PL219723B1 - Związek pochodny pirymidynyloaminobenzamidu, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie związku - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy nowego związku pochodnego pirymidynyloaminobenzamidu, kompozycji farmaceutycznej zawierającej ten związek i zastosowania tego związku.

Kinazy białkowe (KB) są enzymami katalizującymi fosforylację specyficznych reszt serynowych, treoninowych lub tyrozynowych w białkach komórkowych. Te post-translacyjne modyfikacje w białkach działają jako przełączniki cząsteczkowe regulujące rozrost, aktywację oraz/lub różnicowanie komórek. Anormalną oraz nadmierną aktywność KB obserwowano w wielu stanach chorobowych, włączając w to łagodne i złośliwe zaburzenia rozrostowe. W wielu przypadkach, możliwe było leczenie chorób, takich jak choroby rozrostowe, poprzez wykorzystanie inhibitorów KB in vivo oraz in vitro.

W związku z występowaniem dużej ilości inhibitorów kinaz białkowych oraz mnogości chorób rozrostowych i innych chorób związanych z KB, istnieje wciąż potrzeba zapewnienia nowych klas związków, które są użyteczne jako inhibitory KB, a w związku z tym w leczeniu chorób związanych z KB.

Chromosom filadelfijski jest cechą charakterystyczną przewlekłej białaczki szpikowej (Cml) oraz zawiera gen hybrydowy, w skład którego wchodzą N-terminalne eksony genu bec oraz główna część C-końcowa (eksony 2-11) genu c-abl. Produkt genowy jest białkiem o masie 210 000 (210 kD) (p210 Bcr-Abl). Część Abl białka Bcr-Abl zawiera kinazę tyrozyny-abl, która jest ściśle regulowana w c-abl typu dzikiego, natomiast jest konstytucyjnie aktywowana w białku fuzyjnym Bcr-Abl. Ta rozregulowana kinaza tyrozynowa oddziałuje z wieloma komórkowymi ścieżkami sygnałowymi, co prowadzi do transformacji i rozregulowanego rozrostu komórek (Lugo i współprac., Science, 247, 1079 [1990]).

Okazało się, że związki pochodne pirymidynyloaminobenzamidów hamują działanie kinaz białkowych. Są to związki o wzorze ogólnym I, wykazujące w szczególności działanie hamujące aktywność co najmniej jednej z kinaz tyrozynowych, takich jak c-Abl, Bcr-Abl, receptorowych kinaz tyrozynowych PDGF-R, flt3, VEGF-R, EGF-R oraz c-Kit. Związki o wzorze ogólnym I są odpowiednie do hamowania tych oraz/lub innych kinaz białkowych, w szczególności wymienionych powyżej oraz/lub do hamowania mutantów tych enzymów, zwłaszcza Bcr-Abl, dla przykładu mutanta Glu255->Walina. W świetle tych właściwości, związki te mogą być stosowane do leczenia chorób związanych z anormalną lub nadmierną aktywnością tych typów kinaz, zwłaszcza tych wymienionych powyżej.

Grupa związków opisanych powyżej jest określona wzorem I

gdzie

R1 oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową, niższą grupę alkilową podstawioną niższą grupą alkoksylową, acyloksy-niższą grupę alkilową, karboksy-niższą grupę alkilową, niższą grupę alkilową podstawioną niższą grupą alkoksykarbonylową, lub fenylo-niższą grupę alkilową;

R2 oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową, ewentualnie podstawioną jednym lub więcej identycznymi lub różnymi rodnikami R3, grupę cykloalkilową, benzocykloalkilową, heterocykliczną, grupę arylową, lub mono- bądź bicykliczną grupę heteroarylową zawierającą w pierścieniu zero, jeden, dwa albo trzy atomy azotu oraz zero albo jeden atom tlenu oraz zero albo jeden atom siarki, przy czym grupy te w każdym przypadku są niepodstawione lub mono- bądź wielopodstawione; oraz

R3 oznacza grupę hydroksylową, niższą grupę alkoksylową, grupę acyloksylową, karboksylową, niższą grupę aloksykarboksylową, grupę karbamoilową, N-mono- bądź N,N-dipodstawioną karbamoilową, aminową, mono- bądź dipodstawioną grupę aminową, grupę cykloalkilową, heterocykliczną, arylową, lub mono- bądź bicykliczną grupę heteroarylową zawierającą w pierścieniu zero, jeden, dwa albo trzy atomy azotu oraz zero albo jeden atom tlenu oraz zero albo jeden atom siarki, przy czym grupy te w każdym przypadku są niepodstawione lub mono- bądź wielopodstawione;

PL 219 723 B1 albo w którym R1 i R2 oznaczają razem grupę alkilenową z czterema, pięcioma lub sześcioma atomami węgla, która ewentualnie jest mono- lub dipodstawioną przez niższą grupę alkilową, grupę cykloalkilową, heterocykliczną, fenylową, hydroksylową, niższą grupę alkoksylową, aminową, monolub dipodstawioną grupę aminową, grupę oksylową, pirydynylową, pirazynylową lub pirymidynylową; grupę benzoalkilenową z czterema albo pięcioma atomami węgla; grupę oksaalkilenową z jednym atomem tlenu i trzema albo czterema atomami węgla; albo grupę azaalkilenową z jednym atomem azotu i trzema albo czterema atomami węgla, gdzie azot jest niepodstawiony lub podstawiony przez niższą grupę alkilową, fenylo-niższą grupę alkilową, niższą grupę alkilową podstawioną grupą alkoksykarbonylową, karboksy-niższą grupę alkilową, karbamoilo-niższą grupę alkilową, N-mono- bądź Ν,Ν-dipodstawioną karbamoilo-niższą grupę alkilową, grupę cykloalkilową, niższą grupę alkoksykarbonylową, grupę karboksylową, fenylową, podstawioną grupę fenylową, pirydynylową, pirymidynylową, lub pirazynylową;

R4 oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową lub atom fluorowca; oraz N-tlenku lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli takiego związku.

Ogólne określenia stosowane w tym dokumencie powyżej i poniżej mają zgodnie z ujawnieniem korzystnie następujące znaczenia, o ile nie jest to określone inaczej:

Przedrostek „niższy” oznacza rodniki mające maksymalnie włącznie do siedmiu atomów węgla, a szczególnie korzystnie maksymalnie cztery atomy węgla, przy czym rzeczone rodniki są liniowe lub rozgałęzione z jednym bądź wieloma rozgałęzieniami.

Wynalazek stanowi związek pochodny pirymidynyloaminobenzamidu, którym jest 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[5-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)fenylo]-benzamid o wzorze

N lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która charakteryzuje się tym, że składnik aktywny stanowi związek o powyższym wzorze lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku określonego powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia białaczki.

Dopuszczalne farmaceutycznie sole związku będącego wynalazkiem oraz innych związków określonych wzorem I są wytwarzane, na przykład, jako sole addycyjne z kwasami organicznymi albo nieorganicznymi. Odpowiednimi kwasami nieorganicznymi są na przykład kwasy fluorowcowe, takie jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy, albo kwas fosforowy. Odpowiednimi kwasami organicznymi są, na przykład, kwasy karboksylowe, fosfonowe, sulfonowe czy amidosulfonowe, na przykład, kwas octowy, kwas propionowy, kwas oktanowy, kwas dekanowy, kwas dodekanowy, kwas glikolowy, kwas mlekowy, kwas fumarowy, kwas bursztynowy, kwas adypinowy, kwas pimelinowy, kwas suberynowy, kwas azelainowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, aminokwasy takie jak kwas glutaminowy lub kwas asparaginowy, kwas maleinowy, kwas hydroksymaleinowy, kwas metylomaleinowy, kwas cykloheksanokarboksylowy, kwas adamantanokarboksylowy, kwas benzoesowy, kwas salicylowy, kwas 4-aminosalicylowy, kwas (orto)ftalowy, kwas fenylooctowy, kwas migdałowy, kwas cynamonowy, kwas metano- albo etano-sulfonowy, kwas 2-hydroksyetano-sulfonowy, kwas etano-1,2-disulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas naftalenosulfonylowy, kwas 1,5-naftalenodisulfonowy, kwas

PL 219 723 B1

2-, 3- albo 4-metylobenzenosulfonowy, kwas metylosiarkowy, kwas etylosiarkowy, kwas dodecylosiarkowy, kwas N-cykloheksyloamidosulfonowy, kwas Ν-metylo-, N-etylo- albo N-propylo-amidosulfonowy, albo inne protonowe kwasy organiczne, takie jak kwas askorbinowy.

W obecności ujemnie naładowanych rodników, takich jak rodnik karboksylowy albo sulfonowy, sole mogą być tworzone z zasadami, np. sole metali albo sole amonowe, takie jak sole metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, na przykład sole sodu, potasu, magnezu albo wapnia, bądź sole amoniowe z amoniakiem albo z odpowiednimi aminami organicznymi, takimi jak monoaminy trzeciorzędowe, na przykład z trietyloaminą czy tri(2-hydroksyetylo)aminą, albo zasadami heterocyklicznymi, na przykład z N-etylo-piperydyną lub N,N'-dimetylopiperazyną.

Gdy w tej samej cząsteczce obecne są zarówno grupa zasadowa, jak i kwasowa, związek o wzorze I może tworzyć również sole wewnętrzne.

W celu wyodrębniania albo oczyszczania, możliwe jest również zastosowanie farmaceutycznie niedopuszczalnych soli, na przykład pikrynianów czy chloranów (VII). Do celów leczniczych stosowane są wyłącznie sole albo związki wolne dopuszczalne farmaceutycznie (gdzie to możliwe w postaci preparatów farmaceutycznych).

Skuteczność związku według wynalazku i innych związków o ogólnym wzorze I jako inhibitorów aktywności kinaz tyrozynowych c-Abl, Bcr-Abl oraz VGEF-receptorowych kinaz tyrozynowych może być przedstawiona jak następuje.

Badanie aktywności względem kinazy tyrozynowej białka c-Abl.

Test przeprowadzono jako próbę wiązania filtra w następujący sposób:

Oznakowaną przy pomocy His domenę kinazy z c-Abl sklonowano i eksprymowano w układzie bakulowirus/Sf9 opisanym przez Bhat i współprac., J Biol Chem. 272, 16170-5 (1997). Białko o masie 37000 (37 kD) (kinaza c-Abl), oczyszczono przy zastosowaniu dwuetapowej procedury na kolumnie zawierającej chelat metalicznego kobaltu, a następnie na kolumnie anionowymiennej przy wydajności 1-2 mg/L komórek Sf9. Czystość kinazy c-Abl była >90%, co stwierdzono przy wykorzystaniu techniki SDS-PAGE po zabarwieniu przy użyciu Coomassie blue. Próba zawierała: kinazę c-Abl (50 ng), 20 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM MgCfe, 10 μΜ Na3VO4, 1 mM DTT oraz 2,20 kBq/próbę (0,6 μCi/próbę) [γ³³ P]ATP (5 μΜ ATP) przy zastosowaniu 30 μg/ml poli-Ala,Glu₅Lys,Tyr-6:2:5:1 (Poly-AEKY, Sigma P1152) w obecności 1% DMSO, objętość całkowita 30 μΕ Reakcje zakończono przez dodanie 10 μl 250 mM EDTA, po czym 30 μl mieszaniny reakcyjnej przeniesiono na membranę Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA), nasączaną uprzednio przez 5 min metanolem, zwilżoną wodą, po czym nasączaną przez 5 min 0,5% H3PO4 i zamocowaną na próżniowej rurze rozgałęźnej przy odłączonym źródle próżni. Po umieszczeniu wszystkich próbek, podłączano źródło próżni, a każde wgłębienie zwilżano 200 μl 0,5% H3PO4.

Następnie membrany usuwano i przemywano we wstrząsarce 0,5% H3PO4 (4-krotnie) oraz jednokrotnie etanolem. Membrany zliczano po wysuszeniu w temperaturze otoczenia, po zamocowaniu w 96-wgłębieniowej ramce aparatu Packard TopCount, oraz dodatku 10 μl/wgłębienie Microscint TM (Packard).

Test aktywności względem Bcr-Abl.

Mysią linię szpikowych komórek prekursorowych 32Dcl3 transfekowanych przy wykorzystaniu wektora ekspresyjnego p210 Bcr-Abl pGDp120Bcr/Abl (32D-bcr/abl) uzyskano od J. Griffin (Dana Faber Cancer Institue, Boston, MA, USA). Komórki eksprymują białko fuzyjne Bcr-Abl z konstytucyjnie aktywną kinazą abl i niezależną od czynnika wzrostu rozrostowego. Komórki rozmnożono w RPMI 1640 (AMIMED), 10% surowicy płodu cielęcego, 2 mM glutaminy (Gibco) („pożywka całkowita”), a zapas materiałów roboczych przygotowano przez zamrożenie porcji zawierających 2 x 10⁶ komórek na fiolkę w pożywce zamrażającej (95% FCS, 5% DMSO (SIGMA)). Po odmrożeniu, komórki są wykorzystywane w eksperymentach w maksymalnie 10-12 pasażowaniach.

W próbach komórkowych, związki są rozpuszczane w DMSO i rozcieńczane pożywką całkowitą w celu uzyskania stężenia wyjściowego równego 10 μΜ, po czym przygotowywane są serie trzykrotnych rozcieńczeń w pożywce całkowitej. 200000 komórek 32D-Bcr/Abl w 50 ml pożywki całkowitej jest rozsiewanych na każde wgłębienie na płytkach do hodowli tkanek o 96 wgłębieniach o sferycznym dnie. Do każdego wgłębienia trzykrotnie/dodawane są 50 ml serie trzykrotnie rozcieńczonych związków badanych. Komórki nie poddawane działaniu związków traktowane są jako grupa kontrolna. Związki są inkubowane razem z komórkami przez 90 min. w temperaturze 37°C, w 5% CO2, a następnie są odwirowywane na płytkach do hodowli tkanek przy szybkości 1300 obr./min (wirówka Beckmann GPR), po czym usuwane są nadsącze przez ostrożne zasysanie, przy czym zachowana jest

PL 219 723 B1 ostrożność by nie usunąć żadnej ze zgranulowanych komórek. Zgranulowane komórki poddawane są lizie przy pomocy dodatku 150 μΐ buforu do lizy (50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 2 mM orto-wanadanu sodu, 1 mM PMSF, 50 μg/ml aprotyniny oraz 80 μg/ml leupeptyny), przy czym są wykorzystywane od razu w badaniu ELISA, albo przechowywane w stanie zamrożonym na płytkach w temperaturze -20°C do momentu wykorzystania.

Czarne płytki do badania ELISA (czarne płytki Packard HTRF-96) są wstępnie pokrywane przez noc w temperaturze 4°C 50 ng/wgłębienie króliczą poliklonalną domeną anti-abl-SH3 Ab 06-466 uzyskaną z Upstate w 50 μl PBS. Po trzykrotnym przemyciu 200 μl/wgłębienie PBS zawierającym 0,05% Tween20 (PBST) oraz 0,5% TopBlock (Juro), pozostałe centra wiązania białek są blokowane przy zastosowaniu 200 μl/wgłębienie PBST, 3% TopBlock przez 4 h w temperaturze pokojowej, po czym następuje inkubacja z 50 μl lizatów pochodzących z komórek nie poddanych albo poddanych działaniu związków (20 μg białka na wgłębienie) przez 3-4 godziny w temperaturze 4°C. Po trzykrotnym przemyciu dodawane jest 50 μl/wgłębienie anty-fosfotyrozyny Ab PY20(AP) znakowanej fosfatazą alkaliczną (Zymed) rozcieńczonej do 0,2 μg/ml w buforze blokującym, po czym całość jest inkubowana przez noc (4°C). W przypadku wszystkich etapów inkubacji, płytki są przykrywane pokrywkami (Costar). Ostatecznie, płytki są kolejny raz trzykrotnie przemywane buforem do przemywania i jednokrotnie wodą dejonizowaną, przed dodatkiem 90 μl/wgłębienie podłoża-AP CDPStar RTU z Emerald II. Płytki, zamknięte przy wykorzystaniu zamknięć Packard TopSeal^TM-A, inkubowano przez 45 min w temperaturze pokojowej w ciemności, a luminescencja jest określana przez liczbę zliczeń na sekundę (CPS) przy wykorzystaniu licznika scyntylacyjnego Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count).

Różnice pomiędzy wynikami uzyskanymi z badania ELISA (CPS) dla lizatów komórek 32DBcr/Abl nie poddanych działaniu związków oraz dla tła próby (wszystkie składniki, bez lizatu komórek) są obliczane i traktowane jako 100% konstytucyjnie fosforylowanych białek Bcr-Abl obecnych w tych komórkach. Aktywność związków względem aktywności kinazy Bcr-Abl wyrażona jest jako procentowe obniżenie fosforylacji Bcr-Abl. Wartości IC50 oraz IC90 określane są z krzywych odpowiedzi na dawkę przy wykorzystaniu ekstrapolacji graficznej.

Badanie aktywności względem receptorowej kinazy tyrozynowej-VEGF. Badanie przeprowadzono przy zastosowaniu receptorowej kinazy tyrozynowej Flt-1 VEGF. Szczegółowa procedura postępowania była następująca: 30 μl roztworu kinazy (10 ng domeny kinazy Fit-1, Shibuya i współprac., Oncogene 5, 519-24 [1990]) w 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 3 mM chlorku manganu (II) (MnCl₂), 3 mM chlorku magnezu (MgCl2), 10 μΜ wanadanu sodu, 0,25 mg/ml glikolu polietylenowego (PEG) 20000, 1 mM ditiotreitolu oraz 3 μg/μL poli(Glu,Tyr) 4:1 (Sigma, Buchs, Szwajcaria), 8 μΜ [³³P]-ATP (ok. 0,73 kBq (0,2 μ^), 1% DMSO, oraz 0 do 100 μΜ badanego związku inkubowano razem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie reakcję kończono dodatkiem 10 μl 0,25 M etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) pH 7. Przy zastosowaniu dozownika wielokanałowego (LAB SYSTEMS, USA), podawano 20 μl porcje na membranę z PVDF (=difluorku poliwinylowego) Immobilon P (Millipore, Bedford, USA), przez filtracyjną rurę rozgałęźną do mikromiareczkowania Gibco-BRL podłączoną do źródła próżni. Po całkowitym usunięciu cieczy, membranę przemywano czterokrotnie w kąpieli zawierającej 0,5% kwasu ortofosforowego (H3PO4) oraz jednokrotnie w etanolu, inkubowano przez 10 minut, za każdym razem wstrząsając, a następnie umieszczono w aparacie Hewlett Packard TopCount Manifold i dokonano pomiaru radioaktywności po dodaniu 10 μl Microscint® (płynu do licznika β-scyntylacji). Wartości IC₅₀ określono przy wykorzystaniu analizy regresji liniowej procentowych wartości hamowania dla każdego związku, dla co najmniej czterech wartości stężenia (z zasady były to wartości 0,01, 0,1, 1,0 oraz 10 μmol). Wartości IC₅₀ które można było określić dla związków o wzorze I leżały w przedziale od 1 do 10000 nM, korzystnie w przedziale od 1 do 100 nM.

Hamowanie autofosforylacji receptora KDR wywoływanej przez VEGF może być potwierdzone w dalszych doświadczeniach in vitro, przeprowadzonych na komórkach: transfekowane komórki CHO, które stale eksprymują receptor VEGF (KDR), wysiano do kompletnej pożywki zawierającej 10% surowicę płodu cielęcego (FCS) na 6-wgłębieniowych płytkach do hodowli komórkowych i inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do momentu, w którym wykazywały 80% połączenia. Następnie, badane związki rozcieńczano w pożywce hodowlanej (bez FCS, z 0,1% albuminą surowicy wołu) i dodano do komórek. (Grupy kontrolne zawierały pożywkę bez związków badanych). Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, dodano rekombinowane VEGF; przy końcowym stężeniu VEGF równym 20 ng/ml). Po dalszych pięciu minutach inkubacji w temperaturze 37°C, komórki przemywano dwukrotnie lodowatym PBS (solanka buforowana buforem fosforanowym) i bezpośrednio po

PL 219 723 B1 tym poddano lizie w 100 μΐ buforu do lizy. Lizaty odwirowano w celu usunięcia jąder komórkowych, a stężenia białek w nadsączach określono przy wykorzystaniu dostępnej handlowo próby białkowej (BIORAD). Następnie lizaty mogą być od razu wykorzystane, albo jeśli to konieczne przechowywane w temperaturze -20°C.

W celu pomiaru fosforylacji receptora KDR przeprowadzany jest pomiar przy wykorzystaniu „kanapkowej” techniki ELISA: monoklonalne przeciwciało do KDR (na przykład Mab 1495,12,14) unieruchamiane jest na czarnych płytkach do badań ELISA (OptiPlate™ HTRF-96 z firmy Packard). Następnie płytki są przemywane, a pozostałe wolne centra wiązania białek są nasycane przy wykorzystaniu 1% BSA (albuminy serum wołu) w PBS. Następnie, lizaty komórkowe (20 μg białka na wgłębienie) są inkubowane na tych płytkach przez noc w temperaturze 4°C razem z przeciwciałem antyfosfotyrozynowym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (PY20:AP z firmy Transduction Laboratories). Następnie płytki są kolejny raz przemywane, a wiązanie przeciwciała antyfosfotyrozynowego do unieruchomionych fosforylowanych receptorów jest demonstrowane przy zastosowaniu podłoża luminescencyjnego AP (CDP-Star, gotowe do użycia, z Emerald II; TROPIX). Pomiar luminescencji jest dokonywany w liczniku scyntylacyjnym Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count). Różnice pomiędzy sygnałami uzyskanymi dla pozytywnej grupy kontrolnej (pobudzanej VEGF) oraz dla negatywnej grupy kontrolnej (nie pobudzanej VEGF) odpowiadają stopniowi fosforylacji receptora KDF indukowanej przez VEGF (= 100%). Aktywność związków badanych obliczano jako % hamowanie fosforylacji receptora KDF indukowanej przez VEGF, gdzie stężenie związku wywołującego połowę maksymalnego hamowania określone jest jako ED50 (dawka skuteczna do 50% hamowania). Związki o wzorze I wykazują korzystnie wartości ED50 z zakresu od 0,25 nM do 1000 nM, korzystniej od 0,25 do 250 nM.

Związek według wynalazku oraz inne związki o wzorze I hamują aktywność innych kinaz tyrozynowych biorących udział w przekazywaniu sygnałów, w których pośred niczą czynniki tropowe, na przykład, kinaz Ber-Abl i Abl, Arg, kinaz pochodzących z rodziny Src, zwłaszcza kinazy c-Src, Lek, oraz Fyn; jak również kinaz z rodziny EGF, na przykład kinazy, c-erbB2 (HER-2), kinazy c-erbB3, kinazy c-erbB4; insulino-podobnych kinaz receptora czynnika wzrostu (kinaza IGF-1) , zwłaszcza członków rodziny kinaz tyrozynowych receptora PDGF, takich jak kinaza receptora PDGF, kinaza receptora CSF-1, kinaza receptora Kit oraz kinaza receptora VEGF; jak również kinaz serynowych/treoninowych, z których wszystkie biorą udział w regulacji wzrostu i transformacji komórek ssaków, w tym komórek człowieka.

Hamowanie aktywności kinazy tyrozynowej c-erbB2 (HER-2) może być zmierzone, na przykład, w ten sam sposób jak hamowanie kinazy białkowej EGF-R, przy zastosowaniu znanych sposobów.

Związki o wzorze ogólnym I wykazują skuteczność leczniczą, zwłaszcza względem zaburzeń zależnych od kinaz białkowych, zwłaszcza chorób rozrostowych.

W związku z ich skutecznością jako inhibitorów kinazy tyrozynowej receptora EGF, związki o wzorze I hamują głównie wzrost naczyń krwionośnych, będąc w ten sposób skutecznymi względem szeregu chorób związanych z rozregulowaną angiogenezą, zwłaszcza chorób powodowanych przez neowaskularyzację oczną, szczególnie retinopatii, takich jak retinopatia cukrzycowa albo związana z wiekiem degeneracją plamki żółtej, łuszczycy, guza mózgu złożonego z angioblastów, takiego jak naczyniak krwionośny, zaburzeń rozrostowych komórki mezangium w kłębuszku, takich jak przewlekłe albo ostre choroby nerkowe, np. nefropatia cukrzycowa, zmian nerkowych w ciśnieniu złośliwym, zespołów zakrzepowych chorób włośniczek albo odrzuceń przeszczepów, albo w szczególności zapalnych chorób nerek, takich jak zapalenie kłębuszków nerkowych, zespół hemolityczno-mocznicowy, nefropatia cukrzycowa, nadciśnieniowa marskość nerki, ognisko miażdżycowe, nawrót zwężenia naczyń, chorób auto-agresyjnych, cukrzycy, endometriozy, przewlekłej astmy, oraz szczególnie chorób nowotworowych (guzów litych, a także białaczek i innych „guzów ciekłych”, zwłaszcza tych eksprymujących c-kit, KDR, Flt-1 or Flt-3), zwłaszcza takich jak rak piersi, rak okrężnicy, rak płuc, (zwłaszcza drobnokomórkowy rak płuc) rak prostaty albo mięsak Kaposiego. Związek o wzorze I (albo jego N-tlenek) hamuje wzrost guzów i jest szczególnie odpowiedni do zapobiegania przerzutom nowotworowym oraz wzrostowi mikroprzerzutów.

Związek według wynalazku może być podawany samodzielnie albo w połączeniu z co najmniej jednym, innym środkiem leczniczym, przy czym możliwe kombinacje mogą mieć postać kombinacji stałych, albo związek według wynalazku i co najmniej jeden inny środek leczniczy mogą być stosowane przemiennie albo niezależnie jeden od drugiego, albo mogą być stosowane kombinacje stałe oraz co najmniej jeden inny środek terapeutyczny. Ponadto albo dodatkowo, związek według wynalazku

PL 219 723 B1 może być w przypadku terapii nowotworowej, takiej jak leczenie białaczki, stosowany w połączeniu z chemioterapią, immunoterapią, interwencją chirurgiczną albo ich kombinacją. Możliwa jest również terapia długoterminowa jako leczenie wspomagające w kontekście innych strategii terapeutycznych, opisanych powyżej. Inne możliwe sposoby leczenia obejmują terapie mające na celu utrzymanie stanu pacjenta po ustąpieniu nowotworu, lub nawet terapie chemio-zapobiegawcze, na przykład w przypadku pacjentów u których występuje ryzyko.

Środkiem leczniczym, który może być zastosowany w kombinacji jest szczególnie co najmniej jeden związek cytostatyczny albo cytotoksyczny, na przykład środek do chemioterapii albo kilka związków wybranych z grupy obejmującej indarubicynę, cytarabinę, interferon, hydroksymocznik, bisulfan, albo inhibitor biosyntezy poliaminy, inhibitor kinazy białkowej, zwłaszcza kinazy serynowe/treoninowe, takie jak kinaza białkowa C, albo kinazy tyrozynowej, takiej jak kinaza tyrozynowa naskórkowego receptora hormonu wzrostu, cytokina, negatywny regulator wzrostu, taki jak TGF-β albo INF-β, inhibitor aromatazy, klasyczny związek cytostatyczny, oraz inhibitor oddziaływań domeny SH2 z fosforylowanym białkiem.

Związek według wynalazku nie jest przeznaczony jedynie do zastosowań (profilaktycznych oraz korzystnie terapeutycznych) u ludzi, lecz również do leczenia innych zwierząt ciepłokrwistych, na przykład zwierząt użytecznych przemysłowo, na przykład gryzoni, takich jak myszy, króliki czy szczury albo świnki morskie. Związek taki może być również zastosowany jako standard odniesienia w układach testowych opisanych powyżej, pozwalających na porównanie z innymi związkami.

Związki o ogólnym wzorze I mogą być otrzymane sposobami, które są znane per se, zwłaszcza sposobem, w którym w celu syntezy związku o wzorze I, w którym symbole R1, R2 i R4 są określone jak dla związku o wzorze I, przeprowadza się reakcję kwasu 4-R4-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowego o wzorze II

w którym R4 jest określone jak dla związku o wzorze I, albo jego pochodnej, w której grupa karboksylowa -COOH jest w formie aktywowanej, z aminą o wzorze (III)

R1-NH-R2 (III) w którym R1 oraz R2 są określone jak dla związku o wzorze I, ewentualnie w obecności środka odwadniającego oraz obojętnej zasady oraz/lub odpowiedniego katalizatora, oraz ewentualnie w obecności rozpuszczalnika obojętnego.

gdzie związki wyjściowe II oraz III mogą być również obecne z grupami funkcyjnymi w formie zabezpieczonej, jeśli to konieczne, oraz/lub w formie soli, pod warunkiem, że grupa tworząca sól jest obecna, a reakcja związku w postaci soli jest możliwa; przy czym grupy zabezpieczające w zabezpieczonej pochodnej związku o wzorze I są usuwane; oraz, jeśli jest to pożądane, uzyskany związek o wzorze I jest przekształcany w inny związek o wzorze I albo jego N-tlenek, związek o wzorze I w formie wolnej jest przekształcany w sól, uzyskana sól związku o wzorze I jest przekształcana w związek o wzorze I w formie wolnej albo inną sól, oraz/lub mieszanina izomerycznych związków o wzorze I jest rozdzielana na pojedyncze izomery.

Preparaty farmaceutyczne i zastosowania związku

Związek według wynalazku może być zastosowany do leczenia choroby nowotworowej podatnej na hamowanie aktywności kinazy białkowej, obejmującego podawanie zwierzęciu ciepłokrwistemu wymagającemu takiego leczenia związku według wynalazku lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli w ilości skutecznej względem wspomnianej choroby.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według wynalazku jako składnik aktywny może być stosowana w leczeniu chorób nowotworowych. Można wytwarzać kompozycje do podawa8

PL 219 723 B1 nia dojelitowego, takiego jak podawanie donosowe, dopoliczkowe, doodbytnicze, czy doustne, oraz do podawania pozajelitowego, takiego jak podawanie dożylne, domięśniowe czy podskórne, przeznaczone dla zwierząt ciepłokrwistych i ludzi. Dawka składnika aktywnego zależeć będzie od leczonej choroby, oraz gatunku, wieku, wagi i indywidualnego stanu pacjenta, indywidualnych danych farmakokinetycznych oraz drogi podawania.

Kompozycja farmaceutyczna ze związkiem według wynalazku może być zastosowana w profilaktyce albo leczeniu ciała ludzkiego albo zwierzęcego, zwłaszcza w przypadku przewlekłej białaczki szpikowej (Cml).

Kompozycje farmaceutyczne zawierają od około 1% do około 95% składnika aktywnego, przy czym formy podawania w postaci dawek jednostkowych zawierają w korzystnym wariancie od około 20% do około 90% składnika aktywnego, a formy podawania nie będące dawkami jednostkowymi zawierają w korzystnym wariancie od około 5% do około 20% składnika aktywnego. Dawkami jednostkowymi są, na przykład, tabletki powlekane i niepowlekane, ampułki, fiolki, czopki albo kapsułki. Innymi formami dawkowania są, na przykład, maści, kremy, pasty, pianki, nalewki, spraye, itp. Przykładem są kapsułki zawierające od około 0,05 g do około 1,0 g składnika aktywnego.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku są otrzymywane sposobami znanymi per se, na przykład przy wykorzystaniu tradycyjnych czynności takich jak mieszanie, granulowanie, powlekanie, rozpuszczanie czy liofilizacja.

Korzystne jest stosowanie roztworów związków aktywnych, jak również zawiesin czy dyspersji, zwłaszcza izotonicznych roztworów wodnych, dyspersji lub zawiesin, które dla przykładu, w przypadku kompozycji liofilizowanych zawierających samodzielny składnik aktywny albo razem z nośnikiem, mogą być przygotowane przed podaniem. Kompozycje farmaceutyczne mogą być sterylizowane oraz/lub mogą zawierać zaróbki, na przykład środki konserwujące, stabilizujące, zwilżające oraz/lub emulgatory, środki zwiększające rozpuszczalność, sole regulujące ciśnienie osmotyczne oraz/lub bufory i są otrzymywane sposobami znanymi per se, na przykład przy wykorzystaniu tradycyjnych czynności takich jak rozpuszczanie oraz liofilizacja. Wspomniane roztwory albo zawiesiny mogą zawierać środki zwiększające lepkość oraz środki zwiększające rozpuszczalność.

Zawiesiny w olejach zawierają, jako składnik olej roślinny, syntetyczny, albo półsyntetyczny, odpowiedni do wstrzykiwania. W związku z powyższym, warto wspomnieć szczególnie o ciekłych estrach kwasów tłuszczowych zawierających, jako składnik kwasowy, długo-łańcuchowy kwas tłuszczowy posiadający od 8 do 22 atomów węgla. Składnik alkoholowy tych estrów kwasów tłuszczowych posiada maksymalnie 6 atomów węgla i jest alkoholem jedno wartościowym albo wielowartościowym, na przykład jedno-, dwu- albo trójwartościowym, zwłaszcza glikolem albo glicerolem.

Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą być otrzymane, na przykład, przez połączenie składnika aktywnego z co najmniej jednym stałym nośnikiem, jeśli to konieczne, granulowanie uzyskanej mieszaniny, oraz przetwarzanie mieszaniny albo granulek, jeśli to pożądane albo konieczne, przez dodatek dodatkowych zaróbek, w celu uformowania tabletek albo rdzeni tabletek.

Odpowiednimi nośnikami są zwłaszcza środki wypełniające, takie jak cukry, preparaty celulozy oraz/lub fosforany wapnia, jak również środki wiążące, takie jak skrobie, oraz/lub poliwinylopirolidon, oraz/lub, jeśli to konieczne środki spulchniające. Dodatkowymi zaróbkami są zwłaszcza środki utrzymujące płynięcie oraz środki smarujące.

Rdzenie tabletek, zwłaszcza dojelitowe, mogą posiadać odpowiednie powłoki uzyskane przez zastosowanie, między innymi, stężonych roztworów cukru, które mogą zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, glikol polietylenowy oraz/lub dwutlenek tytanu, albo roztwory powłok w odpowiednich rozpuszczalnikach organicznych albo mieszaninach rozpuszczalników, albo w przypadku powłok dojelitowych odpowiednie preparaty celulozy.

Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą również obejmować twarde kapsułki zawierające żelatynę, jak również miękkie, zamknięte kapsułki zawierające żelatynę i plastyfikator. Kapsułki twarde mogą zawierać składnik aktywny w postaci granulek, na przykład zmieszany ze środkami wypełniającymi, wiążącymi oraz/lub poślizgowymi, oraz ewentualnie środkami stabilizującymi. W przypadku kapsułek miękkich, składnik aktywny jest korzystnie rozpuszczony albo jest w postaci zawiesiny w odpowiedniej ciekłej zaróbce, do której mogą być także dodane środki stabilizujące i detergenty.

Kompozycje odpowiednie do podawania doodbytniczego stanowią, na przykład, czopki zawierające kombinację składnika aktywnego i podłoża czopkowego.

PL 219 723 B1

Do podawania pozajelitowego szczególnie korzystne są wodne roztwory składnika aktywnego w formie rozpuszczalnej w wodzie, na przykład w postaci soli rozpuszczalnej w wodzie, albo wodne zawiesiny do wstrzykiwań, zawierające środki zwiększające lepkość, na przykład sól sodową karboksymetylocelulozy, sorbitol oraz/lub dekstran oraz, jeśli to pożądane, środki stabilizujące. Składnik aktywny, ewentualnie wraz z zaróbkami, może być również w postaci liofilizatu i może być przetworzony w roztwór przed podaniem pozajelitowym poprzez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika.

Roztwory takie jak stosowane, na przykład, do podawania pozajelitowego, mogą być również wykorzystane do podawania infuzyjnego.

Korzystnymi środkami konserwującymi są, na przykład, środki przeciwutleniające takie jak kwas askorbinowy albo środki bakteriobójcze, takie jak kwas sorbinowy czy kwas benzoesowy.

Związek według wynalazku może być podawany zwierzęciu ciepłokrwistemu, na przykład człowiekowi wymagającemu takiego leczenia, jako taki albo w postaci kompozycji farmaceutycznych, profilaktycznie lub leczniczo, w ilości skutecznej względem choroby. W przypadku pacjenta o wadze około 70 kg, dawka dzienna mieści się w zakresie od 0,05 do około 5 g, korzystnie od około 0,25 do około

1,5 g związku według wynalazku.

Poniżej przedstawiono sposób otrzymywania związków wyjściowych oraz/lub związków pośrednich oraz związku według wynalazku.

Stosowane w przykładach skróty:

DMSO

HPLC/MS-MS min

t.t.

NMP

NMR

PEG dimetylosulfotlenek wysokosprawna chromatografia cieczowa/spektrometria masowa tandemowa minuty temperatura topnienia

N-metylo-pirolidon magnetyczny rezonans jądrowy glikol polietylenowy

Przykłady

P r z y k ł a d 1 (porównawczy): Otrzymywanie N-(2-furanylometylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzamidu

Roztwór zawierający ~50% bezwodnika propylofosfonowego w W,W-dimetyloformamidzie (Fluka, Buchs, Szwajcaria; 674 μ!, ~1 mmol) dodawany jest przez 20 minut do mieszanej mieszaniny zawierającej kwas 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowy (214,4 mg, 0,7 mmol), furfuryloaminę (Aldrich, Buchs, Szwajcaria; 61,8 μ!, 0,7 mmol) oraz trietyloaminę (776 μ!, 5,6 mmol) w 2 ml N,N-dimetyloformamidu. Po mieszaniu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, mieszaninę poddaje się działaniu pół-nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, po czym ekstrahuje trzykrotnie octanem etylu. Rozpuszczalnik jest odparowywany pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałości są suszone pod próżnią. Surowy produkt jest krystalizowany z dichlorometanu do uzyskania związku tytułowego w postaci krystalicznego ciała stałego.

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ): 2,28 (s, 3H); 4,43 (d, 2H); 6,23 (m, 1H); 6,33-6,37 (m, 1H); 7,30 (d, 1H); 7,42 (d, 1H); 7,49 (ddd, 1H); 7,53 (m, 1H); 7,59 (dd, 1H); 8,11 (d, 1H); 8,38 (m, 1H); 8,49 (d, 1H); 8,66 (dd, 1H); 8,87 (t, 1H); 9,05 (s, 1H); 9,22 (m, 1H).

Związki wyjściowe są otrzymywane jak następuje:

P r z y k ł a d 1a: Monoazotan (V) estru etylowego kwasu 3-[(aminoiminometylo)amino]-4-metylo-benzoesowego

Cyjanoamid (Fluka, Buchs, Szwajcaria; 77,4 g, 1,842 mol) dodawany jest do roztworu estru etylowego kwasu 3-amino-4-metylobenzoesowego (J. Med. Chem. 16, 118-122, 1973; 150 g, 0,837 mol) w 850 ml etanolu. Następnie kroplami przez 15 minut dodawany jest kwas chlorowodorowy (Fluka, Buchs, Szwajcaria; 108 ml roztworu 12M, 1,27 mol), po czym mieszanina reakcyjna mieszana jest w temperaturze 90°C (temperatura łaźni) przez 15 godzin. Rozpuszczalnik jest odparowywany pod zmniejszonym ciśnieniem do uzyskania pozostałości, które poddawane są działaniu wody (1000 ml) i mieszane równocześnie z chłodzeniem w temperaturze 5-10°C. Następnie kroplami przez 30 minut dodawany jest roztwór azotanu amonu (Merck, Darmstadt, Niemcy; 134,8 g, 1,68 mol) w wodzie (400 ml), po czym dodawana jest lodowata woda (1200 ml). Po mieszaniu przez kolejne 30 min, produkt jest odfiltrowywany, przemywany lodowatą wodą (3 x 1000 ml) i suszony na powietrzu. Pozostałości są przemywane eterem dietylowym (2 x 2000 ml) i suszone pod próżnią w temperaturze 50° do uzyskania związku tytułowego jako krystalicznego ciała stałego t.t. 195-197°C.

PL 219 723 B1

P r z y k ł a d 1b: Ester etylowy kwasu 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowego

Mieszaną mieszaninę zawierającą związek pośredni z Przykładu 1a (164 g, 0,577 mol), 3-(dimetyloamino)-1-(3-pirydynylo)-2-propen-1-on (113,8 g, 0,646 mol) oraz sproszkowany NaOH (99%; Merck, Darmstadt, Niemcy; 26,6 g, 0,658 mol) w etanolu (2200 ml) ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną przez 68 godz.. Rozpuszczalnik jest odparowywany z mieszaniny reakcyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałości są dzielone pomiędzy octan etylu i wodę. Warstwa organiczna jest oddzielana a warstwa wodna jest ekstrahowana trzykrotnie octanem etylu. Połączone ekstrakty organiczne są przemywane wodą i solanką, suszone (Na2SO4), a rozpuszczalnik jest odparowywany pod zmniejszonym ciśnieniem do uzyskania pozostałości, które są krystalizowane z eteru dietylowego do uzyskania związku tytułowego jako krystalicznego ciała stałego, t.t. 95-96°C.

P r z y k ł a d 1c: Kwas 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowy

Wodny roztwór wodorotlenku sodu (500 ml, 2M) dodawany jest kroplami do mieszanej zawiesiny zawierającej związek pośredni z Przykładu 1b (132,8 g, 0,397 mol) w etanolu (1200 ml) oraz wodę (1200 ml). Mieszanina reakcyjna mieszana jest w temperaturze 45°C przez 2,5 h, po czym przez

1,5 godz. dodawany jest kroplami wodny roztwór HCl (1000 ml, 1M). Po dodaniu wody (1000 ml), osad jest odfiltrowywany, przemywany wodą (4 x 500 ml) i suszony w temperaturze pokojowej. Pozostałości wody obecne w produkcie suszonym na powietrzu usuwane są przy wykorzystaniu destylacji azeotropowej z toluenem przy obniżonym ciśnieniu. Wysuszona zawiesina w toluenie jest rozcieńczana eterem dietylowym i odfiltrowywana. Stałe pozostałości są przemywane eterem dietylowym i suszone pod próżnią w temperaturze 80°C do uzyskania związku tytułowego, t.t. 277-278°C.

P r z y k ł a d 69 (porównawczy): Otrzymywanie 3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[(4-metylo-1-piperazynylo)metylo]-benzamidu

Dietylocyjanofosfonian (Aldrich, Buchs, Szwajcaria; 0,50 ml, 3,0 mmol) dodawany jest do mieszanej mieszaniny zawierającej kwas 3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowy (438 mg,

1,5 mmol), 4-[(4-metylo-1-piperazynylo)metylo]benzenoaminę (308 mg, 1,5 mmol) oraz trietyloaminę (840 μ|, 3,0 mmol) w 10 ml Ν,Ν-dimetyloformamidu w temperaturze 10°C. Po mieszaniu przez 12 godzin w temperaturze 60°C, mieszanina poddawana jest działaniu nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu i ekstrahowana trzykrotnie octanem etylu. Połączone ekstrakty przemywane są wodą, a rozpuszczalnik jest odparowywany pod obniżonym ciśnieniem do uzyskania pozostałości. Pozostałości są ponownie przeprowadzane w zawiesinę w wodzie i odfiltrowywane do uzyskania surowego produktu, który jest rekrystalizowany z octanu tetrahydrofurano-etylu do uzyskania N-[3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[(4-metylo-1-piperazynylo)-metylo]benzamidu w postaci krystalicznego ciała stałego t.t. 220-224°C.

P r z y k ł a d 69a: Monoazotan estru metylowego kwasu 3-[(aminoiminometylo)amino]-4-metylobenzoesowego

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 1a, lecz przy wykorzystaniu estru metylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (Fluka, Buchs, Szwajcaria) zamiast estru etylowego kwasu 3-amino-4-metylobenzoesowego, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t. 170-172°C.

P r z y k ł a d 69b: Ester metylowy kwasu 3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowego

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 1b, lecz przy wykorzystaniu związku pośredniego z Przykładu 69a zamiast monoazotanu estru etylowego 4-metylo-3-[(aminoiminometylo)-amino]-4-metylobenzoesowego, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t. 195-200°C.

P r z y k ł a d 69c: Kwas 3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowy

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 1c, lecz przy wykorzystaniu związku pośredniego z Przykładu 69b zamiast estru etylowego kwasu 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoesowego, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t. 285-293°C.

P r z y k ł a d 91 (porównawczy):

Otrzymywanie 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[5-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)fenylo]-benzamidu

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 69, lecz przy wykorzystaniu 5-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)-benzenoaminy zamiast 3-[(1-hydroksy-1-metyloetylo)]-5-(1,1,1-trifluoro-metylo)benzenoaminy, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego , t.t. 242-247°C.

PL 219 723 B1

Anilina jest wytwarzana w następujący sposób:

P r z y k ł a d 91a: 3-(2-Metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzonitryl

Mieszaninę zawierającą 3-fluoro-5-(trifluorometylo)-benzonitryl (Lancaster Synthesis GmbH; 17 g, 89 mmol) oraz 2-metyloimidazol (Fluka, Buchs, Szwajcaria; 22,2 g, 270 mmol) w N,N-dimetyloacetamidzie (80 ml) mieszano w temperaturze 145°C przez 19 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałości rozpuszczono w octanie etylu (200 ml). Roztwór przemyto solanką (200 ml), wysuszono (Na2SO4) a rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem do uzyskania surowego produktu, który następnie oczyszczono przez rekrystalizację z mieszaniny eter - heksan do uzyskania związku tytułowego w postaci żółtego krystalicznego ciała stałego, t.t. 132-134°C.

P r z y k ł a d 91b: Kwas 3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzoesowy

Roztwór zawierający 3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzonitryl (Przykład 91a; 16,7 g, 66 mmol) w dioksanie (300 ml) dodano do wodnego roztworu wodorotlenku sodu (275 ml roztworu 1 M), po czym mieszaninę ogrzewano w temperaturze 95°C przez 18 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałości zobojętniono kwasem chlorowodorowym (1 M) i ekstrahowano butanolem (2 x 250 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem do uzyskania związku tytułowego.

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-da, δ): 7,17 (s, 1H); 8,03 (s, 1H); 8,12 (s, 1H); 8,35 (s, 1H); 8,41 (s, 1H); 8,53 (s, 1H); 13,90 (br, 1H).

P r z y k ł a d 91c: Ester 1,1-dimetyloetylowy kwasu [3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)fenylo]-karbamowego

Trietyloaminę (5,23 ml, 37,5 mmol) dodawano do mieszanej zawiesiny kwasu 3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzoesowego (Przykład 91b; 6,8 g, 25 mmol) w t-butanolu (200 ml). Do uzyskanego roztworu dodano difenylofosforyloazydek (7,6 g, 27,5 mmol), po czym mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C przez 16 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałości poddano działaniu wody (100 ml) i ekstrahowana octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (100 ml), wysuszono (Na2SO4), a rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem do uzyskania surowego produktu, który następnie oczyszczono na kolumnie chromatograficznej (żel krzemionkowy, eluent: 2% etanol w octanie etylu) i rekrystalizowano z mieszaniny eter - heksan do uzyskania związku tytułowego w postaci bezbarwnego, krystalicznego ciała stałego, t.t. 203-208°C.

P r z y k ł a d 91d: 5-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)-benzenoamina

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 90c lecz przy wykorzystaniu estru 1,1-dimetyloetylowego kwasu [3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)fenylo]-karbamowego (Przykład 91c) zamiast estru 1,1-dimetyloetylowego kwasu [3-(4-morfolinylo)-5-(trifluorometylo)fenylo]karbamowego, uzyskano związek tytułowy w postaci żółtego krystalicznego ciała stałego, t.t. 130-133°C.

P r z y k ł a d 92: Otrzymywanie związku według wynalazku

4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[5-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)fenylo]-benzamidu

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 69, lecz przy wykorzystaniu 5-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)-benzenoaminy zamiast 3-[(1-hydroksy-1-metyloetylo)]-5-(1,1,1-trifluorometylo)benzenoaminy, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t.

235-236°C.

Anilina jest wytwarzana w następujący sposób:

P r z y k ł a d 92a: 3-(4-Metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzonitryl

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 91a, lecz przy wykorzystaniu 4-metylo-1H-imidazolu zamiast 2-metyloimidazolu, uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t. 127-128°C.

P r z y k ł a d 92b: Kwas 3-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzoesowy

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 91b, lecz przy wykorzystaniu 3-(4-metylo1 H-imidazol-1 -ilo)-5-(trifluorometylo)-benzonitrylu (Przykład 92a) zamiast 3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzonitrylu uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego,

t.t. > 300°C.

P r z y k ł a d 92c: Ester 1,1-dimetyloetylowy kwasu[3-(4-Metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)fenylo]-karbamowego

PL 219 723 B1

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 91c, lecz przy wykorzystaniu kwasu 3-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)benzoesowego (Przykład 92b) zamiast kwasu 3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)-benzoesowego uzyskano związek tytułowy w postaci krystalicznego ciała stałego, t.t. 186-188°C.

P r z y k ł a d 92d: 5-(2-Metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)-benzenoamina

Przy wykorzystaniu procedury opisanej w Przykładzie 91d, lecz przy wykorzystaniu estru 1,1-dimetyloetylowego kwasu [3-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)fenylo]-karbamowego (Przykład 92c) zamiast estru 1,1-dimetyloetylowego kwasu [3-(2-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-5-(trifluorometylo)fenylo]-karbamowego, uzyskano związek tytułowy w postaci bezbarwnego krystalicznego ciała stałego, t.t. 127-131°C.

P r z y k ł a d 97: Miękkie kapsułki

5000 miękkich kapsułek żelatynowych zawierających jako składnik aktywny 0,05 g jednego ze związków o wzorze I przygotowano w następujący sposób:

250 g zmielonego składnika aktywnego przeprowadzano w zawiesinę w 2 I Lauroglykolu2 (laurylowy glikol propylenowy, Gattefosse S.A., Saint Priest, Francja) i osadzono w młynie pyłowym do mielenia na mokro w celu uzyskania cząstek o rozmiarach od około 1 do 3 μm. Następnie porcje 0,419 g mieszaniny wprowadzono do miękkich kapsułek żelatynowych przy wykorzystaniu maszyny do kapsułkowania.

P r z y k ł a d 98: Badania farmakokinetyczne dla związków o wzorze ogólnym I, nie objętych ochroną, analogicznych do związku według wynalazku

Badany związek o wzorze I jest przygotowywany do podania samicy myszy OF1 uzyskanej z firmy IFACREDO, Francja, przez rozpuszczenie w NMP, a następnie przez rozcieńczenie PEG300 do stężenia końcowego równego 10% obj. NMP: 90% obj. PEG300, dzięki czemu uzyskuje się klarowny roztwór związku. Stężenie ustalono tak, by dostarczać stałą objętość równą 10 ml/kg masy ciała. Związek jest przygotowywany bezpośrednio przed zastosowaniem. Przygotowany związek podawany jest doustnie przez zgłębnik w celu dostarczenia dawek 50 mg/kg. W wyznaczonych punktach czasowych, myszy (4 na raz) usypiano przy wykorzystaniu 3% izofluranu w medycznym tlenie, po czym pobierano próbki krwi (ok. 30 IU/ml) do probówek zawierających heparynę, przez nakłucie. Następnie zwierzęta uśmiercano bez wybudzania. Z próbek uzyskiwano osocze krwi przez odwirowywanie (10,000 g, 5 min) i albo od razu analizowano, albo przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C.

Do próbek osocza krwi (10 - 250 μθ dodawano np. 5 μl wewnętrznego roztworu standardowego, mieszano z 200 μl 0.1 M NaOH i 500 μl chloroformu w 1,5 ml w probówce Eppendorfa i wstrząsano energicznie przez 10 minut w mieszalnika Eppendorfa. Następnie, mieszaninę odwirowano (3 min przy 10'000 xg), fazę organiczną przeniesiono do drugiej probówki Eppendorfa i odparowano do suchości w wirówce próżniowej (Speedvac 5301). Suche pozostałości rozpuszczono np. w 250 μl 10% obj. acetonitrylu w wodzie, zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego. Następną analizę przeprowadzono np. przy wykorzystaniu HPLC/MS-MS stosując system HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Palo Alto, CA, USA) z próżniowym pochłaniaczem gazów, pompą binarną i termostatowany przedział kolumny połączony z chłodzonym układem do automatycznego zbierania próbek, (HTS PAL, CTC Analytics, Zwingen, Szwajcaria). Próbki (5-15 μΓ> wstrzykiwano do np. kolumny Ultra Phenyl (rozmiar cząstek 3 μm, 50 x 1 mm; Restek, Bellefonte, USA) z kolumną zabezpieczającą (4 x 2 mm) zawierającą ten sam materiał (Phenomenex, Torrance, USA). Po ustaleniu się równowagi np. z wodą i po okresie oczekiwania równym 1 minutę, próbka jest eluowana np. przy zastosowaniu liniowego gradientu 0 - 100% acetonitrylu w wodzie, zawierającej 0.2% obj. kwasu mrówkowego przez 11 minut przy szybkości przepływu 60 μ^^. Kolumna przygotowywana jest dla następnej próbki np. przez ponowne ustalenie stanu równowagi przez 3 minuty przy wykorzystaniu 100% wody do warunków wyjściowych. Rozdzielanie dokonywane jest np. przy temperaturze kolumny równej 40°C. Strumień wypływający z kolumny wprowadzany jest np. bezpośrednio do źródła jonów na trzecim stopniu kwadrupolowego spektrometru masowego (Quattro Ultima™, Micromass, Manchester, UK) sterowanego przez oprogramowanie Masslynx™ 3.5 (Micromass, Manchester, UK) wykorzystującym jako technikę jonizacji dodatni tryb jonizacji electrosprajem (ESI +). Związek wykrywany jest przy wykorzystaniu MS/MS, po którym następuje fragmentacja na jony macierzyste. Limit ilościowy określany jest na 0,002 nmol/l. Krzywa kalibracyjna tworzona jest przy wykorzystaniu znanych ilości związku włączając w to ustaloną ilość standardu wewnętrznego w osoczu krwi, przetworzonym jak opisano powyżej. Stężenie nieznanych próbek obliczane jest na podstawie wykresu zależności stosunku powierzchni piku dla wybranego jonu pochodnego z analizowanej próbki do produktu standardu wewnętrznego

PL 219 723 B1 (rzędna) od stężenia nominalnego (odcięta). Analiza regresyjna przeprowadzana jest przy wykorzystaniu oprogramowania Quanlynx™, Masslynx™ 3.5 (Micromass, Manchester, UK).

P r z y k ł a d 99: Zestawienie danych dotyczących hamowania in vitro dla związków o wzorze ogólnym I:

Dane dotyczące hamowania enzymatycznego (c-Abl, KDR, Flt3) in vitro przedstawione są jako % hamowania przy stężeniu 10 μΜ. Pomiary wykonywano w sposób opisany powyżej w opisie ogólnym.

Przykład	Abl% przy 10 μΜ	KDR% przy 10 μΜ
1	2	3
N-(2-furanylometylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]benzamid	51	57
N-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -[(4-metylo-1-piperazynylo)metylo]benzenoamina	97	73
1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -(2-pirydynylo)piperazyna	66	71
4-Metylo-N-[2-(2-pirydynylo)etylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	77	46
4-Metylo-N-[1-(fenylometylo)-4-piperydynylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]benzamid	71	60
4-Metylo-N-(4-pirydynylometylo)-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	51	56
4-Metylo-N-[2-(1-metylo-1H-pir-2-ylo)etylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	72	45
N-[(4-Metoksyfenylo)metylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	70	81
4-Metylo-N-(2-metylopropylo)-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	44	39
4-Metylo-N-(2-morfolinoetylo)-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]- amino]-benzamid	57	48
4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[(tetrahydro-2- -furanylo)metylo]benzamid	53	41
N-[2-(2,4-Dihydroksy-5-pirymidynylo)etylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- pirymidynylo]amino]benzamid	22	33
N-Cykloheksylo-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]- amino]benzamid	78	48
N-[(3S)-Heksahydro-2-okso-1H-azepin-3-ylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]benzamid	49	54
N-[2-(3,4-Dimetoksyfenylo)etylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]-amino]benzamid	60	23
Ester etylowy kwasu 2-[[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]amino]-4-tiazolo-oetowego	42	10
N-[3-(1H-Imidazol-1-ilo)propylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]benzamid	54	62
N-(Cyklopropylometylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]- amino]benzamid	56	62
N-(2-Metoksyetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]- amino]benzamid	41	33
4-Metylo-N-[3-(2-okso-1-pirolidynylo)propylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	56	22

PL 219 723 B1 cd. tabeli

1	2	3
N,4-Dimetylo-N-(fenylometylo)-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	30	93
N-[4-(Acetyloamino)fenylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	59	7
N-(4-Metoksy-2-metylofenylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	90	67
4-Metylo-N-[4-(metylosulfonylo)benzylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	80	70
N-[[4-(Dimetyloamino)fenylo]metylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	44	73
N-(2-Amino-2-oksoetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	55	56
Ester metylowy N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoilo]glicyny	54	51
Ester metylowy N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]beta-alaniny	73	61
N-[[4-(aminosulfonylo)fenylo]metylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	78
N-(3-Hydroksypropylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	57	37
N,N-Dietylo-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzamid	68	83
Ester 1,1-dimetylo-etylowy N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoilo]-(L)-fenylalaniny	90	37
Ester 1,1-dimetyloetylowy N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoilo]-(D)-alaniny	97	51
N-[1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -piperydynylo]-benzamid	73	89
4-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]- morfolina	27	47
1-(4-Metoksyfenylo)-4-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]- benzoilo]-piperazyna	57	77
1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -(4-pirydynylo)-piperazyna	28	82
1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -(pirazynylo)-piperazyna	74	91
1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]- -4-(fenylometylo)-piperazyna	64	74
1-Cyklopentyl-4-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]benzoilo]-piperazyna	65	78
4-{{4-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-1- -piperazynylo}-acetylo}morfolina	13	52
1-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -[2-okso-2-(1-pirolidynylo)etylo]piperazyna	32	56
Ester etylowy kwasu 4-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-1-piperazyno-karboksylowego	37	63
2-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-1,2,3,4- -tetrahydro-izochinoliny	75	97

PL 219 723 B1 cd. tabeli

1	2	3
N,N-bis(2-Metoksyetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	34	61
1'-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-1,4'- -bipiperydyna	1	43
Ester etylowy N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-N-(fenylometylo)-glicyny	39	74
N-(3-Chlorofenylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	90	50
N-(2,2-Difenyloetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	72	37
N-(2,3-Dihydro-1H-inden-1-ylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	87	83
N-(Difenylmetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	92	52
4-Metylo-N-[2-(1-piperydynylo)etylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	78	37
Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]- -N-(5,6,7,8-tetrahydro-1-naftalenylo)-benzamid	88	79
4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N- -[[4-(trifluorometylo)fenylo]metylo]-benzamid	69	74
4-Metylo-N-[(5-metylopirazynylo)metylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	43	54
N-(2-Etoksyetylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	40	44
4-Metylo-N- [2-(2-okso-1-imidazolidinylo)etylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]-amino]-benzamid	8	42
4-Metylo-N-(5-metylo-2-pirydynylo)-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]- benzamid	40	26
1-[4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-4- -fenylo-4-piperydynolu	75	83
N-(3-Benzoilofenylo)-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	79	36
Ester 1,1-dimetyloetylo N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]-glicyny	95	65
Ester etylowy kwasu 4-[[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]amino]-benzeno-octowego	59	44
4-Metylo-N-[3-(metylofenylamino)propylo]-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	74	82
Ester etylowy kwasu 1-[[3-[[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]benzoilo]amino]fenylo]-metylo]-4-piperydynokarboksylowego	56	59
Ester dietylowy kwasu [[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-benzoilo]amino]propanodiowego	96	60
N-[2-[bis(1-Metyletylo)amino]etylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	67	23
N-[3-(Dietyloamino)fenylo]-4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2- -pirymidynylo]amino]-benzamid	98	88
4-Metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[[3-[(1-hydroksy-1-metylo-etylo)]-5-( 1,1,1 -trifluorometylo)fenylo]metylo]-benzamid	99	96

PL 219 723 B1

Claims (3)

1. Związek pochodny pirymidynyloaminobenzamidu, którym jest 4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-N-[5-(4-metylo-1H-imidazol-1-ilo)-3-(trifluorometylo)fenylo]-benzamid o wzorze

Ν lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że składnik aktywny stanowi związek określony w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

3. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia białaczki.