ES2376415T3 - Cebada pobre en lipooxigenasa 1. - Google Patents

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Varena Cameron-Mills
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Jolanda Carolina Heistek
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Abstract

Una planta de cebada o porción de la misma que comprende una proteína LOX-1 mutada, en la que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, en la que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.

Description

Cebada pobre en lipooxigenasa 1
Campo de la invención
Esta invención está en el campo de la biotecnología vegetal. Más específicamente, la invención se refiere a un gen
5 de lipooxigenasa 1 (lox-1) de cebada mutante que codifica una enzima con actividad formadora de ácido 9hidroperoxioctadecanoico muy reducida. La invención se refiere también al uso de cultivares de cebada homocigóticos de lox-1 en procesos de fabricación de cerveza para reducir la formación de aromas desagradables en productos de la fabricación de cerveza, tales como cerveza, durante el almacenamiento.
Antecedentes de la invención
10 Las lipooxigenasas son una familia de enzimas (EC 1.13.11.12) que catalizan la dioxidación de ácidos grasos poliinsaturados libres y esterificados que contienen una configuración 1(Z),4(Z)-pentadieno. Los productos de las reacciones catalizadas por lipooxigenasa son sospechosos desde hace tiempo de ser los principales culpables de la aparición de aromas rancios en grano/semilla vegetales y en productos alimentarios derivados de grano/semilla (Robinson et al., 1995, Food Chem., 54: 33-43). Las lipooxigenasas se han implicado en la producción de
15 hexanaldehídos volátiles generados durante el procesamiento de la soja, que tienen un aroma indeseable que limita el uso de proteínas de soja en productos alimentarios. Se cree que tres isozimas de lipooxigenasa expresadas en semilla de soja contribuyen a la oxidación lipídica y la formación de hexanal. Se han generado mutantes de soja que carecen de una o más de estas isozimas con el objetivo de reducir la formación de hexanal y mejorar su estabilidad aromática. El éxito de este enfoque se ha evaluado por Hildebrand et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936.
20 Los mutantes que carecen de lipooxigenasa de soja 3 producían mayores niveles de hexanal, sugiriendo que esta isozima desvía los 13-hidroxiperoxioctadecanoides producidos por la oxidación lipídica hacia productos no volátiles. El rendimiento de campo de las líneas de soja triples nulas, que carecen de las tres lipooxigenasas de semilla, ha mostrado que estas enzimas no son esenciales para las características agronómicas y de semilla normales (Narvel et al., 1998, Crop Sci. 38: 926-928).
25 Las lipooxigenasas se han implicado también en la generación de aromas desagradables en el arroz, que pueden aparecer durante el almacenamiento del grano. Puede detectarse la liberación de ácidos grasos libres en el grano almacenado, que es indicativo del metabolismo de las reservas de triglicéridos. La variedad de arroz Daw Dam se ha encontrado que acumula los menores niveles de pentanales y hexanales, dando una mejor estabilidad aromática en almacenamiento (Susuki et al., 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124). Este fenotipo deseable se atribuyó a la
30 ausencia de lipooxigenasa 3 de arroz, que oxida las cadenas de acilo lipídicas insaturadas formando isómeros posicionales de ácido 9-hidroxiperoxioctadecanoico.
Se reconoce que la ruta de la lipooxigenasa es compleja, con muchas ramificaciones, y su papel en numerosos aspectos del crecimiento y fisiología vegetal no se entiende completamente. Se han propuesto modificaciones de la ruta de la lipooxigenasa que alteran la actividad de 9-hidroperoxidación en cultivos de semilla para regular su
35 sensibilidad a la contaminación por micotoxina por Aspergillus spp. (documento WO 9726364), lo que es consistente con la implicación de esta ruta en la resistencia vegetal a patógenos, pero no está relacionado con los objetivos de la invención descrita en la presente memoria.
Entre los muchos productos volátiles aromáticos que contribuyen al aroma de la cerveza, los aldehídos insaturados superiores con una cadena de 6-12 carbonos tienen umbrales de aroma organoléptico particularmente bajos
40 (Meilgaard 1975, MBAA Tech. Quart. 12: 151-168). El trans-2-nonenal, que es un miembro de este grupo, tiene tanto un umbral de aroma extremadamente bajo de 0,11 ppb como contribuye a un aroma desagradable similar a la paja “acartonado” en la cerveza. El aroma desagradable característico causado por el trans-2-nonenal es una característica común de las cervezas almacenadas durante 1-3 meses o más y es particularmente perjudicial para el aroma de la cerveza rubia, que se fabrica con maltas ligeras y tiene un aroma delicado.
45 El sulfito se ha conocido desde hace tiempo que mejora la estabilidad aromática de la cerveza, no solo al unirse al oxígeno y actuar como antioxidante, sino también al formar compuestos de adición de bisulfito volátiles con aldehídos y cetonas presentes en la cerveza. Las dos fuentes principales de sulfito en la cerveza son el sulfito producido por la levadura durante la fermentación por la ruta de asimilación de azufre y el sulfito añadido a la cerveza antes del envasado. Las condiciones de fermentación que potencian la producción y secreción de sulfito de
50 levadura permitirán la formación de aductos de sulfito-carbonilo a partir de los carbonilos presentes en el mosto y evitarán su metabolismo posterior por la levadura (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisboa, pág. 209216). De esta manera, los carbonilos tales como de acetaldehído y diacetilo pueden transferirse a la cerveza. La capacidad del sulfito de evitar la aparición del compuesto carbonílico trans-2-nonenal durante el envejecimiento de la cerveza se ha demostrado fabricando cerveza con una cepa de levadura bloqueada en la ruta de asimilación de
55 azufre (Johannesen et al., 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Niza, pág. 655-662). Después del embotellado, se sometió la cerveza a envejecimiento forzado por almacenamiento a 37ºC durante 7 días, después de lo cual se encontró que los niveles de trans-2-nonenal estaban bastante por encima del umbral de sabor. Si se añadía sulfito 10 ppm a la cerveza pobre en sulfito justo antes del embotellamiento, se reducía significativamente la aparición de trans-2-nonenal durante el envejecimiento forzado. La reacción entre sulfito y compuestos de carbonilo es reversible y está bajo control termodinámico y cinético. Las constantes de equilibrio aparente de los compuestos de bisulfito se encuentran en el intervalo de 10-6 M para los compuestos de carbonilo tales como acetaldehído, hexanal y decanal hasta 10-3 para diacetilo y piruvato (Dufour 1991, supra). Durante el almacenamiento de la cerveza, el intercambio de
5 gas a través del envasado permitirá la entrada de oxígeno a la cerveza y se perderá el sulfito, de tal modo que los aductos de bisulfito más débiles se disociarán, permitiendo que aparezcan carbonilos libres en la cerveza. Aunque el sulfito potencia incuestionablemente la estabilidad aromática de la cerveza, particularmente a corto plazo, su retención en la cerveza envasada depende en gran medida del intercambio de gas a través del envasado y de la temperatura. En una cerveza acabada, los niveles naturales de sulfito producidos durante la fermentación son variables y la adición de sulfito antes del embotellado no es una práctica universalmente aceptada. Por estas razones, el sulfito solo no proporciona un procedimiento fiable para potenciar la estabilidad aromática a largo plazo de la cerveza en las diferentes condiciones de almacenamiento de cerveza usadas por todo el mundo.
Está generalmente aceptado que el trans-2-nonenal encontrado en la cerveza es el resultado de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados derivados de lípidos de grano de cebada, en que el ácido graso de cadena de 18
15 carbonos, el ácido linoleico [clasificado como un ácido graso poliinsaturado 18:2, n-6 (Broun, Gettner y Sommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216)] es el más abundante. Sin embargo, no hay acuerdo en la bibliografía respecto al mecanismo mediante el cual se forma el trans-2-nonenal. Se ha propuesto la presencia de rutas enzimáticas que conducen a la formación de trans-2-nonenal a partir de ácidos grasos poliinsaturados, pero las etapas enzimáticas individuales no se han demostrado experimentalmente nunca en grano de cebada o durante el proceso de malteado (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol. 9: 161-215). El concepto de uso de tecnología genética anticodificante o de cosupresión para reducir los niveles de lipooxigenasa 1 en grano de cebada, y así controlar la 9hidroperoxidación y reducir los niveles de aldehído y alcohol en el grano de cebada acabado, se ha propuesto como un medio para controlar la formación de aromas desagradables, pero los resultados de dicho enfoque no se han notificado (McElroy y Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245-249).
25 Se ha desarrollado una prueba forzada como procedimiento para valorar el potencial de trans-2-nonenal de una cerveza, en que se induce la formación de trans-2-nonenal en mosto o cerveza sometiendo las muestras a temperaturas elevadas a pH reducido (100ºC a pH 4,0 durante 2 horas). Los intentos de correlacionar el potencial de trans-2-nonenal en mosto y cerveza acabada con el nivel total de actividad lipooxigenasa en la malta horneada han indicado que la lipooxigenasa puede contribuir a la aparición de trans-2-nonenal en cerveza envejecida (Drost et al., 1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124-131). Sin embargo, las conclusiones que pueden extraerse de este estudio están muy limitadas por el hecho de que la actividad lipooxigenasa en la malta de cebada estaba regulada al final del proceso de malteado por el grado de inactivación enzimática durante el secado en horno. Por tanto, se examinó solo el efecto de la actividad lipooxigenasa de malta residual sobre el potencial de trans-2-nonenal en el mosto derivado y la cerveza acabada. El estudio no consiguió evaluar las lipooxigenasas que catalizan la primera etapa de
35 la ruta enzimática de la lipooxigenasa en el grano de cebada durante el desarrollo y malteado, y su papel como determinantes del nivel de trans-2-nonenal encontrado en la cerveza. Es más, la ausencia de cultivares de cebada deficientes en una o más isoenzimas de lipooxigenasa ha hecho imposible proporcionar evidencias convincentes sobre el papel de la ruta de la lipooxigenasa en la malta de cebada para el control de la formación de trans-2nonenal. Dichos experimentos son necesarios para evaluar la contribución de las rutas enzimáticas, en comparación con las autoxidativas/químicas, a la formación de trans-2-nonenal en cerveza. El proceso de fabricación de cerveza implica una etapa de alta temperatura de cocción del mosto en que se propone que ocurren estas reacciones no enzimáticas (Noël et al., 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323-4326).
Sumario de la invención
Esta invención proporciona una planta de cebada que tiene una actividad lipooxigenasa 1 reducida en gran medida.
45 En una realización, las plantas de cebada de la invención contienen un gen lox-1 mutante que expresa niveles reducidos en gran medida de la isoenzima lipooxigenasa 1, en la que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.
Como se muestra en la presente memoria, la malta y mosto producidos a partir de la cebada con lipooxigenasa reducida de la invención son útiles para producir cerveza con una estabilidad aromática significativamente potenciada y niveles de trans-2-nonenal reducidos, particularmente en condiciones conocidas por promover la aparición de T2N. La invención demuestra la correlación entre la actividad de la lipooxigenasa 1 de malta de cebada para producir ácidos 9-hidroxiperoxioctadecadienoicos (9-HPOD) y la presencia de trans-2-nonenal en la cerveza. El uso de cebada homocigótica del gen lox-1 mutante en el proceso de fabricación de cerveza mejora la estabilidad
55 aromática de la cerveza, tanto durante el almacenamiento como en la exposición a temperaturas de almacenamiento elevadas. Estas propiedades potencian la calidad de la cerveza, y son útiles para prolongar su vida de almacenamiento y reducir la necesidad de enfriar la cerveza durante el transporte y almacenamiento.
La invención proporciona plantas de cebada y porciones de las mismas que tienen actividad lipooxigenasa 1 reducida y que expresan la proteína LOX-1 mutante como se describe en la presente memoria. Se describen en la presente memoria los procedimientos para producir dichas plantas de cebada, porciones de planta, productos de plantas y, particularmente, malta y mosto producidos a partir de las plantas de cebada de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto del inhibidor ácido nordihidroguayarético (NDGA) sobre la actividad lipooxigenasa 1 y 2 purificada por inmunoafinidad de embriones de grano de cebada germinado 3 días.
La Figura 2 es una gráfica que muestra el peso húmedo de grano en desarrollo de línea G y cv Vintage desde 5 días 5 después de la floración hasta la maduración completa (MC). Cada determinación es el peso medio del grano individual de 6 espigas.
La Figura 3 es una gráfica que muestra el peso seco de grano en desarrollo de línea G y cv Vintage desde 5 días después de la floración hasta la maduración completa (MC). Cada determinación es el peso medio del grano individual de 3 muestras de 5 granos.
10 La Figura 4 es una gráfica que muestra la actividad lipooxigenasa total en grano en desarrollo de línea G y cv Vintage desde 5 días después de la floración hasta la maduración completa (MC).
La Figura 5 es una gráfica que muestra los productos 9-y 13-HPOD de la oxidación de ácido linoleico por la actividad lipooxigenasa en grano en desarrollo de línea G.
La Figura 6 es una gráfica que muestra la actividad lipooxigenasa total en embriones de grano en germinación de 15 línea G y cv Vintage expresada como μmol/min/10 embriones (U/10 embriones).
La Figura 7 es una gráfica que muestra los productos 9-HPOD y 13-HPOD de la oxidación de ácido linoleico por la actividad lipooxigenasa en embriones de grano en germinación de línea G y cv Vintage, mostrando los niveles de 9-HPOD y 13-HPOD.
La Figura 8 es un Western blot que muestra la inmunodetección de lipooxigenasa 1 en embriones de grano en 20 desarrollo de línea G y cv Vintage [wt] desde 5 días después de la floración hasta la maduración completa (MC).
La Figura 9 es un Western blot que muestra la inmunodetección de lipooxigenasa 1 en embriones de grano de línea G y cv Vintage [de tipo silvestre (wt)] germinados durante 0-6 días.
La Figura 10 es un Northern blot sondeado con la región 3’ no transcrita de ADNc de lox-1 y que muestra transcritos de lipooxigenasa 1 detectados en grano en desarrollo de línea G y cv Vintage [tipo silvestre] desde 5 días después
25 de la floración hasta la maduración completa (MC).
La Figura 11 es una transferencia Northern sondeada con la región 3’ no transcrita de ADNc de lox-1 y que muestra transcritos de lipooxigenasa 1 detectados en embriones de grano de línea G y cv Vintage [wt] germinados durante 06 días.
Las Figuras 12A-12G son un alineamiento de secuencia nucleotídica de la región promotora y transcrita del alelo de
30 lox-1 de cv Vintage de tipo silvestre (WT) y el alelo de línea G (LG). El sitio de inicio de la transcripción (+1), el codón de inicio ATG (+69) y el codón de terminación de la traducción (+4231) están subrayados en las secuencias génicas. Las mutaciones nucleotídicas identificadas en el alelo de línea G se muestran en cursiva y negrita y se indican por un asterisco.
La Figura 13 es una presentación esquemática del gen lox-1 de cv Vintage (tipo silvestre) y del gen lox-1 mutante de
35 línea G. El transcrito de +1 a +4375 está compuesto por 7 exones (rectángulos punteados) y 6 intrones (rectángulos blancos). Se indican dos mutaciones en el gen lox-1.
La Figura 14 es un dibujo esquemático de los módulos génicos de la expresión transitoria de ADNc de lox-1 de tipo silvestre y del gen lox-1 y del gen lox-1 mutante de línea G. Se clonaron las secuencias codificantes de lipooxigenasa entre el promotor constitutivo de ubiquitina de maíz en el intrón 1 (Ubi-1) y el terminador nos.
40 La Figura 15 es una gráfica de barras que muestra la actividad lipooxigenasa 1 en protoplastos de aleurona de cebada transfectados con módulos génicos que contienen ADNc de lox-1 de tipo silvestre, el gen lox-1 mutante de línea G, el gen lox-1 WT y un gen informador GUS de control. Se ensayó la actividad lipooxigenasa en extractos de protoplastos transfectados en placas de microvaloración mediante la oxidación de KI y se cuantificó espectrofotométricamente. Se expresó la actividad lipooxigenasa 1 como unidades por μg de proteína en el extracto,
45 y se muestra como la media de 3 medidas de 2 ensayos por duplicado.
La Figura 16 es un alineamiento de secuencia que demuestra que el RFLP entre el gen lox-1 de tipo silvestre y mutante es debido a una mutación puntual en el nucleótido 2347, que crea un sitio de restricción AatII adicional.
La Figura 17 es una presentación esquemática de fragmentos de PCR de lox-1 amplificados y escindidos en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa –sitio polimórfico amplificado por escisión (PCR-CAPS). Las
50 posiciones de los cebadores de PCR se indican mediante flechas y los sitios AatII se muestran encima de los genes (posición de secuencia). Las regiones exónica e intrónica del producto de PCR se distinguen mediante rectángulos punteados y blancos respectivamente, y se dan los tamaños de los fragmentos de digestión con AatII.
La Figura 18 es un gel de electroforesis de agarosa que muestra fragmentos de PCR de lox-1 (652 pb) amplificados en la primera etapa del ensayo de PCR-CAPS de ADN genómico de línea G y cv Vintage.
La Figura 19 es un gel de electroforesis de agarosa que muestra el RFLP detectado por PCR-CAPS en el gen lox-1 de tipo silvestre y mutante. Los fragmentos de digestión por AatII del gen mutante incluyen un solo fragmento de 5 restricción de 313 pb, indicado por un asterisco.
La Figura 20 es una tabla que muestra un programa de retrocruzamiento para el par génico recesivo individual II (rasgo pobre en lipooxigenasa) de la línea G al cv Alexis. El genotipo LL son plantas que expresan actividad lipooxigenasa de tipo silvestre (alelo dominante), el genotipo ll son plantas que expresan el rasgo pobre en lipooxigenasa (alelo recesivo). Las LI son plantas heterocigóticas que contienen tanto el alelo de tipo silvestre como
10 el pobre en lipooxigenasa. Puesto que el rasgo pobre en lipooxigenasa es un rasgo recesivo, las plantas LI muestran actividad lipooxigenasa de tipo silvestre. Después de cada ronda de retrocruzamiento (incluyendo autopolinización), se espera que la progenie II represente un 25% de la progenie. Se indican las frecuencias observadas de actividad pobre en lipooxigenasa. El porcentaje calculado del fondo genético del cv Alexis que tiene el alelo pobre en lipooxigenasa homocigótico se indica como % de Alexis.
15 La Figura 21 es un gel de electroforesis de agarosa que muestra la detección por PCR-CAPS del gen lox-1 mutante en progenie II del programa de retrocruzamiento de línea G-Alexis. Ensayo PCR-CAPS de ADN genómico de la línea G (carril 2), cv Vintage (carril 3), progenie II del 3º (carril 4) y 4º (carriles 5-9) retrocruzamientos. Escala de ADN (carril 1). Línea de control retrocruzada rica en lox (carril 10).
Las Figuras 22A-22B son un alineamiento comparativo de las secuencias aminoacídicas de las lipooxigenasas LOX20 1 (Gm1), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) de soja y las lipooxigenasas LOX-1 (HvI) y LOX-2 (Hv2) de cebada.
Descripción detallada de la invención
Se proporcionan materiales vegetales, productos vegetales y procedimientos para la producción de una bebida, tal como cerveza, teniendo la bebida un contenido reducido del compuesto de aroma desagradable trans-2-nonenal, de tal modo que mejore la estabilidad aromática de la bebida, por ejemplo cerveza, durante el almacenamiento y
25 exposición a temperaturas elevadas respecto a una bebida de control. Más particularmente, la invención proporciona plantas de cebada cuyo grano en desarrollo y germinación produce niveles de actividad de la enzima lipooxigenasa 1, denominada LOX-1, reducidos en gran medida que, por ejemplo, cuando se usan en un proceso de fabricación de cerveza, dan como resultado una cerveza que tiene niveles reducidos de trans-2-nonenal, en comparación con una planta de cebada de control.
30 Se describen a continuación los procedimientos usados para generar, caracterizar y validar una planta de cebada que tiene una actividad LOX-1 reducida en gran medida, y el uso de este tipo de cebada para la producción de una cerveza de aroma estable.
1. Definiciones
Como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen las definiciones indicadas:
35 "Porción de planta” significa una planta o una parte específica de una planta, tal como el tallo, hojas, raíces, flores, semillas, granos, frutos o yemas.
"LOX-1" significa proteína lipooxigenasa 1; "lox-1" significa el gen que codifica LOX-1.
"lox-1 de cebada mutante” significa un gen de cebada mutagenizado que codifica un polipéptido de lipooxigenasa 1 mutante.
40 “Control no mutado” significa una planta, ácido nucleico, polipéptido, porción de planta o producto vegetal que contiene el gen o proteína de tipo silvestre.
“Heterólogo” significa una secuencia no nativa, por ejemplo, una secuencia derivada de otra especie, o una secuencia modificada recombinantemente o sintética que difiere de la secuencia nativa.
“Producto vegetal” significa un producto resultante del procesamiento de una planta o porción de planta, e incluye, 45 por ejemplo, malta y mosto.
“Aminoácido ácido” significa ácido aspártico o glutámico.
“Aminoácido básico” significa histidina, lisina o arginina.
“Aminoácido polar” significa treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.
“Propiedades organolépticas” significa propiedades que apelan a los sentidos del olfato y gusto que se analizan, por 50 ejemplo, por un panel de degustación entrenado.
“Producto de fabricación de cerveza” significa un producto preparado triturando, hirviendo y fermentando, por ejemplo, cerveza.
“Trans-2-nonenal reducido” significa menos de aproximadamente un 50%, en comparación con las condiciones de tipo silvestre (de control).
5 2. Actividad lipooxigenasa
Las enzimas lipooxigenasas catalizan la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados. En cebada, son conocidas las isoenzimas LOX-1 y LOX-2. La LOX-1 cataliza principalmente la 9-hidroperoxidación, mientras que la LOX-2 cataliza principalmente la 13-hidroperoxidación de ácidos grasos octadecanoicos poliinsaturados. Los datos mostrados en los ejemplos siguientes demuestran una correlación entre la actividad de 9-hidroperoxidación de LOX-1 de cebada y
10 la presencia de trans-2-nonenal en cerveza. Por consiguiente, la cebada con actividad LOX1 reducida es útil para producir cerveza que tiene un nivel y/o potencial reducido de trans-2-nonenal en comparación con el control.
3. Producción de cebada pobre en lipooxigenasa
Puede usarse una variedad de enfoques genéticos conocidos para producir las plantas de la invención, es decir, para reducir el nivel de actividad de la enzima lipooxigenasa 1 expresada en una planta de cebada de manera
15 estable y heredable. Estos enfoques incluyen, pero sin limitación, la tecnología anticodificante y la mutagénesis, tal como mutagénesis química e inducida por radiación, así como mutagénesis dirigida a sitio.
Transformación de cebada. La cebada puede transformarse con diversas moléculas de ácido nucleico diseñadas para manipular la expresión del gen lox-1 o alterar la arquitectura del gen lox-1. Pueden usarse diversos procedimientos, por ejemplo, transferencia mediada por Agrobacterium tumofaciens (Tingay et al., 1997, Plant J., 11:
20 1369-1376), bombardeo de partículas (Wan y Lemaux, 1994, Plant Physiol., 104: 37-48, o captación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG) (Funatsuki y Kihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91:707-712), para introducir ácidos nucleicos en una célula de cebada, por ejemplo, en un protoplasto, callo o embrión.
Pueden usarse diversos promotores para dirigir la expresión del gen de interés. Para la expresión de vectores que contienen lox-1, incluyendo secuencias anticodificantes, puede usarse la región promotora de lox-1 nativa. La 25 secuencia promotora de lox-1 está contenida en los nucleótidos 2602-3511, que incluyen la 5’ UTR de nº de acceso a EMBL U83904. Como alternativa, pueden usarse promotores que dirigen constitutivamente la expresión del gen de interés, por ejemplo, el promotor de ubiquitina de maíz Ubi-1 (Wan y Lemaux, supra; Kjærulff et al., en P. Mathis, Ed., 1995, “Photosynthesis: from Light to Biosphere”, vol. II, 151-154). Los vectores de expresión pueden contener también una región de terminación de la transcripción, por ejemplo, el terminador 3’ del gen de nopalina sintasa (3’
30 nos) (Bevan, et al., 1983, Nucl. Acids Res., 11: 369-385) se ha fusionado con genes expresados en cebada transgénica (Wan y Lemaux, Supra; Funatsuki y Kihara, supra).
Los vectores de expresión pueden contener también un gen que permita la selección de células transformadas cuando el vector se haya integrado exitosamente en la célula. Estos genes pueden codificar genes de resistencia a antibióticos o herbicidas, por ejemplo, el gen de neomicina fosfotransferasa (npt) o de fosfinotricina acetiltransferasa
35 (bar). Cuando se expresan, dichos genes de resistencia permiten el crecimiento de la célula transformada en medio que contiene neomicina o bialafos, respectivamente (véanse, por ejemplo, Wan y Lemaux, Supra; Funatsuki y Kihara, Supra; Kjærulff et al., en P. Mathis, Supra).
Después de la transformación, pueden cultivarse las células en medio selectivo durante un periodo de tiempo y cultivarse entonces para permitir la formación de brotes, seguido de sistemas de raíces y entonces plantones. Se ha 40 desarrollado un procedimiento de transformación de cebada exitoso por Funatsuki y Kihara, (Supra), en que la transformación de protoplastos de cebada por PEG con vectores de expresión que contienen neomicina fosfotransferasa y la posterior selección en neomicina proporcionaron plantas fértiles que contenían el transgén. Se ah mostrado que el transgén se integraba en el genoma y que la mayoría de las plantas transgénicas expresaban la proteína codificada por el transgén. Estas plantas transgénicas eran también capaces de transmitir y expresar el
45 transgén después de cruces.
Se entiende que son conocidos una variedad de procedimientos de transformación, vectores de expresión, promotores, marcadores seleccionables y similares y son útiles para la transformación de cebada.
Mutagénesis de cebada: El gen lox-1 puede orientarse a mutagénesis específica de sitio usando oligonucleótidos de ARN/ADN quiméricos. Se ha mostrado que estos oligonucleótidos de ARN/ADN quiméricos introducen 50 exitosamente mutaciones en células vegetales (Zhu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773 y Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778) y células de mamífero (Yoon et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076) en localizaciones deseadas. Los oligonucleótidos de ARN/ADN quiméricos pueden transformarse en protoplastos o células de cebada de interés en una variedad de formas, por ejemplo, usando los procedimientos de transformación mediada por PEG o mediada por bombardeo de partículas descritos anteriormente. Los protoplastos
55 o células individuales pueden regenerarse entonces mediante cultivo celular hasta plantas fértiles enteras, y puede confirmarse el evento mutacional y seguirse, por ejemplo, usando un enfoque basado en PCR como se detalla en los ejemplos siguientes.
Este procedimiento de mutagénesis dirigida a sitio puede aplicarse a mutar residuos específicos del gen lox-1. El gen lox-1 puede estar mutado en una o más posiciones nucleotídicas en la región promotora para regular negativamente o anular la transcripción de lox-1. Puede aplicarse también una mutagénesis específica para introducir cambios en la región de codificación de lox-1 que, por ejemplo, reduzcan la actividad enzimática. Dichas
5 mutaciones incluyen, pero sin limitación, inserciones, deleciones y sustituciones que dan como resultado un desplazamiento de fase, truncamiento de la proteína LOX-1 y/o una alteración de la naturaleza neutra e hidrófoba de la cavidad de sustrato de la enzima.
Expresión anticodificante: La reducción de la expresión de lox-1 puede lograrse también mediante la expresión de un constructo anticodificante de lox-1 en células de cebada. Se han notificado procedimientos para la expresión de
10 constructos anticodificantes en cebada para reducir la expresión de una proteína diana, por ejemplo, en Gilpin, M.J. et al., 1998, en: “Photosynthesis: Mechanisms and Effects”, G. Garab, ed., vol. IV, 2983-2986; Kjærulff et al., 1995, en: “Photosynthesis: from Light to Biosphere”, P. Mathis, Ed., vol. II, 151-154.
Las células de cebada pueden transformarse con un constructo de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico anticodificante. El constructo de expresión produce una molécula de ARN anticodificante capaz de unirse
15 específicamente al menos a una porción del ARNm producido por el gen lox-1 de tipo silvestre, mediante apareamiento de bases complementarias, y capaz de desestabilizar el corte y empalme del pre-ARNm o la traducción de este ARNm. Un promotor constitutivo o específico de tejido/temporal, por ejemplo, el promotor lox-1 de cebada descrito anteriormente, puede dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico anticodificante.
Mutagénesis química. El mutágeno químico azida de sodio (NaN3) se ha usado habitualmente para la mutagénesis
20 de cebada y es conocido por inducir mutaciones estables en la secuencia de ADN (ácido desoxirribonucleico) del genoma de cebada (Olsen et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8043-8047). Pueden usarse también otros mutágenos químicos, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), azidoglicerol (AG, 3-azido-1,2-propanodiol), metilnitrosourea (MNU) e hidrazida maleica (MH) para inducir las mutaciones de ADN (Rank, J. et al., 1997, Mutat. Res. 390: 121-7), así como irradiación UV.
25 Como se muestra en los ejemplos siguientes, se trató el grano de los cultivares (cv) de cebada Vintage y Caruso con azida de sodio y se propagó por autofertilización hasta la 3ª generación (M3).
4. Identificación y selección de cebada pobre en lipooxigenasa
Puede conseguirse la identificación y selección de plantas de cebada que tienen una actividad reducida de la isoenzima lipooxigenasa, por ejemplo, mediante análisis de la actividad lipooxigenasa. Pueden usarse ensayos
30 enzimáticos para determinar la actividad de las dos lipooxigenasas principales conocidas por estar presentes en grano maduro o en germinación, LOX-1 y LOX-2. Dichos ensayos deben distinguir la actividad LOX-1 de la LOX-2.
Un ensayo selectivo de LOX-1 y LOX-2 está basado en la oxidación de un ácido graso poliinsaturado por lipooxigenasa y la detección espectrofotométrica del producto hidroperóxido de dicha oxidación. La especificidad de este ensayo por LOX-1 aprovecha la insensibilidad comparativa de LOX-1 hacia un inhibidor, por ejemplo NDGA,
35 respecto a LOX-2.
Puede conseguirse también un ensayo selectivo usando la inmunoprecipitación para eliminar selectivamente LOX-1
o LOX-2 del ensayo. Pueden prepararse anticuerpos específicos anti-LOX-1 y anti-LOX-2, por ejemplo anticuerpos monoclonales, a partir de LOX-1 y LOX-2 purificadas como se describe en Holtman et. al, 1996, Supra.
Estos procedimientos de ensayo pueden adaptarse a procedimientos de ensayo de placa de microvaloración, u otros
40 formatos de ensayo de alto rendimiento repetitivos conocidos, permitiendo el cribado rápido de muchas muestras. Estos ensayos pueden validarse cribando puntas de hoja de grano en germinación de manera no destructiva, de tal modo que las plántulas seleccionadas en el cribado puedan propagarse posteriormente.
La pérdida de la actividad LOX-1 en presuntos mutantes puede confirmarse mediante el ensayo de la actividad enzimática. Por ejemplo, los extractos de grano pueden incubarse con ácido linoleico y analizarse los productos de
45 oxidación del ácido linoleico, por ejemplo, mediante HPLC en fase inversa. Las cantidades relativas de 9-HPOD y 13-HPOD formadas a partir de ácido linoleico proporcionan una medida de la actividad LOX-1, cuyo producto mayoritario es 9-HPOD.
Como se muestra en los ejemplos siguientes, se cribó en aproximadamente 20.000 granos de la generación M3 de cv Vintage y cv Caruso mutagenizados la actividad LOX-1 y LOX-2 mediante ensayo de oxidación en presencia de
50 inhibidor y también mediante ensayos de inmunoprecipitación. Usando estos procedimientos de cribado, se encontró que un mutante del cv Vintage tenía la mayor reducción de la actividad LOX-1, y se denominó línea G. El fenotipo mutante se heredó en las generaciones M4 y M5.
Se depositaron semillas producidas por cebada de la línea G el 4 de enero de 2001 en las “National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria” (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY, Escocia, RU, bajo los
55 términos del tratado de Budapest con el número de acceso NCIMB 41078.
5. Secuencias genéticas
Una descripción precisa de la alteración genotípica que da cuenta del fenotipo pobre en lipooxigenasa en plantas de cebada de la invención es útil para identificar plantas que tengan esta alteración genética y para cruzar este carácter genético con otros cultivares de cebada en un programa de reproducción. Puede usarse una variedad de
5 procedimientos moleculares y bioquímicos conocidos para determinar la base genética del fenotipo pobre en lipooxigenasa.
Se reconoce en general que tanto las secuencias que actúan en cis como las que actúan en trans pueden determinar la expresión de un gen dado en el genoma y la actividad del producto génico. Los puntos de control de la expresión génica incluyen la regulación del desarrollo temporal, la especificidad de tejido y la tasa de transcripción
10 génica, la estabilidad del transcrito y la tasa de traducción del transcrito. Tanto el nivel de expresión génica como la estabilidad y actividad específica de la enzima codificada determinarán el nivel de actividad enzimática detectado en un tejido.
Las alteraciones en una secuencia génica vegetal pueden determinarse mediante la secuenciación de ADN de partes relevantes conocidas del genoma, mientras que el análisis Northern proporciona una herramienta para
15 monitorizar los niveles de transcrito estables en un tejido vegetal dado. La enzima expresada en tejido vegetal puede evaluarse extrayendo la enzima del tejido y midiendo la actividad enzimática.
Como se muestra en los ejemplos siguientes, se determinó la identidad de los cambios genéticos que determinan el fenotipo pobre en lipooxigenasa del mutante de línea G inducido en el cv Vintage de la siguiente manera. Se amplificó el gen estructural que codifica la proteína LOX-1, tanto en el cv Vintage original como en la línea G,
20 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se secuenciaron las secuencias promotoras en dirección 5’, que regulan la expresión del gen, así como la secuencia de codificación completa que comprende secuencias intrónicas y extrónicas.
La comparación de las secuencias nucleotídicas del gen lox-1 de la línea G y del cv Vintage de tipo silvestre reveló 2 sustituciones nucleotídicas en 2 exones, de las cuales una (en posición + 2347) conducía a una sustitución
25 aminoacídica no conservativa (glicina368
�aspartato) en la proteína expresada.
La Figura 22 muestra un alineamiento de las lipooxigenasas de soja (Gm: Glycine max L) LOX1 (nº de acc. P08170), LOX2 (nº de acc. P08170), LOX3 (nº de acc. AAB41272) y las lipooxigenasas de cebada (hv: Hordeum vulgare) LOX1 (nº de acc. P29114) y LOX2 (nº de acc. AAB70865.1). Los residuos aminoacídicos conservados y sustituciones conservativas de residuos cargados se muestran en negrita. Las asignaciones de estructura
30 secundaria para LOX3 de soja Glycine max, en que H=hélices α y E= láminas β, se muestran encima del alineamiento, y se muestran los residuos relevantes para la función enzimática (identificados por un asterisco o círculo negro), como se describe en Skrzypczak-Jankun et al., 1997, Proteins 29:15-31.
Los residuos aminoacídicos que participan en la unión de hierro no hemo o esenciales para catálisis (*) en LOX3 de soja incluyen: H518, H523, H709 [3 átomos de N]; N713, I847. Los residuos equivalentes en LOX-1 de cebada son H517,
35 H522, H708, N712 eI862. Los residuos en LOX-3 de soja con un papel predicho en la catálisis (*) son: H266, H513, H776, F264, F272, F714, W519,R552, R726, D766, D779, K278. Los residuos equivalentes en LOX-1 de cebada son: H261, H512, H775, F259, F267, F713, W518, R551,R725, D778 yK273.
Los residuos de prolina (P86, 109, 167, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 486, 541, 548, 600, 616, 627, 685, 726, 734, 788, 829, 833, 839,
857) y glicina (G49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474, 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 855)
40 (+) localizados en bucles y posiciones de extremo de hélices en estructuras secundarias de proteína, pueden facilitar giros bruscos y el plegamiento de la cadena principal peptídica.
El alineamiento de las lipooxigenasas vegetales relacionadas indicó que la glicina 368 en LOX-1 de cebada está altamente conservada. Además, este residuo, que corresponde a la glicina 353 en lox-1 de soja es uno de los 35 residuos altamente conservados de un total de 58 residuos que recubren la cavidad de sustrato II de la enzima, 45 como se observa en su estructura cristalina. Estos residuos conservados están destacados (encuadrados) en el alineamiento de las secuencias de lipooxigenasas vegetales mostrado en la Figura 22 (Minor et al., 1996, Biochemistry 35: 10687-10701) e incluyen los siguientes residuos de LOX-1 de cebada: Y224, L268, W355, E364, G368, V369, N370, I374, L424, L499, K501, A502,V504, D508, S509, H512, Q513, L514, H517, W518, H522, I556, L559, A560, L564, I565,I570, T574, S585, Q715, Y718, N724, R725, P726, T727, I772 yI862. Todos menos 7 de los 35 residuos conservados son residuos neutros
50 o hidrófobos. La sustitución de un residuo cargado en la posición de glicina 368 de cebada o en otro residuo neutro o hidrófobo conservado que recubre la cavidad de sustrato II, es probable que desestabilice las propiedades estructurales y funcionales de la enzima. La mutación G�D368 en LOX1 de línea G de cebada (♦) está localizada entre la hélice α H6 y la lámina β E12.
Como se muestra en la Figura 22, la familia de enzimas lipooxigenasas comparte un alto grado de conservación de
55 secuencia, que se refleja en su estructura secundaria conservada, determinada para varios miembros de la familia de lipooxigenasas vegetales incluyendo LOX1 y LOX3 de soja (Skrzypczak-Jankun et al., 1997, supra). La LOX 1 de cebada comparte un 56,9% de identidad de secuencia y un 67,8% de similitud de secuencia con la LOX3 de soja. Se han identificado varios residuos aminoacídicos en la isoenzima LOX3 de soja como ligandos del hierro no hemo, o se sugiere que son esenciales para su actividad (denominado *). En vista de la alta conservación de secuencia entre la LOX1 de cebada y la LOX3 de soja, es razonable predecir que los residuos en la secuencia de LOX1 de cebada que son homólogos de los identificados como importantes para la función de LOX3 pueden ser también esenciales para la actividad enzimática. Por tanto, es probable que las sustituciones aminoacídicas no conservativas en
5 cualquiera de estas posiciones, incluyendo las sustituciones de aquellos residuos de LOX1 de cebada correspondientes a los 35 residuos altamente conservados de LOX3 de soja que recubren la cavidad de sustrato y en otras posiciones esenciales para la actividad enzimática, reduzcan la actividad lipooxigenasa.
Los residuos aminoacídicos prolina y glicina son conocidos por facilitar los giros en la cadena principal peptídica cuando están localizados entre elementos de estructura secundaria, lo que permite a la proteína asumir una 10 estructura terciaria plegada. Los residuos de prolina y glicina son también comunes en motivos de extremo de hélice (Parker y Hefford, 1997, Protein Eng., 10: 487-496, http://www.expasy.ch). La sustitución no conservativa individual en LOX1 de línea G, en que se reemplazó por aspartato una glicina localizada entre dos elementos estructurales predichos, condujo a una pérdida significativa de actividad enzimática. Se predice por tanto que la mutación del gen lox-1 que causa sustituciones no conservativas en uno o más residuos de prolina o glicina en LOX1 de cebada,
15 localizadas en regiones fuera de los elementos estructurales, puede evitar de forma similar el plegamiento de la proteína nativa y en consecuencia reducir la actividad de la enzima codificada.
Por tanto, en una realización, una planta de cebada mutante útil de la invención que tiene una actividad lipooxigenasa 1 reducida contiene una secuencia de ácido nucleico mutada que altera la naturaleza neutra o hidrófoba de la cavidad de sustrato de la enzima mediante la inserción de uno o más aminoácidos ácidos, básicos o
20 polares. La secuencia de ácido nucleico útil [SEQ ID NO: 11] codifica una proteína LOX-1 de cebada [SEQ ID NO: 12] que tiene una sustitución en el aminoácido 368 de glicina a Xaa, en que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina. Es una secuencia aminoacídica específica de LOX-1 mutante de cebada de la invención cuando Xaa es ácido aspártico, por ejemplo, la línea G.
25 Como se muestra en los ejemplos siguientes, los cambios genotípicos en la línea G no tuvieron una influencia detectable en la expresión del gen lox-1, pero la actividad LOX-1 detectada en grano maduro y en germinación de la línea G era aproximadamente un 9% de la detectada en grano de la línea original, el cv Vintage. Para proporcionar una prueba directa de que la mutación aminoacídica en LOX-1 de la línea G era la responsable del fenotipo de pobre en LOX-1, se expresó transitoriamente la secuencia de codificación de lox-1 de la línea G y lox-1 del cv Vintage en
30 protoplastos de aleurona de cebada, y se mostró que la actividad de la enzima LOX-1 mutante estaba reducida en gran medida en comparación con la enzima LOX-1 de tipo silvestre.
6. Transferencia entre líneas reproductoras
La detección de alteraciones en el carácter genético de las plantas de cebada del genotipo de la invención es útil para identificar la presencia de un carácter genético específico en una línea de cebada, y para facilitar la 35 transferencia de este carácter entre líneas reproductoras en un programa de reproducción. Están disponibles una variedad de herramientas moleculares para la detección de alteraciones en la secuencia genómica. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, la detección de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (Gebhardt y Salamini 1992, Int. Rev. Cytology, 135: 201-237) y procedimientos de detección cuantitativos basados en PCR tales como amplificación usando cebadores fluorescentes, por ejemplo, los sistemas de sonda de cebador
40 TaqMan (Ibraham et al., 1998, Anal. Chem. 70, 2013-2017). La elección del procedimiento de detección dependerá del carácter genético específico, pero debe ser preferiblemente rápido y proporcionar datos claramente interpretables.
Como se muestra en los ejemplos siguientes, se proporcionó un ensayo de PCR-sitio polimórfico amplificado por escisión (PCR-CAPS) para la detección del gen de lipooxigenasa 1 mutante de la línea G. La sustitución nucleotídica
45 en el gen lox-1 de la línea G en posición +2347 introdujo un sitio adicional de reconocimiento por la endonucleasa de restricción AatII que puede detectarse mediante el ensayo de PCR-CAPS. Los procedimientos de detección adecuados para lox-1 no están limitados a este ensayo, sino que pueden estar basados igualmente en tecnología TaqMan y otros procedimientos de detección conocidos.
Se muestra también en los ejemplos siguientes que se aplicó el ensayo PCR-CAPS a 4 generaciones de material
50 reproductivo de un programa de retrocruzamiento, en que el fenotipo pobre en lipooxigenasa de la línea G se retrocruzó sistemáticamente en el cv Alexis. Se mostró que la herencia del fenotipo pobre en lipooxigenasa seguía la herencia del gen lox-1, se identificó el fenotipo como recesivo y observado solo en líneas homocigóticas del gen lox
1.
Por consiguiente, la progenie vegetal de la invención incluye líneas reproductivas, por ejemplo, derivadas de un 55 programa de retrocruzamiento, que contienen lox-1 mutante y expresan un fenotipo pobre en lipooxigenasa.
7. Fabricación de cerveza
Se demuestra en la presente memoria que las plantas de cebada de la invención, incluyendo partes de planta, progenie vegetal, grano, malta y mosto, que tienen baja actividad lipooxigenasa 1, son útiles para la fabricación de una bebida que tiene niveles reducidos de trans-2-nonenal libre durante un periodo de tiempo medido, o en condiciones de elevada temperatura de almacenamiento, en comparación con una bebida producida a partir de una variedad de cebada de control de tipo silvestre. Con el fin de estas comparaciones, se controla el contenido de sulfito de la cerveza a 5 ppm o menos, puesto que se reconoce que niveles de sulfito mayores en el momento del
5 embotellado retardarán temporalmente la aparición de trans-2-nonenal libre. Por ejemplo, la cerveza fabricada a partir de malta derivada de la línea G de cebada mutada descrita en la presente memoria poseía propiedades organolépticas estabilizadas durante un periodo medido de tiempo en comparación con la cerveza fabricada a partir de malta derivada de una cebada de control no mutada.
Los ensayos de fabricación de cerveza y de evaluación de la cerveza embotellada proporcionan el mejor
10 procedimiento para la evaluación de la influencia de los diferentes ingredientes sobre la calidad y estabilidad de la cerveza acabada. Para ensayar la influencia de las diferentes maltas de cebada, se necesita suficiente grano de cebada para efectuar los ensayos de malteado y fabricación de cerveza a escala piloto y escala semi-industrial. Durante el periodo de propagación de cebada, puede evaluarse el rendimiento de campo de la línea de cebada. Pueden evaluarse las propiedades de malteado de una línea de cebada durante el malteado a escala piloto o
15 industrial, y preferiblemente deben encontrarse dentro de las recomendaciones de calidad de malteado nacionales, por ejemplo, las recomendaciones de la European Brewing Convention para la calidad del malteado (AnalyticaEBC/European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Carl Getränke-Fachverlag, Nürnberg, Alemania). Después de la fabricación de cerveza a escala piloto o semi-industrial, se envasa la cerveza en botellas marrones y se enfría a 5ºC para un almacenamiento óptimo. En esta etapa, puede analizarse la cerveza fresca por paneles de degustación
20 entrenados para detectar aromas de cerveza específicos, incluyendo el compuesto de aroma desagradable trans-2nonenal. Adicionalmente, se analizan químicamente en la cerveza los componentes aromáticos principales, incluyendo trans-2-nonenal. Estos procedimientos de análisis de calidad de la cerveza se repiten entonces en la cerveza después de diversas condiciones de almacenamiento conocidas por revelar la estabilidad al almacenamiento a largo plazo de la cerveza, por ejemplo, tratamientos de envejecimiento forzado.
25 Como se muestra en los ejemplos siguientes, se propagó cebada de línea G en el campo durante varias estaciones para maltear 10 ton de esta línea en una maltería industrial. Se maltearon en condiciones similares las variedades de cebada de control de cv Vintage y cv Nevada, ambas con el fenotipo LOX-1 de tipo silvestre. La malta horneada de la línea G y cultivares de cebada de control se encontraba dentro de las especificaciones necesarias para los ensayos de fabricación de cerveza a escala semi-industrial.
30 Se efectuaron ensayos de fabricación de cerveza a escala de 30 hl y una evaluación de las cervezas recién embotelladas reveló que las cervezas fabricadas a partir de malta tanto de la línea G como de los cultivares de control tenían un contenido de trans-2-nonenal inferior al umbral de gusto y se consideraron satisfactorias por un panel de degustación. Se usaron dos tratamientos de envejecimiento forzoso, almacenamiento a 37ºC durante 7 días o almacenamiento durante 6 a 12 semanas a 30ºC, para evaluar la estabilidad aromática de la cerveza. Se
35 encontró que la estabilidad aromática de la cerveza fabricada a partir de malta de la línea G era superior a la de la malta de control, tanto con respecto a la evaluación del panel de degustación como al nivel de trans-2-nonenal libre, y se encontró que la mejora era estadísticamente significativa.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
40 Cribado y selección de mutantes de isoenzima lipooxigenasa a partir de cebada mutagenizada
1. Mutagénesis de cebada
Se mutagenizaron granos de cebada, Hordeum vulgare cv Vintage y cv Caruso, con azida de sodio según un procedimiento publicado (Kleinhofs et al., 1978 Mutation Research 51: 29-35). La mutagénesis introduce mutaciones puntuales en el ADN genómico que pueden dar como resultado, por ejemplo, cambios aminoacídicos en las 45 proteínas codificadas. Se propagaron los granos de M1 mutados en invernadero a lo largo de dos generaciones, y se recogió el grano de M3 para cribado. La frecuencia observada de mutantes del rasgo génico individual en la generación M2, según Kleinhofs et al., 1978, supra, es de 1,0-2,7 mutantes por 10.000 granos de la generación M2. Puesto que la mayoría de las mutaciones génicas son recesivas y solo detectables en el estado homocigótico, se cribó la población mutagenizada en la generación M3, en que la proporción esperada de grano mutante
50 homocigótico sería mayor. Se esperaba una frecuencia de mutación de 0,9-2,3 por 10.000 granos en el material mutagenizado en M3.
2. Un ensayo no destructivo de la actividad lipooxigenasa 1 (LOX-1) y lipooxigenasa 2 (LOX-2) en grano mutagenizado en M3
Se desarrolló un procedimiento de cribado rápido para la detección de grano de cebada mutante con actividad LOX
55 1 reducida con los siguientes criterios: el procedimiento de cribado no debe evitar la propagación del grano/plántula; el grano/tejido de plántula seleccionado debe expresar niveles cuantificables de actividad lipooxigenasa; el ensayo debe distinguir la actividad LOX-1 de la LOX-2 y el procedimiento de ensayo debe englobar múltiples muestras.
Se ensayaron los niveles de actividad lipooxigenasa total en diferentes tejidos de grano en germinación, a saber brote, raíz y tejido de escutelo de embrión y endosperma como sigue: Se prepararon extractos de tejido de plántula de cebada homogeneizando el tejido con Tris-HCl 20 mM enfriado con hielo a pH 7,5, que contiene NaN3 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM (PMSF), seguido de la retirada del material insoluble mediante centrifugación a
5 1000 g durante 10 minutos. Se ensayó la actividad lipooxigenasa en un extracto de 100 μl a 25ºC mediante la adición de 2,9 ml de sustrato ácido linoleico 20 mM, preparado dispersando 35 μl de ácido linoleico (ácido libre, L1376, Sigma, EE.UU.) en 5 ml de H2O que contiene 1% de Tween 20. Se siguió espectrofotométricamente la reacción, en que la tasa de aumento de absorbancia a 234 nm (A234 nm), debida a la formación de dieno conjugado en el producto hidroperóxido, es proporcional a la actividad enzimática presente. Una unidad de actividad lipooxigenasa se define como ΔA234= 0,001 por minuto en una reacción de 3 ml, equivalente a la oxidación de 0,12 μmol de ácido linoleico.
El tejido de hoja de grano germinado durante 4 días en la oscuridad tenía los niveles mayores detectados de actividad lipooxigenasa (Holtman et al., 1996, Plant Physiology 111: 569-576). Se seleccionaron por tanto puntas de hoja de plántulas de 4 días para el ensayo de cribado no destructivo de lipooxigenasa. Se ensayó el pH óptimo de la
15 actividad lipooxigenasa de cebada total a entre pH 4,5 y pH 9,0 y se encontró que era de pH 6,5. Por tanto, se seleccionó un tampón HEPES 25 mM (pH 6,5) que contenía ácido bórico 0,2 M para el ensayo de cribado.
Puesto que tanto la enzima LOX-1 como LOX-2 se inmumodetectaron en brotes de plántulas de 4 días (Holtman et al., 1996, supra), se usó un ensayo específico de LOX-1 y LOX-2. Se encontró que el inhibidor de lipooxigenasa ácido nordihidroguayarético (NDGA), identificado por Eskin et al., 1977, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 140, era un inhibidor selectivo de lipooxigenasas de cebada. NDGA a 1 x 10-5 M inhibía fuertemente LOX-2 de cebada purificada, mientras que LOX-1 retenía un 47% de actividad (Figura 1). Se ensayó la selectividad de este inhibidor en el ensayo de punta de hoja, determinando la relación de 9-hidroperoxioctadecanoide (9-HPOD) a 13hidroperoxioctadecanoide (13-HPOD), que son el resultado de la oxidación de ácido linoleico por LOX-1 y LOX-2, respectivamente. En el ensayo de lipooxigenasa de puntas de hoja del cv Vintage, la proporción de 13-HPOD
25 formado cayó de 24,5% a 9,5% tras la adición de NDGA 1 x 10-5 M.
Se basó un ensayo selectivo de actividad LOX-2 en extractos de punta de hoja en el uso de un anticuerpo monoclonal específico de LOX-1 (5D2) (Holtman et al., 1996, supra) para inmunoprecipitar la LOX-1 presente en los extractos. La actividad lipooxigenasa residual detectada en los extractos después de la precipitación de LOX-1 proporcionó una medida de la actividad LOX-2. Se evaluó la eficacia de esta inmunoprecipitación (descrita a continuación) cuantificando la LOX-1 y LOX-2 residual en el sobrenadante del extracto mediante ensayo ELISA, usando anticuerpos monoclonales específicos frente a LOX-1 (denominado 5D2) y LOX-2 (denominado 5.8) (Holtman et al., 1996, supra). La inmunoprecipitación de LOX-1 de extractos de punta de hoja del cv Vintage retiró un 85% de proteína LOX-1 y un 15% de proteína LOX-2.
Se efectuó la inmunoprecipitación en una placa de 96 pocillos de fondo en V añadiendo 5 μl de Dynabeads
35 recubiertos con 5D2 (Dynal) y 75 μl de tampón [Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, 1% v/v de suero de ternero (HyClone)] a 20 μl de cada extracto de punta de hoja. Se incubó la placa en un agitador de placa de valoración (MTS4, IKA, Labor Technik) durante 1 hora a 4ºC. Se sedimentó el inmunoprecipitado mediante centrifugación a 4ºC en una centrífuga Sigma 302-K durante 10 minutos a 2000 rpm. Se ensayó en el sobrenadante (70 μl) de cada muestra la actividad lipooxigenasa en una placa de 96 pocillos de fondo plano, como se describe a continuación, pero con la adición de 100 μl de tampón de ensayo (HEPES 25 mM, ácido bórico 0,2 M, pH 6,5).
Se adaptaron los ensayos de LOX-1 y LOX-2 para un procedimiento de cribado de alto rendimiento. Se homogeneizaron individualmente puntas de hoja (1 cm) de 8 granos germinados 4 días en 150 μl de tampón enfriado con hielo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) durante 2 x 30 segundos en un homogeneizador multipocillos (Berg et al., 1992, Electrophoresis 13: 76-81). Después de la centrifugación durante 15 minutos a 3000 rpm, se transfirieron
45 40 μl del sobrenadante de cada extracto a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron a cada pocillo 170 μl de tampón (HEPES 25 mM, ácido bórico 0,2 M, pH 6,5, NDGA 1 x 10-5 M) y 10 μl de sustrato (ácido linoleico 20 mM) y se incubaron entonces durante 20 minutos a 25ºC. Se terminó la reacción mediante la adición de 20 μl de solución saturada de yoduro de potasio (KI) y se incubó durante 8 minutos adicionales a 25ºC. La reacción rédox entre hidroperoxidienos y KI proporcionó I2, que se monitorizó por su máximo de extinción a 350 nm en un lector de microplaca (Multiskan MCC/340).
3. Identificación de mutantes de lipooxigenasa 1 potenciales en grano de M3 y M4 de cebada mutagenizada
Se almacenó grano de la generación M3 del cv Vintage y el cv Caruso a 45ºC durante 6,5 días para interrumpir la dormancia, asegurando una frecuencia de germinación de un 95%. Se germinó grano M3 de cv Vintage (9318) y de cv Caruso (9633) y se cribaron las líneas cuya actividad LOX-1 fuera un 15% o menor que la del grano de tipo 55 silvestre. Se propagaron las presuntas líneas mutantes (50 líneas de cv Vintage y 42 de cv Caruso) hasta la generación M4, se recogieron y se volvió a cribar el grano germinado. Se confirmó el fenotipo LOX-1 mutante en una línea de cv Vintage y en 6 líneas de cv Caruso, después de medir la actividad lipooxigenasa en extractos de 5 puntas de hoja de cada línea. Cuando se examinaron las actividades LOX-1 y LOX-2 en embriones en germinación de estos 7 presuntos mutantes, solo el mutante de cv Vintage (denominado línea G) mostraba una reducción importante de LOX-1. En grano quiescente maduro, la actividad lipooxigenasa presente en el embrión es casi
exclusivamente actividad LOX-1, debido al patrón de expresión diferencial de las dos isoenzimas (Schmitt y van Mechelen, 1997, Plant Sci. 128: 141-150). La actividad lipooxigenasa total en extractos de embriones de grano seco maduro de la línea G (generación M5) era de 0,06 ± 0,04 U/mg de proteína en comparación con 0,74 ± 0,44 U/mg de proteína en extractos de embrión del cv Vintage, como se determina mediante el ensayo espectrofotométrico de
5 lipooxigenasa descrito en la sección 2 del ejemplo 1. Se encontró que la actividad lipooxigenasa residual en los embriones maduros de la línea G tanto de la generación M4 como M5 era de aproximadamente un 9% de la línea original.
Ejemplo 2
La línea G es un mutante del cv Vintage con un fenotipo pobre en lipooxigenasa
10 Se analizaron las propiedades agronómicas y el fenotipo mutante de la línea G en material de la generación M5. Los análisis iniciales se realizaron para confirmar que el material de M5 analizado era homocigótico del fenotipo mutante. El fenotipo pobre en LOX-1 de la línea G, detectado en la generación M3, podría ser el resultado de una mutación dominante o recesiva. Si la línea G seleccionada en la generación M3 fuera heterocigótica de una mutación dominante, entonces las generaciones posteriores mostrarían segregación por el fenotipo. Se midió la actividad
15 lipooxigenasa en 26 embriones individuales de la línea G de grano quiescente de la generación M5 y se comparó con embriones de tipo silvestre del cv Vintage. La actividad de lipooxigenasa en todos los embriones de la línea G era muy baja, con una media de 0,06 ± 0,04 U de lipooxigenasa por mg de proteína, en comparación con 0,74 ± 0,44 U de lipooxigenasa por mg de proteína en embriones de cv Vintage de tipo silvestre. Estos datos confirmaron que la línea G en la generación M5 era homocigótica del rasgo pobre en lipooxigenasa.
20 1. La línea G tiene una fisiología de crecimiento de planta y desarrollo de grano de tipo silvestre
Se germinó grano de la línea G y del cv Vintage y se cultivó en una cámara climatizada con 16 horas de luz a 15ºC y 8 horas de oscuridad a 12ºC a una humedad relativa de un 80%. Las características de crecimiento de las plantas de la línea G y del cv Vintage fueron similares con respecto a la altura de planta, número de vástagos por planta, inicio de floración y número de granos por espiga. El peso húmedo (Figura 2) y peso seco (Figura 3) del grano de línea G
25 y del cv Vintage durante el desarrollo desde 5 días después de la floración (DDF) hasta la maduración completa, aproximadamente 90 DDF, fueron muy similares.
2. El grano de línea G tiene un fenotipo pobre en lipooxigenasa 1 a lo largo del desarrollo
Se midió la actividad lipooxigenasa en extractos de grano de cebada en desarrollo de línea G (generación M5) y cv Vintage de tipo silvestre. Se homogeneizó el grano en tampón Tris-HCl 20 mM enfriado en hielo a pH 7,5 que 30 contenía 0,1% (v/v) de Nonidet P-40, un detergente no iónico que potencia la extracción de lipooxigenasa, y se centrifugó a 15.000 g durante 20 minutos para retirar el material insoluble. Se midió polarográficamente la actividad lipooxigenasa en los extractos en 200 μl de tampón saturado con oxígeno (ácido bórico 0,2 M, HEPES 25 mM, pH 6,5) que contenía ácido linoleico 1,2 mM a 25ºC, usando un electrodo de tipo Clark para medir el consumo de oxígeno. La actividad lipooxigenasa aumentó durante los primeros 20 días de desarrollo de grano tanto en grano de
35 línea G como de tipo silvestre, pero solo en la línea G cayó el nivel de actividad durante la maduración de grano (Figura 4).
Las cantidades relativas de 9-HPOD y 13-HPOD formadas durante la oxidación de ácido linoleico proporcionan una medida de los niveles de actividad LOX-1 y LOX-2 en los extractos de grano. En este caso, se omitió Nonidet P-40 del tampón de extracción de grano para evitar la coextracción de enzimas consumidoras de hidroperóxido. Se 40 incubaron los extractos (100 μl), mezclados con 10 ml de tampón fosfato 50 mM a pH 6,5, que contenían ácido linoleico 200 μM, durante 20 minutos. Se terminó la reacción ajustando el pH a 3,5, y se añadió un patrón interno. Se unieron los hidroperóxidos formados en el ensayo con una columna en fase sólida de octadecilo (Bakerbond, Baker) y se eluyeron con metanol. Se separaron entonces 9-HPOD y 13-HPOD mediante HPLC en fase inversa en una columna C-18 con un disolvente de elución isocrática (tetrahidrofurano:metanol:H2O:ácido acético; 25:30:44.9:0,1
45 (v/v) ajustado a pH 5,5 con amoniaco concentrado) a un caudal de 0,5 ml/minuto como se describe por Aarle et al., 1991, FEBS Letters 280: 159-162. Se detectaron los hidroperóxidos a 234 nm y se corrigieron los picos de HPOD frente al patrón estándar, prostaglandina B2.
La Figura 5 muestra que el 13-HPOD era el producto principal de actividad lipooxigenasa presente en grano durante los primeros 20 DDF, mientras que el 9-HPOD se formaba por lipooxigenasas activas durante la maduración de
50 grano. Aunque tanto los extractos de grano de línea G como de tipo silvestre compartían un perfil similar de actividad sintetizadora de 13-HPOD, la línea G no mostraba el aumento de actividad sintetizadora de 9-HPOD del tipo silvestre. Estos datos son consistentes con la pérdida de actividad LOX-1 en grano de cebada de línea G en maduración.
3. El grano de línea G tiene un fenotipo pobre en lipooxigenasa 1 en germinación
55 Se ensayó la actividad lipooxigenasa en extractos de embriones de grano germinados a 15ºC como se describe en el ejemplo 1. La actividad lipooxigenasa presente en grano de tipo silvestre quiescente se redujo durante los primeros 4 días de germinación y aumentó después (Figura 6). En la línea G, la actividad lipooxigenasa en grano quiescente era muy baja pero aumentó después de 4 días.
El análisis de los HPOD formados por la actividad lipooxigenasa en embriones en germinación mostró que el 9-HPOD era el producto principal de las lipooxigenasas presente en grano de tipo silvestre quiescente (Figure 7). El 5 nivel de formación de 9-HPOD cayó con la reducción de la actividad lipooxigenasa en los extractos. El aumento de actividad lipooxigenasa después de 4 días estuvo acompañado por la formación tanto de 9-HPOD como de 13-HPOD. La baja actividad lipooxigenasa de grano quiescente de línea G estaba asociada a la ausencia de formación de HPOD, mientras que el aumento de actividad después de 4 días produjo principalmente 13-HPOD. Estos datos proporcionan pruebas de que la actividad LOX-1 que conduce a la formación de 9-HPOD está reducida en gran
10 medida en los embriones tanto de grano de cebada en desarrollo, quiescente, como en germinación de la línea G, mientras que la actividad LOX-2 que conduce a la formación de 13-HPOD está intacta en la línea G.
Ejemplo 3
La línea G tiene un gen de lipooxigenasa 1 (lox-1) mutante que causa un fenotipo pobre en lipooxigenasa
Se investigó la base molecular del fenotipo de pobre en LOX-1 de la línea G para proporcionar una descripción
15 completa del mutante. Se efectuaron los siguientes análisis para proporcionar una caracterización completa del fenotipo:
1. Se sintetiza lipooxigenasa 1 en grano en desarrollo y en germinación de la línea G
Se efectuaron análisis mediante Western blot de extractos de embriones de grano de cebada en desarrollo y en germinación en paralelo con la medida de la actividad lipooxigenasa, como se describe en el ejemplo 2. Se 20 separaron los extractos brutos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS) según Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685. Se transfirieron las proteínas separadas a nitrocelulosa mediante transferencia semiseca, según Towbin et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354. Se sondeó la transferencia con el anticuerpo monoclonal específico de LOX-1, 5D2, como se describe en Holtman et al., 1996, Plant Physiology 111: 569-576, a una dilución de 500x, seguido de la incubación con anticuerpo de cabra anti-ratón 25 acoplado con fosfatasa alcalina, y se detectó con los sustratos de fosfatasa alcalina nitroazul de tetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo como se describe en Holtman et al., 1996, Plant Physiol. 111: 569-576. Los análisis Western revelaron que la proteína LOX-1 se detectaba en grano en desarrollo desde 10 DDF en embriones del cv Vintage y que el nivel aumentaba durante la maduración del grano (Figura 8). La proteína estaba también presente en el embrión de grano quiescente del cv Vintage, pero se reducía lentamente durante la germinación (Figura 9).
30 Aunque se reconoce LOX-1 en extractos de embriones de línea G y migra en PAGE-SDS como una proteína de tamaño similar a LOX-1 del cv Vintage, los niveles inmunodetectables de proteína en la línea G fueron ligeramente menores que en el cv Vintage.
2. El gen lox-1 se expresa en el grano en desarrollo y en germinación de la línea G
Se aisló ARN total de embriones de grano de cebada en desarrollo y en germinación según el procedimiento de
35 Hensgens y van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163-168, en paralelo con la medida de la actividad lipooxigenasa descrito en el ejemplo 2. Se separaron las muestras de ARN (7,5 μg) en geles de agarosa desnaturalizante y sometieron a transferencias Northern como se describe en Sambrook et al., 1989 en “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY. Se hibridaron las transferencias con una sonda marcada con 32P generada a partir de la región 3’ no traducida de cebada, nucleótidos 2659-2801 [SEQ ID
40 NO:1] del ADNc de lox-1 (nº de acceso EMBL L35931) como se describe en Holtman et al., 1996 Plant Physiol. 111: 569-576, usando el kit Amersham Random Prime.
Se detectaron transcritos de lox-1 que codifican LOX-1 en embriones de grano en desarrollo y maduro del cv Vintage y línea G desde 30 DDF (Figura 10). El nivel de transcritos de lox-1 aumentaba durante la germinación tanto en embriones del cv Vintage como de línea G, indicando la expresión de novo del gen lox-1 (Figura 11). Puesto que los
45 niveles detectables de transcritos de lox-1 eran similares en embriones de línea G y del cv Vintage, ni una transcripción de lox-1 reducida ni una estabilidad de transcrito reducida pueden dar cuenta del fenotipo pobre en lipooxigenasa de la línea G.
3. El gen lox-1 de la línea G codifica una forma mutante de lipooxigenasa 1
Se analizaron la secuencia nucleotídica del gen lox-1 de la línea G y del cv Vintage y se compararon para determinar
50 la base molecular del fenotipo pobre en LOX-1 de la línea G, que se caracteriza por una transcripción normal del gen lox-1, pero con una acumulación y actividad reducida en la enzima lipooxigenasa expresada en grano.
Se aisló ADN genómico de la línea G y del cv Vintage de tipo silvestre a partir de tejido de hoja de plántula según un procedimiento descrito por Pich y Schubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328. Se amplificó el gen lox-1 en las preparaciones de ADN genómico mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores basados 55 en la secuencia del gen lox-1 de cebada (van Mechelen et al. 1995, BBA 1254: 221-225; Rouster et al., 1997, Plant
J. 11: 513-523). La posición y secuencia de los cebadores oligonucleotídicos usados para amplificar el promotor de lox-1 y las regiones de codificación, indicadas en la Figura 12, fueron las siguientes
Se usaron el cebador sentido 5’-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC-3’ [SEQ ID NO:2] y el cebador antisentido 5’-TAT AGG ATC CTT GTT CTT GGC CTC CTC TCC TCG-3’ [SEQ ID NO:3] para amplificar por PCR el 5 dominio promotor de lox-1 (-361 a +68) de lox-1 de la línea G y del cv Vintage.
Se usaron el cebador sentido 5’-ACT GAA AAA CAG TGT GCT GGT G-3’ [SEQ ID NO:4] y el cebador antisentido 5’-GGC TTA AAG AGC AAC TGC TGA-3’ [SEQ ID NO:5] para amplificar por PCR la región de codificación de lox-1 de la línea G.
Se usaron el cebador sentido 5’-CAA GAT GCA TAT GCT GCT GGG AG-3’ [SEQ ID NO:6] y el cebador antisentido
10 5’-CGA TGG TTT AAA TTA GAT GGA GAT GCT GT-3’ [SEQ ID NO:7] para amplificar por PCR la región de codificación de lox-1 del cv Vintage.
Las reacciones PCR consistían en 250 ng de ADN genómico en un volumen de 50 μl que contenía 50 pmol de cebador y 2 U de ADN polimerasa Pfu (Promega) según las instrucciones de los suministradores de enzima. Se llevaron a cabo las amplificaciones por PCR en un Robocycler de Stratagene: 1 minuto a 94ºC, 1 ciclo; 1 minuto a 15 94ºC, 2 minutos a 62ºC y 5 minutos a 72ºC, 30 ciclos; 10 minutos a 72ºC, 1 ciclo. Se separaron los productos de PCR en geles de agarosa al 1,2%. Se purificaron los fragmentos de ADN correspondientes en longitud a la región amplificada usando el kit de extracción en gel Qiax II (Qiagen) y se clonaron en el plásmido pcDNA2.1 (Invitrogen). Se determinó la secuencia nucleotídica de ambas hebras del promotor de lox-1 clonado y de las regiones de codificación usando la reacción de terminación de cadena didesoxinucleotídica con cebadores oligonucleotídicos
20 específicos, y se analizaron en un analizador genético ABI PRISM® 310 (PE Biosystems). Se efectuaron las comparaciones de secuencia usando el paquete de software de análisis de secuencia DNA STAR (DNA STAR Inc., EE.UU.).
Se muestran la región promotora y la estructura intrónica-extrónica de la región codificante de lox-1 de cebada en la Figura 13, y se dedujeron a partir de una comparación de la secuencia nucleotídica de las secuencias genómicas y 25 de ADNc de lox-1 de tipo silvestre (Figura 12). La región secuenciada de la región promotora de lox-1 de -363 a +68, (numerada respecto al sitio de inicio de la transcripción determinado; van Mechelen et al., 1995, BBA 1254: 221-225), es suficiente para dirigir la expresión génica específica de embrión y regulada temporalmente característica del gen nativo (Rouster et al., 1998, Plant J. 15: 435-440). La región promotora y transcrita del gen lox1 de tipo silvestre [SEQ ID NO:8] es de 4663 nt de longitud y contiene 6 intrones de entre 82 nt y 634 nt de longitud,
30 que están ausentes del ADNc respectivo [SEQ ID NO:10] y por lo tanto deben retirarse durante el corte y empalme del transcrito de ARN.
La comparación de la secuencia nucleotídica de lox-1 de la línea G con la del tipo silvestre (Figura 12) mostró que el alelo lox-1 de la línea G tiene dos mutaciones puntuales. Una es una sustitución C�T silenciosa en posición 221 del exón 1, y la segunda es una sustitución G�A en posición 2347 del exón 3 (Figura 13). El gen lox-1 de cebada de
35 tipo silvestre codifica una proteína de 862 residuos aminoacídicos [SEQ ID NO:9], mientras que la mutación en posición 2347 en el alelo lox-1 de la línea G causa una sustitución aminoacídica de glicina por ácido aspártico en el residuo 368 de la proteína codificada.
El alineamiento de lipooxigenasas vegetales relacionadas indicó que la glicina 368 en LOX-1 de cebada está altamente conservada. Además, este residuo, que corresponde a la glicina 353 en LOX-1 de soja, es uno de los 51
40 residuos neutros o hidrófobos que recubren la cavidad de sustrato de la enzima, como se observa en su estructura cristalina (Minor et al., 1996, Biochemistry 35: 10687-10701) y se muestra en la Figura 22. La inserción de un residuo aminoacídico cargado en esta posición es por tanto posible que perturbe las propiedades estructurales y funcionales de la enzima.
4. La proteína LOX-1 mutada codificada por el alelo lox-1 de la línea G tiene una baja actividad enzimática y 45 es responsable del fenotipo pobre en lipooxigenasa de la línea G
La mutagénesis por azida de sodio de grano del cv Vintage, que introducía el alelo lox-1 mutado en la línea G, puede haber inducido mutaciones adicionales en el genoma de la línea G. Se han tomados dos enfoques experimentales para demostrar que el alelo lox-1 mutante en la línea G es responsable de su fenotipo pobre en lipooxigenasa, en lugar de otras mutaciones en el genoma. Se ha determinado la actividad enzimática de LOX-1 50 codificada por el alelo lox-1 mutante y de tipo silvestre para probar que la sustitución de glicina�ácido aspártico en la enzima mutante causa la estabilidad y actividad reducidas. Se expresaron transitoriamente los dos genes lox-1 en protoplastos de aleurona aislados de grano maduro embebido, puesto que se esperaba que el nivel de expresión endógena de lipooxigenasa en estas células estuviera por debajo de los límites de detección. No se detectan en el tejido de aleurona ninguno de los genes de lipooxigenasa de cebada identificados, que se expresan en cebada en
55 germinación (van Mechelen et al., 1999 supra). Para dirigir la expresión directa del gen lox-1 en protoplastos de aleurona, se fusionaron por traducción sus regiones codificantes con un promotor constitutivo conocido por ser activo en estos protoplastos.
Se escindieron mediante la digestión de los sitios KpnI y EcoRV en un sitio de clonaje múltiple vectorial las regiones codificantes del gen lox-1 mutante (posiciones de secuencia +1 a +4350) y de tipo silvestre (posiciones de secuencia +69 a +4230) y el ADNc de lox-1 de tipo silvestre (posiciones de secuencia +69 a +2654), clonadas cada una en el plásmido pcDNA2.1 (véase la sección 3). Se clonaron las regiones codificantes en el plásmido pUBARN (Jensen et
5 al., 1998, Hereditas 129: 215-225) entre el promotor de ubiquitina de maíz constitutivamente activo Ubi (como se describe en la patente de EE.UU. nº 005510474A) y el terminador Nos, en lugar del gen bar que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa (Figura 14).
Se aislaron protoplastos del tejido de aleurona de Hordeum vulgare cv Himalaya embebida según el protocolo de Skriver et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270. Se transfectaron alícuotas de 2 x 105 protoplastos a 10 0ºC con ~100 μg de ADN de plásmido (cantidades equimolares de cada plásmido) mediante la captación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG) (Lee et al., 1997, Plant Mol. Biol. 13: 21-29), y se incubaron entonces en medio de cultivo de protoplastos de aleurona a 25ºC como se describe anteriormente (Skriver et al., 1991 supra). Después de 48 horas de incubación, se retiró cuidadosamente el medio de cultivo, se resuspendieron los protoplastos y se homogeneizaron en 300 μl de tampón de ensayo de lipooxigenasa (ácido bórico 0,2 mM, HEPES 25 mM, pH 6,5). 15 Se centrifugaron los homogeneizados a 15.000 g durante 5 minutos para sedimentar el material insoluble, y se ensayó posteriormente en los sobrenadantes (10 μl) la actividad lipooxigenasa total usando el ensayo de cribado rápido descrito en el ejemplo 1, sección 1, pero con la omisión del inhibidor NDGA. Se midió el contenido de proteína de los extractos de protoplasto mediante un ensayo de unión a tinte de Bradford (Bradford 1976, Anal. Biochem., 72: 248) suministrado por Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE.UU., y se expresó la actividad lipooxigenasa
20 por mg de proteína en el extracto.
Los protoplastos transfectados con el plásmido de control, pUBI-GUS, en que el promotor de maíz ubiquitina 1 dirige la expresión del gen informador de β-glucuronidasa, no dieron actividad lipooxigenasa detectable. Las expresiones transitorias del gen lox-1 de tipo silvestre y del ADNc en protoplastos dieron ambas altos niveles de actividad lipooxigenasa en los extractos de protoplasto (Figura 15). La mayor expresión del ADNc de lox-1 de tipo silvestre en
25 comparación con la secuencia genómica puede ser debida a una mayor frecuencia de transfección para el menor plásmido de expresión de ADNc de lox-1 (4929 pb frente al constructo génico lox-1 de 6505 pb). La expresión transitoria del gen lox-1 mutante dio bajos niveles de actividad lipooxigenasa, ~10% de la actividad lipooxigenasa de tipo silvestre. Estos datos demuestran claramente que el gen lox-1 mutante de la línea G codifica una lipooxigenasa con actividad reducida en gran medida, que da cuenta del fenotipo pobre en lipooxigenasa.
30 Ejemplo 4
Ensayo de PCR-sitio polimórfico amplificado por escisión (PCR-CAPS): un procedimiento usado para la identificación del gen lox-1 mutante
Se desarrolló un procedimiento analítico que permitía la identificación del gen lox-1 mutante de la línea G en cualquier fondo genético basándose en el ensayo de PCR-CAPS. El ensayo implica una amplificación por PCR de
35 fragmentos de ADN genómico, seguido de la digestión de las secuencias amplificadas con una endonucleasa de restricción específica para exponer un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP).
La secuencia codificante del gen lox-1 mutante alberga dos mutaciones puntuales (véase el ejemplo 3), en que la mutación en la posición 2347 (Figura 12) introduce un sitio de escisión de endonucleasa de restricción Aat II adicional no encontrado en el gen lox-1 de tipo silvestre (Figura 16). El siguiente ensayo de PCR-CAPS, basado en
40 el polimorfismo creado por la presencia de este sitio de restricción en el gen lox-1, se muestra que discrimina entre un gen lox-1 de tipo silvestre y un gen lox-1 mutado.
Se aisló ADN genómico de hojas jóvenes de plántulas M6 de Hordeum vulgare, L. cv Vintage y de línea G según el procedimiento de Pich y Schubert (1993, supra). Se amplificó por PCR la secuencia de ADN que engloba la posición 2347 (sitio de mutación del gen lox-1 de la línea G), usando cebadores específicos del gen lox-1 [SEQ ID NO:8]. Se 45 muestran en la Figura 17 los fragmentos de ADN amplificados por el cebador de codificación 5’-CGCTACGACGTCTACAACGA-3’ [SEQ ID NO:13] y el cebador inverso 5’-AGACTACTTTTTGGCGGGA-3’ [SEQ ID NO:14] seleccionados. Se llevaron a cabo las reacciones de PCR con 250 ng de ADN genómico en un volumen de 50 μl que contenía 50 pmol de cada cebador y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Promega) según las instrucciones de los suministradores. Se llevaron a cabo las amplificaciones por PCR en un Robocycler de Stratagene como sigue:
50 1 minuto a 94ºC, 1 ciclo; 1 minuto a 94ºC, 1,5 minutos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, 30 ciclos; 10 minutos a 72ºC, 1 ciclo. Los fragmentos amplificados del gen lox-1 mutante y de tipo silvestre eran de ~650 pb (Figura 18), correspondientes al tamaño esperado (Figura 17). Se digirieron los productos de PCR, purificados en una columna de centrifugación (Qiagen), con 25 unidades de endonucleasa de restricción Aat II durante 24 horas a 37ºC y se analizaron en un gel de agarosa al 1,2%.
55 La digestión del producto de PCR de lox-1 de tipo silvestre proporcionó fragmentos de ADN de 10, 179, y 462 pb, y los fragmentos del producto de PCR de lox-1 mutante fueron de 10, 149, 179 y 313 pb, en que los fragmentos de ADN adicionales fueron debidos a la digestión parcial del producto de PCR de lox-1 (Figura 19). El patrón de fragmentos corresponde al RFLP resultante de esta mutación, en que el fragmento de 313 pb es único del lox-1 mutante. Este ensayo PCR-CAPS proporciona una herramienta reproducible y específica para la identificación del alelo lox-1 en cebada y por tanto puede explotarse en programas de reproducción de cebada orientados a introducir este gen en nuevas variedades de cebada.
Ejemplo 5
El retrocruzamiento del fenotipo pobre en lipooxigenasa de la línea G con el cv Alexis demuestra un 5 ligamiento genético con el gen lox-1 mutante
Se usó el retrocruzamiento repetido para transferir el fenotipo pobre en lipooxigenasa de la línea G a un original recurrente (en este caso el cv Alexis). El programa de retrocruzamiento mostrado en la Figura 20, combinado con la selección del fenotipo pobre en lipooxigenasa, sustituye progresivamente el genoma de la línea G por el genoma original recurrente. Además, se eliminarán otras mutaciones introducidas en el genoma de la línea G durante el 10 tratamiento de mutagénesis con azida de sodio. En el primer retrocruzamiento de la línea G pobre en lipooxigenasa homocigótica (denominado genotipo II) con el cv Alexis (denominado genotipo LL), las líneas de progenie serán heterocigóticas (denominado genotipo LI). No será detectable un fenotipo pobre en lipooxigenasa en las líneas heterocigóticas de la mutación debido a una mutación recesiva. La progenie se autopoliniza y dará una población segregada mendeliana normal, a saber 1 LL:2 LI:1 ll. El genotipo II homocigótico pobre en lox resultante del primer
15 retrocruzamiento tendrá un 50% del fondo genético del cv Alexis. Después de 10 rondas de retrocruzamiento, el fondo original recurrente será aproximadamente de un 99,9%.
Se propagaron Hordeum vulgare, L. cv Alexis y la línea G en invernadero a lo largo del programa de retrocruzamiento. Se germinaron los granos de progenie retrocruzados en placas Petri sobre papel de filtro empapado con 4 ml de H2O durante 3 días a 22ºC en la oscuridad. Se cribaron las líneas pobres en lipooxigenasa
20 midiendo la actividad lipooxigenasa total en extractos del coleóptilo (7 mm superiores) de plántulas en germinación, como se describe en el ejemplo 1. Se analizó también en la progenie del 3º y 4º retrocruzamiento la herencia del gen lox-1 mutante usando el ensayo PCR-CAPS descrito en el ejemplo 4.
La frecuencia esperada de fenotipo pobre en lipooxigenasa en la progenie segregada de las cuatro generaciones retrocruzadas era de un 25% para una mutación recesiva. La frecuencia observada de la actividad pobre en
25 lipooxigenasa en la progenie (24 granos) de las cuatro generaciones retrocruzadas está de acuerdo con la frecuencia esperada (Figura 20). Cuando se analizaron la progenie del 3º y 4º retrocruzamiento, que tenían el genotipo II homocigótico pobre en lox, con el ensayo PCR-CAPS, se encontró que todas tenían el fragmento de 313 pb distintivo, mientras que la progenie con actividad lipooxigenasa de tipo silvestre carecía de este fragmento (Figura 21).
30 El programa de retrocruzamiento demuestra que el alelo lox-1 mutante puede transferirse a un nuevo fondo genético y se hereda de manera monofactorial recesiva siguiendo la segregación mendeliana. Puesto que el fondo original recurrente es de un 93,8% en la progenie del 4º retrocruzamiento, la herencia conjunta del gen lox-1 mutante y el fenotipo pobre en lipooxigenasa proporciona la confirmación de su ligamiento genético.
Ejemplo 6
35 La cerveza fabricada a partir de malta de cebada de la línea G acumula menos trans-2-nonenal durante el almacenamiento, dando una estabilidad aromática mejorada
Se propagaron Hordeum vulgare L cv Vintage y la línea G en el campo durante varias temporadas para proporcionar suficiente grano para malteado industrial. Se efectuaron los siguientes ensayos de malteado y fabricación de cerveza a escala industrial, así como los análisis de la cerveza acabada, para demostrar el valor de la cebada pobre
40 en lipooxigenasa de la línea G para una estabilidad aromática mejorada.
1. Malteado y horneado industrial de la línea G y el cv Vintage
Se efectuó el malteado a escala de 10 ton en una maltería industrial en dos ensayos como sigue:
Ensayo 1: Grano de cebada de la línea G (cosecha de 1996)
Condiciones de maceración: 8 horas húmedo, 14 horas seco, 8 horas húmedo, 10 horas seco, 4 horas húmedo en
45 agua de maceración a 16ºC. Condiciones de malteado: 12 horas a 18ºC, 24 horas a 16ºC, 24 horas a 14ºC, 60 horas a 12ºC. Condiciones de horneado: 12 horas a 60ºC, 3 horas a 68ºC, 4 horas a 74ºC, 3 horas a 80ºC.
Ensayo 2: cv Vintage y línea G (cosecha de 1996/1997)
Condiciones de maceración: 8 horas húmedo, 10 horas seco, 6 horas húmedo, 15 horas seco, 4 horas húmedo en agua de maceración a 15ºC. Condiciones de malteado: 5 días con entrada de aire a 15ºC y pulverización para
50 mantener el nivel de humedad. Condiciones de horneado: 10 horas a 50ºC, 2 horas a 60ºC, 2,5 horas a 80ºC.
Los análisis de malteado de dos muestras de malta de la línea G del ensayo 1 en comparación con la malta de control, el cv Nevada (Tabla 1) y del ensayo 2 en comparación con el cv Vintage (Tabla 2) confirmaron que la malta de la línea G era adecuada para ensayos de fabricación de cerveza.
TABLA 1
ENSAYO DE MALTEADO 1
Variedad de cebada
cv Nevada Línea G Línea G
Año de cosecha
1996 1996 1996
Análisis de malta
Contenido de humedad
% 4,7 4,3 4,4
Extracto fino como tal
% ia 76,9 76,1 75,3
Extracto fino en m.s.
% m.s. 81,4 79,5 78,7
Tiempo de sacarificación
Min <10 <10 <10
Potencia diastática
%WK 252 373 365
Color
EBC 2,8 4,4 3,8
pH
6,16 5,97 5,99
Turbidez
EBC 9,0 2,5 2,4
Proteína total en m.s.
% 10,35 10,74 12,03
Nitrógeno soluble
mg/l 647 787 765
% de proteína soluble en la malta en m.s.
% m.s. 3,7 4,4 4,3
Kolbach
35,3 40,8 35,4
Amino nitrógeno libre
mg/l 97 125 118
Friabilidad
% 89,5 85,6 89,5
Granos completamente no modificados
% 1,1 0,6 0,5
Granos parcialmente no modificados
% 2,3 1,0 0,6
β-glucano en mosto
mg/l 114 66 36
β-glucano en malta
% p/p 0,24 0,11 0,05
S-metilmetionina/eq. de DMS
μg/g 2,4 6,4 8,4
DMS libre
μg/g 1,0 6,6 4,7
NDMA
μg/kg n.d. 0,3/0,6 0,3/0,3
TABLA 2
ENSAYO DE MALTEADO 2
Variedad de cebada
Vintage Línea G Línea G
Año de cosecha
1996 1996 1997
Contenido de humedad
% 4,1 4,1 4,3
Extracto fino como tal
% ia 77,0 75,6 77,5
Extracto fino en m.s.
% m.s. 80,3 78,8 80,9
Diferencia fino/grueso
% m.s. 0,7 1,6 1,7
Tiempo de sacarificación
Min - - <10
Potencia diastática
%WK 343 342 268
Color
EBC 2,5 2,8 3,4
pH
6,05 6,01 6,12
Turbidez
EBC 1,5 1,3 2,5
Proteína total en m.s.
% 10,98 12,22 9,82
Nitrógeno soluble
mg/l 696 741 610
% de proteína soluble en la malta en m.s.
% m.s. 3,9 4,1 3,4
Kolbach
35,2 33,7 34,6
Amino nitrógeno libre
mg/l 110 117 100
Friabilidad
% 91,3 81,8 89,5
Granos completamente no modificados
% 0,7 1,1 1,3
Granos parcialmente no modificados
% 1,0 2,7 2,7
β-glucano en mosto
mg/l 97 172 117
β-glucano en malta
% p/p - - 0,3
S-metilmetionina/eq. de DMS
μg/g - - -
DMS libre
μg/g - - -
2. Fabricación de cerveza industrial con malta de línea G, cv Vintage y malta de control de cv Nevada
Se efectuaron dos ensayos de fabricación de cerveza, usando mosto preparado a partir de malta de línea G y malta 5 de control del cv Nevada en el ensayo 1 y de línea G y de malta de control del cv Vintage en el ensayo 2.
Se fabricó la cerveza a escala industrial de 30 hl con 475 kg de malta según el siguiente esquema: trituración a 50ºC, 30 minutos a 50ºC, calentamiento de 30 minutos a 50-70ºC, 15 minutos a 70ºC. Se calentó una porción del mosto durante 20 minutos a 70-100ºC y durante 5 minutos a 100ºC, mientras que la masa principal se mantenía a 70ºC durante otros 25 minutos, y se combinaron entonces las dos masas y se mantuvieron durante 10 minutos a
10 76ºC. Las etapas de fabricación de cerveza de cocción de mosto, separación del grano gastado por centrifugación, enfriamiento, fermentación, reposo y envasado en botellas de vidrio marrones fueron según la práctica cervecera estándar.
3. Estabilidad aromática y contenido de T2N de la cerveza fabricada a partir de malta de línea G, cv Vintage y malta de control de cv Nevada
Se almacenó cerveza recién embotellada a 5ºC y se analizó al cabo de 2 meses de la producción. Se evaluó la estabilidad aromática de la cerveza fresca y almacenada en dos laboratorios independientes siguiendo dos tipos diferentes de condiciones de almacenamiento. En el laboratorio A, se sometió la cerveza a un proceso de envejecimiento forzado, en que la cerveza se almacenó a 37ºC durante un periodo de 7 días, mientras que en el 5 laboratorio B se almacenaba a 30ºC durante 6 y 12 semanas. Se determinaron los niveles de trans-2-nonenal en la cerveza mediante cromatografía de gases y detección espectrométrica de masas después de la derivatización de carbonilos con O-(2,3,4,5,6-pentafluorobencil)hidroxilamina esencialmente como se describe por Grönqvist et al. 1993 “Proceedings of the 24th EBC Congress”, Oslo, 421-428. Un panel de degustación entrenado evaluó la puntuación de aroma global de la cerveza, que incluye la detección de un aroma acartonado indicativo de trans-2
10 nonenal libre en la cerveza.
Laboratorio A: Tolerancia al envejecimiento forzado
La comparación de la cerveza fabricada a partir de malta de la línea G y de control, del cv Nevada, en el primer ensayo de fabricación de cerveza (Tabla 3) demostró que la cerveza de la línea G tenía una mayor estabilidad aromática y un menor contenido de trans-2-nonenal después de un envejecimiento forzado en comparación con los
15 controles. El segundo ensayo, que compara la cerveza fabricada a partir de malta de la línea G con cerveza fabricada a partir de malta del cv Vintage, el cultivar original, confirmó los datos iniciales (Tabla 4).
TABLA 3
ENSAYO DE FABRICACIÓN DE CERVEZA 1
Malta de cebada
cv Nevada Línea G
Contenido de SO2 (mg/ml)
1 1
T2N** (ppb)-cerveza fresca
0,009 0,005
T2N** (ppb)-cerveza envejecida (37ºC/7 días)
0,117 0,025
Aroma*-cerveza fresca
5,9 5,3
Aroma*-cerveza envejecida (37ºC/7 días)
1,3 5,1
*Escala de evaluación del aroma de 1 a 10 por calidad creciente; **trans-2-nonenal.
TABLA 4
ENSAYO DE FABRICACIÓN DE CERVEZA 2
Malta de cebada
cv Nevada Línea G
Contenido de SO2 (mg/ml)
2 2,5
T2N** (ppb)-cerveza fresca
0,023 0,019
T2N** (ppb)-cerveza envejecida (37ºC/7 días)
0,078 0,035
Aroma*-cerveza fresca
5,5 6,1
Aroma*-cerveza envejecida (37ºC/7 días)
2,9 5,9
*Escala de evaluación del aroma de 1 a 10 por calidad creciente; **trans-2-nonenal.
20 Laboratorio B: Tolerancia al almacenamiento a 30ºC
La cerveza fabricada a partir de malta de la línea G tenía menores niveles de trans-2-nonenal después de 6 y 12 semanas a la temperatura de almacenamiento elevada de 30ºC cuando se comparaba con la cerveza fabricada a partir de cualquiera de la maltas de referencia (Tablas 5 y 6), y tenía una mejor estabilidad aromática a juzgar por un panel de degustación. El umbral de gusto para el trans-2-nonenal en estas cervezas analizadas se encuentra
25 cercano a 0,08 ppb.
TABLA 5
ENSAYO DE FABRICACIÓN DE CERVEZA 1
Malta de cebada
cv Nevada Línea G
trans-2-nonenal (ppb)-cerveza fresca
0,050 0,044
trans-2-nonenal (ppb)-30ºC/6 semanas
0,072 0,037
trans-2-nonenal (ppb)-30ºC/12 semanas
0,095 0,046
Aroma a trans-2-nonenal* -cerveza fresca
0,6 0,3
Aroma a trans-2-nonenal* -30ºC/6 semanas
3,7 1,4
Aroma a trans-2-nonenal* -30ºC/12 semanas
2,5 0,6
*puntuación de detección del aroma a trans-2-nonenal en una escala de 1 a 10
TABLA 6
ENSAYO DE FABRICACIÓN DE CERVEZA 2
Malta de cebada
cv Vintage Línea G
trans-2-nonenal (ppb)-cerveza fresca
0,070 0,062
trans-2-nonenal (ppb)-30ºC/6 semanas
0,093 0,070
trans-2-nonenal (ppb)-30ºC/12 semanas
0,133 0,080
Aroma a trans-2-nonenal* -cerveza fresca
0,3 0,9
Aroma a trans-2-nonenal* -30ºC/6 semanas
2,5 1,7
Aroma a trans-2-nonenal* -30ºC/12 semanas
2,2 1,3
*puntuación de detección del aroma a trans-2-nonenal en una escala de 1 a 10
Se muestra que la estabilidad aromática mejorada de la cerveza fabricada a partir de malta de la línea G, medida por los niveles de trans-2-nonenal detectados en la cerveza después del almacenamiento a 30ºC de los datos de ensayo de fabricación de cerveza combinados, es estadísticamente significativa (Tabla 7).
TABLA 7
TRAN-2-NONENAL EN CERVEZA ALMACENADA
Fresca
Media DE Diferencia P bilateral Significativo (p< 0,05)
Referencia
0,060 0,012 0,007 0,34 No
Línea G
0,053 0,011
6 semanas, 30ºC
Media DE Diferencia P bilateral Significativo (p< 0,05)
Referencia
0,083 0,013 0,029 0,031 Sí
Línea G
0,054 0,021
12 semanas, 30ºC
Media DE Diferencia P bilateral Significativo (p< 0,05)
Referencia
0,114 0,023 0,051 0,003 Sí
Línea G
0,063 0,020
Puesto que los niveles de sulfito natural eran bajos en ambos ensayos de fabricación de cerveza, los niveles de trans-2-nonenal libre en la cerveza envejecida reflejarían estrechamente el potencial de trans-2-nonenal de las diferentes cervezas, a saber, el nivel de aductos de trans-2-nonenal presentes en la cerveza fresca. La adición de sulfito puede retardar temporalmente el proceso de enranciamiento, al complejar el trans-2-nonenal libre, hasta que
5 los niveles de sulfito se reducen por la oxidación debida al intercambio gaseoso a través del envasado. Los ensayos de fabricación de cerveza descritos con malta de cebada pobre en LOX-1 proporcionan la primera
evidencia inequívoca de que la actividad LOX-1 en la cebada durante el proceso de malteado y fabricación de cerveza es un determinante clave de la aparición del compuesto de aroma desagradable LISTADO DE SECUENCIAS
10 <110> Douma, Anneke Doderer, Albert Cameron-Mills, Verena Skadhauge, Birgitte Bech, Lene
15 <120> CEBADA POBRE EN LIPOOXIGENASA 1
<130> 11225.12wo01
<160> 18
<170> PatentIn versión 3.0
<210> 1 20 <211> 143
<212> ADN
<213> Hordeum vulgare
<400> 1
25
<210> 2
<211>
24
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
<400>
2
<210>
3
<211>
33
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
35
<400> 3
<210>
4
<211>
22
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
5
<400> 4
<210>
5
<211>
21
<212>
ADN
10
<213> Hordeum vulgare
<400>
5
<210>
6
<211>
23
15
<212> ADN
<213>
Hordeum vulgare
<400>
6
<210>
7
20
<211> 29
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
<400>
7
25
<210> 8
<211>
4663
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
<400>
8
<210>
9
<211>
862
<212>
PRT
5
<213> Hordeum vulgare
<400>
9
<210>
10
<211>
2818
<212>
ADN
5
<213> Hordeum vulgare
<400>
10
<210>
11
<211>
4663
<212>
ADN
5
<213> Hordeum vulgare
<220>
<221>
variación
<222>
(2346)..(2348)
<223>
“n” es a, c, t, o g que codifican un aminoácido ácido, básico o polar
10
<400> 11
<210>
12
<211>
862
<212>
PRT
5
<213> Hordeum vulgare
<220>
<221>
variación
<222>
(368)..(368)
<223>
“Xaa” es un aminoácido ácido, básico o polar
5
<400> 12
5
<210> <211> <212> <213> <400> 13 20 ADN Hordeum vulgare 13
<210>
14
<211>
20
<212>
ADN
<213>
Hordeum vulgare
<400>
14
<210>
15
<211>
839
<212>
PRT
<213>
Glycine max
10
<400> 15
<210>
16
<211>
865
<212>
PRT
5
<213> Glycine max
<400>
16
<210>
17
<211>
857
<212>
PRT
5
<213> Glycine max
<400>
17
<210>
18
<211>
864
<212>
PRT
5
<213> Hordeum vulgare
<400>
18

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una planta de cebada o porción de la misma que comprende una proteína LOX-1 mutada, en la que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, en la que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO:
    5 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.
  2. 2. La planta de cebada o porción de la misma según la reivindicación 1, en la que la actividad LOX-1 comprende la catálisis de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados libres y esterificados y de ácidos grasos octadecanoicos poliinsaturados para formar derivados de ácidos grasos 9-hidroperoxidados.
    10 3. La planta de cebada o porción de la misma según la reivindicación 1, en la que Xaa es ácido glutámico o ácido aspártico.
  3. 4.
    La planta de cebada o porción de la reivindicación 3, en la que Xaa es ácido aspártico.
  4. 5.
    Grano o progenie vegetal que comprende una proteína LOX-1 mutada, en los que la proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID No. 12, en la que Xaa es D, E, H, K, R, T, S,
    15 Y, W, N o Q, producida a partir de la planta de cebada o porción de planta de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
  5. 6. Una malta o mosto que comprende una proteína LOX-1 mutada, en los que la proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID No. 12, en la que Xaa es D, E, H, K R, T, S, Y, W, N o Q, producida a partir de la planta de cebada o porción de planta de la misma según una cualquiera de las
    20 reivindicaciones 1-4 o a partir del grano o progenie vegetal de la reivindicación 5.
  6. 7. Uso de una malta o mosto según la reivindicación 6, para la preparación de una bebida que presenta cualidades organolépticas que permanecen estables durante un periodo de tiempo medido o a temperaturas de almacenamiento elevadas en comparación con una bebida preparada a partir de un producto vegetal de un control no mutado.
    25 8. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de una bebida.
  7. 9.
    Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de una malta o cerveza.
  8. 10.
    Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una
    30 cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la estabilización de las propiedades organolépticas de un producto de la fabricación de cerveza durante un periodo de tiempo medido, en comparación con un producto de fabricación de la cerveza de control producido usando una planta de cebada no mutada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o producto vegetal.
  9. 11. Uso de una planta de cebada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o malta o mosto según una
    35 cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fabricación de un producto de la fabricación de la cerveza que tiene niveles reducidos de trans-2-nonenal libre durante un periodo de tiempo medido o en condiciones de temperatura de almacenamiento elevada, en comparación con un producto de la fabricación de cerveza de control producido usando una planta de cebada no mutada o porción de la misma, grano o progenie vegetal, o producto vegetal.
  10. 12. Un proceso para la producción de cerveza a partir de cebada en el que la cebada o una porción de la
    40 misma comprende una proteína LOX-1 mutada, en el que la actividad LOX-1 de dicha planta o porción de planta está reducida o ausente en comparación con un control no mutado, y en el que dicha proteína LOX-1 mutada comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que Xaa es ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, treonina, serina, tirosina, triptófano, asparagina o glutamina.
  11. 13. Un proceso según la reivindicación 12, en el que Xaa es ácido glutámico o ácido aspártico.
    45 14. Un proceso según la reivindicación 13, en el que Xaa es ácido aspártico.
    Promotor
    Promotor
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