70° C. Uma parte do mosto foi aquecida durante 20 minutos de 7-10° C e 5 minutos a 100° C, enquanto a pasta principal foi mantida a 70° C durante mais 25 minutos e então as duas pastas foram combinadas e 52 mantidas durante 10 minutos a 76° C. As etapas de produção de fermentação do mosto, separação do grão gasto, arrefecimento, fermentação, fermentação baixa e enbalagem em garrafas de vidro castanhas foram de acordo com as práticas correntes na produção de cerveja. 3. Estabilidade de sabor e conteúdo T2N de cerveja produzida a partir da linha G, malte de cv Vintage e malte controlo cv Nevada A cerveja acabada de engarrafar foi armazenada a 5o C e analisada dentro de 2 meses após produção. A estabilidade do sabor da cerveja fresca e armazenada foi avaliada em dois laboratórios independentes após dois tipos diferentes de condições de armazenamento da cerveja. No laboratório A, a cerveja foi submetida a um processo de envelhecimento forçado, onde a cerveja era armazenada a 37° C durante um período de 7 dias, enquanto que no laboratório B a cerveja foi armazenada a 30° C durante 6 e 12 semanas. Os níveis do Trans-2-nonenal na cerveja foram determinados por cromatografia gasosa e deteção por espectrometria de massa após derivatização de carbonilos com 0-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)-hidroxilamina, essencialmente tal como descrito por Grõnqvist et al. 1993 Proceedings of the 24th EBC Congress, Oslo, 421-428. Um painel treinado para degustação de cerveja avaliou a pontuação geral do sabor da cerveja, que incluiu a deteção de um sabor a papelão, indicativo de trans-2-nonenal livre na cerveja.

Laboratório A: Tolerância ao Envelhecimento Forçado A comparação de cerveja, fabricada a partir do malte de linhagem G e do malte de controlo, cv Nevada, no primeiro ensaio de produção de cerveja (Tabela 3) demonstrou que a cerveja da linha G teve uma maior estabilidade no sabor e um menor conteúdo em trans-2-nonenal a seguir a um 53 envelhecimento forçado, quando comparado com os controlos. 0 segundo ensaio, comparando cerveja fabricada a partir do malte de linha G com cerveja produzida a partir de malte cv Vintage, das culturas parentais, confirmou os dados iniciais (Tabela 4). TABELA 3 ENSAIO DE FERMENTAÇÃO 1 Malte da cevada Cv Nevada Linhagem G Conteúdo em S02 (mg/mL) 1 1 T2N** (ppb) - Cerveja Fresca 0, 009 0, 005 T2N** (ppb) - Cerveja envelhecida (37 °C/7 dias) 0, 117 0, 025 Sabor* - Cerveja fresca 5,9 5, 3 Sabor* - Cerveja envelhecida (37 °C/7 dias) 1,3 5,1 *Escala de avaliação do sabor 1-10 de qualidade crescente; **trans-2-nonenal. TABELA 4 ENSAIO DE FERMENTAÇÃO 2 Malte da cevada Cv Vintage Linhagem G Conteúdo em S02 (mg/mL) 2 2,5 T2N** (ppb) - Cerveja Fresca 0, 023 0, 019 T2N** (ppb) - Cerveja envelhecida (37 °C/7 dias) 2,9 o\ LO Sabor* - Cerveja fresca 5,5 6,1 Sabor* - Cerveja envelhecida (37 °C/7 dias) 2,9 5,9 *Escala de avaliação do sabor 1-10 de qualidade crescente; ** trans-2-nonenal.

Laboratório B: Tolerância ao armazenamento a 30° C A cerveja produzida a partir de malte de linha G teve níveis inferiores de trans-2-nonenal, após 6 e 12 semanas, à temperatura elevada de armazenamento de 30° C, quando comparada com a cerveja produzida a partir de qualquer um dos maltes de referência (Tabela 5 e 6) e teve uma estabilidade do sabor melhor, de acordo com a opinião de um painel de degustação. 0 limiar do sabor para o trans-2-nonenal nestas cervejas analisadas está perto de 0,08 ppb. 54 TABELA 5 ENSAIO DE FERMENTAÇÃO 1 Malte de Cevada Cv Nevada Linhagem G Tra.ns-2-nonenal (ppb) - Cerveja fresca 0, 050 0, 044 rrars-2-nonenal (ppb) - 30 °C/6 semanas 0, 072 0, 037 Trans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/12 semanas 0, 095 0, 046 Sabor a Trans-2-nonenal* - Cerveja fresca 0, 6 O ω Sabor a Trans-2-nonenal* - 30 °C/6 semanas r-* 00 t—1 Sabor a Trans-2-nonenal* - 30 °C/12 semanas 2,5 0, 6 ^Classificação da deteção do sabor a trans-2-nonenal numa escala de Ι- ΙΟ TABELA 6 ENSAIO DE FERMENTAÇÃO 2 Malte de Cevada Cv Vintage Linhagem G Trans-2-nonenal (ppb) - Cerveja fresca 0, 070 0, 062 Trans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/6 semanas 0, 093 0, 070 Trans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/12 semanas 0,133 0, 080 Sabor a rrans-2-nonenal* - Cerveja fresca 00 o 0,9 Sabor a rrans-2-nonenal* - 30 °C/6 semanas 2,5 1,7 Sabor a Trans-2-nonenal* - 30 °C/12 semanas 2,2 1,3 ^Classificação da deteção do sabor a trans-2-nonenal numa escala de Ι- ΙΟ A estabilidade do sabor melhorada da cerveja produzida a partir do malte de linhagem G, tal como medida pelos níveis de trans-2-nonenal detetado no armazenamento seguinte da cerveja a 30° C a partir dos dados combinados do ensaio de produção de cerveja, demonstra ser estatisticamente significativa (Tabela 7). TABELA 7

TRANS—2—NONENAL NA CERVEJA ARMAZENADA fresca Média Desvio Padrão Diferença P 2 caudas Significante (P<0,05) Referência 0, 060 0, 012 0, 007 0, 34 Não Linhagem G 0, 053 0, 011 6 semanas, 30 SC Média Desvio Padrão Diferença P 2 caudas Significante (P<0,05) Referência 0, 083 0, 013 0, 029 0, 031 sim Linhagem G 0, 054 0, 021 12 semanas, 30 fiC Média Desvio Padrão Diferença P 2 caudas Significante (P<0,05) Referência 0,114 0, 023 0, 051 0, 003 sim Linhagem G 0, 063 0, 020 55

Uma vez que os níveis naturais de sulfito eram baixos em ambos os ensaios de produção de cerveja, os níveis do trans-2-nonenal livre na cerveja envelhecida refleteriam bem o potencial do trans-2-nonenal das diferentes cervejas, nomeadamente o nível de aductos do trans-2-nonenal presentes na cerveja fresca. A adição de sulfito pode temporariamente retardar o processo de formação do travo a oxidação, ao complexar-se com o trans-2-nonenal livre, até os níveis de sulfito serem eduzidos por oxidação devido à troca de gases através da embalagem.

Os ensaios descritos de produção de cerveja com baixo teor em LOX-1 de malte de cevada fornecem a primeira evidência inequívoca de que a atividade da LOX-1 em cevada durante o processo de maltagem e de produção de cerveja é um fator determinante da aparência do composto alterador do sabor trans-2-nonenal em cerveja envelhecida. 56

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Douma, Anneke Doderer, Albert Cameron-Mills, Verena Skadhauge, Birgitte Bech, Lene <120> CEVADA COM NÍVEL BAIXO DE LIPOXIGENASE 1 <130> 11225.12wo01 <160> 18

<170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 143 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <400> 1 ctaagccatc ggcaaccatg gatgaataaa gggcgttcgc cacgtacgaa acttgtcgag 60 agattggtgt agtgtgtgtc tgtgacagta ctatgtcagc agttgctctt taagccgaat 120 aaataaagca gatttgcttc caa 143

<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <400> 2 gaaaagcttg gaggtagacg ctgc 24 <210> 3 <211> 33 57 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <4 0 0> 3 tataggatcc ttgttcttgg <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 4 agtgaaaaac agtgtgctgg <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <4 0 0> 5 ggcttaaaga gcaactgctg <210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <400> 6 caagatgcat atgctgctgg <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Hordeum vulgare cctcctctcc tcg 33 tg 22 a 21 gag 23 58 <4Ο0> 7 cgatggttta aattagatgg agatgctgt 29

<210> 8 <211> 4663 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <400> 8 cagccccatg catgcacatg cacatgcaca tgcacatgca gtgcagccaa gcaccgctcg 60 atgggcgatc acccgtcacg ggaccggagc gcgccatgcg aagcacgagg agggcacgtc 120 accgtccgcg cgcagcacgt ggagagcacg tcgccgtccg atccatctct ccaaagccga 180 gcgccacacc accgggaccg gacccggacc ggcctataaa ttgcccggac cgagctgcaa 240 gcagctcctc acacacactc acgcaacaca catccatctt cactgaaaag tgaaaaacag 300 tgtgctggtg ccattggttg gagcagtgaa agcgaggaga ggaggccaag aacaagatgc 360 tgctgggagg gctgatcgac accctcacgg gggcgaacaa gagcgcccgg ctcaagggca 420 cggtggtgct catgcgcaag aacgtgctgg acctcaacga cttcggcgcc accatcatcg 480 acggcatcgg cgagttcctc ggcaagggcg tcacctgcca gcttatcagc tccaccgccg 540 tcgaccaagg taatcactac cctcctccgg ccttctcctc tgtttacaag atatagtatt 600 tctttcgtgt gggccggcgg ccatggatgg atggatgtgt ctggatcggc taaagaagat 660 aggatagcta gccctggccg gtcgtcttta cctgagcatg ggcatatgcc atcgaaaaaa 720 gagacaacag catgcatgca tggtgcgcgc accagaccac gcagagcacc ggatgctcga 780 gacaaagcaa cacaacaagc aaggacgaca cgtcaaaagc aacacaacaa gcaaggacgg 840 cacgtcaaaa gcaacacaaa cctaaactaa agcacaaaga cgtaagagca agcacacaat 900 cagcaggcta taaacagttg tcatcaaaaa caacgctgga agagagagag aaggaaggaa 960 gtagtagcca tgaaaaatta aatcaccggg cgttgctctt tgcccaacaa ttaatcaagc 1020 agggtacgtg gcatgtatag ttcttgtaag taaactaagc atgtgatatg agaaggtacg 1080 tggtggtgca gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc tggagcagtg 1140 ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca ccttcgactg 1200 ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc acagctccga 1260 gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca acctcacctt 1320 cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg tcttcttcgc 1380 caacgacgtg cgtggatttt cctctacttt cctctccttt cattttcacc gccttcgtca 1440 59 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcagcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat ctagatgcat gtcacataat tattgcatac caaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gacgtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacctgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca tctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg ctgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccggcgtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 gtaattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggtt 3000 tgaaatttgc aggcgctgga aagcaacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 ctcttcttcc tgcgcggcga cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 atcatccagg gcggccttac cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg 3300 tggcaccagc tcgtcagcca ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360 60 60 tgcacaacaa ctgatcgaaa tatgattgat tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt 3420 gatggagccg ttcgtgatct cgacgaaccg gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa 3480 gctgctgagc ccgcactacc gcgacaccat gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct 3540 catcaacgcc ggcggcatct tcgagatgac ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat 3600 gtcggccgtg gtgtacaagg actggaagtt caccgagcag ggactgccgg acgatctcat 3660 caagaggtac gtacctggta aatgttatga atgtgtaaaa caaattgggc gtctcgctca 3720 ctgacaggaa cgtggtaaaa aaaatgcagg ggcatggcgg tggaggaccc gtcgagcccg 3780 tacaaggtgc ggttgctggt gtcggactac ccgtacgcgg cggacgggct ggcgatctgg 3840 cacgccattg agcagtacgt gagcgagtac ctggccatct actacccgaa cgacggcgtg 3900 ctgcagggcg atacggaggt gcaggcgtgg tggaaggaga cgcgcgaggt cgggcacggc 3960 gacctcaagg acgccccatg gtggcccaag atgcaaagtg tgccggagct ggccaaggcg 4020 tgcaccacca tcatctggat cgggtcggcg ctgcatgcgg cagtcaactt cgggcagtac 4080 ccctacgcgg ggttcctccc gaaccggccg acggtgagcc ggcgccgcat gccggagccc 4140 ggcacggagg agtacgcgga gctggagcgc gacccggagc gggccttcat ccacaccatc 4200 acgagccaga tccagaccat catcggcgtg tcgctgctgg aggtgctgtc gaagcactcc 4260 tccgacgagc tgtacctcgg gcagcgggac acgccggagt ggacctcgga cccaaaggcc 4320 ctggaggtgt tcaagcggtt cagcgaccgg ctggtggaga tcgagagcaa ggtggtgggc 4380 atgaaccatg acccggagct caagaaccgc aacggcccgg ctaagtttcc ctacatgctg 4440 ctctacccca acacctccga ccacaagggc gccgctgccg ggcttaccgc caagggcatc 4500 cccaacagca tctccatcta atctaagcca tcggcaacca tggatgaata aagggcgttc 4560 gccacgtacg aaacttgtcg agagattggt gtagtgtgtg tctgtgacag tactatgtca 4620 gcagttgctc tttaagccga ataaataaag cagatttgct tcc 4663

<210> 9 <211> 862 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 9

Met Leu leu Gly Gly Leu ile Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser 1 S 10 15

Leu Met Arg Lys Asn vai Leu Asp 25 30

Ala Arg Leu Lys Gly Thr vai Vai 20 61

Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr ile 35 40

Gly Lys Gly vai Thr cys Gin Leu 50 55

Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys vai 65 70

Trp vai Thr Ser Leu pro Ser Leu 85

Leu Thr Phe asp Trp Glu vai Glu 100

Vai Vai Asn Asn Tyr His ser Ser 115 120

Leu His Asp Vai Pro Gly Arg ser 130 135

Ser Trp lie Tyr Pro Ala Ala Asn 145 150

Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro Ser 165

Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn 180

Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg Ile 195 200

Leu Gly Glu Gly Arg Pro ile Leu 210 215 pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg 225 230

Leu Glu ser Arg Leu Ser Leu Leu 245

Ile Asp Gly Ile Gly Glu Phe Leu 45

Ile Ser ser Thr Ala vai Asp Gin 60

Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin 75 80

Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly 90 95

Lys Leu Gly vai Pro Gly Ala ile 105 110

Glu Phe Leu Leu Lys Thr ile Thr 125

Gly Asn Leu Thr Phe Vai Ala Asn 140

Tyr Arg Tyr ser Arg vai Phe Phe 155 160

Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro

17Π 17C

xr v/ x/ J

Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly 185 190

Tyr Arg Tyr Asp Vai Tyr Asn Asp 205

Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr 220

Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser 235 240

Glu Gin Ile Tyr vai Pro Arg Asp 250 255

Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr ser Ile 260 265 270

Lys Ala Ile Thr Gin Gly Ile Leu Pro Ala vai Arg Thr Tyr Vai Asp 275 280 285

Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp Ile Ile Asn Leu Tyr 290 295 300

Glu Gly Gly Ile Lys Leu Pro Lys Vai Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg 305 310 315 320

Lys Gin Phe Pro Leu Gin Leu Ile Lys Asp Leu Leu Pro vai Gly Gly 325 330 335 asd Ser Leu Leu Lys Leu Pro vai Pro His Ile Ile Gin Glu Asn Lys 340 345 350

Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu vai Leu Ala Gly 355 360 365 val Asn Pro vai Met Ile Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro Pro Lys Ser 62 370 375 380

Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr ile Thr Ala 385 390 395 400

Glu His ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr.val Gin Gin Ala Leu 405 410 415

Glu ser Asn Arg Leu Tyr lie Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro 420 425 430

Phe Leu ile Asp vai Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe lie Tyr Ala Thr 435 440 445

Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala 450 455 460

Ile Glu Leu ser Glu Pro ile Ile Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys 465 470 475 480

Ser Lys Vai Tyr Thr Pro vai Pro Ser Gly Ser vai Glu Gly Trp vai 485 490 495

Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr vai Ala vai Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510

Gin Leu val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Vai Met Glu Pro Phe 515 520 525

Val Ile Ser Thr Asn Arg His Leu Ser val Thr His Pro val His Lys 530 535 540

Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr Ile Asn Ala Leu Ala 545 550 555 560

Arg Gin Thr Leu ile Asn Ala Gly Gly Ile Phe Glu Met Thr val Phe 565 570 575

Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala val Val Tyr Lys Asp Trp 580 585 590

Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu ile Lys Arg Gly Met 595 600 605

Ala val Glu Asp Pro Ser ser Pro Tyr Lys val Arg Leu Leu val Ser 610 615 620

Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala ile Trp His Ala Ile Glu 625 630 635 640

Gin Tyr val Ser Glu Tyr Leu Ala Ile Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly val 645 650 655

Leu Gin Gly Asp Thr Glu val Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu 660 665 670

Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Pro Trp Trp pro Lys Met Gin 675 680 685

Ser val Pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr Ile ile Trp ile Gly 690 695 700

Ser Ala Leu His Ala Ala val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly 705 710 715 720 63

Phe Leu Pro Asn Arg Pro Thr vai Ser Arg Arg Arg Met Pro Glu pro 725 730 735 Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp pro Glu Arg Ala Phe 740 745 750 lie HÍS Thr Ile Thr Ser Gin Ile Gin Thr Ile Ile Gly val Ser Leu 755 760 765 Leu Glu vai Leu ser Lys His Ser Ser Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Gin 770 775 780 Arg ASP Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp pro Lys Ala Leu Glu val Phe 785 790 795 800 Lys Arg Phe Ser Asp Arg Leu vai Glu ile Glu Ser Lys val val Gly 805 810 815 Met Asn His Asp Pro Glu Leu Lys Asn Arg Asn Gly Pro Ala Lys Phe 820 825 830 ΡΓΟ Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Lys Gly Ala Ala 835 840 845 Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gly Ile pro Asn Ser Ile Ser Ile 850 855 860

<210> 10 <211> 2818 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <4 0 0> 10 agtgaaaaac agtgtgctgg tgccattggt tggagcagtg aaagcgagga gaggaggcca 60 agaacaagat gctgctggga gggctgatcg acaccctcac gggggcgaac aagagcgccc 120 ggctcaaggg cacggtggtg ctcatgcgca agaacgtgct ggacctcaac gacttcggcg 180 ccaccatcat cgacggcatc ggcgagttcc tcggcaaggg cgtcacctgc cagcttatca 240 gctccaccgc cgtcgaccaa gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc 300 tggagcagtg ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca 360 ccttcgactg ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc 420 acagctccga gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca 480 acctcacctt cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg 540 tcttcttcgc caacgacacg tacctgccga gccagatgcc ggcggcgctg aagccgtacc 600 gcgacgacga gctccggaac ctgcgtggcg acgaccagca gggcccgtac caggagcacg 660 accgcatcta ccgctacgac gtctacaacg acctcggcga gggccgcccc atcctcggcg 720 gcaactccga ccacccttac ccgcgccgcg gccgcacgga gcgcaagccc aacgccagcg 780 64 acccgagcct ggagagccgg ctgtcgctgc tggagcagat ctacgtgccg cgggacgaga 840 agttcggcca cctcaagacg tccgacttcc tgggctactc catcaaggcc atcacgcagg 900 gcatcctgcc ggccgtgcgc acctacgtgg acaccacccc cggcgagttc gactccttcc 960 aggacatcat caacctctat gagggcggca tcaagctgcc caaggtggcc gccctggagg 1020 agctccgtaa gcagttcccg ctccagctca tcaaggacct cctccccgtc ggcggcgact 1080 ccctgcttaa gctccccgtg ccccacatca tccaggagaa caagcaggcg tggaggaccg 1140 acgaggagtt cgcacgggag gtgctcgccg gcgtcaaccc ggtcatgatc acgcgtctca 1200 cggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac accagcacca 1260 tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag gcgctggaaa 1320 gcaacaggct gtacatcctt gatcaccatg accggttcat gccgttcctg atcgacgtca 1380 acaacctgcc cggcaacttc atctacgcca cgaggaccct cttcttcctg cgcggcgacg 1440 gcaggctcac gccgctcgcc atcgagctga gcgagcccat catccagggc ggccttacca 1500 cggccaagag caaggtttac acgccggtgc ccagcggctc cgtcgaaggc tgggtgtggg 1560 agctcgccaa ggcctacgtc gccgtcaatg actccgggtg gcaccagctc gtcagccact 1620 ggctgaacac tcacgcggtg atggagccgt tcgtgatctc gacgaaccgg caccttagcg 1680 tgacgcaccc ggtgcacaag ctgctgagcc cgcactaccg cgacaccatg accatcaacg 1740 cgctggcgcg gcagacgctc atcaacgccg gcggcatctt cgagatgacg gtgttcccgg 1800 gcaagttcgc gttggggatg tcggccgtgg tgtacaagga ctggaagttc accgagcagg 1860 gactgccgga cgatctcatc aagaggggca tggcggtgga ggacccgtcg agcccgtaca 1920 aggtgcggtt gctggtgtcg gactacccgt acgcggcgga cgggctggcg atctggcacg 1980 ccattgagca gtacgtgagc gagtacctgg ccatctacta cccgaacgac ggcgtgctgc 2040 agggcgatac ggaggtgcag gcgtggtgga aggagacgcg cgaggtcggg cacggcgacc 2100 tcaaggacgc cccatggtgg cccaagatgc aaagtgtgcc ggagctggcc aaggcgtgca 2160 ccaccatcat ctggatcggg tcggcgctgc atgcggcagt caacttcggg cagtacccct 2220 acgcggggtt cctcccgaac cggccgacgg tgagccggcg ccgcatgccg gagcccggca 2280 cggaggagta cgcggagctg gagcgcgacc cggagcgggc cttcatccac accatcacga 2340 gccagatcca gaccatcatc ggcgtgtcgc tgctggaggt gctgtcgaag cactcctccg 2400 acgagctgta cctcgggcag cgggacacgc cggagtggac ctcggaccca aaggccctgg 2460 aggtgttcaa gcggttcagc gaccggctgg tggagatcga gagcaaggtg gtgggcatga 2520 accatgaccc ggagctcaag aaccgcaacg gcccggctaa gtttccctac atgctgctct 2580 accccaacac ctccgaccac aagggcgccg ctgccgggct taccgccaag ggcatcccca 2640 acagcatctc catctaatct aagccatcgg caaccatgga tgaataaagg gcgttcgcca 2700 65 cgtacgaaac ttgtcgagag attggtgtag tgtgtgtctg tgacagtact atgtcagcag 2760 ttgctcttta agccgaataa ataaagcaga tttgcttcca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2818

<210> 11 <211> 4663 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <22 0> <221> variação <222> (2346) .. (2348) <223> "n" é a, c, t, ou g que codifica para um aminoácido acídico, ! básico ou polar <4 0 0> 11 cagccccatg catgcacatg cacatgcaca tgcacatgca gtgcagccaa gcaccgctcg 60 atgggcgatc acccgtcacg ggaccggagc gcgccatgcg aagcacgagg agggcacgtc 120 accgtccgcg cgcagcacgt ggagagcacg tcgccgtccg atccatctct ccaaagccga 180 gcgccacacc accgggaccg gacccggacc ggcctataaa ttgcccggac cgagctgcaa 240 gcagctcctc acacacactc acgcaacaca catccatctt cactgaaaag tgaaaaacag 300 tgtgctggtg ccattggttg gagcagtgaa agcgaggaga ggaggccaag aacaagatgc 360 tgctgggagg gctgatcgac accctcacgg gggcgaacaa gagcgcccgg ctcaagggca 420 cggtggtgct catgcgcaag aacgtgctgg acctcaacga cttcggcgcc accatcatcg 480 acggcatcgg cgagttcctc ggcaagggtg tcacctgcca gcttatcagc tccaccgccg 540 tcgaccaagg taatcactac cctcctccgg ccttctcctc tgtttacaag atatagtatt 600 tctttcgtgt gggccggcgg ccatggatgg atggatgtgt ctggatcggc taaagaagat 660 aggatagcta gccctggccg gtcgtcttta cctgagcatg ggcatatgcc atcgaaaaaa 720 gagacaacag catgcatgca tggtgcgcgc accagaccac gcagagcacc ggatgctcga 780 gacaaagcaa cacaacaagc aaggacgaca cgtcaaaagc aacacaacaa gcaaggacgg 840 cacgtcaaaa gcaacacaaa cctaaactaa agcacaaaga cgtaagagca agcacacaat 900 cagcaggcta taaacagttg tcatcaaaaa caacgctgga agagagagag aaggaaggaa 960 gtagtagcca tgaaaaatta aatcaccggg cgttgctctt tgcccaacaa ttaatcaagc 1020 agggtacgtg gcatgtatag ttcttgtaag taaactaagc atgtgatatg agaaggtacg 1080 66 tggtggtgca gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc tggagcagtg 1140 ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca ccttcgactg 1200 ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc acagctccga 1260 gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca acctcacctt 1320 cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg tcttcttcgc 1380 caacgacgtg cgtggatttt cctctacttt cctctccttt cattttcacc gccttcgtca 1440 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcagcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat ctagatgcat gtcacataat tattgcatac caaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gacgtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacctgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca tctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg ctgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccnnngtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 gtaattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggtt 3000 67 tgaaatttgc aggcgctgga aagcaacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 ctcttcttcc tgcgcggcga cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 atcatccagg gcggccttac cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg 3300 tggcaccagc tcgtcagcca ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360 tgcacaacaa ctgatcgaaa tatgattgat tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt 3420 gatggagccg ttcgtgatct cgacgaaccg gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa 3480 gctgctgagc ccgcactacc gcgacaccat gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct 3540 catcaacgcc ggcggcatct tcgagatgac ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat 3600 gtcggccgtg gtgtacaagg actggaagtt caccgagcag ggactgccgg acgatctcat 3660 caagaggtac gtacctggta aatgttatga atgtgtaaaa caaattgggc gtctcgctca 3720 ctgacaggaa cgtggtaaaa aaaatgcagg ggcatggcgg tggaggaccc gtcgagcccg 3780 tacaaggtgc ggttgctggt gtcggactac ccgtacgcgg cggacgggct ggcgatctgg 3840 cacgccattg agcagtacgt gagcgagtac ctggccatct actacccgaa cgacggcgtg 3900 ctgcagggcg atacggaggt gcaggcgtgg tggaaggaga cgcgcgaggt cgggcacggc 3960 gacctcaagg acgccccatg gtggcccaag atgcaaagtg tgccggagct ggccaaggcg 4020 tgcaccacca tcatctggat cgggtcggcg ctgcatgcgg cagtcaactt cgggcagtac 4080 ccctacgcgg ggttcctccc gaaccggccg acggtgagcc ggcgccgcat gccggagccc 4140 ggcacggagg agtacgcgga gctggagcgc gacccggagc gggccttcat ccacaccatc 4200 acgagccaga tccagaccat catcggcgtg tcgctgctgg aggtgctgtc gaagcactcc 4260 tccgacgagc tgtacctcgg gcagcgggac acgccggagt ggacctcgga cccaaaggcc 4320 ctggaggtgt tcaagcggtt cagcgaccgg ctggtggaga tcgagagcaa ggtggtgggc 4380 atgaaccatg acccggagct caagaaccgc aacggcccgg ctaagtttcc ctacatgctg 4440 ctctacccca acacctccga ccacaagggc gccgctgccg ggcttaccgc caagggcatc 4500 cccaacagca tctccatcta atctaagcca tcggcaacca tggatgaata aagggcgttc 4560 gccacgtacg aaacttgtcg agagattggt gtagtgtgtg tctgtgacag tactatgtca 4620 gcagttgctc tttaagccga ataaataaag cagatttgct tcc 4663

<210> 12 <211> 862 <212> PRT <213> Hordeum vulgare 68 <220> <221> variação <222> (368)..(368) <223> "Xaa" é um aminoácido acidico, básico ou polar <400> 12

Met Leu Leu Gly Gly Leu ile Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys ser 15 10 15

Ala Arg Leu Lys Gly Thr vai vai Leu Met Arg Lys Asn vai Leu Asp 20 25 30

Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr lie lie Asp Gly lie Gly Glu Phe Leu 35 40 45

Gly Lys Gly Vai Thr Cys Gin Leu Ile Ser Ser Thr Ala vai Asp Gin 50 55 60

Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys vai Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin 65 70 75 80

Trp Vai Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly 85 90 95

Leu Thr Phe Asp Trp Glu vai Glu Lys Leu Gly vai Pro Gly Ala ile 100 105 110 vai vai Asn Asn Tyr His Ser Ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr ile Thr 115 120 125

Leu His Asp vai pro Gly Arg Ser Gly Asn Leu Thr phe vai Ala Asn 130 135 140 ser Trp Ile Tyr pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr ser Arg vai Phe Phe 145 150 155 160

Ala Asn Asp Thr Tyr Leu pro ser Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro 165 170 175

Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly 180 185 190

Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg ile Tyr Arg Tyr Asp vai Tyr Asn Asp 195 200 205

Leu Gly Glu Gly Arg Pro ile Leu Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr 210 215 220

Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser 225 230 235 240

Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Leu Glu Gin Ile Tyr Vai Pro Arg Asp 245 250 255

Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr ser Asp Phe Leu Gly Tyr ser Ile 69 260 265 270

Lys Ala ile Thr Gin Gly He Leu Pro Ala vai Arg Thr Tyr vai Asp 275 280 285

Thr Thr pro Gly Glu Phe Asp ser Phe Gin Asp lie ile Asn teu Tyr 290 295 300

Glu Gly Gly lie Lys leu Pro lys Vai Ala Ala teu Glu Glu Leu Arg 305 310 315 320

Lys Gin phe Pro Leu Gin Leu lie Lys Asp leu Leu Pro vai Gly Gly 325 330 335

Asp Ser teu Leu Lys Leu Pro Vai Pro His Ile He Gin Glu Asn Lys 340 345 3SO

Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu vai Leu Ala Xaa 355 360 365 vai Asn pro vai Met Ile Thr Arg Leu Thr Glu Phe pro Pro Lys Ser 370 375 380

Ser Leu Asp Pro ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr lie Thr Ala 385 390 395 400

Glu His ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr vai Gin Gin Ala Leu 405 410 415

Glu ser Asn Arg Leu Tyr ile Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro 420 425 430

Phe Leu ile Asp vai Asn Asn teu pro Gly Asn Phe Ile Tyr Ala Thr 435 440 445

Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala 450 455 460

Ile Glu Leu Ser Glu Pro He He Gin Gly Gly teu Thr Thr Ala Lys 465 470 475 480

Ser Lys vai Tyr Thr Pro vai Pro Ser Gly Ser vai Glu Gly Trp vai 485 490 495

Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr vai Ala vai Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510

Gin Leu vai ser His Trp Leu Asn Thr hís Ala vai Met Glu pro phe SIS 520 525

Vai Ile Ser Thr Asn Arg His Leu ser vai Thr His Pro vai His Lys 530 535 540

Leu leu ser pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr Ile Asn Ala Leu Ala 545 550 555 560

Arg Gin Thr Leu He Asn Ala Gly Gly He Phe Glu Met Thr Vai Phe

565 570 S7S

Pro Gly Lys Phe Ala teu Gly Met Ser Ala vai vai ryr Lys Asp Trp 7 7 580 585 590

Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu Ile Lys Arg Gly Met $g$ 600 605 70

Asp Tyr ργο Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala ile Trp His Ala lie Glu 6^5 630 635 640

Gin Tyr vai ser Glu Tyr Leu Ala He Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly vai 645 650 655

Leu Gin Gly Asp Thr Glu vai Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu 660 665 670 val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Pro Trp Trp Pro Lys Met Gin 675 680 K 685

Ser val Pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr lie lie Trp lie Gly 690 695 700

Ser Ala Leu His Ala Ala val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly 705 710 715 720

Phe Leu Pro Asn Arg Pro Thr val Ser Arq Arq Arg Met Pro Glu Pro 725 730 735

Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Arg Ala Phe 740 745 750

Ile His Thr lie Thr Ser Gin lie Gin Thr ile Ile Gly val ser Leu 755 760 765

Leu Glu val Leu ser Lys His ser ser Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Gin 770 775 780

Arg Asp Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp Pro Lys Ala Leu Glu val Phe 785 790 795 800

Lys Arg Phe Ser Asp Arg Leu val Glu ile Glu ser Lys val val Gly 805 810 815

Met Asn His Asp pro Glu Leu Lys Asn Arg Asn Gly Pro Ala Lys Phe 820 825 830

Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Lys Gly Ala Ala 835 840 845

Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gly ile Pro Asn Ser ile Ser ile 850 855 860

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <4 00> 13 cgctacgacg tctacaacga 20 71

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <400> 14 cagactactt tttggcggga 20 <210> 15 <211> 839

<212> PRT <213> Glicina max <400> 15

Met Phe Ser Ala Gly His Lys ile Lys Gly Thr vai vai Leu Met Pro 15 10 15

Lys Asn Glu Leu Glu vai Asn Pro Asp Gly ser Ala vai Asp Asn Leu 20 25 30

Asn Ala Phe Leu Gly Arg Ser vai Ser Leu Gin Leu Ile Ser Ala Thr 35 40 45

Lys Ala Asp Ala His Gly Lys Gly Lys vai Gly Lys Asp Thr Phe Leu 50 55 60

Glu Gly ile Asn Thr Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ala Gly Glu Ser Ala 65 70 75 80

Phe Asn Ile His Phe Glu Trp Asp Gly ser Met Gly Ile Pro Gly Ala 85 90 95

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Tyr Arg Glu Glu Glu Leu Lys ser Leu Arg Gly Asn Gly Thr Gly Glu 165 170 175

Arg Lys Glu Tyr Asp Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Vai Tyr Asn Asp Leu 180 185 190

Gly Asn Pro Asp Lys Ser Glu Lys Leu Ala Arg Pro vai Leu Gly Gly 195 200 205 72

Ser Ser Thr Phe Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Pro 210 215 220

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Pro Arg Asp Glu Asn Leu Gly His Leu Lys ser Lys Asp Ala Leu Glu 245 250 255 lie Gly Thr Lys Ser Leu Ser Gin lie vai Gin Pro Ala Phe Glu Ser 260 265 270

Ala Phe Asp Leu Lys ser Thr Pro lie Glu Phe His Ser Phe Gin Asp 275 280 285

Vai His Asp Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu Pro Arg Asp Vai lie 290 295 300

Ser Thr ile ile Pro Leu Pro vai Ile Lys Glu Leu Tyr Arg Thr Asp 305 310 315 320

Gly Gin His ile Leu Lys Phe Pro Gin Pro His vai vai Gin vai ser 325 330 335

Gin Ser Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met Ile Ala 340 345 350

Gly vai Asn Pro cys vai ile Arg Gly Leu Glu Glu Phe Pro Pro Lys 355 360 365

Ser Asn Leu Asp Pro Ala Ile Tyr Gly Asp Gin ser Ser Lys ile Thr 370 375 380

Ala Asp ser Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Thr Met Asp Glu Ala Leu Gly 385 390 395 400

Ser Arg Arg Leu Phe Met Leu Asp Tyr His Asp Ile Phe Met Pro Tyr 405 410 415

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Leu Ala Lys Ala Tyr val ile val Asn Asp Ser Cys Tyr His Gin Leu 485 490 495

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Ala Thr His Arg His Leu Ser val Leu His Pro Ile Tyr Lys Leu Leu 515 520 525

Thr pro His Tyr Arg Asn Asn Met Asn Ile Asn Ala Leu Ala Arg Gin 530 535 540

Ser Leu Ile Asn Ala Asn Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe Leu Pro ser 73 545 550 555 560

Lys Tyr ser Vai Glu Met Ser Ser Ala vai Tyr Lys Asn Trp vai Phe 565 570 575

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Glu Asp Leu Vai Glu vai Cys Leu ile ile ile Trp ile Ala Ser Ala 675 680 685

Leu His Ala Ala Vai Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Gly Gly Leu Ile 690 695 700

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Phe Gly Asn Lys Leu Lys Glu Ile Glu Glu Lys Leu vai Arg Arg Asn 785 790 795 800

Asn Asp Pro Ser Leu Gin Gly Asn Arg Leu Gly Pro vai Gin Leu pro 805 810 815 .

Tyr Thr Leu Leu Tyr Pro ser Ser Glu Glu Gly Leu Thr Phe Arg Gly 820 825 830

Ile Pro Asn Ser Ile Ser Ile 835 <210> 16 <211> 865

<212> PRT 74 <213> Glicina max <400> 16

Met phe Ser vai Pro Gly vai Ser Gly lie Leu Asn Arg Gly Gly Gly 15 10 15

HlS Lys Ile Lys Gly Thr val Val Leu Met Arg Lys Asn val Leu Asp 20 25 30 Phe Asn ser val Ala Asp Leu Thr Lys Gly Asn Val Gly Gly Leu Ile 35 40 45 Gly Thr Gly Leu Asn val Val Gly Ser Thr Leu Asp Asn Leu Thr Ala 50 55 60 Phe Leu Gly Arg ser val Ala Leu Gin Leu Ile ser Ala Thr Lys pro 65 70 75 80 Leu Ala Asn Gly Lys Gly Lys val Gly Lys Asp Thr Phe Leu Glu Gly 85 90 95 ile lie val ser Leu pro Thr Leu Gly Ala Gly Glu ser Ala Phe Asn 100 105 110 lie Gin Phe Glu Trp Asp Glu Ser Met Gly Ile Pro Gly Ala Phe Tyr 115 120 125 lie Lys Asn Tyr Met Gin val Glu Phe Tyr Leu Lys Ser Leu Thr Leu 130 135 140 Glu ASp val Pro Asn Gin Gly Thr Ile Arg Phe val Cys Asn Ser Trp 145 150 155 160 val Tyr Asn Thr Lys Leu Tyr Lys Ser val Arg Ile Phe Phe Ala Asn 165 170 175 His Thr Tyr val Pro Ser Glu Thr Pro Ala Ala Leu val Gly Tyr Arg 180 185 190 Glu Glu Glu Leu Lys Asn Leu Arg Gly Asp Gly Lys Gly Glu Arg Lys 195 200 205 Glu His 210 Asp Arg ile Tyr Asp 215 Tyr Asp val Tyr Asn 220 Asp Leu Gly Asn Pro ASp His Gly Glu Asn Phe Ala Arg Pro ile Leu Gly Gly Ser Ser 225 230 235 240 Thr His Pro Tyr Pro 245 Arg Arg Gly Arg Thr 250 Gly Arg Tyr Pro Thr 255 Arg Lys ASp Gin Asn Ser Glu Lys Pro Gly Glu val Tyr val Pro Arg Asp 260 265 270 Glu Asn Phe Gly His Leu Lys Ser Ser Asp Phe Leu Ala Tyr Gly Ile 275 280 285 Lys Ser Leu Ser Gin Tyr val Leu Pro Ala Phe Glu Ser val Phe Asp 290 295 300 Leu Asn Phe Thr Pro Asn Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp val Arg Asp B05 310 315 320 75

Leu His Glu Gly Gly ile Lys Leu Pro Thr Glu Vai lie Ser Thr ile 325 330 335

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Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Thr Vai Asp Glu Ala Leu Ala ser Arg Arg 420 425 430

Leu Phe Met Leu Asp Tyr His Asp vai Phe Met Pro Tyr ile Arg Arg 435 440 445 lie Asn Gin Thr Tyr Ala Lys Ala Tyr Ala Thr Arg Thr ile Leu Phe 450 455 460

Leu Arg Glu Asn Gly Thr Leu Lys Pro vai Ala Ile Glu Leu ser Leu 465 470 475 480 pró His Pro Ala Gly Asp Leu ser Gly Ala vai Ser Gin vai ile Leu 485 490 495

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Leu Pro Ala Asp Leu Ile Lys Arg Gly vai Ala ile Lys Asp pro ser 610 615 620

Ala Pro His Gly Leu Arg Leu Leu Ile Glu Asp Tyr Pro Tyr Ala vai 525 630 635 640 aso Glv Leu Glu Ile Trp Ala Ala ile Lys Thr Trp vai Gin Glu Tyr μ y 645 650 655 val Ser Leu Tyr Tyr Ala Arg Asp Asp Asp vai Lys Pro Asp ser Glu 76 76 670 Lys Gly His Gly Asp Leu 685 Thr ile Glu Glu Leu vai 700 ser Ala Leu His Ala Ala 715 720 Phe lie Leu Asn Arg Pro 735 Gly Thr Pro Glu Tyr Glu 750 Leu Arg Thr Ile Thr ser 765 ile Glu He Leu Ser Arg 780 Arg Asp Asn Pro His Trp 795 800 Gin Lys Phe Gly Asn Lys 815 Lys Asn Asn Asp Gin ser 830 pro Tyr Thr Leu Leu His 845 Ile Pro Asn Ser ile Ser 860 660 665

Leu Gin Gin Trp Trp Lys Glu Ala vai Glu 675 680

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Glu lie Cys Thr lie He lie Trp Thr Ala 705 710

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Lys Phe Gin Thr Leu Vai Asp Leu Ser vai 770 775

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Leu Lys Glu lie Glu Glu Lys Leu Ala Arg 820 825

Leu ser Asn Arg Leu Gly Pro vai Gin Leu 835 840

Pro Asn ser Glu Gly Leu Thr Cys Arg Gly 850 855 ile 865 <210> 17 <211> 857

<212> PRT <213> Glicina max <400> 17 Mét Leu Gly Gly Leu Leu His Arg Gly His Lys ile Lys Gly Thr Vai 1 5 10 15

Vai Leu Met Arg Lys Asn vai Leu Asp vai Asn ser vai Thr Ser Vai 20 25 30

Gly Gly Ile ile Gly Gln Gly Leu AsP Leu va^ ®ly Ser Thr Leu Asp y y 35 40 45

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Gly Ala Phe Tyr ile Lys Asn Phe Met Gin Thr Glu Phe Phe Leu vai 115 120 125

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Phe Phe Ala Asn Gin Thr Tyr Leu Pro Ser Glu Thr Pro Ala Pro Leu 165 170 175 val Lys Tyr Arg Glu Glu Glu Leu His Asn Leu Arg Gly Asp Gly Thr 180 185 190

Gly Glu Arg Lys Glu Trp Glu Arg lie Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr Asn 195 200 205

Asp Leu Gly Asp Pro Asp Lys Gly Glu Asn His Ala Arg Pro val Leu 210 215 220

Gly Gly Asn Asp Thr Phe Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg 225 230 235 240

Lys Pro Thr Arg Lys Asp Pro Asn ser Glu Ser Arg Ser Asn Asp Val 245 250 255

Tyr Leu Pro Arg Asp Glu Ala Phe Gly His Leu Lys ser ser Asp Phe 2bU 265 27υ

Leu Thr Tyr Gly Leu Lys Ser val ser Gin Asn val Leu Pro Leu Leu 275 280 285

Gin ser Ala Phe Asp Leu Asn Phe Thr Pro Arg Glu Phe Asp Ser Phe 290 295 300

Asp Glu val His Gly Leu Tyr ser Gly Gly Ile Lys Leu pro Thr Asp 305 310 315 320 ile ile ser Lys ile ser Pro Leu Pro val Leu Lys Glu ile Phe Arg 325 330 335

Thr Asp Gly Glu Gin Ala Leu Lys Phe Pro Pro Pro Lys val ile Gin 340 345 350 val ser Lys Ser Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met 355 360 365

Leu Ala Gly val Asn Pro Asn Leu ile Arg Cys Leu Lys Asp Phe Pro 370 375 380

Pro Arg Ser Lys Leu Asp Ser Gin val Tyr Gly Asp His Thr Ser Gin 385 390 395 400 78 78 Ile Thr Lys Glu His Leu Glu Pro 405 Glu Ala ile Gin Asn Lys Arg Leu 420 ile Met Pro Tyr Leu Arg Arg ile 435 440 Ala Thr Arg Thr ile Leu Phe Leu 450 455 Leu Ala ile Glu Leu Ser Leu Pro 465 470 Ala Phe ser Gin vai Phe Leu Pro 485 ile Trp Leu Leu Ala Lys Ala Tyr 500 His Gin Leu vai Ser His Trp Leu 515 520 Phe Ile Ile Ala Thr Asn Arg His 530 535 Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg 545 550 Ala Arg Leu Ser Leu vai Asn Asp 565 Leu Trp Gly Arg Tyr Ser vai Glu 580 Trp val Phe Thr Asp Gin Ala Leu 595 600 Met Ala Ile Glu Asp Pro Ser Cys 610 615 Glu Asp Tyr Pro Tyr Thr val Asp 625 630 Lys Thr Trp val His Glu Tyr val 645 Thr Leu Arg Glu Asp Pro Glu Leu 660 Glu val Gly His Gly Asp Lys Lys 675 680 Gin Thr Arg Glu Glu Leu val Glu 690 695 Ala Ser Ala Leu His Ala Ala val 705 710 Gly Leu Ile Leu Asn Arg Pro Thr

Lys Gly ser Ala Glu Tyr Glu Glu

Asn Leu Glu Gly Leu Thr val Asp 410 415

Phe Leu Leu Asp His His Asp Pro 425 430

Asn Ala Thr Ser Thr Lys Ala Tyr 445

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Gly Gly val Ile Glu Gin Thr Phe 570 575

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Leu Ser Arg Arg Phe Met Pro Glu 730 735

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Phe Lys Arq Phe Gly Asn Lys Leu Ala Gin ile Glu Asn Lys Leu Ser 805 810 815

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Arq Gly Ile Pro Asn ser Ile Ser 850 855 <210> 18 <211> 864

<212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 18

Met Leu Gly vai Gly Gly ile Vai 1 5

Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Vai 20

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Leu Gly Arg Gly vai Thr Cys Gin 50 55

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Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu K 85

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Ala Asn Ser Trp Vai Tyr Pro 145 150

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Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin ser Asp Leu Leu Gly 260 265 270

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Lys Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu pro Asn ile Pro Ala Leu Glu 305 310 315 320

Glu vai Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu vai Lys Asp Leu Ile Pro 325 330 335

Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys Pro Glu Ile ile Lys 340 345 350

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Gin Ala Leu Ala Gly Asn Arg Leu Tyr ile vai Asp Gin His Asp Asn 420 425 430

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Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn ile Asn Ala 545 550 555 560

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Ala Phe Ile Arg Thr Ile Thr ser Gin Phe His Ala Leu val Gly Ile 755 760 765 ser Leu Met Glu ile Leu Ser Lys His ser ser Asp Glu val Tyr Leu 770 775 780

Gly Gin His Asp Thr Pro Ala Trp Thr ser Asp Ala Lys Ala Leu Glu 785 790 795 800

Ala Phe Lys Arg Phe Gly Ala Lys Leu Glu Gly ile Glu Lys Gin val 805 810 815 val Ala Met Asn ser Asp Pro Gin Leu Lys Asn Arg Thr Gly Pro Ala 820 825 830

Lys Phe Pro Tyr Met Leu Leu Tyr pro Asn Thr Ser Asp His Thr Gly 82 835 840 845

Gin Ala 850

Glu Gly Leu Thr Ala Arg Gly lie Pro Asn Ser lie ser lie 855 860

Lisboa, 30 de Janeiro de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Planta de cevada ou sua porção compreendendo uma proteína LOX-1 mutada, em que a atividade da LOX-1 da referida planta ou porção de planta é reduzida ou ausente quando comparada com um controlo não mutado, em que a referida proteína LOX-1 mutada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, em que o Xaa é o ácido aspártico, ácido qlutâmico, histidina, lisina arqinina, treonina, serina, tirosina, triptofano, asparagina ou glutamina.

2. Planta de cevada ou sua porção de acordo com a reivindicação 1, em que a atividade da LOX-1 compreende a catálise da oxidação dos ácidos gordos poli-insaturados livres e esterifiçados e dos ácidos gordos octadecanóicos poli-insaturados para formar derivados do ácido gordo 9-hidroperoxi.

3. Planta de cevada ou sua porção de acordo com a reivindicação 1, em que Xaa é o ácido glutâmico ou ácido aspártico.

4. Planta de cevada ou porção da reivindicação 3, em que o Xaa é o ácido aspártico.

5. Grão ou progenia de planta compreendendo uma proteína LOX-1 mutada, em que a proteína LOX-1 mutada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO.12, em que o Xaa é D, E, Η, K, R, T, S, Y, W, N ou Q produzido a partir da planta de cevada ou sua porção da planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4. 2

6. Malte ou mosto compreendendo uma proteína LOX-1 mutada, em que a proteína LOX-1 mutada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO. 12, em que o Xaa é D, E, Η, K, R, T, S, Y, W, N ou Q produzido a partir da planta de cevada ou sua porção da planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 ou do grão ou progenia da planta da reivindicação 5.

7. Uso de um malte ou mosto de acordo com a reivindicação 6 para a preparação de uma bebida apresentando qualidades organoléticas que permanecem estáveis ao longo de um período de tempo medido ou a temperaturas de armazenamento elevadas quando comparadas com uma bebida preparada a partir de um produto vegetal de um controlo não mutado.

8. Uso de uma planta de cevada ou sua porção, grão ou progenia de planta, ou malte, ou mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para a produção de uma bebida.

9. Uso de uma planta de cevada ou sua porção, grão ou progenia de planta ou malte ou mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para a produção de um malte ou cervej a.

10. Uso de uma planta de cevada ou sua porção, grão ou progenia de planta, ou malte ou mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para a estabilização das propriedades organoléticas de um produto fermentado ao longo de um período de tempo medido quando comparada com um produto controlo fermentado produzido usando uma planta de cevada não mutada ou sua porção, grão ou progenia de planta, ou produto vegetal. 3

11. Uso de uma planta de cevada ou sua porção, grão ou progenia de planta, ou malte ou mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para a produção de um produto fermentado contendo níveis reduzidos de trans-2-nonenal livre ao longo de um período de tempo medido ou sob condições de temperatura de armazenamento elevada, quando comparada com um produto controlo fermentado produzido usando uma planta de cevada não mutada ou sua porção, grão ou progenia de planta, ou produto vegetal.

12. Processo para produzir cerveja a partir de cevada em que a cevada ou uma sua porção compreende uma proteína LOX-1 mutada, em que a atividade da LOX-1 da referida planta ou porção de planta é reduzida ou ausente quando comparada com um controlo não mutado e em que a referida proteína LOX-1 mutada compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 12, em que o Xaa é ácido aspártico, ácido glutâmico, histidina, lisina arginina, treonina, serina, tirosina, triptofano, asparagina ou glutamina.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o Xaa é o ácido glutâmico ou ácido aspártico.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o Xaa é o ácido aspártico. Lisboa, 30 de Janeiro de 2012