ES2277911T3 - Derivados de glicosaminoglicanos dotados con actividad antiangiogenica y desprovistos de efecto anticoagulante. - Google Patents
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Abstract
Un derivado de glicosaminoglicano 2-O-desulfatado, particularmente una heparina 2-O-desulfatada, con un grado de 2-O-desulfatación no mayor que 60% del total de ácidos urónicos, cuyo anillo glicósido ha sido sometido a ruptura de glicol.
Description
Derivados de glicosaminoglicanos dotados con
actividad antiangiogénica y desprovistos de efecto
anticoagulante.
La invención descrita en este documento se
refiere a derivados de glicosaminoglicanos parcialmente
desulfatados, particularmente heparinas, a procedimientos para su
preparación, a su uso como ingredientes activos para la preparación
de medicamentos con actividad antiangiogénica, particularmente para
el tratamiento de tumores, tales como, por ejemplo, las formas
metastáticas, y a composiciones farmacéuticas que los contienen.
Henry Brem y Judah Folkman descubrieron en 1975
la primera molécula con actividad antiangiogénica en el cartílago.
A partir de ese año, se descubrieron más de 300 nuevas moléculas
capaces de inhibir la angiogénesis.
A principios de la década del ochenta, con el
descubrimiento del interferón (\alpha/\beta) como inhibidor de
angiogénesis tumoral, se inició la experimentación clínica basada en
este enfoque terapéutico.
El 3 de Marzo de 1998 los medios causaron
bastante agitación cuando el New York Times publicó la noticia de
que dos moléculas, angiostatina y endostatina, descubiertas en los
laboratorios de J. Folkman en Harvard Medical School y en
Children's Hospital en Boston, estaban dando resultados prometedores
en la lucha contra el cáncer. El alto grado de eficacia de estas
dos moléculas para inhibir la angiogénesis estimuló sustancialmente
la búsqueda de nuevos compuestos. Actualmente, existen
aproximadamente treinta moléculas dotadas con actividad anticáncer
que actúan por medio de un mecanismo antiangiogénico, que han
entrado en etapas de ensayos clínicos [Fases I-III]
y están involucradas prácticamente la misma cantidad de compañías e
instituciones.
Se estima que sólo en los Estados Unidos hay
aproximadamente 9 millones de pacientes que podrían beneficiarse
del tratamiento antiangiogénico. Actualmente, al menos 4.000
pacientes han sido enrolados en ensayos clínicos usando este
tratamiento sin que se haya registrado ningún efecto indeseado en
particular.
Dentro del marco del concepto general de
angiogénesis deberíamos distinguir entre vasculogénesis, esto es la
formación de vasos sanguíneos durante el desarrollo embrionario y
angiogénesis en el sentido estricto del término, significando la
formación de vasos sanguíneos nuevos (capilares) durante la vida
posterior al nacimiento comenzando a partir de vasos preexistentes.
La importancia de la angiogénesis para el crecimiento de tumores
sólidos está ampliamente documentada. Durante las tres décadas
pasadas se ha informado que el crecimiento tumoral, así como la
formación de metástasis, son estrictamente dependientes del
desarrollo de vasos nuevos capaces de vascularizar la masa
tumoral.
La inhibición de la angiogénesis es la base de
la formación de masas necróticas dentro del tumor o la inducción de
la apoptosis en las células tumorales.
Existen diferencias bien definidas entre la
neovascularización en tejido normal y la que se produce en tejido
tumoral. En la primera, el endotelio vascular representa un tejido
quiescente con un índice mitótico muy bajo de sus células
constituyentes (tiempo de renovación medido en cientos de días), y
la red vascular es regular, relativamente uniforme y apropiada para
oxigenar adecuadamente todos los tejidos, sin ninguna conexión
arteriovenosa. En el tejido tumoral, por otro lado, la estimulación
de proliferación de células endoteliales da lugar a un índice
mitótico alto en el último (tiempo medio de renovación de 5 días),
la neovascularización es distintivamente irregular con áreas de
oclusión, a veces con extremos obturados, con contactos
arteriovenosos en algunos puntos y, finalmente, la membrana basal
presenta brechas, que en algunos puntos llevan a la hipoxia tisular.
Estas diferencias ofrecen la oportunidad de identificar fármacos
que bloquean selectivamente la neovascularización del tumor.
En un tumor, la revascularización no siempre
coincide con una etapa precisa del desarrollo del tumor, existen,
de hecho, casos en los que la angiogénesis comienza incluso previo
al desarrollo del tumor (por ejemplo, en el carcinoma de cuello
uterino), otros en los que las dos fases son coincidentes (por
ejemplo, carcinoma de vejiga y mama) y otros en los que la
angiogénesis comienza tras el neoplasma (por ejemplo, melanoma y
carcinoma de ovario; ver, por ejemplo, "Manual of Medical
Oncology", ed. IV (1991) G. Bonadonna y col.
El tratamiento antiangiogénico presenta
numerosas ventajas en comparación con la quimioterapia estándar
tradicional (Cancer Research 1998, 58,
1408-16):
a) especificidad: su blanco es un proceso, es
decir la neovascularización tumoral;
b) biodisponibilidad: su blanco son las células
endoteliales, que pueden alcanzarse fácilmente sin los problemas de
la quimioterapia tradicional que actúa directamente en las células
tumorales;
c) quimiorresistencia: ésta es tal vez la
ventaja más importante de este tratamiento, de hecho, dado que las
células endoteliales, a diferencia de las células tumorales, son
genéticamente estables, es improbable que se produzcan fenómenos de
resistencia a fármacos;
d) propagación metastática: el bloqueo de la
neovascularización limita la propagación de las células tumorales
hacia otras partes del cuerpo vía torrente sanguíneo;
e) apoptosis: el bloqueo de la red vascular en
el tumor reduce el suministro de oxígeno y nutrientes a las células
tumorales; la apoptosis está favorecida en estas condiciones;
f) toxicidad sistémica reducida: los efectos
tóxicos, tales como mielosupresión, efectos gastrointestinales y
pérdida temporaria del cabello, que están presentes prácticamente
invariablemente con la quimioterapia tradicional, no se observan
con el tratamiento antiangiogénico.
Se sabe que una cantidad de elementos
moleculares están involucrados en la angiogénesis en tumores
(Oncology 1997, 54, 177-84). Se sabe que existen
factores pro y antiangiogénicos involucrados en el mecanismo
biológico regulador en la formación de vasos nuevos.
Entre los estimuladores angiogénicos deberíamos
mencionar: factores de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de
crecimiento vascular endotelial (VEGF), angiogenina, factor de
crecimiento transformador \alpha (TNF\alpha), factor de
crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas, factor de
crecimiento transformador \beta, un inhibidor in vitro,
pero estimulador in vivo, factor de crecimiento placentario,
interleuquina 8, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, factores estimulantes de colonias
de granulocitos, proliferina, las prostaglandinas PGE_{1},
PGE_{2}), GM1-GT1b, sustancia P, las bradiquininas
y óxido nítrico.
En contraste, los inhibidores de la angiogénesis
incluyen: el receptor soluble de bFGF, los interferones (\alpha,
\beta, \gamma), angiostatina, trombospondina 1, prolactina
(fragmento amino terminal de 16 kDa), factor plaquetario 4 (PF4),
los inhibidores de metaloproteinasa tisular (TIMP), péptido
placentario relacionado con proliferina, factor de inhibición de
angiogénesis derivado de glioma, los esteroides angiostáticos,
inhibidor derivado de cartílago (CDI), las heparinasas,
interleuquina 12, inhibidor del activador de plasminógeno, los
retinoides, endostatina, angiopoyetina 2, genisteína, óxido nítrico
y GM3.
Las integrinas son una gran familia de proteínas
transmembrana que median las interacciones
célula-célula y célula-matriz
extracelular. Todas las integrinas son capaces de reconocer una
secuencia de péptidos común
Arg-Gly-Asp ("sitio de
reconocimiento celular universal"), aunque cada integrina
reconoce de preferencia una conformación diferente de este
tripéptido. La inhibición de subtipos específicos de integrinas
puede resultar también de gran interés desde el punto de vista
farmacológico para el desarrollo de inhibidores de angiogénesis.
El control de proteína quinasa C
(PK-C) puede también permitir la regulación de la
angiogénesis. De hecho, existen inhibidores clásicos de
PK-C capaces de bloquear completamente o
parcialmente la angiogénesis.
A pesar de las enormes inversiones y de la gran
cantidad de centros de investigación institucionales y privados
involucrados, el problema del cáncer en el mundo está lejos de una
solución definitiva. Aunque la prognosis de las víctimas del cáncer
ha mejorado, con tasas de supervivencia elevándose durante los
pasados 30 años en promedio desde un 30 hasta un 50%, y con el
actual conocimiento de los mecanismos genéticos, celulares y
bioquímicos involucrados en el desarrollo de un tumor, la
posibilidad de derrotar o al menos limitar este tipo de patologías
es aún un problema con una profunda preocupación y muchos aspectos
están todavía sin resolver, tales como la probabilidad de
recurrencia, remisión completa y propagación metastática del tumor
primario.
Desde finales de los años setenta, cuando las
observaciones de Folkman comenzaron a confirmarse por la comunidad
científica internacional, se aislaron cientos de moléculas dotadas
con actividad antiangiogénica a partir de fuentes naturales
(plantas, hongos, fluidos biológicos) y se sintetizaron en el
laboratorio.
Una cantidad de fármacos están ya en Fase III,
tales como Marimastat (British Biotech.), I'AG3340
(Prinomast-Agouron) y Neovastat (Aeterna), todos
ellos actúan principalmente a nivel pulmonar (SNCL) con un mecanismo
que incluye la interferencia con las metaloproteinasas. RhuMad VEGF
(éste es un anticuerpo anti-VEGF de Genetech) e
interferón \alpha también están en Fase III, los que son activos
contra tumores sólidos gracias a su interferencia con factores de
crecimiento proangiogénicos, o TNP-470 (TAP Pharm.)
que actúa directamente en las células endoteliales. Por último, los
fármacos como CAI (NCI) y IM862 (Cytran) son activos como agentes
antiangiogénicos pero con un mecanismo no específico y muy poco
conocido.
Estos fármacos mencionados anteriormente podrán,
en pocos años, formar parte del armamento terapéutico del oncólogo,
pero existen otras moléculas que se han insertado recientemente en
ensayos clínicos en Fase I/II tales como Combretastatin (OxiGene),
metoxi-estradiol y endostatina (EntreMed), que en
base a estudios preclínicos son muy promisorios. En esta estrategia
terapéutica están involucradas compañías tales como Bristol
Myers-Squibb (con BMS-275291),
Novartis (con CGS27023A) o Parke-Davis (con
Suramin).
La heparina es una mezcla heterogénea de
polisacáridos naturales de diversas longitudes y diversos grados de
sulfatación que posee actividad anticoagulante y es secretada por
las células cebadas del tejido conectivo presentes en el hígado
(desde las que fue aislada por primera vez), en los músculos,
pulmones, timo y bazo.
Además de la secuencia regular, se identificó en
la heparina una secuencia correspondiente al sitio activo para la
actividad antitrombina.
La actividad antitumoral y antimetastática de la
heparina y sus derivados es debida a su capacidad para inhibir la
heparanasa, bloquear los factores de crecimiento y regular la
angiogénesis.
Los heparán sulfatos (HS) son ligandos de
proteínas ubicuos. Las proteínas se unen a las cadenas de HS para
una diversidad de acciones desde la simple inmovilización o
protección contra la acción de degradación proteolítica hasta la
modulación de actividades biológicas, tal como la angiogénesis.
El esqueleto de carbohidratos, tanto en heparina
como en heparán sulfatos (HS), consiste en una alternancia de
D-glucosamina (GlcN) y ácidos hexurónicos (Glc.A o
IdO.A.).
En la heparina, los residuos GlcN son
principalmente N-sulfatados, mientras que en HS son
N-sulfatados y N-acetilados, con
una pequeña cantidad de N- no sustituidos.
HS está también en promedio menos
O-sulfatado que la heparina.
El uso de heparina en el tratamiento de
trastornos con angiogénesis, tales como tumores, particularmente
metástasis, está sustancialmente limitado por la actividad
anticoagulante de la heparina.
Se han hecho modificaciones químicas a la
heparina para reducir su capacidad anticoagulante, preservando al
mismo tiempo sus propiedades antitumorales.
La apertura de una unidad de ácido glucurónico
en el sitio antitrombina reduce la afinidad de la heparina por la
antitrombina: de esta manera, pueden usarse las heparinas con
efectos anticoagulantes reducidos, pero aún con propiedades
antiangiogénicas.
Las "heparanasas" son enzimas que
pertenecen a la familia de las endoglicosidasas que hidrolizan los
enlaces glicósido internos de las cadenas de heparán sulfatos (HS)
y heparina.
Estas endoglicosidasas están involucradas en la
proliferación de células tumorales, en metástasis y en la
neovascularización de tumores. Esto sugiere que también pueden estar
involucradas en la angiogénesis tumoral como resultado de la
liberación, desde la matriz extracelular, de factores de crecimiento
unidos a heparina, tales como aFGF (también llamado
FGF-1), bFGF (también llamado FGF-2)
y VEGF.
Estas enzimas son blancos biológicos para la
actividad antiangiogénica. En la bibliografía científica existe una
gran cantidad de estudios de correlación estructura/actividad (ver,
por ejemplo, Lapierre F. y col., Glycobiology, volumen 6, (3),
355-366, 1996). Aunque muchos aspectos aún tienen
que ser clarificados, se informaron estudios relacionados con la
inhibición de heparanasas por heparina y sus derivados, usando
pruebas específicas que condujeron a la aparición de
consideraciones de un tipo estructural que puede servir como guía
para obtener derivados nuevos, más selectivos.
En el trabajo mencionado anteriormente de
Lapierre y col., se describen derivados de heparina obtenidos por
2-O desulfuración o por "ruptura de glicol"
(oxidación con peryodato y subsiguiente reducción con borohidruro
de sodio). Estos derivados, definidos aquí como "heparina
2-O-desulfatada" o
RO-heparina, respectivamente, mantienen en parte la
actividad antiangiogénica de la heparina como se evalúa por medio de
la prueba CAM en presencia de corticoides, como se informa en la
Tabla III (ibid. página 360).
Los FGFs regulan múltiples procesos fisiológicos
tales como crecimiento y diferenciación celular, pero también
funciones involucradas en procesos patológicos tal como la
angiogénesis en tumores.
Los FGFs son factores de crecimiento (una
familia de más de 10 polipéptidos, de los que los FGF ácidos
(FGF-1) y los básicos (FGF-2) son
los que han sido más estudiados, que requieren un cofactor
polisacárido, heparina o HS, para unirse al receptor de FGF (FGFR)
y activarlo.
Aunque se desconoce el mecanismo preciso por el
cual heparina y HS activan FGFs, se sabe, sin embargo, que
heparina/FGF/FGFR forman un complejo "trimolecular" o
"ternario".
Un mecanismo postulado es que heparina y HS
inducen la dimerización llamada sándwich de FGF, y el último, así
dimerizados, forman un complejo estable con FGFR.
La capacidad de un tumor primario para generar
células metastáticas es tal vez el principal problema que enfrenta
el tratamiento anticáncer.
Los derivados de heparina con una capacidad
sustancial para bloquear la heparanasa parecen ser igualmente
capaces de inhibir la angiogénesis tanto en tumores primarios como
en metástasis.
Además, la inhibición de heparanasa reduce la
capacidad de migración de las células tumorales desde el tumor
primario hacia otros órganos.
La siguiente tabla brinda un ejemplo de
correlación estructura/actividad antimetastática en el caso de
heparina:
Los datos en esta tabla sugieren que fragmentos
muy cortos de heparina están aún dotados con buena actividad
antimetastática, mientras que esta actividad está reducida cuando el
grupo amina de la glucosamina está unido al ácido succínico.
Los requisitos estructurales de las moléculas
similares a heparina que favorecen la acción inhibidora de
angiogénesis pueden agruparse en dos categorías sobre la base del
blanco que se intenta bloquear:
a) bloqueo de heparanasa, una enzima que
hidroliza los enlaces glicósido de heparán sulfatos, liberando
factores de crecimiento.
Con este fin los compuestos similares a heparina
de preferencia comprenden secuencias de al menos ocho unidades de
monosacáridos que contienen ácido
N-acetil-glucosamina-glucurónico
(o glucosamina N-sulfatada) (ver, por ejemplo, D.
Sandback-Pikas y col. J. Biol. Chem., 273,
18777-18780 (1998) y las referencias citadas).
b) bloqueo de factores de crecimiento
angiogénico (de tipo fibroblasto: FGF-1 y
FGF-2; de tipo endotelio vascular: VEGF; de tipo
permeabilidad vascular: VPF).
Con este fin los compuestos similares a heparina
de preferencia tienen secuencias con longitud de al menos cinco
unidades de monosacáridos, que contienen ácido idurónico
2-sulfatado y glucosamina
N,6-sulfatada (ver, por ejemplo, M. Maccarana y
col. J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).
En la bibliografía se describen pequeños
péptidos (5-13 aminoácidos) con actividad
antiangiogénica (Patente de EEUU Nº 5.399.667 de la Universidad de
Washington) que actúan uniéndose a un receptor de trombospondina, o
péptidos mayores (de aproximadamente 50 aminoácidos).
Se conocen factores plaquetarios modificados
-(Documento EP 0 589 719, Lilly), capaces de inhibir la
proliferación endotelial, con CI_{50} = 7 nM.
Se han descrito ampliamente también fragmentos
de oligosacáridos con actividad antiangiogénica: se encontró, de
hecho, que variando la secuencia de carbohidratos puede aumentarse
la selectividad de interacción.
Además, puede usarse heparina como un vehículo
para sustancias que son por sí mismas antiangiogénicas, tales como
algunos esteroides, explotando la afinidad de la heparina por las
células endoteliales vasculares; ver, por ejemplo el documento WO
93/18793 de la Universidad de Texas e Imperial Cancer Research
Technology, donde se reivindican las heparinas con conectores
lábiles a ácidos, tales como hidrazina de ácido adípico, unida a
cortisol. El efecto antiangiogénico de las moléculas conjugadas es
mayor que el de las moléculas sin conjugar, incluso cuando se
administran de manera simultánea.
En Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310,
86-96, se describen heparinas unidas a esteroides
(por ej., cortisol) con un grupo hidrazona en C-20
que presenta mayor actividad antiangiogénica que las dos moléculas
sin conjugar.
El documento EP 0 246 654 de Daiichi Sc.
describe polisacáridos sulfatados con actividad antiangiogénica con
estudios de Fase II.
El documento EP 0 394 971 de Pharmacia &
Upjohn - Harvard Coll. describe fragmentos de
heparina-hexasacári-
dos - con baja sulfatación, capaces de inhibir el crecimiento de células endoteliales y angiogénesis estimulada por (FGF-1).
dos - con baja sulfatación, capaces de inhibir el crecimiento de células endoteliales y angiogénesis estimulada por (FGF-1).
El documento EP 0 618 234 de Alfa Wasserman
describe un procedimiento para preparar glicosaminoglicanos
semisintéticos con una heparina o estructura de heparán llevando un
grupo nucleófilo.
El documento WO 95/05182 de Glycomed describe
diversos oligosacáridos sulfatados con actividad anticoagulante,
antiangiogénica y antiinflamatoria.
La Patente de EEUU Nº 5.808.021 de Glycomed
describe un procedimiento para preparar heparina desulfatada
2-O, 3-O sustancialmente no
despolimerizada con un porcentaje de desulfuración en posiciones 2-
del ácido idurónico (I, 2-O) y en posición 3 de la
unidad glucosamina (A, 3-O) variando desde
aproximadamente 99 hasta aproximadamente 75% del porcentaje
original. Este procedimiento concibe realizar la desulfuración en
presencia de un catión de un metal bivalente, ejemplificado por
calcio o cobre, seguida por liofilización del producto obtenido.
Las heparinas desulfatadas tienen actividad antiangiogénica.
El objetivo de la invención descrita en este
documento es encontrar estructuras de glicosaminoglicanos óptimas
para generar actividad antiangiogénica basada en mecanismos de
inhibición de heparanasa y/o inhibición de factores de crecimiento
FGF. Un objetivo adicional de la invención descrita en este
documento es proveer un medicamento con actividad antiangiogénica
que carece esencialmente de los efectos colaterales típicos de los
derivados de heparina, tal como, por ejemplo, la actividad
anticoagulante.
Se ha descubierto recientemente que sometiendo
un glicosaminoglicano, tal como un glicosaminoglicano similar a
heparina, heparina o heparina modificada, que contiene residuos
glucosamina con diferentes grados de N-desulfatación
y subsiguiente N-acetilación total o parcial
opcional, a un tratamiento controlado de
2-O-desulfatación de las unidades
de idurónico hasta un grado de desulfatación no mayor que 60% del
total de sus unidades urónicas, y posterior apertura de un anillo
de glicósido por escisión del glicol, se mantienen las propiedades
angiogénicas de unión al factor de crecimiento. Sorprendentemente,
estas heparinas 2-O-desulfatadas a
no más de 60% del total de sus unidades urónicas totales son
marcadamente antiangiogénicas.
La desulfatación llevada a cabo en las
condiciones descritas en la presente invención también produce la
formación de unidades de idurónico con un anillo oxiránico en
posición 2,3. La apertura del anillo oxiránico en las condiciones
descritas en la presente invención da lugar a unidades
L-idurónico o L-galacturónico.
Es un objetivo de la invención descrita en este
documento un derivado de glicosaminoglicano
2,0-desulfatado, particularmente una heparina
2,0-desulfatada, parcialmente sulfatada
selectivamente con un grado de desulfatación no mayor que el 60%
del total de unidades urónicas cuyo anillo de glucósido ha sido
sometido a escisión del glicol; estas brechas de desulfatación
reducen la longitud de las secuencias normales constituidas por la
sucesión de unidades de disacáridos trisulfato.
En una forma de realización particular, la
invención descrita en este documento se refiere a un compuesto de
fórmula (I)
en la que el anillo U tiene el
siguiente
significado:
X y X', que pueden ser iguales o diferentes, son
un grupo aldehído o el grupo CH_{2}-D, en el que D
es hidroxi o un aminoácido, un péptido o un residuo de un
carbohidrato u oligosacárido;
R y R_{1}, que pueden ser iguales o
diferentes, son un residuo SO_{3} o acetilo;
n y m, que pueden ser iguales o diferentes,
pueden variar desde 1 hasta 40; la suma de n+m varía desde 6 hasta
40; la relación m:n varía desde 10:2 hasta 1:1. De preferencia, m es
mayor o igual que n. De preferencia n varía desde 40 hasta 60% de la
suma m+n. El símbolo 100 indica que las unidades
marcadas m y n están distribuidas estadísticamente a lo largo de la
cadena de polisacáridos y no están necesariamente en secuencia.
Los compuestos que son el tema de la invención
descrita en este documento, tienen propiedades antiangiogénicas
interesantes, y son por lo tanto útiles como ingredientes activos
para la preparación de medicamentos para el tratamiento de
patologías basadas en angiogénesis anormal, y particularmente para
el tratamiento de metástasis.
De manera ventajosa, los compuestos de acuerdo
con la invención presentan propiedades anticoagulantes reducidas,
ni no inexistentes, por ello evitan o reducen los efectos
colaterales típicos de las heparinas. Otra ventaja proviene del
hecho de que los compuestos de acuerdo con la invención pueden
caracterizarse con técnicas analíticas instrumentales, tal como
espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), permitiendo
así el control de proceso que es absolutamente deseable desde el
punto de vista industrial.
También en el caso de heparinas modificadas, el
peso molecular (PM) tiene una función muy importante cuando se
producen inhibidores de angiogénesis. Es bien sabido, de hecho, que
una reducción en el peso molecular (PM) hasta valores
correspondientes a unidades de pentasacáridos no lleva a la pérdida
de actividad antiangiogénica. Por el contrario, se ha establecido
que, más allá de cierta longitud, las cadenas de heparina favorecen
más que inhiben la dimerización y por ello la activación de
FGF.
Se entiende por grado de desulfatación el
porcentaje de ácidos idurónicos no sulfatados en relación con el
total de ácidos urónicos presentes originalmente en la heparina
inicial. Un intervalo inicial de preferencia para el porcentaje de
desulfatación es desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60%.
Dentro de los compuestos de fórmula (I) el compuesto de preferencia
es:
heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 11200, un índice de polidispersión D de 1,3, un
grado de desulfatación de 1,99 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), un porcentaje de ácidos urónicos
modificados comparado con el total de ácidos urónicos de
aproximadamente 50% (de aquí en adelante también llamado ST1514).
Dicho compuesto está comprendido en la fórmula (I) en el que, dentro
de otras definiciones correspondientes, m:n = 1:1 y las unidades
marcadas m y n están distribuidas a lo largo de la cadena de
polisacáridos de una manera regular, alternada.
Los compuestos de acuerdo con la invención
descritos en este documento se preparan por medio de un
procedimiento que comprende:
a) tratamiento básico a una temperatura que
varía desde temperatura ambiente hasta aproximadamente 100ºC, de
preferencia desde 50 hasta 70ºC y de más preferencia aún a
aproximadamente 65ºC, que lleva a la eliminación de un porcentaje
controlado de grupos sulfato en posición 2 del ácido idurónico y a
la formación de grupos epóxido; y si se desea
b) abrir dicho anillo epóxido a aproximadamente
pH 7, a una temperatura que varía desde aproximadamente 50ºC hasta
aproximadamente 100ºC, de preferencia a aproximadamente 70ºC, para
dar como resultado residuos de ácido galacturónico; o,
alternativamente
c) abrir dicho anillo epóxido a una temperatura
que varía desde aproximadamente 0ºC hasta 30ºC, de preferencia a
aproximadamente 25ºC, para dar como resultado residuos de ácido
idurónico y, si se desea
d) oxidación de los dioles con peryodato de
sodio, para dar como resultado la apertura del anillo glicósido y
la formación de dos grupos aldehído por residuo modificado;
e) reducción de dichos grupos aldehído a alcohol
primario y, si se desea, transformación del grupo D en un grupo
diferente de hidroxilo, como se prevé en diferentes significados
asignados en la fórmula (I)
f) hidrólisis ácida opcional para obtener
oligosacáridos correspondientes a las secuencias normales, o,
alternativamente
g) hidrólisis enzimática parcial con una enzima
seleccionada del grupo constituido por liasa, heparinasa,
heparitinasa, o equivalente de los productos obtenidos en la etapa
e) para dar como resultado oligosacáridos, de preferencia tetra- u
octasacáridos, con el residuo terminal no reductor constituido por
ácido idurónico no saturado, el residuo reductor constituido por
una N-sulfoglucosamina y conteniendo al menos un
residuo de ácido idurónico abierto o, alternativamente
h) el compuesto obtenido en la etapa a), o el
producto obtenido en la etapa b) se trata por medio de hidrólisis
enzimática parcial; y, si se desea
i) someter los productos obtenidos en una de las
etapas a), b) y e) a
6-O-desulfatación parcial; o,
alternativamente,
j) someter la heparina inicial parcial o
totalmente 6-desulfatada a las etapas a), b) y
e).
De acuerdo con la invención descrita en este
documento, el compuesto de preferencia es:
heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento descrito anteriormente, donde la etapa a) se
lleva a cabo durante 45 minutos a 60ºC y la etapa b) a 70ºC a pH 7,
y con un peso molecular (PM) de 11200, un índice de polidispersión
de 1,3, un grado de desulfatación de 1,99 (expresado como la
relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparado con el total de ácidos urónicos de
aproximadamente 50% (de aquí en adelante también llamado
ST1514);
Los pesos moleculares se determinaron por medio
de HPLC-GPC (cromatografía líquida de alto
rendimiento - cromatografía de penetración en gel). El grado de
desulfatación se determina por conductimetría y el porcentaje de
ácidos urónicos modificados por medio de
^{13}C-NMR.
PM es el peso molecular, y D es el índice de
polidispersión expresado como PM/Mn.
De acuerdo con la invención descrita en este
documento, los productos de inicio son glicosaminoglicanos de
diversos orígenes, de preferencia heparinas que se presentan
naturalmente. Es también posible usar heparinas químicamente
modificadas con un contenido por ciento de
N,6-desulfato en el intervalo desde 0 hasta 100%.
Comenzando a partir de productos con un contenido de glucosamina
6-O-desulfatada diferente, es
posible modular la longitud de las secuencias normales entre un
ácido idurónico abierto y otro. Los glicosaminoglicanos de acuerdo
con la invención que presentan apertura del anillo glicósido son
llamados convencionalmente por los expertos en el campo derivados
RO, significando con esto que el añillo glicósido ha sido abierto
por medio de una acción de oxidación, seguida por una reducción
(Reducción-Oxidación - RO). Esta apertura del anillo
glicósido también se llama convencionalmente "ruptura de
glicol", así llamada por la formación de los dos hidroxi
primarios presentes en el anillo abierto. Los compuestos a los que
se refiere este documento se llamarán también derivados "RO" o
"Ruptura de Glicol".
En otra forma de realización de la invención
descrita en este documento, los aldehídos e hidroxi primarios
derivados de la reacción de apertura descrita anteriormente
("ruptura de glicol") también llevan por sí mismos a la
funcionalización subsiguiente. Por lo tanto, los compuestos de
fórmula (I) pueden también llevar grupos iguales o diferentes, como
se definió anteriormente para X y X', en el hidroxi primario
derivado de la ruptura de glicol, por ejemplo, grupos
oligosacáridos o péptidos, variando desde un sacárido único o
aminoácido hasta más de una unidad de longitud, de preferencia 2 a
3 unidades.
Los compuestos de fórmula (I) en los que X y X'
son -CH_{2}OH pueden también usarse como vehículos para otros
tipos de fármacos, por medio de unión adecuada con la porción de
heparina que es capaz de proveer un enlace estable en condiciones
normales de producción y almacenamiento de un fármaco formulado, el
que, sin embargo, libera el fármaco transportado en el cuerpo, de
preferencia en proximidad del órgano blanco. Son ejemplos de
fármacos que pueden transportarse los fármacos antiinflamatorios no
esteroides, corticosteroides y otros fármacos con acción
antimetastática como resultado de la suma de las actividades
intrínsecas separadas del compuesto de acuerdo con la invención y
el agente antimetastático unido al mismo, con las ventajas
relacionadas con una mayor selectividad por el blanco y toxicidad
sistémica más baja. Son ejemplos de estos fármacos los inhibidores
de metaloproteinasas. Otros fármacos que pueden transportarse de
manera útil son aquellos que actúan a nivel endotelial. Los
compuestos de fórmula (I) donde X y X' son diferentes de hidroxi o
aldehído pueden también usarse como vehículos para fármacos, en
cuyo caso los grupos X y X' actuarán como "espaciadores" entre
la molécula transportada, esto es decir el glicosaminoglicano de la
presente invención y la molécula que actúa como vehículo, en
aquellos casos donde esto puede ser deseable por razones de
farmacocinética o farmacodinámica.
En el caso de compuestos de acuerdo con la
invención derivados de heparina, éstos se preparan comenzando a
partir de heparina en sí misma por medio de técnicas de
desulfatación conocidas por los técnicos expertos en el campo. Por
ejemplo, la desulfatación se realiza en presencia de agentes
alcalinos, tal como hidróxido de sodio, a temperaturas que varía
desde temperatura ambiente hasta 100ºC, de preferencia desde 50
hasta 70ºC, por ejemplo a 60ºC, durante un período de tiempo lo
suficientemente prolongado para obtener la desulfatación deseada.
La desulfatación se controla actuando sobre los parámetros del
procedimiento, tales como las concentraciones de reactivos, la
temperatura y los tiempos de reacción. Un ejemplo de preferencia
consiste en mantener concentraciones constantes de sustrato
(glicosaminoglicano) a 80 mg/ml y de NaOH a 1 M, una temperatura
constante de 60ºC y controlar la desulfatación con un tiempo de
reacción desde 15 hasta 60 minutos. El experto en el campo puede
variar las condiciones, por ejemplo elevando la temperatura de
reacción y acortando el tiempo de reacción, sobre la base de ensayo
y error normal en la práctica experimental y sobre la base de su
conocimiento general del tema.
El tratamiento con agentes alcalinos da lugar a
un producto intermedio caracterizado por la presencia de un anillo
epóxido en la unidad desulfatada. De una manera totalmente
sorprendente, estos productos intermedios probaron estar dotados de
propiedades antiangiogénicas similares a aquellos de los compuestos
de fórmula (I). Por lo tanto, otro objetivo de la invención
descrita en este documento es un derivado de heparina parcialmente
desulfatada, y por consiguiente heparina con una carga reducida,
particularmente heparina no desulfatada en más del 60%,
caracterizada por un anillo epóxido en el sitio de desulfatación.
Dichos compuestos caracterizados por un anillo epóxido también
pertenecen a objetivos abarcados por la presente invención, esto es
decir las composiciones farmacéuticas que los contienen y su uso
para la preparación de medicamentos con actividad
antiangiogénica.
Los siguientes son los compuestos de
preferencia:
heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 12900 D, un índice de polidispersión D de 1,5, un
grado de desulfatación de 2,05 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), un porcentaje de ácidos urónicos
modificados comparado con el total de ácidos urónicos: 5% grupos
epóxido, 29% grupos urónico oxidados y reducidos (de aquí en
adelante también llamado ST1513);
heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 11000 D, un índice de polidispersión D de 1,5, un
grado de desulfatación de 2,05 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos
modificados comparado con el total de ácidos urónicos: 5% grupos
epóxido, 29% residuos urónico oxidados y residuos urónico
reducidos;
heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 9200 D, un índice de polidispersión D de 1,5,
porcentaje de ácidos urónicos modificados comparado con el total de
ácidos urónicos: 11% grupos epóxido, 27,5% residuos urónico
oxidados y reducidos.
En una de las formas de realización posibles de
la invención descrita en este documento, los siguientes son los de
preferencia:
heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento descrito anteriormente, donde la etapa a) se
lleva a cabo durante 15 minutos a 60ºC y la etapa b) a 70ºC a pH 7,
y con un peso molecular (PM) de 12900 D, un índice de
polidispersión D de 1,5, un grado de desulfatación de 2,05
(expresado como la relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}),
porcentaje de ácidos urónicos modificados comparado con el total de
ácidos urónicos: 5% grupos epóxido, 29% residuos urónico oxidados y
reducidos (de aquí en adelante llamado ST1513);
heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento descrito anteriormente, donde la etapa a) se
lleva a cabo durante 30 minutos a 60ºC y la etapa b) a 70ºC a pH 7
(de aquí en adelante llamado ST1516), y con un peso molecular (PM)
de 11000 D, un índice de polidispersión de 1,5, un grado de
desulfatación de 1,8 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparado con el total de ácidos urónicos: 5% grupos epóxido, 29%
residuos urónico oxidados y reducidos;
heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento descrito anteriormente, donde la etapa a) se
lleva a cabo durante 60 minutos a 60ºC y la etapa b) a 70ºC a pH 7,
y con un peso molecular (PM) de 9200, un índice de polidispersión D
de 1,5, porcentaje de ácidos urónicos modificados comparado con el
total de ácidos urónicos: 11% grupos epóxido, 27,5% residuos
urónicos oxidados y reducidos (ruptura) (de aquí en adelante
llamado ST1515).
Subsiguientemente a la formación del anillo
epóxido, se abre este último recurriendo a técnicas conocidas. Se
calcula el porcentaje de epóxido formado a partir de la relación
entre las áreas de las señales de ^{13}C-NMR
aproximadamente a 55 ppm, característico de los carbonos 2 y 3 del
anillo de ácido urónico que contiene el epóxido y el número total
de señales anoméricas (C1 de la glucosamina y residuos ácido
urónico). Si se lleva a cabo la apertura en caliente, se obtiene un
residuo ácido galacturónico, mientras que si la apertura del anillo
epóxido se lleva a cabo en frío, se obtiene un residuo ácido
idurónico. Los ejemplos de preferencia de compuestos que contienen
un anillo epóxido son aquellos obtenibles mediante el procedimiento
descrito anteriormente y que contienen 14% de ácido urónico
epoxidado (de aquí en adelante ST1509), 24% (de aquí en adelante
ST1525) y 30% (de aquí en adelante ST1526), respectivamente.
Posteriormente se somete la heparina
parcialmente desulfatada a "ruptura de glicol" (RO
abreviadamente), de acuerdo con el procedimiento definido
anteriormente y por degradación de Smith (SD abreviadamente).
Alternativamente, también pueden obtenerse
compuestos de fórmula (I) sin pasar por el producto intermedio
epóxido, esto es decir por ruptura de glicol directa y subsiguiente
degradación de Smith.
El procedimiento descrito anteriormente lleva a
compuestos de fórmula (I) en los que los grupos X y X' son ambos
-CH_{2}OH.
Para X y X' diferentes de -CH_{2}OH, existen
procedimientos disponibles para los expertos en el campo para
transformar el grupo hidroxilo con otros grupos previstos en las
definiciones presentadas anteriormente. Por ejemplo, la conjugación
con aminoácidos o péptidos puede realizarse tratando el aldehído
intermedio derivado de la reacción de ruptura de glicol con una
reacción de aminación reductora (Hoffmann J. y col. Carbohydrate
Research, 117, 328-331 (1983)), que puede realizarse
en solvente acuoso y es compatible con el mantenimiento de la
estructura de heparina.
Si se desea, y esto constituye otro objetivo de
la invención descrita en este documento, los compuestos de fórmula
(I) pueden degradarse además con agentes ácidos en condiciones
adecuadas de pH, por ej., a pH 4, para dar una mezcla de
oligosacáridos que mantienen las propiedades antiangiogénicas.
De igual manera, son objetivos de la presente
invención los compuestos obtenidos por una de las etapas g), h), i)
y j) del procedimiento descrito anteriormente.
Son objetivos de la invención descrita en este
documento las composiciones farmacéuticas que contienen como
ingrediente activo al menos un compuesto de fórmula (I), solo o en
combinación con uno o más compuestos de fórmula (I), o, dicho
compuesto de fórmula (I) o compuestos en combinación con las
heparinas desulfatadas descritos anteriormente, por ej., los
productos intermedios epoxidados; también pueden usarse los últimos
solos como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas. El
ingrediente activo de acuerdo con la presente invención estará en
una mezcla con vehículos adecuados y/o excipientes usados
normalmente en la tecnología farmacéutica, tales como, por ejemplo,
aquellos descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences
Handbook", última edición. Las composiciones de acuerdo con la
presente invención contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz
del ingrediente activo. Los expertos en el campo determinarán las
dosis, por ej., el médico clínico o de atención primaria de acuerdo
con el tipo de enfermedad a tratar y la condición del paciente, o
concomitantemente con la administración de otros ingredientes
activos. A modo de ejemplo, pueden indicarse dosis en el intervalo
desde 0,1 hasta 100 mg/kg.
Son ejemplos de composiciones farmacéuticas
aquellas que pueden administrarse por vía oral o parenteral,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica o en la forma
de vaporizadores nasales u orales. Las composiciones farmacéuticas
adecuadas para el propósito son comprimidos, cápsulas duras o
blandas, polvos, soluciones, suspensiones, jarabes y formas sólidas
para preparaciones líquidas extemporáneas. Las composiciones para
administración parenteral son, por ejemplo, todas las formas
intramusculares, intravenosas y subcutáneas inyectables así como
las soluciones, suspensiones y emulsiones. También deberían
mencionarse las formulaciones de liposomas. Los comprimidos también
incluyen formas para la liberación controlada del ingrediente activo
ya sea como formas de administración orales, comprimidos
recubiertos con capas adecuadas, polvos microencapsulados, complejos
con ciclodextrinas, formas de depósito, por ejemplo formas
subcutáneas, tales como inyecciones o implantes de
depósito.
depósito.
Los compuestos de acuerdo con la invención
descrita en este documento poseen actividad antiangiogénica. Esto
los hace adecuados para la preparación de medicamentos útiles para
el tratamiento de sujetos, generalmente mamíferos y particularmente
seres humanos, que sufren de angiogénesis alterada. Son ejemplos de
enfermedades tratadas con el medicamento que es el objeto de la
presente invención, tumores primarios, metástasis, retinopatías
diabéticas, soriasis, fibroplasia retrolenticular, reestenosis tras
angioplastia y by-pass coronario.
De manera ventajosa, los compuestos de acuerdo
con la presente invención están sustancialmente exentos de los
efectos colaterales típicos de la heparina. En particular, los
compuestos de acuerdo con la invención están sustancialmente
exentos de actividad anticoagulante. Por sustancialmente exentos de
tal actividad los expertos en el campo quieren decir ninguna
actividad o sólo una actividad insignificante desde el punto de
vista del uso clínico.
Uno de los primeros factores de crecimiento que
demostró tener un papel angiogénico fue bFGF (o
FGF-2) seguido poco después por aFGF (o
FGF-1) (para una revisión del tema ver Christofori,
Oxford University, 1996). Ambas proteínas son miembros de una clase
de factores de crecimiento caracterizados por un alto grado de
afinidad por heparina. Otros potentes inductores angiogénicos son
VEGF, VEGF-B y VEGF-C. Los tres
factores VEGF, como los FGFs, se expresan de manera ubicua en el
cuerpo. Ambos tipos de factores, a/bFGF (FGF-1 y
FGF-2) y VEGF, se unen a receptores de alta
afinidad con un dominio transmembrana que posee actividad tirosina
quinasa. Los tres receptores para VEGFs - VEGF-1
(flt-1), VEGF-2
(kdr/flk-1) y VEGF-3
(flt-4) - se expresan específicamente en células
endoteliales, mientras que los cuatro receptores FGF se expresan en
numerosos órganos y tejidos (para una revisión del tema ver Risau y
Flame 1995 Annu. Rev. Cell Dev: Biol. 11: 73-91).
bFGF unido a heparina o a fragmentos de heparán sulfato causa su
dimerización y la posibilidad de unirse a su propio receptor
activando la ruta de transducción de la señal que activa la célula
endotelial tanto en mitogénesis como en diferenciación.
La inhibición de la unión de FGF a heparina o a
fragmentos de heparán sulfato representa así un blanco terapéutico
válido para combatir la neoangiogénesis patológica inducida por un
incremento del nivel local o sistémico de factores de
crecimiento.
Para este fin se diseñó un modelo in
vitro capaz de evaluar la interferencia de los diversos
derivados de heparina diferentes con la unión de bFGF a su propio
receptor.
En particular, se usaron células ováricas de
hámster Chino (CHO-K1) que poseen heparán sulfatos
en su superficie, pero carecen de receptor de FGF 1. También se
usaron células de CHO llamadas CHO-745flg, que
expresan el receptor de FGF 1 pero que, a diferencia del primer
grupo, no poseen heparán sulfatos de membrana. Se transfectaron de
manera estable estas últimas células con ADNc para proteína
fluorescente verde y por esta razón pudieron observarse bajo el
microscopio de fluorescencia con una combinación de flitros para la
detección de emisión verde. Brevemente, la técnica se basa en la
posibilidad de que dos tipos de células pueden interactuar (formar
enlaces estables) sólo si se agrega FGF a los dos tipos de células.
De hecho, en este caso, los heparán sulfatos de las células
CHO-745flg se unirán a FGF, que a su vez se unirá a
las células CHO-K1, estableciendo un puente. La
unión producida es detectable como resultado de la fluorescencia
verde emitida por las células CHO-745flg.
Además, se evaluaron los compuestos con respecto
a su actividad inhibidora de proliferación celular. De hecho, uno
de los principales efectos de FGF es estimular el crecimiento
celular en ausencia de suero en células que expresan receptor de
FGF 1 (FGFR-1).
Para este fin, se usaron dos líneas celulares,
ambas expresando FGFR-1 (L6WT1 y células de aorta de
ternera), cuyo crecimiento se evaluó en presencia de FGF con y sin
agregado de derivados de heparina para los que se esperó una acción
inhibitoria.
Se sembraron células CHO-K1 a
una densidad de 90.000 cells/cm^{2} en placas de 24 pocillos. Tras
24 horas se fijaron las células en glutaraldehído 3% en PBS durante
2 horas a 4ºC y se lavaron con 0,1 M glicina/PBS. Se transfectaron
las células de CHO 745/flg en las monocapas fijadas con
FGFR-1, a una densidad de 50.000 cells/cm^{2} en
DMEM conteniendo 10 mM EDTA, 30 ng/ml FGF-2 y dosis
crecientes de los compuestos de prueba. Tras 2 horas de incubación
a 37ºC, se contaron las células adheridas bajo el microscopio
invertido. Los resultados se expresaron como porcentaje del número
de células adheridas comparado con las medidas en ausencia de los
compuestos de prueba. Se examinaron los compuestos por triplicado en
6 concentraciones variando desde 1 ng/ml hasta 100 \mug/ml y se
calculó la DI_{50} para cada compuesto (Tabla 1).
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Se sembraron células L6-WT1
(mioblastos de rata transfectados con FGFR-1) a una
densidad de 25.000 cells/cm^{2} en placas de 48 pocillos en DMEM
+ 10% FCS. Tras 24 horas se lavaron las células con medio libre de
suero y se incubaron durante 48 horas con DMEME + 0,5% FCS.
Posteriormente se incubaron las células durante 16 horas con
FGF-2 a las concentraciones de 15 y 30 ng/ml en
presencia o en ausencia de los compuestos de prueba (todos a 100
\mug/ml). Al final de la incubación se agregó
^{3}H-timidina (0,25 \muCi/pocillo) sin cambiar
el medio. Tras 6 horas, se midió la actividad precipitable con TCA.
Cada punto experimental es la media de 3 determinaciones. Los
resultados se presentan en la Tabla 2.
Se sembraron células BAEC a una densidad de
2.500 cells/cm^{2} en placas de 48 pocillos en medio EGM Bullet
Kit completo. Tras 24 horas se cultivaron las células en ausencia de
suero en medio EGM sin extracto de cerebro de ternera y hEGF. Tras
otras 24 horas, se trataron las células con 30 ng/ml de bFGF en
presencia de concentraciones crecientes del compuesto de prueba.
Tras 16 horas, se agregó 1 \muCi/ml de
^{3}H-timidina al medio. Tras 6 horas, se midió
la actividad precipitable con TCA. Cada punto experimental es la
media de 8 determinaciones. Los resultados se presentan en las
Tablas 3-6.
Se sembraron células BAEC en el 7º pasaje a una
densidad de 2.500 cells/cm^{2} en placas de 96 pocillos en medio
EBM sin extracto de cerebro de ternera y hEGF. A este medio se le
agregaron 30 ng/ml de FGF-2 y cada uno de los
compuestos de prueba en 5 concentraciones variando desde 10 ng/ml
hasta 100 \mug/ml. Tras 3 días se fijaron las células y se
tiñeron con violeta cristal y se determinó la densidad óptica por
medio de un lector de microplacas de ELISA. Casa punto experimental
se llevó a cabo por cuadruplicado y se calculó la DI_{50}. Los
resultados se presentan en la Tabla 7.
Se sembraron células GM7373 a una densidad de
70.000 cells/cm^{2} en placas de 96 pocillos en medio MEM + 10%
FCS. Tras 24 horas, se lavaron las células con medio libre de suero
y se trataron con 10 ng/ml de FGF-2 en medio
conteniendo 0,4% de FCS. Tras 8 horas, se agregaron al medio los
compuestos de prueba en 5 concentraciones variando desde 10 ng/ml
hasta 100 \mug/ml. Tras otras 16 horas, se tripsinaron las células
y se realizó el conteo en una cámara de Burker. Se calculó la
DI_{50} para cada compuesto y los resultados son las medias de 2
experimentos por triplicado. Los resultados se presentan en la Tabla
8.
Para el estudio de angiogénesis se usó un modelo
de membrana corioalantóica (CAM) de embrión de polluelo (Ribatti y
col. Int. J. Dev. Biol., 40, 1189 (1996)).
Se incubaron 300 huevos embrionados de gallina a
37ºC en condiciones constantes de humedad. Al 3º día de incubación,
tras aspirar 2-3 ml de albumen del polo agudo del
huevo para despegar la CAM de cáscara, se recortó una ventana con
unas tijeras en la cáscara. Se expusieron así los vasos por debajo
de la CAM. Se cerró la ventana con un panel de vidrio transparente
y se colocaron los huevos nuevamente en el incubador. En el 8º día
de incubación, en condiciones estériles, se trataron las CAMs de
acuerdo con el protocolo descrito a continuación usando una técnica
desarrollada recientemente (Ribatti y col. J. Vasc. Res. 34, 455
(1997)), que incluye el uso de esponjas de gelatina estériles con
un tamaño de 1 mm^{2}. Se resuspendió cada molécula en 3 \mul de
PBS en una concentración de 50 o 100 \mug/embrión. Como control
positivo, se usó FGF-2 (1 \mug/esponja), para el
que se demostró una potente actividad angiogénica en la CAM (Ribatti
y col., Dev. Biol. 170, 39, (1995)). Primero se dejaron reposar las
esponjas en la superficie de la CAM y posteriormente se pipetearon 3
\mul de solución de la sustancia de prueba sobre la superficie de
la esponja. Se examinaron las CAMs diariamente usando un
estereomicroscopio Zeiss SR equipado con un dispositivo fotográfico.
Se discontinuaron los experimentos en el 12º día de incubación,
cuando se llevó a cabo una evaluación total de la actividad
angiogénica de las moléculas, expresada como porcentaje de
inhibición en relación con el número de experimentos iniciados y
completados (Tabla 9). Además, para el compuesto ST1514, evaluado en
una concentración de 100 \mug/embrión, se realizó una evaluación
cuantitativa macroscópica de la actividad angiogénica de acuerdo con
la técnica propuesta por Brooks y col. (Science, 264, 569, (1994)),
contando la cantidad de vasos rodeando la esponja. Se comparó el
número de vasos con el número de vasos de la esponja control tratada
con PBS (vehículo del compuesto de prueba) y con
FGF-2 (control positivo). Los resultados se
presentan en la Tabla 10.
Debería destacarse que la heparina que se
presenta naturalmente no tiene actividad.
Debería destacarse que la heparina que se
presenta naturalmente no tiene actividad.
Se trataron 20 ratones hembra Balb/c de 6
semanas de vida con un peso de 20 g (Harlan), divididos en grupos
por aleatorización casual, con heparina sódica, como referencia, y
con el compuesto de acuerdo con la presente invención llamado
ST1514. El programa de tratamiento fue de q2dxtipo 5, es decir 5
administraciones totales en intervalos de 2 días, administrando 200
\mul/ratón de soluciones de 50 mg/kg/10 ml y 25 mg/kg/10 ml por
vía subcutánea.
Las sustancias se disolvieron de la siguiente
manera:
Heparina sódica: se preparó la solución
disolviendo 160 mg de polvo en 4 ml de PBS libre de Ca^{++} y
Mg^{++} 1x pH 7,4; se subdividió en alícuotas de 243 \mul y se
almacenó a -20ºC. En el momento del tratamiento, se diluyó la
solución en PBS libre de Ca^{++} y Mg^{++} (Dulbecco, fórmula
modificada) 1x, pH 7,4 de manera de tener la sustancia en una
concentración final de 50 mg/kg/10 ml y 25 mg/kg/10 ml.
ST1514: se preparó la solución disolviendo 160
mg de polvo en 4 ml de PBS libre de Ca^{++} y Mg^{++} 1x, pH
7,4; se subdividió en alícuotas de 243 \mul y se almacenó a -20ºC.
En el momento del tratamiento, se diluyó la solución en PBS libre
de Ca^{++} y Mg^{++} (Dulbecco, fórmula modificada) 1x, pH 7,4
de manera de tener la sustancia en una concentración final de 50
mg/kg/10 ml y 25 mg/kg/10 ml.
48 horas tras la última administración de las
sustancias de prueba se recogieron muestras de sangre para recuento
sanguíneo completo y análisis hematológico.
Toma de muestras de sangre: se colocaron los
ratones en una caja sellada herméticamente en la que se insufló
CO_{2} en cantidad suficiente para anestesiar al animal.
Posteriormente se tomó la muestra de sangre del plexo retroorbital
de cada animal (aproximadamente 1 ml de sangre/ratón) que se
distribuyó en cantidades de 0,4 ml de sangre/ratón en tubos de
prueba Eppendorf conteniendo 20 \mul de heparina Vister (5000
U/ml) para llevar a cabo el recuento sanguíneo completo y el
análisis hematológico; y la misma cantidad de sangre se distribuyó
en otro tubo de prueba Eppendorf conteniendo 50 \mul de citrato de
sodio 3,8% con el fin de realizar determinaciones de tiempo de
protrombina. Tras recoger las muestras de sangre, se sacrificó cada
animal por dislocación cervical.
Número de muestras: se tomaron 2 muestras de
sangre/ratón, con las que se realizaron dos recuentos sanguíneos
completos, dos extendidos y una muestra de plasma para almacenar a
-20ºC.
Recuento sanguíneo completo: se usó el aparato
(Cell Analyzer 580 A, DELCON) de acuerdo con el procedimiento
estándar descrito en el manual de uso. Se tomó la muestra de sangre
(25 \mul) por medio del dilutor y se llevó a un volumen de 10 ml
(dilución 1:400) con solución isotónica (PLTA salina, DELCON). De
esta solución (llamada solución A), el dilutor toma automáticamente
una muestra de 100 \mul y la lleva a un volumen de 10 ml
(dilución 1:100), obteniendo así la solución B. A la solución A se
le agregaron 3 gotas de Emosol (DELCON) para provocar la lisis de
los glóbulos rojos. Esta solución se usa para el recuento de
leucocitos (WBC). Por otro lado, la solución B se usa para las
lecturas de glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT). Se leyó cada
muestra por duplicado.
Los datos obtenidos se analizarán usando
ANOVA.
Los grupos de animales tratados con heparina
sódica en dosis de 50 mg/kg/10 ml y 25 mg/kg/10 ml presentaron un
hematoma marcado en el sitio de inoculación; este fenómeno no se
produjo en los grupos sometidos a tratamiento con ST1514. Las
autopsias realizadas en los animales del estudio revelaron que los
grupos sometidos a tratamiento con heparina sódica en dosis de 50
mg/kg/10 ml y 25 mg/kg/10 ml presentaron hígados con características
anormales, mientras que tal fenómeno no se detectó en los grupos
tratados con ST1514.
Los datos referidos al análisis hematológico
mostraron una disminución en los glóbulos rojos en ambos grupos
tratados con heparina sódica en dosis de 50 mg/kg y 25 mg/kg en
comparación con el grupo control, mientras que no se detectó tal
diferencia en los grupos tratados con ST1514.
El grupo tratado con heparina sódica en la dosis
de 25 mg/kg presentó una deficiencia significativa de plaquetas en
comparación con el grupo control. Ninguno de los grupos de
tratamiento del estudio presentó diferencias significativas en la
cantidad de glóbulos blancos sanguíneos en comparación con el grupo
control.
Los siguientes ejemplos ilustran más la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se disolvió 1 g de heparina en 12,5 ml de NaOH 1
N. Se calentó y agitó la solución a 60ºC durante 45 minutos. Se
bloqueó la reacción por enfriamiento rápido y neutralización.
Posteriormente se calentó la solución hasta 70ºC a pH 7 hasta que se
abrió el anillo epóxido por completo (se controló la reacción por
medio de NMR). Se disolvió la muestra desulfatada (aquí llamada
G2999H) en 20 ml de agua y se enfrió a 4ºC. Tras el agregado de 20
ml de una solución de NaIO_{4} 0,2 M, se dejó la solución en
agitación en la oscuridad durante 20 horas, posteriormente se detuvo
la reacción agregando etilenglicol y se eliminaron las sales por
ultrafiltración tangencial. Se agregaron 400 mg de NaBH_{4},
subdivididos en varias porciones a la solución desalada
(30-40 ml). Se dejó la solución en agitación
durante 3 horas a temperatura ambiente, posteriormente se neutralizó
con HCl diluido y de desaló por ultrafiltración tangencial. Se
obtuvieron 710 mg de producto, aquí llamado ST1514.
Peso Molecular (PM): 11200 D, índice de
polidispersión D 1,3, grado de desulfatación 1,9 (expresado como
relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}); el porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparados con el total de ácidos urónicos es
de aproximadamente 50%. Se caracterizó el compuesto por medio de
espectroscopía de NMR (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
2-4
Adoptando el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1, con la excepción de que la solución básica se calentó
durante 15, 30 y 60 minutos, respectivamente, se obtuvieron
compuestos con las siguientes características:
ST1513: peso molecular (PM) 12900 D, índice de
polidispersión D 1,5, grado de desulfatación 2,05 (expresado como
relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), el porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparados con el total de ácidos urónicos: 5%
grupos epóxido, 29% residuos urónico oxidados y reducidos
(ruptura);
ST1516: peso molecular (PM) 12900 D, índice de
polidispersión D 1,5, grado de desulfatación 1,8 (expresado como
relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), el porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparados con el total de ácidos urónicos: 5%
grupos epóxido, 29% residuos urónico oxidados y reducidos
(ruptura);
ST1515: peso molecular (PM) 9200 D, índice de
polidispersión D 1,5, porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparados con el total de ácidos urónicos: 11% grupos epóxido,
27.5% residuos urónico oxidados y reducidos (ruptura).
Claims (28)
1. Un derivado de glicosaminoglicano
2-O-desulfatado, particularmente una
heparina 2-O-desulfatada, con un
grado de 2-O-desulfatación no mayor
que 60% del total de ácidos urónicos, cuyo anillo glicósido ha sido
sometido a ruptura de glicol.
2. Un derivado de acuerdo con la reivindicación
1, que es un glicosaminoglicano similar a heparina.
3. Un derivado de heparina desulfatada de
acuerdo con la reivindicación 1, que es una heparina modificada que
contiene residuos glucosamina con diferentes grados de
N-desulfatación y subsiguiente
N-acetilación total o parcial opcional.
4. Un derivado de heparina desulfatada de
acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la siguiente fórmula
(I):
en la que el anillo U tiene el
siguiente
significado:
X y X', que pueden ser iguales o diferentes, son
un grupo aldehído o el grupo CH_{2}-D, en el que D
es hidroxi o un aminoácido, un péptido o un residuo de un
carbohidrato u oligosacárido;
R y R_{1}, que pueden ser iguales o
diferentes, son un residuo SO_{3} o acetilo;
n y m, que pueden ser iguales o diferentes,
pueden variar desde 1 hasta 40; la suma de n+m varía desde 6 hasta
40; la relación m:n varía desde 10:2 hasta 1:1, el símbolo
100 indica que las unidades marcadas m y n están
distribuidas estadísticamente a lo largo de la cadena de
polisacáridos y no están necesariamente en secuencia.
5. Un derivado de acuerdo con la reivindicación
4, que es heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 11.200 D, un índice de polidispersión de 1,3, un
grado de desulfatación de 1,99 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparado con el total de ácidos urónicos de aproximadamente
50%.
6. Un derivado de acuerdo con la reivindicación
4, que es heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 12.900 D, un índice de polidispersión de 1,5, un
grado de desulfatación de 2,05 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparado con el total de ácidos urónicos: 5% grupos epóxido, 29%
grupos urónico oxidados y reducidos.
7. Un derivado de acuerdo con la reivindicación
4, que es heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 11000 D, un índice de polidispersión de 1,5, un
grado de desulfatación de 2,05 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparado con el total de ácidos urónicos: 5% grupos epóxido, 29%
residuos urónico oxidados y reducidos.
8. Un derivado de acuerdo con la reivindicación
4, que es heparina parcialmente
2-O-desulfatada con un peso
molecular (PM) de 9200 D, un índice de polidispersión de 1,5, un
grado de desulfatación de 1,93 (expresado como la relación molar
SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparado con el total de ácidos urónicos: 11% grupos epóxido,
27,5% residuos urónico oxidados y reducidos.
9. Un procedimiento para la preparación de los
derivados de acuerdo con las reivindicaciones 1-8,
que comprende las siguientes etapas:
(a) tratamiento básico a una temperatura que
varía desde temperatura ambiente hasta aproximadamente 100ºC, de
preferencia desde 50 hasta 70ºC y de más preferencia aún a
aproximadamente 65ºC, que lleva a la eliminación de un porcentaje
controlado de grupos sulfato en posición 2 del ácido urónico y a la
formación de grupos epóxido; y
(b) abrir dicho anillo epóxido a aproximadamente
pH 7, a una temperatura en el intervalo desde 50ºC hasta 100ºC, de
preferencia a 70ºC, para dar como resultado residuos de ácido
galacturónico; o, alternativamente
c) abrir dicho anillo epóxido a una temperatura
en el intervalo desde 0ºC hasta 30ºC, de preferencia a 25ºC, para
dar como resultado residuos de ácido idurónico y,
d) oxidación de los dioles con peryodato de
sodio, para dar como resultado la apertura del anillo glicósido y
la formación de dos grupos aldehído por residuo modificado;
e) reducción de dichos grupos aldehído a alcohol
primario y, si se desea, transformación del grupo D en un grupo
diferente de hidroxi, como se prevé en diferentes significados de
acuerdo con la reivindicación 4;
f) hidrólisis ácida opcional para obtener
oligosacáridos correspondientes a las secuencias normales, o
alternativamente
g) hidrólisis enzimática parcial con una enzima
seleccionada del grupo constituido por liasa, heparinasa,
heparitinasa, o equivalente de los productos obtenidos en la etapa
e) para dar como resultado oligosacáridos, de preferencia tetra- u
octasacáridos, con el residuo terminal no reductor constituido por
ácido idurónico no saturado, el residuo reductor constituido por
una N-sulfoglucosamina y que contiene al menos un
residuo de ácido idurónico abierto; o alternativamente
h) el compuesto obtenido en la etapa a), o el
producto obtenido en la etapa b) se trata por medio de hidrólisis
enzimática parcial; y, si se desea
i) someter los productos obtenidos en una de las
etapas a), b) y e) a
6-O-desulfatación parcial; o
alternativamente,
j) someter la heparina inicial parcial o
totalmente 6-desulfatada a las etapas a), b) y
e).
10. Heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la
etapa a) se lleva a cabo durante 45 minutos a 60ºC y la etapa b) a
70ºC a pH 7, y un peso molecular (PM) de 11.200 D, un índice de
polidispersión de 1,3, un grado de desulfatación de 1,99 (expresado
como relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos
urónicos modificados de aproximadamente 50% comparado con el total
de ácidos urónicos.
11. Heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la
etapa a) se lleva a cabo durante 15 minutos a 60ºC y la etapa b) a
70ºC a pH 7, y un peso molecular (PM) de 12.900 D, un índice de
polidispersión de 1,5, un grado de desulfatación de 2,05 (expresado
como relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparados con el total de ácidos urónicos: 5%
grupos epóxido, 29% residuos urónico oxidados y reducidos.
12. Heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la
etapa a) se lleva a cabo durante 30 minutos a 60ºC y la etapa b) a
70ºC a pH 7, y un peso molecular (PM) de 11.000 D, un índice de
polidispersión de 1,5, un grado de desulfatación de 1,80 (expresado
como relación molar SO_{3}^{-}:COO^{-}), porcentaje de ácidos
urónicos modificados comparados con el total de ácidos urónicos: 5%
grupos epóxido, 29% residuos urónico oxidados y reducidos.
13. Heparina parcialmente
2-O-desulfatada, obtenible por medio
del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la
etapa a) se lleva a cabo durante 60 minutos a 60ºC y la etapa b) a
70ºC a pH 7, y un peso molecular (PM) de 9.200 D, un índice de
polidispersión de 1,5, porcentaje de ácidos urónicos modificados
comparados con el total de ácidos urónicos: 5% grupos epóxido,
27,5% residuos urónico oxidados y reducidos.
14. Mezclas de oligosacáridos con actividad
antiangiogénica obtenibles a partir de la degradación ácida de
compuestos de acuerdo con las reivindicaciones
4-8.
15. Mezclas de oligosacáridos con actividad
antiangiogénica obtenibles de la etapa f) del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 9.
16. Mezclas de oligosacáridos con actividad
antiangiogénica obtenibles de la etapa g) del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 9.
17. Mezclas de oligosacáridos con actividad
antiangiogénica obtenibles de la etapa h) del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 9.
18. Mezclas de oligosacáridos con actividad
antiangiogénica obtenibles de la etapa i) del procedimiento de
acuerdo con la reivindicación 9.
19. Composiciones farmacéuticas que contienen al
menos un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones
1-8 y 10-18 como un ingrediente
activo en una mezcla con vehículos y excipientes farmacéuticamente
aceptables.
20. El uso de compuestos de acuerdo con las
reivindicaciones 1-8 y 10-18, como
medicamentos.
21. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento con
actividad antiangiogénica.
22. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de estados patológicos debidos a angiogénesis
anormal.
23. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de tumores, opcionalmente asociados con metástasis.
24. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de metástasis tumorales.
25. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la retinopatía diabética.
26. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la fibroplasia retrolenticular.
27. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la soriasis.
28. El uso de compuestos de acuerdo con la
reivindicación 20, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la reestenosis tras by-pass
coronario.
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