PL217332B1 - Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosan - Google Patents
Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosanInfo
- Publication number
- PL217332B1 PL217332B1 PL395968A PL39596811A PL217332B1 PL 217332 B1 PL217332 B1 PL 217332B1 PL 395968 A PL395968 A PL 395968A PL 39596811 A PL39596811 A PL 39596811A PL 217332 B1 PL217332 B1 PL 217332B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- parts
- weight
- oil
- culture
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 title claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 38
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000235526 Mucor racemosus Species 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 14
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 claims description 14
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 13
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 11
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 11
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 9
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 claims description 8
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 8
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 claims description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 7
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 7
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 7
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 7
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-WTZNIHQSSA-N n-[(2r)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)NC1[C@H](O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-WTZNIHQSSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 101100173542 Caenorhabditis elegans fer-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- UJHBVMHOBZBWMX-UHFFFAOYSA-N ferrostatin-1 Chemical compound NC1=CC(C(=O)OCC)=CC=C1NC1CCCCC1 UJHBVMHOBZBWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 101710136247 Endo-chitosanase Proteins 0.000 description 3
- 108010014701 Exo-beta-D-glucosaminidase Proteins 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000235389 Absidia Species 0.000 description 1
- 241001149952 Amylomyces rouxii Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000306281 Mucor ambiguus Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 229920001247 Reticulated foam Polymers 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu.The subject of the invention is a method of obtaining insoluble preparations of enzymes that catalyze the hydrolysis of chitosan.
Z czasopisma Biotechnologia 2 (57), 193-206, (2002) jest znany sposób otrzymywania wewnątrzkomórkowego biokatalizatora, pochodzącego z pleśni Absidia orchidis, stosowanego w postaci rozpuszczonej w procesie hydrolizy chitozanu.From the journal Biotechnologia 2 (57), 193-206, (2002) there is a known method of obtaining intracellular biocatalyst derived from Absidia orchidis mold, used in dissolved form in the process of chitosan hydrolysis.
Z czasopisma Food Research International 38, 315-322, (2005) znany jest sposób otrzymywania zewnątrzkomórkowych biokatalizatorów pochodzących z pleśni Aspergillus CJ22, stosowanych w procesie hydrolizy chitozanu.From the Food Research International 38, 315-322, (2005) journal, there is known a method of obtaining extracellular biocatalysts derived from Aspergillus CJ22 mold, used in the chitosan hydrolysis process.
Z czasopisma FEMS Microbiology Letters vol. 95, 187-194, (1992), jest znany sposób otrzymywania dwóch wewnątrzkomórkowych biokatalizatorów (o aktywności endochitozanolitycznej), pochodzących z pleśni Mucor rouxii, stosowanych w postaci roztworu w procesie hydrolizy chitozanu i jego pochodnych.From the journal FEMS Microbiology Letters vol. 95, 187-194, (1992), there is a known method of obtaining two intracellular biocatalysts (with endochitosanolytic activity) derived from Mucor rouxii mold, used in the form of a solution in the hydrolysis of chitosan and its derivatives.
Z opisu zgłoszenia patentowego P 385093 jest znany sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu, w drodze hodowli pleśni z rodzaju Mucor, polegający na tym, że szczepy pleśni Mucor circinelloides CH81 lub Mucor racemosus CH52, po inkubacji na wysterylizowanym i wychłodzonym podłożu stałym zawierającym chitozan lub chitooligosacharydy, agar, brzeczkę piwowarską o stężeniu 8-9°Be, hoduje się w temperaturze 29-31°C, w czasie 3-5 dni i zawiesiną zarodników zmytych z tego podłoża szczepi się wysterylizowane podłoże inokulacyjne i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 28-31°C, w czasie 18-26 godzin. Otrzymanym w wyniku tej hodowli inokulum zaszczepia się, wysterylizowane i wstępnie napowietrzone podłoże hodowlane o składzie analogicznym jak podłoże w hodowli inokulum i prowadzi hodowlę produkcyjną w warunkach wgłębnych, w temperaturze 29-31°C, w czasie 42-72 godzin w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie mieszania, doprowadzając powietrze, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej biomasę, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej, przemywa się acetonem i otrzymany nierozpuszczalny preparat enzymatyczny suszy się na powietrzu. Hodowlę inokulum i hodowlę produkcyjną prowadzi się na podłożu zawierającym oliwę z oliwek lub olej, namok kukurydziany, chitynę, N-acetylo-glukozoaminę lub chitozan oraz wodę destylowaną lub na podłożu zawierającym oliwę z oliwek lub olej, namok kukurydziany oraz wodę destylowaną względnie na podłożu zawierającym glukozę, bactopeptonu, ekstrakt drożdżowy, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4 x 7H2O, NaCl, CaCl2 oraz wodę destylowaną.From the patent application P 385 093 there is known a method of obtaining insoluble preparations of enzymes catalyzing the hydrolysis of chitosan by culturing molds of the genus Mucor, consisting in the fact that the mold strains Mucor circinelloides CH81 or Mucor racemosus CH52, after incubation on a sterilized and cooled solid medium containing chitosan or chitooligosaccharides, agar, brewing broth with a concentration of 8-9 ° Be, cultivated at 29-31 ° C for 3-5 days, and the spore suspension washed from this medium is inoculated into a sterilized inoculation medium and shaken culture is carried out at 28 -31 ° C, during 18-26 hours. The inoculum obtained as a result of this culture is inoculated into a sterilized and pre-aerated culture medium with a composition similar to the inoculum culture medium and the production culture is carried out under deep conditions at 29-31 ° C for 42-72 hours in the presence of anti-foaming agents. while mixing, the biomass obtained as a result of the production culture is fed with air, after separation from the post-culture liquid, washed with acetone and the obtained insoluble enzyme preparation is dried in the air. The inoculum and production culture are carried out on a medium containing olive oil or oil, corn steep, chitin, N-acetyl-glucosamine or chitosan and distilled water, or on a medium containing olive oil or oil, corn steep and distilled water or on a medium containing glucose, bactopeptone, yeast extract, (NH4) 2SO4, K2HPO4, MgSO4 x 7H2O, NaCl, CaCl2 and distilled water.
W kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej znajduje się, szczep pleśni Mucor racemosus oznaczony symbolem CH52, wyodrębniony z pancerzy krewetek.The collection of the Institute of Technical Biochemistry of the Lodz University of Technology includes the Mucor racemosus mold strain marked with the symbol CH52, isolated from shrimp shells.
Sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu, w drodze hodowli pleśni Mucor racemosus, polegający na hodowli zarodników pleśni na wy sterylizowanym, stałym podłożu zawierającym agar i brzeczkę piwowarską o stężeniu 8°Be w temperaturze 30°C w czasie 4-6 dni, następnie zmyciu wyhodowanych zarodników sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem surfaktanta, zaszczepieniu zawiesiną zarodników wysterylizowanego, ciekłego podłoża aktywującego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, chitynę koloidalną, namok kukurydziany i wodę, o wyjściowym pH 4,6-5,0 i prowadzeniu w tym podłożu hodowli wstrząsanej inokulum w temperaturze 28-31°C w czasie 18 godzin przy stop-1 niu napełnienia kolb 20% i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min-1, następnie zaszczepieniu otrzymanym inokulum wysterylizowanego i wstępnie napowietrzonego sterylnym powietrzem, ciekłego podłoża produkcyjnego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, namok kukurydziany i wodę i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w temperaturze 28-31°C w czasie 72 godzin w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie mieszania i napowietrzania sterylnym powietrzem doprowadzanym w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, oddzieleniu otrzymanego preparatu od cieczy pohodowlanej, odmyciu od rozpuszczalnych produktów metabolizmu oraz suszeniu, według wynalazku polega na tym, że preparaty otrzymuje się w drodze hodowli selektanta pleśni Mucor racemosus CH52/3SC, którego zarodniki hoduje się na podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 20-30 części, brzeczki piwowarskiej 20-30 części, a nadto 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek. Hodowlę inokulum selektanta prowadzi się w podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części, handlowej chityny 0,5-1 części oraz 1000 części wody wodociągowej o barwie większej niż 5 mg Pt (PN-EN ISOA method of obtaining insoluble preparations of enzymes catalyzing the hydrolysis of chitosan by culturing Mucor racemosus mold, consisting in the cultivation of mold spores on a sterilized, solid medium containing agar and brewing wort at a concentration of 8 ° Be at a temperature of 30 ° C for 4-6 days, then washing the cultured spores with sterile saline with the addition of a surfactant, inoculation with a spore suspension of a sterilized, liquid activating medium containing olive oil or oil, preferably soybean, sunflower or universal, colloidal chitin, corn steep and water, with an initial pH of 4.6-5.0 and carrying out in this medium the shaking culture of an inoculum at a temperature of 28-31 ° C for 18 hours with a flask filling degree of 20% and a shaker rotational speed of 180 min- 1 , then inoculating the sterilized and pre-aerated liquid medium with the obtained inoculum production containing olive oil or b oil, preferably soybean, sunflower or all-purpose oil, corn steep and water, and cultivation of the production culture at 28-31 ° C for 72 hours in the presence of anti-foaming agents, with agitation and aeration with sterile air at 1 part by volume per 1 the volume part of the medium within 1 minute, separation of the obtained preparation from the post-culture liquid, washing from soluble products of metabolism and drying, according to the invention, preparations are obtained by culturing the Mucor racemosus CH52 / 3SC mold selectant, the spores of which are cultivated on the medium a solid containing in parts by weight: agar 20-30 parts, brewer's wort 20-30 parts, and further 0.5-1 parts colloidal chitin derived from shrimp shells. The culture of the selectant inoculum is carried out in a liquid medium containing in parts by weight: olive oil or oil 10-50 parts, corn steep 30-73 parts, commercial chitin 0.5-1 parts and 1000 parts of tap water with a color greater than 5 mg Pt (PN-EN ISO
PL 217 332 B1PL 217 332 B1
7887 : 2002), mętności nie większej niż 0,4 NTU (PN-EN ISO 7027 : 2003), przewodności nie większej niż 500 ąS/cm (PN-EN-27888 : 1999), pH w zakresie 7,1-7,4 (PN-90/C 04540.01), ChZT nie większym niż 1,75 (PN-ISO 15705 : 2005 PB-22.00 : 2009), twardości nie większej niż 15° n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l (PB-03.00 : 2008) i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l (PN-ISO 6332 : 2001). Hodowlę produkcyjną selektanta prowadzi się na podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, zaszczepionym inokulum użytym w ilości 10% objętościowych stosunku do objętości podłoża, przy mieszaniu zawartości fermentora -1 z szybkością obrotową 120 minut-1 za pomocą mieszadła, do którego przymocowuje się rozłącznie porowaty nośnik hodowanego selektanta, w postaci prostopadłościennych płatów pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej (tak zwanej pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, numer klasyfikacyjny TM23280), o wymia3 rach 250 x 120 x 10 mm, charakteryzującej się gęstością 19-22 kg/m3, wytrzymałością na rozciąganie 70 kPa i średnicą porów 2,20-3,40 mm. Otrzymane w wyniku hodowli płaty pianki z przerośniętą biomasą selektanta Mucor racemosus CH52/3SC oddziela się od cieczy pohodowlanej, przemywa wodą destylowaną w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu, odwadnia acetonem schłodzonym do temperatury 4°C, ekstrahuje eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej lub przemywa wodą destylowaną, zamraża do temperatury -45°C, liofilizuje, przemywa acetonem, eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej. Przemycie wodą monitoruje się pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali λ=280 nm, odwodnienie acetonem prowadzi 3-krotnie stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą w czasie 10 minut w zakrytym na-1 czyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 minut-1, zaś suszenie prowadzi się na powietrzu w czasie 12 godzin.7887: 2002), turbidity not greater than 0.4 NTU (PN-EN ISO 7027: 2003), conductivity not greater than 500 ąS / cm (PN-EN-27888: 1999), pH in the range 7.1-7, 4 (PN-90 / C 04540.01), COD not greater than 1.75 (PN-ISO 15705: 2005 PB-22.00: 2009), hardness not greater than 15 ° n, with a nitrate content not greater than 4 mg / l ( PB-03.00: 2008) and iron no more than 0.2 mg / l (PN-ISO 6332: 2001). The production culture of the selectant is carried out on a liquid medium containing in parts by weight: olive oil or oil 10-50 parts, corn steep 30-73 parts and 1000 parts of tap water with the properties as above, inoculated inoculum used in an amount of 10% by volume of volume of substrate, while mixing the contents of the fermenter -1 at a rotational speed of 120 minutes -1 using a stirrer to which a porous carrier of the cultivated selectant is detachably attached, in the form of cuboidal polyurethane foam sheets based on polyether polyol with a completely open cell structure (the so-called reticulated foam obtained by the process of thermal reticulation, classification number TM23280), to exchange the RACH 3 250 x 120 x 10 mm, characterized by a density of 19-22 kg / m 3, a tensile strength of 70 kPa and a pore diameter 2,20-3,40 mm. The Mucor racemosus CH52 / 3SC selectant obtained as a result of the culture is separated from the culture liquid, washed with distilled water to remove the soluble metabolic products, dehydrated with acetone cooled to 4 ° C, extracted with petroleum ether and dried at room temperature or washed distilled water, frozen to -45 ° C, lyophilized, washed with acetone, petroleum ether and dried at room temperature. Washing with water is monitored by absorbance A <0.05 for wavelength λ = 280 nm, dehydration with acetone is carried out 3 times using 15 parts by weight of acetone per 1 part by weight of foam overgrown with biomass for 10 minutes in a covered vessel placed on a shaker with a rotation speed of 120 minutes -1 , and air drying for 12 hours.
Selektant pleśni Mucor racemosus CH52/3SC otrzymuje się ze szczepu pleśni Mucor racemosus CH52, który poddaje się aktywacji na wysterylizowanym podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be, w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin, po czym wyrosłe kolonie poddaje się selekcji w drodze hodowli wstrząsanej na wysterylizowanym podłożu ciekłym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części handlowej chityny, 10-50 części oliwy z oliwek lub oleju, korzystnie sojowego, słonecznikowego lub uniwersalnego, 30-73 części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, o wyjściowym pH = 4,6-5,0 w temperaturze 29-31°C w czasie 24 godzin przy stopniu napełnienia kolb 20% objęto-1 ściowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min-1, przy czym procedurę aktywowania i selekcji pleśni Mucor racemosus powtarza się 3-krotnie. Otrzymany selektant przechowuje się na podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 1 część koloidalnej chityny, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be, w temperaturze 4°C.Mucor racemosus CH52 / 3SC mold selectant is obtained from the mold strain Mucor racemosus CH52, which is activated on a sterilized solid medium with the composition in parts by weight: 0.5-1 part colloidal chitin from shrimp shells, 30 parts agar, 1000 parts wort brewing at a concentration of 8 ° Be, at the temperature of 30 ° C for 72 hours, then the grown colonies are selected by shaking culture on a sterilized liquid medium with the composition in parts by weight: 0.5-1 part of commercial chitin, 10-50 parts of olive oil or oil, preferably soybean, sunflower or all-purpose oil, 30-73 parts of corn steep, 1000 parts of tap water with the characteristics as above, starting pH = 4.6-5.0 at 29-31 ° C at for 24 hours with a flask filling degree of 20% by volume and a shaker rotational speed of 180 min -1 , the activation and selection procedure for the Mucor racemosus molds being repeated 3 times. The obtained selectant is stored on a solid medium with the composition in parts by weight: 1 part of colloidal chitin, 30 parts of agar, 1000 parts of the brewing wort with the concentration of 8 ° Be, at the temperature of 4 ° C.
Sposób według wynalazku zezwala na otrzymanie aktywnych i stabilnych preparatów enzymów hydrolizujących chitozan, z nowego selektanta Mucor racemosus CH52/3SC, którego aktywność w reakcji hydrolizy chitozanu jest większa o 20% w porównaniu z aktywnością wyjściowego szczepu Mucor racemosus CH52. Wytworzone sposobem według wynalazku preparaty lipaz osadzonych na porowatej piance poliuretanowej są elastyczne i trwałe. Można je przycinać do potrzebnych wymiarów co umożliwia efektywne wypełnienie przestrzeni reaktora przeznaczonego do reakcji hydrolizy chitozanu.The method according to the invention makes it possible to obtain active and stable preparations of chitosan hydrolysing enzymes from the new Mucor racemosus CH52 / 3SC selectant, the activity of which in the chitosan hydrolysis reaction is higher by 20% compared to the activity of the original Mucor racemosus CH52 strain. The preparations of lipases deposited on porous polyurethane foam prepared by the method according to the invention are flexible and durable. They can be cut to the required dimensions, which enables effective filling of the reactor space for the chitosan hydrolysis reaction.
Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady.The process according to the invention is illustrated in the following examples.
P r z y k ł a d I.P r z x l a d I.
Szczep pleśni Mucor racemosus CH52 wyodrębniony z pancerzy krewetek przeszczepiono na aktywujące podłoże stałe, wysterylizowane w temperaturze 121°C w czasie 15 minut, o składzie w częściach wagowych: 1 część koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be i hodowano na tym podłożu w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin. Wyrosłe kolonie przenoszono za pomocą ezy na aktywujące podłoże ciekłe, wysterylizowane w temperaturze 121°C w czasie 20 minut, o składzie w częściach wagowych: 0,5 części handlowej chityny, 27 części oliwy z oliwek lub oleju, korzystnie sojowego, słonecznikowego, uniwersalnego, 37 części namoku kukurydzianego firmy Roquette, 1000 części wody wodociągowej o barwie nie większej niż 5 mg Pt, mętności nie większej niż 0,4 NTU, przewodności nie większej niż 500 ąS/cm, pH w zakresie 7,1-7,4, ChZT nie większym niż 1,75, twardości nie większej niż 15° n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l, o wyjściowym pH = 4,6 i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze 29-31°C przez 24 godziny przy stopniu napełnieniaMucor racemosus CH52 mold strain isolated from shrimp shells was transplanted onto an activating solid medium, sterilized at 121 ° C for 15 minutes, with parts by weight: 1 part colloidal chitin from shrimp shells, 30 parts agar, 1000 parts brewing broth concentration of 8 ° Be and grown in this medium at 30 ° C for 72 hours. Grown colonies were transferred with a loop to an activating liquid medium, sterilized at 121 ° C for 20 minutes, with the composition in parts by weight: 0.5 part of commercial chitin, 27 parts of olive oil or oil, preferably soybean, sunflower, universal, 37 parts of Roquette corn steep, 1000 parts of tap water, color no more than 5 mg Pt, turbidity no more than 0.4 NTU, conductivity no more than 500 ąS / cm, pH in the range 7.1-7.4, COD not more than 1.75, hardness not greater than 15 ° n, with a nitrate content of not more than 4 mg / l and iron not more than 0.2 mg / l, with the initial pH = 4.6 and the shake culture was carried out at the temperature of 29 -31 ° C for 24 hours at a filling degree
PL 217 332 B1 kolb 20% objętościowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min-1. Procedurę hodowli pleśni na obydwu podłożach, stałym i ciekłym, powtarzano 3-krotnie.The flasks were 20 vol.% And the rotational speed of the shaker was 180 min- 1 . The mold growth procedure on both solid and liquid media was repeated 3 times.
Otrzymany w ten sposób selektant Mucor racemosus oznaczony numerem CH52/3SC, wysiano na wysterylizowane termicznie, w czasie 15 minut w temperaturze 121°C, podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 0,5 części koloidalnej chityny, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be i po 3 dniach hodowli w temperaturze 29-31°C zarodniki selektanta zmywano ® sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu® X-100 stosując 8 ml soli fizjologicznej ma 1 skos. Otrzymaną zawiesiną zarodników szczepiono wysterylizowane w czasie 30 minut w temperaturze 121°C, podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 0,5 części handlowej chityny, 27 części oliwy z oliwek, 37 części namoku kukurydzianego oraz 1000 części wody wodociągowej o wła33 ściwościach jako podano wyżej, stosując 1 cm3 zarodników na 100 cm3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze 28-31°C, w czasie 18 godzin, przy stopniu napełnienia kolb 20% obję-1 tościowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min-1. Otrzymanym w wyniku tej hodowli inokulum zaszczepiono, uprzednio wysterylizowane w czasie 30 minut w temperaturze 121°C, podłoże o objętości 18 litrów wprowadzone do fermentora o objętości całkowitej 24 I, wstępnie napowietrzone sterylnym powietrzem, o składzie analogicznym jak w hodowli inokulum, ale bez dodatku chityny, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej (tak zwanej pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, numer klasyfikacyjny TM23280), charakteryzującej 3 się następującymi parametrami fizykochemicznymi: gęstością 19-22 kg/m3, wytrzymałością na rozciąganie 70 kPa i średnicą porów 2,20-3,40 mm, o wymiarach: 250 x 120 x 10 mm wysokość/szerokość/grubość). Hodowlę prowadzono w temperaturze 28-31°C w czasie 72 godzin, w obec-1 ności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 minut-1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej, przerośnięte biomasą Mucor racemosus CH52/3SC, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu monitorowanego pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali λ=280 nm, zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4°C, stosowanym w ilości 15 części wagowych na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i odwadniano 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obro-1 towej 120 minut-1. Odwodnioną i odlipidowaną biomasę, zaadsorbowaną w porach pianki poliuretanowej, suszono na powietrzu w czasie 18 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 20,1 g z 1 I podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 352,5 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,138 U/g preparatu.The thus obtained Mucor racemosus selector, designated with the number CH52 / 3SC, was sown on a thermally sterilized medium for 15 minutes at 121 ° C, with the composition in parts by weight: 0.5 part of colloidal chitin, 30 parts of agar, 1000 parts of wort beer at a concentration of 8 ° Be, and after 3 days of growth at 29-31 ° C spores selektanta ® were washed with sterile saline containing 0.01% Triton ® X-100 using 8 ml of normal saline is one bevel. The obtained spore suspension was inoculated in a culture medium sterilized for 30 minutes at 121 ° C, with the composition in parts by weight: 0.5 part of commercial chitin, 27 parts of olive oil, 37 parts of corn steep and 1000 parts of tap water with the properties as stated. above, using 1 cm 3 of spores per 100 cm 3 of medium, and a shake culture was carried out at 28-31 ° C for 18 hours, with a flask filling degree of 20% v / v and a shaker rotation speed of 180 min- 1 . The inoculum obtained as a result of this culture was inoculated, previously sterilized for 30 minutes at 121 ° C, in a medium with a volume of 18 liters, introduced into a fermenter with a total volume of 24 I, pre-aerated with sterile air, with a composition analogous to that in the inoculum culture, but without addition chitin, using 10% by volume of the inoculum based on the volume of the vehicle. Stirrer arranged in the fermenter mounted in a reproducible way rectangular sheets of flexible polyurethane foam based on polyether polyol with a completely open cell structure (the so-called foam retykulowanej obtained by the process of thermal reticulation, classification number TM23280), 3 characterized by the following physicochemical parameters: density of 19- 22 kg / m 3, a tensile strength of 70 kPa and a pore diameter of 2,20-3,40 mm, dimensions: 250 x 120 x 10 mm height / width / thickness). The cultivation was carried out at the temperature of 28-31 ° C for 72 hours, in the presence of anti-foaming agents, under agitation at a rotational speed of 120 minutes -1 , with air being supplied with 1 part by volume to 1 part by volume of medium for 1 minute. The polyurethane foam sheets obtained as a result of the production culture, overgrown with Mucor racemosus CH52 / 3SC biomass, after separation from the culture liquid by filtration, were washed with water in order to remove the soluble products of metabolism monitored by the absorbance measurement A <0.05 for the wavelength λ = 280 nm, poured successively with 3 portions of acetone cooled to 4 ° C, used in the amount of 15 parts by weight per 1 part by weight of foam overgrown with biomass, and dehydrated for 10 minutes in a covered vessel placed on a shaker with a rotational speed of 120 minutes -1 . The dehydrated and de-lipidized biomass, adsorbed in the pores of the polyurethane foam, was air dried for 18 hours at room temperature. An insoluble enzyme preparation was obtained in the amount of 20.1 g from 1 I of substrate, with the endochitosanase activity equal to 352.5 unit / g and the exochitosanase activity equal to 0.138 U / g of the preparation.
P r z y k ł a d II.P r z x l a d II.
Selektant Mucor racemosus oznaczony numerem CH52/3SC otrzymano postępując jak w przykładzie I, ale stosując aktywujące podłoże stałe zawierające 0,5 części koloidalnej chityny i ciekłe podłoże aktywujące zawierające 1 część chityny handlowej. Dalej postępowano jak w przykładzie I.The Mucor racemosus selectant CH52 / 3SC was obtained by following the procedure of Example 1, but using an activating solid medium containing 0.5 part colloidal chitin and an activating liquid medium containing 1 part commercial chitin. The next step was as in example 1.
Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 20,6g z 1 I podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 375,7 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,142 U/g preparatu.An insoluble enzyme preparation was obtained in the amount of 20.6 g from 1 I of medium, with the endochitosanase activity equal to 375.7 unit / g and the exochitosanase activity equal to 0.142 U / g of the preparation.
P r z y k ł a d III.P r x l a d III.
Selektant Mucor racemosus oznaczony numerem CH52//3SC otrzymano postępując jak w przykładzie I. Hodowlę wytworzonego selektanta prowadzono w fermentorze jak w przykładzie I. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej przerośnięte biomasą Mucor racemosus CH52/3SC, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą jak w przykładzie I, zamrożono do temperatury -45°C i poddano liofilizacji, produkt liofilizacji zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4°C stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i ekstrahowano przez 10 minut w zakrytym naczyniu umiesz-1 czonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 minut-1, następnie przemywano eterem naftowym i suszono na powietrzu w czasie 12 godzin w temperaturze pokojowej.The Mucor racemosus selectant CH52 // 3SC was obtained by following the procedure described in Example 1. The cultivation of the produced selectant was carried out in the fermentor as in Example I. The polyurethane foam sheets obtained as a result of the production culture were grown with Mucor racemosus CH52 / 3SC biomass, after separation from the culture liquid by the method. filtration, washed with water as in example 1, frozen to -45 ° C and freeze-dried, the lyophilization product was poured successively with 3 portions of acetone cooled to 4 ° C using 15 parts by weight of acetone per 1 part by weight of biomass-infused foam and extracted for 10 minutes in a covered vessel placed on a shaker with a rotation speed of 120 minutes -1 , then washed with petroleum ether and air dried for 12 hours at room temperature.
Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 18,1 g z 1 litra podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 368,1 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,139 U/g preparatu.An insoluble enzyme preparation was obtained in the amount of 18.1 g from 1 liter of medium, with the endochitosanase activity equal to 368.1 unit / g and the exochitosanase activity equal to 0.139 U / g of the preparation.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395968A PL217332B1 (en) | 2011-08-16 | 2011-08-16 | Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395968A PL217332B1 (en) | 2011-08-16 | 2011-08-16 | Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosan |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395968A1 PL395968A1 (en) | 2013-02-18 |
| PL217332B1 true PL217332B1 (en) | 2014-07-31 |
Family
ID=47682239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395968A PL217332B1 (en) | 2011-08-16 | 2011-08-16 | Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosan |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL217332B1 (en) |
-
2011
- 2011-08-16 PL PL395968A patent/PL217332B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL395968A1 (en) | 2013-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI68078B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV BIOLOGISKT AKTIVA MICROORGANISMMYCELIEPELLETS | |
| US20100086979A1 (en) | Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media | |
| JP4642351B2 (en) | Preparation of gallic acid by co-culture | |
| CN107475031A (en) | A kind of koji and its production technology | |
| Paranthaman et al. | Optimization of various culture media for tannase production in submerged fermentation by Aspergillus flavus | |
| CN103642698A (en) | Mortierella alpine mutant strain and applications thereof | |
| PL217339B1 (en) | Method for obtaining insoluble preparations of the enzyme catalyzing the hydrolysis of chitosan | |
| CN101845397A (en) | Method for culturing Metarhizium anisopliae | |
| CN103074243A (en) | Burkholderia sp.QZ7 and application of the same in biosurfactant production | |
| PL217361B1 (en) | Method for preparing an insoluble product of Mucor racemosus lipase | |
| PL217686B1 (en) | Method for obtaining an insoluble preparation of the Mucor circinelloides lipase | |
| PL217360B1 (en) | Method for preparing an insoluble product of Mucor circinelloides lipase | |
| PL217358B1 (en) | Method for preparing an insoluble product of Mucor racemosus lipase | |
| PL217695B1 (en) | Method for obtaining an insoluble preparation of the Mucor racemosus lipase | |
| PL217359B1 (en) | Method for preparing an insoluble product of Mucor racemosus lipase | |
| Singh et al. | Chitinase production by Serratia marcescens GG5 | |
| CN114287462A (en) | Cake composite anticorrosive emulsifier and preparation method thereof | |
| RU2815972C1 (en) | Culture medium for culturing ureolytic bacteria | |
| CN114410542B (en) | Vibrio paradise and application thereof in degradation of enteromorpha | |
| Darah et al. | Tannase enzyme production by entrapped cells of Aspergillus niger FETL FT3 in submerged culture system | |
| RU2295563C1 (en) | Bacterium strain lactococcus lactis subcpecies lactis b-8558 useful in dairy product preparation and method for production of starter culture of strain lactococcus lactis subcpecies lactis b-8558 | |
| CN112375699B (en) | A strain of Bacillus licheniformis expressing lipase and its fermentation enzyme production method | |
| Namasivayam et al. | Evaluation of organic waste liquor media for the production of alpha amylase using Aspergillus niger | |
| NO780862L (en) | PROCEDURE FOR PREPARING POLYSACARID | |
| PL214332B1 (en) | method of obtaining insoluble preparations of the chitosan hydrolysis katalyzing enzymes |