PL213496B1 - Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie - Google Patents
Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanieInfo
- Publication number
- PL213496B1 PL213496B1 PL382769A PL38276907A PL213496B1 PL 213496 B1 PL213496 B1 PL 213496B1 PL 382769 A PL382769 A PL 382769A PL 38276907 A PL38276907 A PL 38276907A PL 213496 B1 PL213496 B1 PL 213496B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vaccine
- lettuce
- plant
- hbsag
- production
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims description 58
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 title description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 84
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 claims abstract description 74
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims abstract description 9
- 101000872838 Hepatitis B virus genotype C subtype adr (isolate China/NC-1/1988) Small envelope protein Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 61
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 61
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 57
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 20
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 18
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 18
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 16
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims description 15
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 11
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 52
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 51
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 15
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101800000874 Small capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101800000996 Small capsid protein precursor Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229930003571 Vitamin B5 Natural products 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=CC=CC=C1N GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 2
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 2
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001293495 Lactuca virosa Species 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-M glufosinate-P zwitterion(1-) Chemical compound CP([O-])(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-M 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 210000004837 gut-associated lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003126 m-cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000012492 regenerant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/517—Plant cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy otrzymywania szczepionki doustnej przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (wzw B) w formie utrwalonego materiału roślinnego.
Pomimo że rekombinowana szczepionka przeciwko hepatitis B, tj. wirusowemu zapaleniu wątroby typu B dostępna jest dla profilaktyki od początku lat '80 XX wieku, globalnie liczba osób przewlekle chorych w następstwie zakażenia HBV (ang. Hepatitis B Virus) corocznie wzrasta. O ile liczbę nosicieli HBV na świecie oceniano w końcu lat 80-tych ubiegłego wieku na ok. 300 min osób, 90-tych na ok. 350 min to aktualnie szacunkowe dane wskazują, że zwiększyła się ona do ok. 400 min. Szacuje się, że blisko 100 min spośród tych chorych może umrzeć z powodu chorób i innych powikłań, np. marskości lub raka wątroby. Jednocześnie populacja ludzi przewlekle chorych na wzw B stanowi wielki rezerwuar dla nowych infekcji. Z przybliżonych danych epidemiologicznych wynika, że blisko 1/3 światowej populacji przebyła zakażenie wirusem żółtaczki typu B. O ile w krajach wysoko rozwiniętych zapadalność na wzw B jest raczej niska - mniej niż 0,5%, to w krajach rozwijających się i w Chinach wskaźnik zachorowań wynosi od 5 do 50% (Hollinger 1996. Young i in. 2001). Zapadalność na wzw B była i pozostaje poważnym problemem epidemiologicznym także w Polsce. Spośród chorób wątroby o etiologii wirusowej, ponad 50% wywoływanych jest przez HBV (Walewska-Zielecka i in. 1996). Szacuje się, że około 20% populacji kraju wykazuje markery zainfekowania wirusem HBV. Z kolei według danych Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej z 1997 r., spośród ośmiu obowiązkowych szczepień w naszym kraju, nakłady jedynie na szczepienie przeciwko wzw B stanowiły 70% wszystkich kosztów szczepień (Galimska 1999).
Liczba osób przewlekle chorych i nosicieli wirusa wzrasta także w krajach rozwiniętych pomimo wprowadzenia przed 20 laty rekombinowanej szczepionki opartej na tzw. małym antygenie powierzchniowym wirusa, tj. S-HBsAg produkowanym w komórkach drożdży (rHBsAg), która umożliwiła masowe szczepienia. Stwierdzono bowiem, że u pewnej liczby osób szczepionych dochodzi do skutecznego zakażenia i replikacji wirusa. Zakażenie następuje w następstwie pojawienia się zmutowanych szczepów, które charakteryzują się zamianą aminokwasów w obrębie epitopu „a” małej podjednostki S-HBs antygenu powierzchniowego. Epitop ten jest reprezentatywny, a zarazem neutralizujący dla wszystkich opisanych dotychczas podtypów wirusa. Przypuszcza się, że mutacje następują w wyniku presji selekcyjnej jaką stwarzają przeciwciała powstałe w wyniku szczepienia. Nowe, zmutowane warianty epitopu „a” charakteryzują się zmienioną immunogennością. Dlatego sporadycznie stwierdza się brak wystarczającej ochrony immunologicznej na szczepy wirusa zawierające niektóre zmiany mutacyjne i rozwój przewlekłego schorzenia, pomimo wcześniejszej odpowiedzi na poziomie >10 mlU/ml przeciwciał anty-HBs, który w większości krajów uznaje się za wystarczający dla zapewnienia ochrony immunologicznej przed zakażeniem wirusem (Cooreman i in. 2001, Huang i in. 2004).
Z powyższych przyczyn opracowanie alternatywnej, łatwiej dostępnej oraz wysoce skutecznej szczepionki przeciwko wzw B było i jest nadal powszechnie oczekiwane.
Głównym założeniem otrzymania doustnie aplikowanej szczepionki przeciwko wzw B jest ekspresja i wydajna produkcja wysoce immunogennej małej podjednostki antygenu powierzchniowego S-HBs wirusa HBV w transgenicznej roślinie jadalnej. Prace nad tym zagadnieniem prowadzono przez szereg lat w kilku grupach badawczych (patrz cytowana literatura). Dotychczas otrzymywane rośliny transgeniczne lub kultury tkanek/komórek charakteryzowały się w każdym przypadku opornością na antybiotyki, głównie kanamycynę. Jednocześnie poziom ekspresji S-HBsAg oscylował w granicach 1-3 μg/gram świeżej masy (ang. g of fresh weight, g FW), a maksymalnie wynosił 16 μg/g FW. W badaniach nad immunizacją doustną zwierząt, ewentualnie ochotników, wykorzystywano wyłącznie świeży nieprzetworzony, tj. surowy materiał roślinny.
Celem wynalazku jest uzyskanie alternatywnej doustnej szczepionki przeciwko wzw B opracowanej z wykorzystaniem transgenicznych roślin jadalnych. W szczególności, celem wynalazku jest wydajna ekspresja antygenu S-HBs w jadalnych roślinach transgenicznych, np. w sałacie, pozwalająca na opracowanie szczepionki aplikowanej doustnie, np. w formie zawiesiny, syropu oraz granulatu i tabletki bądź kapsułki, która w tej postaci byłaby istotnie łatwiejsza do zastosowania na szeroką skalę, zarówno jako szczepionka pierwotna, jak i jako szczepionka przypominająca dla osób uprzednio szczepionych, u których miano przeciwciał anty-HBs obniżyło się, względnie przeciwciała anty-HBs nie są już wykrywalne.
Nieoczekiwanie opisane powyżej cele zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Kolejne przedmioty wynalazku zostały opisane poniżej oraz zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach.
PL 213 496 B1
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka T-DNA składająca się z sekwencji granicznych T-DNA oraz umieszczonych pomiędzy nimi dwóch kaset ekspresyjnych:
- kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej białko małego antygenu powierzchniowego wirusa HBV - S-HBsAg oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt), oraz
- kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe, korzystnie genu bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t do otrzymywania roślin transgenicznych, korzystnie sałaty, przeznaczonych do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Korzystnie cząsteczka T-DNA według wynalazku zawiera co najmniej jedną spośród sekwencji: SEQ ID No. 1 i SEQ ID No. 2.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę T-DNA według wynalazku. W przykładowej realizacji jest to wektor binarny pKHBSBAR.
Kolejnymi przedmiotami wynalazku są komórki szczepów E. coli oraz Agrobacterium tumefaciens zawierające wektor ekspresyjny według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie roślinnego wektora ekspresyjnego według wynalazku do otrzymywania transgenicznych roślin, korzystnie sałaty, przeznaczonych do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna komórka roślinna zawierająca T-DNA, pochodzący z roślinnego wektora ekspresyjnego według wynalazku, zdolna do ekspresji białka małego antygenu powierzchniowego wirusa HBV - S-HBsAg i posiadająca oporność na herbicydy fosfinotricynowe, przeznaczona do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Korzystnie, transgeniczna komórka roślinna według wynalazku jest komórką sałaty.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki roślinnej według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem, stosowane komórki roślinne mają postać biomasy roślinnej, zwłaszcza liofilizowanego materiału roślinnego, korzystnie sałaty.
Korzystnie, wytwarzana szczepionka według wynalazku ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek.
W szczególności, zgodnie z wynalazkiem, transgeniczne komórki i zregenerowane oraz potomne rośliny kolejnych pokoleń sałaty charakteryzują się tym, że w wyniku transformacji wektorem według wynalazku zachodzi w nich ekspresja małej podjednostki antygenu powierzchniowego HBV (S-HBsAg) oraz są oporne na fosfinotricynę i pochodne herbicydy. Pochodzący z nich materiał roślinny może być zastosowany jako szczepionka doustna przeciwko HBV i w konsekwencji przeciwko wzw B. Materiał roślinny według wynalazku po odwodnieniu na drodze liofilizacji w warunkach głębokiego zamrożenia, zachowuje w temperaturze pokojowej natywną strukturę białka antygenowego i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy i może być zastosowany do otrzymania szczepionki doustnej przeciwko wzw B w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek.
Jak wspomniano wyżej, komórka roślinna według wynalazku stosowana jest do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. Liofilizowany materiał roślinny według wynalazku podany per os w formie zawiesiny zwierzętom doświadczalnym wywołuje odpowiedź immunologiczną błon śluzowych charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-SHBs oraz odpowiedź systemiczną charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-SHBs. W szczególności, liofilizowany materiał roślinny według wynalazku podany per os jednokrotnie uprzednio immunizowanym per os zwierzętom doświadczalnym wywołuje wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-SHBs oraz wzmocnienie odpowiedzi systemicznej charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-SHBs. Zgodnie z wynalazkiem, szczepionka ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek. Korzystnie, granulat, tabletki oraz kapsułki uformowane ze sproszkowanego liofilizatu transgenicznej sałaty według wynalazku zachowują w temperaturze pokojowej natywną strukturę białek antygenowych i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy.
PL 213 496 B1
W stosunku do znanych ze stanu techniki wyników wynalazek reprezentuje istotne nowości i zasadniczo innowacyjne podejście do otrzymania szczepionki doustnej obejmujące następujące elementy:
- skonstruowana po raz pierwszy cząsteczka T-DNA zawierająca kasetę ekspresyjną białka S-HBsAg oraz gen bar, która po przeniesieniu do genomu komórki roślinnej za pośrednictwem wektora powoduje jednoczesne wytwarzanie S-HBsAg i oporność na herbicydy fosfinotricynowe
- otrzymana po raz pierwszy transgeniczna sałata wytwarzająca S-HBsAg na poziomie przekraczającym 20 μg S-HBsAg/g FW i dochodzącym do 60 μg/g FW, nie zawierająca markerowych genów oporności na antybiotyki, natomiast oporna na herbicydy fosfinotricynowe np. Basta, przez co nie grozi potencjalnym poszerzeniem antybiotykooporności mikroflory ustroju człowieka
- otrzymanie z sałaty transgenicznej wytwarzającej S-HBs po raz pierwszy prototypu doustnej szczepionki w skondensowanej formie liofilizatu i postaci pochodnych: zawiesiny liofilizatu, syropu oraz granulatu, tabletek lub kapsułek
- immunizacja doustna po raz pierwszy za pomocą zawiesiny liofilizatu oraz syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek.
Szczegółowy opis wynalazku
Jedną z korzystnych realizacji wynalazku jest wektor pKHBSBAR [Fig. 1] do otrzymania roślin opornych na herbicydy fosfionotricynowe, np. Basta i jednocześnie ekspresjonujących heterologiczne białko S-HBsAg.
Ważną cechą wektora jest T-DNA zawierające dwie kasety ekspresyjne, determinujące ekspresję immunogennego białka podjednostki S antygenu powierzchniowego HBs (podtypu ayw4, adw4) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz acetylotransferazy fosfinotricyny, warunkującej oporność na fosfinotricynę, która jest składnikiem niektórych herbicydów o nieselektywnym działaniu, np. Basta. W skład pierwszej kasety wchodzi sekwencja kodująca białko S-HBsAg pod kontrolą sekwencji regulatorowych: promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt). W skład drugiej kasety wchodzi sekwencja kodująca genu bar pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t. Kolejną istotną cechą skonstruowanego T-DNA jest występowanie wymienionych sekwencji kodujących lub regulatorowych wyłącznie w jednej kopii i w określonej orientacji względem siebie [Fig. 1]. Brak powtórzeń motywów sekwencyjnych powoduje wyeliminowanie rekombinacji w obrębie wprowadzonego T-DNA oraz zrównoważoną transkrypcję poszczególnych transgenów. Cechy konstrukcyjne T-DNA przyczyniają się zatem do ograniczenia zjawiska wyciszania genów, a tym samym do większej stabilności T-DNA w obrębie genomu roślin transgenicznych, co jest szczególnie istotne w odniesieniu do sałaty, której genom jest stosunkowo zmienny i ulegający rearanżacjom (McCabe i in. 1999). W konsekwencji cechy konstrukcyjne T-DNA przyczyniają się do stabilnej ekspresji transgenów S-HBs oraz bar w komórkach roślinnych.
Kolejnym aspektem wynalazku jest metoda transformowania sałaty za pomocą szczepu Agrobacterium tumefaciens zawierającego wektor do transformowania oraz regeneracji transgenicznej sałaty Lactuca sativa L.
Charakterystyczną właściwością opracowanej metody transformowania komórek sałaty i regeneracji sałaty na drodze organogenezy jest wykorzystany po raz pierwszy system selekcji na fosfinotricynę, który istotnie zwiększa prawdopodobieństwo otrzymania roślin jednolicie transgenicznych, tj. nie wykazujących cech chimer genetycznych [Fig. 2], Jakkolwiek sałatę zawierającą gen oporności na herbicyd opisano w literaturze (Mohapatra i in. 1999), regeneracja roślin po transformacji wektorem zawierającym gen bar oporności na fosfinotricynę i gen nptll oporności na kanamycynę możliwa była wówczas jedynie po zastosowaniu systemu selekcji na antybiotyk. Rośliny zregenerowane według wynalazku w warunkach selekcji na fosfinotricynę po samozapyleniu przekazują transgen potomstwu zgodnie ze schematem mendlowskim 3:1, co można potwierdzić przy użyciu metody PCR [Fig. 3]. W przypadku stosowania czynników selekcyjnych o słabszym działaniu, przede wszystkim antybiotyków np. kanamycyny, istnieje bowiem znaczące ryzyko zregenerowania roślin opornych na czynnik selekcyjny, ale nietransgenicznych (ang. escapes) lub o charakterze chimer genetycznych. Ponadto, system selekcji sałaty transgenicznej w oparciu o herbicyd umożliwia wykorzystanie takiego produktu jako materiału wyjściowego do otrzymania szczepionki doustnej zgodnie z obowiązującymi wymogami i zaleceniami.
Istotną cechą metody transformacji wykorzystywanej w wynalazku jest umożliwienie wprowadzenia niewielkiej liczby tj. 1 lub 2 kopii kasety ekspresyjnej [Fig. 4] do genomu sałaty. Niewielka liczPL 213 496 B1 ba kopii kasety ekspresyjnej w konsekwencji zapewnia stabilną ekspresję transgenu, tj. immunogennego białka podjednostki S antygenu powierzchniowego HBs w roślinach pierwotnych regenerantów (pokolenie T0) i w roślinach potomnych (pokolenie T1). Procesy, które często prowadzą do wyciszenia egzogennych sekwencji DNA wprowadzonych na drodze transformacji genetycznej, zostały zatem istotnie ograniczone bądź wyeliminowane pomimo względnej zmienności i rearanżacji genomu sałaty (McCabe i in. 1999). Warunki niezbędne dla uzyskania efektu stabilnej transformacji sałaty i wydajnej ekspresji transgenu obejmują: cechy konstrukcyjne kasety w plazmidzie binarnym Agrobacterium oraz metodę otrzymania roślin transgenicznych sałaty. Stabilność poziomu ekspresji, będąca rezultatem cech konstrukcyjnych kasety ekspresyjnej oraz 1-2 kopii kasety wprowadzonej do genomu roślin, należy rozumieć jako poziom ekspresji w pokoleniu T1 podobny lub wyższy od obserwowanego w pokoleniu T0.
Następnym aspektem wynalazku są transformowane komórki sałaty i zregenerowane z nich rośliny oraz rośliny kolejnych pokoleń generatywnych charakteryzujące się jednoczesną ekspresją białka małego antygenu powierzchniowego wirusa HBV - S-HBsAg i opornością na herbicydy fosfinotricynowe.
Sposób transformowania i regeneracji sałaty opisany w wynalazku zapewnia otrzymanie linii roślin transgenicznych, których znamienną cechą jest oporność na herbicydy fosfinotricynowe np. Basta oraz ekspresja S-HBsAg na poziomie dochodzącym do kilkunastu, a niekiedy kilkudziesięciu μg/g świeżej masy liści [Fig. 5]. Cechy te utrzymują się w I pokoleniu generatywnym T1 [Fig. 6] i w kolejnych pokoleniach generatywnych. Wytwarzany w sałacie S-HBsAg charakteryzuje się natywną strukturą i zachowuje zdolność do składania się w wysoce immunogenne cząstki subwiralne lub wirusopodobne (ang. Virus-Like Particles, VLPs), o czym świadczą wyniki analiz ELISA, wykonywane za pomocą zestawu firmy Abbott, opartego na przeciwciele monoklonalnym specyficznym wobec epitopu „a” eksponowanym na powierzchni cząstek subwiralnych. Z kolei wśród obserwowanych w western-blot prążków odpowiadającym różnym formom S-HBs, znajdują się również dimery, które są pierwszym etapem w procesie składania się cząstek VLPs z S-HBsAg [Fig. 7]. Cząstki takie obserwowano również bezpośrednio w komórkach mezofilu liści sałaty [Fig. 8] za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM1200EXII firmy Jeol.
Kolejnym aspektem wynalazku jest zastosowanie transgenicznej sałaty opornej na fosfinotricynę i wytwarzającej białko antygenowe S-HBs do otrzymania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Sałata (Lactuca sativa L.) jest gatunkiem rośliny, która w odróżnieniu od wykorzystywanych dotychczas gatunków roślin charakteryzuje się właściwościami istotnymi dla otrzymywania szczepionki podawanej na drodze doustnej. Sałata odmiennie niż zdecydowana większość roślin uprawnych nadaje się do bezpośredniego spożycia bez potrzeby uzdatniania, przede wszystkim obróbki termicznej. Nie zawiera też żadnych substancji antyżywieniowych lub wywołujących alergię, których obecność mogłaby stanowić czynnik limitujący jej spożycie. Natomiast zastosowanie jako surowca do otrzymywania szczepionki doustnej sałaty transgenicznej zawierającej jako gen markerowy gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe, np. Basta, zamiast stosowanych dotychczas genów oporności na antybiotyki, nie grozi potencjalnym poszerzeniem antybiotykooporności mikroflory ustroju człowieka. Znamienną cechą sałaty transgenicznej wytwarzającej S-HBsAg i jednocześnie opornej na herbicydy jest przydatność i dogodność jej wykorzystania jako materiału wyjściowego dla wytworzenia szczepionki przeciwko wzw B aplikowanej na drodze doustnej.
Następnym aspektem wynalazku jest zliofilizowany materiał roślinny i jego zastosowanie do otrzymania szczepionki doustnej w formie pochodnych: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek zawierających białko szczepionkowe S-HBsAg. Skuteczna szczepionka doustna przeciwko wzw B, w przeciwieństwie do stosowanych dotychczas rozwiązań [patrz cytowana literatura] posiada skondensowaną formę sproszkowanego liofilizatu stosowaną w formie zawiesiny, syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek. Materiałem wyjściowym do otrzymania kondensatu są liście sałaty zawierające S-HBsAg, które są poddawane liofilizacji. Materiał ten jest mielony na proszek, a następnie przy użyciu roztworu soli fizjologicznej lub podobnego buforu np. PBS, oraz po dodaniu substancji pomocniczych przeprowadzany do formy zawiesiny lub syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek [Fig. 9, 10]. Sproszkowany liolifizowany materiał roślinny oraz forma zawiesinowa/syropowa lub granulatowa/tabletkowa/kapsułkowa postaci szczepionki doustnej [Fig. 10], w przeciwieństwie do surowego materiału roślinnego, charakteryzują się znamiennymi cechami umożliwiającymi:
- utrwalenie materiału roślinnego z zachowaniem wysokiej zawartości szczepionkowego białka S-HBsAg;
PL 213 496 B1
- skoncentrowanie dawki czynnika szczepionkowego tj. białka S-HBsAg do poziomu wystarczającego do immunizacji na drodze doustnej;
- podawanie stałej wystandaryzowanej dawki S-HBsAg dzięki a) kontroli poziomu S-HBsAg na poszczególnych etapach przygotowania zawiesiny lub syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek oraz b) doborowi odpowiedniego materiału wyjściowego i komponentów wypełniających;
- łatwe przechowywanie sproszkowanego liofilizatu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek w temperaturze pokojowej z zachowaniem trwałości S-HBsAg przez okres co najmniej 12 miesięcy;
- prosty sposób szczepienia na drodze doustnej poprzez wypicie lub połknięcie.
Uzyskane zgodnie z wynalazkiem szczepionki mogą być wykorzystane do szczepienia przeciwko wzw B na drodze doustnej za pomocą zawiesiny lub syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek wytworzonych ze sproszkowanego liofilizatu pochodzącego sałaty zawierającej antygen S-HBs.
Antygen powierzchniowy S-HBs wirusa HBV jest samoistnie silnym immunogenem, który bez dodatku adiuwantów może wywoływać odpowiedź immunologiczną u szeregu gatunków ssaków, w tym u myszy, szympansa oraz człowieka. Odpowiedź immunologiczna może być typu komórkowego obejmującego powstawanie specyficznych limfocytów cytotoksycznych lub typu humoralnego polegającego na powstawaniu specyficznych przeciwciał anty-SHBs. Przyjmuje się, że u człowieka i szympansa zaindukowana na odpowiednim poziomie odpowiedź humoralna jest wystarczająca do ochrony przed zachorowaniem po ekspozycji na wirusa. W zależności od sposobu podania immunogenu, reakcja immunologiczna na antygen S-HBs obejmuje powstawanie przeciwciał klasy IgG (immunizacja domięśniowa) oraz IgG i IgA przy immunizacji poprzez błony śluzowe przewodu pokarmowego tj. metodą doustną oraz poprzez nabłonek dróg oddechowych tj. metodą wziewną, a także na drodze waginalnej, rektalnej lub poprzez skórę.
Istotnym elementem sposobu szczepienia antygenem S-HBs wytworzonym w sałacie zgodnie z wynalazkiem jest immunizacja doustna poprzez śluzówkę jelita.
Jak wykazano, antygen S-HBs jest immunogenny dla myszy po uprzednim utrwaleniu materiału roślinnego zawierającego S-HBsAg na drodze liofilizacji i przeprowadzeniu bezpośrednio przed podaniem w formę zawiesiny (por. Przykład 5). Odpowiedź immunologiczna na antygen S-HBs powstaje w wyniku pierwotnego doustnego podania antygenu (priming), a następnie w efekcie powtarzanych jednej lub więcej immunizacji, których rezultatem jest odpowiedź wtórna (boosting) [Fig. 11-14]. U zwierząt immunizowanych per os antygenem S-HBs obecnym w zawiesinie liofilizatu transgenicznej sałaty według wynalazku nie stwierdzono tolerancji, która w następstwie wcześniejszej jednej lub większej liczby immunizacji doustnych objawiałaby się brakiem odpowiedzi na antygen S-HBs podany na drodze iniekcji. Przyjmuje się, że podanie antygenów na drodze doustnej indukuje komórki GALT (GALT - gut associated lymphoid tissue), tj. komórki układu immunologicznego zasocjowane wokół przewodu pokarmowego. W strukturze GALT znajdują się kępki Peyera, które od strony światła jelita eksponują komórki M (microfold cells). Komórki M cechuje zdolność efektywnego pobierania zarówno zdegradowanych, jak również kompletnych białek, wirusów, bakterii lub jednokomórkowych pasożytów. Antygeny lub drobnoustroje są następnie transportowane do komórek układu immunologicznego, w tym makrofagów i komórek dendrytycznych oraz limfocytów T i B, zarówno lokalnie w obrębie błon śluzowych, jak i do obwodowych organów limfatycznych w wyniku cyrkulacji systemicznej. Antygen S-HBs dostarczany według wynalazku na drodze doustnej może być pobrany przez komórki M z przewodu pokarmowego, a następnie po pobraniu i degradacji przez makrofagi i komórki dendrytyczne prezentowany limfocytom obecnym w śluzówce jelita powodując lokalną odpowiedź immunologiczną objawiającą się wytwarzaniem specyficznych przeciwciał anty-SHBs klasy IgA [Fig. 11, 14A], Dalej S-HBsAg w ciągu kilku godzin może znaleźć się w krwi i wówczas dociera do obwodowych organów układu immunologicznego wywołując systemiczną odpowiedź przeciwciał w klasie IgA i IgG [Fig. 12, 13, 14B, 14C]. Sposób immunizacji według wynalazku pozwala na ustalenie za pomocą wystandaryzowanego utrwalonego materiału, tj. sproszkowanego liofilizatu dostępnego w formie zawiesiny lub syropu bądź uformowanego do postaci granulatu/tabletki/kapsułki, wielkości dawki antygenu S-HBs oraz schematu zaszczepienia, tj. liczby immunizacji oraz okresu niezbędnego pomiędzy priming a boosting. Sposób immunizacji według wynalazku obejmującego zawiesinę/syrop i/lub granulat/tabletki/kapsułki otrzymane z liofilizatu transgenicznej sałaty pozwoli na ustalenie liczby dawek antygenu, wysokości dawek antygenu oraz okresu pomiędzy poszczególnymi immunizacjami w zależności od wieku immunizowanych zwierząt i ludzi, ogólnej kondycji i immunokompetencji, płci, wagi ciała i innych parametrów mających wpływ na odpowiedź immunologiczną. Sposób immunizacji według wynalazku pozwoli na uzyskanie odpowiedzi immunologicznej humoralnej obejmującej elicytację
PL 213 496 B1 przeciwciał klasy IgG oraz IgA, co warunkuje szerszy zakres ochrony immunologicznej niż dostępny w efekcie komercyjnej szczepionki podawanej na drodze iniekcji domięśniowej. Ponieważ zakłada się, że wertykalna transmisja obejmować może błony śluzowe jako wrota zakażenia, sposób immunizacji według wynalazku stanowić będzie potencjalnie bardziej szczelną ochronę immunologiczną w rodzinach osób zakażonych HBV, gdzie może dochodzić do wertykalnej transmisji zakażenia. Ujawniony sposób immunizacji pozwoli na zastosowanie antygenu S-HBs wytwarzanego w transgenicznej sałacie jako czynnika immunomodulującego odpowiedź immunologiczną u osób będących przewlekle nosicielami HBV.
Sposób preparatyki szczepionki według wynalazku, tj. w formie zawiesiny, syropu oraz granulatu i tabletki lub kapsułki, pozwoli na wytworzenie jednorodnego preparatu szczepionki, skomponowanego dla określonego sposobu immunizacji i/lub wywołania odpowiedzi immunologicznej, ewentualnie z odpowiednimi adiuwantami wspomagającymi odpowiedź immunologiczną, przy podaniu antygenu na błony śluzowe. Ujawniony sposób immunizacji obejmujący podanie preparatu szczepionki w formie zawiesiny lub syropu sporządzonych z liofilizowanego materiału transgenicznej sałaty i/lub w formie granulatu/tabletki/kapsułki pozwoli na podanie immunogennego antygenu S-HBs w ilości równej 1 lub więcej nanogramów, tj. 1-1000 ng lub kilku lub więcej mikrogramów, np. 2-1000 mikrogramów lub kilku miligramów, np. 2-100 mg. Antygen S-HBs z transgenicznej sałaty po odpowiedniej preparatyce może być podawany zwierzętom lub ludziom na drodze doustnej w szerokim zakresie dawek jak wyżej.
Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku niniejszy opis wzbogacono o wykaz sekwencji i figury.
Sekwencja nr 1 (SEQ ID No. 1) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej P35SSHBs-NOSt jako części składowej cząsteczki T-DNA, znajdującej się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBSBAR przeznaczonym do transformacji roślin.
Sekwencja nr 2 (SEQ ID No. 2) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej PNOS-bar-g7t jako części składowej cząsteczki T-DNA, znajdującej się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBSBAR przeznaczonym do transformacji roślin.
Na Figurze 1 przedstawiono schemat konstrukcji wektora pKHBSBAR użytego do transformacji sałaty, zawierającego cząsteczkę T-DNA złożoną z sekwencji granicznych i położonych między nimi dwóch kaset ekspresyjnych, obejmujących: 1/ sekwencję kodującą małego antygenu powierzchniowego S-HBs wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S RNA CaMV (P35S) i terminatora syntazy nopalinowej (NOSt) oraz 2/ sekwencję genu bar kodującą acetylotransferazę fosfinotricyny pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora g7t, determinującą oporność roślin transgenicznych na herbicydy fosfinotricynowe.
Oznaczenia: S-HBs - sekwencja kodująca mały antygen powierzchniowy HBV, P35S - promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), NOSt - terminator genu syntazy nopalinowej, BAR - sekwencja kodująca genu bar - acetylotransferazy fosfinotricyny, PNOS - promotor genu syntazy nopalinowej, g7t - terminator g7, RB, LB - prawa i lewa sekwencja graniczna T-DNA, NPT III - gen fosfotransferazy neomycynowej, GUS - sekwencja kodująca β-glukuronidazy, GUS-INT - sekwencja kodująca β-glukuronidazy z intronem.
Na Figurze 2 przedstawiono elektroforegram produktów reakcji amplifikacji przeprowadzonych w celu analizy obecności transgenu S-HBs w DNA genomowym pierwotnych transformantów sałaty (pokolenie T0) za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do sekwencji S-HBs.
Oznaczenia ścieżek elektroforegramu: M - marker wielkości fragmentów DNA (200 bp DNA Ladder, MBI Fermentas), 10B-18 - analizowane rośliny, K- - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, K+ - kontrola pozytywna - plazmid pKHBSBAR.
Na Figurze 3 przedstawiono elektroforegram produktów reakcji amplifikacji przeprowadzonych w celu analizy obecności transgenu S-HBs w DNA genomowym potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) linii 6A, 15E i 26G za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do sekwencji S-HBs.
Oznaczenia ścieżek elektroforegramu: M - marker wielkości fragmentów DNA (200 bp DNA Ladder, MBI Fermentas), 6A/1-26G/10 - analizowane rośliny, K- - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, K+ - kontrola pozytywna - plazmid pKHBSBAR.
Na Figurze 4 przedstawiono wynik analizy liczby miejsc integracji T-DNA w DNA genomowym potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) trawionym enzymem restrykcyjnym EcoR I za pomocą hybrydyzacji Southern-blot z użyciem sondy specyficznej do transgenu S-HBs.
Oznaczenia ścieżek blotu: 6A/3-26G/8 - analizowane rośliny, K- - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, K+ - kontrola pozytywna - plazmid pKHBSBAR traw. EcoR I
PL 213 496 B1
Na Figurze 5 przedstawiono wykres analizy zawartości białka S-HBsAg w liściach pierwotnych transformantów sałaty (pokolenie T0) za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA AUSZYME® firmy Abbott specyficznego dla antygenu S-HBs. Zawartość S-HBsAg wyrażono w μg/g świeżej masy jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń.
Na Figurze 6 przedstawiono wykres analizy zawartości białka S-HBsAg w liściach potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) linii 6A, 15E i 26G za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA AUSZYME® firmy Abbott specyficznego dla antygenu S-HBs. Zawartość S-HBsAg wyrażono w μg/g świeżej masy jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń.
Na Figurze 7 przedstawiono wynik analizy ekspresji transgenu S-HBs i form białka S-HBsAg w liściach potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) za pomocą metody western-blot z użyciem poliklonalnych króliczych przeciwciał specyficznych dla białka S-HBsAg.
Oznaczenia ścieżek blotu: M - marker wielkości białek (MBI Fermentas), 6A/326G/9 - analizowane rośliny, K- - kontrola negatywna - ekstrakt białkowy rośliny nietransgenicznej, K+ - kontrola pozytywna - białko S-HBsAg otrzymane od prof. R. Schirmbeck'a (Uniwersytet w Ulm, Niemcy). Zaznaczono formy S-HBsAg: p24 - monomer nieglikozylowanego białka S-HBsAg o masie 24 kDa, gp27 monomer glikozylowanego białka S-HBsAg o masie 27 kDa, gp30 - prawdopodobnie monomer glikozylowanego białka S-HBsAg o masie około 30 kDa, p48 - dimer nieglikozylowanego białka S-HBsAg o masie 48 kDa, gp54 - dimer glikozylowanego białka S-HBsAg o masie 54 kDa, gp60 - prawdopodobnie dimer białka S-HBsAg formy gp30 o masie 60 kDa.
Na Figurze 8 przedstawiono mikrografię cząstek subwiralnych (VLPs) zbudowanych z białka S-HBsAg w komórkach mezofilu liści sałaty (panel A, B) oraz w preparacie szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham) (panel C). W komórkach roślinnych cząstki subwiralne gromadzą się w pęcherzykach, zamykanych następnie w cysternach retikulum endoplazmatycznego - ER. Mikrografię wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM1200 EXII firmy Jeol.
Na Figurze 9 przedstawiono materiały szczepionkowe przeciwko wzw B, przeznaczone do szczepienia drogą doustną, otrzymane z transgenicznej sałaty wytwarzającej białko S-HBsAg - sproszkowany liofilizat do użycia w postaci zawiesiny lub syropu oraz w upostaciowanej formie granulatu, tabletek lub kapsułek.
Na Figurze 10 przedstawiono wykres analizy zawartości białka S-HBsAg za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA AUSZYME® firmy Abbott specyficznego dla antygenu S-HBs w 1 g liofilizatu oraz w 1 g i 1 sztuce tabletek otrzymanych z liści potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) linii 6A, 15E i 26G. Zawartość S-HBsAg wyrażono w pg jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń.
Na Figurze 11 przedstawiono wykres porównujący odpowiedź immunologiczną błon śluzowych przewodu pokarmowego w zakresie przeciwciał klasy IgA, indukowaną za pomocą S-HBsAg zawartego w zawiesinie liofilizatu sałaty transgenicznej oraz preparatu szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham) (rS-HBsAg). Antygen podawano per os dożołądkowo myszom BALB/c w dawce 100 ng/ 100 μ^ zwierzę w odstępach 1 lub 2 miesięcy. Myszy kontrolne otrzymywały zawiesinę liofilizatu sałaty nietransgenicznej. Na wykresie podano wartości średnie wraz z odchyleniami standardowymi miana przeciwciał IgA anty-SHBs przed immunizacją, 10 dni po I immunizacji i 10 dni po II immunizacji dla pięciu myszy z każdej grupy eksperymentalnej oraz kontrolnej.
Na Figurze 12 przedstawiono wykres porównujący systemiczną odpowiedź immunologiczną w zakresie przeciwciał klasy IgA obecnych w surowicy, indukowaną za pomocą S-HBsAg zawartego w zawiesinie liofilizatu sałaty transgenicznej oraz preparatu szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham) (rS-HBsAg). Antygen podawano per os dożołądkowo myszom BALB/c w dawce 100 ng/ 100 μΙ/ zwierzę w odstępach 1 lub 2 miesięcy. Myszy kontrolne otrzymywały zawiesinę liofilizatu sałaty nietransgenicznej. Na wykresie podano wartości średnie wraz z odchyleniami standardowymi miana przeciwciał IgA anty-SHBs przed immunizacją, 10 dni po I immunizacji i 10 dni po II immunizacji dla pięciu myszy z każdej grupy eksperymentalnej oraz kontrolnej.
Na Figurze 13 przedstawiono wykres porównujący systemiczną odpowiedź immunologiczną w zakresie przeciwciał klasy IgG obecnych w surowicy, indukowaną za pomocą S-HBsAg zawartego w zawiesinie liofilizatu sałaty transgenicznej oraz preparatu szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham) (rS-HBsAg). Antygen podawano per os dożołądkowo myszom BALB/c w dawce 100 ng/ 100 μΙ/ zwierzę w odstępach 1 lub 2 miesięcy. Myszy kontrolne otrzymywały zawiesinę liofilizatu sałaty nietransgenicznej. Na wykresie podano wartości średnie wraz z odchyleniami standardowymi miana
PL 213 496 B1 przeciwciał IgG anty-SHBs przed immunizacją, 10 dni po I immunizacji i 10 dni po II immunizacji dla pięciu myszy z każdej grupy eksperymentalnej oraz kontrolnej.
Na Figurze 14 przedstawiono analizę statystyczną (test Duncan'a) istotności zmian poziomu przeciwciał anty-SHBs w klasie przeciwciał IgA błon śluzowych jelita (panel A) oraz przeciwciał IgA (panel B) oraz IgG (panel C) surowicy krwi w wyniku odpowiedzi immunologicznej na podany per os myszom antygen S-HBs w zawiesinie liofilizatu transgenicznej sałaty oraz pochodzący z preparatu szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham) (rS-HBsAg). Poszczególnym grupom statystycznym przypisano kolejne liczby, a grupy nie wykazujące istotnych różnic, tj. jednorodne statystycznie, oznaczono gwiazdkami.
Oznaczenia grup: 1 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 1 miesiąc, poziom przeciwciał anty-SHBs przed immunizacją, 2 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 1 miesiąc, poziom przeciwciał anty-SHBs po I immunizacji, 3 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 1 miesiąc, poziom przeciwciał anty-SHBs po II immunizacji, 4 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs przed immunizacją, 5 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs po I immunizacji, 6 - myszy immunizowane S-HBsAg w liofilizacie co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs po II immunizacji, 7 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 1 miesiąc, poziom przeciwciał anty-SHBs przed immunizacją, 8 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 1 miesiąc, poziom przeciwciał antySHBs po I immunizacji, 9 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 1 miesiąc, poziom przeciwciał anty-SHBs po II immunizacji, 10 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs przed immunizacją, 11 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs po I immunizacji, 12 - myszy immunizowane rS-HBsAg (Engerix B) co 2 miesiące, poziom przeciwciał anty-SHBs po II immunizacji, 13 - myszy otrzymujące liofilizat kontrolny, poziom przeciwciał anty-SHBs przed podaniem liofilizatu, 14 - myszy otrzymujące liofilizat kontrolny, poziom przeciwciał anty-SHBs po I podaniu liofilizatu, 15 - myszy otrzymujące liofilizat kontrolny, poziom przeciwciał anty-SHBs po II podaniu liofilizatu.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu lepszego wyjaśnienia poszczególnych aspektów i etapów realizacji wynalazku i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektora pKHBSBAR do transformacji sałaty
Przygotowanie wektora zawierającego sekwencję kodującą białko antygenowe S-HBs pod kontrolą promotora 35S obejmowało następujące etapy:
Za pomocą metody PCR na matrycy całkowitego DNA Agrobacterium tumefaciens nopalinowego szczepu C58 namnożono terminator syntazy nopalinowej (NOSt) (Croy 1993). Do sekwencji NOSt wprowadzono jednocześnie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Pst I, Xho I od końca 5' oraz Hind III od końca 3'. Terminator wklonowano następnie do plazmidu pUC18 (MBI Fermentas, Yanisch-Perron i in. 1985, Genebank L09136) otrzymując p18PNOSt oraz zsekwencjonowano.
Adaptowano wcześniej sklonowany promotor 35S CaMV (P35S) z wektora p35SGUS-INT (Vannaceyt i in. 1990) w plazmidzie pBluescript KS (Stratagene, Alting-Mees i Short 1989, Genebank X52327) usuwając miejsce restrykcyjne Pst I przy końcu 5' promotora poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Pst I, degradację 3' wystających lepkich końców za pomocą T4 DNA polimerazy, a następnie religację - otrzymano ostatecznie plazmid pKSP35SGI.
Przeklonowano promotor 35S z plazmidu pKSP35SGI do p18PNOSt - otrzymując wektor pMG2A.
Za pomocą metody PCR namnożono sekwencję kodującą S-HBs (poz. 157 - 837) na matrycy wcześniej otrzymanego plazmidu pHBV312, zawierającego kompletny genom polskiego izolatu wirusa HBV (Płucienniczak 1994). Do sekwencji S-HBs wprowadzono jednocześnie miejsca restrykcyjne BamH I od końca 5' i Pst I od końca 3'. Zmodyfikowaną sekwencję S-HBs wklonowano do pGEM-T (Promega, Marcus i in. 1996) - otrzymując pGTHBS i zsekwencjonowano.
Do wektora pMG2A przeklonowano sekwencję S-HBs z pGTHBS otrzymując pMG2AHBS.
Gotową kasetę ekspresyjną: P35S-sekw. S-HBs-NOSt przeniesiono do wektora pGPTV-BAR (Becker i in. 1992) usuwając jednocześnie fragment GUS-NOSt, otrzymując wektor pKHBSBAR.
Wektor pKHBSBAR przygotowano z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych, Taq DNA polimerazy i innych odczynników firmy MBI Fermentas. Schemat konstrukcji wektora binarnego pKHBS -BAR przedstawiono szczegółowo na schemacie [Fig. 1].
PL 213 496 B1
Przygotowany wektor binarny wprowadzono do komórek Agrobacterium tumefaciens szczepu EHA105.
Obecność plazmidu w klonach Agrobacterium sprawdzono za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do sekwencji kodującej białko antygenowe S-HBs.
P r z y k ł a d 2. Transformowanie sałaty za pomocą Agrobacterium tumefaciens.
W celu przeprowadzenia procedury transformowania przygotowano odpowiednio eksplantaty sałaty polskiej odmiany Syrena oraz szczep Agrobacterium tumefaciens EHA105 zawierający plazmid pKHBSBAR.
W celu skiełkowania nasiona sałaty masłowej odmiany Syrena sterylizowano 12 min w 20% wybielaczu chlorowym Clorox® z 0,01% dodatkiem detergentu Tween® 20, a następnie płukano 5-6 razy w sterylnej wodzie dejonizowanej w celu usunięcia resztek czynnika sterylizującego. Nasiona kiełkowano w półcieniu w warunkach 16/8 h fotoperiodu światło/ciemność. Materiał wyjściowy do transformowania stanowią liścienie długości ok. 2 - 3 mm izolowane z 2 - 3 dniowych siewek. W celu użycia do transformacji odpowiedni szczep Agrobacterium tumefaciens EHA105 zawierający plazmid pKHBSBAR posiewano najpierw na pożywkę agarową YEB (Vervliet i in. 1975) z dodatkiem kanamy-1 -1 cyny 50 mgl-1 oraz rifampicyny 100 mgl-1, a następnie przesiewano na pożywkę minimalną AB (Chilton i in. 1974) z dodatkiem antybiotyków jak wyżej. Kultury bakterii utrzymywano w ciemności w temp. 28°C. Z pożywki minimalnej bakterie posiewano na pożywkę płynną MG/L (Garfinkel i Nester 1980). Hodowle płynne wytrząsano przy ok. 250 obrotów na min w temp. 28°C. Po osiągnięciu przez kulturę bakterii fazy wzrostu logarytmicznego tj. po osiągnięciu gęstości optycznej hodowli przy długości fali 550 nm równej 0,4 - 0,8 (OD550= 0,4 - 0,8) z hodowli pobierano 1 ml zawiesiny bakterii, którą inokulowano 100 ml świeżej pożywki MG/L i prowadzono ponownie hodowlę Agrobacterium do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu przy wartości OD550 = 0,4 - 0,8. Następnie w oparciu o standardowe procedury mikrobiologiczne kulturę Agrobacterium rozcieńczano do uzyskania gęstości zawiesiny zawierającej 108 komórek/ml. W tym celu zawiesinę wirowano przez 10 min przy 10 tys. obrotów/min w temperaturze 4°C. Następnie bakterie zawieszano w medium MSGA, zawierającej makroelementy i mikroelementy wg pożywki MS (Murashige i Skoog 1962), 5% glukozy i 100 nM acetosyringonu w objętości odpowiedniej do otrzymania zawiesiny 108 kom./ml. W przygotowanej zawiesinie komórek Agrobacterium inkubowano bezpośrednio wyizolowane eksplantaty liścieni sałaty. Eksplantaty inokulowano w zawiesinie bakterii na szalce przez ok. 10 - 15 min, a następnie w celu kokultury wykładano po zgrubnym odsączeniu Agrobacterium na pożywkę regeneracyjną LR1 o składzie: makro-1 i mikroelementy oraz witaminy wg MS, sacharoza 3%, agar - 0,8%, 6-benzyloaminopuryna - 0,2 mgl-1, -1 kwas α-naftylooctowy - 0,05 mgl- , pH 5,75. Kokulturę Agrobacterium i liścieni sałaty prowadzono przez 4 dni w ciemności w temp. ok. 24°C, a następnie eksplantaty po opłukaniu w sterylnej wodzie dejonizowanej przekładano na świeżą pożywkę selekcyjną LR1 tj. z dodatkiem antybiotyku timentyny -1 (SmithKlineBeecham) w stężeniu 300 mgl- i fosfinotricyny (Riedel de Haen), substancji czynnej herbi-1 cydu Basta w stężeniu 2,5 mgl-1. Eksplantaty roślinne podczas regeneracji utrzymywano w temp. ok. 24°C przy fotoperiodzie dzień/noc 16/8 h i oświetleniu na poziomie eksplantatów ok. 3000 - 4000 lx. Eksplantaty rosnące na selekcyjnej pożywce LR1 przeszczepiano na świeżą pożywkę początkowo co 5 dni, a po upływie 1 miesiąca kultury, co dwa tygodnie. W ciągu ok. 6 - 8 tygodni kultury transformowanych liścieni na pożywce selekcyjnej LR1, obserwowano wzrost morfogennego kalusa z centrami merystematycznymi oraz początki regeneracji pędów w formie rozet i zawiązków liści. Centra regenerującej tkanki transgenicznej przenoszono wówczas na selekcyjną pożywkę LR2 o składzie: makroi mikroelementy wg pożywki SH (Schenk i Hildebrandt 1972), witaminy B5 wg Gamborga (Gamborg
-1 -1 i in. 1968), sacharoza - 3%, agar - 0,7%, kinetyna - 0,5 mgl-1, zeatyna - 0,5 mgl-1, pH 5,75, z antybioty-1 -1 kiem timentyną - 150 mgl-1 i fosfinotricyną - 2,5 mgl-1. Rośliny transgeniczne rozwijające się po ok. 8 - 10 tyg. na selekcyjnej pożywce LR2 j/w odcinano i przeszczepiano na selekcyjną pożywkę 1/2SH zawierającej połowę ilości makroelementów wg SH i pełną dawkę mikroelementów wg SH, witaminy B5, sacharozę - 3%, agar - 0,8%, pH 5,75, z antybiotykiem timentyną i fosfinotricyną jak wyżej. Rośliny transgeniczne ukorzenione na pożywce selekcyjnej 1/2SH przenoszono do warunków ex vitro i adaptowano do warunków glebowych tj. ziemi ogrodniczej w warunkach fitotronu (fotoperiod dzień/noc 16/8 h i temperaturze 22°C, oświetlenie na poziomie roślin ok. 15 - 20 klx). Procedura transformowania sałaty, będąca przedmiotem wynalazku, umożliwia otrzymanie transgenicznych roślin sałaty opornych na fosfinotricynę z wydajnością ok. 20%. Sole, regulatory wzrostu i rozwoju oraz pozostałe odczynniki do pożywek roślinnych i bakteryjnych pochodziły z firm POCh, Sigma oraz Difco.
Linie potencjalnie transgenicznych roślin sałaty analizowano metodą PCR w celu wstępnego potwierdzenia obecności sekwencji transgenu w DNA genomowym [Fig. 2], Rośliny potomne tj. poPL 213 496 B1 kolenia T1 również sprawdzano metodą PCR w celu określenia/potwierdzenia mendlowskiego mechanizmu 3:1 dziedziczenia transgenu roślin transgenicznych [Fig. 3], Następnie genomowy DNA roślin potomnych poddano hybrydyzacji z sondą komplementarną do sekwencji transgenu S-HBs wg techniki Southern blot [Fig. 4] w celu określenia liczby miejsc integracji T-DNA zawierającego transgeny. Zregenerowane rośliny tj. pokolenia T0 oraz rośliny pokolenia T1 badano również pod kątem ekspresji antygenu powierzchniowego HBs przy użyciu techniki western blot [Fig. 7] oraz jakościowego i ilościowego kanapkowego testu immunoenzymatycznego czyli sandwich ELISA z użyciem zestawu AUSZYME® firmy Abbott [Fig. 5, 6]. Obecność antygenu S-HBs ustrukturalizowanego do postaci cząstek subwiralnych/wirusopodobnych VLPs w komórkach mezofilu uwidoczniono w transmisyjnym mikroskopie elektronowym JEM 1200EXII firmy Jeol [Fig. 8]. W celu uwidocznienia VLPs zastosowano standardowe techniki seryjnych skrawków i kontrastowania z niewielkimi modyfikacjami (Kocjan i in. 1996).
P r z y k ł a d 3. Wykrywanie antygenu S-HBs w transgenicznej sałacie techniką western-blot
Antygen S-HBs w transgenicznej sałacie wykrywano techniką western-blot za pomocą przeciwciała monoklonalnego (Mab) C86132M (Biodesign) oraz przeciwciał poliklonalnych obecnych w surowicy króliczej. Surowicę króliczą anty-SHBs otrzymano od prof. B. Szewczyka (Uniwersytet Gdański) po trzykrotnej immunizacji królika rasy Nowozelandzki Duży antygenem S-HBs ze szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham). W celu wykonania analizy western-blot przygotowywano ekstrakty roślinne przez roztarcie próbek liści sałaty w pięciokrotnej objętości (1 mg = 5 μΐ) buforu PBS z 0,5% dodatkiem detergentu Tween® 20. Do roztartych tkanek dodawano denaturujący bufor do próbek (Laemmli 1970) z 50 mM dodatkiem DTT i inkubowano przez 15 min w temp. 65°C. Próbki ekstraktów wraz z wzorcem białka S-HBs (otrzymanego od prof. R. Schirmbeck'a, Uniwersytet w Ulm, Niemcy) oraz markerem wielkości białek (MBI Fermentas) nanoszono na 12,5% denaturujący żel poliakrylamidowy i prowadzono elektroforezę w buforze Laemmli. Białka przenoszono z żelu na membranę nitrocelulozową metodą „mokrego elektrotransferu w aparacie firmy Bio-Rad. Po trzykrotnym przemyciu w buforze TBST (bufor TBS z 0,05%) dodatkiem Tween® 20), membranę z przeniesionymi białkami blokowano za pomocą 3% roztworu BSA w buforze TBS. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze przeciwciał w TBS: 1 μg/ml Mab C86132M (Biodesign) lub 2000* rozcieńczoną surowicą króliczą. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze II-rzędowych przeciwciał znakowanych peroksydazą chrzanową w buforze TBS: 10000* rozcieńczonych kozich poliklonalnych przeciwciał anty-mysich typu „whole molecule' (Sigma) lub 10000* rozcieńczonych kozich poliklonalnych przeciwciał anty-króliczych typu „whole molecule'' (Sigma). Po pięciokrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano z diaminobenzidyną (DAB), tj. substratem dla peroksydazy (Sigma). Wszystkie inkubacje z przeciwciałami oraz przemycia membrany prowadzono z wytrząsaniem ok. 100 obr./min.
Obserwowane w western-blot prążki odpowiadają różnym formom S-HBs, tj. glikozylowanym i niemodyfikowanym monomerom i dimerom, które są pierwszym etapem w procesie składania się cząstek VLPs z S-HBsAg [Fig. 7].
Sole do buforów, BSA itp. pochodziły z firm POCh oraz Sigma.
P r z y k ł a d 4. Oznaczanie antygenu S-HBs w transgenicznej sałacie metodą ELISA.
Zawartość antygenu S-HBs w liściach oznaczano metodą ELISA z wykorzystaniem komercyjnego zestawu Auszyme® Monoclonal Diagnostic Kit firmy Abbott. Zasada detekcji przy użyciu tego zestawu oparta jest na wykrywaniu przez przeciwciało monoklonalne epitopu „a” antygenu S-HBs, który jest eksponowany na powierzchni białka S-HBs złożonego w cząstki subwiralne (VLPs). Zestaw Auszyme® Monoclonal Diagnostic Kit firmy Abbott umożliwia zatem oznaczenie poziomu S-HBsAg upostaciowanego w immunogenne cząstki VLP w badanym materiale.
W celu oznaczenia S-HBsAg w transgenicznych roślinach sałaty przygotowywano ekstrakty roślinne przez roztarcie próbek liści w stopniowo dodawanym buforze w objętości równej pięćdziesięciokrotności masy próbki, tj. 1 mg liści ucierano w 50 μl buforu. Do ekstrakcji zastosowano bufor o następującym składzie: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 10,3 mM Na2SO3, 2% PVP40000, 0,2% BSA, 1% Tween® 20, pH = 7,4. Roztarte próbki zwirowywano przez 5 min przy 10000 obr./min w temperaturze pokojowej. Z supernatantu pobierano 5 - 10 μl ekstraktu, dodawano 40-100 objętości buforu PBS, a następnie 200 μl rozcieńczonego ekstraktu przenoszono do probówki reakcyjnej zestawu Abbott'a. W probówce z ekstraktem roślinnym umieszczano polistyrenową kulkę z zestawu opłaszczoną monoklonalnym przeciwciałem anty-SHBs skierowanym wobec epitopu „a”, po czym dodawano z zestawu 50 μl roztworu w/w przeciwciała sprzężonego z peroksydazą. Całość inku12
PL 213 496 B1 bowano w temperaturze 28°C przez 16 godzin. Reakcję immunologiczną przerywano przez sześciokrotne przemycie kulek wodą destylowaną, po czym dodawano 300 μl roztworu chlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD) w buforze reakcyjnym z zestawu. Po 30 min inkubacji w temp. pok. zatrzymywano reakcję enzymatyczną peroksydazy za pomocą 300 μl 1 N H2SO4. Absorbancję barwnego produktu reakcji mierzono w spektrofotometrze przy λ = 492 nm. Z otrzymanych wartości wyliczano ilość S-HBsAg w μg/g świeżej masy liści według wzoru: S-HBs = [(A492 - a)/b] χ rozc., gdzie a, b współczynniki kierunkowe krzywej kalibracyjnej, rozcieńczenie = 2000 - 5000χ [Fig. 6, 7].
Odczynniki do analiz, pochodziły, poza wymienionymi reagentami zestawu diagnostycznego firmy Abbott, z firm POCh i Sigma.
P r z y k ł a d 5. Przygotowanie liofilizatu i tabletek zawierających antygen szczepionkowy S-HBs na bazie liści transgenicznej sałaty
Rośliny wybranych linii transgenicznej sałaty, charakteryzujących się względnie wysoką zawartością S-HBsAg, tj. pow. 15 μg/g św. masy, były uprawiane w szklarni w warunkach naturalnego fotoperiodu i w temperaturze 20 - 22°C w dzień i 14 - 16°C w nocy. Liście z dobrze rozwiniętych główek zbierano, zamrażano w ciekłym azocie, częściowo rozdrabniając przy tym tkankę, a następnie przechowywano w temperaturze -80°C. Zamrożony materiał umieszczano w liofilizatorze BETA 1-16 firmy CHRIST® i prowadzono liofilizację przez 24-36 h w próżni 0,2 mbar przy temperaturze zamrożenia
- 55°C i tej samej temperaturze półek, na których umieszczano materiał na plastikowych tackach. Zliofilizowany materiał mielono na proszek i przechowywano w szczelnie zamkniętych pojemnikach w obecności żelu silikonowego jako desykatora w temperaturze pokojowej do czasu przygotowania tabletek [Fig. 9].
Do proszku - półproduktu dodawano wypełniacz - laktozę (Meggle) w proporcji 1:1 i lepiszcze
- 10% roztwór PVP tj. poliwinylopirolidonu (BASF) w CH2Cl2 (Merck). Składniki mieszano w mieszarkozagniatarce (ERWEKA) do uzyskania jednorodnej masy, z której przyrządzano granulat w granulatorze oscylacyjnym (ERWEKA) przecierając przez sito φ 1,6 mm. Granulat suszono w temperaturze pokojowej po czym przecierano przez sito φ 1 mm. Przygotowany granulat mieszano z substancją poślizgową - 2% dodatkiem stearynianu magnezu (Mosselman) w mieszalniku romboidalnym (ERWEKA). Następnie tłoczono rdzenie tabletek za pomocą tabletkarki uderzeniowej (KORSCH) stemplami wklęsłymi φ 12 mm. Otrzymane rdzenie powlekano pistoletem natryskowym w bębnie drażerskim (ERWEKA) poszczególnymi warstwami roztworu powlekającego o składzie: 10% octanoftalan celulozy (Colorcon), 0,5% olej rycynowy, 89,5% aceton (POCh), każdorazowo susząc nadmuchem powietrza. Tabletki powleczono następnie 20% roztworem PEG6000 (Merck) w acetonie. Średnia masa tabletki wynosiła 510 mg ±2%.
Proces przetwarzania materiału roślinnego do postaci tabletki kontrolowano przez oznaczanie zawartości antygenu S-HBs w liofilizacie oraz tabletkach [Fig. 10] wg procedury opisanej w Przykładzie 4. Tabletki przygotowane według wynalazku, zawierały około 2 μg S-HBsAg/ szt. Poziom antygenu S-HBs w tabletkach pozostawał stały przez okres co najmniej 12 miesięcy.
P r z y k ł a d 6. Indukcja odpowiedzi immunologicznej na drodze śluzówkowej u myszy po dożołądkowym podaniu liofilizatu sałaty, zawierającego antygen S-HBs.
Zdolność antygenu S-HBs wytwarzanego w sałacie do immunizacji na drodze śluzówkowej i wywoływania zarówno lokalnej odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych przewodu pokarmowego, jak i odpowiedzi systemicznej potwierdzono w doświadczeniach na zwierzętach.
Badania nad immunizacją myszy na drodze śluzówkowej przeprowadzono w oparciu o liofilizowany szczepionkowy materiał roślinny zawierający antygen S-HBs. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano Engerix B (SmithKlineBeecham), standardową rekombinowaną szczepionkę przeciwko wzw B pochodzenia drożdżowego. Natomiast jako kontrolę negatywną użyto liofilizowany materiał roślinny pochodzący z nietransgenicznej sałaty odmiany Syrena.
Badania prowadzono na 6 - 8-tygodniowych myszach szczepu wsobnego BALB/c. Do immunizacji śluzówkowej zastosowano dawkę 100 ng antygenu S-HBs/zwierzę. W przypadku materiału roślinnego, zawieszano w 100 μl buforu PBS odpowiednią ilość sproszkowanego liofilizatu, zwykle 9-10 mg, zawierającą ok. 100 ng S-HBsAg. Myszy kontrolne otrzymywały 10 mg liofilizatu nietransgenicznej sałaty zawieszonego w 100 μl PBS. W przypadku komercyjnej szczepionki Engerix B (SmithKlineBeecham), odpowiednią objętość preparatu (0,1 μθ rozcieńczano w 100 μl buforu PBS. Zawiesinę liofilizatu lub rozcieńczony Engerix B podawano bezpośrednio do żołądka za pomocą tubki gastrycznej.
Zastosowano następujące schematy dwukrotnej immunizacji: 1/ Immunizacja za pomocą liofilizatu szczepionkowego w odstępie 1 miesiąca, 2/ Immunizacja za pomocą liofilizatu szczepionkowego
PL 213 496 B1 w odstępie 2 miesięcy, 3/ Immunizacja za pomocą Engerix B (rS-HBsAg) w odstępie 1 miesiąca, 4/ Immunizacja za pomocą Engerix B (rS-HBsAg) w odstępie 2 miesięcy. W każdej grupie eksperymentalnej oraz w grupie kontrolnej badano po 5 sztuk zwierząt. Po upływie 10 dni od każdej immunizacji, od badanych zwierząt pobierano krew oraz kał. Z kału myszy ekstrahowano w buforze PBS przeciwciała klasy IgA. Próbkę kału zawieszano w PBS, w pięciokrotnej objętości w stosunku do masy próbki, inkubowano przez 15 min, a następnie dokładnie rozcierano. Po inkubacji przez 10 min, całość wytrząsano, inkubowano przez kolejne 15 min, ponownie wytrząsano i wirowano przez 10 minut przy 14000 obr./min w temp. 4°C . Wszystkie etapy ekstrakcji przeciwciał z mysich odchodów wykonywano na lodzie. Zebrany supernatant, zawierający przeciwciała klasy IgA, przechowywano w temp. -20°C. W ekstraktach otrzymanych z kału zwierząt oznaczano specyficzne przeciwciała anty-SHBs [Fig. 11, 14A], Krew pobierano znieczulonym myszom strzykawką z tętnicy ogonowej. Krew wirowano przez 10 min przy 8000 obr./min w temp. 4°C. Uzyskane surowice przechowywano w temp. - 20°C. W surowicy oznaczano specyficzne przeciwciała anty-SHBs klasy IgA [Fig. 12, 14B] oraz IgG [Fig. 13, 14C]. Przeciwciała IgA i IgG anty-SHBs oznaczano metodami immunoenzymatycznymi wg opracowanej procedury. Testy ELISA wykonywano na płytkach Nunc-Immuno Plate F96 Polysorp firmy NUNC™ z użyciem płuczki i czytnika do płytek firmy Bio-Rad. Płytkę opłaszczano przez noc w temp. 4°C antygenem S-HBs R86872 rekombinowanym w drożdżach (Biodesign) w buforze PBS pH 7,4 w stężeniu 1 μg/ml. Płytkę płukano 3 razy w buforze PBST pH 7,4 (bufor PBS z 0,05% dodatkiem Tween® 20), a następnie blokowano przez 90 minut w temp. 25°C za pomocą 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBS pH 7,4. Płytkę płukano jak wyżej i nanoszono próbki mysich surowic, które następnie rozcieńczano w buforze PBS w stosunku 1/1 do uzyskania odpowiednio 20χ, 40χ, 80χ i 160-krotnego rozcieńczenia. Płytkę inkubowano przez 45 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 400 obr./min. Odczynniki odpipetowywano, płytkę płukano jw., a następnie nanoszono kozie przeciwciała anty-mysie IgG typu „whole molecule” sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Sigma) lub anty-mysie IgA sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Sigma) rozcieńczone 3000χ w buforze PBS. Płytkę inkubowano przez 45 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce jw., a następnie po odpipetowaniu reagentów i trzykrotnym płukaniu naniesiono substrat dla alkalicznej fosfatazy, tj. fosforan p-nitrofenylu (Sigma). Większość reagentów nakładano w objętości 100 μΙ/dołek, za wyjątkiem etapu blokowania i płukania gdzie nanoszono objętość 400 pi. Po upływie 1 h i zatrzymaniu reakcji odczytywano absorbancję przy długości 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek Model 680 firmy Bio-Rad. Poziom przeciwciał anty-SHBs obliczano za pomocą oprogramowania dołączonego do czytnika na podstawie krzywej kalibracyjnej. Analizy poziomu przeciwciał przeprowadzono dwukrotnie. Poziom przeciwciał liczono jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z wartości dla pięciu myszy. Analiza statystyczna poziomu przeciwciał anty-SHBs, wykonana z użyciem programu Statistica 6®, wskazuje na porównywalną lub wyższą immunogenność antygenu S-HBs pochodzącego z materiału roślinnego według wynalazku w porównaniu z komercyjną szczepionką Engerix B przy zastosowaniu doustnej metody immunizacji [Fig. 14]. Istotny wzrost poziomu przeciwciał anty-SHBs u myszy następował zarówno w odniesieniu do stanu przed immunizacją, jak i w porównaniu z kontrolą. Większą immunogenność antygenu S-HBs w liofilizacie od rS-HBsAg ze szczepionki Engerix B obserwowano dla klasy przeciwciał IgA w jelicie w przypadku zastosowania 2-miesięcznych odstępów immunizacji [Fig. 14A], a dla klasy przeciwciał IgG w surowicy jeśli zastosowano 1-miesięczne odstępy immunizacji [Fig. 14C]. W pozostałych przypadkach obserwowano porównywalny poziom odpowiedzi immunologicznej na S-HBsAg obecny w materiale roślinnym lub rS-HBsAg ze szczepionki Engerix B.
Claims (11)
1. Cząsteczka T-DNA składająca się z sekwencji granicznych T-DNA oraz umieszczonych pomiędzy nimi dwóch kaset ekspresyjnych:
- kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej białko małego antygenu powierzchniowego wirusa HBV - S-HBsAg oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt), oraz
- kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe, korzystnie genu bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t do otrzymywania roślin transgenicznych, korzystnie sałaty, przeznaczonych do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
2. Cząsteczka T-DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną spośród sekwencji: SEQ ID No. 1 i SEQ ID No. 2.
3. Wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę T-DNA jak określono w zastrz. od 1 do 2.
4. Komórka E. coli zawierająca wektor ekspresyjny jak określono w zastrz. 3.
5. Komórka Agrobacterium tumefaciens zawierająca wektor ekspresyjny jak określono w zastrz. 3.
6. Zastosowanie roślinnego wektora ekspresyjnego jak określono w zastrz. 3, do otrzymywania transgenicznych roślin, korzystnie sałaty, przeznaczonych do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
7. Transgeniczna komórka roślinna zawierająca T-DNA jak określono w zastrz. od 1 do 2 pochodzącego z wektora jak określono w zastrz. 3, zdolna do ekspresji białka małego antygenu powierzchniowego wirusa HBV-S-HBsAg i posiadająca oporność na herbicydy fosfinotricynowe, przeznaczona do otrzymywania liofilizowanego materiału roślinnego do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
8. Komórka według zastrz. 7, znamienna tym, że jest komórką sałaty.
9. Zastosowanie komórki roślinnej jak określono w zastrz. od 7 do 8, do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że stosowane komórki roślinne mają postać biomasy roślinnej, zwłaszcza liofilizowanego materiału roślinnego, korzystnie sałaty.
11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382769A PL213496B1 (pl) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie |
| PCT/PL2008/000046 WO2009002198A2 (en) | 2007-06-28 | 2008-06-26 | Expression cassette, t-dna molecule, plant expression vector, transgenic plant cell as well as their use in the manufacturing of a vaccine |
| EP08779135.6A EP2173885B1 (en) | 2007-06-28 | 2008-06-26 | Expression cassette, t-dna molecule, plant expression vector, transgenic plant cell as well as their use in the manufacturing of a vaccine |
| US12/668,693 US20100313298A1 (en) | 2007-06-28 | 2008-06-26 | Expression cassette, t-dna molecule, plant expression vector, transgenic plant cell as well as their use in the manufacturing of a vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382769A PL213496B1 (pl) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL382769A1 PL382769A1 (pl) | 2009-01-05 |
| PL213496B1 true PL213496B1 (pl) | 2013-03-29 |
Family
ID=40019281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL382769A PL213496B1 (pl) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100313298A1 (pl) |
| EP (1) | EP2173885B1 (pl) |
| PL (1) | PL213496B1 (pl) |
| WO (1) | WO2009002198A2 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL216099B1 (pl) | 2009-01-23 | 2014-02-28 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Transgeniczne komórki roslinne produkujace bialko antygenowe HBcAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki |
| CN110229847A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-13 | 王跃驹 | 生菜作为宿主在表达乙肝疫苗中的应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5612487A (en) * | 1991-08-26 | 1997-03-18 | Edible Vaccines, Inc. | Anti-viral vaccines expressed in plants |
| EP1230257A4 (en) * | 1998-12-23 | 2003-08-13 | Thompson Boyce Plant Res | EXPRESSION OF IMMUNOGENIC HEPATITIS B SURFACE ANTIGENS IN TRANSGENIC PLANTS |
| US7527810B1 (en) * | 1999-10-13 | 2009-05-05 | Health Research, Inc. | Oral immunology using plant product containing hepatitis surface antigen |
| EP1423508B1 (en) * | 2001-09-05 | 2012-01-18 | BASF Plant Science GmbH | Protein phosphatase stress-related polypeptides and methods of use in plants |
-
2007
- 2007-06-28 PL PL382769A patent/PL213496B1/pl unknown
-
2008
- 2008-06-26 EP EP08779135.6A patent/EP2173885B1/en not_active Not-in-force
- 2008-06-26 US US12/668,693 patent/US20100313298A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-26 WO PCT/PL2008/000046 patent/WO2009002198A2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100313298A1 (en) | 2010-12-09 |
| WO2009002198A2 (en) | 2008-12-31 |
| WO2009002198A3 (en) | 2009-02-19 |
| EP2173885A2 (en) | 2010-04-14 |
| EP2173885B1 (en) | 2017-05-03 |
| PL382769A1 (pl) | 2009-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pniewski et al. | Low-dose oral immunization with lyophilized tissue of herbicide-resistant lettuce expressing hepatitis B surface antigen for prototype plant-derived vaccine tablet formulation | |
| Gao et al. | Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg | |
| US7504560B2 (en) | Vaccines expressed in plants | |
| US6136320A (en) | Vaccines expressed in plants | |
| US6034298A (en) | Vaccines expressed in plants | |
| Lou et al. | Expression of the human hepatitis B virus large surface antigen gene in transgenic tomato plants | |
| Shchelkunov et al. | Immunogenicity of a novel, bivalent, plant-based oral vaccine against hepatitis B and human immunodeficiency viruses | |
| Mason et al. | Transgenic plants as vaccine production systems | |
| JP2003512812A (ja) | トランスジェニック植物における免疫原性ｂ型肝炎表面抗原の発現 | |
| CN101815784A (zh) | 植物系统中外来核酸和多肽的产生 | |
| Wang et al. | Immunogenicity of foot-and-mouth disease virus structural polyprotein P1 expressed in transgenic rice | |
| US7879338B2 (en) | Vectors and methods for immunization against norovirus using transgenic plants | |
| Choi et al. | Synthesis and assembly of a cholera toxin B subunit-rotavirus VP7 fusion protein in transgenic potato | |
| US20200080101A1 (en) | Expression of pedv sequences in plants and plant produced vaccine for same | |
| PL213496B1 (pl) | Czasteczka T-DNA, wektor ekspresyjny, zawierajaca go komórka E.coli oraz Agrobacterium tumefaciens, transgeniczna komórka roslinna oraz ich zastosowanie | |
| US8591915B2 (en) | Plant-derived vaccines against respiratory syncytial virus | |
| Elkholy et al. | Expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene in transgenic banana (Musa Sp.) | |
| CN101591647A (zh) | 含有外源性内表位的病毒颗粒 | |
| WO2010085162A2 (en) | Expression cassettes, T-DNA molecules, plant expression vectors, transgenic plant cells as well as the use thereof in the production of a vaccine | |
| US20010053367A1 (en) | Vaccines expressed in plants | |
| Khalsa et al. | Plant‐Derived Vaccines: Progress and Constraints | |
| PL217229B1 (pl) | Transgeniczne komórki roślinne produkujące białko antygenowe M-HBsAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki | |
| PL217212B1 (pl) | Transgeniczne komórki roślinne produkujące białko antygenowe L-HBsAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki | |
| Alli et al. | Pharming vaccines for hepatitis and cytomegalovirus: towards the development of multivalent and subunit vaccines for oral delivery of antigens | |
| JP2003116385A (ja) | 日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物 |