PL209479B1 - 2-O-odsiarczanowane pochodne heparyny, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek odnosi się do częściowo odsiarczanowanych pochodnych glikozaminoglikanu, szczególnie 2-O-odsiarczanowanych heparyn, do sposobów ich wytwarzania, do ich zastosowania jako składników czynnych do wytwarzania leków z aktywnością przeciwangiogenną, szczególnie do leczenia nowotworów, takich jak, np., formy przerzutowe, i do zawierających je kompozycji farmaceutycznych.

Pierwszą cząsteczkę wykazującą aktywność przeciwangiogenną odkrył w chrząstkach Henry Brem i Judah Folkman w 1975 roku. Od tego roku odkryto ponad 300 nowych cząsteczek zdolnych do hamowania angiogenezy.

We wczesnych latach osiemdziesiątych, z odkryciem interferonu (α/β) jako inhibitora angiogenezy nowotworu, rozpoczęto kliniczne eksperymenty oparte na tym podejściu terapeutycznym.

Prasa dość szeroko opisywała, gdy 3 marca 1998 New York Times opublikował wiadomość, że dwie cząsteczki, angiostatyna i endostatyna, odkryte w laboratoriach J. Folkmana w Harvard Medical School i Children's Hospital w Bostonie, dawały bardzo zachęcające wyniki w walce z rakiem. Wysoki stopień skuteczności tych dwu cząsteczek w hamowaniu angiogenezy zasadniczo przyspieszył poszukiwania nowych związków. Obecnie istnieje około 30 cząsteczek wykazujących aktywność przeciwrakową, które działają przez mechanizm antyangiogenny, które wprowadzono do etapu prób klinicznych [fazy I-III] i zaangażowanych jest niemal tyle przedsiębiorstw i instytucji.

W samych Stanach Zjednoczonych Ameryki ocenia się, że istnieje w przybliżeniu 9 milionów pacjentów, którzy mogą skorzystać z terapii przeciwangiogennej. Obecnie co najmniej 4000 pacjentów poddało się próbom klinicznym z użyciem tej terapii bez żadnych konkretnych niepożądanych skutków.

W schemacie ogólnej koncepcji angiogenezy odróż nimy waskulogenezę , to jest tworzenie naczyń krwionośnych podczas rozwoju embrionu oraz angiogenezę w ścisłym sensie terminu, oznaczającą tworzenie nowych naczyń krwionośnych (kapilar) podczas życia po urodzeniu rozpoczynane od istniejących naczyń. Doniosłość angiogenezy dla wzrostu litych nowotworów jest dostatecznie udokumentowana. W ostatnich trzech dekadach opisano, że wzrost nowotworu, jak też tworzenie przerzutów, silnie zależy od rozwoju nowych naczyń zdolnych do unaczynienia masy nowotworu.

Inhibicja angiogenezy powoduje tworzenie martwicowych mas w nowotworze lub indukcję apoptozy komórek nowotworu.

Istnieją wyraźne różnice pomiędzy neonaczynieniem w normalnej tkance i w tkance nowotworu. W tej pierwszej, śródbłonek naczynia oznacza nieaktywną tkankę z bardzo niskim wskaźnikiem mitotycznym składowych komórek (czas odnawiania mierzony w setkach dni), i sieć naczyniowa jest regularna, względnie jednorodna i odpowiednia do właściwego utleniania wszystkich tkanek, bez połączenia tętniczo-żylnego. W tkance nowotworu, z drugiej strony, stymulacja rozrostu komórek śródbłonka daje w nich wysoki wskaźnik mitotyczny (średni czas odnawiania 5 dni), neonaczynienie jest wyraźnie nieregularne z polami okluzji, czasami zamkniętymi zakończeniami, z tętniczo-żylnymi kontaktami w pewnych punktach, i na koniec, błona podstawna ma luki, które gdzieniegdzie prowadzą do niedotlenienia tkanki. Te różnice dają możliwość identyfikacji leków, które selektywnie blokują neonaczynienie nowotworu.

W nowotworze neonaczynienie nie zawsze zbiega się z dokładnym etapem rozwoju nowotworu; istnieją w istocie przypadki, w których angiogeneza rozpoczyna się nawet przed rozwojem nowotworu (np., rak szyjki macicy), inne, w których dwie fazy zbiegają się (np., rak pęcherza i piersi), oraz inne, w których angiogeneza zaczyna się po nowotworze (np., czerniak i rak jajników; patrz np. „Manual of Medical Oncology, wyd. IV (1991) G. Bonadonna i in.

Terapia przeciwangiogenna daje wiele korzyści w porównaniu z tradycyjną standardową chemioterapią (Cancer Research 1998, 58, 1408-16):

a) specyficzność: jej celem jest proces, to jest neonaczynienie nowotworu;

b) biodostępność: jej celem są komórki śródbłonka, które można łatwo dosięgać bez problemów tradycyjnej chemioterapii, która działa bezpośrednio na komórki nowotworu;

c) chemiooporność: to jest chyba najważniejsza zaleta tej terapii; w istocie, ponieważ komórki śródbłonka, w odróżnieniu od komórek nowotworu, są genetycznie stabilne, zjawiska lekooporności nie powinny zachodzić;

d) rozprzestrzenianie przerzutów: blokada neonaczynienia ogranicza propagację komórek nowotworu do innych części ciała przez krew;

e) apoptoza: blokada sieci naczyniowej w nowotworze redukuje zasilanie tlenem i pokarmem komórek nowotworu; apoptoza jest korzystna w tych warunkach;

PL 209 479 B1

f) zmniejszona toksyczność układowa: efekty toksyczne, takie jak zahamowanie czynności szpiku, efekty żołądkowo-jelitowe i czasowa utrata włosów, które niemal zawsze towarzyszą tradycyjnej chemioterapii, nie występują przy przeciwangiogennej terapii.

Wiadomo, że kilka elementów cząsteczkowych jest zaangażowanych w angiogenezę nowotworu (Oncology 1997, 54, 177-84). Pro- i przeciwangiogenne endogenne czynniki są związane z biologicznym regulującym mechanizmem tworzenia nowych naczyń.

Pośród angiogennych stymulatorów powinno się wspomnieć: czynniki wzrostu fibroblastów (FGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), angiogeninę, przekształcający czynnik wzrostu α, czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α), pochodzący z płytek czynnik wzrostu komórek śródbłonka, transformujący czynnik wzrostu β, inhibitor in vitro, lecz stymulator in vivo, czynnik wzrostu łożyska, interleukina-8, czynnik wzrostu hepatocytów, pochodzący z płytek czynnik wzrostu, czynniki stymulujące kolonii granulocytów, proliferyna, prostaglandyny (PGE1, PGE2), GM1-GT1b, substancja P, bradykininy i tlenek azotu.

Przeciwnie, inhibitory angiogenezy obejmują: rozpuszczalny receptor bFGF, interferony (α, β, γ), angiostatynę, trombospondynę 1, prolaktyny (terminalny aminowy fragment 16 kDa), czynnik płytkowy 4 (PF4), inhibitory metaloproteazy tkanki (TIMP), łożyskowy pokrewny proliferynie peptyd, pochodzący od glejaka czynnik inhibicji angiogenezy, sterydy angiostatyczne, pochodzący od chrząstki inhibitor (CDI), heparynazy, interleukinę-12, inhibitor aktywatora plazminogenu, retynoidy, endostatynę, angiopoietynę-2, genisteinę, tlenek azotu i GM3.

Integryny są wielką rodziną transmembranowych białek mediujących oddziaływania komórkakomórka i komórka-matryca pozakomórkowa. Wszystkie integryny są zdolne do rozpoznawania zwykłej sekwencji peptydów Arg-Gly-Asp („uniwersalne miejsce rozpoznawania komórki), chociaż każda integryna preferencyjnie rozpoznaje różne konformacje tego tripeptydu. Inhibicja specyficznych podtypów integryn może również być bardzo interesująca z farmakologicznego punktu widzenia dla rozwoju inhibitorów angiogenezy.

Kontrolowanie białka kinazy-C (PK-C) może również pozwolić na regulację angiogenezy. Istnieją w istocie klasyczne inhibitory PK-C zdolne do zupełnego lub częściowego blokowania angiogenezy.

Pomimo ogromnych inwestycji i zaangażowania wielu instytucjonalnych i prywatnych centrów badawczych, problem raka na świecie jest wciąż daleki od ostatecznego rozwiązania. Chociaż prognozowanie dla chorych na raka polepszyło się, z przeżywalnością zwiększoną w ciągu 30 lat średnio z 30 do 50%, i genetyczne, komórkowe i biochemiczne mechanizmy zaangażowane w rozwój nowotworu są teraz dobrze znane, możliwość pokonania lub co najmniej ograniczenia tego typu patologii jest ciągle problemem i wciąż nie rozwiązano wielu aspektów, takich jak prawdopodobieństwo nawrotu, pełna remisja i przerzutowe rozpowszechnianie pierwotnego nowotworu.

Od późnych lat siedemdziesiątych, gdy obserwacje Folkmana zaczęła potwierdzać międzynarodowa społeczność naukowa, setki cząsteczek wykazujących aktywność przeciwangiogenną wydzielono z naturalnych źródeł (rośliny, grzyby, płyny biologiczne) i syntetyzowano w laboratorium.

Wiele leków jest już w fazie III, takich jak Marimastat (British Biotech.), l'AG3340 (PrinomastAgouron), i Neovastat (Aeterna), wszystkie działające głównie na poziomie płucnym (SNCL) z mechanizmem wymagającym interferencji z metaloproteazami. Również w fazie III są RhuMad VEGF (jest to przeciwciało przeciw-VEGF Genetech) i interferon α (handlowy), które są aktywne przeciwko litym nowotworom dzięki ich zakłócaniu pro-angiogennych czynników wzrostu, lub TNP-470 (TAP Pharm.) który działa bezpośrednio na komórki śródbłonka. Ostatnio, leki takie jak CAI (NCI) i IM862 (Cytran) są czynne jako środki przeciwangiogenne, lecz z nie-specyficznym i słabo znanym mechanizmem.

Te powyżej wspomniane leki mogą w ciągu kilku lat stać się częścią leczniczej broni onkologa, lecz istnieją inne cząsteczki, które ostatnio włączono w fazę I/II prób klinicznych, takie jak Combretastatin (OxiGene), metoksy-estradiol i endostatyna (EntreMed), które na podstawie przedklinicznych badań są bardzo obiecujące. Firmy takie jak Bristol Myers-Squibb (z BMS275291), Novartis (z CGS27023A) lub Parke-Davis (z Suramin) są zaangażowane w tę strategię leczniczą.

Heparyna

Heparyna jest niejednorodną mieszaniną naturalnie występujących polisacharydów różnych długości i różnych stopni siarczanowania, która wykazuje przeciwkoagulacyjną aktywność i jest wydzielana przez komórki tuczne tkanki łącznej obecne w wątrobie (z której ją po raz pierwszy wydzielono), w mięśniach, płucach, grasicy i śledzionie.

Poza regularną sekwencją zidentyfikowano w heparynie sekwencję właściwą miejscu aktywnemu aktywności antytrombinowej.

PL 209 479 B1

Przeciwnowotworowa i przeciwprzerzutowa aktywność heparyny i jej pochodnych jest związana z jej zdolnością do hamowania heparanazy, blokowania czynników wzrostu i regulacji angiogenezy.

Siarczany heparanu (HS)

Siarczany heparanu (HS) są wszechobecnymi białkowymi ligandami. Białka wiążą się z łańcuchami HS dla licznych działań, od prostego unieruchomienia lub ochrony przed proteolityczną degradacją do specyficznych modulacji biologicznych aktywności, takich jak angiogeneza.

Szkielet węglowodanowy w heparynie i siarczanach heparanu (HS) składa się naprzemiennie z D-glukozaminy (GlcN) i kwasów heksuronowych (Glc.A lub IdO.A).

W heparynie, reszty GlcN są głównie N-siarczanowane, podczas gdy w HS są N-siarczanowane i N-acetylowane, z małą ilością niepodstawionego N-.

HS jest również średnio mniej O-siarczanowany niż heparyna.

Zastosowanie heparyny w leczeniu zaburzeń angiogenezy, takich jak nowotwory, szczególnie przerzuty, jest zasadniczo ograniczone przeciwkoagulacyjną aktywnością heparyny.

Dokonywano chemicznych modyfikacji na heparynie, aby zmniejszyć jej zdolność przeciwkoagulacyjną, jednocześnie utrzymując jej właściwości przeciwnowotworowe.

Otwarcie jednostki kwasu glukuronowego w miejscu antytrombinowym zmniejsza powinowactwo heparyny do antytrombiny: w ten sposób można stosować heparyny ze zmniejszonymi efektami przeciwkoagulacyjnymi, lecz zachowujące wciąż przeciwangiogenne właściwości.

Heparanazy „Heparanazy są enzymami z rodziny endoglikozydaz, które hydrolizują wewnętrzne wiązania glikozydowe łańcuchów siarczanów heparanu (HS) i heparyny.

Te endoglikozydazy są zaangażowane w rozrost komórek nowotworu, w przerzuty i w neonaczynienie nowotworów. Sugeruje to, że mogą również być zaangażowane w angiogenezę nowotworu w wyniku uwalniania, z substancji międzykomórkowej, czynników wzrostu związanych z heparyną, takich jak aFGF (również nazywane FGF-1), bFGF (również nazywane FGF-2) i VEGF.

Te enzymy są biologicznymi celami aktywności przeciwangiogennej. W naukowej literaturze istnieje wiele badań korelacji struktura/aktywność (patrz, np., Lapierre F. i in., Glycobiology, tom 6, (3), 355-366, 1996). Chociaż wiele aspektów musi być jeszcze wyjaśnionych, opisano związane z inhibicją heparanaz przez heparynę i jej pochodne, z użyciem specyficznych testów, które doprowadziły do rozważań o strukturalnym typie, który może służyć jako wskazówka do otrzymywania nowych, bardziej selektywnych pochodnych.

W powyżej wspomnianej pracy Lapierre'a i in., opisano pochodne heparyny otrzymane przez odsiarczanowanie 2-O lub „glikolowe rozszczepienie (utlenianie nadjodanem i z kolei redukcja borowodorkiem sodu). Te pochodne, zdefiniowane w wynalazku jako „2-O-odsiarczanowana heparyna i „RO-heparyna, odpowiednio, częściowo zachowały aktywność przeciwangiogenną heparyny ocenianą w teście CAM w obecności kortykosterydów, jak podano w tablicy III (ibid. str. 360).

Heparyny i FGF

FGF regulują wiele fizjologicznych procesów, takich jak wzrost i różnicowanie komórek, lecz również funkcje związane z patologicznymi procesami, takimi jak angiogeneza nowotworu.

FGF są czynnikami wzrostu (rodziną ponad 10 polipeptydów), z których kwasowe (FGF-1) i zasadowe FGF (FGF-2) są najlepiej zbadane, i które wymagają polisacharydowego kofaktora, heparyny lub HS, dla związania z receptorem FGF (FGFR) i jego aktywowaniem.

Chociaż dokładny mechanizm aktywacji FGF przez heparynę i HS jest nieznany, wiadomo jednakże, że heparyna/FGF/FGFR tworzą „trójcząsteczkowy lub „potrójny kompleks.

Jeden z postulowanych mechanizmów jest taki, że heparyna i HS indukują tzw. sandwiczową dimeryzację FGF i ten ostatni, dimeryzowany, tworzy trwały kompleks z FGFR.

Przeciwprzerzutowa aktywność pochodnych heparyny

Zdolność pierwotnego nowotworu do generowania komórek przerzutowych jest zapewne głównym problemem napotykanym przez terapię przeciwrakową.

Pochodne heparyny z zasadniczą zdolnością do blokowania heparanazy wydają się być równie zdolne do hamowania angiogenezy w pierwotnych nowotworach i w przerzutach.

Ponadto inhibicja heparanazy osłabia zdolność migracji komórek nowotworu z pierwotnego nowotworu do innych narządów.

Następująca tablica daje przykład korelacji struktura/aktywność przeciwprzerzutowa w przypadku heparyny:

PL 209 479 B1

	% inhibicji
Heparyna	97
N-sukcynylo-heparyna	60
N-sukcynylo-RO-heparyna	58
Heparyna o niskiej MW	86
N-sukcynylo-heparyna o niskiej MW	61
Heparyna o bardzo niskiej MW	83

MW = masa cząsteczkowa

Dane w tej tablicy sugerują, że bardzo krótkie fragmenty heparyny ciągle wykazują dobrą przeciwprzerzutową aktywność, chociaż ta aktywność jest zredukowana, gdy grupa aminowa glukoz aminy jest związana z kwasem bursztynowym (sukcynylowym).

Strukturalne wymagania wobec heparynopodobnych cząsteczek, które sprzyjają działaniu hamowania angiogenezy, można zgrupować w dwie kategorie na bazie celu przewidzianego do blokowania:

a) blokada heparanazy, enzymu hydrolizującego wiązania glikozydowe siarczanów heparanu, uwalniającego czynniki wzrostu.

W tym celu heparynopodobne zwią zki korzystnie obejmują sekwencje co najmniej oś miu monosacharydowych jednostek zawierających kwas N-acetyloglukozamino-glukuronowy (lub N-siarczanowaną glukozaminę (patrz, np., D. Sandback-Pikas i in. J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) i cytowane odno ś niki).

b) blokada angiogennych czynniki wzrostu (typu fibroblastu: FGF-1 i FGF-2; typu śródbłonka naczyń: VEGF; typu przepuszczalności naczyniowej: VPF).

W tym celu heparynopodobne zwią zki korzystnie mają sekwencje co najmniej pię ciu monosacharydowych jednostek długich, zawierających 2-siarczanowany kwas iduronowy i N,6-siarczanowaną glukozaminę (patrz, np., M. Maccarana i in. J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).

W literaturze małe peptydy (5-13 aminokwasów) z aktywnością przeciwangiogenną (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5399667- z University of Washington) działają przez wiązanie z receptorem trombospondyny, lub dłuż sze peptydy (około 50 aminokwasów).

Znane są zmodyfikowane czynniki płytkowe - (europejski opis patentowy nr 0589719, Lilly), zdolne do hamowania rozrostu śródbłonka, z IC50 = 7 nM.

Oligosacharydowe fragmenty z aktywnością przeciwangiogenną zostały również w pełni opisane: stwierdzono w istocie, że zmieniając węglowodanową sekwencję można zwiększyć selektywność oddziaływania.

Ponadto, heparynę można stosować jako nośnik dla substancji, które są same przeciwangiogenne, takich jak pewne sterydy, wykorzystując powinowactwo heparyny do naczyniowych komórek śródbłonka; patrz, np., publikacja WO 93/18793 z University of Texas i Imperial Cancer Research Technology, gdzie zastrzeżono heparyny z nietrwałymi w kwasach łącznikami, takimi jak hydrazyna kwasu adypinowego, związana z kortizolem. Przeciwangiogenne działanie sprzężonych cząsteczek jest większe niż niesprzężonych cząsteczek, nawet gdy podaje się je równocześnie.

W Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96, opisano heparyny związane ze sterydami (np. kortizolem) z hydrazonową grupą w C-20, które wykazują większą aktywność przeciwangiogenną niż dwie niesprzężone cząsteczki.

Europejski opis patentowy nr 0246654 Daiichi Sc. opisuje siarczanowane polisacharydy z aktywnością przeciwangiogenną w badaniach fazy II.

Europejski opis patentowy nr 0394971 Pharmacia & Upjohn-Harvard Coll. opisuje fragment heksasacharydów-heparyny z niskim siarczanowaniem, zdolne do hamowania wzrostu komórek śródbłonka i angiogenezy stymulowanej (FGF-1).

Europejski opis patentowy nr 0618234 Alfa Wasserman opisuje sposób wytwarzania półsyntetycznych glikozaminoglikanów ze strukturą heparyny lub heparanu niosącą grupę nukleofilową.

Publikacja WO 95/05182 Glycomed opisuje różne siarczanowane oligosacharydy z przeciwkoagulacyjną, przeciwangiogenną i przeciwzapalną aktywnością.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5808021 Glycomed opisuje sposób wytwarzania zasadniczo nie-depolimeryzowanej 2-O, 3-O odsiarczanowanej heparyny z procentem odsiarczenia

PL 209 479 B1 w pozycjach 2 kwasu iduronowego (I, 2-O) i w pozycji 3 jednostki glukozaminowej (A, 3-O) w zakresie od w przybliżeniu 99 do w przybliżeniu 75% początkowego procentu. Ten sposób przewiduje odsiarczanowanie prowadzone w obecności kationu dwuwartościowego metalu, przykładowo wapnia lub miedzi, a następnie liofilizację otrzymanego produktu. Odsiarczanowane heparyny mają aktywność przeciwangiogenną.

Celem wynalazku opisanym tutaj jest znalezienie optymalnej struktury glikozaminoglikanu dla wytwarzania aktywności przeciwangiogennej w oparciu o mechanizmy inhibicji heparanazy i/lub inhibicji czynnika wzrostu FGF. Dodatkowym celem wynalazku opisanym tutaj jest wytwarzanie leku z aktywnoś cią przeciwangiogenną , która jest zasadniczo pozbawiona typowych skutków ubocznych pochodnych heparyny, takich jak, np., aktywność przeciwkoagulacyjna.

Odkryto obecnie, że przy poddaniu glikozaminoglikanu, takiego jak heparynopodobny glikozaminoglikan, heparyna lub modyfikowana heparyna, zawierającego reszty glukozaminy z różnymi stopniami N-odsiarczanowania i ewentualne dalsze całkowite lub częściowe N-acetylowanie, kontrolowanemu traktowaniu 2-O-odsiarczanującemu iduronowych jednostek do stopnia odsiarczanowania nie większego niż 60% łącznych jednostek uronowych, zachowują się właściwości wiążące angiogennego czynnika wzrostu. Niespodziewanie, heparyna 2-O-odsiarczanowana do nie więcej niż 60% łącznych uronowych jednostek jest wyraźnie przeciwangiogenną.

Odsiarczanowanie prowadzone w warunkach opisanych w niniejszym wynalazku również powoduje tworzenie jednostek iduronowych z pierścieniem oksiranowym w pozycji 2,3. Otwarcie pierścienia oksiranowego w warunkach opisanych w niniejszym wynalazku powoduje powstanie jednostek L-iduronowych lub L-galakturonowych.

Przedmiotem opisanego wynalazku jest pochodna glikozaminoglikanu, szczególnie odsiarczanowana heparyna, selektywnie częściowo odsiarczanowana ze stopniem odsiarczanowania nieprzekraczającym 60% łącznych uronowych jednostek; te luki odsiarczanujące redukują długość regularnych sekwencji tworzonych przez następstwo disacharydowych jednostek trisiarczanowych.

Wynalazek opisany tutaj odnosi się do związku o wzorze (I)

X i X', które mogą być takie same lub różne, oznaczają grupę aldehydową lub grupę -CH2-D, gdzie D oznacza hydroksyl lub aminokwas, peptyd lub resztę węglowodanu lub oligosacharydu;

R i R1, które mogą być takie same lub różne, oznaczają resztę SO3 lub acetylową;

n i m, które mogą być takie same lub róż ne, mogą się wahać od 1 do 40; suma n+m waha się od 6 do

40; stosunek m:n waha się od 10:2 do 1:1. Korzystnie, m jest większe lub równe n. Korzystnie n waha się od 40 do 60% sumy m+n. Symbol wskazuje, że jednostki oznaczone m i n są statystycznie rozłożone wzdłuż łańcucha polisacharydowego i niekoniecznie występują kolejno.

Związki będące przedmiotem opisanego wynalazku mają interesujące przeciwangiogenne właściwości, i są więc stosowane jako składniki czynne do wytwarzania leków, według wynalazku, do leczenia patologii opartych na nienormalnej angiogenezie, a szczególnie do leczenia przerzutów oraz jako składnik aktywny kompozycji farmaceutycznej według wynalazku.

PL 209 479 B1

Opisano również sposób według wynalazku otrzymywania tych O-odsiarczanowanych pochodnych Heparyny o wzorze (I).

Korzystnie, związki według wynalazku mają osłabione, a nawet nieobecne właściwości przeciwkoagulacyjne, a więc pozwalają uniknąć lub osłabić skutki uboczne typowe dla heparyn. Kolejna korzyść wynika z faktu, że związki według wynalazku można scharakteryzować metodami analizy instrumentalnej, takimi jak spektroskopia NMR, a więc pozwala to na kontrolowanie procesu, które jest bardzo pożądane z przemysłowego punktu widzenia.

Również w przypadku modyfikowanych heparyn, masa cząsteczkowa (MW) jest bardzo ważną funkcją przy wytwarzaniu inhibitorów angiogenezy. Dobrze wiadomo, w istocie, że zmniejszenie masy cząsteczkowej (MW) do wartości właściwych dla jednostek pentasacharydowych nie prowadzi do utraty aktywności przeciwangiogennej. Odwrotnie, ustalono, że poza pewną długością, łańcuchy heparyny sprzyjają raczej niż hamują dimeryzację, a więc aktywację FGF.

Tym, co się rozumie przez stopień odsiarczanowania, jest procent niesiarczanowych kwasów iduronowych względem łącznych jednostek uronowych pierwotnie obecnych w początkowej heparynie. Jednym początkowym korzystnym zakresem dla procentu odsiarczanowania jest od w przybliżeniu 40 do w przybliżeniu 60%. Przedmiotem wynalazku są związki o wzorze (I) pochodne heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowane, korzystnie z masą cząsteczkową (MW) 11200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,3, stopniem odsiarczanowania 1,99 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^- : COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi w przybliżeniu 50% (dalej również nazywana ST1514). Taki związek jest ujęty wzorem (I) gdzie, pośród innych odpowiednich definicji, m:n=1:1 i jednostki oznaczone m i n są rozłożone wzdłuż łańcucha polisacharydowego w regularny, przemienny sposób.

Związki o wzorze (I) według wynalazku opisane tutaj wytwarza się sposobem według wynalazku obejmującym:

a) traktowanie zasadowe w temperaturze w zakresie od temperatury otoczenia do 100°C, korzystnie od 50 do 70°C, i jeszcze korzystniej w temperaturze 65°C, co prowadzi do eliminacji kontrolowanego procentu grup siarczanowych w pozycji 2 kwasu iduronowego i do tworzenia grup epoksydowych; i, jeśli to pożądane

b) otwarcie pierścienia epoksydowego przy pH w przybliżeniu 7, w temperaturze w zakresie od 50°C do 100°C, korzystnie w temperaturze w przybliżeniu 70°C, z wytworzeniem reszt kwasu galakturonowego; lub, alternatywnie

c) utlenienie dioli nadjodanem sodu, ze spowodowaniem otwarcia pierścienia glikozydowego i utworzenia dwu grup aldehydowych na zmodyfikowaną resztę;

d) redukcję grup aldehydowych do pierwszorzędowego alkoholu, i ewentualnie

e) przekształcenie grupy D w grupę wybraną z grupy obejmującej hydroksyl, aminokwas, peptyd i oligosacharyd. Następnie sposób obejmuje częściową enzymatyczną hydrolizę, enzymem wybranym z grupy obejmującej liazę, heparynazę, heparytynazę, lub równoważniki produktów otrzymanych w etapie e) z wytworzeniem oligosacharydów, korzystnie tetra-lub oktasacharydów, z nieredukującą resztą terminalną złożoną z nienasyconego kwasu iduronowego, przy czym redukująca reszta składa się z N-sulfoglukozaminy i zawiera co najmniej jedną resztę otwartego kwasu iduronowego.

Według wynalazku opisanego tutaj, korzystnym związkiem jest: heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana, otrzymywana w procesach opisanych powyżej, gdzie etap a) prowadzi się przez 45 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7, i mają ca masę czą steczkową (MW) 11200, wskaźnik polidyspersji (D) 1,3, stopień odsiarczanowania 1,99 (wyrażony jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procent zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi w przybliżeniu 50% (dalej również nazywana ST1514);

Masy cząsteczkowe określa się metodą HPLC-GPC (wysokowydajna cieczowa chromatografiażelowa permeacyjna chromatografia). Stopień odsiarczanowania określa się metodą konduktometrii i procent zmodyfikowanych kwasów uronowych metodą ¹³C-NMR.

MW oznacza masę cząsteczkową i D oznacza wskaźnik polidyspersji wyrażony jako MW/Mn.

Masa cząsteczkowa (MW) dla cząsteczek o dużej masie wyrażana jest w Daltonach lub kD-kilodaltonach.

Według wynalazku opisanego tutaj, produkty początkowe są glikozaminoglikanami różnego pochodzenia, korzystnie naturalnie występującymi heparynami. Jest również możliwe zastosowanie chemicznie zmodyfikowanych heparyn z zawartością procentową N,6-disiarczanu w zakresie od 0 do 100%. Rozpoczynając od produktów z różną zawartością 6-O-siarczanowanej glukozaminy, jest możliwe modulowanie

PL 209 479 B1 długości regularnych sekwencji pomiędzy jednym otwartym kwasem iduronowym i kolejnym. Glikozaminoglikany według wynalazku stanowiące otwarcie pierścienia glikozydowego są zwyczajowo nazywane pochodnymi RO przez specjalistów, co oznacza, że pierścień glikozydowy został otwarty za pomocą działania utleniającego, a następnie redukcji (redukcja-utlenianie - RO). Takie otwarcie pierścienia glikozydowego jest również zwyczajowo nazywane „rozszczepieniem glikolowym, nazywanym ze względu na tworzenie dwu pierwszorzędowych hydroksyli obecnych w otwartym pierścieniu. Związki omówione tutaj będą również nazywane pochodnymi „RO lub „rozszczepienia glikolowego.

W kolejnej odmianie wynalazku opisanej tutaj, aldehydy i pierwszorzędowe hydroksyle pochodzące z reakcji otwarcia opisanej powyżej („rozszczepieniem glikolowym) również daje wkład do dalszej funkcjonalizacji. Tak więc związki o wzorze (I) mogą również nieść jednakowe lub różne grupy, jak zdefiniowano powyżej dla X i X', na pierwszorzędowych hydroksylach pochodzących z rozszczepienia glikolowego, np., grupy oligosacharydowe lub peptydowe, w zakresie od pojedynczego sacharydu lub aminokwasu do więcej niż jednej jednostki długości, korzystnie 2 lub 3 jednostek.

Związki o wzorze (I), gdzie X i X' oznaczają -CH2OH, można również stosować jako nośniki dla innych typów leków, za pomocą odpowiedniego wiązania z częścią heparynową, które jest zdolne do zapewnienia trwałego wiązania w normalnych warunkach wytwarzania i przechowywania skomponowanego leku, jednakże uwalnia transportowany lek w ciele, korzystnie w sąsiedztwie docelowego narządu. Przykładami leków, które można transportować, są sterydowe i niesterydowe leki przeciwzapalne, kortykosterydy, i inne leki z działaniem przeciwprzerzutowym, dzięki czemu nastąpi korzystne polepszenie działania przeciwprzerzutowego w wyniku zsumowania oddzielnych wewnętrznych aktywności związków według wynalazku i środka przeciwprzerzutowego związanego z nimi, z odpowiednimi korzyściami większej selektywności docelowej i niższej układowej toksyczności. Przykładami takich leków są inhibitory metaloproteaz. Innymi lekami, które mogą być korzystnie transportowane, są te, które działają na poziomie śródbłonka. Związki o wzorze (I), gdzie X i X' są inne niż hydroksyl lub aldehyd, można również stosować jako nośniki dla leków, i wówczas grupy X i X' będą działały jako „przerywniki pomiędzy transportowaną cząsteczką, to jest glikozaminoglikanem według niniejszego wynalazku, i cząsteczką działającą jako nośnik, gdzie to może być pożądane z powodów farmakokinetyki lub farmakodynamiki.

W przypadku związków według wynalazku pochodzących z heparyny, wytwarza się je rozpoczynając od samej heparyny za pomocą technik odsiarczanowania znanych technicznym ekspertom w dziedzinie. Np., odsiarczanowanie prowadzi się w obecności zasadowych środków, takich jak wodorotlenek sodu, w temperaturach w zakresie od temperatury otoczenia do 100°C, korzystnie od 50 do 70°C, np. w temperaturze 60°C, przez czas dostatecznie długi dla spowodowania żądanego odsiarczanowania. Odsiarczanowanie kontroluje się działając na parametry procesu, takie jak stężenia reagentów, temperatura i czasy reakcji. Jeden z korzystnych przykładów obejmuje utrzymywanie stałych stężeń substratu (glikozaminoglikanu) przy 80 mg/ml i NaOH przy 1M, stałej temperatury 60°C i kontrolowanie odsiarczanowania z czasem reakcji od 15 do 60 minut. Ekspert w dziedzinie może zmieniać warunki, np. podnosząc temperaturę reakcji i skracając czas reakcji, przy pomocy prób i błędów w praktyce eksperymentalnej i na podstawie ogólnej wiedzy o pacjencie.

Traktowanie zasadowymi środkami powoduje powstanie pośredniego produktu charakteryzującego się obecnością pierścienia epoksydowego na jednostce odsiarczanowanej. Całkowicie zaskakująco, te związki pośrednie wykazały przeciwangiogenne właściwości podobnie jak związki o wzorze (I). Tak więc kolejnym przedmiotem wynalazku opisanego tutaj jest pochodna częściowo odsiarczanowanej heparyny, a więc heparyna ze zmniejszonym ładunkiem, szczególnie heparyna nie odsiarczanowana bardziej niż o 60%, charakteryzująca się pierścieniem epoksydowym w miejscu odsiarczanowania. Takie związki charakteryzują się pierścieniem epoksydowym również należą do zakresu niniejszego wynalazku, to znaczy kompozycje farmaceutyczne zawierające je i ich zastosowanie do wytwarzania leków z aktywnością przeciwangiogenną.

Poniższe związki są korzystne: heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana z masą cząsteczkową (MW) 12900, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 2,05 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych (dalej również nazywana ST1513);

heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana z masą cząsteczkową (MW) 11000, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 2,05, (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% reszt uronowych utlenionych i reszt uronowych zredukowanych;

PL 209 479 B1 heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana z masą cząsteczkową (MW) 9200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 11% grup epoksydowych, 27,5% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

W jednej z możliwych odmian wynalazku opisanego tutaj, następujące związki są korzystne: heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana, otrzymywana w procesie opisanym poniżej, gdzie etap a) prowadzi się przez 15 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7, i z masą cząsteczkową (MW) 12900, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 2,05 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentu zmodyfikowanych kwasami uronowymi w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych (dalej nazywane ST1513);

heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana, otrzymywana w procesie opisanym poniżej, gdzie etap a) prowadzi się przez 30 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7 (dalej nazywana ST1516), i z masą cząsteczkową (MW) 11000, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 1,8 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych;

heparyna częściowo 2-O-odsiarczanowana, otrzymywana w procesie opisanym poniżej, gdzie etap a) prowadzi się przez 60 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7, i z masą cząsteczkową (MW) 9200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 11% grup epoksydowych, 27,5% utlenionych i zredukowanych (rozszczepienie) reszt uronowych (dalej nazywana ST1515).

Po utworzeniu pierścienia epoksydowego otwiera się go, ponownie zgodnie ze znanymi technikami. Procent epoksydu utworzonego oblicza się ze stosunku pomiędzy polami sygnałów ¹³C-NMR w przybliżeniu 55 ppm, charakterystycznych dla węgli 2 i 3 pierścienia kwasu uronowego zawierających epoksyd i łącznej liczby anomerycznych sygnałów (C1 glukozaminy i reszt kwasu uronowego). Jeśli otwieranie prowadzi się na gorąco, otrzymuje się resztę kwasu galakturonowego, podczas gdy, jeśli otwieranie pierścienia epoksydowego prowadzi się na zimno, otrzymuje się resztę kwasu iduronowego. Korzystnymi przykładami związków zawierających pierścień epoksydowy są otrzymywane w procesie opisanym poniżej i mające zawartość epoksydowanego kwasu uronowego odpowiednio 14% (dalej ST1509), 24% (dalej ST1525) i 30% (dalej ST1526).

Częściowo odsiarczanowaną heparynę poddaje się następnie „rozszczepieniu glikolowemu (krótko RO), zgodnie z procesem zdefiniowanym powyżej i degradacji Smitha (krótko SD).

Alternatywnie, związki o wzorze (I) można również otrzymywać bez przechodzenia przez pośredni epoksyd, to jest przez bezpośrednie rozszczepienie glikolowe i dalszą degradację Smitha.

Proces opisany dotychczas prowadzi do związków o wzorze (I), w którym grupy X i X' oznaczają -CH2OH.

Dla X i X' innych niż -CH2OH, dostępne są dla eksperta w dziedzinie sposoby przekształcania grupy hydroksylowej w inne grupy przewidziane w definicjach podanych powyżej. Np., sprzężenia z aminokwasami lub peptydami moż na dokonywać traktując pośredni aldehyd pochodzący z reakcji rozszczepienia glikolowego reakcji redukującego aminowania (Hoffmann J. i in. Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)), którą można prowadzić w wodnym rozpuszczalniku i jest ona zgodna z utrzymaniem struktury heparyny.

Jeśli to pożądane, i jest to kolejnym przedmiotem wynalazku opisanego tutaj, związki o wzorze (I) można następnie degradować środkami kwasowymi w odpowiednich warunkach pH, np. przy pH 4, z wytworzeniem mieszaniny oligosacharydów utrzymujących przeciwangiogenne właś ciwości.

Przedmiotem wynalazku opisanego tutaj są kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik czynny związek o wzorze (I), odsiarczanowane heparyny opisane powyżej, lub z np. epoksydowanymi związkami pośrednimi; te ostatnie można również stosować same jako składniki czynne w kompozycjach farmaceutycznych. Składnik czynny według niniejszego wynalazku będzie znajdował się w mieszaninie z odpowiednimi nośnikami i/lub zaróbkami zwykle stosowanymi w technologii farmaceutycznej, takimi jak, na przykład, te opisane w „Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, ostatnie wydanie. Kompozycje według niniejszego wynalazku będą zawierały terapeutycznie skuteczną ilość składnika czynnego. Dawki będzie określał specjalista w dziedzinie, np. klinicysta lub lekarz pierwszego kontaktu zgodnie z typem choroby leczonej i stanem pacjenta, lub jednocześnie z podawaniem innych składników czynnych. Przykładowo można wymienić dawki w zakresie od 0,1 do 100 mg/kg.

PL 209 479 B1

Przykładami kompozycji farmaceutycznych są te, które można podawać doustnie lub pozajelitowo, dożylnie, śródmięśniowo, podskórnie, przezskórnie lub w postaci rozpylanej do nosa lub ust. Kompozycjami farmaceutycznymi odpowiednimi dla tego celu są tabletki, twarde lub miękkie kapsułki, proszki, roztwory, zawiesiny, syropy oraz postaci stałe do późniejszego wytwarzania ciekłych preparatów. Kompozycje do pozajelitowego podawania są, np., wszystkimi domięśniowymi, dożylnymi i podskórnymi postaciami do wstrzykiwania, jak też roztworami, zawiesinami i emulsjami. Można wspomnieć preparaty liposomowe. Tabletki obejmują również postaci do kontrolowanego uwalniania składnika czynnego jako doustne postaci podawane, tabletki powlekane odpowiednimi warstwami, mikrokapsułkowane proszki, kompleksy z cyklodekstrynami, depoty, np., postaci podskórne, takie jak zastrzyki lub implanty.

Związki według wynalazku opisane tutaj wykazują aktywność przeciwangiogenną, są zasadniczo pozbawione aktywności przeciwkoagulacyjnej i są zasadniczo pozbawione skutków ubocznych typowych dla heparyny, są więc odpowiednie do stosowania do wytwarzania leków do leczenia pacjentów, ogólnie ssaków, a szczególnie ludzi, cierpiących na zmiany angiogenezy. Przykłady chorób, w których stosuje się lekiem, zawierający związki o wzorze (I) według niniejszego wynalazku, oznaczają pierwotne nowotwory, przerzuty, diabetyczne retynopatie, łuszczyca, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, nawrót zwężenia po angioplastyce i wieńcowy przepływ omijający.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związków według niniejszego wynalazku do wytwarzania leków do leczenia powyższych chorób. Przez zasadnicze pozbawienie takiej aktywności specjalista w dziedzinie rozumie brak lub tylko pomijalną aktywność z punktu widzenia zastosowania klinicznego.

Jednym z pierwszych znalezionych czynników wzrostu mającym angiogenną rolę był bFGF (lub FGF-2), po czym niedługo później aFGF (lub FGF-1) (przegląd podaje Christofori, Oxford University, 1996). Oba białka są członkami klasy czynników wzrostu cechujących się wysokim stopniem powinowactwa do heparyny. Innymi silnymi angiogennymi induktorami są VEGF, VEGF-B i VEGF-C. Wszystkie trzy czynniki VEGF, jak FGF, są obficie wydzielane w ciele. Oba te typy czynników, a/bFGF (FGF-1 i FGF-2) i VEGF, wiążą się ze specyficznymi receptorami o wysokim powinowactwie z transmembranową domeną wykazującą aktywność kinazy tyrozyny. Trzy receptory VEGF - VEGF-1 (flt-1), VEGF-2 (kdr/flk-1) i VEGF-3 (flt-4) - ulegają ekspresji specyficznie na komórkach śródbłonka, podczas gdy cztery receptory FGF ulegają ekspresji w licznych narządach i tkankach (przegląd przedmiotu patrz Risau i Flame 1995 Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 73-91). Wiązanie bFGF do heparyny lub do fragmentów siarczanu heparanu powoduje ich dimeryzację i możliwość wiązania z ich własnym receptorem przez aktywowanie szlaku przewodzenia sygnału aktywującego komórki śródbłonka w mitogenezie i różnicowaniu.

Inhibicja wiązania FGF do heparyny lub do fragmentów siarczanu heparanu oznacza więc ważny leczniczy cel w zwalczaniu patologicznej neoangiogenezy indukowanej przez zwiększony poziom lokalny lub układowy czynników wzrostu.

W tym celu zaprojektowano model in vitro nadający się do oceny interferencji różnych pochodnych heparyny z wiązaniem bFGF do jego własnego receptora.

W szczególności, zastosowano komórki jaj chińskich chomików (CHO-K1) mające siarczany heparanu na swojej powierzchni, lecz pozbawione receptora FGF 1. Zastosowano również komórki CHO nazywane CHO-745flg, które dają ekspresję receptora FGF 1, lecz które, inaczej niż poprzednia grupa, nie mają siarczanów heparanu w błonie. Te ostatnie komórki trwale transfekowano cDNA dla zielonego fluorescencyjnego białka i nadającego się do obserwacji pod fluorescencyjnym mikroskopem z kombinacją filtrów do detekcji emisji w zieleni. W skrócie, technika jest oparta na możliwości, że oba typy komórek mogą oddziaływać (tworzyć trwałe wiązania) tylko jeśli FGF dodaje się do obu typów komórek. Istotnie, w tym przypadku, siarczany heparanu komórek CHO-745flg zwiążą się z FGF, który z kolei zwiąże się z komórkami CHO-K1, tworząc mostek. Zachodzące wiązanie wykrywa się dzięki zielonej fluorescencji emitowanej przez komórki CHO-745flg.

Ponadto, związki testowano na ich aktywność hamowania rozrostu komórek. Istotnie, jednym z głównych efektów FGF jest stymulacja wzrostu komórek w nieobecności surowicy w komórkach z ekspresją receptora FGF 1 (FGFR-1).

W tym celu zastosowano dwie linie komórkowe, obie z ekspresją FGFR-1 (L6WT1 i komórki aorty wołowej), których wzrost oceniono w obecności FGF z dodatkiem lub bez dodatku pochodnych heparyny, dla których spodziewano się aktywności hamującej.

Inhibicja mediowanej FGF2 międzykomórkowej adhezji

Komórki CHO-K1 zaszczepiono przy gęstości 90000 komórek/cm² w 24-dołkowych płytkach. Po 24 godzinach komórki utrwalono w 3% aldehydzie glutarowym w PBS przez 2 godziny w temperaturze

PL 209 479 B1

4°C i przemyto 0,1 M glicyną/PBS. Na utrwalonych monowarstwach komórek CHO 745/flg, transfekowanych FGFR-1, przy gęstości 50000 komórek/cm² w DMEM zawierającym 10 mM EDTA, 30 ng/ml FGF-2 i rosnące dawki testowanych związków. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, przywierające komórki zliczono pod odwracającym mikroskopem. Wyniki wyrażono jako procent liczby komórek przywierających w porównaniu co tymi zmierzonymi w nieobecności testowanych związków.

Związki badano potrójnie w 6 stężeniach w zakresie od 1 ng/ml do 100 μg/ml i ID₅₀ obliczono dla każdego związku (tablica 1).

T a b l i c a 1

Inhibicja międzykomórkowej adhezji (ID50) komórek CHO-K1 i CHO-745flg

Produkt	Inhibicja (ID50)
Heparyna	100
RO heparyna	8
ST1513	80
ST1516	110
ST1514	105
ST1515	120
ST1525	50
ST1528	75
ST1507	125

Inhibicja syntezy DNA w komórkach L6 transfekowanych FGFR-1

Komórki L6-WT1 (mioblasty szczura transfekowane FGFR-1) zaszczepiono przy gęstości 25000 komórek/cm² w 48-dołkowych płytkach w DMEM + 10% FCS. Po 24 godzinach komórki przemyto wolną od surowicy pożywką i inkubowano przez 48 godzin z DMEM + 0,5% FCS. Komórki inkubowano następnie przez 16 godzin z FGF-2 przy stężeniach 15 i 30 ng/ml w obecności lub nieobecności testowanych związków (wszystkie przy 100 μg/ml). Na koniec inkubacji dodano 3H-tymidynę (0,25 μCi/dołek) bez zmieniania pożywki. Po 6 godzinach zmierzono ilość strącanego TCA. Każdy punkt pomiarowy jest średnią 3 określeń. Wyniki podano w tablicy 2.

T a b l i c a 2

Inhibicja syntezy DNA w komórkach L6 transfekowanych FGFR-1.

Produkt	Włączenie 3H-tymidyny (% względem kontrolnej)
Heparyna (FGF-2 15 ng/ml)	50
Heparyna (FGF-2 30 ng/ml)	74
Heparyna RO (FGF-2 15 ng/ml)	41
Heparyna RO (FGF-2 30 ng/ml)	80
ST1513 (FGF-2 15 ng/ml)	93
ST1513 (FGF-2 30 ng/ml)	102
G3025B (FGF-2 15 ng/ml)	68
G3025B (FGF-2 30 ng/ml)	71
ST1514 (FGF-2 15 ng/ml)	58
ST1514 (FGF-2 30 ng/ml)	99
ST1515 (FGF-2 15 ng/ml)	79
ST1515 (FGF-2 30 ng/ml)	100

PL 209 479 B1

Wpływ na syntezę DNA w komórkach śródbłonka aorty wołowej (BAEC)

Komórki BAEC zaszczepiono z gęstością 2500 komórek/cm² w 48-dołkowych płytkach w pełnej pożywce EGM Bullet Kit. Po 24 godzinach komórki hodowano w nieobecności surowicy w pożywce EGM bez ekstraktu mózgu wołowego i hEGF. Po dalszych 24 godzinach komórki potraktowano 30 ng/ml bFGF w obecności rosnących stężeń testowanego związku. Po 16 godzinach 1 μ^ΛτΗ 3H-tymidyny dodano do pożywki. Po 6 godzinach zmierzono aktywność strącanego TCA. Każdy punkt doświadczalny jest średnią 8 oznaczeń. Wyniki podano w tablicach 3-6.

Zastosowane oznaczenia: PBS - oznacza buforowaną fosforanem solankę; FCS - oznacza pożywkę, cielęcą płodową surowicę krwi; TCA - oznacza kwas trichlorooctowy

T a b l i c a 3

Wpływ na syntezę DNA w komórkach śródbłonka aorty wołowej (BAEC)-ST1514

Stężenie ng/ml	Włączenie 3H-tymidyny (% względem kontrolnej)
1	80
10	78
100	42
1000	33
10000	22
100000	5

T a b l i c a 4

Wpływ na syntezę DNA w komórkach śródbłonka aorty wołowej (BAEC)-ST1528

Stężenie ng/ml	Włączenie 3H-tymidyny (% względem kontrolnej)
1	85
10	73
100	85
1000	32
10000	28
100000	5

T a b l i c a 5

Wpływ na syntezę DNA w komórkach śródbłonka aorty wołowej (BAEC)-ST1525

Stężenie ng/ml	Włączenie 3H-tymidyny (% względem kontrolnej)
1	75
10	67
100	26
1000	21
10000	7
100000	2

PL 209 479 B1

T a b l i c a 6

Wpływ na syntezę DNA w komórkach śródbłonka aorty wołowej (BAEC) - ST1507

Stężenie ng/ml	Włączenie 3H-tymidyny (% względem kontrolnej)
1	92
10	92
100	45
1000	40
10000	18
10000C	12

Test rozrostu komórek w BAEC ₂

Komórki BAEC w 7 pasażu zaszczepiono przy gęstości 2500 komórek/cm² w 96-dołkowych płytkach w pożywce EBM bez ekstraktu mózgu wołowego i hEGF. Do tej pożywki dodano 30 ng/ml

FGF-2 i każdy z testowanych związków w 5 stężeniach w zakresie od 10 ng/ml do 100 μg/ml. Po dniach komórki utrwalono i zabarwiono fioletem krystalicznym i optyczną gęstość określono przy pomocy czytnika mikropłytek ELISA. Każdy eksperymentalny punkt wytworzono poczwórnie i obliczono ID50. Wyniki podano w tablicy 7. Pożywka EBM oznacza śródbłonkową podstawową pożywkę.

T a b l i c a 7

Test rozrostu komórek w BAEC

Produkt	Inhibicja (ID50) μg/ml
Heparyna	100
ST1509	0,02
ST1525	10
ST1526	0,02
ST1527	100
ST1528	0,1

Test rozrostu komórek w płodowym BAEC GM 7373

Komórki GM7373 zaszczepiono przy gęstości 70000 komórek/cm² w 96-dołkowych płytkach w pożywce MEM+10% FCS. Po 24 godzinach komórki przemyto wolną od surowicy pożywką i potraktowano 10 ng/ml FGF-2 w pożywce zawierającej 0,4% FCS. Po 8 godzinach testowane związki dodano do pożywki w 5 stężeniach w zakresie od 10 ng/ml do 100 μg/ml. Po dalszych 16 godzinach komórki trypsynizowano i zliczono w komorze Burkera. ID50 obliczono dla każdego związku i wyniki są średnimi 2 eksperymentów potrójnie. Wyniki podano w tablicy 8.

T a b l i c a 8

Test rozrostu komórek w płodowym BAEC GM 7373

Produkt	Inhibicja (ID50) μg/ml
Heparyna	2
ST1509	0,3
ST1525	2
ST1526	1
ST1527	20
ST1528	0,2
ST1514	0,1

PL 209 479 B1

Inhibicja angiogenezy

Dla badań angiogenezy modelem użytym był model błony kosmówkowo-omoczniowej embrionu kurczęcia (CAM) (Ribatti i in. Int. J. Dev. Biol., 40, 1189 (1996)).

300 jaj kurzych z embrionami inkubowano w temperaturze 37°C w warunkach stałej wilgotności. 3 dnia inkubacji, po odessaniu 2-3 ml białka z ostrego końca jaja, aby odłączyć CAM od skorupy, wycięto nożycami okno w skorupie. Odsłonięto w ten sposób naczynia pod CAM. Okno zamknięto przezroczystą szklaną szybką i jaja zawrócono do inkubatora.

dnia inkubacji w sterylnych warunkach, CAM potraktowano zgodnie z protokołem opisanym poniżej z użyciem techniki opracowanej ostatnio (Ribatti i in. J. Vasc. Res. 34, 455 (1997)), która obejmuje stosowanie tamponów ze sterylnej żelatyny o rozmiarach 1 mm². Każdą cząsteczkę zawieszono w 3 μl PBS w stężeniu 50 lub 100 μg/embrion. Jako pozytywną kontrolę użyto FGF-2 (1 μg//tampon), dla której silną angiogenną aktywność wobec CAM wykazano (Ribatti i in., Dev. Biol. 170, 39, (1995)). Tampony najpierw spoczywały na powierzchni CAM, i następnie 3 μl roztworu testowanej substancji pipetowano na powierzchni tamponu. CAM badano raz dziennie stosując stereomikroskop Zeiss SR wyposażony w urządzenie fotograficzne. Eksperymenty przerwano 12 dnia inkubacji, gdy przeprowadzono łączną ocenę angiogennej aktywności cząsteczek, wyrażoną jako procent inhibicji względem liczby eksperymentów rozpoczętych i zakończonych (tablica 9). Ponadto, dla związku ST1514, testowanego w stężeniu 100 μg/embrion, prowadzono również makroskopową ilościową ocenę angiostatycznej aktywności zgodnie z techniką proponowaną przez Brooksa i in. (Science, 264, 569, (1994)), zliczając liczbę naczyń otaczających tampon. Liczbę naczyń porównano z kontrolnymi tamponami potraktowanymi PBS (nośnik testowanego związku) i FGF-2 (pozytywna kontrola). Wyniki podano w tablicy 10.

T a b l i c a 9

Angiostatyczna aktywność na modelu CAM

Związek	Stężenie ^g/embrion)	Liczba eksperymentów	Inhibicja (%)
N-acetylowana heparyna	50	10	0
Heparyna RO (utleniona-zredukowana 19,6%)	50	10	20
ST1514 (RO 56%)	50	10	50
ST1514 (RO 56%)	100	10	80

Należy zauważyć, że naturalnie występująca heparyna nie wykazuje aktywności.

T a b l i c a 10

Aktywność angiostatyczna: makroskopowa ilościowa ocena (Brooks)

Związek	Liczba embrionów	Liczba naczyń na połączeniu tampon/CAM
ST 1514 (100 μg/embrion)	10	2 + 1
PBS (3 μ!)	5	7 + 2
FGF-2 (1 μg/embrion)	5	50 + 4

Należy zauważyć, że naturalnie występująca heparyna nie wykazuje aktywności.

Ocena toksyczności heparyny u myszy Balb/c.

6-tygodniowych samic myszy Balb/c ważących 20 g (Harlan), podzielone na grupy w sposób stochastyczny, potraktowano heparyną sodową, jako odnośnikiem, i związkiem według niniejszego wynalazku o nazwie ST1514. Reżim terapii był typu q2dx5, to jest 5 łącznych podawań w odstępach 2 dni, podawanie 200 μl/mysz 50 mg/kg/10 ml i 25 mg/kg/10 ml roztworów podskórnie.

Substancje solubilizowano jak następuje:

Heparyna sodowa: roztwór wytwarza się solubilizując 160 mg proszku w 4 ml wolnego od Ca⁺⁺ i Mg++ PBS 1x pH 7,4; dzieli się go na porcje 243 μl i przechowuje w temperaturze -20°C. Na czas terapii roztwór rozcieńcza się w wolnym od Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺ PBS (Dulbecco, skład zmodyfikowany) 1x, pH 7,4 dla uzyskania substancji w końcowych stężeniach 50 mg/kg/10 ml i 25 mg/kg/10 ml.

ST 1514: roztwór wytwarza się solubilizując 160 mg proszku w 4 ml wolnego od Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺ PBS 1x, pH 7,4; dzieli się go na porcje 243 μl i przechowuje w temperaturze -20°C. Na czas terapii

PL 209 479 B1 roztwór rozcieńcza się w wolnym od Ca++ i Mg++ PBS (Dulbecco, skład zmodyfikowany) 1x, pH 7,4 dla uzyskania substancji w końcowych stężeniach 50 mg/kg/10 ml i 25 mg/kg/10 ml.

godzin po ostatnim podawaniu testowanych substancji pobiera się próbkę krwi na pełne zliczenie krwinek i analizę hematologiczną.

Pobieranie krwi: myszy umieszcza się w hermetycznie zamkniętym pudle, do którego wdmuchuje się CO2 w ilości dostatecznej do ogłuszenia zwierząt. Następnie pobiera się krew z tylnego oczodołowego węzła każdego zwierzęcia (w przybliżeniu 1 ml krwi/mysz) rozprowadzaną w ilości 0,4 ml krwi/mysz w probówkach Eppendorfa zawierających 20 μΐ heparyny Vister (5000 U/ml) dla przeprowadzenia pełnego zliczenia krwinek i analizy hematologicznej; i tę samą ilość krwi rozprowadza się w innych probówkach Eppendorfa zawierających 50 μΐ 3,8% cytrynianu sodu w celu wykonania oznaczeń czasu protrombiny. Po pobraniu próbki krwi, każde zwierzę zabija się przez przemieszczenie kręgu.

Liczba próbek: pobiera się 2 próbki krwi/mysz, z których prowadzi się dwa pełne zliczenia krwinek i wytwarza dwa preparaty oraz próbkę osocza do przechowywania w temperaturze -20°C.

Pełne zliczenie krwinek: Stosuje się urządzenie (Cell Analyzer 580 A, DELCON) zgodnie ze standardową procedurą opisaną w podręczniku. Próbki krwi (25 μΐ) pobiera się do rozcieńczalnika i rozcieńcza do objętości 10 ml (rozcieńczenie 1:400) roztworem izotonicznym (solanka PLTA, DELCON). Z tego roztworu (nazwanego roztworem A), rozcieńczalnik automatycznie pobiera próbkę 100 μl i rozcieńcza do objętości 10 ml (rozcieńczenie 1:100), otrzymując roztwór B. Do roztworu A dodaje się 3 krople Emosolu (DELCON) dla lizy czerwonych krwinek. Ten roztwór stosuje się do odczytów WBC. Roztwór B, z drugiej strony, stosuje się do odczytów RBC i płytek (PLT). Każdą próbkę odczytuje się podwójnie.

Zastosowany Emosol jest środkiem lizującym stosowanym w takich badaniach jako odczynnik wytwarzany przez firmę DELCON do stosowania w urządzeniu - analizatorze do zliczania komórek firmy DELCON.

Otrzymane dane zanalizuje się stosując analizę wariancji.

Grupy zwierząt potraktowane heparyną sodową w dawkach 50 mg/kg/10 ml i 25 mg/kg/10 ml mają wyraźny krwiak w miejscu szczepienia; to zjawisko nie zachodzi w grupach poddanych terapii ST1514.

Autopsje prowadzone na badanych zwierzętach pokazują, że grupy poddane terapii heparyną sodową w dawkach 50 mg/kg/10 ml i 25 mg/kg/10 ml mają wątroby z nienormalną charakterystyką, podczas gdy nie zauważono takiego zjawiska w grupach potraktowanych ST1514.

Dane odnoszące się do analizy hematologicznej pokazują redukcję ilości czerwonych krwinek w obu grupach potraktowanych heparyną sodu przy dawkach 50 mg/kg i 25 mg/kg w porównaniu z grupami kontrolnymi, podczas gdy nie zauważono takiej różnicy w grupach potraktowanych ST1514.

Grupa potraktowana heparyną sodu przy dawce 25 mg/kg wykazuje znaczący deficyt płytek w porównaniu z grupą kontrolną.

Żadne z badanych grup terapii nie wykazała znaczących problemów z liczbą białych krwinek w porównaniu z grupą kontrolną.

Poniższe przykłady ilustrują dalej wynalazek.

P r z y k ł a d 1 g heparyny rozpuszcza się w 12,5 ml 1N NaOH. Roztwór ogrzewa się i miesza w temperaturze 60°C przez 45 minut. Reakcję zatrzymuje się przez szybkie chłodzenie i zobojętnienie. Roztwór ogrzewa się następnie w temperaturze 70°C przy pH 7, aż pierścień epoksydowy jest zupełnie otwarty (kierunek reakcji kontrolowany przez NMR). Odsiarczanowaną próbkę (tutaj nazwaną G2999H) rozpuszcza się w 20 ml wody i ochładza do 4°C. Po dodaniu 20 ml 0,2M roztworu NaIO4, roztwór pozostawia się z mieszaniem w ciemności przez 20 godzin i reakcję zatrzymuje dodając glikol etylenowy, a sole usuwa się przez styczną ultrafiltrację. 400 mg NaBH4, podzielone na kilka porcji, dodaje się do odsolonego roztworu (30-40 ml). Roztwór pozostawia się z mieszaniem przez 3 godziny w temperaturze otoczenia, następnie zobojętnia rozcieńczonym HCl i odsala przez styczną ultrafiltrację. Otrzymuje się 710 mg produktu, tutaj nazwanego ST1514.

Masa cząsteczkowa (MW): 11200, wskaźnik polidyspersji (D) 1,3, stopień odsiarczanowania 1,9 (wyrażony jako stosunek molowy SO3^-:COO-); procent zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi wynosi w przybliżeniu 50%. Związek zbadano metodą spektroskopii NMR (fig. 1).

PL 209 479 B1

P r z y k ł a d y 2-4

Przyjmując taką samą procedurę jak w przykładzie 1, za wyjątkiem tego, że podstawowy roztwór ogrzewano odpowiednio przez 15, 30 i 60 minut, otrzymano związki z następującymi charakterystykami:

- ST1513: masa czą steczkowa (MW) 12900, wskaź nik polidyspersji (D) 1,5, stopień odsiarczanowania 2,05 (wyrażony jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procent zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych (rozszczepionych) reszt uronowych;

- ST1516: masa czą steczkowa (MW) 12900, wskaź nik polidyspersji (D) 1,5, stopień odsiarczanowania 1,8 (wyrażony jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procent zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych (rozszczepionych) reszt uronowych;

- ST1515: masa cząsteczkowa (MW) 9200, wskaźnik polidyspersji (D) 1,5, procent zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 11% grup epoksydowych, 27,5% utlenionych i zredukowanych (rozszczepionych) reszt uronowych.

Claims (13)

1. 2-O-odsiarczanowane pochodne heparyny, ze stopniem 2-O-odsiarczanowania nie większym niż 60% łącznych jednostek uronowych, o wzorze (I):

gdzie pierścień U ma następujące znaczenie:

X i X', które mogą być takie same lub różne, oznaczają grupę aldehydową lub grupę -CH2-D, gdzie D jest wybrany z grupy obejmującej hydroksyl, aminokwas, peptyd i oligosacharyd;

R i R1, które mogą być takie same lub różne, oznaczają resztę SO3 lub acetylową; n i m, które mog ą być takie same lub róż ne, mogą się wahać od 1 do 40; suma n+m jest w granicach od 6 do 40;

stosunek m:n jest w granicach od 10:2 do 1:1, i symbol wskazuje, że jednostki oznaczone m i n są statystycznie rozłożone wzdłuż łańcucha polisacharydowego.

2. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparyną z masą cząsteczkową (MW) 11200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,3, stopniem odsiarczanowania 1,99 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi 50%.

PL 209 479 B1

3. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparyną z masą cząsteczkową (MW) 12900, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 2,05 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

4. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparyną z masą cząsteczkową (MW) 11000, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 1,93 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

5. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparyną z masą cząsteczkową (MW) 9200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 11% grup epoksydowych, 27,5% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

6. Sposób wytwarzania pochodnych 2-O-odsiarczanowanej heparyny, ze stopniem 2-O-odsiarczanowania nie większym niż 60% łącznych jednostek uronowych, o wzorze (I):

gdzie pierścień U ma następujące znaczenie:

X i X', które mogą być takie same lub różne, oznaczają grupę aldehydową lub grupę -CH2-D, gdzie D jest wybrany z grupy obejmującej hydroksyl, aminokwas, peptyd i oligosacharyd;

R i R1, które mogą być takie same lub różne, oznaczają resztę SO3 lub acetylową; n i m, które mogą być takie same lub różne, mogą się wahać od 1 do 40; suma n+m jest w granicach od 6 do 40;

stosunek m:n jest w granicach od 10:2 do 1:1, i symbol wskazuje, że jednostki oznaczone m i n są statystycznie rozłożone wzdłuż łańcucha polisacharydowego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) traktowania zasadowego glikozaminoglikanów, korzystnie heparyn występujących naturalnie, w temperaturze w zakresie od temperatury otoczenia do 100°C, korzystnie od 50 do 70°C, korzystniej 65°C, do eliminacji kontrolowanego procentu grup siarczanowych w pozycji 2 kwasu iduronowego i do utworzenia grup epoksydowych;

(b) otwiera się pierścień epoksydowy przy pH 7, w temperaturze w zakresie od 50°C do 100°C, korzystnie 70°C, z wytworzeniem reszt kwasu galakturonowego;

(c) utlenia się diole nadjodanem sodu, z wytworzeniem otwartego pierścienia glikozydowego i utworzeniem dwu grup aldehydowych na zmodyfikowaną resztę;

(d) redukuje się grupy aldehydowe do pierwszorzędowego alkoholu; i, ewentualnie

PL 209 479 B1 (e) przekształca się grupę D w grupę wybraną z grupy obejmującej hydroksyl, aminokwas, peptyd i oligosacharyd.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje następnie częściową enzymatyczną hydrolizę enzymem wybranym z grupy obejmującej liazę, heparynazę, heparytynazę, lub równoważniki produktów otrzymanych w etapie e) z wytworzeniem oligosacharydów, korzystnie tetra- lub oktasacharydów, z nieredukującą resztą terminalną złożoną z nienasyconego kwasu iduronowego, przy czym redukująca reszta składa się z N-sulfoglukozaminy i zawiera co najmniej jedną resztę otwartego kwasu iduronowego.

8. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są wytworzone sposobem według zastrz. 6, w którym etap a) prowadzi się przez 45 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7 i otrzymuje się częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparynę z masą cząsteczkową (MW) 11200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,3, stopniem odsiarczanowania 1,99 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi w przybliżeniu 50%.

9. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są wytwarzone sposobem według zastrz. 6, w którym etap a) prowadzi się przez 15 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7 i otrzymuje się częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparynę z masą cząsteczkową (MW) 12900, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 2,05 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

10. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są wytwarzone sposobem według zastrz. 6, w którym etap a) prowadzi się przez 30 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7 i otrzymuje się częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparynę z masą cząsteczkową (MW) 11000, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, stopniem odsiarczanowania 1,93 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3^-:COO^-), procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 5% grup epoksydowych, 29% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

11. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są wytworzone sposobem według zastrz. 6, w którym etap a) prowadzi się przez 60 minut w temperaturze 60°C i etap b) w temperaturze 70°C przy pH 7 i otrzymuje się częściowo 2-O-odsiarczanowaną heparynę z masą cząsteczkową (MW) 9200, wskaźnikiem polidyspersji (D) 1,5, procentem zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z łącznymi kwasami uronowymi: 11% grup epoksydowych, 27,5% utlenionych i zredukowanych reszt uronowych.

12. Kompozycje farmaceutyczne, znamienne tym, że jako składnik czynny zawierają pochodną 2-O-odsiarczanowanej heparyny, ze stopniem 2-O-odsiarczanowania nie większym niż 60% łącznych kwasów uronowych, o wzorze (I), zdefiniowanym w zastrz. 1, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami i zaróbkami.

13. Zastosowanie pochodnej 2-O-odsiarczanowanej heparyny, ze stopniem 2-O-odsiarczanowania nie większym niż 60% łącznych kwasów uronowych, o wzorze (I), zdefiniowanym w zastrz. 1 do wytwarzania leków do leczenia chorób spowodowanych nienormalną angiogenezą, wybranych z grupy obejmującej leczenie nowotworów, przerzutów nowotworów, leczenie retynopatii cukrzycowej, leczenie pozasoczewkowego rozrostu włóknistego, leczenie łuszczycy.