PT1268558E - Derivados de glicosaminoglicanos parcialmente dessulfatados dotados com actividade angiogénica e isentos de efeito anticoagulante - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"DERIVADOS DE GLICOSAMINOGLICANOS PARCIALMENTE DESSULFATADOS DOTADOS COM ACTIVIDADE ANGIOGÉNICA E ISENTOS DE EFEITO ANTICOAGULANTE" A invenção aqui descrita refere-se a derivados de glicosaminoglicano parcialmente dessulfatados, particularmente heparinas, a processos para a sua preparação, à sua utilização como ingredientes activos para a preparação de medicamentos com uma actividade antiangiogénica, particularmente para o tratamento de tumores, tais como, por exemplo, as formas metastáticas e a composições farmacêuticas que os contêm.

Estado da técnica A primeira molécula possuidora de actividade antiangiogénica foi descoberta em cartilagem por Henry Brem e Judah Folkman, em 1975. Desde esse ano, foram descobertas mais de 300 novas moléculas capazes de inibir a angiogénese.

No principio da década de oitenta, com a descoberta do interferão (α/β) como um inibidor da angiogénese tumoral, foi iniciada experimentação clinica com base nesta abordagem terapêutica. A comunicação social provocou uma grande agitação quando, a 3 de Março de 1998, o New York Times publicou a noticia de que 1 duas moléculas, a angiostatina e a endostatina, descobertas nos laboratórios de J. Folkman na Harvard Medicai School e no Children's Hospital em Boston, estavam a produzir resultados muito encora j adores na luta contra o cancro. 0 elevado grau de eficácia destas duas moléculas na inibição da angiogénese deu um incremento substancial à pesquisa de novos compostos. Presentemente, existem cerca de trinta moléculas dotadas de actividade anticancerigena que actuam via um mecanismo antiangiogénico, as quais entraram na fase de ensaios clinicos [Fases I—III] e estão envolvidas quase o mesmo número de companhias e instituições. Só nos Estados Unidos da América, estima-se que existem aproximadamente 9 milhões de doentes que poderiam beneficiar da terapia antiangiogénica. Actualmente, pelo menos 4000 doentes participaram em ensaios clinicos, utilizando esta terapia, sem terem sido registados nenhuns efeitos indesejados particulares.

Na estrutura do conceito geral de angiogénese deve-se fazer a distinção entre vasculogénese, isto é, a formação de vasos sanguíneos durante o desenvolvimento embrionário, e angiogénese, no sentido estrito do termo, significando a formação de novos vasos sanguíneos (capilares) durante a vida pós-natal, a partir de vasos pré-existentes. A importância da angiogénese para o crescimento de tumores sólidos está amplamente documentada. Ao longo das três últimas décadas foi relatado que o crescimento tumoral, assim como a formação de metástases, são estritamente dependentes do desenvolvimento de novos vasos, capazes de vascularizar a massa tumoral. 2 A inibição da angiogénese está subjacente à formação de massas necróticas no seio do tumor ou à indução de apoptose em células tumorais.

Existem diferenças nítidas entre a neovascularização em tecido normal e a que ocorre em tecido tumoral. Na primeira, o endotélio vascular representa um tecido quiescente com um índice mitótico muito baixo das suas células constituintes (tempo de renovação medido em centenas de dias) e a rede vascular é regular, relativamente uniforme e adequada para a oxigenação adequada de todos os tecidos, sem nenhuma ligação arteriovenosa. No tecido tumoral, por outro lado, a estimulação da proliferação de células endoteliais dá origem a um índice mitótico elevado neste último (tempo de renovação médio 5 dias), a neovascularização é distintivamente irregular, com áreas de oclusão, por vezes com extremidades fechadas, com contactos arteriovenosos nalguns pontos e, por fim, a membrana basal apresenta fossos, o que nalguns pontos conduz a hipóxia dos tecidos. Estas diferenças oferecem a oportunidade de identificação de fármacos que bloqueiem selectivamente a neovascularização tumoral.

Num tumor, a neovascularização não coincide sempre com um estágio preciso no desenvolvimento tumoral; existem, de facto, casos em que a angiogénese começa mesmo antes do desenvolvimento tumoral (por exemplo, carcinoma do colo do útero), outros em que as duas fases são coincidentes (por exemplo, carcinoma da bexiga e da mama) e outros em que a angiogénese começa após o neoplasma (por exemplo, melanoma e carcinoma do ovário; ver, por exemplo, "Manual of Medicai Oncology", IV ed. (1991) G. Bonadonna et al. 3 A terapia antiangiogénica apresenta numerosas vantagens em comparação com a quimioterapia padrão tradicional (Câncer Research 1998, 58, 1408-16): a) especificidade: o seu alvo é um processo, i.e., a neovascularização tumoral; b) biodisponibilidade: o seu alvo são as células endoteliais, as quais podem ser facilmente alcançadas sem os problemas da quimioterapia tradicional que actua directamente sobre as células tumorais; c) quimiorresistência: esta é, talvez, a vantagem mais importante desta terapia; de facto, uma vez que as células endoteliais, ao contrário das células tumorais, são geneticamente estáveis, os fenómenos de resistência a fármacos têm pouca probabilidade de ocorrer; d) disseminação metastática: o bloqueio da neovascularização limita a propagação de células tumorais para outras partes do corpo via corrente sanguínea; e) apoptose: o bloqueio da rede vascular no tumor reduz o fornecimento de oxigénio e nutrientes às células tumorais; a apoptose é favorecida nestas condições; f) toxicidade sistémica reduzida: os efeitos tóxicos, tais como mielosupressão, efeitos gastrointestinais e perda temporária de cabelo, que estão quase invariavelmente presentes com a quimioterapia tradicional, não são observados com a terapia angiogénica. É sabido que uma série de elementos moleculares estão envolvidos na angiogénese tumoral (Oncology 1997, 54, 177-84). É sabido que factores pró- e antiangiogénicos endógenos estão envolvidos no mecanismo biológico regulador na formação de novos vasos. 4

Entre os estimuladores angiogénicos devem ser mencionados: factores de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, factor de crescimento transformante-α, factor α de necrose tumoral (TNF-α), factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, factor de crescimento transformante-β, um inibidor in-vitro, mas não um estimulador in-vivo, factor de crescimento placentário, interleucina-8, factor de crescimento de hepatócitos, factor de crescimento derivado de plaquetas, factores estimulantes de colónias de granulócitos, proliferina, as prostaglandinas (PGEi, PGE2) , GMl-GTlb, substância P, as bradiquininas e óxido nitrico.

Em contraste, os inibidores de angiogénese incluem: receptor solúvel de bFGF, interferões (α, β, γ), angiostatina, trombospondina 1, prolactina (fragmento amino terminal de 16kDa), factor 4 de plaquetas (PF4), inibidores da metaloproteinase tecidular (TIMP), péptido relacionado com a proliferina placentária, factor de inibição de angiogénese derivado de glioma, esteróides angiostáticos, inibidor derivado de cartilagem (CDI), heparinases, interleucina-12, inibidor do activador de plasminogénio, retinóides, endostatina, angiopoietina-2, genisteina, óxido nitrico e GM3.

As integrinas são uma vasta família das proteínas transmembranares que fazem a mediação das interacções célula-para célula e célula-para matriz extracelular. Todas as integrinas são capazes de reconhecer uma sequência de péptido comum Arg-Gly-Asp ("sítio universal de reconhecimento de células"), apesar de cada integrina reconhecer, de um modo

preferido, uma conformação diferente deste tripéptido. A 5 inibição de subtipos específicos de integrinas pode também ter um grande interesse do ponto de vista farmacológico para o desenvolvimento de inibidores da angiogénese. 0 controlo da proteína cinase-C (PK-C) pode também permitir a regulação da angiogénese. Existem, de facto, inibidores clássicos da PK-C, capazes de bloquear completamente, ou parcialmente, a angiogénese.

Apesar dos avultados investimentos e do envolvimento de um grande número de centros de investigação institucionais e privados, o problema do cancro em todo o mundo está ainda muito longe de ser definitivamente resolvido. Apesar do prognóstico das vítimas de cancro ter melhorado, com um aumento das taxas de sobrevivência ao longo dos últimos 30 anos, em média, de 30 para 50%, e sendo agora bem conhecidos os mecanismos genéticos, celulares e bioquímicos envolvidos no desenvolvimento de um tumor, a possibilidade de derrotar, ou, pelo menos, limitar este tipo de patologia continua a ser um problema de grande preocupação e muitos aspectos não estão ainda resolvidos, tais como, a probabilidade de recorrência, a remissão completa e a disseminação de metástases do tumor primário.

Desde o final da década de setenta, quando as observações de Folkman começaram a ser confirmadas pela comunidade científica internacional, foram isoladas centenas de moléculas dotadas de actividade antiangiogénica, a partir de fontes naturais (plantas, fungos, fluidos biológicos) e sintetizadas no laboratório.

Uma série de fármacos encontram-se já na Fase III, tais como Marimastat (British Biotech.), l'AG3340 (Prinomast-Agouron) e 6

Neovastat (Aeterna), todos os quais actuam principalmente ao nivel pulmonar (SNCL), com um mecanismo envolvendo a interferência com as metaloproteinases. Também na Fase III, encontram-se RhuMad VEGF (este é um anticorpo anti-VEGF de Genetech) e o interferão α (comercial) , que são activos contra tumores sólidos, graças à sua interferência com factores de crescimento pró-angiogénicos, ou TNP-470 (TAP Pharm.) que actua directamente sobre as células endoteliais. Por fim, fármacos tais como CAI (NCI) e IM862 (Cytran) são activos como agentes antiangiogénicos, mas com um mecanismo não especifico e fracamente conhecido.

Estes fármacos acima mencionados podem, dentro de alguns anos, fazer parte do arsenal terapêutico dos oncologistas, mas existem outras moléculas que foram inseridas recentemente em ensaios clinicos de Fase I/II, tais como, Combretastatina (OxiGene), metoxiestradiol e endostatina (EntreMed), as quais, com base em estudos pré-clinicos são muito promissoras.

Companhias, tais como, a Bristol Myers-Squibb (com BMS-275291), Novartis (com CGS27023A) ou Parke-Davis (com Suramin) estão envolvidas nesta estratégia terapêutica.

Heparina A heparina é uma mistura heterogénea de polissacáridos de ocorrência natural, de vários comprimentos e vários graus de sulfatação, que possui actividade anticoagulante e é segregada pelos mastócitos do tecido conjuntivo presente no figado (a partir do qual foi isolada em primeiro lugar), nos músculos, pulmões, timo e baço. 7 na

Em adição à sequência regular, foi identificada, heparina, uma sequência correspondente ao sitio activo para actividade antitrombina. A actividade antitumoral e antimetastática da heparina e seus derivados é devida à sua capacidade para inibir a heparanase, para bloquear factores de crescimento e para regular a angiogénese.

Sulfatos de Heparano (HS)

Os sulfatos de heparano (HS) são ligandos de proteina ubiquos. As proteínas ligam-se às cadeias de HS para uma variedade de acções, desde a simples imobilização ou protecção contra a acção de degradação proteolítica, a modulações especificas de actividades biológicas, tal como a angiogénese. 0 esqueleto de hidrato de carbono, na heparina e nos sulfatos de heparano (HS), consiste numa alternação de D-glucosamina (GlcN) e ácidos hexurónicos (Glc.A ou IdO.A).

Na heparina, os residuos GlcN são principalmente N-sulfatados, enquanto nos HS são N-sulfatados e N-acetilados, com uma pequena quantidade de N não substituído. HS é também, em média, menos O-sulfatado do que a heparina. A utilização de heparina no tratamento de perturbações da angiogénese, tal como tumores, particularmente metástases, é substancialmente limitada pela actividade anticoagulante da heparina. 8

Foram realizadas modificações quimicas na heparina, de forma a reduzir a sua capacidade anticoagulante, preservando, ao mesmo tempo, as suas propriedades antitumorais. A abertura de uma unidade de ácido glucorónico no sitio de antitrombina reduz a afinidade da heparina para a antitrombina: desta forma, as heparinas podem ser utilizadas com efeitos anticoagulantes reduzidos, mas retendo ainda propriedades antiangiogénicas.

Heparanases

As "heparanases" são enzimas pertencentes a uma família de endoglicosidases que hidrolisam as ligações glicósido internas das cadeias de sulfatos de heparano (HS) e heparina.

Estas endoglicosidases estão envolvidas na proliferação de células tumorais, em metástases e na neovascularização tumoral. Isto sugere que podem, também, estar envolvidas na angiogénese tumoral como resultado da libertação, a partir da matriz extracelular, de factores de crescimento ligados a heparina, tais como, aFGF (também denominado FGF-1), bFGF (também denominado FGF-2) e VEGF.

Estas enzimas são alvos biológicos para actividade antiangiogénica. Na literatura científica existe um grande número de estudos de correlação de estrutura/actividade (ver, por exemplo, Lapierre F. et al., Glycobiology, vol.6, (3), 355- 366, 1996) . Apesar de muitos aspectos ainda terem de ser clarificados, foram relatados estudos relativos à inibição de 9 heparanases pela heparina e seus derivados, utilizando testes específicos que conduziram à emergência de considerações de um tipo estrutural que podem servir como guias para a obtenção de novos derivados, mais selectivos.

No trabalho acima mencionado, de Lapierre et al., são descritos derivados de heparina obtidos por 2-0 dessulfatação ou por "divisão de glicol" (oxidação com periodato e redução subsequente com boro-hidreto de sódio). Estes derivados, definidos aqui como "heparina 2-0-dessulfatada" e "RO-heparina", respectivamente, mantiveram parcialmente a actividade antiangiogénica da heparina, conforme avaliado pelo teste CAM na presença de corticosteróides, como apresentado na Tabela III (ibid. página 360) .

Heparinas e FGF

Os FGFs regulam múltiplos processos fisiológicos, tais como, o crescimento e diferenciação celular, mas também funções envolvidas em processos patológicos, como a angiogénese tumoral.

Os FGFs são factores de crescimento (uma familia de mais do que 10 polipéptidos, dos quais os FGFs ácidos (FGF-1) e básicos (FGF-2) são aqueles que foram mais estudados, os quais requerem um cofactor polissacárido, heparina ou HS, para se ligarem ao receptor de FGF (FGFR) e o activarem.

Apesar do mecanismo preciso por meio do qual a heparina e o HS activam os FGFs ser desconhecido, é sabido, no entanto, que a heparina/FGF/FGFR formam um complexo "trimolecular" ou "ternário". 10

Um mecanismo postulado é que a heparina e o HS induzem a denominada dimerização em sanduíche do FGF e este último assim dimerizado, forma um complexo estável com FGFR.

Actividade antimetastática de derivados de heparina A capacidade de um tumor primário para gerar células metastáticas é, talvez, o principal problema que a terapia anticancerigena tem de enfrentar.

Os derivados de heparina com uma capacidade substancial para bloquear a heparanase parecem ser, igualmente, capazes de inibir a angiogénese, tanto em tumores primários como em metástases.

Adicionalmente, a inibição de heparanases reduz a capacidade de migração de células tumorais, a partir do tumor primário para outros órgãos. A tabela que se segue dá um exemplo da correlação estrutura/actividade antimetastática, no caso da heparina: % inibição Heparina 97 N-succinil-heparina 60 N-succinil-RO-heparina 58 11 (continuação) % inibição Heparina de baixo MW 86 N-succinil-heparina de baixo MW 61 Heparina de muito baixo MW 83 MW = peso molecular

Os resultados, nesta tabela, sugerem que fragmentos muito curtos de heparina estão ainda dotados de boa actividade antimetastática, enquanto esta actividade é reduzida quando o grupo amina da glucosamina está ligado a ácido succinico.

Os requisitos estruturais das moléculas do tipo da heparina, que favorecem a acção inibidora da angiogénese, podem ser agrupados em duas categorias, com base no alvo que se pretende bloquear: a) bloqueio da heparanase, uma enzima que hidrolisa as ligações glicósido dos sulfatos de heparano, libertando factores de crescimento.

Para esta finalidade, os compostos do tipo da heparina compreendem, de um modo preferido, sequências de, pelo menos, oito unidades monossacárido contendo ácido N-acetilglucosaminaglucurónico (ou glucosamina N-sulfatada (ver, por exemplo, D. Sandback-Pikas et al. J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) e as referências citadas). b) bloqueio de factores de crescimento angiogénico (tipo fibroblasto: FGF-1 e FGF-2; tipo endotélio vascular: VEGF; tipo permeabilidade vascular: VPF). 12

Para esta finalidade, os compostos do tipo heparina, de um modo preferido, têm sequências de, pelo menos, cinco unidades monossacárido de comprimento, contendo ácido idurónico 2-sulfatado e glucosamina N,6-sulfatada (ver, por exemplo, M. Maccarana et al. J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).

Na literatura, péptidos pequenos (5-13 aminoácidos) com actividade antiangiogénica (Patente US 5.399.667 da Universidade de Washington) que actuam por ligação a um receptor de trombospondina, ou péptidos mais compridos (50 aminoácidos aprox.). São conhecidos factores de plaquetas modificados - (EP 0589719, Lilly), capazes de inibir a proliferação endotelial, com ICso=7 nM.

Fragmentos de oligossacáridos com actividade antiangiogénica foram também amplamente descritos: verificou-se, de facto, que por variação da sequência de hidratos de carbono a selectividade da interacção pode ser aumentada.

Adicionalmente, a heparina pode ser utilizada como veiculo para substâncias que são, elas próprias, antiangiogénicas, tais como, alguns esteróides, explorando a afinidade da heparina para células endoteliais vasculares; ver, por exemplo, o documento WO 93/18793 da Universidade do Texas e Imperial Câncer Research Technology, em que são reivindicadas heparinas com ligantes ácidos lábeis, tal como hidrazina de ácido adipico, ligada a cortisol. O efeito antiangiogénico das moléculas conjugadas é superior ao das moléculas não conjugadas, mesmo quando administradas simultaneamente. 13

Em Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96, são descritas heparinas ligadas a esteróides (e.g., cortisol) com um grupo hidrazona em C-20 que apresentam maior actividade antiangiogénica do que as duas moléculas não conjugadas. O documento EP 0246654 de Daiichi Sc., descreve polissacáridos sulfatados com actividade antiangiogénica com estudos da Fase II. O documento EP 0394971 de Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll., descreve hexassacáridos - fragmentos de heparina - com baixa sulfatação, capazes de inibir o crescimento de células endoteliais e angiogénese estimulada por (FGF-1). O documento EP 0618234 de Alfa Wasserman, descreve um método para a preparação de glicosaminoglicanos semi-sintéticos com uma estrutura de heparina ou heparano, comportando um grupo nucleófilo. O documento WO 95/05182 de Glycomed, descreve vários oligossacáridos sulfatados com actividade anticoagulante, antiangiogénica e anti-inflamatória. O documento US 5808021 de Glycomed, descreve um método para a preparação de heparina 2-0, 3-0 dessulfatada, substancialmente não despolimerizada, com uma percentagem de dessulfatação nas posições 2- do ácido idurónico (I, 2-0) e na posição 3 da unidade glucosamina (A, 3-0) variando entre aproximadamente 99 e aproximadamente 75% da percentagem original. Este método contempla a dessulfatação conduzida na presença de um catião de um metal bivalente, exemplificado por cálcio ou cobre, seguida 14 por liofilização do produto obtido. As heparinas dessulfatadas têm actividade antiangiogénica. 0 documento WO 99/27976 revela um processo para a preparação de materiais poliméricos com elevada compatibilidade com fluidos e tecidos orgânicos, compreendendo um polimero básico ao qual estão ligadas, covalentemente, moléculas de um polissacárido compreendendo unidades repetitivas dissacárido, formadas por um ácido urónico e uma hexosamina. 0 polissacárido é submetido a dessulfatação, de modo a obter funcionalidades epoxi sobre os residuos ácido urónico. 0 objectivo da invenção aqui descrita é encontrar estruturas óptimas de glicosaminoglicano para a geração de actividade antiangiogénica, com base em mecanismos de inibição da heparanase e/ou de inibição do factor de crescimento FGF. Um objectivo adicional da invenção aqui descrita é proporcionar um medicamento com actividade antiangiogénica que seja essencialmente isento de efeitos secundários, típicos dos derivados de heparina, tal como, por exemplo, actividade anticoagulante.

Resumo da invenção

Verificou-se agora que por sujeição de um glicosaminoglicano, tal como um glicosaminoglicano do tipo heparina, heparina ou heparina modificada, contendo resíduos glucosamina com diferentes graus de N-dessulfatação e opcional N-acetilação total ou parcial subsequente, a tratamento de 2-0-dessulfatação controlada das unidades idurónico, até um grau de dessulfatação não superior a 60% das unidades urónico totais, e 15 abertura subsequente do seu anel glicósido, por divisão de glicol, as propriedades do factor de crescimento angiogénico são mantidas. Surpreendentemente, estas heparinas 2-0-dessulfatadas em não mais do que 60%, das suas unidades urónico totais, são marcadamente antiangiogénicas. A dessulfatação, conduzida nas condições descritas na presente invenção, produz também a formação de unidades idurónico com um anel oxirânico na posição 2,3. A abertura do anel oxirânico, nas condições descritas na presente invenção, dá origem a unidades L-idurónico ou L-galacturónico.

Constitui um objecto da invenção aqui descrita, um derivado glicosaminoglicano 2-O-dessulfatado, particularmente uma heparina 2-O-dessulfatada, selectivamente dessulfatada parcialmente, com um grau de dessulf atação que não exceda 60% das unidades urónico totais, cujo anel glucósido tenha sido submetido a divisão de glicol; estes fossos de dessulfatação reduzem o comprimento das sequências regulares constituídas pela sucessão de unidades trissulfato de dissacárido.

Numa forma de realização particular, a invenção descrita aqui refere-se a um composto de fórmula (I)

U n OSOa- 16 em que o anel U tem o significado seguinte:

X e X', que podem ser iguais ou diferentes, são um grupo aldeido ou o grupo -CH2-D, em que D é hidroxilo ou um aminoácido, um péptido ou um residuo de um hidrato de carbono ou oligossacárido; R e Ri, que podem ser iguais ou diferentes, são um residuo S03 ou acetilo; nem, que podem ser iguais ou diferentes, podem variar desde 1 a 40; a soma de n+m varia desde 6 a 40; a razão m:n varia desde 10:2 a 1:1. De um modo preferido, m é maior ou igual a n. De um modo preferido, n varia entre 40 e 60% da soma m+n. O simbolo Lj indica que as unidades marcadas com m e n estão distribuídas estatisticamente ao longo da cadeia de polissacárido e não estão necessariamente em sequência.

Os compostos que constituem a matéria da invenção aqui descrita têm propriedades antiangiogénicas interessantes e são, portanto, úteis como ingredientes activos para a preparação de medicamentos para o tratamento de patologias com base na angiogénese anormal e, particularmente, para o tratamento de metástases. 17

Vantajosamente, os compostos de acordo com a invenção apresentam propriedades anticoagulantes reduzidas, senão mesmo não-existentes, evitando assim, ou reduzindo, os efeitos secundários típicos das heparinas. Uma outra vantagem deriva do facto dos compostos, de acordo com a invenção, poderem ser caracterizados com técnicas analíticas instrumentais, tal como a espectroscopia de RMN, possibilitando assim um controlo de processo que é absolutamente desejável do ponto de vista industrial.

Também no caso das heparinas modificadas, o peso molecular (MW) tem uma função muito importante quando se produzem inibidores de angiogénese. É bem sabido, de facto, que uma redução no peso molecular (MW) para valores que correspondem a unidades pentassacárido, não conduz a uma perda de actividade antiangiogénica. Pelo contrário, foi estabelecido que, para além de um certo comprimento, as cadeias de heparina favorecem, em vez de inibir, a dimerização e, portanto a activação de FGF.

Descrição detalhada da invenção 0 que se entende por grau de dessulfatação é a percentagem de ácidos idurónicos não sulfatados, em relação aos ácidos urónicos totais, presentes originalmente na heparina de partida. Um intervalo inicial preferido para a percentagem de dessulfatação varia entre, aproximadamente, 40 e, aproximadamente, 60%. Entre os compostos de fórmula (I), o composto preferido é: heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, com um peso molecular (MW) de 11200, um índice de polidispersão D de 18 1,3, um grau de dessulf atação de 1,99 (expresso como a razão molar S03~:C00”), uma percentagem de ácidos urónicos modificados, comparada com os ácidos urónicos totais, de aproximadamente, 50% (seguidamente também denominada ST1514) . O dito composto está compreendido na fórmula (I) em que, entre as outras definições correspondentes, m:n = 1:1 e as unidades marcadas com m e n estão distribuídas ao longo da cadeia polissacárido numa maneira alternada, regular.

Os compostos de acordo com a invenção aqui descrita são preparados por meio de um processo compreendendo: a) tratamento básico, a uma temperatura variando desde a temperatura ambiente até aproximadamente 100 °C, de um modo preferido, desde 50 a 70 °C e, de um modo ainda mais preferido, a aproximadamente 65 °C, o que conduz à eliminação de uma percentagem controlada de grupos sulfato na posição 2 do ácido idurónico e à formação de grupos epóxido; e, se desejado b) abertura do dito anel epóxido a aproximadamente pH 7, a uma temperatura que varia desde, aproximadamente, 50 °C até, aproximadamente, 100 °C, de um modo preferido, a, aproximadamente, 70 °C, para originar resíduos de ácido galacturónico; ou, em alternativa, c) abertura do dito anel epóxido a uma temperatura variando desde, aproximadamente, 0 °C até 30 °C, de um modo preferido, a, aproximadamente, 25 °C, para originar resíduos de ácido idurónico; e 19 d) oxidação dos dióis com periodato de sódio, para originar a abertura do anel glicósido e a formação de dois grupos aldeido, por resíduo modificado; e) redução dos ditos grupos aldeído no álcool primário e, se desejado, transformação do grupo D num grupo diferente de hidroxilo, como considerado nos diferentes significados atribuídos na fórmula (I) f) hidrólise ácida opcional, para se obterem oligossacáridos correspondentes às sequências regulares, ou, em alternativa, g) hidrólise enzimática parcial, com uma enzima seleccionada do grupo consistindo em liase, heparinase, heparitinase, ou equivalente de produtos obtidos no passo e), para originar oligossacáridos, de um modo preferido, tetra- ou octa-sacáridos, com o resíduo terminal não redutor consistindo em ácido idurónico não saturado, o resíduo redutor consistindo numa N-sulfoglucosamina e contendo, pelo menos, um resíduo de ácido idurónico aberto; ou, em alternativa, h) o composto obtido no passo a) , ou o produto obtido no passo b) , é tratado por hidrólise enzimática parcial; e se desej ado, i) sujeição dos produtos obtidos num dos passos a), b) e e) a 6-0-dessulfatação parcial; ou, em alternativa, j) sujeição da heparina de partida, parcialmente ou totalmente 6-dessulfatada, aos passos a), b) e e). 20

De acordo com a invenção aqui descrita, o composto preferido é: heparina parcialmente 2-0-dessulfatada, obtenível pelo processo descrito acima, em que o passo a) é realizado durante 45 minutos, a 60 °C e o passo b) a 70 °C a pH 7, e possuindo um peso molecular (MW) de 11200, um índice de polidispersão D de 1,3, um grau de dessulfatação de 1,99 (expresso como a razão molar S03~:C00“), percentagem de ácidos urónicos modificados, comparada com os ácidos urónicos totais de, aproximadamente, 50% (seguidamente também denominada ST1514);

Os pesos moleculares são determinados por HPLC-GPC (cromatografia líquida de alta eficiência - cromatografia de permeação em gele). O grau de dessulfatação é determinado por conductimetria e a percentagem de ácidos urónicos modificados por 13C-RMN. MW é o peso molecular e D é o índice de polidispersão, expresso como MW/Mn.

De acordo com a invenção aqui descrita, os produtos de partida são glicosaminoglicanos de várias origens, de um modo preferido, heparinas de ocorrência natural. Também é possível utilizar heparinas quimicamente modificadas com um teor, em percentagem, de N,6 dissulfato variando entre 0 e 100%. Partindo de produtos com um teor diferente em glucosamina 6-O-sulfatada, é possível modular o comprimento das sequências regulares entre um ácido idurónico aberto e outro. Os glicosaminoglicanos de acordo com a invenção que apresentam abertura do anel glicósido são denominados, convencionalmente, por derivados RO pelos 21 especialistas na técnica, significando com isto que o anel glicósido foi aberto por meio de uma acção de oxidação, seguida por uma redução (Redução-Oxidação - RO) . Esta abertura do anel glicósido é também denominada convencionalmente "divisão de glicol", assim denominada devido à formação dos dois hidroxilo primários presentes no anel aberto. Os compostos aqui referidos serão também denominados derivados "RO" ou de "Divisão de Glicol".

Numa outra forma de realização da invenção aqui descrita, os aldeidos e hidroxilo primário derivado da reacção de abertura descrita acima ("divisão de glicol") prestaram-se também, eles próprios, à funcionalização subsequente. Deste modo, os compostos de fórmula (I) podem, também, comportar grupos iguais ou diferentes, como definido acima para X e X', no hidroxilo primário derivado da divisão de glicol, por exemplo, grupos oligossacárido ou péptido, variando desde um sacárido ou aminoácido singular, a mais do que uma unidade de comprimento, de um modo preferido, 2 ou 3 unidades.

Os compostos de Fórmula (I) em que X e X' são -CH2OH podem também ser utilizados como veiculos para outros tipos de fármacos, por meio de ligação adequada com a porção de heparina que é capaz de proporcionar uma ligação estável, em condições normais da manufactura e armazenagem de um fármaco formulado que, no entanto liberta o fármaco transportado no organismo, de um modo preferido, na vizinhança do órgão alvo. Os exemplos de fármacos que podem ser transportados são fármacos anti- inflamatórios esteróides e não esteróides, corticosteróides e outros fármacos com uma acção antimetastática, caso em que existirá um incremento vantajoso do efeito antimetastático, como resultado da soma das actividades intrínsecas, separadas, dos 22 compostos de acordo com a invenção e do agente antimetastático ligado a ele, com as vantagens relacionadas de uma maior selectividade para o alvo e menor toxicidade sistémica. Exemplos desses fármacos são os inibidores de metaloproteinases. Outros fármacos que podem ser transportados com utilidade são aqueles que actuam ao nivel endotelial. Os compostos de Fórmula (I) em que X e X' são diferentes de hidroxilo ou aldeído, podem também ser utilizados como veiculos para fármacos, caso em que os grupos X e X' actuarão como "espaçadores" entre a molécula transportada, quer isto dizer o glicosaminoglicano da presente invenção e a molécula actuando como veículo, naqueles casos em que isto possa ser desejável por razões de farmacocinética ou farmacodinâmica.

No caso dos compostos, de acordo com a invenção, derivados de heparina, estes são preparados a partir da própria heparina por meio de técnicas de dessulfatação conhecidas dos técnicos com experiência nesse campo. Por exemplo, a dessulfatação é conduzida na presença de agentes alcalinos, tal como hidróxido de sódio, a temperaturas que variam entre a temperatura ambiente e 100 °C, de um modo preferido, entre 50 e 70 °C, por exemplo a 60 °C, durante um período suficientemente longo para se obter a dessulfatação desejada. A dessulfatação é controlada por actuação sobre os parâmetros de processo, tais como as concentrações de reagentes, a temperatura e os tempos de reacção. Um exemplo preferido consiste na manutenção de concentrações constantes de substrato (glicosaminoglicano) a 80 mg/mL e de NaOH a 1 M, uma temperatura constante de 60 °C e controlando a dessulfatação com um tempo de reacção entre 15 e 60 minutos. O técnico experiente neste campo pode variar as condições, por exemplo elevando a temperatura de reacção e encurtando o tempo de reacção, com base na tentativa e erro 23 normais na prática experimental e com base no seu conhecimento geral do assunto. 0 tratamento com agentes alcalinos dá origem a um produto intermediário, caracterizado pela presença de um anel epóxido sobre a unidade dessulfatada. De uma maneira totalmente surpreendente, estes intermediários provaram ser dotados de propriedades antiangiogénicas similares às dos compostos de fórmula (I) . Deste modo, um outro objecto da invenção aqui descrita é um derivado de heparina parcialmente dessulfatada e, portanto, heparina com uma carga reduzida, particularmente heparina não dessulfatada em mais do que 60%, caracterizada por um anel epóxido no sitio de dessulfatação. Os ditos compostos, caracterizados por um anel epóxido, pertencem também aos objectos cobertos pela presente invenção, quer isto dizer, as composições farmacêuticas que os contêm e a sua utilização para a preparação de medicamentos com actividade antiangiogénica. São preferidos os compostos seguintes: heparina parcialmente 2-O-dessulfatada com um peso molecular (MW) de 12900 D, um índice de polidispersão D de 1.5, um grau de dessulf atação de 2,05 (expresso como a razão molar SO3-:COO-) , percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de residuos urónicos oxidados e reduzidos (seguidamente também denominada ST1513); heparina parcialmente 2-O-dessulfatada com um peso molecular (MW) de 11000 D, um índice de polidispersão D de 1.5, um grau de dessulf atação de 2,05 (expresso como a razão molar S03-:COO-), percentagem de ácidos urónicos 24 modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos, resíduos urónicos oxidados e reduzidos; heparina parcialmente 2-0-dessulfatada com um peso molecular (MW) de 9200 D, um índice de polidispersão D de 1,5, percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 11% de grupos epóxido, 27,5% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos.

Numa das formas de realização possíveis da invenção aqui descrita, são preferidos os seguintes: heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenível pelo processo descrito acima, em que o passo a) é conduzido durante 15 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e com um peso molecular (MW) de 12900 D, um índice de polidispersão D de 1,5, um grau de dessulfatação de 2,05 (expresso como a razão molar S03-:C00-), percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos (seguidamente também denominada ST1513); heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenível pelo processo descrito acima, em que o passo a) é conduzido durante 30 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, (seguidamente denominada ST1516) e com um peso molecular (MW) de 11000 D, um índice de polidispersão D de 1,5, um grau de dessulf atação de 1,8 (expresso como a razão molar SO3-:COO-), percentagem de ácidos urónicos modificados em 25 comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos; heparina parcialmente 2-0-dessulfatada, obtenível pelo processo descrito acima, em que o passo a) é conduzido durante 60 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e com um peso molecular (MW) de 9200 D, um indice de polidispersão D de 1,5, percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 11% de grupos epóxido, 27,5% de residuos urónicos oxidados e reduzidos (divisão) (seguidamente denominada ST1515).

Subsequentemente à formação do anel epóxido, este último é aberto, recorrendo novamente a técnicas conhecidas. A percentagem de epóxido formado é calculada a partir da razão entre as áreas dos sinais de RMN de 13C a aproximadamente 55 ppm, caracteristicos dos carbonos 2 e 3 do anel de ácido urónico contendo o epóxido, e o número total de sinais anoméricos (Cl dos residuos glucosamina e ácido urónico). Se a abertura for conduzida a quente, é obtido um resíduo de ácido galacturónico, enquanto que se a abertura do anel epóxido for conduzida a frio é obtido um resíduo de ácido idurónico. Os exemplos preferidos de compostos contendo um anel epóxido são os obteníveis pelo processo descrito acima e possuindo teores de ácido urónico oxidado de 14% (seguidamente ST1509), 24% (seguidamente ST1525) e 30% (seguidamente ST1526), respectivamente. A heparina parcialmente dessulfatada é então submetida a "divisão de glicol" (RO para encurtar), de acordo com o processo definido acima e a degradação de Smith (SD para encurtar). 26

Em alternativa, os compostos de fórmula (I) podem também ser obtidos sem passagem via o intermediário epóxido, quer isto dizer, por divisão de glicol directa e subsequente degradação de Smith. 0 processo descrito até aqui conduz aos compostos de fórmula (I) em que os grupos X e X" são ambos -CH2OH.

Para X e X' diferentes de -CH2OH, estão disponiveis métodos, para o técnico experiente nesse campo, para transformação do grupo hidroxilo com outros grupos abrangidos nas definições dadas acima. Por exemplo, a conjugação com aminoácidos ou péptidos pode ser realizada por tratamento do intermediário aldeído, derivado da reacção de divisão de glicol, com uma reacção de aminação redutora (Hoffmann J. et al., Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)), que pode ser conduzida em solvente aquoso e é compatível com a manutenção da estrutura da heparina.

Se desejado, e isto constitui um outro objecto da invenção aqui descrita, os compostos de fórmula (I) podem ser ainda degradados com agentes ácidos em condições de pH adequadas, e.g., a pH 4, para originar uma mistura de oligossacáridos que mantém as propriedades antiangiogénicas.

Da mesma forma, constituem objecto da presente invenção os compostos obtidos por um dos passos g) , h) , i) e j) do processo descrito acima.

Os objectos da invenção aqui descritos são composições farmacêuticas contendo como seu ingrediente activo, pelo menos, um composto de fórmula (I), sozinho ou em combinação com um ou 27 mais compostos de fórmula (I), ou o referido composto, ou compostos, de fórmula (I) em combinação com as heparinas dessulfatadas descritas acima, e.g., os intermediários epoxidados; estes últimos podem também ser utilizados sozinhos como ingredientes activos nas composições farmacêuticas. 0 ingrediente activo, de acordo com a presente invenção, estará numa mistura com veiculos e/ou excipientes adequados, vulgarmente utilizados em tecnologia farmacêutica, tal como, por exemplo, os descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", última edição. As composições, de acordo com a presente invenção, conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo. As doses serão determinadas pelo técnico com experiência nesse campo, e.g., o clinico ou médico de cuidados de saúde primários, de acordo com a doença a ser tratada e a condição do doente, ou concomitantemente com a administração de outros ingredientes activos. A titulo de exemplo, podem ser indicadas doses variáveis entre 0,1 e 100 mg/kg.

Os exemplos de composições farmacêuticas são aquelas que podem ser administradas por via oral ou parentérica, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, ou na forma de pulverizações nasais ou orais. As composições farmacêuticas adequadas para esse fim são comprimidos, cápsulas duras ou macias, pós, soluções, suspensões, xaropes e formas sólidas para preparações liquidas extemporâneas. As composições para administração parentérica são, por exemplo, todas as formas injectáveis por via intramuscular, intravenosa e subcutânea, assim como soluções, suspensões e emulsões. As formulações de lipossomas também devem ser mencionadas. Os comprimidos incluem também as formas para a libertação controlada do ingrediente activo, quer como formas de administração oral, comprimidos 28 revestidos com camadas apropriadas, pós microencapsulados, complexos com ciclodextrinas, formas de depósito, por exemplo, formas subcutâneas, tais como injecções ou implantes de depósito.

Os compostos de acordo com a invenção aqui descrita possuem actividade antiangiogénica. Isto torna-os úteis para a preparação de medicamentos úteis para o tratamento de sujeitos, geralmente mamiferos, e particularmente sujeitos humanos, que sofram de angiogénese alterada. Os exemplos de doenças tratadas com o medicamento que constitui o objecto da presente invenção são tumores primários, metástases, retinopatias diabéticas, psoriase, fibroplasia retrolenticular, restenose após angioplastia e "by-pass" coronário.

Vantajosamente, os compostos de acordo com a presente invenção são substancialmente isentos dos efeitos secundários tipicos da heparina. Em particular, os compostos de acordo com a invenção são substancialmente isentos de actividade anticoagulante. Por substancialmente isentos dessa actividade, o especialista na técnica pretende significar nenhuma ou uma actividade negligenciável, do ponto de vista da utilização clinica.

Um dos primeiros factores de crescimento que se descobriu para ter um papel angiogénico foi o bFGF (ou FGF-2), seguido ligeiramente mais tarde pelo aFGF (ou FGF-1) (para uma revisão sobre este assunto ver Christofori, Universidade de Oxford, 1996) . Ambas as proteínas são membros de uma classe de factores de crescimento caracterizada por um elevado grau de afinidade para a heparina. Outros indutores angiogénicos potentes são VEGF, VEGF-B e VEGF-C. Todos os três factores VEGF, como os 29 FGFs, são expressos ubiquamente no organismo. Todos estes tipos de factores, a/bFGF (FGF-1 e FGF-2) e VEGF, ligam-se a receptores de alta afinidade específicos, com um domínio transmembranar possuindo actividade de tirosina-cinase. Os três receptores para os VEGFs - VEGF-1 (flt-1), VEGF-2 (kdr/flk-1) e VEGF-3 (flt-4) - são expressos especificamente sobre células endoteliais, enquanto os quatro receptores FGF são expressos em numerosos órgãos e tecidos (para uma revisão sobre este assunto, ver Risau e Flame 1995 Annu. Rev. Cell Dev: Biol. 11: 73-91) . A ligação de bFGF a heparina, ou a fragmentos de sulfato de heparano, provoca a sua dimerização e a possibilidade de ligação ao seu próprio receptor, por activação da via de tradução do sinal que activa a célula endotelial na mitogénese e na diferenciação. A inibição da ligação de FGF a heparina ou a fragmentos de sulfato de heparano representa, assim, um alvo terapêutico válido no combate da neoangiogénese patológica, induzida por um nível local ou sistémico aumentado de factores de crescimento.

Para esta finalidade foi concebido um modelo in vitro, capaz de avaliar a interferência dos vários derivados diferentes de heparina com a ligação de bFGF ao seu próprio receptor.

Em particular, foram utilizadas células de ovário de hamsters chineses (CH0-K1) que possuem sulfatos de heparano na sua superfície, mas a que falta o receptor 1 de FGF. Foram também utilizadas células CHO denominadas CHO-745flg, que expressam o receptor 1 de FGF mas que, ao contrário do primeiro grupo, não possuem sulfatos de heparano na membrana. Estas últimas células foram transfectadas de forma estável com cDNA para proteína fluorescente verde e, por esta razão, puderam ser 30 observadas sob o microscópio de fluorescência com uma combinação de filtros para a detecção de emissão verde. Em resumo, a técnica é baseada na possibilidade de que os dois tipos de células possam interagir (formar ligações estáveis), apenas se for adicionado FGF aos dois tipos de células. De facto, neste caso, os sulfatos de heparano das células CHO-745flg ligar-se-ão a FGF, que por sua vez se ligará às células CH0-K1, estabelecendo uma ponte. A ligação que ocorre é detectável como resultado da fluorescência verde emitida pelas células CHO-745flg.

Adicionalmente, os compostos foram avaliados em relação à sua actividade inibidora da proliferação celular. De facto, um dos principais efeitos do FGF é estimular o crescimento celular na ausência de soro, em células que expressam o receptor 1 de FGF (FGFR-1) .

Para esta finalidade, foram utilizadas duas linhas de células, ambas expressando FGFR-1 (células L6WT1 e da aorta de bovino), cujo crescimento foi avaliado na presença de FGF, com ou sem, a adição de derivados de heparina para os quais era esperada uma actividade inibitória.

Inibição da adesão intercelular mediada por FGF2

Semearam-se células CH0-K1 a uma densidade de 90000 células/cm2 em placas de 24 cavidades. Ao fim de 24 horas as células foram fixadas em glutaraldeido a 3% em PBS, durante 2 horas a 4 °C, e lavadas com glicina 0,1 M/PBS. Sobre as monocamadas fixadas células CHO 745/flg, transfectadas com FGFR-1, a uma densidade de 50000 células/cm2 em DMEM contendo 31 EDTA 10 inM, FGF-2 30 ng/mL e doses crescentes dos compostos de teste. Ao fim de 2 horas de incubação a 37 °C, as células aderentes foram contadas sob o microscópio invertido. Os resultados foram expressos como percentagem do número de células aderentes, em comparação com os medidos na ausência dos compostos de teste. Os compostos foram examinados em triplicado a 6 concentrações, variando desde 1 ng/mL a 100 yg/mL e o ID50 foi calculado para cada composto (Tabela 1).

Tabela 1

Inibição da adesão intercelular (ID50) de células CHO-K1 e CHO-745flg Produto Inibição (ID50) Heparina 100 Heparina RO 8 ST1513 80 ST1516 110 ST1514 105 ST1515 120 ST1525 50 ST1528 75 ST1507 125

Inibição da síntese de DNA em células L6 transfectadas com FGFR-1

Semearam-se células L6-WT1 (mioblastos de rato transfectados com FGFR-1) a uma densidade de 25000 células/cm2, 32 em placas de 48 cavidades em DMEM + FCS a 10%. Ao fim de 24 horas, as células foram lavadas com meio livre de soro e incubadas durante 48 horas com DMEM + FCS 0,5%. As células foram então incubadas durante 16 horas com FGF-2, nas concentrações de 15 e 30 ng/mL, na presença ou ausência dos compostos de teste (todos a 100 yg/mL). No final da incubação, adicionou-se 3H-timidina (0,25 yCi/cavidade) sem mudar o meio. Ao fim de 6 horas, o TCA precipitável foi medido. Cada ponto experimental é a média de 3 determinações. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Inibição da sintese de DNA em células L6 transfectadas com FGFR-1 Produto Incorporação de 3H-timidina (% vs. controlo) Heparina (FGF-2 15 ng/mL) 50 Heparina (FGF-2 30 ng/mL) 74 Heparina RO (FGF-2 15 ng/mL) 41 Heparina RO (FGF-2 30 ng/mL) 80 ST1513 (FGF-2 15 ng/mL) 93 ST1513 (FGF-2 30 ng/mL) 102 G3025B (FGF-2 15 ng/mL) 68 G3025B (FGF-2 30 ng/mL) 71 ST1514 (FGF-2 15 ng/mL) 58 ST1514 (FGF-2 30 ng/mL) 99 ST1515 (FGF-2 15 ng/mL) 79 ST1515 (FGF-2 30 ng/mL) 100 33

Efeito sobre a síntese de DNA em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC)

Semearam-se células BAEC a uma densidade de 2500 células/cm2, em placas de 48 cavidades em meio completo de EGM, Estojo Bullet. Ao fim de 24 horas as células foram cultivadas na ausência de soro, em meio EGM sem extracto de cérebro bovino e hEGF. Ao fim de mais 24 horas, as células foram tratadas com 30 ng/mL de bFGF, na presença de concentrações crescentes do composto de teste. Ao fim de 16 horas, adicionou-se 1 yCi/mL de 3H-timidina ao meio. Ao fim de 6 horas, a actividade TCA precipitável foi medida. Cada ponto experimental é a média de 8 determinações. Os resultados são apresentados nas Tabelas 3-6.

Tabela 3

Efeito sobre a sintese de DNA em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC) - ST1514 Concentração ng/mL Incorporação de JH-timidina (% vs controlo) 1 80 10 78 100 42 1000 33 10000 22 100000 5 34

Tabela 4

Efeito sobre a síntese de DNA em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC) - ST1528 Concentração ng/mL Incorporação de JH-timidina (% vs controlo) 1 85 10 73 100 85 1000 32 10000 28 100000 5

Tabela 5

Efeito sobre a sintese de DNA em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC) - ST1525 Concentração ng/mL Incorporação de JH-timidina (% vs controlo) 1 75 10 67 100 26 1000 21 10000 7 100000 2 35

Tabela 6

Efeito sobre a sintese de DNA em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC) - ST1507 Concentração ng/mL Incorporação de ^H-timidina (% vs controlo) 1 92 10 92 100 45 1000 40 10000 18 100000 12

Teste de proliferação celular em BAEC

Semearam-se células BAEC à 7a passagem, a uma densidade de 2500 células/cm2, em placas de 96 cavidades em meio EBM sem extracto de cérebro de bovino e hEGF. A este meio, adicionaram-se 30 ng/mL de FGF-2 e cada um dos compostos de teste em 5 concentrações, variando desde 10 ng/mL a 100 yg/mL. Ao fim de 3 dias, as células foram fixadas e coradas com violeta de cristal e a densidade óptica foi determinada por meio de um leitor de microplacas ELISA. Cada ponto experimental foi efectuado em guadruplicado e calculou-se o ID5o. Os resultados são apresentados na Tabela 7. 36

Tabela 7

Teste de proliferação de células em BAEC Inibição (IDso) Produto yg/mL Heparina 100 ST1509 0,02 ST1525 10 ST1526 0,02 ST1527 100 ST1528 0,1

Teste de proliferação de células em BAEC GM 7373 fetal

Semearam-se células GM7373, a uma densidade de 70000 células/cm2, em placas de 96 cavidades em meio de MEM + FCS a 10%. Ao fim de 24 horas, as células foram lavadas com meio isento de soro e tratadas com 10 ng/mL de FGF-2, em meio contendo FCS a 0,4%. Ao fim de 8 horas, os compostos de teste foram adicionados ao meio a 5 concentrações, variando desde 10 ng/mL a 100 yg/mL. Ao fim de mais 16 horas, as células foram tripsinizadas e contadas numa câmara Burker. O ID50 foi calculado para cada composto e os resultados são as médias de 2 experiências em triplicado. Os resultados são apresentados na Tabela 8. 37

Tabela 8

Teste de proliferação de células em BAEC GM 7373 fetal Produto Inibição (ID50) pg/mL Heparina 2 ST1509 00 o ST1525 2 ST1526 1 ST1527 20 ST1528 0,2 ST1514 0,1

Inibição da angiogénese

Para o estudo da angiogénese, o modelo utilizado foi o modelo da membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) (Ribatti et al. Int. J. Dev. Biol., 40, 1189 (1996)).

Incubaram-se 300 ovos de galinha embrionados, a 37 °C em condições de humidade constante. No 3o dia de incubação, após se aspirarem 2-3 mL de albumina do pólo agudo do ovo, de forma a destacar a CAM da casca, abriu-se uma janela na casca com uma tesoura. Os vasos subjacentes à CAM foram assim expostos. A janela foi fechada com um painel de vidro transparente e os vidros foram colocados de novo na incubadora. No 8 o dia de incubação, em condições estéreis, as CAMs foram tratadas de acordo com o protocolo descrito abaixo, utilizando uma técnica desenvolvida recentemente (Ribatti et al. J. Vasc. Res. 34, 455 (1997)), que envolve a utilização de esponjas de gelatina estéreis, medindo 1 mm2 de tamanho. Cada molécula foi ressuspendida em 3 yL de PBS a uma concentração de 50 ou 100 38 yg/embrião. Como controlo positivo, utilizou-se FGF-2 (1 yg/esponja), para o qual tinha sido demonstrada uma actividade angiogénica potente sobre a CAM (Ribatti et ai., Dev. Biol. 170, 39, (1995)). As esponjas, foram primeiro deixadas em repouso sobre a superfície da CAM e, em seguida pipetaram-se 3 yL da solução da substância de teste para a superfície da esponja. As CAMs foram examinadas diariamente utilizando um estereomicroscópio Zeiss SR, equipado com um dispositivo fotográfico. As experiências foram interrompidas no 12° dia de incubação, altura em que foi realizada uma avaliação global da actividade angiogénica das moléculas, expressa como percentagem de inibição, em relação ao número de experiências iniciadas e completadas (Tabela 9) . Adicionalmente, para o composto ST1514, avaliado na concentração de 100 yg/embrião, foi também realizada uma avaliação macroscópica quantitativa da actividade angiostática, de acordo com a técnica proposta por Brooks et al. (Science, 264, 569, (1994)), contando o número de vasos que circundam a esponja. 0 número da vases foi comparado com o das esponj as de controlo tratadas com PBS (veículo do composto de teste) e com FGF-2 (controlo positivo). Os resultados são apresentados na Tabela 10.

Tabela 9

Actividade angiostática sobre modelo CAM Composto Concentração N° de Inibição (yg/embrião) experiências (%) heparina N-acetilada 50 10 0 Heparina RO (ox- 50 10 20 vermelho 19,6%) ST1514 (RO 56%) 50 10 50 ST1514 (RO 56%) 100 10 80 39

Deve ser notado que a heparina de ocorrência natural não tem actividade.

Tabela 10

Actividade angiostática: avaliação quantitativa macroscópica (Brooks) Composto N° de N° de vasos na interface embriões esponj a/CAM ST1514 10 2 + 1 (100 pg/embrião) PBS (3 pL) 5 7 + 2 FGF-2 (1 pg/embrião) 5 50 + 4

Deve ser notado que a heparina de ocorrência natural não tem actividade.

Avaliação da toxicidade da heparina em ratinhos Balb/c. 20 Ratinhos Balb/c fêmea de 6 semanas de idade, pesando 20 g (Harlan), divididos em grupos por distribuição aleatória casual, foram tratados com heparina sódica, como referência, e com o composto de acordo com a presente invenção denominado ST1514. O esquema de tratamento foi do tipo q2dx5, i.e., 5 administrações totais a intervalos de 2 dias, administrando 200 pL/rato de soluções 50 mg/kg/10 mL e 25 mg/kg/10 mL, por via subcutânea. 40

As substâncias foram solubilizadas como se segue:

Heparina sódica: a solução é preparada por solubilização de 160 mg de pó em 4 mL de PBS lx isento de Ca++ e Mg++, pH 7,4; é subdividida em aliquotas de 243 pL e armazenada a -20 °C. Na altura do tratamento, a solução é diluida em PBS lx isento de Ca++ e Mg++ (Dulbecco, fórmula modificada), pH 7,4, de forma a ter a substância em concentrações finais de 50 mg/kg/10 mL e 25 mg/kg/10 mL. ST1514: a solução é preparada por solubilização de 160 mg de pó em 4 mL de PBS lx isento de Ca++ e Mg++, pH 7,4; é subdividida em aliquotas de 243 pL e armazenada a -20 °C. Na altura do tratamento, a solução é diluida em PBS lx isento de Ca++ e Mg++ (Dulbecco, fórmula modificada) , pH 7 ,4, de forma a ter a substância em concentrações finais de 50 mg/kg/10 mL e 25 mg/kg/10 mL. 48 horas após a última administração das substâncias de teste, é retirada uma amostra de sangue para contagem do sangue total e análise hematológica.

Amostragem do sangue: os ratinhos são colocados numa caixa fechada hermeticamente, para a qual é insuflado CO2, numa quantidade suficiente para atordoar o animal. O sangue é retirado do plexo retro-orbital de cada animal (aproximadamente 1 mL de sangue/rato) que é distribuído em quantidades de 0,4 mL de sangue/rato em tubos de ensaio Eppendorf contendo 20 pL de heparina Vister (5000 U/mL), para realização da contagem do sangue total e da análise hematológica; e a mesma quantidade de sangue é distribuída noutros tubos Eppendorf contendo 50 pL de citrato de sódio a 3,8%, de forma a realizar determinações de 41 tempo de protrombina. Após a remoção da amostra de sangue, cada animal é sacrificado por deslocação cervical. Número de amostras: são retiradas 2 amostras de sangue/rato, com as quais são realizadas duas contagens do sangue total e são produzidas duas lâminas e uma amostra de plasma para serem armazenadas a -20 °C.

Contagem do sangue total: o dispositivo (Cell Analyzer 580 A, DELCON) é utilizado, de acordo com o procedimento padrão descrito no manual de operação. A amostra de sangue (25 pL) é tomada pelo diluidor e levada a um volume de 10 mL (dil. 1 :400) com solução isotónica (solução salina PLTA, DELCON). A partir desta solução (denominada solução A) , o diluidor retira automaticamente uma amostra de 100 pL e leva-a a um volume de 10 mL (dil. 1:100), obtendo-se assim a solução B. À solução A adicionam-se 3 gotas de Emosol (DELCON) para lise dos eritrócitos. Esta solução é utilizada para a leitura WBC. A solução B, por outro lado, é utilizada para as leituras RBC e de plaquetas (PLT). Cada amostra é lida em duplicado.

Os resultados obtidos serão analisados utilizando ANOVA.

Os grupos de animais tratados com heparina sódica, nas doses de 50 mg/kg/10 mL e 25 mg/kg/10 mL, apresentaram um hematoma marcado no sitio do inoculo; este fenómeno não ocorre nos grupos submetidos a tratamento com ST1514. As autópsias conduzidas nos animais de estudo revelaram que os grupos submetidos a tratamento com heparina sódica, em doses de 50 mg/kg/10 mL e 25 mg/kg/10 mL, apresentavam fígados com características anormais, enquanto esse fenómeno não é detectado nos grupos tratados com ST1514. 42

Os resultados relativos à análise hematológica mostram uma redução nos eritrócitos em ambos os grupos tratados com heparina sódica, nas doses de 50 mg/kg e 25 mg/kg, em comparação com o grupo de controlo, enquanto não é detectada essa diferença nos grupos tratados com ST1514. O grupo tratado com heparina sódica, na dose de 25 mg/kg, apresenta uma deficiência de plaquetas significativa, em comparação com o grupo de controlo. Nenhum dos grupos de tratamento em estudo apresenta diferenças significativas nos números de leucócitos, em comparação com o grupo de controlo.

Os exemplos que se seguem ilustram adicionalmente a invenção. EXEMPLO 1

Dissolve-se 1 g de heparina em 12,5 mL de NaOH e IN. A solução é aquecida e agitada a 60 °C durante 45 minutos. A reacção é bloqueada por arrefecimento rápido e neutralização. A solução é, então, aquecida a 70 °C, a pH 7, até o anel epóxido estar completamente aberto (a tendência da reacção é controlada por RMN) . A amostra dessulfatada (aqui denominada G2 999H) é dissolvida em 2 0 mL de água e arrefecida para 4 °C. Após a adição de 2 0 mL de uma solução de NaI04 a 0,2 M, a solução é deixada em agitação no escuro durante 20 horas, e a reacção é parada por adição de etilenoglicol e os sais são eliminados por ultrafiltração tangencial. Adicionam-se 400 mg de NaBH4, subdivididos em várias porções, à solução dessalinizada (30-40 mL) . A solução é deixada em agitação durante 3 horas à 43 temperatura ambiente, em seguida neutralizada com HC1 diluído e dessalinizada por ultrafiltração tangencial. Obtêm-se 710 mg de produto, aqui denominado ST1514. Peso molecular (MW) : 11200 D, índice de polidispersão D 1,3, grau de dessulfatação 1,9 (expresso como razão molar S03_:C00“); a percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais é de aproximadamente 50%. O composto foi caracterizado por meio de espectroscopia de RMN (Figura 1). EXEMPLOS 2-4

Adoptando o mesmo procedimento que no exemplo 1, com a excepção de a solução básica ter sido aquecida durante 15, 30 e 60 minutos, respectivamente, obtiveram-se compostos com as características seguintes: ST1513: peso molecular (MW) 12900 D, índice de polidispersão D 1,5, grau de dessulfatação 2,05 (expresso como razão molar SCg-rCOO-), percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos (divisão); ST1516: peso molecular (MW) 12900 D, índice de polidispersão D 1,5, grau de dessulfatação 1,8 (expresso como razão molar S03~:C00-), percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos (divisão); 44 ST1515: peso molecular (MW) 9200 D, índice de polidispersão D 1,5, percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 11% de grupos epóxido, 27,5% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos (divisão).

Lisboa, 6 de Fevereiro de 2007 45

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Derivado de glicosaminoglicano 2-O-dessulfatado, particularmente uma heparina 2-O-dessulfatada, com um grau de 2-O-dessulfatação não superior a 60% do total de ácidos urónicos, cujo anel glicósido foi submetido a divisão de glicol.
2. 2. Derivado de acordo com a reivindicação 1, que é um glicosaminoglicano do tipo heparina.
3. 3. Derivado de heparina dessulfatada, de acordo com a reivindicação 1, que é uma heparina modificada contendo resíduos glicosamina, com diferentes graus de N-dessulfatação e N-acetilação, total ou parcial subsequente, opcional.
4. 4. Derivado de heparina dessulfatada, de acordo com a reivindicação 1, que tem a seguinte fórmula (I):

   em que o anel U tem o significado seguinte: 1 -Ο X X υ X e X' , que podem ser iguais ou diferentes, são um grupo aldeído ou 0 grupo -CH2-D, em que D é hidroxilo ou um aminoácido, um péptido ou um resíduo de um hidrato de carbono ou oligossacárido; R e Ri, que podem ser iguais ou diferentes, são um resíduo SO3 ou acetilo; nem, que podem ser iguais ou diferentes, podem variar desde 1 a 40; a soma de n+m varia desde 6 a 40; a razão m:n varia desde 10:2 a 1:1. O símbolo indica Ljue as unidades marcadas com m e n estão distribuídas estatisticamente ao longo da cadeia de polissacárido e não estão, necessariamente, em sequência.
5. 5. Derivado de acordo com a reivindicação 4 que é heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, com um peso molecular (MW) de 11200 D, um índice de polidispersão de 1,3, um grau de dessulfatação de 1,99 (expresso como a razão molar S03_:C00”), uma percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais de, aproximadamente, 50%.
6. 6. Derivado de acordo com a reivindicação 4 que é heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, com um peso molecular (MW) de 12900 D, um índice de polidispersão de 1-5, um grau de dessulfatação de 2,05 (expresso como a razão molar 2 S03~:C00“), percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos. Derivado de acordo com a reivindicação 4 que é heparina parcialmente 2-0-dessulfatada, com um peso molecular (MW) de 11000 D, um indice de polidispersão de 1,5, um grau de dessulfatação de 1,93 (expresso como a razão molar SCç” :COO”) , percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos. Derivado de acordo com a reivindicação 4 que é heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, com um peso molecular (MW) de 9200 D, um índice de polidispersão de 1,5, um grau de dessulfatação de 1,93 (expresso como a razão molar SCd- :COO~), percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais: 11% de grupos epóxido, 27,5% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos. Processo para a preparação de derivados de acordo com as reivindicações 1-8, compreendendo os passos seguintes: a) tratamento básico, a uma temperatura variando desde a temperatura ambiente a 100 °C, de um modo preferido desde 50 a 70 °C, e, de um modo ainda mais preferido, a 65 °C, o que conduz à eliminação de uma percentagem controlada de grupos sulfato na posição 2 do ácido idurónico e à formação de grupos epóxido; e, b) abertura do referido anel epóxido a pH 7, a uma temperatura variando desde 50 °C a 100 °C, de um modo 3 preferido, a 70 °C, para originar resíduos de ácido galacturónico; ou, em alternativa, c) abertura do dito anel epóxido a uma temperatura variando desde 0 °C até 30 °C, de um modo preferido, a 25 °C, para originar residuos de ácido idurónico; e d) oxidação dos dióis com periodato de sódio, para originar a abertura do anel glicósido e a formação de dois grupos aldeido, por residuo modificado; e) redução dos ditos grupos aldeido ao álcool primário e, se desejado, transformação do grupo D num grupo diferente de hidroxilo, tal como considerado nos diferentes significados de acordo com a reivindicação 4; f) hidrólise ácida opcional para se obterem oligossacáridos correspondentes às sequências regulares, ou, em alternativa, g) hidrólise enzimática parcial, com uma enzima seleccionada do grupo constituído por liase, heparinase, heparitinase, ou equivalente de produtos obtidos no passo e) , para originar oligossacáridos, de um modo preferido tetra- ou octassacáridos, com o resíduo terminal não redutor consistindo em ácido idurónico insaturado, o resíduo redutor consistindo numa N-sulfoglucosamina e contendo, pelo menos, um resíduo de ácido idurónico aberto; ou, em alternativa, h) o composto obtido no passo a), ou o produto obtido no passo b), é tratado por hidrólise enzimática parcial; e, se desejado, 4 i) sujeição dos produtos obtidos num dos passos a), b) e e) a 6-0-dessulfatação parcial/ ou, em alternativa, j) sujeição da heparina de partida, parcialmente ou totalmente 6-dessulfatada, aos passos a), b) e e).
7. 10. Heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenivel pelo processo de acordo com a reivindicação 9, em que o passo a) é realizado durante 45 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e possuindo um peso molecular (MW) de 11200 D, um indice de polidispersão de 1,3, um grau de dessulfatação de 1,99 (expresso como a razão molar de S03”:C00”), percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais de, aproximadamente, 50%.
8. 11. Heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenivel pelo processo de acordo com a reivindicação 9, em que o passo a) é conduzido durante 15 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e com um peso molecular (MW) de 12900 D, um índice de polidispersão de 1,5, um grau de dessulfatação de 2,05 (expresso como a razão molar S03~:C00-), percentagem de ácidos urónicos modificados, em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de resíduos urónicos oxidados e reduzidos.
9. 12. Heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenível pelo processo de acordo com a reivindicação 9, em que o passo a) é conduzido durante 30 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e com um peso molecular (MW) de 11000 D, um índice de polidispersão de 1,5, um grau de dessulfatação de 5 1,80 (expresso como a razão molar S03~:C00~), percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 5% de grupos epóxido, 29% de residuos urónicos oxidados e reduzidos.
10. 13. Heparina parcialmente 2-O-dessulfatada, obtenível pelo processo de acordo com a reivindicação 9, em que o passo a) é conduzido durante 60 minutos, a 60 °C, e o passo b) a 70 °C, a pH 7, e com um peso molecular (MW) de 9200 D, um indice de polidispersão de 1,5, percentagem de ácidos urónicos modificados em comparação com os ácidos urónicos totais: 11% de grupos epóxido, 27,5% de residuos urónicos oxidados e reduzidos.
11. 14. Misturas de oligossacáridos com actividade antiangiogénica, obteníveis a partir da degradação ácida de compostos de acordo com as reivindicações 4-8.
12. 15. Misturas de oligossacáridos com actividade antiangiogénica, obteníveis a partir do passo f) do processo de acordo com a reivindicação 9.
13. 16. Misturas de oligossacáridos com actividade antiangiogénica, obteníveis a partir do passo g) do processo de acordo com a reivindicação 9.
14. 17. Misturas de oligossacáridos com actividade antiangiogénica, obteníveis a partir do passo h) do processo de acordo com a reivindicação 9. 6 18. Misturas de oligossacáridos com actividade antiangiogénica, obteníveis a partir do passo i) do processo de acordo com a reivindicação 9.
15. 19. Composições farmacêuticas contendo, pelo menos, um composto de acordo com as reivindicações 1-8 e 10-18, como ingrediente activo, em mistura com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
16. 20. Utilização de compostos de acordo com as reivindicações 1-8 e 10-18, como medicamentos.
17. 21. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento com actividade antiangiogénica.
18. 22. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento de estados patológicos devidos a angiogénese anormal.
19. 23. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumores, opcionalmente associados com metástases.
20. 24. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento de metástases tumorais.
21. 25. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento da retinopatia diabética. 7
22. 26. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento da fibroplasia retrolenticular.
23. 27. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento da psoriase.
24. 28. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento da restenose após "by-pass" coronário. Lisboa, 6 de Fevereiro de 2007 8