PL216224B1

PL216224B1 - Pochodne rapamycyny zawierające fosfor, kompozycja je zawierająca oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL216224B1
Application number: PL371526A
Authority: PL
Inventors: David L. Berstein; Chester A. Metcalf Iii; Leonard W. Rozamus; Yihan Wang
Original assignee: Ariad Pharmaceuticals
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2014-03-31
Also published as: IL162734A0; US8058426B2; US7709020B2; IL162734A; WO2003064383A2; WO2003064383A3; PL371526A1; US7186826B2; EP1478648A4; KR101004224B1; EA011488B1; US20120178714A1; EP1478648A2; BR0307544A; US20060264456A1; KR20090118118A; DK1478648T3; CN101717410B; MXPA04007402A; JP2005516065A

Description

Przedmiotem wynalazku są pochodne rapamycyny zawierające fosfor, kompozycja je zawierająca oraz ich zastosowanie.

Rapamycyna jest antybiotykiem makrolidowym wytwarzanym przez Streptomyces hygroscopicus. Wiąże się ona z białkiem wiążącym FK506, FKBP12, z wysokim powinowactwem, tworząc kompleks rapamycyna: FKBP. Opisywane wartości Kd dla tego połączenia są tak niskie jak 200 pM. Kompleks rapamycyna: FKBP wiąże się z dużym powinowactwem z dużymi białkami komórkowymi, FRAP, tworząc kompleks trzyczęściowy [FKBP:rapamycyna]; [FRAP]. W kompleksie tym rapamycyna może być postrzegana jako czynnik dimeryzujący lub łącznik łączący FKBP z FRAP. Tworzenie kompleksu jest związane z różnymi biologicznymi aktywnościami rapamycyny.

Rapamycyna jest silnym środkiem immunosupresyjnym i jest klinicznie stosowana do zapobiegania odrzucaniu narządów po transplantacji. Rapamycyna i/lub jej analogi, CCI 779 (Wyeth) i SDZ Rad (RAD001, Novartis) są obiecującymi środkami do leczenia niektórych raków, do immunosupresji i/lub wspomagania obniżania występowania nawrotu zwężenia w następstwie interwencji kardiologicznych. Rapamycyna wykazuje również działanie jako środek przeciwgrzybiczy, w doświadczalnym modelu alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (model stwardnienia rozsianego), w modelu wspomagającym zapalenia stawów (reumatoidalnego zapalenia stawów), hamowaniu tworzenia przeciwciał typu IgE i w leczeniu lub zapobieganiu liszajowi rumieniowatemu, zapaleniu płuc, cukrzycy insulinozależnej, białaczce/chłoniakowi dorosłych z komórkami T oraz proliferacji komórek mięśni gładkich i zgrubieniu błony wewnętrznej wskutek uszkodzenia naczyń. Patrz np. opublikowane zgłoszenie patentowe USA 2001/0010920.

Ze względu na to, że rapamycyna służy jako łącznik w kompleksie FKBP z FRAP, jest ona również zdolna do multimeryzowania odpowiednio oznaczonych domen z wbudowanymi chimerycznymi białkami, pochodzących odpowiednio od FKBP i FRAP. Z powodu tego działania rapamycyna i jej różne pochodne lub analogi stosuje się również jako środki multimeryzujące do aktywowania biologicznych przełączników na podstawie takich chimerycznych białek. Patrz np. WO 96/41865, WO 99/36553, WO 01/14387, Rivera i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8657-8662 oraz Ye, X. i inni, (1999) Science 283, 88-91.

Potencjał rapamycyny w łagodzeniu znacznego zakresu poważnych chorób stymuluje poszukiwania analogów rapamycyny o poprawionym wskaźniku terapeutycznym, lepszej farmakokinetyce, lepszych właściwościach formułowania preparatów, łatwości lub oszczędności w procesie wytwarzania itp. W ciągu kilku ostatnich dekad prowadzone są badania w tym zakresie przez przemysł farmaceutyczny i ośrodki akademickie. Doprowadziły one do badania substancji i sposobów transformacji rapamycyny, obejmujących redukcję ketonów, demetylowanie, epimeryzację, różne procesy acylowania i alkilowania grup hydroksylowych itp.

Opisane są liczne strukturalne warianty rapamycyny, zwykle powstające jako alternatywne produkty fermentacji i/lub produkty syntetyczne. Na przykład obszerna literatura dotycząca analogów, homologów, pochodnych i innych związków strukturalnie związanych z rapamycyną („rapalogi) obejmuje m.in. warianty rapamycyny wykazujące jedną lub więcej spośród następujących modyfikacji wobec rapamycyny: demetylowanie, eliminowanie lub podstawianie grupy metoksylowej przy C7, C42 i/lub C29, eliminowanie, derywatyzacja lub podstawianie grupy hydroksylowej przy C13, C43 i/lub C28, redukcja, eliminowanie lub derywatyzacja ketonu przy C14, C24 i/lub C30, podstawianie 6-członowego pierścienia pipekolinowego 5-członowym pierścieniem profilowym i alternatywne podstawianie przy pierścieniu cykloheksylowym lub zastąpienie pierścienia cykloheksylowego podstawionym pierścieniem cyklopentylowym. Dodatkowe informacje historyczne przedstawione są w częściach dotyczących znanego stanu techniki w opisach patentowych USA nr 5525610, 5310903 i 5362718. Patrz również opis patentowy USA nr 5527907. Opisane są również substancje i sposoby bardzo skutecznej i selektywnej epimeryzacji grupy hydroksylowej C-28 (WO 01/14387).

Nowe rapalogi o zmniejszonej aktywności immunosupresyjnej i/lub interesującym profilu farmakokinetycznym lub profilu biodostępności byłyby bardzo pożądane do stosowania jako środki multimeryzujące lub jako środki przeciwgrzybicze.

Nowe rapalogi o atrakcyjnych właściwościach fizykochemicznych lub funkcjonalnych w stosunku do rapamycyny, np. pod względem wskaźnika terapeutycznego, biodostępności, farmakokinetyki, trwałości itp. są również bardzo interesujące dla różnych zastosowań farmaceutycznych, takich jak powyżej wspomniane, m.in. jako środków immunosupresyjnych, jako środków przeciwrakowych

PL 216 224 B1 i środków do zmniejszania występowania nawrotu zwężenia po interwencjach kardiologicznych (np.

w przypadku stentów zawierających lek).

Jedynymi rapalogami stosowanymi obecnie w badaniach klinicznych jako środki immunosupresyjne są związki o raczej skromnych, konwencjonalnych modyfikacjach strukturalnych, takich jak acylowanie lub alkilowanie przy C-43 (odpowiednio CCI 779 i SDZ RAD; patrz np. Yu, K. i inni, EndocrineRelated Cancer (2001) 8, 249-258; Geoerger, B. i inni, Cancer Res. (2001) 61, 1527-1532) i Dancey, Hematol. Oncol. Clin. N Am 16 (2002):1101-1114.

Wynalazek opisany poniżej przedstawia zasadnicze odstępstwo w projektowaniu nowych rapalogów, w oparciu o włączenie ugrupowania zawierającego fosfor.

Pochodne rapamycyny zawierające fosfor, według obecnego wynalazku, określone są następującym wzorem:

w którym A oznacza O, Q oznacza wiązanie, a J jest wybrany z grupy obejmującej poniższe wzory

₅ w których każdy R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grup: fenylowej i C1-C6alkilowej, niepodstawionych lub podstawionych przez podstawnik wybrany z grupy obejmującej atom fluorowca, -OH oraz grupę alkoksylową, alkiloksyalkiloksylową, halogenoalkilową, hydroksyalkoksylową, acylową i acyloksylową, przy czym każda grupa alkilowa, alkoksylowa i acylowa zawiera 1-6 sąsiednich atomów węgla;

pod warunkiem, że J-Q-A nie oznacza (MeO2) (P=O)O-.

W zakres wynalazku wchodzą również farmaceutycznie dopuszczalne sole powyższych pochodnych.

Korzystnie, każda z grup C1-C6alkilowych jest niezależnie wybrana z grupy obejmującej metyl, etyl, n-propyl, i-propyl oraz n-butyl.

Korzystnie są następujące związki:

PL 216 224 B1

a zwłaszcza poniższy związek

Ponadto, zakresem wynalazku objęta jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera określoną powyżej pochodną rapamycyny, jako substancję czynną, oraz farmaceutycznie dopuszczalne podłoże, przy czym farmaceutycznie dopuszczalne podłoże ewentualnie zawiera farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze.

Korzystnie, kompozycja ma postać odpowiednią do podawania doustnego lub pozajelitowego osobnikom, np. ssakom, takim jak człowiek. Kompozycje według wynalazku można wytwarzać, stosując konwencjonalne substancje odpowiednie do podawania różnymi drogami aplikowania omawianymi w niniejszym opisie.

PL 216 224 B1

Ponadto, w zakres wynalazku wchodzi zastosowanie pochodnej rapamycyny, określonej powyżej, do wytwarzania leku do leczenia glejaka, mięsaka, białaczki, raka sutka, raka trzustki, raka płuc lub raka okrężnicy.

Określone powyżej pochodne rapamycyny zawierające fosfor, według wynalazku, wchodzą w zakres rodziny związków o wzorze I

i ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych.

₂

W związkach o wzorze I A oznacza -O-, -S- lub grupę -NR²-, lub A nie występuje (tj. oznacza wiązanie kowalencyjne łączące grupę JQ- z węglem 43); Q nie występuje (tj. oznacza wiązanie kowa₂ lencyjne łączące J z A lub z węglem 43), lub jeśli A oznacza -O-, -S- lub -NR²-, Q może oznaczać -V-, ₂

-OV-, -SV- lub -NR²V-, przy czym V oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub heteroarylową, tak że J jest związany z grupą cykloheksylową bezpośrednio, poprzez A lub poprzez VA, OVA, SVA lub NR²VA;

K oznacza O lub S;

₂ każdy z podstawników Y niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR²-, lub wiązanie chemiczne wiążące grupę R⁵ z P;

5 każdy z podstawników R² i R⁵ niezależnie oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub 6 5 5 5 heteroarylową, lub atom wodoru, a każdy z podstawników R⁶ niezależnie oznacza R⁵, -PK(YR⁵)(YR⁵),

-SO2(YR⁵) lub -C(O)(YR⁵); gdy podstawniki R², R⁵ lub R⁶ związane bezpośrednio z P nie oznaczają 2 5 6 atomu wodoru (np. -PR², -PR⁵ i -PR⁶ nie mogą oznaczać -PH);

5 6 przy czym dwa spośród podstawników R², R⁵ i/lub R⁶ mogą być związane chemicznie pomiędzy sobą, tworząc pierścień;

każdy podstawnik G niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR²-, (M)x lub wiązanie chemiczne łączące R⁶ z P; każdy podstawnik M niezależnie oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę metylenową, a ugrupowanie M-M' może być nasycone lub nienasycone;

każdy symbol x niezależnie oznacza liczbę całkowitą 0-6;

jeden z podstawników R^7a i R^7b oznacza atom wodoru, a drugi oznacza atom wodoru, fluorowca, -R^A, -OR^A, -SR^A, -OC(O)R^A, -OC(O)NR^AR^B, -NR^AR^B, -NR^BC(O)R^A, -NR^BC(O)OR^A, -NR^BSO2R^A lub -NR^BSO₂NR^AR^B;

lub R^7a i R^7b razem oznaczają H w grupie tetraenowej:

PL 216 224 B1

A 2 B 2 gdzie R^A oznacza R², a R^B oznacza OH lub R², przy czym w pewnych przypadkach jeden lub obydwa

AB z podstawników R^A i R^B oznaczają H;

R²⁸ oznacza atom wodoru, J lub grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową, heteroarylową, acylową, aroilową lub heteroaroilową, a n oznacza 1 lub 2; przy czym każda z poniżej wymienionych grup alifatycznych i heteroalifatycznych jest niezależnie liniowa lub rozgałęziona, lub cykliczna lub acykliczna i podstawiona lub niepodstawiona, a każda z grup arylowych, heteroarylowych, acylowych, aroilowych lub heteroaroilowych jest niezależnie podstawiona lub niepodstawiona;

z tym, że (a) jeśli JQA- oznacza (R²Y) (Me) (P=O)O-, wówczas (R²Y) (i) nie oznacza immunogennego ₂ materiału nośnikowego, detektorowego materiału nośnikowego lub stałej matrycy, lub (ii) R² zawiera 15 lub mniej atomów węgla, korzystnie 10 lub mniej; i (b) związek nie stanowi związku o wzorze

lub jego demetylowanego lub zredukowanego analogu, lub soli poniżej wspomnianych związków, gdzie W oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę heterocykliczną zawierającą grupę

samą lub skondensowaną z 6-członowym pierścieniem aromatycznym, przy czym U oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę aminową, O, S, SO lub SO2; i (c) w związkach o wzorze

J-Q-A- nie oznacza grupy (HO)2(PO)-O- lub jej dimetylowego estru fosforanowego (i korzystnie nie oznacza innego jej niższego estru dialkilowego);

szczególnie interesującymi podstawnikami J w różnych opcjach są grupy przedstawione w serii 1:

PL 216 224 B1

5 6 w których K, R², R⁵ i R⁶ mają znaczenie poniżej podane.

Szczególnie interesującymi grupami J są grupy, w których K oznacza atom tlenu, jak przedstawiono w licznych przykładach związków podanych poniżej, obejmujące m.in. następujące grupy:

₅ w których każdy z podstawników R⁵ jest niezależnie wybrany spośród niższych grup alifatycznych lub ₅ grup arylowych, które mogą być podstawione lub niepodstawione, lub w przypadku grup -OR⁵ mogą również oznaczać atom wodoru. Korzystne są również rozwiązania, w których ugrupowanie -Q-Aoznacza O, zwłaszcza w przypadkach, w których J ma jedno z korzystnych znaczeń podanych poniżej (choć korzystnie nie -PO3H2). Również korzystne są powyższe związki, w których JQA- oznacza grupę 22 (R²Y)(Me)P=O)O-, w której R²Y- zawiera 15 lub mniej atomów węgla, korzystnie 10 lub mniej atomów węgla, a w pewnych przypadkach 6 lub mniej atomów węgla.

Ta rodzina związków obejmuje szereg klas związków szczególnie interesujących.

Na przykład jedna z takich klas jest przedstawiona wzorem (a):

₅

W tej klasie związków każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (przy czym każda z tych grup może być podstawiona lub niepodstawiona), i oznacza zwłaszcza niższą (tj. o 1-6 atomach węgla) grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez atomy fluorowca, grupy hydroksylowe, -O-acyIowe (tj. acyloksylowe), alkoksylowe, fluorowcoalkilowe, hydroksyalkoksylowe, arylowe lub heteroarylowe itp.). W niektórych przykładach tej klasy związki o wzorze (a) zawierają ugrupowanie J wybrane spośród następujących grup:

Ta klasa związków jest dalej zilustrowana w przykładach syntezy, wśród przykładów podklasy, ₅ w których ugrupowanie J-Q-A- oznacza grupę (R⁵)2PO-O-. Należy zaznaczyć, że wszystkie podstaw256 niki R², R⁵, R⁶ i J opisane lub podane w przykładach w związku z danym związkiem, podklasą lub klasą związków można tak samo stosować w innych klasach, o ile nie podano inaczej. Tak więc, grupy 256

R², R⁵, R⁶ lub J opisane w jednym przypadku należy rozciągnąć na wszystkie inne przypadki, o ile nie podano inaczej.

PL 216 224 B1

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (b):

₅

W klasie tej każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione), zwłaszcza oznacza niższą grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez grupy hydroksylowe, alkoksylowe, hydroksyalkoksylowe, acyloksylowe, arylowe lub heteroaryIowe itp.). W przypadku grupy -OR⁵ podstawnik R⁵ może dodatkowo oznaczać atom wodoru. Odpowiednie przykłady obejmują związki o wzorze (b), w którym J jest wybrany spośród następujących grup:

Ta klasa związków jest również zilustrowana w przykładach syntezy przez człony podklasy, 55 w której ugrupowanie J-Q-A- oznacza (R⁵) (R⁵)PO-O-.

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (c) z ograniczeniem podanym na wstępie:

₅

W klasie tej każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród atomu wodoru lub grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione), zwłaszcza oznacza niższą grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez grupy hydroksylowe, alkoksylowe, hydroksyalkoksylowe, acyloksylowe, arylowe lub heteroarylowe itp.). Odpowiednie przykłady obejmują związki o wzorze (c), w którym J jest wybrany spośród następujących grup:

PL 216 224 B1

Ta klasa związków jest również zilustrowana w przykładach syntezy przez człony podklasy, w której ugrupowanie J-Q-A- oznacza (R⁵O) (R⁵O)PO-O-.

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (d):

₅

W klasie tej każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione), zwłaszcza oznacza niższą (tj. o 1-6 atomach węgla) grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez grupy hydroksylowe, alkoksylowe, hydrok₅ syalkoksylowe, acyloksylowe, arylowe lub heteroarylowe itp.). W pewnych przypadkach grupa -NHR⁵oznacza grupę -NH2. Odpowiednie przykłady obejmują związki o wzorze (d), w którym J jest wybrany spośród następujących grup:

Ta klasa związków jest również zilustrowana przez podklasę, w której ugrupowanie J-Q-Aoznacza (R⁵) (R⁵N)PO-O-.

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (e):

(β)

PL 216 224 B1 ₅

W klasie tej każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród atomu wodoru lub grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione), zwłaszcza oznacza niższą (tj. o 1-6 atomach węgla) grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez grupy hydroksylowe, alkoksylowe, hydroksyalkoksylowe, acyloksylowe, arylowe lub heteroarylowe itp.). Odpowiednie przykłady obejmują związki o wzorze (e), w którym J jest wybrany spośród następujących grup:

Ta klasa związków jest ponadto zilustrowana w przykładach syntezy, wśród członów podklasy, 55 w których ugrupowanie J-Q-A- oznacza grupę (R⁵N) (R⁵N)PO-O-.

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (f):

₅

W klasie tej każdy podstawnik R⁵ jest niezależnie wybrany spośród atomu wodoru lub grup alifatycznych, heteroalifatycznych, arylowych lub heteroarylowych (które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione), zwłaszcza oznacza niższą (tj. o 1-6 atomach węgla) grupę alifatyczną, np. niższą grupę alkilową, która może być ewentualnie podstawiona (np. przez grupy hydroksylowe, alkoksylowe, hydroksyalkoksylowe, acyloksylowe, arylowe lub heteroarylowe itp.). Odpowiednie przykłady obejmują związki o wzorze (f), w którym J jest wybrany spośród następujących grup:

W klasach (d), (e) i (f) grupa „QA” korzystnie oznacza -O- lub -OVO-. Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (g):

PL 216 224 B1 w którym J, Q, n i różne podstawniki R mają znaczenie poniżej podane, z ograniczeniem podanym na wstępie. Ta klasa związków obejmuje szereg interesujących podklas, takich jak następuje:

w którym to wzorze Q nie występuje, tj. J jest połączony (tj. związany kowalencyjnie) z pierścieniem cykloheksylowym poprzez tlen. Ta podklasa (która obejmuje samą O-fosforylowaną rapamycynę i jej sole lub fosfodiestry metylowe) obejmuje związki zawierające dowolne ugrupowania J, jak poniżej określono, obejmujące wszystkie typy ugrupowań J podane w dowolnym miejscu tego dokumentu, w tym opisane tu grupy przedstawione w różnych związkach, typach związków i przykładach grup J, przy czym obejmują one m.in. następujące przykłady:

gdzie J jest wybrany spośród następujących grup: -P(O)Me2, -P(O)Ph2, -P(O)(OMe)(Me), -P(O)(OnPr)(Me), -P(O)(OiPr)(Me), -P(O)(OnBu)(Me), -P(O)(Me)(OCH2CH2OMe), -P(O)(Me)(OCH2CH2OEt), -P(O)(Me)(OCH2CH2OCH2CH2OH), -P(O)(OMe)(Et), -P(O)(CH2CH2OH)2, -P(O)(OEt)2, -P(O)(NH2)2.

W związkach o budowie przedstawionej we wzorze „(g) (i) (a)” J oznacza grupę inną niż -PO3H2, jej sól lub -PO-3Me2. Taki wybór podstawnika J jest dozwolony jedynie w kombinacji z jedną lub więcej dodatkowymi zmianami strukturalnymi w stosunku do rapamycyny, jak np. zmieniona stereochemia w jednej lub więcej pozycjach, obejmującej C43 lub C28, modyfikacje w podstawniku lub stereochemii przy C7, redukcja jednej lub więcej funkcji ketonowej, demetylowanie w jednej lub więcej pozycjach itp. I tak interesujące są m.in. następujące związki:

PL 216 224 B1

₅ w których R⁵ oznacza atom wodoru lub niższą grupę alkilową, taką jak m.in. grupa metylowa.

Szczególnie interesująca jest również podklasa związków (g) (ii), która różni się od podklasy (g) (i) (a) pod jednym lub więcej następującymi względami: (a) podstawnik w pozycji 28 jest epimeryzowany (w stosunku do orientacji rapamycyny C28 -OH), (b) jedna lub obydwie grupy ketonowe w pozycjach 24 i 30 są zredukowane do grup hydroksylowych, (c) grupa metoksylowa w pozycji 7 jest zastąpiona przez atom wodoru lub przez jeden z różnych podstawników C7 wymienionych w innym miejscu tego opisu i (d) podstawnik J-O- w położeniu 43 występuje w orientacji epimerycznej (w stosunku do orientacji rapamycyny C43 -OH). Natomiast J oznacza ugrupowania zawierające fosfor, jak poniżej opisano.

Inną interesującą podklasą są związki przedstawione wzorem (g)(iii) z O-związaną grupą J, w której występuje Q. Ta podklasa ilustruje przypadek, w którym Q oznacza grupę -OV-, w której V oznacza grupę alifatyczną.

gdzie J jest wybrany spośród następujących grup:

-Ρ(Ο)Μβ2, -P(O)Ph2, -P(O)(OMe)(Me), -P(O)(OnPr)(Me), -P(O)(OiPr)(Me), -P(O)(OnBu)(Me), -P(O)(Me)(OCH2CH2OMe), -P(O)(Me) (OCH2CH2OEt), -P(O)(Me) (OCH2CH2OCH2CH2OH), -P(O)(OMe)(Et), -P(O)(CH2CH2OH)2, -P(O)(OEt)2, -P(O)(NH2)2.

Inną klasę związków, które również są interesujące, przedstawiają związki, w których A oznacza ₂ grupę -NR²-, jak podano we wzorze (h):

PL 216 224 B1

Ta klasa obejmuje podklasę, w której Q nie występuje, tj. w której J jest połączony (czyli kowalencyjnie związany) z pierścieniem cykloheksylowym poprzez atom azotu, jak podano poniżej:

przy czym J jest wybrany spośród następujących grup:

-P(O)Me2, -P(O)Ph2, -P(O)(OMe)(Me), -P(O)(OnPr)(Me), -P(O)(OiPr)(Me), -P(O)(OnBu)(Me),

-P(O)(Me)(OCH2CH2OMe), -P(O)(Me)(OCH2CH2OEt), -P(O)(Me)(OCH2CH2OCH2CH2OH), -P(O)(OMe)(Et), -P(O)(CH2CH2OH)2, -P(O)(OEt)2, -P(O)(NH2)2.

Inną korzystną podklasę klasy (h) ilustrują poniżej pochodne rapamycyny, w których Q występuje i obejmuje alifatyczną lub heteroalifatyczną grupę V, która może być podstawiona lub niepodstawiona, przy czym wszelkie zmienne podstawniki mają znaczenie poniżej podane lub w inny sposób przykładowo wymienione:

PL 216 224 B1 przy czym JQ- oznacza grupę J-OCH2CH2NH-, J-CH2CH2NH-, J-OCH2CH2OCH2CH2NH- lub J-OCH (CH3)CH2NH-.

Inna klasa interesujących związków jest przedstawiona wzorem (i):

w którym J, Q, n oraz różne grupy R mają znaczenie poniżej podane. Ta klasa obejmuje szereg korzystnych podklas, włączając następujące:

w którym Q nie występuje, tj. w którym J jest połączony (czyli kowalencyjnie związany) z pierścieniem cykloheksylowym poprzez atom siarki. Ta podklasa obejmuje związki zawierające ugrupowania J, jak poniżej określono, włączając następujące przykłady:

PL 216 224 B1 gdzie J jest wybrany spośród następujących grup:

-Ρ(Ο)Μβ2, -P(O)Ph2, -P(O)(OMe)(Me), -P(O)(OnPr)(Me), -P(O)-(OiPr)(Me), -P(O)(OnBu)(Me), -P(O)(Me)(OCH2CH2OMe), -P(O)(Me)(OCH2CH2OEt), -P(O)(Me)(OCH2CH2OCH2CH2OH), -P(O)(OMe)(Et), -P(O)(CH2CH2OH)2, -P(O)(OEt)2, -P(O)(NH2)2.

Inna interesująca podklasa jest przedstawiona poniżej wzorem (i) (ii), który ilustruje związki zawierające O-związane ugrupowanie J, w którym występuje Q. Ta podklasa przedstawia przypadek, w którym Q oznacza grupę -SV-, w której V oznacza grupę alifatyczną:

przy czym J jest wybrany spośród następujących grup:

-P(O)Me2, -P(O)Ph2, -P(O)(OMe)(Me), -P(O)(OnPr)(Me), -P(O)(OiPr)(Me), -P(O)(OnBu)(Me), -P(O)(Me)(OCH2CH2OMe), -P(O)(Me)(OCH2CH2OEt), -P(O)(Me)(OCH2CH2OCH2CH2OH), -P(O)(OMe)(Et), -P(O)(CH2CH2OH)2, -P(O)(OEt)2, -P(O)(NH2)2.

Poniżej podane są dodatkowe klasy szczególnie interesujących związków:

(j) Związki o wzorze I, w których grupa JQA- zastępuje grupę hydroksylową C-43 rapamycyny, z zachowaniem stereochemii przy C43 w stosunku do rapamycyny, przy czym JQA ma znaczenie poniżej podane, z ograniczeniem podanym na wstępie. Takie związki można wytwarzać z rapamycyny w sposób opisany poniżej.

(k) Związki jak w klasie (j), lecz z jedną lub więcej dodatkowymi modyfikacjami strukturalnymi w stosunku do rapamycyny. Znane są liczne takie modyfikacje, jak na przykład zastępowanie podstawnika -OMe przy C7 lub zmiana jego stereochemii, epimeryzacja przy jednym lub obydwu C28 i C43, redukcja jednej lub więcej funkcji ketonowych, np. w jednej lub obydwu pozycjach 24 i 30 w pierścieniu, demetylowanie w jednej lub więcej pozycjach, redukcja jednego lub więcej podwójnych wiązań pomiędzy C1 i C6 i/lub stosowanie analogów prolilowych w miejsce struktury pipekolinianu rapamycyny.

Wszystkie te związki, można wytwarzać, wychodząc z odpowiednich analogów rapamycyny, zamiast samej rapamycyny.

(l) Związki, w których J ma znaczenie inne niż -PO3H2, ich sole lub dialkilofosforany (takie jak na przykład PO3Me2).

(m) Związki o masie cząsteczkowej poniżej 1700, korzystnie poniżej 1400, a zwłaszcza poniżej 1200 jednostek masy (nie licząc udziału przeciwjonu w przypadku, gdy związek jest w postaci soli).

(n) Związki, które są chemicznie związane z grupą glikolu polietylenowego lub innymi grupami zwiększającymi rozpuszczalność. Przykłady obejmują estry glicyny (lub inne aminokarboksylany) lub estry PEG (patrz np. publikacja WO 02/24706,) każdej wolnej grupy -OH rapalogu według wynalazku.

(o) Związki według wynalazku, które wykazują co najmniej 0,01, korzystnie 0,1 i więcej, zwłaszcza co najmniej 0,5-krotność aktywności rapamycyny w teście proliferacji komórek T.

PL 216 224 B1 (p) Związki o wzorze

₂ i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, w których A oznacza -O-, -S- lub -NR²- lub nie występuje (tj. oznacza wiązanie kowalencyjne łączące JQ z C-43); Q nie występuje (tj. oznacza wiązanie ₂ kowalencyjne) lub (jeśli A oznacza -O-, -S- lub -NR²-) Q może oznaczać -V-, -OV-, ₂

-SV- lub -NR²V-, przy czym V oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub heteroarylową, tak że J jest związany z pierścieniem cykloheksylowym bezpośrednio, poprzez A lub poprzez VA, OVA, SVA lub NR²VA; K oznacza O lub S;

przy czym każdy podstawnik Y niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR²- lub wiązanie łączące ugrupowanie R⁵ z P,

5 każdy podstawnik R² i R⁵ niezależnie oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub 6 5 5 5 heteroarylową, lub atom wodoru, i każdy podstawnik R⁶ niezależnie oznacza R⁵, -PK(YR⁵)(YR⁵),

-SO2(YR⁵) lub -C(O)(YR⁵), gdy R², R⁵ lub R⁶ związane bezpośrednio z P nie oznaczają atomu 2 5 6 wodoru; przy czym dwa podstawniki R², R⁵ i/lub R⁶ mogą być chemicznie związane pomiędzy ₂ sobą, tworząc pierścień; każdy podstawnik G niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR -, (M)_x lub wiązanie chemiczne łączące R⁶ z P; każdy podstawnik M niezależnie oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę metylenową i każde ugrupowanie M-M' może być nasycone lub nienasycone, x każdorazowo oznacza niezależnie liczbę całkowitą 0-6, przy czym poniżej wymienione grupy alifatyczne i heteroalifatyczne są każdorazowo niezależnie liniowe lub rozgałęzione, lub cykliczne lub acykliczne i podstawione lub niepodstawione, i grupy arylowe, heteroarylowe, acylowe, aroilowe lub heteroaroilowe są każdorazowo niezależnie podstawione lub niepodstawione; z tym, że J-Q-A- nie oznacza (HO)2(P=O)O- lub (MeO)2(P=O)O-, lub (HO)2(P=O)-W-O-, lub demetylowanego lub zredukowanego analogu takiej zawierającej (HO) 2(P=O)-W-O- pochodnej rapamycyny, przy czym W oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę heterocykliczną obejmującą grupę

samą lub skondensowaną z 6-członowym pierścieniem aromatycznym, w której U oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę aminową, O, S, SO lub SO2, lub sól poniżej wymienionych związków, i jeżeli JQA- oznacza (R²Y)(Me)(P=O)O-, wówczas (R²Y) nie oznacza immunogennego materiału nośnikowego, detektorowego materiału nośnikowego lub stałej matrycy, lub ich soli (np. jak w rozwiąza22 niach, w których R² w grupie R²Y zawiera 15 lub mniej, korzystnie 10 lub mniej, a zwłaszcza 6 lub mniej atomów węgla).

PL 216 224 B1 (q) Związki o wzorze

i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, w których A, J, K i inne zmienne grupy mają znaczenie podane w punkcie (p), z wyjątkiem związków z ograniczeniem takim, że (a) J-A- nie oznacza (HO)2(P=O)O- lub (MeO)2(P=O)O-, oraz (b) jeżeli JA- oznacza (R²Y) (Me) (P=O)O-, wówczas (R²Y) nie oznacza immunogennego materiału nośnikowego, detektorowego materiału nośnikowego lub stałej 22 matrycy, lub ich soli (np. jak w rozwiązaniach, w których R² w grupie R²Y zawiera 15 lub mniej, korzystnie 10 lub mniej, a zwłaszcza 6 lub mniej atomów węgla) (zamiast ograniczenia w przypadku (p)).

(r) Związek o wzorze

oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, w których J jest wybrany spośród następujących grup:

w których różne zmienne grupy mają znaczenie poniżej podane w punkcie (p) i (q) z wyjątkiem tego, 2 5 że każdorazowo R² i R⁵ są niezależnie wybrane spośród niższych grup alifatycznych lub grup arylo₅ wych, które mogą być podstawione lub niepodstawione (z wyjątkiem tego, że dodatkowo -OR⁵i -NR²R⁵ mogą oznaczać -OH i -NHR⁵);

i pod warunkiem, że jeżeli J-Q-A- oznacza (R²Y) (Me) (P=O)O-, wówczas (R²Y) nie oznacza immunogennego materiału nośnikowego, detektorowego materiału nośnikowego lub stałej matrycy, lub ich soli.

(s) Związki o wzorze

PL 216 224 B1 i ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, w których J jest wybrany spośród następujących grup:

-]^{- RS}~p-p tftfN-l·-]-- oraz

Α» R^£Q H^N R^sH²N^Z flłW

A nie występuje lub oznacza -O-, -S- lub -NR²-; Q nie występuje lub (gdy A oznacza -O-, -S- lub -NR²-) ₂

Q może oznaczać -V-, -OV-, -SV- lub -NR²V-, przy czym V oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub heteroarylową, tak że J jest związany z pierścieniem cykloheksylowym bezpośrednio, poprzez A lub poprzez VA, OVA, SVA lub NR²VA;

₂

K oznacza O lub S; podstawnik Y każdorazowo niezależnie oznacza -O-, -S-, -N R²- lub wiązanie 5 2 5 chemiczne łączące R⁵ z P, każdorazowo R² i R⁵ niezależnie oznaczają grupę alifatyczną, heteroalifa65 tyczną, arylową lub heteroarylową, lub atom wodoru, i każdorazowo R⁶ niezależnie oznacza R⁵,

-PK(YR⁵)(YR⁵), -SO2(YR⁵) lub -C(O)(YR⁵), gdy ugrupowanie R², R⁵ lub R⁶ związane bezpośrednio 2 5 6 z P nie oznacza atomu wodoru; przy czym dwa podstawniki R², R⁵ i/lub R⁶ mogą być chemicznie ₂ związane, tworząc pierścień; każdy podstawnik G niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR²-, (M)x lub wiązanie chemiczne łączące R⁶ z P; każdy podstawnik M niezależnie oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę metylenową i każde ugrupowanie M-M' może być nasycone lub nienasycone, x każdorazowo oznacza niezależnie liczbę całkowitą 0-6, przy czym poniżej wymienione grupy alifatyczne i heteroalifatyczne są każdorazowo niezależnie liniowe lub rozgałęzione, lub cykliczne lub acykliczne i podstawione lub niepodstawione, i grupy arylowe, heteroarylowe, acylowe, aroilowe lub heteroaroilowe są każdorazowo niezależnie podstawione lub niepodstawione;

przy czym każdorazowo R² i R⁵ są niezależnie wybrane spośród niższych grup alifatycznych lub grup ₅ arylowych, które mogą być podstawione lub niepodstawione, z wyjątkiem tego, że dodatkowo -OR⁵ i -NR²R⁵ mogą oznaczać -OH i -NHR⁵ i pod warunkiem, że jeżeli J-Q-A- oznacza (R²Y) (Me) (P=O)O-, ₂ wówczas (R²Y) zawiera 15 lub mniej atomów węgla.

(t) Związki typu (p) do (s), w których każdorazowo R² i R⁵ oznaczają niezależnie grupę C1-C6-alkilową ewentualnie zawierającą jeden lub więcej podstawników, takich jak atom fluorowca, -OH, grupa alkoksylowa, alkiloksyalkiloksylowa, fluorowcoalkilowa, hydroksyalkoksylowa, acylowa, acylo5 2 5 ksylowa, heterocykliczna, arylowa lub heteroarylowa, z tym, że dodatkowo -OR⁵ i -NR²R⁵ mogą oznaczać -OH i-NHR⁵.

(u) Związki typu (t), w których każdorazowo R² i R⁵ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej grupę metylową, etylową, n-propylową, -propylową, n-butylową, 2-butylową, t-butylową, fenylową lub heteroarylową, które to grupy każdorazowo są ewentualnie podstawione jedno- lub wielokrotnie przez fluorowiec, -OH, grupę alkoksylową, alkoksyalkoksylową, fluorowcoalkilową, hydroksyalkoksylową, 5 2 5 acylową, acyloksylową, heterocykliczną, arylową lub heteroarylową, i dodatkowo grupy -OR⁵ i -NR²R⁵mogą oznaczać -OH i -NHR⁵.

(v) Związki typu (p) do (u), w których podstawniki R² i R⁵ w ugrupowaniu J oznaczają grupy alifatyczne zawierające do 8 atomów węgla, które mogą być ewentualnie podstawione, np. jak przedstawiono w następujących grupach J:

PL 216 224 B1

(w) Związki typu (p), (s), (t), (u) lub (v), w których grupa QA oznacza -O-, -OVO-, -NH-, -OVNH-, -S- lub -SVS-, przy czym V oznacza niższą grupę alifatyczną.

₂ (x) Związki wszelkich poprzednich typów, w których grupy JQA- lub JA- zawierają grupę (R²Y) ₂ (Me)(P=O)O-, w której R²Y- zawiera 15 lub mniej, korzystnie 10 lub mniej, a zwłaszcza 8 lub mniej atomów węgla.

(y) Związki obejmujące pochodne rapamycyny lub 43-epirapamycyny, w których grupa hydroksylowa w położeniu 43 jest zastąpiona przez grupę JQA-, w której

A oznacza -Ο-, -S- lub -NR²- lub nie występuje; Q nie występuje lub (jeśli A oznacza -O-, -S- lub -NR²-) Q ₂ może oznaczać -V-, -OV-, -SV- lub -N R²V-, przy czym V oznacza grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub heteroarylową, tak że J jest związany z pierścieniem cykloheksylowym bezpośrednio, poprzez A lub poprzez VA, OVA, SVA lub NR²VA; K oznacza O lub S;

PL 216 224 B1 przy czym każdorazowo Y oznacza niezależnie -O-, -S-, -NR²- lub wiązanie łączące R⁵ z P;

każdorazowo R² i R⁵ oznaczają niezależnie grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub hetero6 5 5 5 5 arylową, lub atom wodoru, i każdorazowo R⁶ niezależnie oznacza R⁵, -PK(YR⁵)(YR⁵), -SO2(YR⁵) lub 5 2 5 6

-C(O)(YR⁵), gdy ugrupowanie R², R⁵ lub R⁶ związane bezpośrednio z P nie oznacza atomu wodoru; 2 5 6 przy czym dwa podstawniki R², R⁵ i/lub R⁶ mogą być chemicznie związane, tworząc pierścień;

₂ każdy podstawnik G niezależnie oznacza -O-, -S-, -NR²-, (M)x lub wiązanie chemiczne łączące R⁶ z P;

każdy podstawnik M niezależnie oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę metylenową i każde ugrupowanie M-M' może być nasycone lub nienasycone, x każdorazowo oznacza niezależnie liczbę całkowitą 0-6, przy czym poniżej wymienione grupy alifatyczne i heteroalifatyczne są każdorazowo niezależnie liniowe lub rozgałęzione, lub cykliczne lub acykliczne i podstawione lub niepodstawione, i grupy arylowe, heteroarylowe, acylowe, aroilowe lub heteroaroilowe są każdorazowo niezależnie podstawione lub niepodstawione z jedną lub więcej spośród następujących cech:

(1) epimeryzacja w pozycji 28 lub zastąpienie grupy hydroksylowej w pozycji 28 (o dowolnej orientacji 22 stereochemicznej) przez atom fluorowca, -OR² lub -OC(=O)AR²;

(2) zastąpienie grupy ketonowej w pozycji 24 przez podstawiony lub niepodstawiony oksym lub przez 22 grupę hydroksylową lub jej pochodną o wzorze -OR² lub -OC(=O)AR²;

(3) zastąpienie grupy ketonowej w pozycji 24 przez podstawiony lub niepodstawiony oksym lub przez 22 grupę hydroksylową lub jej pochodną o wzorze -OR² lub -OC(=O)AR²;

(4) epimeryzacja grupy -OMe w pozycji 7 i/lub zastąpienie grupy -OMe przez ugrupowanie wybrane , -OC(O)NR^AR^B, -NR^AR^B',

A 2 B przy czym R^A oznacza R², a R^B ozna-OC(O)R^A z grupy obejmującej atom wodoru, fluorowca, -R^A, -OR^A, -SR -NR^BC(O)R^A, -NR^BC(O)OR^A, -NR^BSO2R^A lub -NR^BSO2NR^AR^Bcza OH lub R²; i (5) eliminowanie grupy -OMe w pozycji 7, przy czym otrzymuje się ugrupowanie tetraenowe:

(z) Związki typu (y), w których każdorazowo R² i R⁵ oznaczają niezależnie wybrane grupy

C1-C6-alkilowe, ewentualnie zawierające jeden lub więcej podstawników, takich jak atom fluorowca,

-OH, grupa alkoksylowa, alkiloksyalkiloksylowa, fluorowcoalkilowa, hydroksyalkoksylowa, acylowa, 5 2 5 acyloksylowa, heterocykliczna, arylowa lub heteroarylowa, z tym, że dodatkowo -OR⁵ i -NR²R⁵ mogą 5 2 5 oznaczać -OH i -NHR⁵. Na przykład w pewnych przypadkach każdy R² i R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grupy metylowej, etylowej, n-propylowej, propylowej, n-butylowej, 2-butylowej, t-butylowej, fenylowej lub heteroarylowej, przy czym każda z tych grup jest ewentualnie podstawiona przez jeden lub więcej podstawników powyżej wzmiankowanego typu lub przez inne podstawniki, jak tu opisano.

(aa) Związki typu (y) lub (z), w których QA oznacza -OVO-, -OVNH- lub -SVS-, przy czym V oznacza niższą grupę alifatyczną.

(ab) Związki typu (y) lub (z) zawierające ugrupowanie J, jak opisano w przypadku związków typu (v). Jedną z klas związków, które nie są objęte wynalazkiem, są koniugaty rapamycyny lub jej pochodnych, zawierające w pozycji 43, przy tlenie, podstawnik, który obejmuje grupę -P(O)(Me)(Z), w której Z oznacza immunogenny materiał nośnikowy, detektorowy materiał nośnikowy lub stałą matrycę lub ich sól, związany z P poprzez grupę karbonylową, -NH-, -S-, -O- lub pewne grupy alifatyczne, takie jak opisano w US 2001/0010920 A1. Dokument ten omawia koniugaty rapamycyny z takimi nośnikami lub matrycami, do stosowania przy wytwarzaniu i wykrywaniu przeciwciał, do pomiaru poziomu rapamycyny i do wyodrębniania białek wiążących rapamycynę, Jak podano w niniejszym opisie, immunogenny materiał nośnikowy może być wybrany spośród konwencjonalnych znanych immunogennych materiałów nośnikowych i stanowi zwykle białko lub polipeptyd, a w pewnych przypadkach mogą to być dostatecznie duże i immunogenne węglowodany, polisacharydy, lipopolisacharydy lub kwasy nukleinowe, przy czym immunogenne białka i polipeptydy mają ciężar cząsteczkowy 5000-10000000, korzystnie większy niż 15000, a zwłaszcza większy niż 40000. Przykłady obejmują albuminy, globuliny, enzymy, hemocyjaniny, gluteliny lub białka zawierające znaczące składniki niebiałkowe, np. glikoproteiny. Jako detektorowy materiał nośnikowy można stosować enzym, taki jak peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, Iucyferaza, reszta fluorescencyjna, taka jak fIuoresceina, czerwień teksańska lub rodamina, grupa chemiluminescencyjna i tym podobne. Jako materiał nośnikowy

PL 216 224 B1 dla stałej matrycy można stosować kuleczki żywicy, płytki ELISA, kuleczki szklane, takie jak zwykle stosowane w testach radioimmunologicznych, kuleczki z tworzywa sztucznego lub materiał dla stałej matrycy stosowany zwykle w testach paskowych (dipstick).

Opisane tu związki znajdują zastosowanie przy wytwarzaniu kompozycji nadających się do różnych wskazanych tu celów medycznych i innych.

Jednym z takich celów jest tłumienie odpowiedzi immunologicznej u osobnika przez podawanie takiemu osobnikowi immunosupresyjnej ilości (tj. traktowanie immunosupresyjne obejmujące okresowe podawanie dawki immunosupresyjnej) jednej ze wzmiankowanych powyżej kompozycji, przykładowo, traktowanie lub tłumienie u biorcy odrzucania przeszczepionych tkanek.

Ponadto, opisane tu związki znajdują zastosowanie w leczeniu reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (GvHD), tocznia, reumatoidalnego zapalenia stawów, cukrzycy, ciężkiego osłabienia mięśni, stwardnienia rozsianego, łuszczycy, zapalenia skóry, egzemy, łojotoku, zapalenia jelit, zapalenia płuc, zapalenia błony naczyniowej oka, białaczki/chłoniaka dorosłych z komórkami T, infekcji grzybiczych, nawrotu zwężenia naczyń związanego z nadmierną proliferacją, przeszczepu naczyniowego związanego z miażdżycą tętnic, schorzeń naczyń mózgowych, choroby tętnic wieńcowych, schorzeń mózgowonaczyniowych, stwardnienia tętnic, miażdżycy tętnic, niemiażdżycowego stwardnienia tętnic, lub uszkodzeń ścianek naczyń wskutek urazów komórkowych prowadzących do uwarunkowanych immunologicznie uszkodzeń naczyń, demencji wywołanej udarem lub wielozawałem;

jak również w leczeniu choroby tętnic wieńcowych, schorzeń mózgowonaczyniowych, stwardnienia tętnic, miażdżycy tętnic, niemiażdżycowego stwardnienia tętnic, uszkodzeń ścianek naczyń wskutek urazów komórkowych prowadzących do uwarunkowanych immunologicznie uszkodzeń naczyń, demencji wywołanej udarem lub wielozawałem u osobnika wymagającego takiego traktowania, przy czym leczonemu osobnikowi podaje się kompozycję zawierającą opisany tu związek sam lub w kombinacji z jednym lub więcej innymi środkami leczniczymi, jak podano w innym miejscu tego opisu, obejmującymi m.in. inhibitory ACE (takie jak chinapryl, perindopryl, ramipryl, kaptopryl, trandolapryl, fozynopryl, lizynopryl, moeksypryl i enalapryl); antagoniści receptora angiotensyny II (takie jak kandesartan, irbesartan, losartan, walsartan i telmisartan); pochodne kwasu fibrynowego (takie jak klofibrat i gemfibrozyl); inhibitory reduktazy HMG Co-A (takie jak ceriwastatyna, fluwastatyna, atorwastatyna, lowastatyna, prawastatyna lub simwastatyna); beta-adrenergiczne środki blokujące (takie jak sotalol, timolol, esmolol, karteolol, propranolol, betaksolol, penbutolol, nadolol, acebutolol, atenolol, metoprolol i bisoprolol); środki blokujące kanał wapniowy (takie jak nifedypina, werapamil, nikardypina, diltiazem, nimodypina, amlodypina, felodypina, nizoldypina i beprydyl); przeciwutleniacze, antykoagulanty (takie jak warfaryna, dalteparyna, heparyna, enoksaparyna i danaparoid); lub środki stosowane w terapii hormono-zastępczej, zawierające estrogeny (takie jak sprzężone estrogeny, etynylo-estradiol, 17-beta-estradiol, estradiol i estropipat). Dodatkowy środek lub środki stosowane w tym oraz innych tu opisanych przypadkach, można podawać przed lub po lub równocześnie z podawaniem w związku według wynalazku.

Ponadto, opisane tu związki, w tym związki według wynalazku, znajdują zastosowanie w leczeniu raka, u osobnika wymagającego takiego leczenia, przez podawanie takiemu osobnikowi skutecznej ilości kompozycji zawierającej związek według wynalazku. Różne raki, które można leczyć w ten sposób, są w innym miejscu tego opisu. Leczenie to można prowadzić w kombinacji z jedną lub więcej terapiami rakowymi, na przykład w skojarzeniu z podawaniem takiemu osobnikowi jednego lub więcej przeciwrakowego środka alkilującego lub dodatkowego; przeciwestrogenu; inhibitora kinazy (np. Src, BRC/Abl, kdr, aurora-2, kinaza 3 syntazy glikogenowej (GSK-3)); przeciwciał wobec receptora lub hormonu związanego z rakiem (np. EGFR, PDGFR, IGF-R i IL-2); lub rozpuszczalnych receptorów lub innych receptorów antagonistycznych wobec takiego receptora; inhibitora proteasomu lub innych inhibitorów NF-kB, lub również z radioterapią. Przykłady innych środków leczniczych wskazanych w innym miejscu tego opisu obejmują m.in. zyloprym, alemtuzmab, altretaminę, amifostynę, nastrozol, przeciwciała przeciwko prostatospecyficznym antygenom błonowym (jak MLN-591, MLN591RL i MLN2704), tritlenek arsenu, Avastin® (lub inne przeciwciała anty-VEGF), beksaroten, bleomycynę, busulfan, kapecytabinę, karboplatynę, Gliadel Wafer, celekoksyb, chlorambucyl, cisplatynę, żel cisplatyno-epinefrynowy, kladrybinę, cytarabinę liposomalną, daunorubicynę Iiposomalną, daunorubicynę, daunomycynę, deksrazoksan, docetaksel, doksorubicynę, roztwór B Elliotta, epirubicynę, estramustynę, fosforan etopozydu, etopozyd, eksemestan, fludarabinę, 5-FU, fulwestrant, gemcytabinę, gemtuzumabozogamicynę, octan gosereliny, hydroksymocznik, idarubicynę, idarubicynę, idamycynę, ifosfamid, mesylan imatynibu, irinotekan (lub inne inhibitory topoizomerazy, obejmujące przeciwciała,

PL 216 224 B1 takie jak MLN576 (XR11576)), letrozol, leukoworynę, leukoworyno-lewamisol, liposomalną daunorubicynę, melfalan, L-PAM, mesnę, metotreksat, metoksalen, mitomycynę C, mitoksantron, MLN518 lub MLN608 (lub inne inhibitory receptora kinazy tyrozynowej fit-3, PDFG-R lub c-kit), itoksantron, paklitaksel, Pegademase, pentostatynę, sodową pochodną porfimeru, Rituximab (RITUXAN®), talk, tamoksyfen, temozolamid, tenipozyd, VM-26, topotekan, toremifen, Trastuzumab (Herceptin®, lub inne przeciwciała anty-Her2), 2C4 (lub inne przeciwciała kolidujące z sygnalizacją mediowaną przez HER2), tretinoin, ATRA, walrubicynę, winorelbinę lub pamidronat, zoledronat lub inne bis-fosfoniany.

Można stosować stenty do uwalniania leku, obejmujące stenty naczyniowe zawierające opisany tu związek zdyspergowany w matrycy lub umieszczony w kanałach, zbiornikach lub innych pojemnikach na lub w tym stencie. Różne typy stentów i środków i materiałów do obciążania takich stentów lekiem są wymienione w niniejszym opisie i w cytowanych odnośnikach. Różne matryce, polimery i inne materiały są również wymienione w niniejszym opisie oraz w cytowanych odnośnikach. Przykładowo można wymienić następujące stenty: Angiomed (Bard), Cardiocoil (In-Stent Medtronic), CORINTHIAN (BSC), Radius (Scimed), Wallstent (Schneider), Act-one (ACT), Angiostent (angioynamics), be-Stent (In-Stent Medtronic), Biodiv-Ysio (Biocompatibles), Cordis, Cross-flex (Cordis), Crown (JJIS), Freedom (Global therapeutics), Gianturco-Roubin II (Cook), Jo-med, Jostent flex (Jomed), Microstent GFX (AVE), Multilink (Guidant-ACS), NIR (Medinol), NIR Royal (Medinol), NIRflex (Medinol), NIRSIDEflex (Medinol), Palmaz-Scatz (JJIS), STS (De Scheerder), Tensum (Biotronic), Wiktor-GX (Medtronic), Wiktor-I (Medtronic), X-Trode (Bard), Y-Flex (Devon), Tsunami (Terumo), Bx Velocity (J&J), SLK-View (Advanced Stent Technologies, Inc.) oraz stent Duraflex (Avantec). Jako stenty można stosować stenty powyżej wymienione lub również mogą to być inne przykłady dowolnych typów stentów wymienione w niniejszym opisie oraz w cytowanych odnośnikach, i mogą one zawierać inne materiały (np. polimery, które mogą ulegać albo nie degradacji lub erozji).

Można stosować kompozycje zawierające opisany tu związek oraz rozcieńczalnik odpowiedni do stosowania związku w stencie.

Opisano tu rodzinę nowych rapalogów, przy czym wymieniono wiele przykładowych typów i konkretnych przykładów takich związków. Związki te, będące analogami rapamycyny modyfikowanymi w stosunku do rapamycyny w pozycji 43 mogą być dalej derywatyzowane w stosunku do rapamycyny, np. w jednej lub więcej pozycjach spośród C7, C28, C13, C24, C30 i innych, z zastosowaniem chemicznych transformacji, takich jak opisane w US 6258823, WO 96/41865, WO 98/02441, WO 99/36553 i WO 01/14387 oraz w innych opisach patentowych i odnośnikach literaturowych cytowanych w niniejszym opisie lub w odnośnym dokumencie. Związki te m.in. obejmują związki, które wiążą się z ludzkim FKBP12 lub hamują działanie rotamazy, w zależności od dwóch, a zwłaszcza od jednej wielkości wyników uzyskanych z rapamycyną w konwencjonalnych testach na wiązanie FKBP lub aktywność rotamazy.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalna pochodna powyższych związków oznacza farmaceutycznie dopuszczalną sól, ester, karbaminian lub sól takiego estru lub karbaminianu tego związku, lub inny addukt lub pochodną, które to związki po podaniu pacjentowi są zdolne do dostarczania (bezpośrednio lub pośrednio) rapalogu zawierającego grupę JQA-, jak tu opisana, lub jego biologicznie czynnego metabolitu lub reszty. Farmaceutycznie dopuszczalne pochodne obejmują m.in. proIeki rapalogów. Prolek jest pochodną związku, zwykle o znacznie zmniejszonej aktywności farmakologicznej, który zawiera dodatkową grupę, która jest zdolna do odszczepienia in vivo, przy czym otrzymuje się macierzystą cząsteczkę, jako substancję farmakologicznie czynną. Przykładem proleku jest ester, który ulega rozszczepieniu in vivo, z wytworzeniem danego związku. Różne proleki rapamycyny i innych związków, oraz substancje i sposoby derywatyzacji macierzystych związków w celu uzyskania proleków, są znane i mogą być stosowane.

Opisane tu związki, w tym związki według wynalazku, można stosować w zasadniczo czystej postaci (w stosunku do produktów ubocznych, pozostałości reagentów i innych niepożądanych substancji), na przykład o czystości co najmniej 50%, korzystnie co najmniej 60%, zwłaszcza co najmniej

75%, w szczególności co najmniej 85%, szczególnie korzystnie co najmniej 95%, a zwłaszcza co najmniej 98%, przy czym wszystkie dane procentowe są obliczone na podstawie stosunku wagowo/wagowego. Zgodnie z wynalazkiem, związek zanieczyszczony lub związek w mniej czystej postaci można stosować do wytwarzania bardziej czystej postaci danego związku lub pokrewnego związku (na przykład odpowiedniej pochodnej) nadającej się do stosowania farmaceutycznego.

Opisane związki można stosować do multimeryzacji chimerycznych białek w komórkach (in vitro, ex vitro lub in vivo, tj. w organizmach magazynujących je) do różnych ważnych celów, jak opisane

PL 216 224 B1 szczegółowo dla rapamycyny i innych rapalogów w WO 96/41865, WO 99/36553 i WO 01/14387. Patrz również Rivera VM, Ye X, Courage NL, Sachar J., Cerasoli F., Wilson JM I Oilman M. (1999): Long-term regulated expression of growth hormone in mice following intramuscular gene transfer; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8657-8662, oraz Ye X, Rivera VM, Zoltick P., Cerasoli F. Jr, Schnell MA, Gao G-p, Hughes JV, Gilman M. i Wilson JM (1999): Regulated delivery of therapeutic proteins after in vivo somatic cell gene transfer, Science 283, 88-91. Substancje i sposoby, które można stosować do tego celu, są opisane w publikacji WO 01/14387 str. 18 do 24. Adaptując ujawnienie z WO 01/14387 można, przykładowo, zastąpić opisany tam 28-epi-rapalog rapalogiem opisanym w niniejszym opisie.

Opisane w niniejszym opisie związki o właściwościach przeciwgrzybiczych, obejmujące m.in. związki mające przy C7 inny podstawnik, zamiast grupy metoksylowej, nadają się do stosowania do zapobiegania i leczenia infekcji grzybiczych u organizmów żywych, zwłaszcza ssaków, w szczególności ludzi, korzystnie ludzi i zwierząt domowych (w tym zwierząt hodowlanych). Związki te można stosować na przykład do leczenia miejscowych infekcji grzybiczych, spowodowanych m.in. przez organ izmy z gatunku Candida (np. C. albicans). Trichophyton (np. Trichophyton mentagrophytes), Microsporum (np. Microsporum gypseum) lub Epidermophyton, lub w zakażeniach błony śluzowej spowodowanych przez Candida albicans (np. pleśniawki i kandydoza pochwy). Można je również stosować w leczeniu układowych zakażeń grzybiczych powodowanych na przykład przez Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Coccidioides, Paracoccidioides, Histoplasma lub Blastomyces spp. Można je również stosować do leczenia mycetomy wywoływanej przez grzyby właściwe, chromoblastomikozy i mukormikozy. Omówienie innych infekcji grzybiczych, w przypadku których można stosować opisane tu związki oraz podstawowe informacje dotyczące testów do porównawczej oceny tych związków, wytwarzania formulacji i aplikowania rapalogów w przypadku leczenia infekcji grzybiczych, można znaleźć w publikacji Holt i inni, opis patentowy USA nr 6258823 (opublikowany 10 lipca, 2001) oraz w cytowanych tam odnośnikach. Zaznacza się, że rapalogi przeciwgrzybicze mogą mieć zachowany podstawnik metoksylowy przy C7 lub mogą zawierać dowolny z różnych podstawników zastępujących metoksyl, obejmujących atom wodoru i podstawniki objętościowe lub nieobjętościowe. W opisie patentowym USA nr 6258823, opisano na przykład szereg zastępczych podstawników przy C7, które można włączyć do związków o wzorze I, zwłaszcza w przypadku zastosowań przeciwgrzybiczych lub do multimeryzacji.

Stwierdzono, że pochodne rapamycyny według wynalazku hamują proliferację komórek T, przy czym uzyskane wartości EC50 są porównywalne z wartościami dla rapamycyny. Dużą aktywność obserwuje się również w działaniu przeciwko ludzkim nowotworom w modelu heteroprzeszczepu nagiej myszy. W tych rapalogach zwykle zachowany jest podstawnik metoksylowy przy C7 lub zastąpiony wodorem lub innym podstawnikiem, który nie jest dużo bardziej objętościowy niż metoksyl, niepożądanie zmniejszając hamowanie proliferacji komórek T. Rapalogi te można stosować jako środki immunosupresyjne, przeciwproliferacyjne, przeciwnowotworowe i przeciwdziałające nawrotowi zwężenia, jak również do innych celów opisanych w niniejszym opisie lub w literaturze dotyczącej rapamycyny i analogów, takich jak CCI 779 i SDZ RAD (RAD 001), w literaturze naukowej i patentowej, której przykłady są tu podane. Związki według wynalazku tj. związki z niemodyfikowanym względem rapamycyny podstawnikiem C7, lub opisane tu związki zawierające zastępczy (tj. zamiast -OMe) podstawnik przy C7, które nie zmniejszają niepożądanie aktywności w teście na hamowanie komórek T, są szczególnie interesujące w przypadku takiego zastosowania.

W szczególności, niektóre opisane tu związki wykazują działanie immunomodulujące, co oznacza, że związki te są zdolne do wywoływania immunosupresji przez hamowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej lub proliferacji in vitro lub in vivo i/lub przez powodowanie statystycznie znaczącego obniżenia odpowiedzi zapalnej, jak określono w naukowo dopuszczalnych modelach komórek, tkanek lub organizmów żywych. Związki takie można aplikować w ilości leczniczo skutecznej z zastosowaniem odpowiedniego dawkowania w leczeniu m.in. stanów chorobowych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, liszaj rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane, ostre odrzucenie/przeszczepu, ciężka miastenia, twardzizna uogólniona, stwardnienie guzowate, szpiczak mnogi, atopowe zapalenie skóry, hiperimmunoglobulina E, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby przy ujemnym antygenie zapalenia wątroby B, zapalenie tarczycy Hashimoto, rodzi n na gorączka śródziemnomorska, choroba Grave'a, niedokrwistość hemolityczna autoimmunizacyjna, zastoinowa marskość wątroby, zapalna choroba jelit oraz insulinozależna cukrzyca.

PL 216 224 B1

Opisane tu związki, w tym związki według wynalazku, wykazują również działanie przeciwko rakom pierwotnym i/lub przerzutowym. Można je stosować do zmniejszania wielkości guza, hamowania wzrostu guza lub przerzutów, do leczenia różnych białaczek i/lub do przedłużania czasu przeżycia zwierząt lub pacjentów z takimi chorobami.

Tak więc opisane tu związki można stosować w terapii medycznej, zwłaszcza jako środki przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe, immunosupresyjne lub środki przeciwdziałające nawrotowi zwężenia naczyń, lub jako środki przeciw innym omówionym tu chorobom i stanom chorobowym.

Związki te można stosować do leczenia ludzi i zwierząt cierpiących na wskazane choroby lub stany chorobowe, podając im skuteczną ilość rapalogu, który może mieć postać kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek, stanowiący substancję aktywną, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, jak również może być zawarty w urządzeniu medycznym, takim jak zawierające lek stenty.

Opisane tu związki można poddawać w postaci formulacji, jak opisane poniżej (lub stosując formulacje na bazie formulacji opisanych dla rapamycyny lub pochodnych rapamycyny, jak CCI-779 lub RAD001), które można następnie podawać wymagającym tego pacjentom, stosując skuteczne leczniczo ilości, w przypadku leczenia różnych opisanych tu chorób. Kompozycje takie można podawać w różny sposób nadający się do kierowania substancji aktywnej do krwiobiegu lub miejsca działania, przy czym stosuje się podawanie doustne, pozajelitowe (takie jak iniekcje dożylne, śródotrzewnowe i podskórne, jak również iniekcje do stawów lub innych tkanek), poprzez stenty lub inne implanty, doodbytniczo, donosowo, dopochwowo i przezskórnie. Dla celów wynalazku należy rozumieć, że podawanie przezskórne obejmuje wszelkiego rodzaju aplikowanie przez powierzchnię ciała i wewnętrzną wyściółkę dróg organizmu, w tym tkanki nabłonka i śluzówki. Takie podawanie można prowadzić, stosując opisane tu związki lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole lub proleki w lotionach, kremach, piankach, plastrach, zawiesinach, roztworach i czopkach (doodbytniczych i dopochwowych).

Do podawania pozajelitowego lub śródotrzewnego można wytwarzać roztwory lub zawiesiny tych substancji aktywnych lub ich farmakologicznie dopuszczalnych soli w wodzie, korzystnie w mieszaninie ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak hydroksypropyloceluloza, lub również można adaptować formulacje odpowiednie dla rapamycyny, CCI779 lub RAD001. Można również wytwarzać dyspersje w glicerynie, ciekłych glikolach polietylenowych i ich mieszaninach w oleju. W typowych warunkach magazynowania i stosowania preparaty te mogą zawierać środki konserwujące dla zapobiegania wzrostowi mikroorganizmów.

Kompozycje zawierające związek według wynalazku, które nadają się do iniekcji, obejmują sterylne wodne roztwory lub dyspersje i sterylne proszki, do wytwarzania sterylnych roztworów lub dyspersji do wstrzykiwania przygotowywanych bezpośrednio przed użyciem. We wszystkich przypadkach kompozycja do iniekcji powinna być sterylna i powinna być dostatecznie płynna, aby mogła przechodzić przez strzykawkę. Kompozycje te powinny być trwałe w warunkach wytwarzania i magazynowania i powinny być korzystnie chronione przed zanieczyszczeniem mikroorganizmami, takimi jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub medium dyspersyjne zawierające na przykład wodę, etanol, poliole (np. glicerynę, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy), odpowiednie mieszaniny tych związków oraz oleje roślinne. Formulacje pozajelitowe, które można adaptować do stosowania w odniesieniu do opisanych tu rapalogów, są ujawnione w opisach patentowych USA nr 5530006, 5516770 i 5616588.

Formulacje, drogi podawania i dawkowanie mogą być wybrane spośród lub na podstawie stosowanych dla rapamycyny i innych pochodnych rapamycyny stosowanych do tych samych lub analogicznych wskazań. W przypadku leczenia nowotworów korzystnie należy najpierw określić, czy w nowotworze pacjenta występuje częściowy lub całkowity niedobór funkcji PTEN (lub procesów zachodzących za pośrednictwem PTEN), a następnie należy selektywnie leczyć pacjentów z nowotworami z niedoborem PTEN (patrz np. Neshat i inni, PNAS, poniżej). Bardziej ogólnie, korzystnym podejściem może być zidentyfikowanie za pomocą analizy genotypu i/lub hodowli in vitro i biopsji próbek nowotworowych tych pacjentów z nowotworami, u których szlak sygnałowy kinaza 3-fosfatydyloinozytolu/Akt-mTOR jest szczególnie ważny dla wzrostu komórek, a następnie selektywne leczenie tych pacjentów przy użyciu rapalogów. Nieograniczające przykłady takich raków, związanych z nieprawidłowościami w szlaku kinazy 3-fosfatydyloinozytolu/Akt-mTOR, obejmują glejaka, chłoniaka oraz nowotwory płuc, pęcherza, jajnika, śluzówki macicy, gruczołu krokowego lub szyjki macicy, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi receptorów czynnika wzrostowego (np. EGFR, PDGFR, IGF-R i IL-2); nowotwory jajnika, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi kinazy PI3;

PL 216 224 B1 czerniaka oraz nowotwory sutka, gruczołu krokowego lub endometrium, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi PTEN; raka sutka, żołądka, jajnika, trzustki i gruczołu krokowego, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi Akt; chłoniaka, raka sutka lub pęcherza oraz raka głowy i szyi, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi elF-4E; chłoniaka komórek korowych, raka sutka i raka głowy i szyi, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi cykliny D, oraz czerniaka rodzinnego i raka trzustki, które są związane z nieprawidłowościami dotyczącymi P16.

Dla wszystkich wymienionych tu wskazań może być korzystne, w niektórych przypadkach, leczenie pacjenta za pomocą kombinacji opisanego związku i jednego lub więcej innych środków nadających się do leczenia danej choroby. Kombinację taką można podawać razem lub oddzielnie (np. seryjnie). Na przykład pacjent leczony związkiem przeciwnowotworowym według wynalazku może (przed, w czasie lub po takim leczeniu) być również leczony przy użyciu jednego lub więcej innych środków przeciwrakowych, takich jak cisplatyna; antyestrogeny (np. raloksyfendroloksyfen, idoksyfina, nafoksydyna, toremifen, TAT-59, lewomeloksyfen, LY-353381, CP-3361656, MDL-103323, EM-800 i ICI-182, 780; patrz np. WO 02/13802, który może być adaptowany do niniejszego wynalazku); inhibitor kinazy, taki jak Src, BRC/Abl, kdr, aurora-2, kinaza syntazy glikogenu-3 (GSK-3), receptor czynnika wzrostu naskórka (EGF-R), lub receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF-R), na przykład obejmujący inhibitory, takie jak Gleevec, Iressa, CP-358774 (Tarceva), ZD-1839, SU-5416 lub NSC-649890; przeciwciała (takie jak Herceptin) wobec receptora lub hormonu (np. VEGF) stosowane w przypadku raka, lub rozpuszczalny receptor lub inne receptory antagonistyczne wobec takiego receptora, inhibitor proteasomu, taki jak Velcade; inhibitor IKK lub inne inhibitory NF-kB; lub również radioterapia. Każdy składnik kombinacji można podawać tak, jak byłby podawany samodzielnie, chociaż w pewnych przypadkach, w świetle łącznego działania różnych leków, możliwa lub korzystna jest zmniejszona dawka jednego lub więcej składników.

Opisane tu związki można również stosować do zapobiegania nawrotowi zwężenia naczyń lub w przypadku innych powikłań występujących w związku z wprowadzaniem do organizmu pacjenta przeszczepu, stentu lub innych urządzeń, patrz np. Sousa i inni, jak poniżej, oraz Marx i Marks, 2001, Circulation 104:852-855. I tak opisane rapalogi można stosować w przypadku stentów, przeszczepów, sztucznych przetok lub innych urządzeń lub przyrządów (jak przewody lub zakończenia przewodów rozruszników serca, przewody lub zakończenia przewodów defibrylatorów serca, zastawki serca, rozruszniki, urządzenia ortopedyczne itp.), w celu wprowadzenia urządzeń eluujących lek do implantowania do organizmu wymagającego tego pacjenta. Stenty i podobne urządzenia wprowadza się zwykle do naczyń pacjenta (np. do żył, tętnic, aorty itp., w tym do tętnic wieńcowych i obwodowych), lecz można je stosować do wielu różnych narządów, gruczołów, przewodów itp.

Stent jest rozszerzalną rurką, zwykle rozszerzalną rurką z drucianej siatki, dostatecznie małą, aby mogła być wprowadzona do naczynia krwionośnego. Stosuje się je na ogół w celu zapobieżenia zamknięciu naczynia po zabiegu, takim jak plastyka naczyń. Dostępne dla lekarzy są różnorodne wzory i typy stentów, w rosnącej ilości, w tym stenty wykonane z substancji, takich jak nitynol (stop niklu i tytanu), stop kobaltu na rdzeniu platynowym, platyna-iryd, stal nierdzewna, stal nierdzewna pokryta złotem, węglik krzemu, tantal, tantal powlekany oraz inne metale lub niemetale, o różnych wzorach, takich jak plecionka z drutu, zwój spiralny, rurka z nacięciami (wzór zygzakowaty, siateczka o wzorze serpentyny z ruchomymi węzłami, nacięcia sinusoidalne, siateczka komórkowa, spiralne połączenia przegubowe itp.), siateczka druciana, pojedynczy sinusoidalny zwój druciany, pojedynczy zwój helikalny, wzór typu szkieletu rybiego, zwój giętki, połączone druciki zygzakowate, urządzenia wielopierścieniowe, wielokomórkowe itp. Jednym z częstych powikłań w przypadku stosowania stentów jest ponowne zamknięcie („restenoza) naczynia po wprowadzeniu stentu. Uważa się, że jedną z przyczyn restenozy jest szybka proliferacja komórek naczyń krwionośnych w rejonie stentu (rozrost wewnątrznaczyniowy), blokująca ostatecznie naczynie. Jednym ze sposobów zmniejszenia występowania restenozy jest stosowanie stentów uwalniających rapamycynę. W literaturze odnotowano również inne korzyści ze stentów uwalniających rapamycynę.

W celu uzyskania stentu (lub innego urządzenia do implantowania) zmniejszającego prawdopodobieństwo restenozy, opisany tu związek można umieścić na lub w takim urządzeniu, zamiast rapamycyny lub innego leku tak, że ten związek jest uwalniany („eluuje) z urządzenia po implantowaniu u odbiorcy. Stenty eluujące lek wytwarza się na ogół przez powlekanie co najmniej części stentu nośnikiem (zwykle polimerem) zawierającym lek lub przez napełnianie jednej lub więcej komór lub kanałów w stencie, lub na jego powierzchni, lekiem lub kompozycją zawierającą lek. Można stosować jedną lub więcej niż jedną warstwę powłoki, przy czym niektóre z nich mogą nie zawierać leku. Czasem

PL 216 224 B1 stosuje się dodatkową powłokę na szczycie zawierającej lek warstwy lub zbiornika, przy czym ta dodatkowa powłoka umożliwia stopniowe uwalnianie leku do tkanki odbiorcy.

Istnieją różne dostępne dla lekarzy, materiały i sposoby dostarczania leków do stentów i stosowania takich stentów i można je dostosowywać do opisanych tu związków. Na przykład, sposoby i materiały odpowiednie do uwalniania leków z implantowanych i innych urządzeń są opisane w opisach patentowych USA o numerach 6471980, 6096070, 5824049, 5624411, 5609629, 5569463, 5447724 i 5464650 oraz WO 02066092. Stosowanie stentów w celu dostarczania leków do układu naczyniowego jest opisane w publikacji PCT nr WO 01/01957 oraz w opisach patentowych USA o numerach 6099561, 6071305, 6063101, 5997468, 5980551, 5980566, 5972027, 5968092, 5951586, 5893840, 5891108, 5851231, 5843172, 5837008, 5769883, 5735811, 5700286, 5679400, 5649977, 5637113, 5591227, 5551954, 5545208, 5500013, 5464450, 5419760, 5411550, 5342348, 5286254 i 5163952. Biodegradowalne materiały opisane są w opisach patentowych USA o numerach 6051276, 5879808, 5876452, 5656297, 5543158, 5484584, 517907, 4894231, 4897268, 4883666, 4832686 i 3976071. Zastosowanie hydrocyklosiloksanu, jako bariery limitującej dawkę, jest opisane w opisie patentowym USA nr 5463010. Sposoby powlekania stentów są opisane w opisie patentowym USA nr 5356433. Powłoki do uzyskiwania biokompatybilności implantowanych urządzeń są opisane w opisach patentowych USA o numerach 5463010, 5112457 i 5067491. Urządzenia oparte na energii opisane są w opisach patentowych USA o numerach 6031375, 5928145, 5735811, 5728062, 5725494, 5409000, 5368557, 5000185 i 4936281. Procesy magnetyczne, z których niektóre są stosowane w systemach dostarczania leków, są opisane w opisach patentowych USA o numerach 5427767, 5225282, 5206159, 5069216, 4904479, 4871716, 4501726, 43579259, 4345588 i 4335094. Rozszerzalne urządzenia medyczne zawierające jeden lub więcej leków w jednym lub większej liczbie otworów na lub w urządzeniu, z zastosowaniem różnych ewentualnych warstw, kompozycji barierowych i konfiguracji są opisane w opublikowanym zgłoszeniu patentowym USA nr 2002/0082680 na rzecz Shanley i in. Patrz również np. opis patentowy USA nr 6471979, w którym opisano sposoby i materiały do obciążania stentów, które można również stosować w przypadku opisanych tu związków. Przykłady powłok obejmują fosforylocholinę, poliuretany, poliuretany segmentowe, kwas poli-L-mlekowy, estry celulozy, estry glikolu polietylenowego i polifosforanów, jak również występujące w naturze podłoża lub nośniki, takie jak kolageny, lamininy, heparyny, fibryny i inne substancje występujące w przyrodzie absorbowane na celulozie. Stosowanie takich powłok jest korzystne, ponieważ umożliwia powolne uwalnianie związku z urządzenia. Wydłuża to czas, w którym zaatakowana część organizmu jest poddana skutecznemu działaniu związków. Sposób, w którym powłoki te ulegają interakcji z materiałem urządzenia, jak również struktura powłoki, stwarzają barierę dyfuzyjną kontrolującą uwalnianie tych związków. I tak matryca lub powłoka, za pomocą których związki są wprowadzane do stentu lub urządzenia dostarczającego, może kontrolować powolne lub szybkie dostarczanie związku.

W innych rozwiązaniach można również stosować powłoki, takie jak powłoka oparta na fosforylocholinie, jak polimer (LO) PC Biocompatibles'. Powłoki takie zawierają składnik hydrofobowy, który wspomaga początkową adhezję i tworzenie filmu przez polimer na podłożu stentu ze stali nierdzewnej, podczas gdy inne grupy umożliwiają sieciowanie pomiędzy polimerem a powierzchnią stentu, tworząc trwałe zakotwiczenie. Powłoka przylega wówczas ściśle do stentu i może przetrzymać bez uszkodzenia balonikowanie. Powłoka może absorbować różne cząsteczki o różnej wielkości i właśc iwościach fizycznych do powłoki z PC i uwalniać je w sposób kontrolowany. Powłoka PC może mieć grubość ~0,1 ąm, choć można również stosować powłoki grubsze. Stent powlekany matrycą LO można zanurzać w roztworze związku w rozpuszczalniku organicznym na okres kilku minut. Poziom obciążenia można kontrolować za pomocą stężenia roztworu związku. Po usunięciu z roztworu powłokę suszy się krótko, po czym jest gotowa do użycia. Patrz np. opisy WO 01/00109, 01/01957, 01/52915, 02/55121 i 02/55122.

Zastosowanie opisanych tu rapalogów, w połączeniu ze stentem, można uzyskać np. przez wykorzystanie sposobów i materiałów stosowanych do dostarczania innych leków, zwłaszcza rapamycyny, z zastosowaniem takich urządzeń, np. jak opisano w poniżej podanych dokumentach, jak również w opisach patentowych o numerach US 5516781, 6153252, 5665728, 5646160, 5563146 i 5516781 oraz w opublikowanych międzynarodowych zgłoszeniach patentowych o numerach WO 01/01957, 01/49338, 01/87263, 01/87342, 01/87372, 01/87373, 01/87374, 01/87375 i 01/87376. Rapalogi te są szeroko kompatybilne z różnymi wzorami stentów oraz sposobami i materiałami do powlekania, osadzania, powlekania lub innego obciążania ich lekiem. Po obciążeniu urządzenia medycznego rapalogiem, urządzenie to wprowadzane jest do naczynia krwionośnego lub innego światła przewodu u od30

PL 216 224 B1 biorcy takiego urządzenia, obciążonego takim rapalogiem. W praktyce dobór materiałów (np. rozpuszczalników, polimerów, warstw barierowych, matryc itp.) oraz precyzyjnych sposobów postępowania można optymalizować w zależności od wyboru związku, stosując rutynowe testowanie. Innymi słowy, pożądany i optymalny wybór wzoru stentu lub kompozycji, rozpuszczalników, ko-rozpuszczalników, polimerów, kopolimerów, powłok, barier, procesów obciążania lekiem, zakresu stężeń lub czasu lub temperatury itp. staje się jasny w danym przypadku, przy zastosowaniu rutynowego postępowania.

Dalsze omawianie zastosowań farmaceutycznych, formulacji, dawkowania i podawania jest przedstawione poniżej.

W niniejszym opisie, o ile nie podano inaczej, stosuje się następujące informacje i definicje. Dodatkowo, o ile nie podano inaczej, wszelkie grupy funkcyjne są wybrane niezależnie, przy czym w pewnych przypadkach stosuje się odpowiednie oznakowanie w celu wskazania, czy dane podstawniki mają to samo czy różne znaczenie (np. R i R'). Numerowanie atomów we wzorach chemicznych, podanych w niniejszym opisie, odnosi się do układu numerowania wskazanego we wzorze I. Wskazuje się tu również na strony 15-18 opisu WO 01/14387 zawierające dodatkowe definicje i informacje uzupełniające następujące dane.

Stosowane tu określenie „alifatyczny” oznacza nasycone i nienasycone (lecz niearomatyczne), proste (tj. nierozgałęzione), rozgałęzione, cykliczne lub policykliczne niearomatyczne grupy węglowodorowe, które są ewentualnie podstawione przez jedną lub więcej grup funkcyjnych. O ile nie podano inaczej, grupy alkilowe, inne alifatyczne, alkoksylowe i acylowe korzystnie zawierają 1-8, zwłaszcza

1-6 sąsiadujących alifatycznych atomów węgla. Przykłady takich grup alifatycznych obejmują grupę metylową, etylową, n-propylową, izopropylową, cyklopropylową, -CH2-cyklopropylową, allilową, n-butylową, s-butylową, izobutylową, t-butylową, cyklobutylową, -CH2-cyklobutylową, n-pentylową, s-pentylową, izopentylową, t-pentylową, cyklopentylową, -CH2-cyklopentylową, n-heksylową, s-heksylową, cykloheksylową, -CH2-cykloheksylową i tym podobne, które to grupy mogą z kolei zawierać jeden lub więcej podstawników.

A zatem, określenie „alifatyczny obejmuje grupy alkilowe, alkenylowe, alkinylowe, cykloalkilowe, cykloalkenylowe i cykloalkinylowe.

Stosowane tu określenie „alkil oznacza proste, rozgałęzione i cykliczne grupy alkilowe. To samo dotyczy pozostałych określeń, takich jak „alkenyl, „alkinyl i tym podobne. Ponadto stosowane tu określenia „alkil, „alkenyl, „alkinyl i tym podobne obejmują zarówno grupy podstawione jak i nie-podstawione.

Określenie „alkil obejmuje grupy zawierające na ogół 1-8, korzystnie 1-6 atomów węgla. Na przykład „alkil może oznaczać grupę metylową, etylową, n-propylową, izopropylową, cyklopropylową, butylową, izobutylową, s-butylową, t-butylową, cyklobutylową, pentylową, izopentylową, t-pentylową, cyklopentylową, heksylową, izoheksylową, cykloheksylową i tym podobne. Odpowiednie podstawione grupy alkilowe obejmują, ale nie wyłącznie, grupę fluorometylową, difluorometylową, trifluorometylową,

2-fluoroetylową, 3-fluoropropylową, hydroksymetylową, 2-hydroksyetylową, 3-hydroksypropylową, benzylową, podstawioną benzylową i tym podobne.

Określenie „alkenyl dotyczy grup, które zwykle zawierają 2-8, korzystnie 2-6 atomów węgla. Na przykład „alkenyl może obejmować grupę prop-2-enylową, but-2-enylową, but-3-enylową, 2-metyloprop-2-enylową, heks-2-enylową, heks-5-enylową, 2,3-dimetylobut-2-enylową i tym podobne. Określenie „alkinyl, które również dotyczy grup zawierających 2-8, korzystnie 2-6 atomów węgla, obejmuje, lecz nie wyłącznie, grupę prop-2-ynylową, but-2-ynylową, but-3-ynylową, pent-2-ynylową,

3-metylopent-4-ynylową, heks-2-ynylową, heks-5-ynylową i tym podobne.

Stosowane tu określenie „cykloalkil obejmuje zwłaszcza grupy o 3-7, korzystnie 3-10 atomach węgla. Odpowiednie grupy cykloalkilowe obejmują, lecz nie wyłącznie, grupę cyklopropylową, cyklobutylową, cyklopentylową, cykloheksylową, cykloheptylową i tym podobne, które to grupy tak jak w przypadku innych grup alifatycznych lub heteroalifatycznych lub heterocyklicznych mogą być ewentualnie podstawione.

Stosowane tu określenie „heteroalifatyczny oznacza grupy alifatyczne zawierające jeden lub więcej atomów tlenu, siarki, azotu, fosforu lub krzemu, np. zamiast atomów węgla. Grupy heteroalifatyczne mogą być rozgałęzione, nierozgałęzione lub cykliczne i obejmują grupy heterocykliczne, takie jak grupa morfolinowa, pirolidynylowa itp.

Stosowane tu określenia „heterocykl, „heterocyklil lub „heterocykliczny dotyczą niearomatycznych 5-15-członowych, korzystnie 5-10-członowych układów pierścieniowych, w których 1 lub więcej pierścieniowych atomów węgla, korzystnie 1-4, jest zastąpionych przez heteroatom, taki jak N,

PL 216 224 B1

O lub S. Nieograniczające przykłady takich pierścieni heterocyklicznych obejmują 3-1H-benzimidazol-2-on, (1-podstawiony)-2-oksobenzimidazol-3-il, 2-tetrahydrofuranyl, 3-tetrahyrofuranyl, 2-tetrahydrotiofenyl, 3-tetrahydrotiofenyl, 2-morfolinyl, 3-morfolinyl, 4-morfolinyl, 2-tiomorfolinyl, 3-tiomorfolinyl,

4- tiomorfolinyl, 1-pirolidynyl, 2-pirolidynyl, 3-pirolidynyl, 1-piperazynyl, 2-piperazynyl, 1-piperidynyl,

2- piperidynyl, 3-piperidynyl, 4-piperidynyl, 4-tiazolidynyl, diazolonyl, N-podstawiony diazolonyl, 1-ftalimidynyl, benzoksanyl, benzopirolidynyl, benzopiperydynyl, benzoksolanyl, benzotiolanyl i benzotianyl. Stosowany tu termin „heterocyklil lub „heterocykliczny oznacza również grupę, w której niearomatyczny pierścień zawierający heteroatom jest skondensowany z jednym lub więcej aromatycznym lub niearomatycznym pierścieniem, tak jak w grupie indolinylowej, chromanylowej, fenantrydynylowej lub tetrahydrochinolinylowej, gdzie rodnik lub punkt przyłączenia występuje przy niearomatycznym pierścieniu zawierającym heteroatom. Określenia „heterocykl, „heterocyklil lub „heterocykliczny, nasycone lub częściowo nienasycone. Dotyczą również pierścieni, które są ewentualnie podstawione.

Określenie „aryl stosowane samo lub jako część większego ugrupowania, jak w grupie „aralkilowej, „aralkoksylowej lub „aryloksyalkilowej obejmuje 5-14-członowe aromatyczne grupy pierścieniowe, takie jak fenyl, 1-naftyl, 2-naftyl, 1-antracyl i 2-antracyl. Określenie „aryl dotyczy również pierścieni ewentualnie podstawionych. Termin „aryl można stosować zamiennie z określeniem „pierścień arylowy. „Aryl obejmuje również skondensowane policykliczne aromatyczne układy pierścieniowe, w których pierścień aromatyczny jest skondensowany z jednym lub większą liczbą pierścieni. Nieograniczające przykłady arylowych grup pierścieniowych obejmują fenyl, fIuorowcofenyl, alkoksyfenyl, dialkoksyfenyl, trialkoksyfenyl, alkilenodioksyfenyl, naftyl, fenantryl, antryl, fenantro i tym podobne, jak również 1-naftyl, 2-naftyl, 1-antracyl i 2-antracyl. Stosowane tu określenie „aryl obejmuje również grupę, w której pierścień aromatyczny jest skondensowany z jednym lub więcej pierścieniami niearomatycznymi, taką jak indanyl, fenantrydynyl lub tetrahydronaftyl, gdzie rodnik lub punkt przyłączenia występuje przy pierścieniu aromatycznym.

Stosowane tu określenie „heteroaryl oznacza trwałe heterocykliczne i poliheterocykliczne grupy aromatyczne zawierające 3-14, zwykle 5-14 atomów węgla, które to grupy mogą być podstawione lub niepodstawione i mogą zawierać jeden lub więcej pierścieni. Podstawnikami są podane powyżej podstawniki. Przykładami typowych pierścieni heteroarylowych są 5-członowe monocykliczne grupy pierścieniowe, takie jak tienyl, pirolil, imidazolil, pirazolil, furyl, izotiazolil, furazanyl, izoksazolil, tiazolil i tym podobne; 6-członowe grupy monocykliczne, takie jak pirydyl, pirazynyl, pirymidynyl, pirydazynyl, triazynyl i tym podobne; oraz policykliczne heterocykliczne grupy pierścieniowe, takie jak benzo[b]tienyl, nafto[2,3-b]tienyl, tiantrenyl, izobenzofuranyl, chromenyl, ksantenyl, fenoksatienyl, indolizynyl, izoindolil, indolil, indazolil, purynyl, izochinolil, chinolil, ftalazynyl, naftyrydynyl, chinoksalinyl, chinazolinyl, benzotiazol, benzimidazol, tetrahydrochinolina, cynnolinyl, pterydynyl, karbazolil, beta-karbolinyl, fenantrydynyl, akrydynyl, perimidynyl, fenantrolinyl, fenazynyl, izotiazolil, fenotiazynyl, fenoksazynyl i tym podobne (patrz np. Katritzky, Handbook of Heterocyclic Chemistry). Dalsze konkretne przykłady pierścieni heteroarylowych obejmują 2-furanyl, 3-furanyl, N-imidazolil, 2-imidazolil, 4-imidazolil,

5- imidazolil, 3-izoksazolil, 4-izoksazolil, 5-izoksazolil, 2-oksadiazolil, 5-oksadiazolil, 2-oksazolil, 4-oksazolil, 5-oksazolil, 1-pirolil, 2-pirolil, 3-pirolil, 2-pirydyl, 3-pirydyl, 4-pirydyl, 2-pirymidyl, 4-pirymidyl, 5-pirymidyl, 3-pirydazynyl, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5-tiazolil, 5-tetrazolil, 2-triazolil, 5-triazolil, 2-tienyl,

3- tienyl, karbazolil, benzimidazolil, benzotienyl, benzofuranyl, indolil, chinolinyl, benzotriazolil, benzotiazolil, benzoksazolil, benzimidazolil, izochinolinyl, indolil, izoindolil, akrydynyl lub benzoizoksazolil. Grupy heteroarylowe obejmują ponadto grupy, w których pierścień heteroaromatyczny jest skondensowany z jednym lub większą liczbą pierścieni aromatycznych lub niearomatycznych, gdzie rodnik lub punkt przyłączenia występuje przy pierścieniu heteroaromatycznym. Przykłady obejmują tetrahydrochinolinę, tetrahydroizochinolinę i pirydo[3,4-d]pirymidynyl. Termin „heteroaryl obejmuje również pierścienie ewentualnie podstawione. Określenie „heteroaryl można stosować zamiennie z określeniem „pierścień heteroarylowy lub z określeniem „heteroaromatyczny.

Grupa arylowa (obejmująca również część arylową grupy aralkilowej, aralkoksylowej lub aryloksyalkilowej i tym podobnych) lub grupa heteroarylowa (obejmująca również część heteroarylową grupy heteroaralkilowej lub heteroaryloalkoksyIowej i tym podobnych) może zawierać jeden lub więcej podstawników. Przykłady odpowiednich podstawników przy nienasyconym atomie węgla grupy arylowej lub heteroarylowej obejmują atom fluorowca, -YR² (tj. włącznie z -R², -OR², -SR² i -NR²R⁵), -Y-C(=O)R², -Y-C(=O)OR², -Y-C(=O)NR²R⁵, -Y-C(=NR^2')- NR²R⁵, -COCOR², -COMCOR²), J, -CN, -S(=O)R², -SO2R², -SO2NR²R⁵, -NO2, -NR⁵SO2R² i -NR⁵SO2NR²R⁵. Podstawniki, w których Y oznacza

PL 216 224 B1 grupę NR², obejmują m.in. -NR²C(=O)R⁵, -NR²C(=O)NR⁵, -NR²C(=O)OR⁵ i -NR²C(=NH)NR⁵. Należy

5 zaznaczyć, że podstawniki R² i R⁵ mogą być podstawione lub niepodstawione (np. nieograniczające ₅ przykłady grup R⁵ obejmują grupy alkilofluorowcowe, takie jak grupa chlorometylowa lub trichlorometylowa, grupy alkoksyalkilowe, takie jak grupa metoksyetylowa, grupy mono-, di- i tri-alkoksyfenylowe, metylenodioksyfenylowe lub etylenodioksyfenylowe, grupy fIuorowcofenylowe i alkiloaminowe). Dalsze przykłady obejmują grupę 1,2-metylenodioksy, 1,2-etylenodioksy, zabezpieczoną grupę OH (taką jak grupa acyloksylowa), grupę fenylową, podstawioną grupę fenylową, -O-fenylową, -O-(podstawioną)-fenylową, benzylową, podstawioną benzylową, -O-fenyloetylową (tj. -OCH2CH2C6H5), -O-(podstawioną)-fenylo2 2 2 2 etylową, -C(O)CH2C(O)R², -CO2R², -C(=O)R² (tj. acylową, gdy R² oznacza grupę alifatyczną, aroilową, 2 2 2 5 gdy R² oznacza grupę arylową i heteroaroilową, gdy R² oznacza grupę heteroarylową), -C(=O)NR²R⁵, -OC(=O)N R²R⁵, -C(=NH)NR²R⁵ i -OC(=NH)NR²R⁵. Dalsze przykłady podstawników obejmują grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, aminokarbonylową, atom fluorowca, grupę alkilową, alkiloaminokarbonylową, dialkiloaminokarbonylową, alkiloaminokarbonyloksylową, dialkiloaminokarbonyloksylową, alkoksylową, nitrową, cyjanową, karboksylową, alkoksykarbonylową, alkilokarbonylową, hydroksylową, fluorowcoalkoksylową i fluorowcoalkilową.

Grupy alifatyczne, heteroalifatyczne lub niearomatyczne heterocykliczne również mogą zawierać jeden lub więcej podstawników. Przykłady odpowiednich podstawników przy tych grupach obejmują grupy wymienione poniżej dla atomów węgla grup arylowych lub heteroarylowych i dodatkowo

2 5 2 obejmują następujące podstawniki dla nasyconego atomu węgla: =O, =S, =NR², =NNR²R⁵, =NNHC(O)R², 22 =NNHCO2R² lub =NNHSO2R². Przykłady podstawników przy grupach alifatycznych, heteroalifatycznych lub heterocyklicznych obejmują grupy aminowe, alkiloaminowe, dialkiloaminowe, aminokarbonylowe, atom fluorowca, grupy alkilowe, alkiloaminokarbonylowe, dialkiloaminokarbonylowe, aIkiloaminokarbonyloksylowe, diaIkiloaminokarbonyloksylowe, alkosylowe, nitrowe, cyjanowe, karboksylowe, alkoksykarbonylowe, alkilokarbonylowe, hydroksylowe, fIuorowcoalkoksylowe lub fIuorowcoalkilowe.

Przykładowe podstawniki przy atomie azotu w pierścieniu aromatycznym lub niearomatycznym heterocyklicznym obejmują -R², '-NR²R⁵, -C(=O)R², -C(=O)OR², -C(=O)NR²R⁵, -C(=NR^2')NR²R⁵, COCOR², ^-COMCOR²), -CN, -NR⁵SO2R² i -NR⁵SO2NR²R⁵.

Przykładowe podstawniki przy grupie alifatycznej lub pierścieniu fenylowym obejmują grupy aminowe, alkiloaminowe, dialkiloaminowe, aminokarbonylowe, atomy fluorowca, grupy alkilowe, alkiloaminokarbonylowe, dialkiloaminokarbonylowe, alkiloaminokarbonyloksylowe, dialkiloaminokarbonyloksylowe, alkoksylowe, nitrowe, cyjanowe, karboksylowe, alkoksykarbonylowe, alkilokarbonylowe, hydroksylowe, fIuorowcoalkoksylowe lub fIuorowcoalkilowe.

Kombinacja podstawników lub zmiennych jest dopuszczalna tylko wtedy, gdy w wyniku tej kombinacji uzyskuje się związek trwały i chemicznie możliwy do otrzymania. Związek jest trwały lub chemicznie możliwy do otrzymania wtedy, jeżeli nie zmienia się zasadniczo, po umieszczeniu w temperaturze 40°C lub niższej, w nieobecności wilgoci lub innych chemicznie reaktywnych warunków, w ciągu co najmniej tygodnia.

Niektóre związki mogą występować w postaciach tautomerycznych oraz w postaciach stereochemicznych, tj. w konfiguracji R i S dla każdego centrum asymetrii. We wzorach chemicznych w niniejszym opisie linia falista, np. linia falista we wzorze I przy pozycji 43 i 28, wskazuje orientację R lub S.

O ile nie podano inaczej, uważa się, że przedstawione tu wzory obejmują związki, które różnią się tylko obecnością jednego lub więcej atomów wzbogaconych izotopowo (np. związki, w których wodór jest zastąpiony przez deuter lub tryt, lub węgiel jest zastąpiony przez węgiel wzbogacony w ¹³C lub ¹⁴C.

Opisane tu rapalogi zawierające grupę JQA (tj. rapalogi zawierające 43-JQA) mogą różnić się od odpowiednich zawierających grupę 43-JQA pochodnych rapamycyny ze względu na zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 (lub więcej) podstawników lub grup funkcyjnych w pozycjach innych niż pozycja 43. Jedna klasa rapalogów obejmuje zawierające grupę JQA rapalogi niewykazujące żadnych innych modyfikacji względem rapamycyny, tj. innych niż modyfikacja JQA w pozycji 43. Inna klasa obejmuje m.in. zawierające grupę JQA rapalogi z dodatkowymi modyfikacjami w 1, 2, 3, 4, 5 lub wszystkich 6 pozycjach C7, C13, C14, C24, C28 i C30. Modyfikacje w budowie rapalogów są znane dla licznych wcześniej znanych rapalogów (patrz np. WO 99/36553, tabela III i Liberles i inni, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7825-7830 i poniżej). Patrz również opis WO 01/14387, zawierający m.in. na str. 24-30 informacje o modyfikacjach i kombinacjach modyfikacji znanych dla rapamycyny, które można zastosować w rapalogach zawierających JQA.

PL 216 224 B1

Szczególnie interesującą podgrupą rapalogów zawierających grupę JQA są związki (lub ich

C7a farmaceutycznie dopuszczalne pochodne), w których R^C7a oznacza grupę inną niż OMe. Ta podgrupa (rapalogi zawierające przy C7 grupę JQA) obejmuje związki, w których jeden z podstawników R^7a i R^7boznacza atom wodoru, a drugi jest wybrany spośród grup -R^A, -Z-R^A, -Z-(CO)R^A, -Z-(CO)ZR^A, -NR^ASO2R^A i -NSO2R^A, przy czym każdy symbol Z niezależnie oznacza O, S lub NR^A. Przykłady tej podgrupy obejmują rapalogi zawierające grupę JQA podstawione przy C7 podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej grupę arylową, heteroarylową, grupę eteru arylowego, heteroarylowego lub benzylowego oraz -NH(CO)OR^A, -NH(CO)R^A, -NH(SO2)R^A lub -NH(SO2)NHR^A (przy czym R^A oznacza podstawioną lub niepodstawioną niższą grupę alkilową, np. metylową, etylową, izopropylową, butylową, benzylową itp., lub oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę fenylową (np. p-tolilową). W niektórych rozwiązaniach w tej podgrupie R^7a i R^7b są niezależnie wybrane spośród następujących ugrupowań: atom wodoru, podstawione lub niepodstawione, zawierające 2-8 atomów węgla, proste, rozgałęzione lub cykliczne grupy alkenylowe, alkoksylowe lub alkilomerkapto; oraz podstawione lub niepodstawione grupy arylowe, heteroarylowe, aryloksylowe lub heteroaryloksylowe, aryIomerkapto 7a lub heteroarylomerkapto. Związki z tej podgrupy obejmują m.in. związki, w których R^7a oznacza atom wodoru, (razem z R^7b) =O, grupa alkoksylowa, alkilomerkapto, grupa aminowa, (pierwszorzędowa, drugorzędowa, trzeciorzędowa lub czwartorzędowa); amidowa, karbaminianowa, arylowa lub podstawiona arylowa, fenylowa lub podstawiona fenylowa, podstawiona lub niepodstawiona grupa heteroarylowa, taka jak podstawiona lub niepodstawiona grupa tiofenylowa, furylowa, indolilowa itp., lub grupa benzyloksylowa lub podstawiona benzyloksylowa. Inne przykłady rapalogów zawierających przy C7 grupę JQA obejmują związki, w których jeden z podstawników R^7a i R^7b oznacza atom wodoru, a drugi jest wybrany z grupy obejmującej -OEt, -O-propyl, -O-butyl, -OCH2CH2-OH, -O-benzyl, -O-podstawiony benzyl (np. 3-nitro-, 4-chloro, 3-jodo-4-diazo-, 3,4-dimetoksy- i 2-metoksy-), -S-Me, -S-fenyl, O(CO)Me, -allil, -CH2C(Me)=CH2, -OCH2-CCH, -OCH2-CC-Me, -OCH2-CC-Et, -OCH2-CC-CH2OH lub -2,4-dimetoksyfenyl, 2,4,6-trimetoksyfenyl, furanyl, tiofenyl, metylotiofenyl, pirolil i indolil. Szczególnie interesującymi C7-modyfikowanymi rapalogami zawierającymi grupę JQA są związki, które zawierają przy C7 podstawione lub niepodstawione grupy eteru aromatycznego, podstawione lub niepodstawione grupy eteru benzylowego lub grupy karbaminianowe. W C7-modyfikowanych rozwiązaniach podstawnik przy C43 może występować w orientacji stereochemicznej (lub jako mieszanina izomerów). Rapalogi zawierające przy C7 grupę JQA mogą ponadto różnić się od odpowiedniej C7-modyfikowanej rapamycyny w 1, 2, 3, 4, 5 lub więcej innych pozycjach.

Szczególnie interesujące są rapalogi 43-JQA-rapamycyny i rapalogi zawierające C7-JQA.

Inną podgrupą szczególnie interesujących rapalogów zawierających JQA są związki, w których obydwa podstawniki przy C24 i C30 mają znaczenie inne niż (=O). Szczególnie interesujące są podstawniki przy C30 i C24 opisane w WO 99/36553. Ta podgrupa obejmuje m.in. rapalogi zawierające 43-JQA, w których R^C30 i R^C24 oznaczają grupę OH i jeden z R^C7a i R^C7b zawiera podstawniki zastępcze dla tej pozycji, obejmujące podstawniki przy C7 podane w WO 01/14387. Szczególnie interesujące są związki, w których jeden z podstawników R^C7a i R^C7b oznacza cykliczną grupę alifatyczną, arylową, heterocykliczną lub heteroarylową, które mogą być ewentualnie podstawione. Inne związki w tej podgrupie obejmują związki, w których 1, 2, 3, 4 lub 5 grup hydroksylowych jest epimeryzowanych, fluorowanych, alkilowanych, acylowanych lub inaczej modyfikowanych przez utworzenie innych estrów, karbaminianów, węglanów lub moczników. Przykład takiego związku obejmuje rapalog zawierający grupę JQA, w którym grupy hydroksylowe przy C28 i C30 są alkilowane, acylowane lub związane przez utworzenie węglanu.

Inną szczególnie interesującą podgrupą rapalogów zawierających grupę JQA są rapalogi zawierające grupę mono- i difluoro-JQA, które zawierają F w jednej lub obydwu pozycjach C13 i C28, jak opisano w WO 99/36553, z dodatkowymi zmianami lub bez dodatkowych zmian z cząsteczce rapalogu zawierającego JQA.

C24

W innej interesującej podgrupie rapalogów zawierających JQA występuje R^C24 o znaczeniu innym niż =O, znów z dodatkowymi modyfikacjami lub bez dodatkowych modyfikacji względem rapamycyny przy innych pozycjach.

C14

Inne interesujące rapalogi zawierające JQA obejmują związki, w których R^C14 oznacza OH.

Ponadto przedmiotem zainteresowania są zawierające JQA rapalogi, z modyfikacją, która polega na tym, że jedno lub więcej podwójnych wiązań węgiel-węgiel w pozycjach 1,2, 3,4 lub 5,6 w rapamycynie jest nasyconych, samą lub w kombinacjach z innymi modyfikacjami w cząsteczce, np. przy jednym lub więcej spośród C7, C13, C24, C28 i/lub C30. Należy również zaznaczyć, że podwójne

PL 216 224 B1 wiązanie C3,C4 może być epoksydowane, grupa metylowa C6 może być zastąpiona przez -CH2OH lub -CH2OMe, a grupa metoksylowa C42 może być demetylowana, w dowolnych związkach tu opisanych, z zastosowaniem znanych metod.

Sposób wytwarzania rapamycyny drogą fermentacji i drogą syntezy totalnej jest znany. Znany jest również sposób wytwarzania pewnej liczby rapalogów jako produktów fermentacji. Sposoby te obejmują m.in. rapalogi o alternatywnych resztach występujących zamiast charakterystycznych pierścieni cykloheksylowych lub pierścieni pipekolinowych rapamycyny, jak również C7-demetylorapamycynę, C29-demetylorapamycynę i C29-demetoksyrapamycynę.

Sposoby i substancje potrzebne do prowadzenia różnych chemicznych transformacji rapamycyny i strukturalnie pokrewnych makrolidów są znane. Wiele takich chemicznych transformacji rapamycyny i różnych rapalogów jest opisanych w opisach patentowych zebranych w tabeli I opisu WO/014387, co umożliwia ocenę poziomu znanego stanu techniki i wiedzy na temat syntezy chemicznej i sposobu wyodrębniania, oczyszczania i formułowania, co można stosować również w niniejszym wynalazku. Kilka reprezentatywnych transformacji i/lub odnośników, które można wykorzystać do wytwarzania żądanych rapalogów, zastawiono poniżej w celach ilustracyjnych.

Modyfikowana pozycja w pierścieniu	Odnośniki literaturowe
C7	Luengo i inni, J. Org. Chem. 59, 6512 (1995); Chem. & Biol. 2(7), 471-481 (1995)
C14	Schubert i inni, Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 23, 167 (1984)
C20	Nelson, opis patentowy USA nr 5387680
C-24	opisy patentowe USA nr 5373014 i 5378836; Lane i inni. Synthesis 1975, p./136
C-30	Luengo i inni, Tet. Lett. 35, 6469 (1994)

Patrz również: opisy patentowe USA o numerach 5100883, 5118677, 5118678, 5130307, 5177203 i 5194447 dla substancji i sposobów dotyczących wytwarzania fluorowanych estrów, estrów amidów, karbaminianów, aminoestrów, sulfonianów i sulfaminianów oraz sulfonylokarbaminianów rapamycyny.

Ponadto rapamycynę można łatwo przeprowadzić w 28-epirapamycynę w sposób opisany np. w WO/014387. W dokumencie tym opisano materiały i sposoby przeprowadzania wielu innych znanych chemicznych transformacji rapamycyny. Patrz również cytowane tam odnośniki oraz US 2001/0010920. Zamiast rapamycyny można stosować 28-epirapamycynę w celu uzyskania odpowiedniego 28-epi-rapalogu modyfikowanego w pozycji 43, zgodnie z obecnym ujawnieniem.

Podobnie można prowadzić redukcję grup ketonowych w jednej lub obydwu pozycjach 24 i 30, z zastosowaniem znanych metod, np. metod opisanych uprzednio dla samej rapamycyny, lecz stosowanych obecnie w odniesieniu do opisanych w niniejszym opisie C-43 rapalogów, otrzymując odpowiednie 24-hydroksy-, 30-hydroksy- lub 24,30-tetrahydro-rapalogi modyfikowane w pozycji 43, zgodnie z obecnym ujawnieniem.

Rapalogi stosowane jako związki pośrednie do wytwarzania 43-JQA-rapalogów można wytwarzać drogą bezpośredniej biosyntezy, np. jak opisano w Katz i inni, WO 93/13663 oraz Cane i inni, WO 9702358. Patrz również Khaw i inni, 1998, J. Bacteriology 180 (4):809-814 dla dodatkowych metod biologicznych.

Rapalogi według wynalazku można wytwarzać, stosując znane fachowcom, poniżej opisane metody i materiały. Na przykład, metody i materiały można dostosowywać na podstawie znanych metod opisanych lub powoływanych w cytowanych poniżej dokumentach. Dodatkowe wskazówki i przykłady podano w niniejszym opisie dla ilustracji i jako dalsze wskazówki dla specjalistów. Należy rozumieć, że chemik będzie mógł łatwo przeprowadzać modyfikacje, np. dodawać odpowiednie grupy ochronne do reaktywnych ugrupowań w czasie syntezy, po czym usuwać te grupy ochronne, gdy nie będą już dłużej potrzebne lub pożądane, i będzie zdolny do określania innych sugestii dotyczących syntezy.

Niektóre dodatkowe transformacje, interesujące dla specjalisty, są przedstawione poniżej, w tym sposób wytwarzania reagentów do otrzymywania opisanych rapalogów zawierających fosfor w pozycji C-43.

PL 216 224 B1

Wytwarzanie chlorofosforanów dialkilowych/diarylowych

Wytwarzanie halogenoalkilofosfonianów

1. Arbuzoy

BnO(CHg)n8r

HgPd/C

H0{GHa)nPO₃Ra

PPhg, Br_a

Orf?, Prep, Proced. !nf., 1988,20,371-6

Br( PO₃R₂

Przykładowe drogi stosowania poniżej podanych rodzajów reagentów do wytwarzania niektórych rapalogów według wynalazku są przedstawione poniżej.

Droga I (2 etapy, jeden reaktor)

Droga II (1 etap)

Synteza związków według wynalazku często wymaga wytwarzania aktywowanej postaci żądanej grupy „J, tak jak w przypadku chlorku fosforylu, jak przedstawiono powyżej (np. (R)(RO)P-Cl lub RR'P(=O)-Cl itp.) i reakcji tego reagentu z rapamycyną (lub odpowiednim rapalogiem) w warunkach, w których otrzymuje się żądany produkt, który można następnie wyodrębniać spośród pozostałych reagentów i niepożądanych produktów ubocznych. Grupy ochronne można dobierać, dodawać i usuwać, jeśli jest to pożądane, stosując konwencjonalne metody i materiały.

PL 216 224 B1

Oczyszczanie związków według wynalazku

W literaturze naukowej i patentowej opisano różne materiały i metody oczyszczania rapamycyny i różnych rapalogów i można je stosować w odniesieniu do rapalogów omawianych w niniejszym opisie. Szczególnie korzystnie stosuje się chromatografię typu flash z zastosowaniem pakowanych jednostkowo wkładów BIOTAGE. Typowy sposób postępowania opisany jest w przykładach.

Właściwości fizykochemiczne związków według wynalazku

Tożsamość, czystość i właściwości fizykochemiczne rapalogów można określać lub potwierdzać, stosując znane metody i materiały, takie jak HPLC, analiza spektralna mas, krystalografia

31 z wykorzystaniem promieniowania X i spektroskopia NMR. Wysoką rozdzielczość widma 1D ¹H i ³¹P NMR uzyskano, stosując typowe opóźnienie relaksacji wynoszące 3 s, tak jak w analizie HPLC w odwróconym układzie faz (kolumna analityczna, wielkość cząstek 3 μm, wielkość porów 120 A, termostat do 50°C z fazą ruchomą 50% acetonitrylu, 5% metanolu i 45% wody (wszystkie % objętościowe), np. w układzie elucji izokratycznej, z elucją produktu i pików zanieczyszczeń, a następnie detekcją za pomocą UV przy 280 nm). Można również stosować HPLC w normalnym układzie faz, zwłaszcza w przypadku określania poziomu pozostałości rapamycyny lub rapalogowych produktów ubocznych. Obecność resztkowego rozpuszczalnika, metali ciężkich, wilgoci i bioosadu można określać, stosując konwencjonalne metody.

Charakterystyka biologiczna związków według wynalazku

Właściwości biologiczne rapalogów mogą być określone z zastosowaniem znanych sposobów i materiałów, obejmujących np. oznaczenia mierzące wiązanie z FKPB12, hamowanie proliferacji komórek T, aktywność przeciwgrzybiczą, aktywność przeciwnowotworową in vitro lub in vivo (np. przeciwko jednej lub więcej linii komórek nowotworowych in vitro/lub in vivo), aktywność immunosupresyjną i aktywność w 3-hybrydowym oznaczeniu opartym na białkach fuzyjnych zawierających FKPB i FRAP. Przykłady wielu takich oznaczeń są ujawnione lub wskazane jako odsyłacze w publikacji Sorbera i wsp., Drugs of the Future 2002, 27 (1) : 7-13.

Następujący poniżej tekst będzie szczególnie interesujący w związku z wiązaniem rapalogów do FKPB12.

Oznaczenia właściwości wiążących

Wiadomo, że rapamycyna wiąże się z ludzkim białkiem FKPB12 i tworzy trzyczęściowy kompleks z hFKBP12 i FRAP, ludzkim odpowiednikiem białek drożdży TOR1 i TOR2. Rapalogi mogą być charakteryzowane i porównywane z rapamycyną pod względem ich zdolności do wiązania z ludzkim FKPB12 i/lub tworzenia trzyczęściowych kompleksów z ludzkim FKPB12 i ludzkim FRAP (lub białkami fuzyjnymi lub fragmentami zawierającymi domenę FRB), patrz WO 96/41865 (Clackson i wsp.). Niniejszy opis ujawnia różne materiały i sposoby, które mogą być stosowane do ilościowego określania zdolności związku do wiązania z ludzkim FKPB12 lub odpowiednio do tworzenia trzyczęściowego kompleksu (tj. heterodimeryzacji) z białek zawierających odpowiednio ludzkie FKPB12 i domenę FRB ludzkiego FRAP. Takie oznaczenia obejmują oznaczenia polaryzacji fluorescencyjnej do pomiaru wiązania. Inne użyteczne oznaczenia obejmują oparte na komórkach oznaczenia transkrypcji, w których zdolność rapalogów do tworzenia trzyczęściowego kompleksu jest mierzona pośrednio poprzez korelację z obserwowanym poziomem produktu genu reporterowego, produkowanego przez modyfikowane genetycznie komórki ssaków, w obecności związku. Odpowiadające, oparte na komórkach, oznaczenia mogą być również prowadzone w modyfikowanych genetycznie komórkach drożdży, patrz np. WO 95/33052 (Berlin i wsp.).

Często będzie korzystne, jeśli rapalogi według wynalazku będą fizjologicznie dopuszczalne (tj. pozbawione nadmiernej toksyczności względem komórek lub organizmów, z którymi będą stosowane), będą mogły być podawane doustnie lub pozajelitowo zwierzętom i/lub będą mogły przekraczać błony komórkowe i inne błony, w zależności od potrzeby konkretnego zastosowania.

W pewnych przypadkach, np. w zastosowaniach przeciwgrzybiczych lub w celu uruchomienia „przełącznika” biologicznego z udziałem inżynierii genetycznej, korzystnymi rapalogami są te, które preferencyjnie wiążą się ze zmutowanymi lub wiążącymi białkami grzybów w stosunku do ludzkich odpowiadających białek wiążących. Nieograniczającym przykładem zmutowanego białka wiążącego jest ludzkie białko FKPB, w którym Phe36 jest zastąpiona innym aminokwasem, korzystnie aminokwasem z mniej objętościowym łańcuchem bocznym, takim jak walina lub alanina). Na przykład związki takie mogą wiązać się preferencyjnie ze zmutowanymi białkami FKPB o co najmniej jeden rząd wielPL 216 224 B1 kości lepiej niż z ludzkim białkiem FKPB12, a w pewnych przypadkach o więcej niż 2 lub nawet 3 rzędy wielkości lepiej, przy oznaczeniu dowolną obowiązującą naukowo lub dopuszczoną do stosowania metodologią oznaczania.

Powinowactwo wiązania różnych rapalogów, w tym rapalogów według wynalazku, względem ludzkiego FKPB12, jego wariantów lub innych białek immunofilin, może być określane przez adaptację znanych sposobów stosowanych w przypadku białka FKPB. Na przykład, specjalista może mierzyć zdolność związku według wynalazku do współzawodnictwa z wiązaniem znanego liganda do białka, o którym mowa, patrz np. Siekierka i wsp., 1989, Nature 341, 755-757 (testowany związek współzawodniczy z wiązaniem znakowanej pochodnej FK506 do FKPB).

Pewne rapalogi według wynalazku, które budzą szczególne zainteresowanie, wiążą się z ludzkim FKPB12, jego mutantem, jak omawiano poniżej, lub z białkiem fuzyjnym zawierającym domeny FKPB, które mają wartości Kd poniżej około 200 nM, bardziej korzystnie poniżej 50 nM, jeszcze korzystniej poniżej 10 nM, a jeszcze bardziej korzystnie poniżej 1 nM, określone przez bezpośredni pomiar wiązania (np. tłumienie fIuorescencji), pomiar kompetycyjności wiązania (np. względem FK506), inhibicji aktywności enzymu FKPB (rotamaza) lub przy zastosowaniu innej metodologii badań.

Znane oznaczenie kompetycyjnego wiązania FP jest opisane szczegółowo w WO 99/36553 i WO 96/41865. Oznaczenie to umożliwia pomiar in vitro wartości IC50 dla danego związku, która odzwierciedla jego zdolność do wiązania się z białkiem FKPB we współzawodnictwie ze znakowanym ligandem FKPB, takim jak na przykład FK506.

Jedna interesująca klasa opisanych tu związków ma wartość IC50, określoną w oznaczeniu kompetycyjnego wiązania FP (np. z zastosowaniem znakowanego fluorosceiną wzorca FK506), lepszą niż 1000 nM, korzystnie lepszą niż 300 nM, bardziej korzystnie lepszą niż 100 nM, a jeszcze bardziej korzystnie lepszą niż 10 nM, względem danej domeny FKPB i pary ligandów, np. ludzkiego FKPB12 lub jego wariantu z podstawieniem do 10 aminokwasów, korzystnie z podstawieniem 1-5 aminokwasów.

Zdolność rapalogów do multimeryzacji chimerycznych białek może być mierzona za pomocą oznaczeń z zastosowaniem komórek, przez pomiar wystąpienia wyniku spowodowanego taką multimeryzacją. Na przykład, można zastosować komórki zawierające i zdolne do ekspresji DNA kodując ego pierwsze białko chimeryczne zawierające jedną lub więcej domen FKPB i jedną lub więcej domen efektorowych, jak również DNA kodujące drugie białko chimeryczne zawierające domenę FRB i jedną lub więcej domen efektorowych zdolnych, po multimeryzacji, do uruchomienia odpowiedzi biologicznej. Preferowane jest stosowanie komórek, które zawierają również gen reporterowy pod kontrolą transkrypcyjną elementu regulatorowego (np. promotora), który odpowiada na multimeryzację chim erycznych białek. Opracowanie i wytworzenie przykładowych związków oraz ich zastosowanie w takich modyfikowanych genetycznie komórkach jest opisane w WO 00/36553 i WO 96/41865 oraz innych międzynarodowych zgłoszeniach patentowych powoływanych w tej i następnych częściach opisu (patrz również WO 99/10510 po dodatkowe wskazówki dotyczące opracowania, konstrukcji i dostarczania kwasów nukleinowych w celu uwrażliwienia komórek i zwierząt na będące przedmiotem zainteresowania rapalogi i po dodatkowe wskazówki dotyczące zastosowania takich systemów). Komórki są hodowane lub utrzymywane w hodowli. Do pożywki hodowlanej jest dodawany rapalog i po odpowiednim okresie inkubacji (umożliwiającym ekspresję i sekrecję genu, np. po kilku godzinach lub całej nocy) jest dokonywany pomiar obecności produktu genu reporterowego. Wynik pozytywny tj. multimeryzacja, koreluje z transkrypcją genu reporterowego, co jest obserwowane przez pojawienie się produktu genu reporterowego. Produkt genu reporterowego może być łatwym do wykrycia (np. metodą ELISA) białkiem lub może katalizować produkcję łatwo wykrywalnego produktu (np. zabarwionego). Materiały i metody do produkcji linii komórkowych odpowiednich do przeprowadzania takich oznaczeń są ujawnione w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych cytowanych poniżej w tej części opisu. Typowo stosowane geny docelowe obejmują przykładowo SEAP, hGH, beta-galaktozydazę, zielone białko fluoroscencyjne i lucyferazę, dla których są dostępne na rynku wygodne oznaczenia.

Przeprowadzenie takich oznaczeń umożliwia specjaliście wybranie rapalogów mających pożądane wartości IC50 i/lub charakterystyki wiązania. Oznaczenie kompetycyjnego wiązania FP umożliwia wybór rapalogów mających żądane wartości IC50 i/lub preferencję wiązania do zmutowanego FKPB lub FKPB typu dzikiego względem kontroli, takiej jak FK506.

PL 216 224 B1

Zastosowania

Rapalogi według wynalazku mogą być stosowane, jak opisano w WO 94/18317, WO 95/02684, WO 96/20951, WO 95/41865, WO 99/36553 i WO/01/14387, np. do regulowanej aktywacji transkrypcji żądanego genu, usuwania docelowego genu, uruchomienia apoptozy lub do wyzwalania innych zdarzeń biologicznych w genetycznie modyfikowanych komórkach wrastających w hodowli lub w całych organizmach, włączając zastosowania w terapii genowej. Dodatkowo, pewne opisane tu związki mają aktywność immunosupresyjną i/lub przeciwnowotworową i/lub przeciwzapalną i/lub antyproliferacyjną, i/lub przeciwgrzybiczą, i/lub hamującą in vitro proliferację tymocytów, co może być określane ilościowo i porównywane za pomocą konwencjonalnych metod badawczych. Dlatego również związki te są użyteczne w leczeniu lub hamowaniu odrzucania przeszczepionych narządów lub tkanek; w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych, takich jak toczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca i stwardnienie rozsiane; infekcji grzybiczych; chorób zapalnych (takich jak łuszczyca, wyprysk, łojotok, choroba zapalna jelit i stany zapalne dróg oddechowych, takie jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc, rozedma, zapalenie oskrzeli itp.; w leczeniu hiperproliferacyjnej choroby naczyń (np. restenozy po wprowadzeniu stentu naczyniowego) (patrz np. Sousa i wsp. Circulation, 2001, 103:192-195); zespołów takich, jak stwardnienie guzowate (patrz np. Kwiatkowski i wsp. Human Molecular Genetics, 2002, tom 11, nr 5, str. 525-534) i pewnych nowotworów (np. guzów sutka, prostaty, jajnika, płuca, trzustki, okrężnicy, głowy i szyi, glejaków lub innych nowotworów mózgu, czerniaka i raka szyjki macicy. Dotyczy to zwłaszcza guzów z niedoborem PTEN (patrz np. Neshat i wsp. PNAS 98(18):10314-10319; Podsypanina i wsp. PNAS 98(18): 01320-10325; Mills i wsp. PNAS 98(18) 10031-10033; Hidalgo i wsp. Oncogene (2000) 19, 6680-6686). Pewne opisane tu związki będą przedmiotem zainteresowania z powodu ich zdolności do hamowania funkcji osteoklastów i mogą być stosowane w leczeniu wyniszczających schorzeń kości, takich jak osteoporoza, a szczególnie osteoporoza związana ze stanami około- i po menopauzalnymi. Uwzględnione jest również podawanie opisanych tu związków w leczeniu pacjentów cierpiących na chorobę Pageta lub zagrożonych tą chorobą, pacjentów z hiperkalcemią związaną z nowotworami kości i innymi rodzajami chorób z grupy osteoporozy i podobnych schorzeń. Grupa ta obejmuje, ale nie wyłącznie, osteoporozę zanikową, osteoporozę typu I lub osteoporozę pomenopauzalną, osteoporozę typu II lub starczą, osteoporozę młodzieńczą, idiopatyczną, nieprawidłowości wewnątrzwydzielnicze, nadczynność tarczycy, niedoczynność gonad, agenezję jajników lub zespół Turnera; nadczynność kory nadnerczy lub zespół Cushinga, nadczynność przytarczyc, nieprawidłowości szpiku kostnego, szpiczaka mnogiego i pokrewne choroby, uogólnioną mastocytozę, rozsianego raka, chorobę Gauchera, nieprawidłowości tkanki łącznej, wrodzoną łamliwość kości (osteogenesis imperfecta), homocystynurię, zespół Ehlersa-Danlosa, zespół Marfana, zespół Menkesa, unieruchomienie lub immobilizację, zanik Sudecka, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, przewlekłe podawanie heparyny i przewlekłe stosowanie leków przeciwdrgawkowych.

Wiele z tych zastosowań jest omawiane poniżej.

1. Regulowana terapia genowa

W wielu sytuacjach dla skuteczności terapeutycznej ważna jest możliwość włączania i wyłączania na życzenie terapeutycznego genu lub oznaczanie stopnia jego ekspresji. Ten wynalazek jest szczególnie dobrze dostosowany do uzyskania regulowanej ekspresji terapeutycznego genu docelowego w kontekście terapii genowej u ludzi. W jednym z przykładów stosowana jest para białek fuzyjnych (jedno białko, zawierające co najmniej jedno z następujących: FKPB:domena białka FRAP wiążąca rapamycynę (domena „FRB), białko FRAP, drugie białko, zawierające co najmniej jedną domenę FKPB), rapalog według wynalazku mający zdolność dimeryzacji białek fuzyjnych i konstrukt genu docelowego. Jedno z białek fuzyjnych zawiera domenę wiążącą DNA, korzystnie złożoną domenę wiążącą DNA, taką jak opisana przez Pomerantz i wsp., poniżej, jako heterologiczną domenę efektorową. Drugie białko fuzyjne zawiera aktywującą domenę transkrypcyjną, jako heterologiczną domenę efektorową. Rapalog ma zdolność wiązania się z obydwoma białkami fuzyjnymi i w ten sposób ich skutecznego sieciowania. Cząsteczki DNA kodujące i mające zdolność kierowania ekspresją tych chimerycznych białek są wprowadzane do komórek, które mają być modyfikowane genetycznie. Do komórek jest również wprowadzany gen docelowy związany z sekwencją DNA, z którą może się związać domena wiążąca DNA. Kontaktowanie komórek modyfikowanych genetycznie, lub ich komórek potomnych, z rapalogiem (przez podawanie go zwierzęciu lub pacjentowi), prowadzi do połączenia kompleksu czynnika transkrypcyjnego i wskutek tego do ekspresji genu docelowego. Opracowanie i zastosowanie podobnych składników jest ujawnione w dokumentach PCT/US93/01617 i w WO 96/41865

PL 216 224 B1 (Clackson i wsp.). W praktyce, poziom ekspresji genu docelowego powinien być funkcją ilości lub stężenia chimerycznych kompleksów czynnika transkrypcyjnego, które z kolei powinny być funkcją stężenia rapalogu. Zwykle obserwowana jest ekspresja genu zależna od dawki (rapalogu).

Rapalog może być podawany biorcy według potrzeby, w celu aktywacji transkrypcji genu docelowego. Zależnie od powinowactwa wiązania rapalogu, żądanej odpowiedzi, sposobu podawania, biologicznego okresu półtrwania rapalogu i/lub mRNA genu docelowego, ilości zmodyfikowanych genetycznie komórek, mogą być stosowane różne protokoły. Rapalog może być podawany różnymi drogami, obejmującymi drogę pozajelitową lub drogę doustną. Ilość podań będzie zależna od opisanych poniżej czynników. Rapalog może być podawany doustnie w postaci pigułki, proszku lub dyspersji. Można stosować podawanie podpoliczkowe, podjęzykowe; drogą inhalacji; lub przez wstrzyknięcia wewnątrznaczyniowe, dootrzewnowe, domięśniowe, podskórne lub dostawowe. Rapalog (i monomeryczny związek antagonistyczny) mogą być formułowane z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów i materiałów stosowanych dla różnych dróg podawania, dobrze znanych w tej dziedzinie. Precyzyjna dawka i konkretny sposób podawania będzie zależny od powyższych czynników i może być określony przez lekarza prowadzącego lub osobę zapewniającą opiekę zdrowotną ludziom lub zwierzętom. W większości przypadków sposób podawania będzie określany empirycznie.

W przypadku, gdy aktywacja transkrypcyjna spowodowana rapalogiem ma być odwrócona lub zakończona, kończy się podawanie rapalogu. Dodatkowo, jeśli istnieje taka potrzeba, można podawać monomeryczny związek, który może współzawodniczyć z rapalogiem. Tak więc, w przypadku wystąpienia reakcji niepożądanej lub w razie potrzeby zakończenia efektu terapeutycznego, można podawać, dowolną dogodną drogą, antagonistę czynnika dimeryzującego, w szczególności, jeśli jest potrzeba szybkiego odwrócenia działania, drogą wewnątrznaczyniową. Alternatywnie, można uwzględnić obecność domeny inaktywacyjnej (lub wyciszacza transkrypcji) z użyciem domeny wiążącej ligand.

W innym podejściu, komórki są modyfikowane genetycznie w taki sposób, aby wyrażały chimeryczne białka zawierające domeny FRB i FKBP, jak rozważano poniżej, ale zawierające komórkową domenę sygnalizacyjną w miejscu domeny wiążącej DNA lub domeny aktywacji transkrypcji. Wiadomo jest, że grupowanie, dimeryzacja lub oligomeryzacja takich domen sygnalizacyjnych wyzwala śmierć, proliferację lub różnicowanie komórek. Takie podejście pozwala na regulację za pośrednictwem rapalogów sygnalizacji komórkowej (tj. śmierci komórek, ich proliferacji lub różnicowania) w komórkach poddanych modyfikacji genetycznej lub w organizmach będących ich siedliskiem, jak to zostało opisane w innych źródłach, i może być adaptowane do zastosowania rapalogów opisanych w niniejszym opisie, patrz międzynarodowe zgłoszenia patentowe o numerach PCT/US94/1617 i PCT/US94/08008.

Konkretna dawka rapalogu dla dowolnego zastosowania może być określona zgodnie z procedurami stosowanymi do monitorowania dawkowania terapeutycznego, gdy pożądane jest utrzymywanie określonego poziomu ekspresji przez długi czas, na przykład dłuższy od około dwóch tygodni lub gdy mamy do czynienia z leczeniem powtarzanym, z pojedynczymi lub powtarzanymi w krótkim czasie dawkami rapalogu, z wydłużonymi przerwami trwającymi np. dwa tygodnie lub dłużej. Podawana będzie dawka rapalogu mieszcząca się w uprzednio ustalonych granicach i dawka ta będzie monitorowana pod względem odpowiedzi aż do uzyskania zależności pomiędzy czasem a poziomem ekspresji, jak również będzie obserwowana odpowiedź terapeutyczna. Zależnie od poziomów obserwowanych w danym okresie i odpowiedzi terapeutycznej, następnym razem będzie można podać większą lub mniejszą dawkę. Taki proces może być powtarzany aż do uzyskania dawki mieszczącej się w zakresie terapeutycznym. Jeśli rapalog jest podawany przewlekle, po określeniu dawki podtrzymującej rapalogu, w celu upewnienia się, czy układ komórkowy odpowiada prawidłowo i dostarcza właściwego poziomu produktu ekspresji, oznaczenia można przeprowadzać w większych odstępach czasu.

Należy uwzględnić fakt, że układ jest przedmiotem wielu zmiennych, takich jak odpowiedź komórkowa na rapalog, wydajność ekspresji i odpowiednio, poziom sekrecji, aktywność produktu ekspresji, indywidualna potrzeba pacjenta, która może zmieniać się w czasie i zależnie od okoliczności, szybkość utraty aktywności komórkowej w wyniku utraty komórek lub aktywności ekspresji w poszczególnych komórkach i podobne.

2. Produkcja rekombinowanych białek i wirusów

Produkcję rekombinowanych terapeutycznych białek dla celów handlowych i badawczych często prowadzi się przez zastosowanie ssaczych linii komórkowych modyfikowanych genetycznie, aby posiadały wysoki poziom ekspresji białka. Tam, gdzie właściwa funkcja białka wymaga modyfikacji potranslacyjnych, które zwykle nie zachodzą w komórkach heterologicznych, wskazane jest zastoso40

PL 216 224 B1 wanie komórek ssaczych a nie bakteryjnych lub drożdżowych. Przykłady białek produkowanych tą drogą obejmują erytropoetynę, tkankowy aktywator plazminogenu, czynniki krzepnięcia, takie jak czynnik VIII:c, przeciwciała itp. Koszt produkcji białek tą metodą jest bezpośrednio związany z poziomem ekspresji osiąganym w modyfikowanych genetycznie komórkach. Drugim ograniczeniem w produkcji takich białek jest toksyczność względem komórek gospodarza. Ekspresja białek może zapobiegać wzrostowi komórek do wysokiej gęstości, znacznie obniżając poziomy produkcji. Dlatego też, zdolność do ścisłego kontrolowania ekspresji białek, jak to zostało opisane dla regulowanej terapii genowej, umożliwia wzrost komórek do wysokiej gęstości, przy braku produkcji białka. Dopiero po osiągnięciu optymalnej gęstości komórek, aktywowana jest ekspresja genu i w wyniku tego otrzymywany jest produkt białkowy.

Podobny problem jest spotykany w konstrukcji i stosowaniu „linii pakujących do produkcji rekombinowanych wirusów w celach handlowych (np. do terapii genowej) i do zastosowania eksperymentalnego. Te linie komórkowe są modyfikowane genetycznie w taki sposób, aby produkowały białka wirusowe potrzebne do składania zakaźnych cząstek wirusowych zawierających defektywne rekombinowane genomy. Wektory wirusowe zależne od takich linii pakujących obejmują retrowirusy, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami. W ostatnim przypadku, miano wirusa otrzymanego z linii pakującej jest, bezpośrednio zależne od poziomu produkcji wirusowych białek rep i cap. Jednak te białka są w wysokim stopniu toksyczne względem komórek gospodarza. Zatem udowodniono, że generowanie wirusów AAV o wysokim mianie jest trudne. Wynalazek ten dostarcza rozwiązania tego problemu, umożliwiając konstrukcję linii pakujących, w których geny rep i cap znajdują się pod kontrolą regulowanych czynników transkrypcyjnych, według projektu opisanego w niniejszym opisie. Linia pakująca może wzrastać do wysokiej gęstości, zainfekowana wirusem pomocniczym i transfekowana rekombinowanym genomem wirusa. Następnie, przez dodanie czynnika dimeryzującego, indukowana jest ekspresja białek wirusa kodowanych przez komórki pakujące, co pozwala na produkcję wirusa o wysokim mianie.

3. Badania biologiczne

Niniejszy wynalazek jest możliwy do zastosowania w szerokim zakresie eksperymentów biologicznych, w których pożądana jest precyzyjna kontrola ekspresji genu docelowego. Obejmują one, między innymi: (1) ekspresję białka lub RNA, będących przedmiotem zainteresowania, w celu biologicznego oczyszczenia; (2) regulowaną ekspresję białka lub RNA, będących przedmiotem zainteresowania, w tkankowej hodowli komórek (lub in vivo, poprzez komórki modyfikowane genetycznie) w celu oceny ich funkcji biologicznej; (3) regulowaną ekspresję białka lub RNA, będących przedmiotem zainteresowania, u transgenicznych zwierząt w celu oceny ich funkcji biologicznej; (4) regulowanie ekspresji genu kodującego inne białko regulatorowe, rybozym lub cząsteczkę antysensowną, która działa na endogenny gen, w celu oceny funkcji biologicznej tego genu. Modele z transgenicznymi zwierzętami i inne zastosowania, do których mogą być adaptowane związki według wynalazku obejmują te ujawnione w PCT/US95/10591.

Opisano również zestawy użyteczne w uprzednich zastosowaniach. Zestawy takie zawierają konstrukty DNA kodujące i zdolne do kierowania ekspresją chimerycznych białek według wynalazku (i mogą zawierać dodatkowe domeny, jak to zostało omówione poniżej), i w przypadku występowania regulowanej transkrypcji genu, konstrukt genu docelowego zawierający gen docelowy połączony z jednym lub więcej elementami kontrolnymi transkrypcji, które są aktywowane przez multimeryzację chimerycznych białek. Alternatywnie, konstrukt genu docelowego może zawierać miejsce klonowania do wstawienia przez specjalistę żądanego genu docelowego. Takie zestawy mogą również zawierać próbkę czynnika dimeryzującego, zdolnego do dimeryzacji dwóch rekombinowanych białek i aktywacji transkrypcji genu docelowego. Mogą być również dostarczane zestawy do modyfikacji genetycznej komórek lub organizmów, dla umożliwienia regulowanej przez lek sygnalizacji komórkowej (np. prowadzącej do proliferacji, różnicowania lub śmierci komórki) z zastosowaniem rapalogów według wynalazku.

4. Kilka innych zastosowań farmaceutycznych

Stwierdzono, że związki według wynalazku, które były testowane pod względem ich aktywności wobec różnych linii komórek nowotworowych, hamują wzrost komórek nowotworowych i dlatego są użyteczne jako związki przeciwnowotworowe.

W szczególności, związki według wynalazku mogą być stosowane pojedynczo lub w kombinacji z innymi lekami i/lub radioterapią w leczeniu lub hamowaniu wzrostu różnych nowotworów, obejmująPL 216 224 B1 cych białaczki i guzy lite, takie jak mięsaki i raki, takie jak gwiaździaki, rak prostaty, rak sutka, rak drobnokomórkowy płuca i rak jajnika. Ich stosowanie jest analogiczne do stosowania rapamycyny lub CC1779, jak to ujawniono na przykład w publikacji Sorbera i wsp., „CCI-779 Drugs of the Future 2002, 27(1):7-13; WO 02/4000 i WO 02/13802. Przykłady innych leków, które mogą być stosowane do leczenia pacjentów z nowotworami, w połączeniu ze związkiem według wynalazku (tj. przed, podczas lub po podaniu związku według wynalazku), obejmują m.in. Zyloprim, alemtuzumab, altretaminę, amifostynę, nastrozol, przeciwciała przeciwko specyficznym antygenom błonowym prostaty (takie jak MLN-591, MLN591RL i MLN2704), tritlenek arsenu, Avastin® (lub inne przeciwciało przeciw VEGF), beksaroten, bleomycynę, busulfan, kapecytabinę, karboplatynę, Gliadel Wafer, celekoksib, chlorambucyl, cisplatynę, żel cisplatyna-epinefryna, kladrybinę, liposomalną cytarabinę, liposomalną daunorubicynę, daunorubicynę, daunomycynę, deksrazoksan, docetaksel, doksorubicynę, roztwór Elliota B, epirubicynę, estramustynę, fosforan etopozydu, etopozyd, VP-16, eksemestan, fludarabinę, 5-FU, fulwestrant, gemcytabinę, gemtuzumab-ozogamycynę, octan goserelinu, hydroksymocznik, idarubicynę, idamycynę, ifosfamid, mesylan imatinibu, irinotekan (lub inny inhibitor topoizomerazy, w tym przeciwciała, takie jak MLN576 (XR11576)), letrozol, leukoworynę, lewamizol, liposomalną daunorubicynę, melfalan, L-PAM, mesnę, metotreksat, metoksalen, mitomycynę C, mitoksantron, MLN518 lub MLN608 (lub inne inhibitory receptora o aktywności kinazy tyrozynowej (flt-3), PDFG-R lub c-kit), itoksantron, paklitaksel, Pegademase, pentostatynę, sól sodową porfimeru, Rituximab (RITUXAN®), talk, tamoksyfen, ternozolamid, tenipozyd, VM-26, topotekan, toremifen, Trastuzumab (Herceptin®, lub inne przeciwciało anty-Her2), 2C4 (lub inne przeciwciało interferujące z sygnalizacją za pośrednictwem HER2), tretinoinę, ATRA, walrubicynę, winorelbinę lub pamidronat, zoledronat lub inne bifosfoniany.

Opisane tu związki mogą również być użyteczne w leczeniu lub hamowaniu odrzucenia transplantowanych tkanek, takich jak np. nerka, serce, wątroba, płuco, szpik kostny, trzustka (komórki wysepek), rogówka, jelito cienkie, allogeniczne przeszczepy skóry i przeszczepy zastawek serca; w leczeniu lub hamowaniu choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi; w leczeniu lub hamowaniu chorób autoimmunizacyjnych, takich jak toczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca, nużliwość mięśni i stwardnienie rozsiane; oraz chorób zapalnych, takich jak łuszczyca, zapalenie skóry, wyprysk, łojotok, zapalna choroba jelit, stany zapalne płuc (w tym astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc, rozedma, ostry zespół niewydolności oddechowej, zapalenie oskrzeli i podobne) oraz zapalenie błony naczyniowej oka; w leczeniu T-komórkowej białaczki/chłoniaka dorosłych; infekcji grzybiczych; hiperproliferacyjnych chorób naczyniowych, w tym restenozy; miażdżycy przeszczepu naczyniowego; chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń mózgowych i obwodowych, takich jak choroba tętnic wieńcowych, choroby naczyń mózgowych, stwardnienie naczyń, miażdżyca, stwardnienie naczyń niespowodowane miażdżycą lub uszkodzenia ściany naczyniowej z powodu zdarzeń komórkowych prowadzących do uszkodzenia naczyń na drodze immunologicznej lub w zapobieganiu udarowi lub otępieniu spowodowanemu mnogimi zawałami. Dla takich zastosowań, sposoby i materiały do stosowania rapalogów opisanych w niniejszym opisie, mogą być adaptowane w oparciu o sposoby i materiały stosowane w odniesieniu do rapamycyny, CC1779 lub RAD001.

Rapalog, stosowany jako środek immunosupresyjny lub przeciwzapalny, może być podawany w połączeniu z jednym lub więcej środkami immunoregulującymi. Środki te obejmują, ale nie wyłącznie, azatioprynę, kortykosteroidy, takie jak prednizon i metyloprednizolon, cyklofosfamid, rapamycynę, cyklosporynę A, FK-506, OKT-3, mykofenolat i ATG. Przez skojarzenie opisanych tu rapalogów z innymi lekami lub związkami, w celu indukowania immunosupresji lub leczenia stanów zapalnych, aby osiągnąć żądany efekt, mogą być potrzebne mniejsze ilości każdego ze związków. Podstawy takiego leczenia skojarzonego zostały ustalone przez Stępkowskiego, a jego wyniki wykazały, że zastosowanie kombinacji rapamycyny i cyklosporyny A, w oddzielnych, subterapeutycznych dawkach, istotnie wydłużało czas przeżycia przeszczepu serca. [Transplantation Proc, 23: 507 (1991)]. Opisane tu rapalogi mogą być stosowane w leczeniu choroby zapalnej serca, np. przez adaptację sposobów i materiałów ujawnionych w patencie USA nr 5496832; w leczeniu stanów zapalnych oka, np. przez adaptację sposobów i materiałów ujawnionych w patencie USA nr 5387589; oraz w leczeniu chorób zapalnych jelit o podłożu immunologicznym i innych chorób zapalnych o podłożu immunologicznym np. przez adaptację sposobów i materiałów ujawnionych w patencie nr USA 5286731 i 5286730.

Opisane rapalogi mogą być również stosowane w leczeniu lub hamowaniu chorób naczyniowych (obejmujących m.in. choroby naczyń wieńcowych, choroby naczyń mózgowych, stwardnienie tętnic, miażdżycę, stwardnienie tętnic niespowodowane miażdżycą, uszkodzenie ściany naczyniowej

PL 216 224 B1 spowodowane zdarzeniami komórkowymi prowadzącymi do uszkodzenia naczyń na tle immunologicznym, udaru i otępienia spowodowanego mnogimi udarami). Rapalogi mogą wywierać korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy, naczynia mózgowe lub obwodowe, działając pojedynczo, lub mogą być podawane w kombinacji z innymi środkami, które wywierają korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy i naczynia mózgowe lub obwodowe. Środki takie obejmują inhibitory ACE, takie jak kwinapryl, peryndopryl, ramipryl, kaptopryl, trandolapryl, fosinopryl, lizinopryl, moeksypryl i enalapryl; antagonistów receptora angiotensyny II, jak kandesartan, irbesartan, losartan, valsartan i telmisartan; pochodne kwasu fibrowego, takie jak klofibrat i gemfibrozyl; inhibitory reduktazy HMG Co-A, takie jak cerywastatyna, fluwastatyna, atorwastatyna, lowastatyna, prawastatyna, simwastatyna; środki blokujące receptory beta adrenergiczne, takie jak sotalol, tymolol, esmolol, karteolol, propranolol, betaksolol, penbutolol, nadolol, acebutolol, atenolol, metoprolol i bisoprolol; blokery kanału wapniowego, takie jak nifedypina, werapamil, nikardypina, diltiazem, nimodypina, amlodypina, felodypina, nisoldypina i beprydyl; antyoksydanty; środki przeciwzakrzepowe, takie jak warfaryna, dalteparyna, heparyna, enoksaparyna i danaparoid; oraz środki stosowane w zastępczej terapii hormonalnej zawierające estrogeny, takie jak skoniugowane estrogeny, etynyloestradiol, 17-beta-estradiol, estradiol i estropipat. Przykłady sposobów i materiałów, które mogą być adaptowane do stosowania opisanych tu rapalogów do leczenia różnorodnych chorób, obejmujących choroby hiperproliferacyjne i inne choroby naczyniowe, patrz np. patent USA 5288711 i WO 01/97809.

Opisane tu związki mogą być również stosowane jako środki neurotropowe i mogą być szczególnie użyteczne we wspomaganiu regeneracji komórek nerwowych i funkcjonalnej regeneracji oraz stymulacji odrostu wypustek nerwowych. Tym samym mogą być użyteczne w leczeniu różnorodnych stanów neuropatologicznych, obejmujących uszkodzenie nerwów obwodowych i ośrodkowego układu nerwowego spowodowanych urazem fizycznym (np. uszkodzeniem i urazem rdzenia kręgowego, uszkodzeniem nerwu kulszowego lub twarzowego), chorobą (np. neuropatią cukrzycową), chemioterapią nowotworu (np. przez alkaloidy Vinca lub doksorubicynę), uszkodzenie mózgu związane z udarem i niedokrwienie związane z udarem. Mogą również być użyteczne w leczeniu chorób neurologicznych obejmujących, ale nie wyłącznie, różnorodne obwodowe schorzenia neuropatyczne i neurologiczne związane z degeneracją tkanki nerwowej w tym, ale nie wyłącznie: neuralgię nerwu trójdzielnego, neuralgię językowo-gardłową, porażenie Bella, nużliwość mięśni, dystrofię mięśniową, stwardnienie zanikowe boczne, postępujący zanik mięśni, postępujący opuszkowy wrodzony zanik mięśni, zespoły związane z przepukliną, pęknięciem lub wypadnięciem krążka międzykręgowego, spondylozę szyjną, schorzenia splotów, zespoły zniszczenia wylotu klatki piersiowej, neuropatie obwodowe, takie jak te spowodowane ołowiem, akrylamidami, gamma-diketonami (neuropatia wąchaczy kleju), disiarczkiem węgla, dapsonem; w leczeniu tików, porfirii, zespołu Guillain-Barre, otępienia, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona.

5. Zastosowanie w zapobieganiu restenozie; zastosowanie ze stentami lub innymi urządzeniami

Rapalog może być stosowany w leczeniu lub zmniejszaniu ryzyka lub nasilenia hiperplazji mięśni gładkich błony wewnętrznej naczyń, restenozy, i zamknięcia naczyń u ssaka, zwłaszcza zachodzących po biologicznym lub mechanicznym uszkodzeniu naczynia, lub w stanach predysponujących ssaka do uszkodzenia naczyń tego rodzaju. Może być stosowany w tych sytuacjach albo samodzielnie albo w skojarzeniu z kwasem mykofenolowym np. przez adaptację sposobów i materiałów ujawnionych w patencie USA nr 5665728. Spowodowane przyczynami biologicznymi uszkodzenie naczyń obejmuje uszkodzenie przypisywane schorzeniom infekcyjnym, obejmujące endotoksyny i wirusy Herpes, takie jak wirus cytomegalii; schorzenia metaboliczne, takie jak miażdżyca i uszkodzenie naczyń spowodowane m.in. hipotermią i napromienianiem. Mechaniczne uszkodzenie naczyń obejmuje m.in. uszkodzenie naczyń spowodowane procedurami cewnikowania lub wyskrobywania, takimi jak przezskórna wewnątrznaczyniowa angioplastyka wieńcowa; uszkodzenia spowodowane chirurgią naczyniową; chirurgią transplantacyjną; leczeniem laserem i przy wykorzystaniu innych inwazyjnych procedur, które naruszają integralność błony wewnętrznej lub śródbłonka naczyń. Z tego powodu, rapalog według wynalazku, stosowany pojedynczo lub w kombinacji z kwasem mykofenolowym, może być stosowany w zapobieganiu restenozie po inwazyjnych procedurach, które naruszają wyściółkę śródbłonka naczyń, takich jak przezskórna wewnątrznaczyniowa angioplastyka wieńcowa, cewnikowanie naczyń, wyskrobywanie naczyń lub procedury leczenia laserem.

Jedno z zastosowań budzących szczególne zainteresowanie obejmuje zastosowanie opisanego tu rapalogu do leczenia lub zmniejszania prawdopodobieństwa restenozy, takiej jaka zdarza się

PL 216 224 B1 u części pacjentów po procedurze angioplastyki. Stosowane w takich sposobach związki mogą być podawane przed procedurą angioplastyki, podczas procedury, po procedurze lub w dowolnej kombinacji wymienionych poniżej. Wielkie zainteresowanie budzi zastosowanie opisanego tu rapalogu, w tym rapalogu według wynalazku, dostarczanego na powierzchni lub wewnątrz stentu (lub innego wsuniętego lub wszczepionego urządzenia) w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa restenozy po wprowadzeniu urządzenia. Stosowanie rapalogu według wynalazku, razem ze stentem, może być osiągnięte przez adaptowanie sposobów i materiałów stosowanych do dostarczania innych leków, zwłaszcza rapamycyny, z zastosowaniem takich urządzeń, jak np. ujawnione w patentach USA o numerach 5516781; 6153252; 5665728; 5646160; 5563146; i 5516781 jak również w opublikowanych międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 01/01957, 01/49338, 01/87263, 01/87342, 01/87372, 01/87373, 01/87374, 01/87375, 01/87376 i innych dokumentach patentowych dotyczących stentów i innych urządzeń zawierających leki, wspomnianych w innym miejscu tego opisu. Opisane tu rapalogi są w szerokim zakresie kompatybilne z szeregiem projektów stentów i ze sposobami i materiałami do powlekania lub wypełniania ich lekiem w inny sposób.

Ogólnie mówiąc, urządzenie będące nośnikiem rapalogu, zawiera rozprężalną strukturę, która jest implantowana do światła przewodu wewnątrz organizmu i środki na zewnątrz lub wewnątrz struktury służące do uwalniania związku, w pewnych przypadkach, z wybraną uprzednio szybkością. Uwalnianie związków może zachodzić z szybkością w zakresie od 5 pg/dzień do 200 pg/ dzień, korzystnie w zakresie od 10 pg/dzień do 60 pg/dzień. Całkowita ilość uwolnionego związku w pewnych przypadkach jest w zakresie od 100 pg do 10 mg, korzystnie od 300 pg do 2 mg, bardziej korzystnie od 500 pg do 1,5 mg.

Rozprężalna struktura może mieć postać stentu, który dodatkowo utrzymuje drożność przewodu, lub może mieć postać wszczepu, który dodatkowo ochrania lub zwiększa wytrzymałość ściany przewodu. Rozprężalna struktura może rozszerzać się radialnie i/lub rozprężać się samoczynnie i korzystnie jest odpowiednia do umieszczenia wewnątrz światła przewodu w organizmie. Miejscem implantacji może być dowolne naczynie krwionośne w obrębie układu naczyniowego pacjenta, w tym żyły, tętnice, aorta, a w szczególności, tętnice wieńcowe i obwodowe, jak również uprzednio implantowane wszczepy, przyrządy zmieniające kierunek przepływu, przetoki i podobne. Miejscem implantacji mogą również być inne przewody organizmu, takie jak przewód żółciowy lub inne narządy, takie jak narządy, nerwy, gruczoły, przewody i podobne. Przykładowym stentem do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jest dostępny na rynku Duraflex Coronary Stent (Avantec).

Przez określenie „rozprężalny radialnie należy rozumieć, że urządzenie lub jego element mogą być przekształcone z konfiguracji o małej średnicy do konfiguracji radialnie rozszerzonej, zwykle cylindrycznej, która jest osiągana, gdy urządzenie jest implantowane do żądanego miejsca docelowego. Urządzenie może mieć właściwości minimalnie sprężynujące, np. ciągliwe, może więc wymagać zastosowania wewnętrznej siły do rozprężenia i usytuowania w miejscu docelowym. Zwykle, siła rozprężająca może być dostarczona przez balon, taki jak balon cewnika do angioplastyki, stosowanego w procedurach naczyniowych. Urządzenie może mieć esowate połączenia pomiędzy następującymi po sobie jednostkowymi segmentami, co jest szczególnie użyteczne dla zwiększania giętkości stentu i podatności na zgięcia.

Alternatywnie, urządzenie może być samorozprężalne. Takie samorozprężalne struktury są wytwarzane z zastosowaniem sprężystego materiału, takiego jak hartowana stal nierdzewna lub bardzo elastyczny stop, taki jak stop Nitinol™. Po uwolnieniu z ograniczeń tj. po uwolnieniu od działania radialnych sił ograniczających osłonki, struktury te kształtują odcinek organizmu w taki sposób, że przyjmuje on pożądany, radialnie rozszerzony kształt. Aby urządzenie pozostało zakotwiczone w przewodzie organizmu, pozostaje ono częściowo ograniczone przez światło przewodu. Samorozprężające urządzenie może być wprowadzone i dostarczone w radialnie ograniczonej konfiguracji, np. przez umieszczenie urządzenia we wprowadzającej osłonie lub rurce i usunięcie osłony w miejscu docelowym.

Wymiary urządzenia będą zależne od jego przeznaczenia. Zwykle, dla zastosowań naczyniowych, urządzenie będzie miało długość w zakresie od około 5 mm do 100 mm, zwykle od około 8 mm do około 50 mm. Dla zastosowań naczyniowych, mała (zapadnięta radialnie) średnica cylindrycznego urządzenia będzie zwykle mieścić się w zakresie od 0,8 mm do 8 mm. Dla zastosowań naczyniowych, rozprężona średnica będzie zwykle mieścić się w zakresie od około 1,0 mm do 100 mm, korzystnie w zakresie od około 2 mm do 30 mm. Wysokość urządzenia będzie mieścić się w zakresie od 0,025 mm do 2,0 mm, korzystnie w zakresie od 0,05 mm do 0,5 mm.

PL 216 224 B1

Segmenty urządzenia mogą być wytworzone z konwencjonalnych materiałów używanych do produkcji stentów i wszczepów do przewodów wewnątrz organizmu i zwykle są wykonywane z podatnych metali, takich jak nierdzewna stal serii 300 lub ze sprężynujących metali, takich jak superelastyczne i zapamiętujące kształt stopy np. stopy NitinolTM, sprężysta nierdzewna stal i podobne. Istnieje możliwość wykonania segmentów urządzenia z kombinacji tych metali lub kombinacji tych typów metali i innych materiałów niemetalicznych. Dodatkowe struktury urządzeń lub ich jednostkowych segmentów są zilustrowane w patentach USA o numerach 5195417; 5102417; i 4776337. Przykładowe stenty i opóźnione lub stopniowo opóźnione uwalnianie leku, obejmujące uwalnianie z ustaloną uprzednio szybkością, zostały opisane w patencie USA nr 6471980.

Przykładowo, środek do uwalniania związku może zawierać matrycę uformowaną ponad co najmniej częścią struktury. Matryca może być złożona z ulegającego degradacji, częściowo ulegającego degradacji lub nieulegającego degradacji syntetycznego lub naturalnego materiału polimerowego. Związek może być rozmieszczony w matrycy lub może przylegać do matrycy w sposób, który zapewnia żądaną szybkość uwalniania. Alternatywnie, dla zapewnienia żądanej szybkości uwalniania, związek może być rozmieszczony na lub w obrębie rozprężalnej struktury przylegającej do matrycy. Wśród różnych polimerycznych substratów stosowanych do tego celu, odpowiednie, ulegające degradacji lub erozji biologicznej, materiały tworzące matrycę obejmują polibezwodniki, poliortoestry, polikaprolaktony, poli(octan winylu), poli(hydroksymaślan-walerianian), kwas poliglikolowy, kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego i inne alifatyczne poliestry. Często preferowanym, ulegającym degradacji biologicznej materiałem matrycy, jest kopolimer kwasu l-mlekowego i e-kaprolaktonu. Odpowiednie nieulegające degradacji materiały matrycy obejmują poliuretan, polietylenoiminę, octano-maślan celulozy, kopolimer etylenu i alkoholu winylowego lub podobne.

Matryca polimerowa może ulegać degradacji poprzez degradację w masie (tj. taką, w której matryca ulega zupełnej degradacji) lub degradację powierzchniową (tj. taką, w której powierzchnia matrycy ulega degradacji w czasie, przy utrzymaniu integralności całości). Czasem preferowane są matryce hydrofobowe, ponieważ mają one tendencję do uwalniania związku z uprzednio ustaloną szybkością. Alternatywnie, do uwalniania substancji drogą dyfuzji, może być stosowana matryca nieulegająca degradacji.

W niektórych przypadkach, matryca może zawierać liczne przylegające warstwy z tego samego lub różnego materiału matrycy, z co najmniej jedną warstwą zawierającą związek i inną warstwą zawierającą związek, co najmniej jedną substancję inną niż związek, lub bez substancji. Na przykład, związek zawarty w górnej, ulegającej degradacji, warstwie matrycy jest uwalniany podczas degradacji tej warstwy, a druga substancja, zawarta w przylegającej, nieulegającej degradacji warstwie matrycy, jest uwalniana zasadniczo na drodze dyfuzji. W pewnych przypadkach, w obrębie pojedynczej warstwy matrycy mogą być zawarte liczne substancje. Ewentualna substancja stosowana dodatkowo do związku według wynalazku może być przykładowo wybrana spośród substancji wymienionych w patencie USA nr 6471980.

Dodatkowo, może zostać wytworzona bariera ograniczająca szybkość uwalniania, przylegająca do struktury i/lub matrycy. Takie bariery ograniczające szybkość uwalniania mogą być wykonane z materiałów nieulegających erozji i degradacji, takich jak silikon, politetrafluoretylen (PTFE), parylen i PARYLAST™, i mogą kontrolować szybkość przepływu uwalniania poprzez ograniczającą szybkość barierę. Dodatkowo, nad matrycą lub barierą ograniczającą mogą być wytworzone biokompatybilne lub kompatybilne wobec krwi warstwy, takie jak glikol polietylenowy (PEG), powodując, że protezę dostarczającą bardziej biokompatybilną.

Środki do uwalniania związku mogą zawierać barierę ograniczającą szybkość uwalniania utworzoną ponad co najmniej częścią struktury. Związek może być zawarty w obrębie bariery lub może przylegać do bariery. Bariera ograniczająca szybkość może mieć grubość wystarczającą do zapewnienia żądanej szybkości uwalniania związku. Bariery ograniczające szybkość, dla zapewnienia uwalniania związku z żądaną szybkością, będą zwykle miały całkowitą grubość w zakresie od 0,01 ąm do 100 ąm, korzystnie od 0,1 ąm do 10 ąm. Bariera ograniczająca szybkość jest zwykle wytworzona z materiału nieulegającego erozji, takiego jak silikon, PTFE, PARYLAST™, poliuretan, parylen lub ich kombinacji, a uwalnianie związku poprzez taką ograniczająca szybkość barierę zachodzi zwykle drogą dyfuzji. W niektórych przypadkach, bariera ograniczająca szybkość może zawierać wiele przylegających warstw z tego samego lub różnych materiałów, przy czym co najmniej jedna warstwa zawiera związek a inna warstwa zawiera związek i co najmniej jedną substancję inną niż związek, lub nie zawiera substancji. W pojedynczej warstwie bariery mogą być również zawarte liczne substancje.

PL 216 224 B1

W innym przypadku, środek do uwalniania substancji zawiera na strukturze lub w jej obrębie, zbiornik zawierający związek i pokrywkę nad zbiornikiem. Pokrywka może ulegać degradacji lub częściowej degradacji w ustalonym uprzednio czasie, zapewniając żądaną szybkość uwalniania związku. Pokrywka może zawierać polimerową matrycę, taką jak opisana poniżej, która utrzymuje związek w obrębie zbiornika. Dodatkowo, może zostać utworzona bariera ograniczająca szybkość, np. z silikonu, która przylega do zbiornika i/lub pokrywki, co umożliwia uwalnianie związku drogą dyfuzji poprzez tę barierę ograniczającą szybkość. Alternatywnie, pokrywka może być nieulegającą degradacji matrycą lub barierą ograniczającą szybkość.

Inne urządzenie zawiera rozprężającą się strukturę przeznaczoną do implantacji do przewodów w obrębie organizmu, posiadającą na powierzchni barierę ograniczającą szybkość. Umożliwia to uwalnianie związku z uprzednio ustaloną szybkością, np. szybkością wybraną tak, aby hamować prol iferację komórek mięśni gładkich. Bariera zawiera liczne warstwy, z których każda zawiera PARYLAST™ lub parylen i ma grubość rzędu 50 nm -10 ąm. Co najmniej jedna warstwa zawiera związek a inna warstwa zawiera związek, co najmniej jedną substancję inną niż związek lub nie zawiera substancji.

Innym takim urządzeniem jest proteza naczyniowa, która zawiera rozprężającą się strukturę, źródło związku na powierzchni lub w obrębie struktury i ewentualnie, dodatkowo do związku znajdującego się na lub w obrębie struktury, źródło co najmniej jednej innej substancji. Związek jest uwalniany ze źródła wtedy, gdy rozprężająca się struktura zostanie implantowana do naczynia krwionośnego. Ewentualna substancja dodatkowa jest również uwalniana z jej źródła wtedy, gdy rozprężająca się struktura zostanie implantowana do naczynia krwionośnego. Każde źródło może zawierać matrycę, błonę ograniczającą szybkość, zbiornik lub inny środek kontrolujący szybkość uwalniania, jak opisane w niniejszym opisie. Przykłady ewentualnych substancji dodatkowych obejmują substancje immunosupresyjne (np. kwas mykofenolowy lub jego analog), środek przeciwpłytkowy, środek przeciwzakrzepowy lub środek Ilb/IIIa taki jak ujawniony w patencie USA nr 6,471,980.

Tak więc, w niniejszym opisie ujawniono sposoby hamowania restenozy po rekanalizacji naczynia krwionośnego. Na przykład, jeden ze sposobów obejmuje implantowanie protezy naczyniowej, zawierającej opisany tu związek, do przewodu organizmu, takiego jak na przykład naczynie wieńcowe lub obwodowe, w celu zapobieżenia jego ponownemu zamknięciu. Następnie uwalniany jest związek, w pewnych przypadkach z szybkością wybraną tak, aby hamowała proliferację komórek mięśni gładkich. Uwalnianie związku może zachodzić natychmiast po wprowadzeniu lub rozprężeniu stentu lub może być opóźnione. Tak więc, w pewnych przypadkach istotne uwalnianie związku może być opóźnione po implantacji protezy o co najmniej godzinę. Opóźnione uwalnianie ze zbiornika może być zapewnione przez zastosowanie materiału, który w środowisku naczyniowym ulega w ciągu jednej godziny co najmniej częściowej degradacji. W pewnych przypadkach uwalnianie może być spowolnione przez zastosowanie matrycy, która w ciągu co najmniej jednej godziny w środowisku naczyniowym ulega częściowej degradacji. W innych przypadkach, uwalnianie może być spowolnione przez zastosowanie matrycy nieulegającej degradacji lub bariery ograniczającej szybkość uwalniania, która pozwala na dyfuzję związku poprzez tę nieulegająca degradacji matrycę lub barierę po jednej godzinie. Uwalnianie związku będzie zwykle zachodzić z szybkością w zakresie od 5 ąg/dzień do 200 ąg/dzień, korzystnie w zakresie od 10 ąg/dzień do 60 ąg/dzień. Zwykle, w środowisku naczyniowym, związek jest uwalniany czasie od 1 dnia do 45 dni, korzystnie w czasie od 7 dni do 21 dni.

Urządzenie może być powlekane matrycą lub barierą poprzez rozpylanie, zanurzanie, osadzanie lub malowanie. Takie powłoki mogą być niejednorodne. Na przykład, powłoka może być nałożona tylko na jedną stronę protezy lub może być grubsza z jednej strony. Podobnie, związek może być włączony do urządzenia za pomocą powlekania, rozpylania, zanurzania, osadzania, wiązania chemicznego lub malowania związkiem całkowitej lub częściowej powierzchni urządzenia.

W przypadkach, w których urządzenie oprócz związku zawiera również co najmniej jedną substancję dodatkową, związek może być uwalniany w czasie od 1 do 45 dni, a substancja lub substancje dodatkowe, mogą być uwalniane w czasie od 2 dni do 3 miesięcy. Tak więc, uwalnianie związku i substancji dodatkowej (-ych) może być jednoczesne lub sekwencyjne.

Całkowita ilość uwalnianego związku zależy częściowo od stopnia i zakresu uszkodzenia naczynia. W niektórych przypadkach, szybkość uwalniania będzie w zakresie od 100 ąg do 10 mg, korzystnie od 300 ąg do 2 mg, bardziej korzystnie od 500 ąg do 1,5 mg. Często jest korzystne, aby szybkość uwalniania w początkowej fazie wynosiła od 0 ąg/dziennie do 50 ąg/dzień, zwykle od ąg/dzień do 30 ąg/dzień. Szybkość uwalniania związku w następnej fazie będzie znacznie większa,

PL 216 224 B1 typowo w zakresie od 5 ąg/dzień do 200 ąg/dzień, zwykle od 10 ąg/dzień do 100 ąg/dzień. Tak więc, początkowa szybkość uwalniania typowo stanowi od 0% do 99% kolejnych szybkości uwalniania, zwykle od 0% do 90%, korzystnie od 0% do 75%. Stężenie związku w tkance ssaka w fazie początkowej typowo wynosi od 0 ąg/mg tkanki do 100 ąg/mg tkanki, korzystnie od 0 ąg/mg tkanki do 10 ąg/mg tkanki. Stężenie substancji w tkance ssaka w kolejnej fazie będzie typowo mieścić się w zakresie od 1 pg/mg tkanki do 100 ąg/mg tkanki, korzystnie od 1 ng/mg do 10 ąg/mg tkanki.

Czas trwania początkowej, następnej i każdej innej dodatkowej fazy może być różny. Typowo, faza początkowa będzie trwała wystarczająco długo, aby umożliwić początkowy rozwój komórek lub powstawanie śródbłonka przynajmniej w części stentu i zwykle wynosi mniej niż 12 tygodni, częściej od 1 godziny do 8 tygodni, bardziej korzystnie od 12 godzin do 2 tygodni, a najbardziej korzystnie od 1 dnia do 1 tygodnia. Czas trwania następnych faz może również być różny i typowo wynosi od 4 godzin do 24 tygodni, częściej od 1 dnia do 12 tygodni, bardziej korzystnie w środowisku naczyniowym od 2 dni do 8 tygodni, a najbardziej korzystnie w środowisku naczyniowym od 3 dni do 50 dni.

W pewnych przypadkach, profil uwalniania związku w ustalonym uprzednio czasie, może umożliwiać większą szybkość uwalniania podczas fazy początkowej, typowo od 40 ąg/dzień do 300 ąg/dzień, zwykle od 40 ąg/dzień do 200 ąg/dzień. W takich przypadkach, uwalnianie związku podczas następnej fazy będzie znacznie mniejsze, typowo w granicach od 1 ąg/dzień do 100 ąg//dzień, zwykle od 10 ąg/dzień do 40 ąg/dzień. Czas trwania fazy początkowej, w której zachodzi szybsze uwalnianie, będzie mieścić się w zakresie od 1 dnia do 7 dni, a czas trwania następnej fazy wolniejszego uwalniania - w zakresie od 2 dni do 45 dni. Stężenie substancji w tkance ssaka w fazie początkowej trwającej 1-7 dni będzie typowo mieścić się w zakresie od 10 nanogramów/mg tkanki do 100 ąg/mg tkanki. Stężenie substancji w tkance ssaka w następnej fazie trwającej 2-45 dni będzie typowo mieścić się w zakresie od 0,1 ąg/mg tkanki do 10 ąg/mg tkanki. W innych przypadkach, uwalnianie związku może mieć wartość stałą mieszczącą się w zakresie od 5 ąg/dzień do 200 ąg/dzień, przez czas od 1 dnia do 45 dni. Stężenie substancji w tkance ssaka w tym czasie, trwającym 1-45 dni będzie typowo mieścić się w zakresie od 1 ng/mg tkanki do 10 ąg/mg tkanki.

Środek uwalniający związek może zawierać matrycę lub powłokę utworzoną na co najmniej części urządzenia, przy czym matryca składa się z materiału który ulega degradacji. Związek może być zawarty w matrycy w sposób, który umożliwia osiągnięcie żądanych szybkości uwalniania. Alternatywnie, w celu umożliwienia osiągnięcia żądanych szybkości uwalniania, związek może być zawarty w obrębie lub na powierzchni urządzenia pod matrycą.

Urządzenie działa jako mechaniczna podpora dla matrycy dostarczającej, umożliwia zastosowanie wielu różnych materiałów. Odpowiednie ulegające biologicznej degradacji lub biologicznej erozji materiały matrycy obejmują, pośród wielu syntetycznych lub naturalnych substancji polimerycznych stosowanych do tego celu, polibezwodniki, poliortoestry, polikaprolakton, poli(octan winylu), poli(hydroksymaślan-hydroksywalerianian), poli(kwas glikolowy), kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego i inne alifatyczne poliestry.

Przykładem biodegradowalnego materiału matrycy, jest kopolimer kwasu l-mlekowego (o średnim ciężarze cząsteczkowym około 200000 daltonów) i e-kaprolaktonu (o średnim ciężarze cząsteczkowym około 30000 daltonów). Poli(e-kaprolakton) (PCL) jest półkrystalicznym polimerem o temperaturze topnienia w zakresie od 59°C do 64°C i czasie degradacji wynoszącym około 2 lat. Poli(kwas l-mlekowy) (PLLA) może być łączony z PCL w celu utworzenia matrycy, która generuje żądane szybkości uwalniania. Korzystny stosunek PLLA do PCL wynosi 75:25 (PLLA/PCL). Jak to zostało ogólnie opisane w publikacji Rajasubramanian i wsp. w ASAIO Journal, 40, str. M584-589 (1994), mieszanka kopolimerów 75:25 PLLA/PCL wykazuje wystarczającą wytrzymałość i właściwości rozciągliwe co umożliwia łatwiejsze powlekanie matrycy PLLA/PLA na rusztowaniu. Dodatkowo, matryca kopolimerów 75:25 PLLA/PCL umożliwia kontrolowane dostarczanie leku w ustalonym uprzednio czasie, ponieważ niższa zawartość PCL powoduje, że mieszanka kopolimerów jest mniej hydrofobowa, a wyższa zawartość PLLA prowadzi do niższej porowatości masy.

Polimerowa matryca może ulegać degradacji przez degradację w masie, w której matryca ulega degradacji zupełnej, lub korzystnie, degradacji powierzchniowej, w której jedynie powierzchnia matrycy ulega degradacji w czasie, zachowując integralność całości. Alternatywnie, matryca może być złożona z materiału nieulegającego degradacji, który uwalnia związek na drodze dyfuzji. Odpowiednie materiały matrycy nieulegające degradacji obejmują poliuretan, polietylenoiminę, octanomaślan celulozy, kopolimer etylenu i alkoholu winylowego lub podobne.

PL 216 224 B1

Matryca może zawierać liczne warstwy, z których każda zawiera związek, inną substancję lub nie zawiera substancji. Górna warstwa może nie zawierać substancji, natomiast warstwa dolna zawiera związek. W miarę jak górna warstwa ulega degradacji, zwiększa się szybkość uwalniania związku. Dodatkowo, można zastosować barierę ograniczającą szybkość, utworzoną pomiędzy urządzeniem a matrycą, lub ewentualnie bariera taka może być utworzona ponad matrycą. Takie bariery ograniczające szybkość mogą być wykonane z materiału nieulegającego erozji i kontrolować szybkość przepływu związku, uwalnianego drogą dyfuzji, poprzez barierę. Odpowiednie, nieulegające erozji bariery ograniczające szybkość obejmują silikon, PTFE, PARYLAST™ i podobne. Dodatkowo, aby zwiększyć kompatybilność urządzenia, ponad matrycą może zostać uformowana warstwa z materiału, takiego jak glikol polietylenowy (PEG) i podobne.

W innym zastosowaniu, urządzenie uwalniające związek zawiera zbiornik ze związkiem na powierzchni lub w obrębie urządzenia i pokrywkę zamykającą zbiornik. Pokrywka ulega degradacji w uprzednio określonym czasie, tak więc uwalnianie związku ze zbiornika zaczyna się w znaczący sposób po upływie uprzednio określonego czasu. Pokrywka, w tym przykładzie, może zawierać matrycę polimerową, taką jak opisana poniżej, która utrzymuje związek w zbiorniku w taki sposób, że matryca jest uzupełniana związkiem ze zbiornika. Pomiędzy zbiornikiem a pokrywką, lub na górnej części pokrywki, może zostać utworzona dodatkowo bariera ograniczająca szybkość, co umożliwia uwalnianie związku poprzez barierę ograniczającą szybkość na drodze dyfuzji.

Sposoby dostarczania związku obejmują dostarczanie protezy przewodowej zawierającej związek lub będącej jego nośnikiem. Proteza jest pokryta matrycą, która ulega degradacji w środowisku naczyniowym. Proteza jest implantowana do przewodu wewnątrz organizmu w taki sposób, że co najmniej część matrycy ulega degradacji w uprzednio wybranym czasie i znaczące uwalnianie związku rozpoczyna się po tym jak ta część matrycy ulegnie degradacji. Ewentualnie, proteza może być powleczona barierą ograniczającą szybkość lub matrycą nieulegającą degradacji, która ma wystarczającą umożliwiającą dyfuzję związku poprzez barierę lub nieulegającą degradacji matrycę. Proteza jest implantowana do przewodu organizmu, tak aby znaczące uwalnianie związku z bariery lub nieulegającej degradacji matrycy rozpoczynało się, korzystnie, po uprzednio określonym czasie. Ponieważ proliferacyjny efekt restenozy objawia się zwykle w okresie od kilku tygodni do kilku miesięcy, w pewnych przypadkach istotne uwalnianie związku w środowisku naczyniowym będzie się zaczynało w czasie od 4 godzin do 24 tygodni, korzystnie w czasie od 1 dnia do 12 tygodni, bardziej korzystnie w czasie od 2 dni do 8 tygodni a najbardziej korzystnie w czasie od 3 dni do 50 dni w środowisku naczyniowym.

Związek może być zawarty w zbiorniku znajdującym się wewnątrz lub na urządzeniu. W tej konfiguracji zbiornik jest pokryty matrycą, tak aby znaczące uwalnianie związku rozpoczynało się po tym, gdy matryca ulegnie wystarczającej degradacji, z odsłonięciem zbiornika. Alternatywnie, związek może być rozmieszczony w matrycy pokrywającej urządzenie. W tej konfiguracji, zewnętrzna warstwa matrycy praktycznie nie zawiera związku i znaczące uwalnianie związku nie rozpoczyna się zanim zewnętrzna warstwa nie ulegnie degradacji. Związek może być ewentualnie rozmieszczony w obrębie lub części urządzenia pokrytego matrycą.

Związek może zostać włączony do protezy przez powlekanie, rozpylanie, zanurzanie, osadzanie lub malowanie. Zwykle, w celu utworzenia roztworu, związek jest rozpuszczany w rozpuszczalniku. Odpowiednie rozpuszczalniki obejmują rozpuszczalniki wodne (np. wodę z buforami pH, środki korygujące pH, sole organiczne i nieorganiczne), alkohole (np. metanol, etanol, propanol, izopropanol, heksanol i glikole), nitryle (np. acetonitryl, benzonitryl i butyronitryl), amidy (np. formamid i N-dimetyloformamid), ketony, estry, etery, DMSO, gazy (np. ditlenek węgla) i podobne. Przykładowo, proteza może zostać spryskana roztworem lub zanurzona w roztworze, a następnie wysuszona, tak aby na powierzchni protezy pozostały kryształy związku. Alternatywnie, proteza może zostać powleczona roztworem matrycy przez rozpylenie, zanurzanie, osadzanie lub malowanie protezy roztworem polimeru. Zwykle polimer jest delikatnie rozpylany na protezie obracającej się na trzpieniu. Grubość pokrywającej matrycy może być kontrolowana przez czas spryskiwania i szybkość obracania trzpienia. Grubość powlekającej matrycy mieści się zwykle w zakresie od 0,01 do 100 ąm, korzystnie od 0,1 ąm do 10 ąm. Po pokryciu protezy związkiem/matrycą, stent może być umieszczony w próżni lub piecu w celu zakończenia odparowywania rozpuszczalnika.

Przykładowy stent ze stali nierdzewnej Duraflex.TM o wymiarach 3,0 mm-14 mm jest spryskiwany roztworem zawierającym 25 mg/ml związku w 100% etanolu, metanolu, acetonie, octanie etylu, chlorku metylenu lub w innym rozpuszczalniku. Następnie stent jest suszony, a rozpuszczalnik odparowywany, pozostawiając związek na powierzchni stentu. Kopolimer PLLA/PCL 75:25 (sprzedawany

PL 216 224 B1 na rynku przez Polysciences) jest przygotowywany w 1,4 Dioxane (sprzedawanym na rynku przez Aldrich Chemicals). Stent obciążony związkiem jest zakładany na trzpień wirujący z prędkością 200 obr./min i za pomocą pistoletu natryskowego (z firmy Binks Manufacturing) na obracającym się, obciążonym związkiem stencie przez 10-30 sekund jest rozprowadzany delikatnie roztwór kopolimeru. Następnie stent jest umieszczany w piecu w 25-35°C na czas do 24 godzin, aby zakończyć odparowywanie rozpuszczalnika.

Alternatywnie, stent zawierający rapalog może być przygotowany i stosowany analogicznie do sposobów opisanych przez Sousa i wsp., Circulation, 2001; 103:192; Sousa i wsp. Circulation, 2001; 104: 2007; i Morice i wsp. N. Engl J Med. 2002; 346 (23): 1773-1780, ale zastępując Sirolimus rapalogiem. Tak więc pacjent z pierwotną chorobą tętnicy wieńcowej i dusznicą bolesną może być leczony poprzez implantację pojedynczego, eluującego rapalog stentu Bx VELOCITY.

W tym przypadku, rapalog jest łączony z mieszaniną nieulegających erozji polimerów (patrz np. Kindt-Larsen i wsp. J Appl Biomater. 1995;6: 75-83; Revell i wsp. Biomaterials. 1998; 19:1579-1586). Warstwa matryca rapalogu-polimeru o grubości 5 μm jest nakładana na powierzchnię ciętego laserowo 316L, zawierającego balon, samorozprężającego stentu Bx VELOCITY (Cordis). Jest to tzw. formulacja szybkiego uwalniania [FR].

Lek jest prawie całkowicie uwalniany w ciągu 15 dni po implantacji.

W celu wytworzenia formulacji o powolnym uwalnianiu [SR], na powierzchnię matrycy zawierającej lek i polimer jest nakładana kolejna warstwa polimeru niezawierająca leku. Ma to na celu stworzenie bariery dla dyfuzji i wydłużenie uwalniania leku do > 28 dni. W ciągu około 30 dni z formulacji o powolnym uwalnianiu powinno zostać uwolnione około 80% rapalogu.

W tym przypadku, stenty niezależnie od rodzaju powlekającej je kompozycji, są wypełnione sta₂ łą ilością leku na jednostkę powierzchni metalu (140 μg leku/cm ).

Opierając się na doświadczeniu z Sirolimusem, poziomy leków we krwi powinny osiągnąć wartości maksymalne po 1 godzinie (~ 2-3 ng/ml, FR; ~ 1 ng/ml, SR) po implantacji i obniżyć się poniżej dolnej granicy możliwości oznaczenia w ciągu 72 godzin. Biorąc pod uwagę, że pacjenci po transplantacji nerki utrzymują przewlekłe poziomy rapamycyny we krwi w zakresie od 8 do 17 ng/ml, szczytowy poziom rapalogu po implantacji tego typu stentu eluującego rapalog powinien być nieistotny.

Będące nośnikami rapalogu, stenty Bx VELOCITY są implantowane zgodnie ze standardową praktyką, po wstępnym rozszerzeniu balonem i następnym zastosowaniu wysokociśnieniowego (>12 atmosfer) balonu. W tym przypadku, stenty mają długość 18 mm i średnicę 3 do 3,5 mm. W celu utrzymania aktywowanego czasu krzepnięcia > 300 sekund, może być podana heparyna. Pacjenci mogą również otrzymywać aspirynę (325 mg, na stałe), rozpoczynając podawanie na co najmniej 12 godzin przed procedurą. Natychmiast po implantacji stentu pacjenci mogą otrzymać 300 mg klopidogrelu, a następnie otrzymywać 75 mg dziennie przez 60 dni.

W innym przypadku, środki do uwalniania związku mogą obejmować zbiornik zawierający związek, znajdujący się na lub w obrębie rusztowania, i zewnętrzne źródło energii kierujące energię na protezę w celu uwolnienia związku po implantacji. Aby utrzymać związek w obrębie zbiornika, ponad zbiornikiem można wytworzyć matrycę. Alternatywnie, środki uwalniające związek mogą obejmować matrycę uformowaną wokół co najmniej części rusztowania wraz ze związkiem umieszczonym pod lub w obrębie matrycy, oraz zewnętrzne źródło energii kierujące energię na protezę w celu uwolnienia związku po implantacji. Odpowiednie źródła energii obejmują ultradźwięki, obrazowanie rezonansem magnetycznym, pole magnetyczne, częstotliwość radiową, zmiany temperatury oraz fale elektromagnetyczne, promienie Rentgena, promieniowanie, ciepło, promieniowanie gamma i mikrofale.

Na przykład, można zastosować ultradźwiękowe zewnętrzne źródło energii o częstotliwości w zakresie od 20 kHZ do 100 MHz, korzystnie od 0,1 MHz do 20 MHz i o natężeniu w zakresie od 2 2 2 2

0,05 W/cm² do 10 W/cm², korzystnie od 0,5 W/cm² do 5 W/cm². Energia ultradźwiękowa powinna być skierowana na protezę z odległości w zakresie od 1 mm do 30 cm, korzystnie od 1 cm do 20 cm. Ultradźwięki mogą być stosowane w sposób ciągły lub pulsacyjnie, przez czas w zakresie od 5 sekund do 30 minut, korzystnie od 1 minuty do 15 minut. Temperatura protezy dostarczającej będzie w tym czasie wynosić od 37°C do 48°C. Ultradźwięki mogą być stosowane do zwiększania porowatości protezy, umożliwiając uwalnianie związku z protezy.

W jednym przypadku, środki do uwalniania związku obejmują cząstki magnetyczne połączone ze związkiem i źródło magnetyczne kierujące po implantacji pole magnetyczne na protezę, w celu uwolnienia związku. Środki do uwalniania związku mogą ewentualnie obejmować cząstki magnetyczne połączone z matrycą, utworzoną wokół urządzenia, i źródło magnetyczne kierujące po implantacji

PL 216 224 B1 pole magnetyczne na protezę, w celu uwolnienia związku. Związek może być umieszczony pod matrycą lub w jej obrębie. Cząstki magnetyczne mogą być wytworzone z kuleczek magnetycznych i typowo mają wymiary w zakresie od 1 nm do 100 nm. Źródło magnetyczne eksponuje protezę na działanie pola magnetycznego o natężeniu typowo mieszczącym się w zakresie od 0,1 T do 2 T, co aktywuje cząstki magnetyczne i w ten sposób wywołuje uwalnianie związku z protezy.

Związek może być uwalniany do tętnicy, w ten sposób, że proteza jest implantowana do tętnicy i uwalnia związek. Sposób ten wymaga implantowania protezy, która jest tak zaprogramowana, że korzystnie, rozpoczyna znaczące uwalnianie związku po rozroście wokół części protezy co najmniej jednej warstwy komórek. Komórki należą typowo do komórek zapalnych, komórek mięśni gładkich lub komórek śródbłonka, wskazując na rozpoczynanie się procesu restenozy.

Możliwe jest również ustalanie położenia protezy dostarczającej związek w przewodzie w obrębie organizmu. Jedno podejście polega na tym, że do dostarczenia protezy do miejsca zwężenia w naczyniu krwionośnym stosowany jest cewnik z balonem rozszerzającym. Początkowo, proteza jest przenoszona w swej konfiguracji z radialnie zapadniętym wymiarem, na balonie z wypuszczonym gazem. Cewnik z balonem jest wprowadzany na drucie prowadzącym, kierowanym pod kontrolą fluoroskopii. Cewniki i druty wiodące, w celu osiągnięcia dostępu do tętnic wieńcowych, mogą być wprowadzane poprzez konwencjonalne miejsca dostępu do układu naczyniowego, takiego jak tętnica udowa, ramienna, podobojczykowa lub promieniowa. Gdy proteza dostarczająca jest prawidłowo umiejscowiona w rejonie zwężenia, balon jest nadmuchiwany, co powoduje radialne rozprężenie protezy w rejonie zwężenia. Następnie, gaz może zostać wypuszczony z balonu a cewnik może zostać wycofany po drucie wiodącym. Po usunięciu druta wiodącego, rozprężona proteza pozostaje na miejscu, dostarczając związek do opisanego poniżej przewodu, w celu hamowania powstawania restenozy.

Na ogół, możliwe jest łączenie elementów różnych protez i sposobów leczniczych opisanych poniżej. Na przykład, proteza posiadająca zbiornik uwalniający lek może dodatkowo zawierać barierę ograniczającą szybkość. Dodatkowo, można łączyć angioplastykę balonem i/lub inne sposoby leczenia interwencyjnego. Ma to na celu rozwiązanie problemu zwężenia, za pomocą opisanych w niniejszym opisie sposobów leczenia polegających na dostarczaniu związku do przewodu.

Formulacje, kompozycje farmaceutyczne, dawkowanie i podawanie.

Rapalogi mogą występować w postaci wolnej lub, gdy jest to odpowiednie, w postaci soli. Specjalistom w tej dziedzinie znane jest wiele sposobów wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych soli różnych typów związków. Farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują konwencjonalne, nietoksyczne sole, takie jak czwartorzędowe sole amoniowe tworzone przez te związki z nieorganicznymi lub organicznymi kwasami lub zasadami.

Opisane tu związki mogą tworzyć hydraty lub solwaty. Fachowcom w tej dziedzinie wiadomo jest, że naładowane związki, gdy są liofilizowane z wodą, tworzą hydraty, a gdy są zatężane w roztworze z odpowiednim organicznym rozpuszczalnikiem, tworzą solwaty.

Wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające terapeutycznie (lub profilaktycznie) skuteczną ilość związku według wynalazku i jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i/lub innych substancji pomocniczych. Nośniki obejmują np. roztwór soli, buforowany roztwór soli, glukozę, wodę, glicerol, etanol i ich kombinacje i są bardziej szczegółowo omawiane poniżej. Jeśli jest to pożądane, kompozycja może zawierać również mniejsze ilości środków zwilżających, emulgujących lub środków buforujących pH. Kompozycja może stanowić ciekły roztwór, zawiesinę, emulsję, tabletkę, pigułkę, kapsułkę, formulację o przedłużonym uwalnianiu lub proszek. Kompozycja może być sformułowana w postaci czopka, z zastosowaniem tradycyjnych środków wiążących i nośników, takich jak triglicerydy. Formulacje doustne mogą zawierać standardowe nośniki, takie jak farmaceutyczne rodzaje mannitolu, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celulozę, węglan magnezu itp. Formułowanie może polegać na mieszaniu, granulowaniu, prasowaniu lub rozpuszczaniu składników odpowiednio do żądanej postaci preparatu. W innym podejściu, kompozycja może być formułowana w postaci nanocząstek.

PL 216 224 B1

Zastosowanym nośnikiem farmaceutycznym może być, na przykład, substancja stała lub ciecz.

Przykładowe nośniki stałe obejmują laktozę, białą glinkę, sacharozę, talk, żelatynę, agar, pektynę, gumę arabską stearynian magnezu, kwas stearynowy i podobne. Stały nośnik może zawierać jedną lub więcej substancji, które mogą również działać jako środki smakowo-zapachowe, smarujące, zwiększające rozpuszczalność, środki zawieszające, wypełniacze, środki poślizgowe, wspomagające prasowanie, środki wiążące lub dezintegrujące tabletek. To może również być substancja enkapsulująca. W przypadku proszków, nośnik jest subtelnie rozdrobnioną substancją stałą, która jest zmieszana z drobno rozdrobnionym składnikiem aktywnym. W przypadku tabletek, składnik aktywny jest mieszany w odpowiednich proporcjach z nośnikiem mającym niezbędne właściwości kompresyjne i prasowany do żądanego kształtu i wymiaru. Proszki i tabletki korzystnie zawierają do 99% składnika aktywnego. Odpowiednie stałe nośniki obejmują na przykład fosforan wapnia, stearynian magnezu, talk, cukry, laktozę, dekstrynę, skrobię, żelatynę, celulozę, metylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidon, woski topniejące w niskich temperaturach i żywice jonowymienne.

Przykładowe nośniki ciekłe obejmują syrop, olej arachidowy, oliwę z oliwek, wodę itp. Ciekłe nośniki stosowane są do przygotowywania roztworów, zawiesin, emulsji, syropów, eliksirów i kompozycji ciśnieniowych. Składnik aktywny może być rozpuszczony lub zawieszony w farmaceutycznie dopuszczalnym ciekłym nośniku, takim jak woda, rozpuszczalnik organiczny, lub w ich mieszaninie, lub w farmaceutycznie dopuszczalnych olejach albo tłuszczach. Ciekły nośnik może zawierać inne odpowiednie farmaceutyczne dodatki, takie jak substancje poprawiające rozpuszczalność, substancje emulgujące, bufory, środki konserwujące, słodzące, smakowe, zawieszające, zagęszczające, barwniki, środki regulujące lepkość, stabilizujące lub regulujące osmolalność. Odpowiednie przykłady ciekłych nośników do podawania doustnego lub pozajelitowego obejmują wodę (częściowo zawierającą dodatki, takie jak wymienione poniżej, np. pochodne celulozy, korzystnie roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy), alkohole (w tym jednowodorotlenowe i wielowodorotlenowe alkohole np. glikole) i ich pochodne, oraz oleje (np. frakcjonowany olej kokosowy i olej arachidowy). Do podawania pozajelitowego, nośnik może stanowić również olejowy ester, taki jak oleinian etylu i mirystynian izopropylu. Do jałowych ciekłych postaci kompozycji do podawania pozajelitowego użyteczne są jałowe ciekłe nośniki. Ciekłym nośnikiem dla kompozycji pod ciśnieniem może być fluorowcowany węglowodór lub inny farmaceutycznie dopuszczalny propelent. Ciekłe kompozycje farmaceutyczne, które są jałowymi roztworami lub zawiesinami, mogą być podawane na przykład drogą iniekcji dożylnych, domięśniowych, dootrzewnowych lub podskórnych. Iniekcje mogą mieć miejsce przez jednorazowe szybkie wstrzyknięcie lub drogą stopniowego wlewu np. 30 minutowego wlewu dożylnego. Związek może być również podawany doustnie w postaci ciekłej lub stałej kompozycji.

Nośnik lub substancje pomocnicze mogą obejmować substancje opóźniające, których przykłady są dobrze znane w technice, takie jak monostearynian glicerolu lub distearynian glicerolu, i mogą dodatkowo zawierać wosk, etylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, metakrylan metylu i podobne. Przy formułowaniu preparatów do podawania doustnego stwierdzono, że 0,01% Tween 80 w PHOSAL PG-50 (koncentrat fosfolipidowy z 1,2 glikolem propylenowym, A. Natterman & Cie. GmBH) dostarcza dopuszczalnej doustnej formulacji dla innych związków i może być dostosowany do formulacji dla różnych opisanych w niniejszym opisie związków.

Tak więc, do podawania związków według wynalazku, może być zastosowane wiele postaci farmaceutycznych. Jeśli jest stosowany nośnik stały, preparat może być tabletkowany, umieszczany w twardej żelatynowej kapsułce w postaci proszku lub granulek, lub wytwarzany w postaci kołaczyków lub tabletek do ssania. Ilość stałego nośnika będzie się mieścić w szerokich granicach, ale korzystnie będzie wynosić od około 25 mg do około 1 g. Gdy jest stosowany nośnik ciekły, preparat będzie miał postać syropu, emulsji, miękkiej żelatynowej kapsułki, jałowego roztworu lub zawiesiny do wstrzyknięć w ampułce lub fiolce, lub bezwodnej płynnej zawiesiny.

W celu uzyskania stabilnej, rozpuszczalnej w wodzie postaci dawkowania, związek lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, może być rozpuszczony w wodnym roztworze organicznego lub nieorganicznego kwasu, takim jak 0,3 M roztwór kwasu bursztynowego lub cytrynowego. Alternatywnie, kwaśne pochodne mogą być rozpuszczone w odpowiednich roztworach zasad. Jeżeli nie jest dostępna postać rozpuszczalna, związek jest rozpuszczany w odpowiednim ko-rozpuszczalniku lub jego kombinacji. Przykłady odpowiednich ko-rozpuszczalników obejmują, ale nie wyłącznie, alkohol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy 300, polisorbat 80, glicerynę, polioksyetylowane kwasy tłuszczowe, alkohole tłuszczowe lub estry gliceryny hydroksykwasów tłuszczowych i podobne, w stężeniu w zakresie 0-60% całkowitej objętości.

PL 216 224 B1

Do podawania związków znane są i mogą być stosowane różne układy dostarczania lub różne formulacje, obejmujące tabletki, kapsułki, roztwory do wstrzyknięć, związki zamknięte w liposomach, mikrocząstki, mikrokapsułki, itp. Sposoby wprowadzania obejmują, ale nie wyłącznie, drogę przezskórną, śródskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, donosową, płucną, nadtwardówkową, oczną i (zwykle preferowaną) drogę doustną. Związek może być podawany dowolną wygodną, lub z innego względu właściwą drogą, na przykład przez infuzję lub jednorazowe szybkie wstrzyknięcie, przez absorpcję poprzez wyściółki nabłonkowe lub śluzówkowo-skórne (np. błonę śluzową jamy ustnej, błonę śluzową odbytnicy i jelita, itp.), lub poprzez będący nośnikiem związku stent. Związek może być podawany łącznie z innymi biologicznie aktywnymi związkami. Podawanie może mieć charakter ogólnoustrojowy lub miejscowy. Do leczenia lub profilaktyki stanów chorobowych nosa, oskrzeli lub płuc, korzystnymi drogami podawania jest droga doustna, donosowa lub dooskrzelowa (lek w postaci aerozolu lub w nebulizacji).

W pewnych wykonaniach wynalazku może być pożądane podawanie związku miejscowo, w obszarze wymagającym leczenia. Nieograniczającym przykładem takiego podawania może być na przykład miejscowy wlew podczas zabiegu chirurgicznego, zastosowanie miejscowe, przez wstrzyknięcie, za pomocą cewnika, czopka lub przezskórnego plastra, stentu lub innego implantu, przy czym implant jest zwykle porowatym, nieporowatym lub żelatynowym materiałem obejmującym błony, takie jak błony silastikowe lub włókna.

W konkretnym wykonaniu wynalazku, kompozycja jest formułowana jako kompozycja farmaceutyczna do podawania dożylnego ludziom, za pomocą rutynowych sposobów. Zwykle, kompozycje do podawania dożylnego są roztworami w jałowym izotonicznym wodnym buforze. W razie potrzeby, kompozycja może również zawierać środek solubilizujący i środek miejscowo znieczulający, łagodzący ból w miejscu wstrzyknięcia. Ogólnie, składniki są dostarczane lub oddzielnie lub zmieszane razem w jednostkowej postaci dawkowania, na przykład, jako liofilizowany proszek lub bezwodny koncentrat w hermetycznie zamkniętym pojemniku, takim jak ampułka lub saszetka z oznaczoną ilością składnika aktywnego. Jeśli kompozycja ma być podawana w postaci wlewu, może być dozowana w butelce infuzyjnej zawierającej sterylną wodę jakości farmaceutycznej lub roztwór soli fizjologicznej. Jeśli kompozycja jest podawana drogą iniekcji, może być dostarczana ampułka sterylnej wody do iniekcji lub roztworu soli zawierającej sterylną wodę jakości farmaceutycznej lub roztwór soli fizjologicznej, tak że składniki mogą być zmieszane przed podaniem.

Na przykład roztwór rapalogu według wynalazku przeznaczony do wstrzyknięć może zawierać 0,1 do 10 mg/ml, np.

1-3 mg/ml rapalogu w roztworze rozcieńczalnika zawierającym Phosal 50 PG (fosfatydylocholina, glikol propylenowy, mono- i di-glicerydy, etanol, sojowe kwasy tłuszczowe, palmitynian askorbylu) i polisorbat 80, zawierającym 0,5-4% etanolu, np. 1,5%-2,5% etanolu. Jako kolejny przykład, rozcieńczalnik może zawierać 2-8%, np. 5-6%, każdego spośród glikolu propylenowego USP i polisorbatu 80 w wodzie do iniekcji. Stwierdziliśmy, że w pewnych przypadkach dobrze działa zawartość każdego z nich w ilości 5,2%. Typowo, roztwór jest przetwarzany z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów i materiałów, obejmujących np. jeden lub więcej cykli sterylnej filtracji.

Doustne formulacje zawierające związek według wynalazku mogą obejmować dowolne konwencjonalnie stosowane doustne postaci dawkowania, takie jak tabletki, kapsułki, postaci dopoliczkowe, kołaczyki, pastylki do ssania i płyny doustne, zawiesiny lub roztwory. Kapsułki mogą zawierać mieszaniny związku (-ów) aktywnego(-ych) z obojętnymi wypełniaczami i/lub rozcieńczalnikami, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne skrobie (np. skrobia kukurydziana, ziemniaczana, lub tapioka), cukry, sztuczne środki słodzące, sproszkowane celulozy, takie jak celuloza krystaliczna i mikrokrystaliczna, mączki, żelatyny, gumy itp. Użyteczne formulacje w postaci tabletek mogą być wytworzone przez konwencjonalne prasowanie, granulację na mokro lub na sucho i z zastosowaniem farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników, środków wiążących, smarujących, dezintegrujących, środków modyfikujących powierzchniowo (w tym surfaktantów), środków zawieszających lub stabilizujących w tym, ale nie wyłącznie, stearynianu magnezu, kwasu stearynowego, talku, soli sodowej siarczanu Iaurylu, mikrokrystalicznej celulozy, soli wapniowej karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, żelatyny, kwasu alginowego, gumy akacjowej, gumy ksantanowej, cytrynianu sodu, złożonych silikatów, węglanu wapnia, glicyny, dekstryny, sacharozy, sorbitolu, fosforanu diwapnia, siarczanu wapnia, laktozy, kaolinu, mannitolu, chlorku sodu, talku, suchych skrobi i sproszkowanego cukru. Odpowiednie środki modyfikujące powierzchniowo obejmują środki niejonowe i anionowe. Reprezentatywne przykłady środków powierzchniowo modyfikujących obejmują, ale nie wyłącznie, poloksamer

PL 216 224 B1

188, chlorek benzalkonium, stearynian wapnia, alkohol cetostearylowy, emulgujący wosk cetomakrogol, estry sorbitanu, koloidalny ditlenek silikonu, fosforany, dodecylosiarczan sodu, krzemian glinu i magnezu i trietanolaminę. W doustnych formulacjach opisanych w niniejszym opisie mogą być wykorzystane standardowe formulacje o opóźnionym uwalnianiu, zmieniające wchłanianie związku(-ów) aktywnego(-ych). Doustne formulacje do podawania składnika aktywnego w wodzie lub soku owocowym mogą również w miarę potrzeby zawierać odpowiednie substancje poprawiające rozpuszczalność lub emulgujące. Doustne formulacje, które można adaptować do stosowania z rapalogami według wynalazku są ujawnione w patentach USA o numerach 5559121; 5536729; 5989591; 5985325; 5145684 (nanocząstki); 6197781; i WO 98/56358. Tabletki zawierające rapalog według wynalazku mogą zawierać konwencjonalne składniki nieaktywne obejmujące, na przykład, sacharozę, laktozę, glikol polietylenowy 8000, siarczan wapnia, mikrokrystaliczną celulozę, glazurę jakości farmaceutycznej, talk, ditlenek tytanu, stearynian magnezu, powidon, poloksamer 188, glikol polietylenowy 20000, monooleinian glicerolu, wosk karnauba i inne składniki. Mogą być również stosowane kompozycje złożone z nanocząstek. W takich przypadkach, nanocząstki są wytwarzane z kompozycji zawierających (na podstawie stosunku wagowo/wagowego) 1-20% rapalogu, 70-95% obojętnej substancji, takiej jak sacharoza, 0,1 do 4% substancji, takiej jak poliwinylopirolidon i chlorek benzalkonium i 0-1% surfaktanta, takiego jak Tween. Taka przykładowa kompozycja zawiera około 15% rapalogu, 81% sacharozy, 2% poliwinylopirolidonu, 2% chlorku benzalkonium i 1% Tweenu.

W pewnych przypadkach może być pożądane podawanie związku bezpośrednio do dróg oddechowych w postaci aerozolu.

Można również podawać danemu osobnikowi skuteczną ilość związku(-ów) miejscowo, bezpośrednio do obszaru objętego procesem chorobowym na skórze tego osobnika. W tym celu, związek jest podawany lub stosowany w kompozycji zawierającej farmakologicznie dopuszczalny nośnik do podawania miejscowego, taki jak żel, maść, lotion, lub krem, który zawiera, ale nie wyłącznie, nośniki, takie jak woda, glicerol, alkohol, glikol propylenowy, alkohole tłuszczowe, triglicerydy, estry kwasów tłuszczowych lub oleje mineralne.

Inne nośniki do podawania miejscowego obejmują palmitynian izopropylu, glikol polietylenowy, etanol (95%), monolaurynian polioksyetylenu (5%) w wodzie, lub sól sodową siarczanu laurylu (5%) w wodzie. W miarę potrzeby, można dodać inne substancje, takie jak antyoksydanty, środki utrzymujące wilgoć, stabilizatory lepkości i podobne. Mogą być również dołączone środki wzmagające przezskórną penetrację, takie jak Azone.

Dodatkowo, w pewnych przypadkach, oczekuje się, że związki mogą wchodzić w skład przezskórnych urządzeń umieszczonych na skórze, w jej obrębie lub pod skórą. Takie urządzenia obejmują plastry, implanty i iniekcje, które uwalniają związek do skóry lub przez bierny albo aktywny mechanizm uwalniania. Dla celów niniejszego ujawnienia, jako podawanie przezskórne należy rozumieć wszystkie sposoby podawania przez powierzchnię ciała i wewnętrzne wyściółki kanałów ciała, w tym tkanki nabłonkowe i błony śluzowe. Takie podawanie może być przeprowadzone przez podawanie związków lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w lotionach, kremach, piankach, plastrach, zawiesinach, roztworach i czopkach (odbytniczych i dopochwowych).

Podawanie przezskórne można realizować przez zastosowanie przezskórnych plastrów zawierających związek aktywny i nośnik, który jest obojętny względem związku aktywnego, jest nietoksyczny wobec skóry i umożliwia wchłanianie związku do ogólnoustrojowego krwioobiegu poprzez skórę. Nośnik może mieć różną postać, taką jak kremy i maści, pasty, żele i urządzenia okluzyjne. Kremy i maści mogą być lepkimi płynami lub półstałymi emulsjami typu olej w wodzie lub woda w oleju. Przydatne mogą być również pasty zawierające chłonne proszki zdyspergowane w wazelinie lub wazelinie hydrofilowej zawierającej składnik aktywny. W celu uwalniania składnika aktywnego do krwioobiegu może być stosowanych wiele różnych urządzeń okluzyjnych, takich jak półprzepuszczalne błony pokrywające zbiornik zawierający związek aktywny z nośnikiem lub bez nośnika, lub matrycę zawierającą składnik aktywny. W literaturze znane są również inne urządzenia okluzyjne.

Formulacje w postaci czopków mogą być wytwarzane z tradycyjnych materiałów, obejmujących masło kakaowe, z dodatkiem lub bez dodatku wosków, w celu zmiany temperatury topnienia czopka i gliceryny. Mogą być również stosowane rozpuszczalne w wodzie podłoża, takie jak glikole polietylenowe o różnym ciężarze cząsteczkowym.

Materiały i sposoby wytwarzania różnych formulacji są znane w technice i mogą być adaptowane do zastosowania w wynalazku, patrz np. patenty USA o numerach 5182293 i 4837311 (tabletki, kapsułki i inne formulacje zarówno doustne jak i dożylne) i europejskie zgłoszenia patentowe nr 0 649 659 (opuPL 216 224 B1 blikowane 26 kwietnia 1995 r., ilustrujące formulację do podawania dożylnego) oraz 0 648 494 (opublikowane 19 kwietnia 1995 r.; ilustrujące formulację do podawania doustnego). Patrz również patenty USA o numerach 5145684; (nanocząstki) i 5989591 (stałe postaci dawkowania) i WO 98/56358, jak również YU, K i wsp., Endocrine-Related Cancer (2001) 8, 249-258 i Geoerger i wsp. Cancer Res. (2001)61 1527-1532.

Skuteczna ogólnoustrojowa dawka związku będzie zwykle mieścić się w zakresie od około 0,01 do około 100 mg/kg, korzystnie około 0,1 do około 10 mg/kg ciężaru ciała ssaka, podawana w dawce pojedynczej lub kilku dawkach. Zwykle, związek może być podawany, pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia, w dawce dziennej mieszczącej się w granicach od około 1 do około 2000 mg na pacjenta. Podawanie może mieć miejsce raz lub kilka razy dziennie, raz w tygodniu (lub w innych kilkudniowych przedziałach) lub w według schematu nieciągłego. Na przykład, związek może być podawany raz lub kilka razy dziennie w schemacie tygodniowym (np. w każdy poniedziałek) przez kilka tygodni, np. 4-10 tygodni. Alternatywnie, może być podawany codziennie w ciągu kilku dni (np. 2-10 dni), po których następuje kilka dni (np. 1-30 dni) bez podawania związku. Taki cykl może być powtarzany określoną ilość razy, np. 4-10 cykli. Jako przykład, przeciwnowotworowy związek według wynalazku, może być podawany raz dziennie przez 5 dni, następnie odstawiony na 9 dni, następnie podawany raz dziennie przez kolejny okres 5 dni, ponownie odstawiony na 9 dni i tak dalej. Cykl taki powtarza się 4 do 10 razy.

Ilość związku, która będzie skuteczna w leczeniu lub zapobieganiu poszczególnym schorzeniom lub stanom będzie zależała częściowo od dobrze znanych czynników wpływających na dawkę leku. W przypadku zastosowań w terapii genowej lub komórkowej, ilość ta będzie również zależna od cech charakterystycznych białek fuzyjnych, które mają ulec multimeryzacji, cech charakterystycznych i lokalizacji genetycznie modyfikowanych komórek, oraz od natury schorzenia lub stanu, które mogą być określone za pomocą standardowych technik klinicznych. Dodatkowo, w celu ułatwienia identyfikacji optymalnych zakresów dawek, mogą być stosowane oznaczenia przeprowadzane in vitro lub in vivo. Skuteczne dawki mogą być ekstrapolowane z krzywych zależności dawka-odpowiedź, wyprowadzonych z modelowych układów testowych przeprowadzanych in vitro lub na zwierzętach. Precyzyjny poziom dawkowania powinien być okreśIony przez lekarza prowadzącego lub innego członka personelu medycznego i będzie zależny od dobrze znanych czynników, obejmujących drogę podawania, wiek, ciężar ciała, płeć i ogólny stan zdrowia osobnika; charakter, stopień zaawansowania klinicznego choroby; zastosowanie (lub nie) współistniejących terapii oraz natury i zakresu inżynierii genetycznej w komórkach pacjenta.

Przy podawaniu w celu leczenia lub hamowania poszczególnego stanu chorobowego lub schorzenia, skuteczna dawka rapalogu według wynalazku może być różna, zależnie od konkretnego stosowanego związku, schematu podawania, stanu chorobowego i jego ciężkości, stanu podlegającego leczeniu, jak również od różnorodnych czynników fizycznych związanych z leczonym osobnikiem. W wielu przypadkach, satysfakcjonujące wyniki można osiągnąć stosując rapalog w dziennej dawce od około 0,01 mg/kg-100 mg/kg, korzystnie w zakresie 0,01-25 mg/kg, a bardziej korzystnie w zakresie 0,01-5 mg/kg. Należy oczekiwać, że proponowane dzienne dawki będą się różnić w zależności od drogi podawania. Tak więc, dawkowanie pozajelitowe będzie na poziomie wynoszącym w przybliżeniu 10-20% doustnego poziomu dawkowania.

Jeśli rapalog jest stosowany jako składnik schematu leczenia skojarzonego, podczas pożądanego okresu leczenia podawane są dawki każdego ze składników. Składniki schematu leczenia skojarzonego mogą być podawane w tym samym czasie; albo jako jednostkowe postaci dawkowania zawierające oba składniki, albo jako oddzielne jednostki dawkowania. Składniki takiego schematu mogą być również podawane w różnym czasie, podczas okresu leczenia, lub jeden ze składników może być podawany jako leczenie wstępne dla drugiego.

Poniższe przykłady zawierają ważne dodatkowe informacje i wskazówki, które mogą być adaptowane do realizacji wynalazku w jego różnych wykonaniach i ich ekwiwalentach. Przykłady są tu podane w celu ilustracji wynalazku. Zawartość wszystkich cytowanych odsyłaczy obejmujących odsyłacze do literatury, wydanych patentów i opublikowanych zgłoszeń patentowych, cytowanych w tym dokumencie jest wyraźnie włączona przez odniesienie. W praktyce niniejszego wynalazku będą stosowane, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki syntetycznej chemii organicznej, obejmujące odzyskiwanie, oczyszczanie i formułowanie produktu, jak również techniki z zakresu biologii i hodowli komórek, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii, które są w zakresie umiejętności specjalisty z danej dziedziny. Takie techniki są w pełni

PL 216 224 B1 wyjaśnione w literaturze patentowej i naukowej. Patrz na przykład w przypadku technik biologicznych: Molecular Cloning JA Laboratory Manual, wydanie 2, Sambrook, Fritsch i Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, tomy I i II (wyd. D.N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M.J.Gait, 1984); Mullis i wsp. Patent US No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (wyd B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (wyd. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc, 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); traktat „Methods in Enzymology (Academic Press, Inc, N.Y.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (wyd. J.H. Miller i M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology. Tomy 154 i 155 (wyd. Wu i wsp.) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (wyd. Mayer and Walker, Academic Press, Londyn, 1987); Handbook of Experimental Immunology, tomy I-IV (wyd. D.M. Weir i C.C. Blackwell, 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

P r z y k ł a d 1

Ester C-43-rapamycyny i estru etylowego kwasu metylofosfonowego

X°'

Ester etylowy kwasu metylochlorofosfonowego

Do schłodzonego (0°C) roztworu estru dietylowego kwasu metylofosfonowego (15,2 g, 0,1 mola) w benzenie (30 ml) wprowadza się PCI5 (20,8 g, 0,1 mola) w jednej porcji. Mieszaninę reakcyjną miesza się w 0°C w ciągu 2 godzin, po czym rozpuszczalnik i produkt uboczny POCI3 usuwa się w wysokiej próżni. Produkt destyluje się i otrzymuje się 12,7 g bezbarwnego oleju o temperaturze wrzenia 52-54°C / 1 mm Hg; ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 40,7.

Ester C-43-rapamycyny i estru etylowego kwasu metylofosfonowego

Do schłodzonego (0°C) roztworu rapamycyny (0,1 g, 0,109 mmola) w 1,5 ml dichlorometanu wprowadza się roztwór 3,5-lutydyny (0,088 g, 0,82 mmola) w 0,25 ml dichlorometanu w atmosferze N2, po czym natychmiast dodaje się roztwór estru etylowego kwasu metylochlorofosfonowego (0,078 g, 0,547 mmola) w 0,25 ml dichlorometanu. Bezbarwny roztwór reakcyjny miesza się w temperaturze 0°C w ciągu 3 godzin (reakcja monitorowana za pomocą MS; próbki mieszaniny reakcyjnej rozcieńcza się 50:50 CH3CN/H2O, 1 kropla DMSO, bezpośrednio przed analizą). Zimny (0°C) roztwór reakcyjny rozcieńcza się ~ 20 ml EtOAc, po czym przenosi się do rozdzielacza zawierającego EtOAc (150 ml) i nasycony NaHCO3 (100 ml). Po usunięciu warstwy wodnej, warstwę organiczną przemywa się kolejno chłodzonym lodem 1N HCl (1x100 ml), nasyconym roztworem NaHCO3 (1x100 ml) i solanką (1x100 ml), po czym suszy się nad MgSO4 i zatęża. Surowy produkt oczyszcza się drogą chromatografii typu flash na żelu krzemionkowym (eluowanie za pomocą 0,5:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/heksan, otrzymując 0,024 g białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1):

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3) d 4,19 (m, 1Ha, 1Hb), 4,15-4,01 (m, 3Ha, 3Hb), 1,56-1,27 (m, 6Ha, 6Hb); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 32,1, 29,9; 1043 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 1

Synteza alternatywna

Rapamycynę i dichlorometan wprowadza się do reaktora przepłukanego azotem. Roztwór miesza się i chłodzi do około 0°C (temperaturę zewnętrzną -5°C ± 5°C utrzymuje się przez cały czas reakcji). Następnie dodaje się roztwór estru etylowego kwasu metylochlorofosfonowego w dichlorometanie w ciągu około 8-13 minut, po czym natychmiast dodaje się roztwór 3,5-lutydyny w dichlorometanie w ciągu około 15-20 min. W czasie obydwu procesów dodawania utrzymuje się temperaturę wePL 216 224 B1 wnętrzną mieszaniny reakcyjnej poniżej 0°C. Schłodzony roztwór reakcyjny miesza się w ciągu 3 godzin, monitorując przebieg reakcji za pomocą TLC (1:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/heksany) i HPLC w odwróconym układzie faz. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu i poddaje obróbce w sposób poniżej opisany.

P r z y k ł a d 2

Ester C-43-rapamycyny i estru n-butylowego kwasu metylofosfonowego

Do kolby zawierającej 1H-tetrazol (~0,002 g, 0,028 mmola) wprowadza się roztwór n-butanolu (0,041 g, 0,55 mmola) w 0,33 ml DCM, a następnie roztwór 3,5-lutydyny (0,090 g, 0,84 mmola) w 0,33 ml DCM. Uzyskany klarowny roztwór chłodzi się do 0°C, po czym w atmosferze N2 dodaje się roztwór dichlorku metylofosfonowego (0,073 g, 0,55 mmola) w 0,33 ml DCM. Otrzymaną białą zawiesinę miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Do schłodzonego (0°C) roztworu rapamycyny (0,1 g, 0,11 mmola) w 0,5 ml DCM dodaje się roztwór 3,5-lutydyny (0,090 g, 0,84 mmola) w 0,5 ml DCM, a następnie natychmiast dodaje się odczynnik fosforylujący (żółty roztwór z białym osadem) i przemywa się 1,0 ml DCM. Uzyskany żółty roztwór miesza się w temperaturze 0°C w ciągu 1,0 godziny (po czym prowadzi się MS). Schłodzony roztwór reakcyjny (0°C) rozcieńcza się ~20 ml EtOAc, a następnie przenosi się do rozdzielacza zawierającego EtOAc (120 ml) i nasycony roztwór NaHCO3 (100 ml). Po usunięciu warstwy wodnej, warstwę organiczną przemywa się kolejno chłodzonym lodem 1N HCl (1x100 ml), nasyconym roztworem NaHCO3 (3x100 ml) i solanką (1x100 ml), po czym suszy się nad MgSO4 i zatęża się. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii typu flash na żelu krzemionkowym (eluowanie za pomocą 0,25:10:3:3, następnie 0,5:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/heksan), a następnie RP HPLC (85% MeOH/H2O), otrzymując 0,063 g białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ¹H-NMR (300 MHz, CDCl3) d 4,15 (m, 1Ha, 1Hb), 4,11-3,89 (m, 3Ha, 3Hb), 3,04 (m, 1Ha, 1Hb); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 32,1, 29,9; 1071 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 3

Ester C-43-rapamycyny i estru 2-metoksyetylowego kwasu metylofosfonowego

Związek tytułowy wytwarza się analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 2. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 33,0, 30,8; 1073 m/z (M+Na).

PL 216 224 B1

P r z y k ł a d 4

Ester C-43-rapamycyny i estru 2-etoksyetylowego kwasu metylofosfonowego

Związek tytułowy wytwarza się analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 2. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 32,8, 30,8; 1087 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 5

Ester C-43-rapamycyny i estru n-propylowego kwasu metylofosfonowego

Związek tytułowy wytwarza się analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 2. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 32,1, 29,9; 1057 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 6

Ester C-43-rapamycyny i estru izopropylowego kwasu metylofosfonowego

Związek tytułowy wytwarza się analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 2. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 31,3, 28,8; 1057 m/z (M+Na).

PL 216 224 B1

P r z y k ł ad 7

Ester C-43-rapamycyny i estru 2-(2-hydroksyetoksy)etylowego kwasu metylofosfonowego

Związek tytułowy wytwarza się analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 2. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (mieszanina diastereomerów ~2:1): ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 32,7, 30,9; 1103 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 8

Ester C-43-rapamycyny i kwasu diaminofosfinowego

Do roztworu (0°C) rapamycyny (0,109 g, 0,12 mmola) i 4-dimetyloaminopirydyny (0, 072 g, 0,59 mmola) w 5,0 ml DCM wkrapla się, mieszając, tlenochlorek fosforu (0,050 ml, 0,54 mmola). Po upływie 15 minut mieszaninę rozcieńcza się dodatkowo 5,0 ml DCM i chłodzi się do temperatury -78°C. Następnie przez mieszaninę reakcyjną przepuszcza się amoniak w ciągu 2 minut, przy czym wytrąca się gęsty biały osad. Następnie mieszaninę rozdziela się pomiędzy dwufazową mieszaninę 75 ml EtOAc i 25 ml 5% wodnego HCl. Fazę organiczną przemywa się kolejno 25 ml wody i 25 ml solanki, suszy się nad MgSO4 i zatęża się. Uzyskaną pozostałość oczyszcza się za pomocą chromatografii typu flash na żelu krzemionkowym (eluowanie za pomocą dichlorometanu/metanolu 9:1), przy czym otrzymuje się 0,029 g żądanego produktu:

³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) 16,4; 1014 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 9

Ester C-43-rapamycyny i kwasu dimetylofosfinowego

PL 216 224 B1

Ester C-43-rapamycyny i kwasu dimetylofosfinowego

Do schłodzonego (0°C) roztworu rapamycyny (0,1 g, 0,109 mmola) w 1,8 ml dichlorometanu dodaje się 0,168 g (0,82 mmola) 2,6-di-t-butylo-4-metylopirydyny w strumieniu N2, po czym od razu dodaje się roztwór chlorku dimetylofosfinowego (0,062 g, 0,547 mmola) w 0,2 ml dichlorometanu. Jasnożółty roztwór reakcyjny miesza się w temperaturze 0°C w atmosferze N2 w ciągu 3,5 godzin (reakcja monitorowana przez TLC). Schłodzony (0°C) roztwór reakcyjny rozcieńcza się ~20 ml EtOAc i następnie przenosi się do rozdzielacza zawierającego EtOAc (150 ml) i nasycony roztwór NaHCO3 (100 ml). Warstwę wodną oddziela się, warstwę organiczną przemywa się kolejno chłodzonym lodem 1N HCl (1x100 ml), nasyconym roztworem NaHCO3 (1x100 ml) i solanką (1x100 ml), po czym suszy się nad MgSO4 i zatęża się. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii typu flash na żelu krzemionkowym (eluowanie za pomocą 1:10:3:3 •1

MeOH/DCM/EtOAc/heksan), przy czym otrzymuje się 0,092 g białej substancji stałej: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl3) d 4,18 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 1,51 (m, 6H); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 53,6; 1013 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 9

Synteza alternatywna

Rapamycynę i dichlorometan wprowadza się do reaktora przepłukanego azotem. Roztwór mieszając chłodzi się do około 0°C (temperaturę zewnętrzną -5°C ± 5°C utrzymuje się w ciągu całej reakcji). Następnie dodaje się roztwór chlorku dimetylofosfinowego (2,0 równoważniki molowe) w dichlorometanie w ciągu około 8-13 minut, po czym od razu dodaje się roztwór 3,5-lutydyny (2,2 równoważników molowych) w dichlorometanie w ciągu około 15-20 minut. W czasie obydwu procesów dodawania temperaturę wewnętrzną mieszaniny reakcyjnej utrzymuje się poniżej 0°C. Schłodzony roztwór reakcyjny miesza się w ciągu 1 godziny, po czym przenosi się na zimno do ekstraktora zawierającego nasycony wodny roztwór NaHCO3 i eter metylo-t-butylowy (MTBE), octan etylu i eter dietylowy. W czasie procesu pobiera się próbki w odstępach czasowych 30 i 60 minut. Próbki przygotowuje się w sposób analogiczny do opisanego dla obróbki mieszaniny reakcyjnej. Przebieg reakcji monitoruje się za pomocą TLC (1:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/heksany) i HPLC w odwróconym układzie faz. Wyodrębnioną warstwę organiczną przemywa się kolejno chłodzonym lodem 1N HCl, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (2x), nasyconym wodnym NaCl i suszy się nad siarczanem sodu. Po przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika w pozostałości, wymienia się rozpuszczalnik na aceton, po czym zatęża się w próżni, uzyskując surowy produkt, który poddaje się analizie na czystość za pomocą HPLC w normalnym i odwróconym układzie faz.

P r z y k ł a d 10

Ester C-43-rapamycyny i estru dietylowego kwasu fosforowego

O

Związek tytułowy wytwarza się w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 9. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej: ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d ~1,2; 1073 m/z (M+Na).

PL 216 224 B1

P r z y k ł a d 11

Ester C-43-rapamycyny i kwasu difenylofosfinowego

Związek tytułowy wytwarza się w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 9. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej: ³¹P-NMR (121 MHz, CDCI3) d 31,3; 1137 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 12

Ester C-43-rapamycyny i kwasu dietylofosfinowego

Związek tytułowy wytwarza się w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 9. Produkt otrzymuje się w postaci białej substancji stałej: ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl3) d 61,3; 1041 m/z (M+Na).

P r z y k ł a d 13

Wytwarzanie zawierających fosfor pochodnych estrów C-43-epirapamycyny

Przedstawione powyżej związane przez fosfor związki 43-epi można wytwarzać za pomocą metody Kay, P.B. i inni, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1987, [8], 1813-1815, stosując podane reagenty, w których R i R' oznaczają podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

PL 216 224 B1

P r z y k ł a d 14

Wytwarzanie związanych przez fosfor pochodnych C-43-rapamycyny

Przedstawione powyżej związane przez fosfor związki można wytwarzać za pomocą metody Yamashita, M. i inni, Bull. Chem. Soc. Japan, 1983, 56, 1871-1872, stosując podane reagenty, w których X oznacza atom fluorowca lub bezwodnik, na przykład z R*X otrzymuje się grupę C-43 R*O-, która działa jak grupa odszczepialna, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

Przedstawione powyżej związki związane przez aminę można wytwarzać za pomocą metody

Cavalla, D. i inni, Tet. Lett., 1983, 24, 295-298; Grinfield, A. i inni, WO 98/09972 i Or, Y.S. i inni, opis patentowy USA nr 5583139, stosując podane reagenty, w których X oznacza atom fluorowca lub bezwodnik, na przykład z R*X otrzymuje się grupę C-43 R*O-, która działa jak grupa odszczepialna, m oznacza liczbę 1 do 10, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

PL 216 224 B1

Przedstawione powyżej etery można wytwarzać za pomocą metody Cottens, S. i inni, opublikowane międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 94/09010 i Cheng, D. i inni, WO 98/09970, stosując podane reagenty (i zasadę), w których X oznacza grupę odszczepialną, m oznacza liczbę 1 do 10, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

Przedstawione powyżej tioetery można wytwarzać za pomocą metody Grinfield i inni, opublikowane międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 98/09972, stosując podane reagenty, w których X oznacza atom fluorowca lub bezwodnik, na przykład z R*X otrzymuje się grupę C-43 R*O-, która działa jak grupa odszczepialna, m oznacza liczbę 1 do 10, PG oznacza grupę chroniącą tiol, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

P r z y k ł a d 18

Wytwarzanie dodatkowych zawierających fosfor tio-związanych pochodnych C-43-rapamycyny

1. R*-X, zasada

PL 216 224 B1

Przedstawione tiozwiązki można wytwarzać metodą Yuan i inni, Synthesis, 1989, 1, 48 - 50 (droga A) lub Grinfield i inni, opublikowane międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 98/09972 i Masson S. i inni, Bull. Soc. Chim. Fr., 1996, 133, 951-964 (droga B), stosując podane reagenty, w których X oznacza atom fluorowca lub bezwodnik, na przykład z R*X otrzymuje się grupę C-43 R*O-, która działa jak grupa odszczepialna, m oznacza liczbę 1 do 10, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

P r z y k ł a d 19

Wytwarzanie zawierających fosfor związanych przez aminę pochodnych C-43-rapamycyny

Przedstawione powyżej związki można wytwarzać za pomocą metody Grinfield i inni, opublikowane międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 98/09972; Bravo, F. i inni, Tetrahedron: Assymetry, 2001, 12, 1635-1643; i Wang M. i inni, J. Org. Chem., 1995, 60, 7364-7365, stosując podane reagenty, w których X oznacza atom fluorowca lub bezwodnik, na przykład z R*X otrzymuje się grupę C-43 R*O-, która działa jak grupa odszczepialna, m oznacza liczbę 1 do 10, PG oznacza grupę chroniącą tiol, a każdy podstawnik R oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, alifatyczno-O-, arylową, aryloksylową, heteroarylową, heteroaryloksylową itp.

P r z y k ł a d 20

Wytwarzanie zawierających fosfor mieszanych estrowych pochodnych C-43-rapamycyny

Przedstawione powyżej związki można wytwarzać za pomocą metody Zhao, K. i inni, Tetrahedron, 1993, 49, 363-368, stosując reagenty, w których X oznacza NH, O lub S, a podstawniki R i R' oznaczają każdorazowo podstawioną lub niepodstawioną grupę alifatyczną, heteroalifatyczną, arylową lub heteroarylową (lub gdy X oznacza NH, R' może oznaczać wodór).

PL 216 224 B1

P r z y k ł a d 21

Dodatkowe O-P-związane związki

Przedstawione powyżej związki można wytwarzać metodą McCallum, J. S. i inni, Synthesis, 1993, 8, 819-823, i Nifantyev, E. E. i inni, J. Organomet. Chem., 1997, 529, 171-176, stosując reagenty, w których X oznacza grupę odszczepialną.

P r z y k ł a d 22

Wytwarzanie zawierających fosfor, związanych przez eter pochodnych C-43-rapamycyny (patrz przykłady 1,2, 5, 11, 17-20 odnośnie warunków sprzęgania i znaczeń grupy R)

1. PG-X’-(linker)-X zasada (gdzie !inker= alkil, aryl;

X= grupa odszczepiaina X’=O, NH, S;

PG= grupa ochronna)

2. bez ochrony

3. patrz przykłady 1,2,5,11,17-20 dla warunków sprzęgania i znaczeń grupy R (Coftona, S, et aL PCT hl.Appl. (19941WO 94X13013 i Chsng.O «, aL ΡΟΓtnL ApfJ.

I1090j WO 98/09070}

P r z y k ł a d 23

Wytwarzanie związanych przez fosfor estrów PEG C-43-rapamycyny

P r z y k ł a d 24

Oczyszczanie

Związki z powyższych przykładów można oczyszczać za pomocą chromatografii typu flash na żelu krzemionkowym w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń, takich jak pozostałości reagentów (pozostałości rapamycyny lub wyjściowych rapalogów) i niepożądane produkty uboczne. Jako odpowiednie układy do chromatografii typu flash wymienia się dostępne w handlu pakowane firmowo wkłady,

PL 216 224 B1 takie jak BIOTAGE, Inc. (PO Box 8006), Charlottesville, Va 22906-8006). Dostępne są wkłady o wielkości cząstek ~30-70 μΜ, wielkość porów krzemionki 60 A. Poniżej opisuje się typowy sposób postępowania w przypadku stosowania chromatografii typu flash do oczyszczania związków według wynalazku.

Surowy produkt rozpuszcza się w niewielkiej ilości odpowiedniego rozpuszczalnika (np. dichlorometan, „DCM) i wprowadza się do wkładu FLASH Biotage. Niepolarne zanieczyszczenia eluuje się za pomocą DCM, a następnie eluuje się produkt za pomocą układu rozpuszczalników 0,5:10:3:3 MeOH-/DCM/EtOAc/heksany. Na koniec kolumnę przemywa się np. za pomocą układu rozpuszczalników 1:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/heksany. Zebrane frakcje poddaje się analizie metodą TLC, HPLC w normalnym i odwróconym układzie faz. Frakcje zawierające czysty produkt z dwóch lub więcej eluowań identyfikuje się za pomocą HPLC w normalnym układzie faz, po czym łączy się i zatęża w próżni. W celu polepszenia całkowitej wydajności oczyszczanego produktu, zanieczyszczone frakcje można ponownie oczyszczać na oddzielnym układzie FLASH Biotage, stosując te same rozpuszczalniki do eluowania i kryteria czystości. Wielokrotnie oczyszczane partie produktu poddaje się indywidualnie kilkakrotnym wymianom rozpuszczalnika, np. za pomocą acetonu (zwykle 4-6 razy), po czym łączy się, stosując taki sam rozpuszczalnik (np. aceton), jak rozpuszczalnik transferowy. Przed połączeniem partie można testować w celu potwierdzenia dopuszczalnej czystości. Można prowadzić dodatkowe wymiany rozpuszczalnika (zwykle 2) z tym samym rozpuszczalnikiem (w tym przykładzie aceton) w połączonej partii produktu, którą następnie suszy się w próżni do stałego ciężaru w temperaturze pokojowej, uzyskując produkt, który można, jeśli to pożądane, poddawać analizie QC.

P r z y k ł a d 25

Związek wprowadzany do stentu naczyniowego

Stent ze stali nierdzewnej Duraflex TM o wymiarach 3,0 mm x 14 mm spryskuje się roztworem 25 mg/ml związku z dowolnego z przykładów 1-12 w 100% etanolu, acetonie lub octanie etylu jako rozpuszczalniku. Stent suszy się, a rozpuszczalnik odparowuje się, pozostawiając związek na powierzchni stentu. Kopolimer 75:25 PLLA/PCL (dostarczany przez Polysciences) roztwarza się w 1,4-dioksanie (dostarczany przez Aldrich Chemicals). Obciążony związkiem stent umieszcza się na wirującym trzpieniu przy 200 obr./min i za pomocą pistoletu do rozpylania (dostarczany przez Binks Manufacturing) nanosi się roztwór kopolimeru w postaci drobnego aerozolu na stent obciążony związkiem w czasie wirowania 10-30 s. Następnie stent umieszcza się w piecu w 25-35°C do 24 godzin w celu odparowania rozpuszczalnika.

P r z y k ł a d 26

Zwiększone obciążenie związkiem stentu naczyniowego

Stent ze stali nierdzewnej Duraflex (3,0 x 13 mm) odcina się laserem z rurki SS. Powierzchnię obciążenia lekiem zwiększa się przez zwiększenie chropowatości powierzchni stentu. Powierzchnię objętość stentu można dalej powiększać za pomocą rowków o szerokości 10 nm i głębokości 5 nm. Rowki umieszcza się w miejscach o małym naprężeniu w czasie rozszerzania tak, aby nie narażać wytrzymałości radialnej stentu. Następnie związkami z przykładów 1-12 można obciążać stent i rowki za pomocą zanurzania lub napylania na stent roztworu związku w rozpuszczalniku o niskim napięciu powierzchniowym, jak dichlorometan, alkohol izopropylowy, aceton, octan etylu, etanol lub metanol. Następnie stent suszy się i związek pozostaje na powierzchni stentu i w rowkach, które służą jako zbiornik leku. Następnie na stent wprowadza się parylen, który służy jako bariera ograniczająca dawkę. Związek eluuje ze stentu w ciągu 1 do 45 dni.

P r z y k ł a d 27

Związek z dowolnego z przykładów 1-12 rozpuszcza się w octanie etylu, po czym rozpyla się na stent i pozostawia do wysuszenia w celu odparowania rozpuszczalnika, przy czym związek pozostaje na powierzchni stentu. Matrycę lub barierę (silikon, politetrafluoroetylen, PARYLAST™, parylen) napyla się lub osadza na stencie obudowując związek. Ilość związku jest w zakresie 100 mikrogramów do miligramów, a uwalnianie trwa od 1 dnia do 45 dni.

P r z y k ł a d 28

Matrycę ze związkiem powlekającym stent wytwarza się w sposób opisany w przykładzie 25, po czym pokrywa się lub napyla szczytową powłokę, jako barierę limitującą dawkę (i/lub matrycę bez leku działającą jako bariera limitująca dawkę). Można również związkiem pokrywać stent poprzez barierę limitującą dawkę i następnie powlekać szczytową powłoką (inna bariera lub matryca). Stosowanie szczytowych powłok umożliwia dalszą kontrolę uwalniania dawki, polepsza biokompatybilność i/lub odporność na zarysowanie i pękanie w czasie dostarczania lub rozszerzania stentu.

PL 216 224 B1

Claims

1. Pochodna rapamycyny zawierająca fosfor określona poniższym wzorem w którym:

A oznacza O,

Q oznacza wiązanie, a J jest wybrany z grupy obejmującej ₅ w których to wzorach każdy R⁵ jest niezależnie wybrany spośród grup fenylowej i C1-C6alkilowej, niepodstawionych albo podstawionych przez podstawnik wybrany z grupy obejmującej halogen, -OH oraz grupę alkoksylową, alkiloksyalkiloksylową, halogenoalkilową, hydroksyalkoksylową, acylową i acyloksylową, przy czym każda grupa alkilowa, alkoksylowa i acylowa zawiera 1-6 sąsiednich atomów węgla; pod warunkiem, że J-Q-A nie oznacza (MeO2) (P=O)O-, i jej farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Pochodna rapamycyny według zastrz. 1, w której każda z grup C1-C6alkilowych jest niezależnie wybrana z grupy obejmującej metyl, etyl, n-propyl, i-propyl i n-butyl.

3. Pochodna rapamycyny według zastrz. 1, która jest wybrana z grupy obejmującej poniższe związki:

PL 216 224 B1

4. Pochodna rapamycyny według zastrz. 1, przedstawiona poniższym wzorem

PL 216 224 B1

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalne podłoże, znamienna tym, że jako substancję czynną, zawiera pochodną rapamycyny określoną w zastrz. 1-4, przy czym farmaceutycznie dopuszczalne podłoże zawiera ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać odpowiednią do doustnego podawania ssakom.

7. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać odpowiednią do pozajelitowego podawania ssakom.

8. Zastosowanie pochodnej rapamycyny określonej w zastrz. 1-4 do wytwarzania leku do leczenia glejaka, mięsaka lub białaczki, albo raka sutka, raka trzustki, raka płuc lub raka okrężnicy.