PL216193B1

PL216193B1 - Wyizolowana, ssacza, pochodząca ze szpiku kostnego linia populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych

Info

Publication number: PL216193B1
Application number: PL374868A
Authority: PL
Inventors: Martin Friedlander; Atsushi Otani; Karen Dasilva
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2002-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2014-03-31
Also published as: PL374868A1; RU2331669C2; JP2010285434A; RU2005105065A; US20040197902A1; US7153501B2; KR101095287B1; EP1542536A2; KR20050027132A; AU2003259687A1; KR20110102961A; MXPA05000972A; ES2376866T3; EP1542536A4; CA2493122A1; JP5385219B2; ATE536405T1; WO2004098499A3; BR0312920A; ZA200500682B

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana, ssacza, pochodząca ze szpiku kostnego linia populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych (Lin HSC).

Związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (ARMD) i retinopatia cukrzycowa (DR) są wiodącymi przyczynami utraty wzroku w krajach uprzemysłowionych, a dzieje się tak na skutek nieprawidłowego ponownego unaczyniania (ang. neovascularization) siatkówki. Ponieważ siatkówka składa się z dobrze określonych warstw elementów neuronowych, glejowych i naczyniowych, względnie niewielkie zaburzenia, takie jak te obserwowane w rozroście naczyń lub obrzęku, mogą doprowadzić do znaczącej utraty funkcji wzrokowej. Dziedziczne zwyrodnienia siatkówki, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) także wiążą się z nieprawidłowościami naczyniowymi, takimi jak zwężenie tętniczkowe i zanik naczyń. Mimo, że poczyniono istotne postępy w identyfikacji czynników promujących i hamujących rozwój naczyń (angiogenezę), nie jest obecnie dostępna żadna terapia swoiście lecząca naczyniowe choroby oczu.

Przez wiele lat wiadomo było, że u dorosłych w prawidłowym krążeniu i w szpiku kostnym istnieje populacja komórek macierzystych. Różne subpopulacje tych komórek mogą różnicować się w linii krwiotwórczej zróżnicowanej (Lin+) lub niekrwiotwórczej niezróżnicowanej (Lin ). Ponadto, wykazano niedawno, że populacja komórek macierzystych krwiotwórczych (HSC) niezróżnicowanych zawiera śródbłonkowe komórki prekursorowe (EPC) zdolne do tworzenia naczyń krwionośnych in vitro oraz in vivo. Asahara i wsp. Science 275, 964-7 (1997). Komórki te mogą uczestniczyć w prawidłowym i patologicznym poporodowym rozwoju naczyń (Patrz Lyden i wsp. Nat. Med. 7, 1194-201 (2001); Kalka i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3422-7 (2000); i Kocher i wsp. Nat. Med. 7, 430-6 (2001)), a także różnicować się w kierunku szeregu różnych typów komórek nieśródbłonkowych, w tym hepatocytów (Patrz Lagasse i wsp. Nat. Med. 6, 1229-34 (2000)), mikrogleju (Patrz Priller i wsp. Nat. Med. 7, 1356-61 (2002)), kardiomiocytów (Patrz Orlic i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 10344-9 (2001)) i nabłonka (Patrz Lyden i wsp. Nat. Med. 7, 1194-201 (2001)). Chociaż komórki te były stosowane w kilku doświadczalnych modelach rozwoju naczyń, mechanizm kierowania EPC do nowo tworzących się naczyń nie jest znany i nie zidentyfikowano strategii, która skutecznie zwiększyłaby liczbę komórek, które przyczyniają się do powstania danego układu naczyniowego.

EPC w populacjach niezróżnicowanych HSC według niniejszego wynalazku rozlegle włączają się do rozwijających się naczyń siatkówki i pozostają stabilnie włączone do nowo powstających naczyń oka. Wyizolowane niezróżnicowane populacje HSC według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do ratowania i stabilizowania wyrodniejącego układu naczyniowego siatkówki u ssaków. W jednym z wykonań wyizolowanych populacji Lin HSC według niniejszego wynalazku komórki są transfekowane użytecznym terapeutycznie genem. Stransfekowane komórki mogą wybiórczo kierować się do nowo powstającego układu naczyniowego i hamować powstawanie nowych naczyń bez wpływu na już utworzone naczynia przez rodzaj komórkowej terapii genowej. Komórki z wyizolowanej niezróżnicowanej populacji HSC według niniejszego wynalazku, które stransfekowano genem kodującym peptydy hamujące angiotensynę są użyteczne w modulacji nieprawidłowego wzrostu naczyń krwionośnych w chorobach, takich jak ARMD, DR i niektóre zwyrodnienia siatkówki związane z nieprawidłowym układem naczyniowym.

Szczególną zaletą terapii ocznych przy zastosowaniu wyizolowanych populacji Lin HSC według niniejszego wynalazku jest ratujący wpływ odżywczy na naczynia i nerwy obserwowany w oczach śródszklistkowo leczonych Lin HSC. W oczach leczonych izolowanymi Lin HSC według wynalazku neurony i fotoreceptory siatkówki są zachowane i utrzymana jest funkcja wzrokowa.

Krótki opis rysunków

Figura 1 (a i b) przedstawia schematyczne diagramy rozwijającej się siatkówki myszy, (a) Rozwój splotu pierwotnego, (b) Druga faza tworzenia się naczyń siatkówki. GCL - warstwa komórek zwojowych, IPL - wewnętrzna warstwa komórek splotowych, INL - wewnętrzna warstwa komórek jądrzastych, OPL - zewnętrzna warstwa komórek splotowych, ONL - zewnętrzna warstwa komórek jądrzastych, RPE - warstwa nabłonka barwnikowego siatkówki, ON - nerw wzrokowy, P - obwód.

Figura 1c przedstawia charakterystykę przez cytometrię przepływową rozdzielonych pochodzących ze szpiku kostnego komórek Lin⁺HSC i Lin HSC. Górny rząd: wykres punktowy komórek nie wyznakowanych przeciwciałem, w których R1 określa mierzalny bramkowany obszar dodatniego barwienia PE; R2 oznacza dodatnie barwienie pod względem GFP. Środkowy rząd: komórki Lin HSC (C57B/6) i dolny rząd - Lin⁺HSC (C57B/6), gdzie każdą linię komórkową wyznakowano sprzęgniętymi

PL 216 193 B1 z PE przeciwciałami przeciwko Sca-1, c-kit, Flk-1/KDR, CD31. Dane dla Tie-2 uzyskano od myszy Tie-2-GFP. Procenty oznaczają procent dodatnio wyznakowanych komórek w całych populacjach

Lin HSC lub Lin+HSC.

Figura 2 przedstawia wszczepienie komórek Lin HSC do rozwijającej się siatkówki myszy, (a) Cztery dni po śródszklistkowym wstrzyknięciu (P6) komórki eGFP+ Lin HSC przyłączają się i różnicują na siatkówce (b) Lin HSC (myszy B6.129S7-Gtrosa26, wybarwione przeciwciałem β-gal) lokują się powyżej układu naczyniowego wybarwionego przeciwciałem przeciwko kolagenowi IV (gwiazdka wskazuje końcówkę układu naczyniowego). (c) Większość komórek Lin⁺HSC (eGFP⁺) cztery dni po wstrzyknięciu (P6) nie była zdolna do różnicowania. (d) Krezkowe mysie EC eGFP⁺ cztery dni po wstrzyknięciu (P6). (e) Lin HSC (eGFP+) wstrzyknięte do oczu dorosłej myszy. (f) niskie powiększenie eGFP+ Lin HSC (strzałki) kierujących się do i różnicujących wzdłuż powstałej wcześniej matrycy astrocytów u myszy transgenicznej GFAP-GFP. (g) Wyższe powiększenie związku między komórkami Lin^- (eGFP) a podścielającymi je astrocytami (strzałki), (h) Nie nastrzyknięta kontrola transgeniczna GFAP-GFP. (i) Cztery dni po wstrzyknięciu (P6) komórki eGFP⁺ Lin HSC migrują do obszaru przyszłego głębokiego splotu i tam ulegają różnicowaniu. Figura po lewej ukazuje aktywność komórek Lin HSC w osadzonym preparacie całej siatkówki; Figura po prawej wskazuje położenie komórek Lin^- (strzałki) w siatkówce (góra to strona ciała szklistego, dół to strona twardówki). (j) Podwójne znakowanie przeciwciałami a-CD31-PE i a-GFP-alexa 488. Siedem dni po wstrzyknięciu wstrzyknięte komórki Lin HSC (eGFP, czerwone) zostały włączone do układu naczyniowego (CD31). Strzałki wskazują obszary włączenia, (k) Komórki eGFP⁺ Lin HSC tworzą naczynia czternaście dni po wstrzyknięciu (P17). (l i m) Dosercowe wstrzyknięcie rodaminy-dekstranu wskazuje, że naczynia są nienaruszone i funkcjonalne zarówno w splocie pierwotnym (I), jak i splocie głębokim (m).

Figura 3 (a i b) pokazuje, że komórki eGFP⁺ Lin^-HSC kierują się do miejsca glejozy (wskazanego przez wyrażające GFAP astrocyty, obraz skrajny po lewej) zaindukowanej zarówno przez uszkodzenie wywołane laserem (a), jak i mechaniczne (b) w dorosłej siatkówce (gwiazdka wskazuje miejsce uszkodzenia), Obrazy skrajne po prawej przedstawiają większe powiększenia, wykazujące bliski związek Lin HSC z astrocytami. Słupek skali - 20 μΜ.

Figura 4 pokazuje, że komórki Lin HSC ratują układ naczyniowy myszy ze zwyrodnieniem siatkówki, (a-d) Siatkówki 27 dni po wstrzyknięciu (P33) z barwieniem kolagenu IV; (a) i (b), siatkówki, do których wstrzyknięto komórki Lin⁺HSC (Balb/c) nie wykazywały różnic w układzie naczyniowym w porównaniu z normalnymi myszami FVB; (c) i (d), siatkówki, do których wstrzyknięto Lin HSC (Balb/c) wykazywały bogatą sieć naczyń analogicznie do myszy dzikich; (a) i (c), zamrożone skrawki całej siatkówki (góra jest stroną ciałka szklistego, dół jest stroną twardówki) z barwieniem DAPI; (b) i (d) splot głęboki w osadzonym preparacie całej siatkówki; (e) wykres słupkowy przedstawiający wzrost unaczynienia głębokiego splotu naczyniowego tworzonego w siatkówkach, do których wstrzyknięto komórki Lin HSC (n=6). Zakres głębokiego unaczynienia siatkówki oznaczono ilościowo przez obliczenie całkowitej długości naczyń w każdym obrazie. Porównano średnie całkowite długości naczyń/pole widzenia przy dużym powiększeniu (w mikronach) dla Lin HSC, Lin⁺HSC lub siatkówek kontrolnych, (f) Porównanie długości głębokiego splotu naczyniowego po wstrzyknięciu Lin HSC (R, prawe oko) lub Lin⁺HSC (L, lewe oko) u myszy rd/rd. Przedstawiono wyniki dla sześciu niezależnych myszy (każdy z kolorów przedstawia inną mysz). (g) i (h) Komórki Lin HSC również (Balb/c) ratowały układ naczyniowy rd/rd po wstrzyknięciu do oczu P15. Przedstawiono środkowy i głęboki splot naczyniowy siatkówek, do których wstrzyknięto komórki Lin HSC (G) lub Lin⁺HSC (H) (jeden miesiąc po wstrzyknięciu).

Figura 5 przedstawia mikrofotografie tkanki siatkówki myszy: (a) głęboka warstwa osadzonego preparatu całej góry siatkówki (mysz rd/rd), pięć dni po wstrzyknięciu (P11) eGFP⁺ Lin HSC (zielone).

(b) i (c) układ naczyniowy siatkówki P60 myszy Tie-2-GFP (rd/rd), które otrzymały iniekcję komórek Balb/c Lin^- (A) lub komórek Balb/c Lin⁺ (B) w P6. Układ naczyniowy wybarwiono przeciwciałem przeciwko CD31 (czerwone), zaś tylko endogenne komórki śródbłonka wykazują barwę zieloną. Strzałki wskazują naczynia wybarwione CD31, lecz nie GFP. (d) barwienie α-SMA siatkówki, do której wstrzyknięto Lin HSC i siatkówki kontrolnej.

Figura 6 pokazuje, że Lin HSC stransfekowane T2-TrpRS hamują rozwój układu naczyniowego siatkówki myszy, (a) Schemat ludzkiego TrpRS, T2-TrpRS i T2-TrpRS z sekwencją sygnałową Igk na

N-końcu. (b) Siatkówki, do których wstrzyknięto komórki Lin^- stransfekowane T2-TrpRS wyrażają białko T2-TrpRS in vivo. 1, zrekombinowane T2-TrpRS wytworzone w E. coli; 2, zrekombinowane T2-TrpRS wytworzone w E. coli; 3, zrekombinowane T2-TrpRS wytworzone w E. coli; 4, siatkówka kontrolna;

PL 216 193 B1

5, siatkówka, do której wstrzyknięto Lin HSC + pSecTag2A (sam wektor); 6, siatkówka, do której wstrzyknięto Lin HSC + pKLel35 (Igk-T2-TrpRS w pSecTag). (a; endogenne TrpRS b; zrekombinowane T2-TrpRS c; T2-TrpRS z siatkówki, do której wstrzyknięto Lin HSC). (c-f) reprezentatywne pierwotne (płytkie) i wtórne (głębokie) sploty nastrzykniętych siatkówek siedem dni po wstrzyknięciu;

(c) i (d), oczy, do których wstrzyknięto Lin HSC stransfekowane pustym plazmidem rozwijały się prawidłowo; (e) i (f) większość oczu, do których wstrzyknięto Lin HSC stransfekowane T2-TrpRS wykazywała zahamowanie rozwoju splotu głębokiego; (c) i (e), splot pierwotny (płytki); (d) i (f) splot wtórny (głęboki). Słabe zarysy naczyń obserwowane w F są wynikiem przenikania obrazów naczyń sieci pierwotnej przedstawionych w (e).

Figura 7 przedstawia sekwencję DNA kodującą wyznakowane His6 T2-TrpRS, SEKW. NR ID.: 1.

Figura 8 przedstawia sekwencję aminokwasową wyznakowanego His6 T2-TrpRS, SEKW. NR

ID.: 2.

Figura 9 przedstawia mikrofotografie i elektroretinogramy (ERG) siatkówek myszy, do których oczu wstrzyknięto Lin HSC według niniejszego wynalazku i Lin+HSC (kontrole).

Figura 10 przedstawia wykresy statystyczne ukazujące korelację między ratowaniem neuronów (oś y) a ratowaniem naczyń (oś x) zarówno dla pośredniej (Int), jak i głębokiej warstwy naczyniowej oczu myszy rd/rd poddanych leczeniu Lin HSC.

Figura 11 przedstawia wykresy statystyczne ukazujące brak korelacji między ratowaniem neuronów (oś y) a ratowaniem naczyń (oś x) oczu myszy rd/rd poddanych leczeniu Lin⁺HSC.

Figura 12 to wykres słupkowy długości naczyń (oś y) w arbitralnych jednostkach względnych dla oczu myszy rd/rd traktowanych Lin HSC (ciemne słupki) i nie traktowanych (jasne słupki) w punktach czasowych 1 miesiąca (1M), 2 miesięcy (2M) i 6 miesięcy (6M) po wstrzyknięciu.

Figura 13 zawiera trzy wykresy słupkowe liczby jąder w zewnętrznej warstwie nerwowej (ONR) myszy rd/rd 1 miesiąc (1M), 2 miesiące (2M) i 6 miesięcy (6M) po wstrzyknięciu i wykazuje znaczący wzrost liczby jąder dla oczu traktowanych Lin^-HSC (ciemne słupki) względem oczu kontrolnych traktowanych Lin⁺HSC (jasne słupki).

Figura 14 przedstawia wykresy liczby jąder w zewnętrznej warstwie nerwowej pojedynczych myszy rd/rd porównujące oko prawe (R, leczone Lin HSC) względem oka lewego (L, oko kontrolne traktowane Lin⁺HSC) w punktach czasowych (po wstrzyknięciu) 1 miesiąca (1M), 2 miesięcy (2M) i 6 miesięcy (6M); każda linia na danym wykresie porównuje oczy pojedynczej myszy.

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej, ssaczej, pochodzącej ze szpiku kostnego linii populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych obejmującej śródbłonkowe komórki progenitorowe, w której przynajmniej około 50% komórek zawiera znaczniki komórkowe CD31 i c-kit i ewentualnie transfekowanej przeciwangiogennym fragmentem T2 syntetazy tryptofanylo-tRNA (T2-TrpRS) do zastosowania w leczeniu choroby oczu u ssaka przez iniekcję śródszklistkową do chorego oka ssaka.

Korzystnie w wyizolowanej populacji komórek macierzystych przynajmniej około 75% komórek zawiera znacznik komórkowy CD31.

Korzystnie przynajmniej około 65% komórek zawiera znacznik komórkowy c-kit.

Korzystnie przynajmniej około 80% komórek zawiera znacznik komórkowy CD31 i przynajmniej około 70% komórek zawiera znacznik komórkowy c-kit.

Korzystnie komórki są komórkami mysimi lub komórki są komórkami ludzkimi.

Korzystnie do około 8% komórek zawiera także znacznik komórkowy Sca-1 i do około 4% komórek zawiera także znacznik komórkowy Flk-1/KDR.

Korzystnie wyizolowana populacja komórek obejmuje ponadto pożywkę do hodowli komórek.

Korzystnie populacje Lin HSC według niniejszego wynalazku mogą także obejmować do około 1% komórek zawierających znacznik komórkowy Tie-2.

W korzystnych wykonaniach wyizolowane populacje Lin HSC według niniejszego wynalazku pochodzą ze szpiku kostnego myszy lub człowieka, korzystnie z ludzkiego szpiku kostnego.

Wyizolowane populacje Lin HSC według niniejszego wynalazku zawierają komórki EPC, które różnicują się w kierunku komórek śródbłonka i wytwarzają struktury naczyniowe w siatkówce. Lin HSC według niniejszego wynalazku są szczególnie korzystne dla leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki związanych z tworzeniem nowych naczyń i z naczyniami, a także dla naprawiania uszkodzeń naczyń siatkówki.

Wyizolowaną populację niezróżnicowanych komórek krwiotwórczych korzystnie wykorzystuje się w leczeniu, gdy chorobą jest choroba zwyrodnieniowa siatkówki lub retinopatia niedokrwienna lub

PL 216 193 B1 krwotok naczyniowy lub wyciek naczyniowy lub niezapalne zwyrodnienie naczyniówki lub gdy chorobą jest związane z wiekiem tarczkowate zwyrodnienie plamki żółtej (ARMD) lub retinopatia cukrzycowa (DR) lub domniemana histoplazmoza oczna (POHS), lub retinopatia wcześniaków (fibroplazja pozasoczewkowa (ROP), lub anemia sierpowata lub barwnikowe zwyrodnienie siatkówki.

Liczba komórek macierzystych wstrzykniętych do oka jest wystarczająca dla zatrzymania stanu chorobowego w oku pacjenta. Przykładowo, liczba komórek może być skuteczna dla naprawy uszkodzenia siatkówki w oku pacjenta, stabilizacji nowo powstających naczyń siatkówki, dojrzewania nowo powstających naczyń siatkówki i zapobiegania lub naprawy wycieków naczyniowych i krwotoków naczyniowych.

Komórki obecne w wyizolowanych populacjach Lin HSC według niniejszego wynalazku mogą być stransfekowane użytecznymi terapeutycznie genami takimi, jak geny kodujące biała przeciwangiogenne, dla zastosowania w komórkowej terapii genowej oczu.

Stransfekowane komórki mogą zawierać dowolny gen, który jest użyteczny terapeutycznie dla leczenia schorzeń siatkówki.

Korzystnie komórki w wyizolowanej populacji komórek macierzystych są stransfekowane genem kodującym przeciwangiogenny fragment TrpRS, którym jest 2-TrpRS.

TrpRS lub jego fragmenty przeciwangiogenne takie, jak jego fragmenty T1 i T2, są szczegółowo opisane w będącym współwłasnością i jednocześnie przedmiotem postępowania zgłoszeniu patentowym USA nr 10/080,839, którego opis jest tu włączony przez referencję.

Niniejszym ujawniono również sposób izolowanie populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych zawierających śródbłonkowe komórki prekursorowe ze szpiku kostnego. Sposób obejmuje etapy (a) uzyskania szpiku kostnego od ssaka; (b) wydzielenia ze szpiku kostnego zbioru monocytów; (c) wyznakowania monocytów sprzęgniętymi z biotyną przeciwciałami panelu linii różnicowania przeciwko CD45, CD3, Ly-6G, CD11 i TER-119; i (d) usunięcia monocytów dodatnich pod względem CD45, CD3, Ly-6G, CD11 i TER-119 ze zbioru monocytów dla dostarczenia populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych zawierających śródbłonkowe komórki prekursorowe.

Choroby związane z tworzeniem naczyń w oczach leczy się przez podanie Lin HSC według niniejszego wynalazku za pomocą śródszklistkowego wstrzyknięcia komórek do oka. Takie stransfekowane kompozycje Lin HSC obejmują Lin HSC stransfekowane użytecznym terapeutycznie genem, takim jak gen kodujący produkt przeciwangiogenny.

₅

Korzystnie przynajmniej 1 x 10 komórek Lin HSC lub stransfekowanych komórek Lin HSC podaje się przez śródszklistkowe wstrzyknięcie do oka cierpiącego na zwyrodnieniowe schorzenie siatkówki. Liczba wstrzykiwanych komórek może zależeć od nasilenia zwyrodnienia siatkówki, wieku pacjenta i innych czynników, które będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie leczenia chorób siatkówki. Lin HSC mogą być podane jako pojedyncza dawka lub przez podawanie wielu dawek w określonym czasie, zgodnie z wytycznymi lekarza prowadzącego leczenie.

Populacje Lin HSC według niniejszego wynalazku są użyteczne dla wprowadzania terapeutycznych genów do siatkówki, zwłaszcza do układu naczyniowego siatkówki. W korzystnym wykonaniu sposobu dostarczania genów komórki w populacjach Lin HSC według niniejszego wynalazku są stransfekowane genem kodującym peptyd przeciwangiogenny taki, jak przeciwangiogenny fragment syntetazy tryptofanylo-tRNA (TrpRS). Do szczególnie korzystnych fragmentów TrpRS należą fragmenty T1 i T2 TrpRS. Stransfekowane komórki w kompozycjach Lin HSC kodujące peptyd przeciwangiogenny są użyteczne dla leczenia chorób siatkówki związanych z nieprawidłowym rozwojem naczyń, takich jak retinopatia cukrzycowa i podobne choroby.

Sposoby

P r z y k ł a d 1.

Izolacja i wzbogacanie komórek; Wytwarzanie populacji A i B Lin HSC.

Ogólna procedura. Wszystkie oceny in vivo przeprowadzono w zgodzie z wytycznymi NIH dotyczącymi hodowli i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych, a wszystkie procedury oceny zostały zaakceptowane przez Komitet Hodowli i Wykorzystania Zwierząt The Scripps Research Institute (TSRI, La Jolla, CA). Komórki szpiku kostnego wyekstrahowano od dorosłych myszy B6. 1 29S7-Gtrosa26, Tie-2GFP, ACTbEGFP, FVB/NJ (myszy rd/rd) lub Balb/cBYJ (The Jackson Laboratory, ME).

Następnie monocyty oddzielono metodą rozdziału w gradiencie gęstości z wykorzystaniem gradientu polisacharozy HISTOPAQUE® (Sigma, St. Louis, MO) i wyznakowano sprzęgniętymi z biotyną przeciwciałami panelu linii różnicowania (CD45, CD3, Ly-6G, CD11, TER-119, Pharmingen,

PL 216 193 B1

San Diego, CA) w celu selekcji Lin^-. Komórki zróżnicowane (Lin+) oddzielono i usunięto od Lin HSC za pomocą urządzenia do rozdziału magnetycznego (AUTOMACS™ sorter, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Uzyskaną populację Lin HSC zawierającą śródbłonkowe komórki prekursorowe scharakteryzowano dalej stosując cytometr przepływowy FACS™ Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) z zastosowaniem następujących przeciwciał: Sca-1 sprzęgnięte z PE, c-kit, KDR, i CD31 (Pharmingen, San Diego, CA). Komórki szpiku kostnego Tie-2-GFP użyto dla scharakteryzowania Tie-2.

W celu zebrania komórek śródbłonka dorosłych myszy tkankę krezkową pobrano chirurgicznie od myszy ACTbEGFP i umieszczono w kolagenazie (Worthington, Lakewood, NJ) dla strawienia tkanki, po czym przefiltrowano przez filtr 45 μm. Przesącz zebrano i inkubowano z podłożem do hodowli komórek śródbłonka Endothelial Growth Media (Clonetics, San Diego, CA). Cechy śródbłonkowe potwierdzono przez obserwację występowania morfologii przypominającej „kostkę brukową, wybarwienie CD31 mAb (Pharmingen) i badanie hodowli pod kątem tworzenia rurkopodobnych struktur w macierzy MATRIGEL™ (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Populacja A Lin^-HSC. Komórki szpiku kostnego wyizolowano od myszy ACTbEGFP przy zastosowaniu opisanej powyżej ogólnej procedury. Komórki Lin HSC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej FACS pod kątem występowania antygenów znaczników powierzchniowych CD31, c-kit, Sca-1, Flk-1 i Tie-2. Wyniki przedstawiono na FIG. 1c. Około 81% Lin HSC wykazało obecność znacznika CD31, około 70,5% Lin HSC wykazało obecność znacznika c-kit, około 4% Lin HSC wykazało obecność znacznika Sca-1, około 2,2% Lin HSC wykazało obecność znacznika Flk-1 i około 0,91% Lin HSC wykazało obecność znacznika Tie-2. W przeciwieństwie do nich, komórki Lin⁺HSC, które wyizolowano spośród tych komórek szpiku wykazały istotnie różny profil znaczników komórkowych (tzn. CD31: 37,4%; c-kit: 20%; Sca-1: 2,8%; Flk-1 0,05%).

Populacja B Lin^-HSC. Komórki szpiku kostnego wyizolowano od myszy BalbC, ACTbEGFP i C3H przy zastosowaniu opisanej powyżej ogólnej procedury. Komórki Lin HSC przeanalizowano na obecność znaczników powierzchniowych komórki (Sca-1, KDR, cKit, CD34, CD31 i różne integryny: α1, α2, α3, α4, α5, a6, α_Μ, α_ν, a_X, an_b, β·|, β₂, β₃, β₄, β₅ i β₇).

Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1.

Charakterystyka populacji B Lin^-HSC

Znacznik komórkowy	Lin'HSC
1	2
α1	0,10
α2	17,57
α3	0,22
α4	89,39
α5	82,47
α6	77,70
αι_	62,69
αΜ	35,84
αχ	3,98
αν	33,64
αΙΙό	0,25
βΐ	86,26
β2	49,07
β3	45,70
β4	0,68
β5	9,44

PL 216 193 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

1	2
β7	11,25
CD31	51,76
CD34	55,83
Flk-1/KDR	2,95
c-kit	74,42
Sca-1	7,54

P r z y k ł a d 2.

Śródszklistkowe podawanie komórek

Powiekę nacięto cienkim ostrzem dla odsłonięcia gałki ocznej P2 do P6. Następnie populację A ₅ niezróżnicowanych HSC według niniejszego wynalazku (około 10 komórek w około 0,5 μΐ do około 1 μΐ podłoża do hodowli komórek) wstrzyknięto śródszklistkowo za pomocą strzykawki z igłą rozmiaru 33 (Hamilton, Reno, NV).

P r z y k ł a d 3.

Transfekcja EPC.

Lin^-HSC (populacja A) transfekowano DNA kodującym fragment T2 TrpRS kodującym również znacznik His6 (SEKW. NR ID.: 1, FIG. 7) za pomocą odczynnika do transfekcji FuGENE^TM6 Transfection Reagent (Roche, Indianapolis, IN) zgodnie z protokołem wytwórcy. Komórki z kompozycji Lin HSC (około 10⁶ komórek na ml) zawieszono w podłożu opti-MEM® (Invitrogen, Carlsbad, CA) zawierającym czynnik dla komórek macierzystych (PeproTech, Rocky Hill, NJ). Następnie dodano mieszaninę DNA (około 1 μg) i odczynnika FuGENE (około 3 μθ i inkubowano mieszaniny w około 37°C przez około 18 godzin. Po inkubacji komórki przepłukano i zebrano. Częstość transfekcji w tym układzie wynosiła około 17%, co potwierdzono analizą FACS. Wytwarzanie T2 potwierdzono przez hybrydyzację Western. Sekwencję aminokwasową wyznakowanego His6 T2-TrpRS przedstawiono jako SEKW. NR ID.: 2, FIG. 8.

P r z y k ł a d 4.

Immunohistochemia i analiza konfokalna

Siatkówki zebrano w różnych punktach czasowych i przygotowano do osadzania w całości albo do przygotowania skrawków w kriotomie. Dla osadzania w całości siatkówki utrwalono 4% paraformaldehydem i blokowano w 50% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20% normalnej surowicy koziej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Siatkówki poddano obróbce dla przeciwciał pierwszorzędowych i wykrywano przeciwciałami drugorzędowymi. Zastosowanymi przeciwciałami pierwszorzęd owymi były anty-Collagen IV (Chemicon, Temecula, CA, anty-3-gal (Promega, Madison, WI), anty-GFAP (Dako Cytomation, Carpenteria, CA), anty-a-aktyna mięśni gładkich (α-SMA, Dako Cytomation). Zastosowane przeciwciała drugorzędowe były sprzęgnięte ze znacznikami fluorescencyjnymi Alexa 488 albo 594 (Molecular Probes, Eugene, OR). Zdjęcia zrobiono za pomocą mikroskopu konfokalnego MRC 1024 (Bio-Rad, Hercules, CA). Obrazy trójwymiarowe stworzono za pomocą programu LASERSHARP® (Bio-Rad) w celu zbadania trzech różnych warstw rozwijających się naczyń w preparacie osadzonej w całości siatkówki.

P r z y k ł a d 5.

Ilościowe oznaczenie angiogenezy w siatkówce in vivo

Do analizy T2-TrpRS z obrazów trójwymiarowych odtworzono splot pierwotny i głęboki. Splot pierwotny podzielono na dwie kategorie: rozwój prawidłowy lub zatrzymana progresja naczyń. Kategorie zahamowania głębokiego rozwoju naczyniowego utworzono na podstawie procentowego zahamowania naczyń obejmującego następujące kryteria: całkowite zahamowanie tworzenia splotu głębokiego oznaczono jako Całkowite, prawidłowy rozwój naczyń (w tym poniżej 25% hamowania) oznaczono jako Prawidłowe, zaś pozostałe przypadki oznaczono jako Częściowe. Dla danych ratowania myszy rd/rd sfotografowano cztery odrębne obszary splotu głębszego w każdej osadzonej w całości siatkówce przy zastosowaniu obiektywu 10x. Dla każdego obrazu obliczono całkowitą długość naczyń, dodano i porównano między grupami. Dla uzyskania dokładnych informacji u tej samej myszy

PL 216 193 B1 wstrzyknięto do jednego oka Lin HSC, a do drugiego oka Lin+HSC. Kontrolne, nienastrzyknięte siatkówki pobrano z tego samego miotu.

P r z y k ł a d 6.

Modele uszkodzeń siatkówki dorosłych

Modele laserowe i blizn wytworzono przy zastosowaniu lasera diodowego (150 mW, 1 sekunda, 50 mm) albo mechanicznie przez przekłucie siatkówki igłą rozmiaru 27. Pięć dni po uszkodzeniu komórki wstrzyknięto stosując metodę śródszklistkową. Oczy pobrano pięć dni później.

P r z y k ł a d 7.

Neurotroficzne ratowanie regeneracji siatkówki

Niezróżnicowane krwiotwórcze komórki macierzyste (Lin HSC) pochodzące z dorosłego szpiku kostnego mają ratunkowy efekt waskulotroficzny i neurotroficzny w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki. Prawe oczy dziesięciodniowych myszy nastrzyknięto śródszklistkowo około 0,5 mikrolitrami ₅ zawierającymi około 10 Lin HSC według niniejszego wynalazku i oceniono dwa miesiące później na obecność układu naczyniowego siatkówki i ilości jąder w warstwie neuronowej. Lewe oczy tych samych myszy nastrzyknięto tą samą ilością Lin⁺HSC w charakterze kontroli i oceniono w ten sam sposób. Jak przedstawiono to na FIG. 9, w oczach leczonych Lin HSC układ naczyniowy siatkówki wyglądał nieomal prawidłowo, wewnętrzna warstwa jądrowa była nieomal prawidłowa, zaś zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL) miała 3 do 4 warstw jąder. W przeciwieństwie do nich, oko po przeciwnej stronie leczone Lin⁺HSC miało znacząco zanikową środkową warstwę naczyniową siatkówki, całkowicie zanikową zewnętrzną warstwę naczyniową siatkówki, wewnętrzna warstwa jądrowa była znacząco zanikowa, zaś zewnętrzna warstwa jądrowa całkowicie zniknęła. Wyraźnie ilustrował to przykład u myszy 3 i u myszy 5. U myszy 1 nie było efektu ratowania i to było prawdziwe w przypadku około 15% nastrzykniętych myszy.

Gdy oceniano funkcję wzrokową elektroretinogramami (ERG), odzyskanie dodatniego ERG dostrzeżono, gdy zaobserwowano zarówno ratowanie naczyń, jak i neuronów (myszy 3 i 5). Nie zaobserwowano dodatniego ERG gdy nie wystąpiło ratowanie naczyń i neuronów (mysz 1). Ta korelacja między ratowaniem naczyń i neuronów w oczach myszy rd/rd przez Lin HSC według niniejszego wynalazku jest zobrazowana wykresem analizy regresji przedstawionym na FIG. 10. Zaobserwowano korelację między odtwarzaniem neuronów (oś y) i naczyń (oś x) dla układu naczyniowego pośredniego (r=0,45) i układu naczyniowego głębokiego (r=0,67).

Figura 11 przedstawia brak jakiejkolwiek znaczącej statystycznie korelacji między ratowaniem naczyń i neuronów przez Lin⁺HSC. Ratowanie naczyń zmierzono ilościowo i przedstawiono wyniki na Figurze 12. Dane dla myszy w 1 miesiącu (1M), dwóch miesiącach (2M) i 6 miesiącach (6M) po wstrzyknięciu wykazują, że długość naczyń znacząco wzrosła w oczach traktowanych Lin HSC według niniejszego wynalazku (ciemne słupki) względem długości naczyń w oczach nietraktowanych u tej samej myszy (jasne słupki), zwłaszcza w 1 miesiąc i 2 miesiące po wstrzyknięciu. Neurotroficzne działanie ratujące zmierzono ilościowo przez zliczenie jąder w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie jąder około 2 miesiące po wstrzyknięciu Lin HSC lub Lin⁺HSC. Wyniki przedstawiono na Figurach 13 i 14.

Wyniki.

Rozwój naczyń siatkówki myszy: model angiogenezy oczu

Oko myszy dostarcza uznanego ssaczego modelu dla badania rozwoju naczyń siatkówki takiego, jak rozwój naczyń siatkówki u ludzi. Podczas rozwoju mysiego układu naczyniowego siatkówki, ukierunkowane niedokrwieniem naczynia krwionośne rozwijają się w bliskim związku z astrocytami. Te elementy glejowe migrują w trzecim trymestrze na siatkówkę ludzkiego płodu lub noworodka gryzonia z tarczy nerwu wzrokowego wzdłuż warstwy komórek zwoju i rozprzestrzeniają się promieniście. W miarę rozwoju układu naczyniowego mysiej siatkówki komórki śródbłonkowe wykorzystują ten ustanowiony już wzorzec dla ustalenia układu naczyń siatkówki (patrz FIG. 1a i b). FIG. 1 (a i b) przedstawia schematyczne przekroje rozwijającej się siatkówki myszy. FIG. 1a przedstawia rozwój splotu pierwotnego (ciemne linie w górnej lewej części schematu) nałożonego na matrycę astrocytów (jasne linie), podczas gdy FIG. 1b przedstawia drugą fazę rozwoju naczyń siatkówki. Na Figurach GCL oznacza warstwę komórek zwojowych, IPL oznacza wewnętrzną warstwę splotu, INL oznacza wewnętrzną warstwę jądrową, OPL oznacza zewnętrzną warstwę komórek splotowych, ONL oznacza zewnętrzną warstwę jądrową, RPE oznacza nabłonek barwnikowy siatkówki, ON oznacza nerw wzrokowy zaś P oznacza obwód.

Przy urodzeniu układ naczyniowy siatkówki jest praktycznie nieobecny. Przed dniem 14 po urodzeniu (P14) w siatkówce rozwijają się złożone warstwy pierwotna (powierzchniowa) i wtórna

PL 216 193 B1 (głęboka) naczyń siatkówki wraz z początkiem widzenia. Początkowo promieniste naczynia okołobrodawkowe rosną promieniowo nad istniejącą już siecią astrocytów w kierunku obwodowym, stając się stopniowo połączonymi przez tworzenie splotu kapilarnego. Naczynia te rosną jako pojedyncza warstwa wewnątrz włókna nerwowego do P10 (FIG. 1a). Między P7 a P8 oboczne odgałęzienia zaczynają wyrastać z tego splotu pierwotnego i penetrują w głąb siatkówki do zewnętrznej warstwy w kształcie splotu, gdzie tworzą wtórny, lub głęboki, splot siatkówki. Przed P21 cała sieć przechodzi daleko idące przemodelowanie i tworzy się splot trzeciorzędowy, czyli pośredni, na wewnętrznej powierzchni wewnętrznej warstwy jądrowej (FIG. 1b).

Model angiogenezy mysiego noworodka jest z kilku powodów przydatny do badania roli HSC podczas angiogenezy oczu. W tym znaczącym fizjologicznie modelu przed pojawieniem się endogennych naczyń krwionośnych istnieje duża matryca astrocytów, co pozwala na zbadanie roli oddziaływania komórka - komórka podczas procesu tworzenia się nowych naczyń. Ponadto wiadomo, że ten zgodny i powtarzalny proces tworzenia naczyń siatkówki u noworodków jest kierowany przez niedotlenienie, wykazując w tym względzie podobieństwa do wielu chorób siatkówki, w których stwierdzono udział niedokrwienia.

Wzbogacanie śródbłonkowych komórek prekursorowych (EPS) ze szpiku kostnego

Mimo, że ekspresja znaczników powierzchni komórki w populacji EPC znajdowanej w preparatach HSC została szeroko przebadana, wciąż słabo zdefiniowane są znaczniki jednoznacznie identyfikujące EPC. Dla wzbogacenia EPC komórki dodatnie pod względem znaczników zróżnicowanych komórek linii krwiotwórczych (Lin⁺), tj. limfocyty B (CD45), limfocyty T (CD3), granulocyty (Ly-6G), monocyty (CD11) i erytrocyty (TER-119) usunięto spośród komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Dla dalszego wzbogacenia w EPC wykorzystano antygen Sca-1. Porównanie wyników uzyskanych po śródszklistkowym wstrzyknięciu tej samej liczby komórek Lin Sca-1⁺ albo Lin nie wykazało jakichkolwiek wykrywalnych różnic między obu grupami. Rzeczywiście, przy wstrzyknięciu jedynie komórek Lin Sca-1^- zaobserwowano znacznie silniejsze włączanie ich do rozwijających się naczyń krwionośnych.

Lin HSC według niniejszego wynalazku są wzbogacone w EPC na podstawie oznaczeń funkcjonalnych. Ponadto, populacje Lin⁺HSC funkcjonalnie zachowują się zupełnie odmiennie od populacji Lin HSC. Oznaczono także w każdej frakcji epitopy zwykle stosowane do identyfikacji EPC (na podstawie wcześniej opublikowanych charakterystyk in vitro). Podczas gdy żaden z tych znaczników nie był wyłącznie związany z frakcją Lin , udział wszystkich wzrastał od około 70 do około 1800% w LinHSC w porównaniu z frakcją Lin⁺HSC (FIG. 1c). FIG. 1c przedstawia charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej pochodzących ze szpiku kostnego rozdzielonych komórek Lin HSC i Lin⁺HSC. Górny rząd FIG. 1c przedstawia wykres punktowy rozkładu komórek niewyznakowanych przeciwciałem macierzystych komórek krwiotwórczych. R1 określa mierzalny bramkowany obszar dodatniego barwienia PE; R2 wskazuje dodatnie pod względem GFP. Środkowy rząd przedstawia wykresy punktowe Lin HSC, a dolny rząd wykresy punktowe Lin⁺HSC. Komórki C57B/6 wyznakowano sprzęgniętymi z PE przeciwciałami przeciwko Sca-1, c-kit, Flk-1/KDR, CD31. Dane dla Tie-2 uzyskano od myszy Tie-2-GFP. Procenty w narożnikach wykresów punktowych wskazują procent dodatnio wyznakowanych komórek z całych populacji Lin HSC lub Lin⁺HSC. Co ciekawe, uznane znaczniki EPC, takie jak Flk-1/KDR, Tie-2 i Sca-1 były słabo wyrażane i w związku z tym nie zostały wykorzystane w dalszym frakcjonowaniu.

Śródszklistkowo wstrzyknięte komórki Lin^-HSC zawierają EPC, które kierują się do astrocytów i włączają się do rozwijającego się unaczynienia siatkówki

Dla określenia, czy wstrzyknięte śródszklistkowo Lin^-HSC mogą wybiórczo kierować się do konkretnych typów komórek siatkówki, wykorzystywać matrycę astrocytów i uczestniczyć w angiogenezie

5+ siatkówkowej, około 10⁵ komórek z Lin HSC według niniejszego wynalazku lub komórek Lin⁺HSC ₅ (kontrola, około 10⁵ komórek) wyizolowanych ze szpiku kostnego dorosłych (transgenicznych dla GFP lub LacZ) myszy wstrzyknięto do oczu myszy w dwa dni po urodzeniu (P2). Cztery dni po wstrzyknięciu (P6) wiele komórek z Lin HSC według niniejszego wynalazku, pochodzących od myszy transgenicznych dla GFP lub LacZ, przylegało do siatkówki i wykazywało charakterystyczny wydłużony kształt komórek śródbłonka (FIG. 2a). FIG. 2 ilustruje wszczepienie komórek Lin^- do rozwijającej się mysiej siatkówki. Jak pokazano na FIG. 2a, cztery dni po śródszklistkowym wstrzyknięciu (P6) wstrzyknięte komórki eGFP⁺ Lin HSC przyłączają się i różnicują na siatkówce.

W wielu obszarach siatkówek komórki wyrażające GFP układały się we wzór zgodny z leżącymi pod nimi astrocytami i przypominały naczynia krwionośne. Te fluoryzujące komórki obserwowano

PL 216 193 B1 przed endogenną, rozwijającą się siecią naczyń (FIG. 2b). W przeciwieństwie do nich, tylko niewielka liczba Lin⁺HSC (FIG. 2c) lub krezkowych komórek śródbłonka dorosłych myszy (FIG. 2d) przyłączała się do powierzchni siatkówki. W celu ustalenia, czy komórki ze wstrzykniętej kompozycji Lin HSC mogą też przyłączać się do siatkówek z już rozwiniętymi naczyniami, wstrzyknęliśmy kompozycję Lin HSC do oczu dorosłych. Co ciekawe, nie zaobserwowano przyłączania się komórek do siatkówki lub włączania do rozwiniętych, prawidłowych naczyń krwionośnych siatkówki (FIG. 2e). Wskazuje to, że Lin HSC według niniejszego wynalazku nie zaburzają prawidłowo rozwiniętego unaczynienia i nie będą inicjować nieprawidłowego unaczynienia w prawidłowo rozwiniętych siatkówkach.

W celu ustalenia związku między wstrzykiwanymi Lin HSC według niniejszego wynalazku a astrocytami siatkówki wykorzystano transgeniczną mysz, która wyrażała kwaśne włókienkowe białko glejowe (GFAP, znacznik astrocytów) i zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod kontrolą promotora. Badanie siatkówek tych transgenicznych myszy GFAP-GFP, którym wstrzyknięto Lin HSC od myszy transgenicznych eGFP wykazało lokalizację wstrzykniętych eGFP EPC i istniejących astrocytów (FIG. 2f-h), strzałki). Zaobserwowano, że procesy eGFP⁺Lin^-HSC są zgodne z siecią podścielających astrocytów (strzałki, FIG. 2g). Badanie tych oczu wykazało, że wstrzyknięte wyznakowane komórki przyłączały się tylko do astrocytów; w siatkówkach myszy P6, gdzie obwód siatkówki nie ma jeszcze endogennych naczyń zaobserwowano, ze wstrzyknięte komórki przylegają do astrocytów w tych jeszcze nie unaczynionych obszarach. Nieoczekiwanie wstrzyknięte wyznakowane komórki zaobserwowano w głębszych warstwach siatkówki dokładnie w miejscu, gdzie następnie rozwiną się prawidłowe naczynia siatkówki (FIG. 2i, strzałki).

W celu ustalenia, czy wstrzyknięte Lin HSC według niniejszego wynalazku są stabilnie włączone do rozwijającego się unaczynienia siatkówki zbadano naczynia siatkówki w różnych późniejszych punktach czasowych. Już w P9 (siedem dni po wstrzyknięciu) Lin HSC włączały się do struktur CD31⁺(FIG. 2j). Przed P16 (14 dni po wstrzyknięciu) komórki były już w znacznym stopniu włączone do przypominających naczynia struktur siatkówki (FIG. 2k). Gdy przed uśmierceniem zwierząt wstrzyknięto im dożylnie rodaminę-dekstran (dla zidentyfikowania funkcjonalnych naczyń krwionośnych siatkówki), większość Lin HSC układała się wzdłuż drożnych naczyń (FIG. 2I). Zaobserwowano dwa wzory dystrybucji wyznakowanych komórek: (1) w jednym wzorze komórki były rozrzucone wzdłuż naczyń między niewyznakowanymi komórkami śródbłonka; zaś (2) drugi wzór przedstawiał, że naczynia były złożone w całości z wyznakowanych komórek. Wstrzyknięte komórki były też włączone do naczyń głębokiego splotu naczyniowego (FIG. 2m). Podczas gdy stwierdzano wcześniej sporadyczne włączanie się pochodzących z Lin HSC EPC do nowo powstających naczyń, jest to pierwsze doniesienie o istnieniu sieci naczyniowych w całości złożonych z tych komórek. Wykazuje to, że komórki z populacji pochodzących ze szpiku kostnego Lin HSC według niniejszego wynalazku wstrzyknięte śródszklistkowo mogą wydajnie włączać się do każdej warstwy tworzącego się splotu naczyniowego siatkówki.

Badanie histologiczne tkanek innych niż siatkówka (np. mózgu, wątroby, serca, płuca, szpiku kostnego) nie wykazało obecności jakichkolwiek dodatnich pod względem GFP komórek podczas badania 5 do 10 dni po wstrzyknięciu śródszklistkowym. Wskazuje to, że subpopulacja komórek we frakcji Lin HSC wybiórczo kieruje się do astrocytów siatkówki i stabilnie włącza się w rozwijające się unaczynienie siatkówki. Ponieważ komórki te mają wiele cech komórek śródbłonkowych (związek z astrocytami siatkówki, wydłużona morfologia, stabilne włączanie do drożnych naczyń i nieobecność poza naczyniami), reprezentują one EPC obecne w populacji Lin HSC. Docelowe astrocyty są tego samego typu, co obserwowane w wielu retinopatiach z niedotlenieniem, dobrze wiadomo, że komórki glejowe są znaczącym składnikiem pióropuszy neowaskularyzacyjnych obserwowanych w DR i innych postaciach uszkodzeń siatkówki. W warunkach glejozy reaktywnej i zaindukowanego przez niedokrwienie tworzenia nowych naczyń zaktywowane astrocyty proliferują, wytwarzają cytokiny i zwiększają ekspresję GFAP, podobnie jak obserwuje się to podczas tworzenia wzorca naczyń siatkówki u noworodków wielu gatunków ssaków, w tym człowieka.

Dla zbadania, czy Lin HSC według niniejszego wynalazku będą kierować się do zaktywowanych astrocytów w oczach dorosłych myszy podobnie, jak dzieje się to w oczach noworodków, komórki Lin HSC wstrzyknięto do dorosłych oczu, z uszkodzonymi siatkówkami przez fotokoagulację (FIG. 3a) lub końcówką igły (FIG. 3b). W obu modelach populację komórek z wyraźnym wybarwieniem GFAP zaobserwowano jedynie wokół miejsca uszkodzenia (FIG. 3a-b). Komórki ze wstrzykniętych Lin HSC lokalizowały się w miejscu uszkodzenia i pozostawały swoiście związane z dodatnimi pod względem GFAP astrocytami (FIG. 3 a i b). W tych miejscach zaobserwowano też, że komórki Lin HSC migrują do głębszych warstw siatkówki, podobnie, jak obserwuje się to podczas tworzenia głębokiego układu

PL 216 193 B1 naczyniowego u noworodków (dane nie przedstawione). Nieuszkodzone części siatkówki nie zawierały komórek Lin HSC dokładnie tak, jak zaobserwowano to przy wstrzyknięciu Lin HSC do prawidłowych, nieuszkodzonych siatkówek dorosłych (FIG. 2e). Dane te wykazują, że Lin HSC mogą wybiórczo kierować się do zaktywowanych komórek glejowych w uszkodzonych siatkówkach dorosłych z glejozą, jak również w przechodzących unaczynianie siatkówkach noworodków.

Śródszklistkowo wstrzyknięte Lin HSC mogą ratować i stabilizować wyrodniejący układ naczyniowy

Ponieważ wstrzyknięte śródszklistkowo Lin HSC kierują się do astrocytów i włączają do prawidłowego układu naczyniowego, komórki te mogą również stabilizować wyrodniejący układ naczyniowy w niedokrwiennych lub zwyrodnieniowych chorobach siatkówki związanych z glejozą i zwyrodnieniem naczyń. Mysz rd/rd jest modelem zwyrodnienia siatkówki, który wykazuje głębokie zwyrodnienie warstw fotoreceptorów i naczyń siatkówki przed upływem jednego miesiąca po urodzeniu. Układ naczyniowy siatkówki u tych myszy rozwija się prawidłowo do P16, w którym to czasie głębszy splot naczyniowy uwstecznia się, u większości myszy sploty głęboki i pośredni ulegają pełnemu zwyrodnieniu przed P30.

W celu ustalenia, czy HSC mogą ratować uwsteczniające się naczynia, HSC Lin⁺ lub Lin (od myszy Balb/c) wstrzyknięto śródszklistkowo myszom rd/rd w dniu P6. Przed P33 po wstrzyknięciu komórek Lin⁺ naczynia najgłębszej warstwy siatkówki były nieomal całkowicie nieobecne (FIG. 4 a i b). W przeciwieństwie do nich, większość siatkówek nastrzykniętych Lin^-HSC miała przed P33 nieomal prawidłowy układ naczyniowy z trzema równoległymi dobrze wykształconymi warstwami naczyń (FIG. 4a i 4d). Ilościowy pomiar tego efektu wykazał, że średnia długość naczyń w głębokim splocie naczyniowym oczu rd/rd nastrzykniętych Lin^- była prawie trzykrotnie większa niż w oczach nietraktowanych lub traktowanych komórkami Lin⁺ (FIG. 4e). Nieoczekiwanie, wstrzyknięcie Lin HSC pochodzących ze szpiku kostnego dorosłej myszy rd/rd (FVB/N) także ratowało wyrodniejący układ naczyniowy siatkówki noworodka myszy rd/rd (FIG. 4f). Zwyrodnienie układu naczyniowego w oczach myszy rd/rd obserwowane jest już w 2-3 tygodnie po urodzeniu. Wstrzyknięcie Lin HSC nawet tak późno, jak w P15 także powodowało częściową stabilizację wyrodniejącego układu naczyniowego u myszy rd/rd przez co najmniej jeden miesiąc (FIG. 4g i 4h).

Lin HSC wstrzyknięte młodszym (np. P2) myszom rd/rd także włączały się do rozwijającego się powierzchniowego układu naczyniowego. Przed P11 zaobserwowano, że komórki te migrują do poziomu głębokiego splotu naczyniowego i tworzą wzór identyczny do obserwowanego w zewnętrznej warstwie naczyń siatkówki typu dzikiego (FIG. 5a). W celu dokładniejszego opisania sposobu, w jaki komórki ze wstrzykniętych kompozycji Lin HSC włączają się i stabilizują wyrodniejący układ naczyniowy siatkówki u myszy rd/rd, kompozycję Lin HSC pochodzącą od myszy Balb/c wstrzyknięto do oczu myszy Tie-2-GFP FVB. Myszy FVB mają genotyp rd/rd, a ponieważ wyrażają białko fuzyjne Tie-2-GFP, wszystkie endogenne naczynia krwionośne są fluoryzujące.

Gdy niewyznakowane komórki z kompozycji Lin HSC są wstrzykiwane do oczu noworodków Tie-2-GFP FVB, a następnie włączają się do rozwijającego się układu naczyniowego, powinny pojawić się niewyznakowane przerwy w endogennych naczyniach wyznakowanych Tie-2-GFP, odpowiadające włączonym, niewyznakowanym Lin HSC, które były wstrzyknięte. Wybarwienie następnie innym znacznikiem naczyń (np. CD-31) zarysowuje następnie całe naczynie, co pozwala na stwierdzenie, czy nieendogenne komórki śródbłonka stanowią część układu naczyniowego. Dwa miesiące po wstrzyknięciu zaobserwowano naczynia CD31-dodatnie i Tie-2-GFP-ujemne w siatkówkach oczu nastrzykniętych kompozycją Lin HSC (FIG. 5b). Co ciekawe, większość uratowanych naczyń zawierała komórki Tie-2-GFP-dodatnie (FIG. 5c). Rozmieszczenie perycytów, jak określono przez wybarwienie aktyny mięśni gładkich, nie zmieniło się przez wstrzyknięcie Lin HSC, niezależnie od tego, czy nastąpiło ratowanie naczyń (FIG. 5d).

Dane te jasno wykazują, że wstrzyknięte śródszklistkowo Lin HSC według niniejszego wynalazku migrują do siatkówki, uczestniczą w tworzeniu się prawidłowych naczyń krwionośnych siatkówki i stabilizują endogenny wyrodniejący układ naczyniowy u myszy z defektem genetycznym.

Hamowanie angiogenezy w siatkówce przez stransfekowane komórki z Lin HSC

Większość chorób naczyniowych siatkówki wiąże się raczej z nieprawidłową proliferacją naczyń niż z ich zwyrodnieniem. Transgeniczne komórki kierujące się do astrocytów mogą być wykorzystane dla dostarczenia białka przeciwangiogennego i zahamowania angiogenezy. Komórki z kompozycji Lin^-HSC stransfekowano syntetazą tryptofanylo-tRNA-T2 (T2-TrpRS). T2-TrpRS jest to fragment TrpRS o wielkości 43 kD silnie hamujący angiogenezę w siatkówce (FIG. 6a). W dniu P12 siatkówki

PL 216 193 B1 oczu, do których wstrzyknięto w dniu P2 kompozycję Lin^-HSC stransfekowanych plazmidem kontrolnym (bez genu T2-TrpRS) miały prawidłowy splot naczyń siatkówki pierwotny (FIG. 6c) i wtórny (FIG. 6d). Gdy do oczu w P2 wstrzyknięto Lin HSC według niniejszego wynalazku stransfekowane T2TrpRS i 10 dni później zbadano, sieć pierwotna wykazywała znaczące nieprawidłowości (FIG. 6e) zaś tworzenie głębokiego układu naczyniowego siatkówki było nieomal całkowicie zahamowane (FIG. 6f). Nieliczne naczynia obserwowane w tych oczach były znacząco osłabione, ze znacznymi przerwami między naczyniami. Zasięg hamowania przez wydzielające T2-TrpRS komórki Lin HSC jest szczegółowo przedstawiony w Tabeli 2.

T2=TrpRS jest wytwarzany i wydzielany przez komórki w kompozycji Lin HSC in vitro, zaś po wstrzyknięciu tych komórek do ciała szklistego obserwowano w siatkówce (FIG. 6b) fragment T2-TrpRS o wielkości 30 kD. Ten fragment 30 kD zaobserwowano specyficznie jedynie w tych siatkówkach, do których wstrzyknięto stransfekowane Lin HSC według niniejszego wynalazku, zaś to zmniejszenie widocznej masy cząsteczkowej w porównaniu z białkiem zrekombinowanym lub zsyntetyzowanym in vitro może być spowodowane obróbką lub degradacją T2-TrpRS in vivo. Dane te wskazują, że Lin^-HSC mogą być zastosowane do dostarczania aktywnych funkcjonalnie genów, takich jak geny wyrażające cząsteczki hamujące angiogenezę do układu naczyniowego siatkówki przez kierowanie do zaktywowanych astrocytów. Podczas gdy możliwe jest, że obserwowane działanie hamujące angiogenezę spowodowane jest aktywnością, w której pośredniczy komórka, jest to wysoce nieprawdopodobne, ponieważ oczy traktowane identycznymi, lecz niestransfekowanymi kompozycjami Lin HSC miały prawidłowy układ naczyniowy.

T a b e l a 2.

Hamowanie tworzenia się naczyń przez wydzielające T2-TrpRS komórki Lin^-HSC

	Splot pierwotny	Splot głęboki
	Zahamowane	Prawidłowe	Pełne	Częściowe	Prawidłowe
TsTrpRs	60%	40%	33,3%	60%	6,7%
(15 oczu)	(9 oczu)	(6 oczu)	(5 oczu)	(9 oczu)	(1 oko)
Kontrola	0%	100%	0%	38, 5%	61,5%
(13 oczu)	(0 oczu)	(13 oczu)	(0 oczu)	(5 oczu)	(8 oczu)

Wstrzyknięte śródszklistkowo kompozycje Lin HSC lokalizują się na astrocytach siatkówki, włączają do naczyń i mogą być użyteczne w leczeniu wielu chorób siatkówki. Podczas, gdy większość komórek spośród wstrzykniętych kompozycji HSC przylega do matrycy astrocytów, niewielka liczba migruje głęboko w siatkówkę, kierując się do obszarów gdzie następnie rozwinie się głęboka sieć naczyniowa. Mimo, że w tym obszarze nie zaobserwowano dodatnich pod względem GFAP astrocytów przed 42 dniem po urodzeniu, nie wyklucza to możliwości, że komórki glejowe GFAP-ujemne są już tam obecne i dostarczają sygnału dla lokalizacji Lin HSC. Wcześniejsze badania wykazały, że wiele chorób związanych jest z glejozą reaktywną. Szczególnie w DR komórki glejowe i ich macierz zewnątrzkomórkowa są związane z patologiczną angiogenezą.

Ponieważ komórki ze wstrzykniętych kompozycji Lin^-HSC wybiórczo przyłączały się do komórek glejowych wyrażających GFAP, niezależnie od typu uszkodzenia, kompozycje Lin HSC mogą być zastosowane do wybiórczego niszczenia poprzedzających angiogenezę uszkodzeń w siatkówce. Na przykład, w retinopatiach niedokrwiennych, takich jak cukrzyca, tworzenie nowych naczyń jest odpowiedzią na niedotlenienie. Przez skierowanie kompozycji Lin HSC do miejsc patologicznego tworzenia nowych naczyń można ustabilizować rozwijający się układ naczyniowy, zapobiegając nieprawidłowościom nowo tworzonego układu naczyniowego takim, jak krwotok lub obrzęk (przyczyny związanej z DR utraty wzroku) i być może potencjalnie złagodzić niedotlenienie, które początkowo stymulowało powstawanie nowych naczyń. Nieprawidłowe naczynia krwionośne mogą być przywrócone do stanu prawidłowego. Ponadto, białka hamujące angiogenezę, takie jak T2-TrpRS, mogą być dostarczone do miejsc patologicznej angiogenezy przy zastosowaniu stransfekowanych kompozycji Lin HSC i zaindukowanej laserem aktywacji astrocytów. Ponieważ fotokoagulacja laserem jest powszechnie stosowana w oftalmologii klinicznej, podejście to ma zastosowania w wielu chorobach siatkówki. Podczas, gdy takie oparte na komórkach podejścia badano w terapii nowotworów, ich zastosowanie do chorób oka jest korzystniejsze, gdyż wstrzyknięcie dooczne umożliwia dostarczenie znacznej liczby komórek bezpośrednio do miejsca choroby.

PL 216 193 B1

Ratujące działanie odżywcze Lin HSC na naczynia i nerwy

Do oddzielenia Lin HSC od szpiku kostnego myszy wyrażających wzmocnione zielone białko fluoryzujące (eGFP), C3H (rd/rd), FVB (rd/rd) zastosowano MACS tak, jak opisano to powyżej. Lin^-HSC zawierające EPC od tych myszy wstrzyknięto śródszklistkowo do oczu myszy P6 CH3 lub FVB. Siatkówki zebrano w różnych punktach czasowych (1 miesiąc, 2 miesiące i 6 miesięcy) po iniekcji. Układ naczyniowy zbadano za pomocą skanującego laserowego mikroskopu konfokalnego po wybarwieniu przeciwciałami przeciwko CD31 oraz przez histologię siatkówki po wybarwieniu jąder DAPI. Do mRNA z siatkówek zastosowano również analizę ekspresji genów na mikromacierzach w różnych punktach czasowych dla zidentyfikowania genów potencjalnie zaangażowanych w to działanie.

Oczy myszy rd/rd wykazywały głębokie zwyrodnienie zarówno części nerwowo-czuciowej siatkówki, jak i układu naczyniowego siatkówki przed dniem P21. Oczy myszy rd/rd traktowane Lin HSC w dniu P6 zachowywały prawidłowy układ naczyniowy nawet do 6 miesięcy, zarówno głęboka jak i pośrednia warstwa wykazywała znaczącą poprawę w porównaniu z kontrolami we wszystkich punktach czasowych (1M, 2M i 6M) (patrz FIG. 12). Ponadto zaobserwowano, że siatkówki traktowane Lin HSC były też grubsze (1M -1,2 krotnie, 2M - 1,3 krotnie, 6M - 1,4 krotnie) i miały większą liczbę komórek w zewnętrznej warstwie jąder (1M - 2,2 krotnie, 2M - 3,7 krotnie, 6M - 5,7 krotnie) względem oczu traktowanych Lin⁺HSC w charakterze kontroli. Analiza genomowa na dużą skalę siatkówek rd/rd ratowanych (tzn. Lin HSC) w porównaniu z kontrolnymi (nietraktowanymi, lub traktowanymi komórkami innymi, niż Lin^-) wykazała znaczące zwiększenie ekspresji genów kodujących sHSP (małe białka szoku cieplnego) oraz swoiste czynniki wzrostowe, korelujące z działaniem ratującym naczynia i nerwy, w tym czynniki przedstawione w Tabeli 3.

Pochodzące ze szpiku kostnego Lin HSC według niniejszego wynalazku znacząco i powtarzalnie indukują utrzymywanie prawidłowego układu naczyniowego i wyraźnie zwiększają warstwę fotoreceptorów i innych komórek nerwowych u myszy rd/rd. To ratujące działanie na nerwy jest skorelowane ze znaczącym zwiększeniem ekspresji małych białek szoku cieplnego oraz czynników wzrostowych, dostarcza zatem wglądu w podejścia terapeutyczne dotychczas nieuleczalnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki.

T a b e l a 3.

Geny, których ekspresja wzrasta w siatkówkach myszy, do których wstrzyknięto Lin^-HSC

Nazwa zwyczajowa	Lin (-)	CD31 (-)	Myszy kontrolne rd	Genbank #	Komentarz
1	2	3	4	5	6
Tgtp	11,855	0,526	0,664	L38444	Białko swoiste dla limfocytów T
H-2D4(q)	7,091	0,916	0,694	X52914	antygen przeszczepów
H2-K2; H-2K2	4,507	0,705	0,547	M27134	glikoproteina powierzchni komórki
Lzp-s	6,514	0,648	0,987	X51547	lizozym; lizozym P
Kcnj5	4,501	0,855	0,722	U33631	Kanał K+ bramkowany białkiem G
EST	2,905	1,000	0,750	AA087373	EST
Scya8	5,186	0,470	0,996	AB023418	prekursor MCP-2
Ly6a	4,020	0,962	0,792	X04653	aloantygen Ly-6
Anxa1	2,490	0,599	0,510	AV003419	EST
Pip5k1c	3,405	0,944	0,782	AB006916	kinaza fosfatydyloinozytolu
EST	3,999	0,502	0,975	AU042276	EST
MAD	3,763	0,560	0,892	X83106	białko dimeryzacji MAX
Cxadr	3,977	0,814	1,000	U90715	CAR
Isg15	2,218	0,642	0,449	X56602	białko indukowane interferonem
EST	3,512	0,901	0,978	AA790936	EST
Tm4sf1	3,022	0,493	0,697	AV087000	EST

PL 216 193 B1 ciąg dalszy Tabeli 3

1	2	3	4	5	6
IgG VH-II	2,644	0,948	0,909	X02463	łańcuch ciężki Ig; region zmienny
Yy1	2,967	0,854	0,874	M74590	czynnik transkrypcyjny delta
EST	2,952	0,869	0,822	AA739246	EST
EST	2,575	0,486	0,650	AW046243	EST
Psmb9	3,288	0,492	0,975	D44456	podjednostka 2 kompleksu polipeptydowego
EST	2,195	0,873	0,904	AV172782	EST
H2-Aa	2,627	0,878	0,940	X52643	I-E alfa NON, MHC
EST	2,697	0,791	0,869	AV076889	EST
Geny krystalin
Crybb2	8,726	0,552	0,831	M60559	beta-B2-krystalina
Cryaa	3,995	0,567	1,000	J00376	alfa-A-krystalina
CrygD	2,090	0,740	0,972	AJ224342	gamma-D-krystalina
Cryba1	6,520	0,930	0,603	AJ239052	beta-A3/A1-krystalina
Crygs	2,892	0,971	0,854	AF032995	gamma-S-krystalina
CrygC	5,067	1,000	0,826	Z22574	gamma-C-krystalina
CrygF	1,942	0,999	0,688	AJ224343	gamma-F-krystalina

Dyskusja

Znaczniki zróżnicowanych w kierunku linii rozwojowych komórek krwiotwórczych zastosowano do selekcji negatywnej pochodzących ze szpiku kostnego Lin HSC zawierających EPC. Podczas, gdy subpopulacja pochodzących ze szpiku kostnego Lin HSC, które mogą służyć jako EPC nie cechuje się występowaniem powszechnie stosowanych znaczników powierzchni komórki, zachowanie tych komórek w rozwijającym się lub uszkodzonym układzie naczyniowym jest zupełnie odmienne od obserwowanego dla populacji komórek Lin⁺ lub dorosłych komórek śródbłonka. Dalsze subfrakcjonowanie HSC przy pomocy znaczników, takich jak Sca-1 wykazało, że komórki Lin Sca1⁺ nie wykazały znaczącej różnicy w porównaniu z wykorzystaniem samych komórek Lin HSC. Komórki te mogą wybiórczo kierować się do miejsc angiogenezy w siatkówce i uczestniczyć w tworzeniu drożnych naczyń krwionośnych.

Dziedzicznym chorobom zwyrodnieniowym siatkówki towarzyszy często utrata układu naczyniowego siatkówki. Skuteczne leczenie takich chorób wymaga odtworzenia funkcji a także utrzymania złożonej architektury tkankowej. Podczas, gdy w kilku niedawnych projektach badano zastosowanie dostarczania czynników odżywczych opartego na komórkach lub dostarczania samych komórek macierzystych, konieczne może być jakieś połączenie ich obu. Na przykład, zastosowanie terapii czynnikiem wzrostowym do leczenia choroby zwyrodnieniowej siatkówki spowodowało nieregulowany przerost naczyń krwionośnych prowadzący do ciężkiego zakłócenia prawidłowej architektury tkankowej siatkówki. Zastosowanie komórek macierzystych nerwowych lub siatkówkowych do leczenia choroby zwyrodnieniowej może odtworzyć funkcję neuronalną, ale do utrzymania integralności funkcjonalnej siatkówki konieczny będzie również funkcjonalny układ naczyniowy. Włączenie komórek z Lin HSC według niniejszego wynalazku do naczyń siatkówki myszy rd/rd ustabilizowało wyrodniejący układ naczyniowy bez zaburzenia struktury siatkówki. Ten efekt ratowania zaobserwowano także gdy komórki wstrzyknięto myszom rd/rd P15. Ponieważ wyrodnienie naczyń u myszy rd/rd rozpoczyna się w dniu P16, obserwacja ta rozszerza okno terapeutyczne dla skutecznego leczenia Lin HSC. Neurony i fotoreceptory siatkówki są zachowywane i funkcja wzrokowa jest utrzymywana w oczach, do których wstrzyknięto Lin HSC według niniejszego wynalazku.

Lin HSC według niniejszego wynalazku zawierają populację EPC, która może promować angiogenezę przez kierowanie się do reaktywnych astrocytów i włączać się do ustalonego wzorca bez zaburzania struktury siatkówki. Lin^-HSC według niniejszego wynalazku dostarczają także zaskakująco

PL 216 193 B1 długotrwałego ratującego działania odżywczego na nerwy w oczach cierpiących na zwyrodnienie siatkówki. Dodatkowo, zmodyfikowane genetycznie autologiczne kompozycje Lin HSC zawierające EPC mogą być wszczepiane do niedokrwionych lub nieprawidłowo unaczynionych oczu i stabilnie włączać się do nowych naczyń i ciągle dostarczać lokalnie cząsteczki terapeutyczne przez dłuższy czas. Takie lokalne dostarczenie genów, które wyrażają czynniki farmakologiczne w znaczących fizjologicznie dawkach stanowi nowy paradygmat leczenia obecnie nieuleczalnych chorób oczu.

PL 216 193 B1

LISTA SEKWENCJI <110>The Scripps Research Insfcitute Friedlander, Martin Otani, Atsushi Da3ilva, Karen <12 0> Krwiotwórcze komórki macierzyste i sposoby leczenia za ich pomocą związanych z tworzeniem naczyń chorób oka <130 TSRI 900.1PC <15O> 60/398,522 <151> 2002-07-25 <150> 60/467,051 <151> 2003-05-02 <160> 2 <170> FastSEQ diii Windows 4.0 <210> 1 <211> 4742 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <223> DNA kodujący wyznakowany His ludzki T2-TrpRS <400> i tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attahgcgcg gcgggtgtgg 'tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgtfccgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcaectcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgcect ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctfctaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgcegatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaafc attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tćggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacafct caaafcatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gettcaataa tafcfcgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tcccttfcttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagafccagfc tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgttfct ccaafcgafcga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 340 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tafctctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagcfcaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1030 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcecttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttafcctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaaeg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440

PL 216 193 B1 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ecaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gcfcctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg, gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggcctfcttgc tggocttttg ctcacatgtt 2280 ctttcotgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgo gaggcagctg-cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctogt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgfctgct caggtcgcag 3180 acgfctttgca gcagcagfccg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagoacg atcatgcgca 3300 cccgtggoca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420 tatacatatg agtgcaaaag gcatagaota cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480 taaaattgac aaagagetaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540 cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600 tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660 tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720 cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780 ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840 caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaąaa 3900 fcgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960 tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020 caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080 cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggotatcc 4140 taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200 gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac 4260 caaggtcaat aagcatgogt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt 4320 tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga 4380 cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440 caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa 4500 ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt 4560 tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaecac cactgagatc cggctgctaa 4620 caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680 octtggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740 at 4742

PL 216 193 B1 <210 2 <211> 392 <212> PAT <213>

sztuczna sekwencja <223> Wyznakowany His ludzki T2-TrpRS <400 2

Met Ser Ala Lys Gly	Ile	Asp Tyr Asp Lys	Leu	Ile Val Arg	Phe	Gly
1 5		10			15
Ser Ser Łys Ile Asp	Lys	Glu Leu Ile Asn	Arg	Ile Glu Arg	Ala	Thr
20		25		30
Gly Gin Arg Pro His	His	Phe Leu Arg Arg	Gly	Ile Phe Phe	Ser	His
35		40		45
Arg Asp Met Asn Gin	Val	Leu Asp Ala Tyr	Glu	Asn Lys Lys	Pro	Phe
50		55		60
Tyr Leu Tyr Thr Gly	Arg	Gly Pro Ser Ser	Glu	Ala Met His	Val	Gly
55	70		75			eo
His Leu Ile Pro Phe	Ile	Phe Thr Lys Trp	Leu	Gin Asp Val	Phe	Asn
85		90			95
Val Pro Leu Val Ile	Gin	Met Thr Asp Asp	Glu	Lys Tyr Leu	Trp	Lys
100		105		110
Asp Leu Thr Leu Asp	Gin	Ala Tyr Gly Asp	Ala	Val Glu Asn	Ala	lys
115		120		125
Asp Ile Ile Ala Cys	Gly	Phe Asp Ile Asn	Lys	Thr Phe Ile	Phe	Ser
130		L3S		140
Asp Leu Asp Tyr Met	Gly	Met Ser Ser Gly	Phe	Tyr Lys Asn	Val	Val
145	150		155			160
Lys Ile Gin Lys His	val	Thr Phe Asn Gin	Val	Lys Gly Ile	Phe	Gly
165		170			175
Phe Thr Asp Ser Asp	Cys	Ile Gly Lys Ile	Ser	Phe Pro Ala	Ile	Gin
180		185		190
Ala Ala Pro Ser Phe	Ser	Asn Ser Phe'Pro	Gin	Ile Phe Arg Asp	Arg
195		200		205
Thr Asp Ile Gin Cys	Leu	Ile Pro Cys Ala	Ile	Asp Gin Asp	Pro	Tyr
210		215		220
Ehe Arg Met Thr Arg	Asp	Val Ala Pro Arg	Ile	Gly Tyr Pro	Lys	Pro
225	230		235			240
Ala Leu Leu His Ser	Thr	Phe Phe Pro Ala	Leu	Gin Gly Ala	Gin	Thr
, . 245		250			255
Lys Met Ser Ala Ser	Asp	Pro Asn Ser Ser	Ile	Phe Leu Thr	Asp	Thr
260		265		270
Ala Lya Gin Ile Lys	Thr	Lys Val Asn Lys	His	Ala Phe Ser	Gly	Gly
275		280		285
Arg Asp Thr Ile Glu	Glu	His Arg Gin Phe	Gly	Gly Asn Cys	Asp	Val
290		295		300
Asp Val Ser Phe Met	Tyr	Leu Thr Phe Phe	Leu	Glu Asp Asp	Asp	Lys
305	310		315			320
Leu Glu Gin Ile Arg	Lys	Asp Tyr Thr Ser	Gly	Ala Met Leu	Thr	siy
325		330			335
Glu Leu Lys Lys Ala	Leu	Ile Glu Val Leu	Gin	Pro Leu Ile	Ala	GlU
34 0		345		350
His Gin Ala Arg Arg	Lys	Glu Val Thr Asp	Glu	Ile Val Lys	Glu	Phe
355		360		365
Met Thr Pro Arg Lys	Leu	Ser Phe Asp Phe	Gin	Lys Leu Ala	Ala	Ala
370		375		380
Leu Glu His His His	His	His His
385	390

PL 216 193 B1

Claims

1. Wyizolowana, ssacza, pochodząca ze szpiku kostnego linia populacji niezróżnicowanych krwiotwórczych komórek macierzystych obejmująca śródbłonkowe komórki progenitorowe, w której przynajmniej około 50% komórek zawiera znaczniki komórkowe CD31 i c-kit i ewentualnie transfekowana przeciwangiogennym fragmentem T2 syntetazy tryptofanylo-tRNA (T2-TrpRS) do zastosowania w leczeniu choroby oczu u ssaka przez iniekcję śródszklistkową do chorego oka ssaka.

2. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że przynajmniej około 75% komórek zawiera znacznik komórkowy CD31.

3. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że przynajmniej około 65% komórek zawiera znacznik komórkowy c-kit.

4. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że przynajmniej około 80% komórek zawiera znacznik komórkowy CD31 i przynajmniej około 70% komórek zawiera znacznik komórkowy c-kit.

5. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że komórki są komórkami mysimi.

6. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że komórki są komórkami ludzkimi.

7. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że do około 8% komórek zawiera także znacznik komórkowy Sca-1 i do około 4% komórek zawiera także znacznik komórkowy Flk-1/KDR.

8. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 7, znamienna tym, że do około 1% komórek zawiera znacznik komórkowy Tie-2.

9. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że 50% do około 85% komórek zawiera znacznik CD31, około 70% do około 75% komórek zawiera znacznik c-kit, około 4% do około 8% komórek zawiera znacznik Sca-1 i około 2% do około 4% komórek zawiera znacznik Flk-1/KDR.

10. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje ponadto pożywkę do hodowli komórek.

11. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 10, znamienna tym, że komórki macierzyste pochodzą ze szpiku kostnego człowieka.

12. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest choroba zwyrodnieniowa siatkówki.

13. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest choroba zwyrodnieniowa naczyń siatkówki.

14. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest retinopatia niedokrwienna.

15. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest krwotok naczyniowy.

16. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest wyciek naczyniowy.

17. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest niezapalne zwyrodnienie naczyniówki.

18. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest związane z wiekiem tarczkowate zwyrodnienie plamki żółtej.

19. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest retinopatia cukrzycowa.

20. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest domniemana histoplazmoza oczna.

21. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest retinopatia wcześniaków (fibroplazja pozasoczewkowa).

PL 216 193 B1

22. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest anemia sierpowata.

23. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą jest barwnikowe zwyrodnienie siatkówki.

24. Wyizolowana populacja komórek macierzystych według zastrz. 1, znamienna tym, że komórki są stransfekowane genem kodującym przeciwangiogenny fragment TrpRS, którym jest 2-TrpRS.