PL222876B1 - Zastosowanie pochodnych glicerolu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania pochodnych glicerolu, a mianowicie jako czynnika zwiększającego przeżycie i aktywację neutrofilii lub czynnika proliferacji komórek macierzystych szpiku kostnego.

Chemioterapia dotyczy stosowania środków cytotoksycznych, takich jak, lecz nie wyłącznie, cyklofosfamid, doksorubicyna, daunorubicyna, winblastyna, winkrystyna, bleomycyna, etopozyd, topotekan, iminotekan, taksoter, taksol, 5-fluorouracyl, metotreksat, gemcytabina, cisplatyna, karboplatyna lub chlorambucil, w celu zniszczenia komórek i guzów nowotworowych. Jednakże środki te nie są specyficzne i, szczególnie w dużych dawkach, są toksyczne dla normalnych i szybko dzielących się komórek. Prowadzi to często do występowania różnych działań ubocznych u pacjentów poddawanych chemioterapii i radioterapii. Jednym z takich działań ubocznych jest mielosupresja, czyli znaczne zmniejszenie wytwarzania komórek krwi w szpiku kostnym. Charakteryzuje ją leukopenia, neuropenia i trombocytopenia. Ciężką przewlekłą neuropenię (idiopatyczną, okresową i wrodzoną) także charakteryzuje selektywne zmniejszenie liczby krążących neutrofili i zwiększona podatność na zakażenia bakteryjne.

Istotą leczenia nowotworu z użyciem chemioterapeutyków jest połączenie mechanizmu cytotoksyczności z mechanizmem selektywności wobec szybko namnażających się komórek nowotworowych w porównaniu do komórek organizmu gospodarza. Jednakże rzadko się zdarza, aby leki chemioterapeutyczne wykazywały taką selektywność. Cytotoksyczność środków chemioterapeutycznych ogranicza podawane dawki leków, wpływa na cykle leczenia i w poważnym stopniu zagraża jakości życia pacjenta onkologicznego.

Chociaż inne prawidłowe tkanki mogą być także uszkadzane, szpik kostny jest szczególnie wrażliwy na sposoby leczenia specyficzne wobec proliferacji komórek, takie jak chemioterapia lub radioterapia. Ostre i przewlekłe uszkodzenie szpiku kostnego jest częstym działaniem ubocznym różnych sposobów leczenia przeciwnowotworowego; prowadzi do spadku mian komórek krwi i niedokrwistości, leukopenii, neuropenii, agranulocytozy i trombocytopenii. Jedną z przyczyn występowania tych efektów jest zmniejszenie liczby komórek hematopoetycznych (np. pluripotencjalnych komórek macierzystych i innych komórek progenitorowych) spowodowane zarówno zabójczym działaniem środków cytotoksycznych lub promieniowania na te komórki, jak i różnicowaniem komórek macierzystych, stymulowanym przez mechanizm ze sprzężeniem zwrotnym, zainicjowany ubytkiem bardziej dojrzałych przedziałów szpiku kostnego.

Drugą przyczyną jest zmniejszenie zdolności komórek macierzystych do samoodnowy, co ma również związek zarówno z bezpośrednimi działaniami (mutacje), jak i pośrednimi (starzenie się populacji komórek macierzystych). (Tubiana, M. i inni, Radiotherapy and Oncology 29:1-17, 1993). Zatem różne sposoby leczenia przeciwnowotworowego często prowadzą do spadku liczby wielojądrzastych neutrofili (PMN) lub neuropenii. PMN stanowią pierwszą linię obrony przed atakiem patogenów i odgrywają główną rolę w czasie ostrego zapalenia; ich podstawową funkcją jest fagocytoza i zabijanie czynników zakaźnych. Dla wypełnienia tego zadania PMN opuszczają układ krążenia w odpowiedzi na czynniki chemotaktyczne i wchodzą do zaatakowanego obszaru, aby wypełniać swoje biologiczne funkcje. U osobników z prawidłową morfologią krwi, neutrofile stanowią około 60% wszystkich leukocytów. (SI Units Conversion Guide, 66-67 (1992), New England Journal of Medicine Books). Jednakże aż u jednego na trzech pacjentów otrzymujących chemioterapię z powodu nowotworu może występować neuropenia. W warunkach prawidłowych średnie miano neutrofili u zdrowych dorosłych ludzi wynosi około 4400 komórek/pl, w zakresie wartości 1800-7700 komórek/pl. Miano w zakresie 1000-500 komórek/pl oznacza umiarkowaną neuropenię, a miano 500 komórek/pl lub poniżej oznacza ciężką neuropenię. Pacjenci w stanie mielosupresji są podatni na zakażenia i często występują u nich zaburzenia krzepnięcia krwi, wymagające hospitalizacji. Brak neutrofili i płytek krwi jest główną przyczyną chorobowości i umieralności po leczeniu przeciwnowotworowym i przyczynia się do wysokich kosztów leczenia przeciwnowotworowego. W tych powyżej opisanych warunkach zastosowanie dowolnego środka zdolnego do zahamowania apoptozy neutrofili lub do pobudzenia aktywacji i mobilizacji neutrofili może mieć znaczenie terapeutyczne. Wysiłki zmierzające do odbudowania układu odpornościowego pacjenta po zastosowaniu chemioterapii obejmują zastosowanie hematopoetycznych czynników wzrostowych w celu pobudzenia pozostających komórek macierzystych do proliferacji i różnicowania się w dojrzałe komórki zdolne do zwalczania zakażenia.

W przypadku przeszczepu szpiku kostnego wykorzystywano zjawisko znane jako „mobilizacja” do uzyskania większej liczby komórek macierzystych/komórek progenitorowych z krwi obwodowej.

PL 222 876 B1

Metoda ta jest obecnie stosowana w autologicznym lub alogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Stosuje się czynniki wzrostowe w celu zwiększenia liczby obwodowych progenitorowych komórek macierzystych, które można uzyskać przed zastosowaniem leczenia mieloablacyjnego i podaniem progenitorowych komórek macierzystych we wlewie dożylnym.

Przeszczep szpiku kostnego zastosowany po leczeniu także może zwalczyć neuropenię. Jednakże wymaga to 10-15 dni leczenia, w czasie których pacjent jest podatny na zakażenie. Środki zdolne do pobudzenia komórek macierzystych szpiku kostnego mogą ułatwić i przyspieszyć zasiedlenie komórek macierzystych i w ten sposób skrócić okno neuropeniczne, występujące po przeszczepie szpiku kostnego.

Jakkolwiek hematopoetyczne czynniki wzrostu, takie jak czynnik stymulujący kolonie granulocytarno-makrofagowe (GM-CSF) i czynnik stymulujący kolonie granulocytarne (G-CSF) mogą wywierać takie działanie, ich stosowanie jest kosztowne, gdyż muszą być wytwarzane technikami rekombinacji. Stosowanie takiej terapii po leczeniu jest zbędne, jeśli pacjenci są w trakcie leczenia „chronieni lekami” (chemioochrona) przed immunosupresją.

W WO95/30413 dotyczy zastosowania kwasów tłuszczowych w przyśpieszaniu proliferacji krwiotwórczych komórek macierzystych, jednakże publikacja ta zdecydowanie zachęca do stosowania jedynie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do stymulowania hematopoezy. Ponadto kolejne badania wykonane przez tę samą grupę naukowców, opublikowane w artykule z Blood (1997), wskazują, że jakiekolwiek dalsze badania powinny koncentrować się na kwasach tłuszczowych C16-C18.

W publikacji Wanten i in. Journal of Lipid Research tom. 42 nr 3 marca 2001, pp. 428-436, ujawniono badanie mechanizmu aktywacji istniejących jut neutrofili i efekt MCT (średniołańcuchowych triglicerydów) i LT (długołańcuchowych triglicerydów) w hodowli neutrofili wyodrębnionych z ludzkiej krwi. Zaobserwowano aktywność fagocytozy cząsteczek drożdży (zymosan traktowany surowicą) przez istniejące neutrofile. Wanten i in. zaobserwowali, że MCI stymuluje aktywność istniejących neutrofili oraz, że mechanizm aktywacji jest zależny od Ca2+ i PKC. Brak jest natomiast omówienia dotyczącego granulopoezy, czyli wytwarzania nowych neutrofili przez komórki macierzyste.

Zatem istnieje nadal zapotrzebowanie na nowe środki i sposoby, które umożliwiłyby zmniejszenie niepożądanych skutków ubocznych stanu mielosupresji, wywołanego leczeniem chemioterapeutycznym i radioterapią.

Zgodnie z powyższym, celem wynalazku jest dostarczenie środków zawierających kwas kaprynowy, kwas kaprylowy, kwas laurynowy lub ich sole z metalami (sodowe, potasowe, wapniowe, magnezowej albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi do wytwarzania środków farmaceutycznych o działaniu chemioterapeutycznym, jako pojedynczego środka lub połączenia dwóch lub większej liczby środków, ewentualnie z innymi środkami chemioterapeutycznymi lub takimi lekami, które wywołują stan mielosupresji.

Kolejny cel wynalazku dotyczy zastosowania kwasu kaprynowego, kwasu kaprylowego lub ich soli sodowych lub triglicerydów albo ich mono- lub diglicerydów lub związków pokrewnych jako czynników pobudzających hematopoezę.

Wynalazek dotyczy zastosowania pochodnych glicerolu do wytwarzania leku do leczenia stanów związanych z przeszczepem szpiku lub do leczenia stanów wybranych spośród neuropenii, ran u pacjenta i mielosupresji, której przyczyną jest chemioterapia i radioterapia; przy czym pochodną, glicerolu stanowi związek o wzorze I o

II

R-C-O—

AY —

BO —

Y = O, NH I gdzie R₁ oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C7 lub C9 alkil;

o

II

A i B niezależnie oznaczają atom wodoru lub '1 *· .

Korzystne jest zastosowanie, w którym związek stanowi trigliceryd kwasu kaprylowego. Korzystne jest zastosowanie, w którym związek stanowi trigliceryd kwasu kaprynowego.

PL 222 876 B1

Korzystne jest zastosowanie, w którym stężenie związku we krwi wynosi powyżej 1 μΜ.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta mielosupresji, której przyczyną jest chemioterapią .

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta mielosupresji, której przyczyną jest radioterapia.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta przewlekłej neuropenii.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta przejściowej neuropenii.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest Choroba hamatologiczna.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii indukowanej lekami.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest niedobór żywieniowy.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest zakażenie .

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest radioterapia.

Korzystne jest zastosowanie, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta ran u pacjenta.

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek służy do indukowania mobilizacji neutrofili, co ułatwia przeszczep szpiku u pacjenta.

Korzystne jest zastosowanie, ponadto polegające na jednoczesnym podawaniu farmakologicznie skutecznej ilości ludzkiego czynnika stymulującego kolonie, przy czym ta farmakologicznie skuteczna ilość zostaje zmniejszona w obecności związku.

Korzystne jest zastosowanie, w którym czynnikiem stymulującym kolonie jest G-CSF lub GM-CSF.

Korzystne jest zastosowanie, ponadto polegające na oddzielnym podawaniu farmakologicznie skutecznej ilości ludzkiego czynnika stymulującego kolonie, przed/lub po podaniu związku, ale nie drogą równoczesnego podawania.

Korzystne jest zastosowanie, w którym czynnikiem stymulującym kolonie jest G-CSF lub GM-CSF.

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek służy do leczenia przejściowej neuropenii u zwierząt, której przyczyną jest stres związany z transportem lub podróżą.

Wynalazek zaspokaja zatem zapotrzebowanie na środki chemioochronne przez dostarczenie nowego sposobu pobudzenia układu hematopoezy u ssaka, w tym człowieka. Wynalazek także umożliwia leczenie mielosupresyjnych efektów chemioterapii i radioterapii oraz wszystkich innych sytuacji, w których pobudzenie układu hematopoezy może mieć wartość terapeutyczną, takich jak, lecz nie wyłącznie, przeszczep szpiku kostnego i przewlekała neuropenia oraz neuropenia będąca wynikiem zakażeń, chorób hematologicznych i niedoborów żywieniowych. Leczenie to wspomaga układ hematopoezy w zwalczeniu mielosupresji, zwiększa przeżycie i aktywację neutrofili u pacjentów poddawanych takiemu leczeniu.

Zgodnie z tym leczeniem, środek zawierający jeden lub większą liczbę kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha, takich jak kwas kaprynowy, kwas kaprylowy, lub ich sole albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku podaje się ssakowi, korzystnie człowiekowi, w ilości skutecznej w zapobieganiu lub leczeniu neuropenii, celem zmniejszenia niepożądanych działań chemioterapii i radioterapii oraz w leczeniu neuropenii, której przyczyną jest zakażenie, choroby hematologiczne i niedobory żywieniowe.

Ponadto wynalazek umożliwia stosowanie środków zawierających kwas kaprynowy, kwas kaprylowy lub ich sole sodowe albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi i zastosowanie takich związków w leczeniu mielosupresji i wynikającej z niej immunosupresji.

Celem wynalazku było dostarczenie sposobu skutecznego w zapewnieniu chemioochrony ssaka, w tym człowieka.

Innym celem wynalazku było dostarczenie sposobu skutecznego w zwiększeniu skuteczności chemioterapii i. radioterapii u ssaka, w tym człowieka.

Kolejnym celem wynalazku było dostarczenie sposobów z użyciem dawek bardziej zbliżonych do normalnych, lub nawet zwiększenia dawki środków chemioterapeutycznych niezbędnych do osiągnięcia lepszego efektu terapeutycznego przy jednoczesnym Uniknięciu nasilenia działań ubocznych.

Kolejnym celem wynalazku było dostarczenie sposobu skutecznego w zmniejszaniu lub eliminowaniu neuropenii wywołanej chemioterapią u ssaka, w tym człowieka.

PL 222 876 B1

Kolejnym celem wynalazku było dostarczenie sposobu leczenia neuropenii będącej efektem chorób hematologicznych, takich jak przewlekłe idiopatyczne neuropenie, okresowa neuropenia, zespół leniwych leukocytów, zespół Chediak-Higashi'ego, białaczka i niedokrwistość aplastyczna.

Kolejnym celem wynalazku było dostarczenie sposobu leczenia neuropenii, której przyczyną jest zakażenie, takie jak zakażenie wirusowe (np. HIV, odra, zapalenie wątroby, żółta gorączka, mononukleoza) oraz bakteryjne (np. dur brzuszny, paradur, bruceloza).

Na koniec innym celem wynalazku było dostarczenie sposobu, który powoduje minimalne działania uboczne lub ich brak w organizmie leczonego osobnika.

Powyższe i inne cele, cechy i zalety wynalazku staną się jasne po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem ujawnionej postaci i załączonych zastrzeżeń patentowych.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia wpływ MCT na apoptozę PMN.

Fig. 2 przedstawia wpływ MCT na fagocytozę PMN.

Fig. 3A i 3B przedstawiają wpływ doksorubicyny na apoptozę PMN.

Fig. 4A przedstawia przebieg w czasie odpowiedzi MCT na neutrofile poddane działaniu doksorubicyny.

Fig. 4B przedstawia przebieg w czasie odpowiedzi doksorubicyny na neutrofile poddane działaniu MCT.

Fig. 5 przedstawia wpływ MCT i trikapryny na proliferację szpiku kostnego.

Fig. 6 przedstawia wpływ MCT na miano komórek szpiku kostnego u zwierząt z immunosupresją.

Fig. 7 przedstawia wpływ MCT na miano komórek śledziony u zwierząt z immunosupresją.

Fig. 8 przedstawia wpływ MCT i GM-CSF na masę grasicy u normalnych myszy.

Fig. 9 przedstawia wpływ MCT, kaprylanu sodu i kaprynianu sodu na miano, komórek szpiku kostnego u zwierząt z immunosupresją.

Fig. 10 przedstawia działanie chemioochronne i skuteczność przeciwnowotworową MCT w połączeniu z subterapeutycznym stężeniem doksorubicyny w modelu czerniaka BT6F10.

Fig. 11 przedstawia działanie chemioochronne i skuteczność przeciwnowotworowa MCT w połączeniu z subterapeutycznym stężeniem cyklofosfamidu lub taksoteru w modelu raka sutka DA-3.

Fig. 12 przedstawia działanie chemioochronne i skuteczność przeciwnowotworową MCT w połączeniu z terapeutycznym stężeniem cyklofosfamidu lub taksoteru w modelu raka sutka DA-3.

Wysokie dawki chemioterapii i radioterapii niszczą hematopoetyczne komórki w szpiku kostnym, prowadząc do ciężkiego zubożenia pacjenta w neutrofile i płytki krwi. Po takim leczeniu pacjenci spędzają kilka tygodni na oddziale intensywnej Opieki medycznej, z powodu zakażeń i gorączki, będących wynikiem neuropenii, Trombocytopenia prowadzi do wydłużenia czasu krzepnięcia i występowania krwawień wymagających transfuzji płytek krwi. Mielosupresja jest czynnikiem ograniczającym stosowane dawki w leczeniu przeciwnowotworowym, a brak neutrofili i płytek krwi jest główną przyczyną chorobowości i umieralności po zastosowaniu leczenia przeciwnowotworowego.

W przypadku przeszczepu szpiku kostnego można zastosować dwa podejścia. Pobudzenie szpiku kostnego przód przeszczepem może doprowadzić do wzrostu liczby obwodowych progenitorowych komórek macierzystych. Jednakże świeżo przeszczepiony szpik kostny nie zawiera wystarczająco dojrzałych neutrofili lub pośrednich neutrofili, aby odbudować układ odpornościowy pacjenta. To zjawisko sprawia, że istnieje okres, w którym pacjent jest bardziej podatny na zakażenia i wydłużenie czasu krzepnięcia. Terapia obejmująca pobudzenie i aktywację neutrofili przyspiesza proces zdrowienia po przeszczepie szpiku kostnego, zmniejszając neuropenię i trombocytopenię.

Wynalazek ułatwia zwiększanie i aktywację neutrofili u pacjenta. Obecnie stosowane sposoby ukierunkowane są na odtworzenie układu hematopoetycznego pacjenta. Hematopoetyczne czynniki wzrostowe obecnie stosowane w ramach takiego leczenia obejmują czynnik stymulujący kolonie granulocytarne (G-CSF), czynnik komórek macierzystych (SCF) oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytarno-makrofagowe (GM-CSF) G-CSF i GM-CSF mogą skrócić całkowity czas trwania neuropenii i trombocytopenii, ale cały czas pozostaje istotny przedział czasowy, w którym u pacjenta istnieje niedobór czynników krzepnięcia i jest on podatny na zakażenia.

W przypadku przeszczepu szpiku kostnego stosuje się również „mobilizację” do żebrania większej liczby komórek, macierzystych/komórek progenitorowych z krwi obwodowej. Hematopoetyczne komórki macierzyste w szpiku kostnym są mobilizowane we krwi po zastosowaniu leczenia czynnikami wzrostu. Czynniki wzrostowe stosowane w ramach takiego leczenia obejmują interleukinę-3 (IL-3), G-CSF, GM-CSF, SCF oraz rekombinowane białko fuzyjne, mające aktywne ugrupowania zarówno IL-3,

PL 222 876 B1 jak i GM-CSF. Zmobilizowane komórki macierzyste następnie zbiera się po leczeniu czynnikiem wzrostowym i ponownie podaje dożylnie pacjentowi po następnym zastosowaniu wysokiej dawki chemioterapii lub napromieniania, aby odbudować neutrofile i płytki krwi pacjenta.

Triglicerydy o średniej długości łańcucha (określane także w opisie jako „MCT”) zawierają glicerynę zestryfikowaną kwasami tłuszczowymi o łańcuchu zawierającym 8 atomów węgla (C8, kwas oktanowy lub kwas kaprylowy) i 10 atomów węgla (C10, kwas dekanowy lub kwas kaprynowy). MCT zazwyczaj zawiera mieszaninę estrów glicerylowych kwasów tłuszczowych C8 i C10. Jednakże MCT może także zawierać niewielkie ilości (po 2±1%) estrów glicerylowych C6 (kwas heksanowy lub kapronowy) i C12 (kwas dodekanowy lub leurynowy). CRODAMOL™ jest dostępnym w handlu MCT, sprzedawanym przez Croda Ltd., Toronto (Kanada). Jak pokazano w przykładzie 1, CRODAMOL™ stanowi MCT, który zawiera triestry gliceryny z kwasami tłuszczowymi C8 i C10, obecne w różnych proporcjach. Jednakże CRODAMOL™ nie zawiera żądnych estrów kwasów tłuszczowych C6 lub C12. Natomiast triglicerydy o długim łańcuchu (także znane pod nazwą „LCT”) składają się z gliceryny zestryfikowanej kwasami tłuszczowymi mającymi łańcuch węglowy o długości większej niż 12. Typowe kwasy tłuszczowe obecne w LCT obejmują kwasy palmitynowy (C16) i stearynowy (C18). Inaczej niż w przypadku MCT, LCT jest głównym składnikiem tłuszczów spożywczych. W rzeczywistości MCT i LCT mają znacząco różne właściwości biologiczne. Niektóre z różnic fizjologicznych pomiędzy MCT a LCT opisano, w Harrison's Principles of Internal Medicine, 8 wydanie, 1520-1521 (1977), McGraw Hill Book Company lub 15 wydanie, 1668-1669 (2001). Przykładowo MCT, w przeciwieństwie do LCT, nie wymaga hydrolizy przez lipazę trzustkową, gdyż może być wchłonięty przez komórki, nabłonka jelitowego.

MCT oraz jego składniki, kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha, są nietoksycznymi substancjami, stosowanymi w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym. Przykładowo K.A. Traul i inni w Food and Chemical Toxicology 39:79-98 (2000) podają, że MCT są stosowane w coraz większych ilościach w celach pokarmowych i żywieniowych, ponieważ wykazują szereg zalet w porównaniu z LCT. MCI są także głównie stosowane jako emulgatory w różnych preparatach farmaceutycznych, przeznaczonych dla ludzi i weterynaryjnych, oraz w kosmetykach. Badacze cytują szereg badań toksykologicznych, które potwierdzają bezpieczeństwo MCT. Przykładowo zauważają, że bezpieczeństwo spożywania MCT przez ludzi z pokarmami do poziomu 1 g/kg potwierdzono w badaniach klinicznych. Kwasy tłuszczowe C8 i C10 cechuje podobne bezpieczeństwo i zastosowanie. Przykładowo w The Merck Index, 11 wydanie, 266 (1989) podano, że kwas kaprylowy ma LD₅₀ (doustnie, szczury) = 10,08 g/kg, co oznacza, że jest on praktycznie nietoksyczny. Rzeczywiście, zgodnie w rozdziałem. 184 Kodeksu Regulacji. Federalnych (Code of Federal Regulations, CFR), amerykańska Federalna Agencja ds. Leków (Federal Drug Agency, FDA) przyznała kwasowi kaprylowemu oznaczenie GRAS (Generally Recognized As Safe czyli Ogólnie Uważany Za Bezpieczny). Podobnie, zgodnie z rozdziałem 172 (CFR) wolne, kwasy tłuszczowe (np. kaprynowy, kaprylowy) i ich sole z metalami, są uważane za bezpieczne dodatki do stosowania w żywności. Jak zauważyli D. Dimitrijevic i inni w Journal of Pharmacy and Pharmacology 53:149-154 (2001), kwas kaprynowy (sól sodowa) został zatwierdzony w Japonii i Szwecji do stosowania u ludzi jako środek poprawiający wchłanianie dla postaci leków do podawania doodbytniczego. W opisie patentowym US 4602040 (1986) opisano zastosowanie MCT jako zaróbki farmaceutycznej. W nowszej publikacji PCT WO 01/97799 opisano zastosowanie kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha, w szczególności kwasu kaprylowego i kaprynowego, jako środków przeciwdrobnoustrojowych.

Jednakże, aż do nieoczekiwanego odkrycia ujawnionego w tym dokumencie, skuteczność kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha, takich, jak kwas kaprynowy, kwas kaprylowy lub ich sole z metalami albo ich mono-, di- lub triglicerydy (MCT) jako czynników zwiększających przeżycie i aktywację neutrofili nie była znana. Jak opisane w tym dokumencie, MCT zawiera triglicerydy kwasów tłuszczowych C8 (kaprylowego) i C10 (kaprynowego), które stanowią co najmniej 98% aktywności dotyczącej pobudzania hematopoezy i dojrzewania neutrofili. D. Waitzberg i inni podają w Nutrition 13: 128-132 (1997), że emulsje lipidowe (LCT i MCT) jedynie w umiarkowanym stopniu zmniejszają bakteriobójcze działanie neutrofili i nie mają żadnego wpływu na monocyty. W rzeczywistości w jedynej publikacji, która zawiera sugestię, że MCT może oddziaływać na neuropenię, opisano badania kliniczne, w których MCT podawano razem z LCT i porównywano z samym LCT. Nie przeprowadzone żadnych badań klinicznych z samym MCT, a zatem jego wpływ na działanie układu odpornościowego nie jest jasny. Jednakże wyniki opisane przez S. Demierera i innych w Clinical Nutrition 19:253-258 (2000) wskazują, że MCT prowadzi do nasilenia neuropenii, gdy jest podany łącznie Z. LCT, w porównaniu z samym LCT. Sugerowano w związku z tym, iż MCT hamuje czynność i/lub przeżycie neutrofili.

PL 222 876 B1

Pewnym wsparciem dla tej sugestii jest publikacja PCT WO 95/30413 gdzie podano, że nienasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu, takie jak kwas linolenowy, oraz nasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu (C16 lub dłuższym) mogą przyspieszać hematopoetyczną proliferację komórek macierzystych.

Wynalazek dotyczy zatem zastosowania triglicerydów albo innych analogów jako czynnika aktywacji hematopoezy lub czynnika wzrostowego i czynnika zwiększającego przeżycie i aktywację neutrofili. Przy stosowaniu w chemioterapii i radioterapii, środek zawierający kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha albo ich sole, z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub MCT, podaje się przed leczeniem, w trakcie leczenia i/lub po leczeniu, aby skrócić okno neuropeniczne i przyspieszyć odtworzenie układu hematopoezy. Dodatkowo można stosować połączenie kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha i ich soli z metalami albo ich triglicerydów albo ich mono- lub diglicerydów albo innych analogów i/lub MCT, w wielu punktach czasowych w odniesieniu do chemioterapii i radioterapii (np. kwasy tłuszczowe przed leczeniem i MCT po leczeniu). Alternatywnie połączenie to można podawać równocześnie: przed leczeniem, w trakcie leczenia i/lub po leczeniu chemioterapią lub radioterapią. W przypadku ciężkiej neuropenii środek zawierający kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo .inne analogi lub MCT stosuje się jako środek terapeutyczny. W przypadku przeszczepu szpiku kostnego kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha lub ich sole Z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub MCT stosuje się w celu zwiększenia liczby obwodowych komórek macierzystych, które są dostępne dla przeszczepu po ablacyjnej radioterapii lub chemioterapii. Kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub MCT można także stosować po przeszczepie szpiku kostnego w celu pobudzenia komórek macierzystych szpiku kostnego, a tym samym skrócenia okresu zdrowienia z neuropenii.

Opisany sposób jest użyteczny do pobudzenia hematopoezy w celu leczenia mielosupresji, której przyczyną jest chemioterapia lub radioterapia; przewlekłej lub przejściowej neuropenia; neuropenii wywołanej lekiem; i neuropenii, której przyczyną jest choroba hematologiczna, niedobór żywieniowy, zakażenie lub radioterapia. Przyczyną przejściowej neuropenii może być stres spowodowany transportem zwierzęcia lub podróżą człowieka lub zwierzęcia. Sposób ten jest także użyteczny do pobudzenia hematopoezy w celu przyspieszenia gojenia ran u pacjenta oraz wywoływania mobilizacji neutrofili w celu ułatwienia przeszczepu szpiku kostnego u pacjenta.

Stosowane w opisie określenia w liczbie pojedynczej dotyczą jednego lub większej liczby elementów w zależności od kontekstu, w jakim zostały użyte.

Stosowane w opisie określenie „kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha, takie jak kwas kaprynowy lub kwas kaprylowy lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi. lub kompozycje MCT” dotyczy środka zawierającego ten składnik czynny i jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych nośników.

Stosowane w opisie określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” dotyczy substancji, która nie zaburza fizjologicznego działania kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha, takich jak kwas kaprynowy, kwas kaprylowy lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub kompozycje MCT, oraz nie jest toksyczna dla ssaków, w tym ludzi.

Kwas kaprynowy, kwas kaprylowy lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich monolub diglicerydy albo inne analogi lub kompozycje MCT formułuje się z użyciem kwasu kaprynowego, kwasu kaprylowego lub ich soli z metalami albo ich triglicerydów albo ich mono- lub diglicerydów albo innych analogów oraz farmaceutycznie dopuszczalnych nośników sposobami znanymi fachowcom (MERCK INDEX, Merck & Co., Rahway, NJ, USA). Powyższe środki obejmują, lecz nie wyłącznie, płyny, oleje, emulsje, aerozole, środki do inhalacji, kapsułki, pigułki, plastry i czopki.

Wszystkie sposoby obejmują etap połączenia jednej lub większej liczby substancji czynnych z nośnikiem, którym jest jeden lub większa liczba dodatkowych składników.

Stosowane w opisie określenie „chemioterapia” dotyczy sposobu zabijania proliferujących komórek z użyciem środka cytotoksycznego. Wyrażenie „podczas chemioterapii” oznacza okres, w którym utrzymuje się efekt działania podanego środka cytotoksycznego. Natomiast wyrażenie „po chemioterapii” obejmuje wszystkie sytuacje, w których środek jest podawany po podaniu środka cytotoksycznego, bez względu na wcześniejsze podanie tego samego środka, a także bez względu na utrzymywanie się efektu podanego środka cytotoksycznego.

PL 222 876 B1

W przypadku chemioterapii, kwas kaprynowy, kwas kaprylowy lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub kompozycje MCT można podawać przed chemioterapią, w czasie lub po chemioterapii (czyli przed podaniem, w czasie podawania lub po podaniu środka cytotoksycznego).

„Środek cytotoksyczny” oznacza środek, który zabija szybko proliferujące komórki, np. komórki nowotworowe, komórki zakażone wirusem lub komórki hematopoetyczne. Przykłady środka cytotoksycznego, który można stosować w realizacji wynalazku obejmują, lecz nie wyłącznie, cyklofosfamid, doksorubicynę, daunorubicynę, winblastynę, winkrystynę, bleomycynę, etopozyd, topotekan, iminotekan, taksoter, taksol, 5-fluorouracyl, metotreksat, gemcytabinę, cisplatynę, karboplatynę lub chlorambucil, oraz agonistów wszystkich wyżej wymienionych związków. Cytotoksycznym środkiem może także być środek przeciwwirusowy, np. AZT (czyli 3'-azydo-3'-deoksytymidyna) lub 3TC/lamiwudyna (czyli 3-tiacytydyna).

Stosowane w opisie określenie „leucopenia” dotyczy nieprawidłowego zmniejszenia liczby leukocytów we krwi.

Stosowane w opisie określenie „neuropenia” dotyczy obecności nieprawidłowo małej liczby neutrofili we krwi.

W jednej korzystnej postaci środek farmaceutyczny jest w postaci dowolnego odpowiedniego środka do podawania doustnego, podjęzykowego lub drogą inhalacji (spray donosowy), dożylnego, domięśniowego, podskórnego, do stosowania w leczeniu neuropenii, trombocytopenii lub jako czynnika zwiększającego przeżycie i aktywację neutrofili.

Należy podkreślić, że ilość środka zgodnie z wynalazkiem, wymagana do stosowania w leczeniu, będzie różna w zależności od drogi podawania, rodzaju leczonej choroby, wieku i stanu pacjenta, i ostatecznie będzie zależała od decyzji lekarza prowadzącego. Żądaną dawką można dogodnie podawać w postaci pojedynczej dawki lub dawek podzielonych, przyjmowanych w odpowiednich odstępach czasowych, np. jako dwie, trzy, cztery lub większa liczba dawek dziennie.

Jakkolwiek istnieje możliwość, że do stosowania w terapii kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha lub ich sole, z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub kompozycje MCT można podawać w postaci samych związków chemicznych, korzystne jest stosowanie substancji czynnej, w preparacie farmaceutycznym.

W korzystnej postaci podawana jest taka ilość składnika czynnego, aby osiągnąć jego stężenie we krwi (wolnego i/lub związanego z albuminą surowicy) większe niż 1 μΜ. W szczególnie korzystnej postaci stężenie we krwi jest większe niż 1 mM.

W innej postaci środek farmaceutyczny jest w postaci do podawania doustnego (w tym podjęzykowego) lub pozajelitowego (w tym domięśniowego, podskórnego, doodbytniczego i dożylnego). Preparaty mogą, gdy jest to odpowiednie, być dogodnie obecne w oddzielnych jednostkach dawkowanych i mogą być wytwarzane dowolnymi sposobami znanymi w farmacji. Wszystkie sposoby obejmują etap połączenia związku czynnego z ciekłymi nośnikami i/lub subtelnie rozdrobnionymi stałymi nośnikami, a następnie, gdy jest to konieczne, nadanie preparatowi żądanej postaci. Gdy istnieje takie zapotrzebowanie, powyżej opisane preparaty mogą być przystosowane do postaci o przedłużonym uwalnianiu składnika czynnego.

Kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha lub ich sole z metalami albo ich triglicerydy albo ich mono- lub diglicerydy albo inne analogi lub MCT można także stosować w połączeniu z innymi terapeutycznie czynnymi środkami, takimi jak cytotoksyczne środki przeciwnowotworowe lub inne środki przeciwnowotworowe (leki immunomodulujące lub immunoregulujące lub szczepionki terapeutyczne lub leki hamujące angiogenezę itp.), leki immunosupresyjne (w tym leki przeciwzapalne), czynniki wzrostowe, takie jak czynnik stymulujący kolonie (korzystnie GM-CSF lub G-CSF), cytokina, taka jak interleukina 2 lub interleukina 15, lub ich połączenia. Poszczególne składniki takich połączeń można podawać albo kolejno, (przed 5 lub po) lub jednocześnie w oddzielnych lub złożonych preparatach farmaceutycznych. Opisane powyżej połączenie może dogodnie być przystosowane do stosowania w postaci preparatu farmaceutycznego.

Realizację wynalazku ponadto ilustrują poniższe przykłady, ale nie mają na celu jego ograniczenia. Jest oczywiste, że wybór dawki średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub ich soli albo ich triglicerydów albo ich mono- lub di- glicerydów albo innych analogów albo MCT i pokrewnych preparatów farmaceutycznych podawanych każdemu Z konkretnych pacjentów, (człowiekowi lub zwierzęciu) będzie podlegać rozwadze prowadzącego lekarza, przepisującemu w sposób współmierny do odpowiednich

PL 222 876 B1 dawek i w zależności od stanu choroby i indywidualnych czynników z punktu widzenia prowadzącego lekarza.

P r z y k ł a d 1. Analiza CRODAMOL™ (MCT; trigliceryd kapryIowo/kaprynowy)

CRODAMCL™ GTCC partia nr T1033-1299 z Croda Ltd. (Toronto, Kanada) poddano analizie metoda chromatografii gazowej. Analiza GC FID, warunki gradientu: 100°C-250°C w ciągu 10 minut, następnie 250°C przez 25 minut ; FID 250°C. Zaobserwowano cztery piki: 22,04 minuty (26%), 25,07 minuty (43%), 29,16 minuty (25%) i 34,75 minuty (5%).

Próbkę, triglicerydu kaprylowego (trikaprylin), otrzymanego z Sigma-Aldrich partia nr 079H1212, poddano analizie metodą chromatografii gazowej. Analiza GC FID, warunki gradientu: 100°C-250°C w ciągu 10 minut, następnie 250°C przez 25 minut; FID 250°C. Głównie jeden pik przy 22,31 minuty (9,8%).

P r z y k ł a d 2. Acylowanie alkoholu z użyciem chlorku kwasowego i pirydyny jako zasady

.-OH

Sposób A ci >

-OH + lub

O Sposób B

Sposób A: Pirydyna, CH₂Cl₂

Sposób B: DMAP, CH₂Cl₂

Ogólny sposób A (Pirydyna)

Roztwór alkoholu (około 0,1M) w mieszaninie bezwodnego CH₂Cl₂ i pirydyny (4:1) ochłodzono do 0°C w atmosferze azotu i potraktowano chlorkiem kwasowym (1/2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjna powoli ogrzano do temperatury pokojowej, potem mieszano przez noc. Analiza TLC (SiO2, EtOAc: heksan 1: 9) wykazała brak pozostałości alkoholu. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH₂Cl₂ i przemyto nasyconym wodnym roztworem NH₄CI. Fazę wodną wyekstrahowano CH₂Cl₂ (x 1) i heksanem (x 1), potem połączone fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano pod próżnią, w wyniku czego otrzymano surowy produkt.

Ogólny sposób B. (DMAP)

Roztwór alkoholu (około 0,1M) w bezwodnym CH₂Cl₂ ochłodzono do 0°C, w atmosferze azotu i potraktowano DMAP (1,3 równoważnika) i chlorkiem kwasowym (1,2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną powoli ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Analiza TLC (SiO2, EtOAc 1:9 heksan) wykazała brak pozostałości alkoholu. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2Cl2 i przemyto nasyconym wodnym, roztworem NH₄CI. Fazę wodną wyekstrahowano CH₂Cl₂ (x 1) i heksanem (x 1) i potem połączone fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano pod próżnią, w wyniku czego otrzymano surowy produkt.

P r z y k ł a d 3. Trigliceryd kwasu nonanowego

Glicerynę (120 mg, 1,30 mmola) acylowano chlorkiem nonanoilu (751 μ( 4,16 mmola) zgodnie z ogólnym sposobem A, przykład 2. Po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej (Isolute™ SiO2, z elucją 0-5% EtOAc w heksanie) otrzymano frakcje zawierające dwa produkty, które odparowano pod próżnią i otrzymano żądany produkt w postaci bezbarwnej cieczy, o czystości odpowiednio 85% (127 mg, 19%) i 93% (475 mg, 71%) (GC/FID), R_f 0,46 (SiO₂, 10% octan etylu w heksanie); ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) δμ = 5,27 (m, 1H), 4,29 (dd, 2H), 4,14 (dd, 2tt), 2,31 (m, 6H), 1,61 (m, 6H), 1,27 (m, 3OH), 0,88 (t, 9H); MS (FAB+) m/z = 510 (M-H+); Analiza GC FID, warunki: gradient 100°C-250°C w ciągu 10 minut, następnie 250°C przez 2,5 minut; FID 250°C; 27,25 minuty.

P r z y k ł a d 4. 1,2,3-O,N,O-Tridekanoiloserynol

Serynol (51 mg, 0,56 mola) acylowano chlorkiem dekanoilu (372 μ( 1,76 mmola) zgodnie z ogólnym sposobem B, przykład 2. Po oczyszczeniu metodą MPLC (SiO2, z elucją 0, następnie 10% EtOAc w heksanie) Otrzymano żądany produkt w postaci białej substancji stałej (301 mg, 97%). t.t. 54°C; TLC, Rf 0,85 (SiO₂, EtOAc:heksan 2:3); ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) δμ 0,84 (9H, t), 1,20-1,27 (36H, m), 1,52-1,60 (6H, m), 2,13 (2H, t), 2,28 (4H, t), 4,03 (2H, 2 x A w 2 x ABX), 4,19 (2H, 2 x B w 2 x ABX), 4,41-4,46 (1H, m), 5,70 (1H, d); HRMS m/e obliczono dla C33H63NO5 553,4706; stwierdzono

PL 222 876 B1

553,4713. Analiza GC-FID, warunki gradientu: 100°C-250°C w ciągu 10 minut, następnie 250°C przez 25 minut; FID 250°C. Głównie jeden pik przy 14,80 minuty (98%).

P r z y k ł a d 5. 1,3-O,O-Didekanoiloserynol

a) BOC-ON, EtaN; b) DMAP, CH₂CI₂; c) HCI.

Roztwór serynolu (1,57 g, 17,2 mmola) w acetonie (17 ml) i wodzie (17 ml) potraktowane trietyloaminą (3,60 ml, 25,9 mmola) i BOC-ON (4,67 g, 19,0 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze azotu przez noc. Aceton odparowano pod próżnią i surową mieszaninę rozdzielono pomiędzy EtOAc i wodę. Fazę wodną wyekstrahowano EtOAc (x 3) i połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad Na₂SO₄, przesączono i odparowano pod próżnią, w wyniku czego otrzymano żółtą substancję stałą. Po oczyszczeniu metodą MPLC (SiO₂, z elucją 40-80% EtOAc w heksanie) otrzymano N-BOC-diolowy związek pośredni w postaci białej krystalicznej substancji stałej (2,10 g, 64%). TLC, Rf 0,15 (SiO2, EtOAc:heksan 4:1); ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) δμ 1,40 (9H, s), 3,54-3,56 (5H, m).

N-BOC-diolowy związek pośredni (50 mg, 0,26 mmola) acylowano chlorkiem dekanoilu (173 pl, 0,83 mmola) zgodnie z ogólnym sposobem B. Po oczyszczeniu metodą MPLC (SiO₂, z elucją 0, następnie 10% EtOAc w heksanie) otrzymano N-BOC-diacylowy związek pośredni w postaci bezbarwnego oleju (115 mg, 88%). TLC, Rf 0,80 (SiO2, EtOAc:heksan 2:3); ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) δμ 0,87 (6H, t), 1,23-1,30 (24H, m), 1,44 (9H, s), 1,56-1,70 (4H, m), 2,31 (4H, t), 4,04-4,21 (4H, m), 4,77-4,80 (1H, m), 6,73 (dH, d).

Roztwór N-BOC-diacylowego związku pośredniego (76 mg, 0,15 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (1,5 ml) ochłodzono do 0°C i potraktowano roztworem 4,0M bezwodnego HCl w 1,4-dioksanie (375 pl, 1,50 mmola; stężenie końcowe 0,8M). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez 3 godziny w tej samej temperaturze. Dodano kolejną porcję 4,0M bezwodnego HCl w 1,4-dioksane (375 pl, 1,50 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dalsze 2 godziny. Po odparowaniu rozpuszczalników otrzymano żądany produkt w postaci białej substancji stałej (69 mg, 100%). t.t. 101°C; TLC, Rf 0,40 (SiO₂, EtOAc:heksan 2:3); ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz) δH 0,88 (6H, t),

I, 20-1,29 (24H, m), 1,55-1,65 (4H, m), 2,45-2,52 (4H, m), 3,72-3,80 (1H, m), 4, 30-4,51 (2H, m), 8,6-9,0 (3H, br m); HRMS m/e obliczono dla (M-HCl), C₂₃H₄₅NO₄ 339,3348; stwierdzono 339,3340; Analiza GC-FID, warunki gradientu: 100°C-250°C w ciągu 10 minut, następnie 250°C przez 25 minut; FID 250°C. Głównie jeden pik przy 17,14 minuty (94%).

P r z y k ł a d 6. Badanie apoptozy i przeżycia neutrofili w warunkach in vitro

Przeżycie neutrofili mierzono według metody opisanej przez Lagraoui i Gagnon (Cell. Mol. Biol. 43:313-318, 1997). Neutrofile otrzymano z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Krew poddano wirowaniu z gradientem z użyciem Lympholyte-poly (Cedarlane, Hornby, Kanada) a następnie zanieczyszczające erytrocyty poddawano hipotonicznej lizie. Komórki przeprowadzono w zawiesinę w RPMI (Gibco, Burlington, Kanada) wzbogaconym 10% FBS (Hyclone, Logan, USA). Ostateczne preparaty komórkowe zawierały >95% neutrofili, co potwierdzono barwieniem Wright Geimsa. Żywotność komórek przekraczała 97%, co potwierdzono wykluczeniem za pomocą błękitu trypanowego. Leukocyty wielojądrzaste (PMN) mają krótki okres półtrwania i szybko zachodzą w nich charakterystyczne zmiany, typowe dla apoptozy. Apoptozę oceniano sposobem opisanym przez Nicoletti i inni,

J. Immunol. Math. 139:271-279 (1991). W skrócie, świeżo izolowane neutrofile inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C z różnymi stężeniami MCT. Po inkubacji komórki barwiono z użyciem jodku propidium (PI, Sigma) i analizowano apoptozę za pomocą cytometru przepływowego (XL Flow Cytometer, Coulter). Następnie dane wyrażano jako procent komórek apoptotycznych.

PL 222 876 B1

Fig. 1 przedstawia zestawienie kilku doświadczeń, w których mierzono apoptozę neutrofili przy braku (kontrola) lub w Obecności różnych stężeń MCT. Wyniki pokazują, że w obecności MCT, w warunkach in vitro, zahamowanie apoptozy neutrofili sięga 90%, i że zahamowanie jest zależne od dawki. Dlatego MCT może prowadzić do wydłużenia czasu przeżycia neutrofili i może być stosowany jako czynnik zapewniający przetrwanie neutrofili.

P r z y k ł a d 7. Badanie fagocytozy neutrofili w warunkach in vitro

Neutrofile (2 x 106/ml) inkubowano przez 24 godziny, w temperaturze 37°C w 5% CO₂ i 95% wilgotności, z różnymi stężeniami MCT. Po 24 godzinach oceniano żywotność za pomocą wykluczania błękitem trypanowym i komórki płukano trzykrotnie PBS zawierającym 2 mM glukozę, 1 mM MgCl₂ i 1 mM CaCl₂. Następnie stężenie komórek doprowadzano do 1 x 10⁶ komórek/ml i inkubowano z karboksylowanymi mikrosferami Fluoresbrite, rozcieńczenie 1/10). Po 30 minutach inkubacji neutrofile przemyto i utrwalano 2% paraformaldehydem. Następnie analizowano obecność mikrosfer wewnątrz utrwalonych neutrofili za pomocą cytometru przepływowego (XL Flow Cytometer, Coulter). Dane wyrażano w procentach komórek fagocytujących.

Fig. 2 przedstawia zestawienie kilku: doświadczeń, w których mierzono aktywność fagocytarną neutrofili przy braku (kontrola) i w obecności różnych stężeń MCT. Wyniki pokazują, że MCT pobudza aktywność fagocytarną ludzkich PMN. Aktywność fagocytarna jest maksymalnie pobudzona dwutrzykrotnie, w porównaniu z wartościami kontrolnymi, a stopień pobudzenia zależy od stanu układu odpornościowego dawcy.

P r z y k ł a d 8. Wpływ doksorubicyny na apoptozę neutrofili

PMN izolowano w sposób opisany w przykładzie 11. Komórki (2 x 10⁶/ml) inkubowano przez 4 godziny, w temperaturze 37°C w 5% CO2 i 95% wilgotności, w obecności różnych stężeń chemioterapeutyku, doksorubicyny. Komórki apoptotyczne oceniano metodą opisaną w przykładzie 6. Dane wyrażano w procentach apoptotycznych komórek. Fig. 3A i 3B pokazuje, że doksorubicyna indukuje apoptozę PMN.

P r z y k ł a d 9. MCT chroni neutrofile przed apoptozą indukowana przez doksorubicynę

PMN izolowano w sposób opisany w przykładzie 6. Komórki (2 x 10⁶/ml) inkubowano przez 4 godziny, w temperaturze 37°C w 5% CO2 i 95% wilgotności, w obecności różnych stężeń doksorubicyny z lub bez MCT (2,5% i 5,0%). Komórki apoptotyczne oceniano w sposób opisany w przykładzie 6. Dane wyrażane w procentach, apoptotycznych komórek.

W tabeli 1 przedstawiono wyniki dwóch doświadczeń, w których badano chemioochronne działanie MCT na PMN. Wyniki wyrażono w procentach komórek apoptotycznych po 4 godzinach inkubacji w obecności i przy braku doksorubicyny, z lub bez MCT. Tak jak w przykładzie 8, doksorubicyna indukowała apoptozę PMN w warunkach in vitro. Jednakże w obecności MCT, w stężeniu 2,5% i 5% (obj./obj.) apoptotyczne działanie doksorubicyny jest zahamowane. Zatem MCT wywiera przeciwapoptotyczne działanie na PMN. Apoptozę badano także metoda z zastosowaniem aneksyny V-FITC/PI (jodek propidium) zgodnie z zaleceniami producenta Biosources (Apotarget Annexin-VFITC Apoptosis Kit nr PHN 1018). Aneksyna V wiąże się z fosfatydyloseryną, która we wczesnej do późnej fazie apoptozy przemieszcza się z wewnętrznej powierzchni na zewnętrzną powierzchnię błony, W skrócie neutrofile inkubowano w obecności lub przy braku różnych stężeń doksorubicyny i MCT. Po 24 godzinach neutrofile przemywano PBS i barwiono 2 pl aneksyny V-FITC i 10 pl PI (Sigma, 1 mg/ml) przez 20 minut. Po inkubacji wybarwione komórki utrwalano paraformaldehydem (1%) i analizowano pod kątem apoptozy za pomocą cytometru przepływowego (Flow Cytometer, Coulter). Następnie dane wyrażano w procentach apoptotycznych komórek.

Fig. 4A przedstawia przebieg w czasie działania MCT na neutrofile traktowane doksorubicyną. MCT chronił ludzkie neutrofile przed apoptozą indukowaną przez doksorubicynę, w sposób zależny od czasu i dawki.

Fig. 4B przedstawia przebieg w czasie działania doksorubicyny na neutrofile traktowane MCT, MCT zapobiega, w sposób zależny od dawki, apoptozie neutrofili indukowanej doksorubicyną, gdy jest podany do 4 godzin przed wprowadzeniem toksycznego środka (doksorubicyny).

PL 222 876 B1

T a b e l a 1

Ochronne działanie MCT przeciw apoptozie neutrofili indukowanej doksorubicyną

Stężenie doksorubicyny	% Apoptozy neutrofili (PMN)
Doświadczenie 1	Doświadczenie 2
Kontrola	MCT 2,5% (obj./obj.)	MCT 5% (obj./obj.)	Kontrola	MCT 2,5% (obj./obj.)	MCT 5% (obj./obj.)
0	12,4	9,5	12,3	49,6	23,6	4,6
10'10 M	9,3	11,7	7,4	60,6	14,7	23,9
10'8 M	18,7	14,2	8,3	59,2	32,5	14,8
10'6 M	23,2	12,7	3,5	55,0	21,6	16,9
10'5 M	23,8	12,3	8,3	66,2	74,7	12,1
10'4 M	27,5	35,2	17,1	53,2	58,6	55,7

P r z y k ł a d 10. MCT chroni neutrofile przeciw apoptozie indukowanej przez doksorubicynę: porównanie z GM-CSF

Tabela 2 przedstawia wpływ GM-CSF, MCT i trikapryliny na apoptozę ludzkich neutrofili indukowaną doksorubicyną, GM-CSF i MCT chronią ludzkie neutrofile przed apoptozą indukowaną doksorubicyną. Trikaprylina chroni przed apoptozą indukowaną doksorubicyną i dodatkowo silniej wzmacnia żywotność ludzkich neutrofili traktowanych doksorubicyną, niż neutrofili kontrolnych, przy braku doksorubicyny.

T a b e l a 2

Ochronne działanie MCT i GM-CSF przeciw apoptozie neutrefili indukowanej doksorubicyną

	% Żywotności PMN
Kontrola	35,9 ± 0,71
Doksorubicyną (DOX) (10'5 M)	6,82 ± 0,5
GM-CSF (10·7 M) + DOX	16,75 ± 2,05
GM-CSF (10 8 M) + DOX	6,99 ± 0,23
MCT (24 mM) + DOX	14,20 ± 1,98
MCT (12 mM) + DOX	12,37 ± 1,72
Trikaprylina (24 mM) + DOX	12,13 ± 1,25
Trikaprylina (12 mM) + DOX	42,95 ± 6,15

P r z y k ł a d 11. MCT i trikaprylina przyspieszają proliferację szpiku kostnego myszy w warunkach in vitro

Komórki szpiku kostnego otrzymano z kości udowej samic myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni). Komórki przemywano i płukano w PBS. Zebrane komórki wirowano i ponownie przeprowadzano w zawiesinę w stężeniu 2 x 10 komórek/ml. 100 μl komórek (2 x 10 komórek) inkubowano w 96-studzienkowej płytce do mikromianowania przez 48 godzin w obecności i przy braku MCT łub trikapryny. Po inkubacji komórki poddaje się działaniu 1 μφ [ H]-tymidyny przez 6 godzin. Płytki następnie zbierano aparatem Tomteck i zliczane licznikiem promieni β (Microbeta β-counter). Wbudowywanie ₃

[ H]-tymidyny do DMA jest bezpośrednim wskaźnikiem proliferacji komórek.

Fig. 5 przedstawia typowe doświadczenie badające wpływ MCT i trikapryny na proliferację komórek szpiku kostnego, MCT i trikapryna przyspieszają proliferację szpiku kostnego 3-5-krotnie, w porównaniu z kontrolą.

P r z y k ł a d 12. Badania chemioochrony: Indukcja proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo przez MCT

U samic myszy C57BL/6, w wieku 6-8 tygodni wywołano immunosupresję poprzez podawanie 80 mg 5-fluorouracylu (5-FU) lub 100-200 mg cyklofosfamidu (CY) lub 12 mg taksoteru (TX), dożylnie w dniu 0. Aby zbadać immunoochronne działanie MCT lub innych związków, myszy otrzymywały związek badany doustnie w dniu -3, -2 i -1 lub dożylnie w dniu 0. Myszy uśmiercano w dniu +5 poprzez

PL 222 876 B1 nakłucie serca i zwichnięcie kręgów szyjnych. Następnie przygotowywano zawiesiny komórek grasicy, śledziony i szpiku kostnego w następujący sposób.

Tkanki miażdżono w buforze PBS a zanieczyszczające erytrocyty poddawano lizie w buforze ACK (155 mM NH₄CI; 12 mM NaHCO₃; 0,1 mM EDTA; pH 7,3) przez 5 minut. Komórki zebrano przez odwirowanie i płukano trzykrotnie w PBS i ponownie przeprowadzano w zawiesinę w pożywce hodowli tkankowej. Komórki liczono hemacytometrem.

Wyniki, wskazują, że MCT istotnie zwiększa liczbę komórek w tkankach odpornościowych zwierząt normalnych i poddanych immunosupresji, w porównaniu z samym nośnikiem, co pokazują kolejne tabele i rysunki. W zależności od doświadczeń i stanu układu odpornościowego myszy, MCT może zwiększać miano komórek szpiku kostnego i/lub śledziony i/lub grasicy.

Fig. 6 przedstawia wpływ MCT na miano komórek szpiku kostnego u zwierząt z immunosupresją. Jedynie CY i 5-FU prowadziły do spadku miana komórek szpiku kostnego, w porównaniu z kontrolą (bez leczenia cytotoksycznego). U myszy podawanie taksoteru nie wywiera istotnego wpływu, na miano komórek szpiku kostnego. W przypadku supresji szpiku kostnego podanie MCT (6,25 pmola na mysz) w dniach -3, -2 i -1 znamiennie zwiększa miano komórek szpiku kostnego.

Fig. 7 przedstawia wpływ MCT na miano komórek śledziony u myszy z immunosupresją, które przed potraktowaniem otrzymały doustnie MCT. Wszystkie leki cytotoksyczne (CY, 5-FO i TX) znacząco zmniejszają miano komórek śledziony, w porównaniu z kontrolą. Podanie MCT (6,25 pmola/mysz) w dniach -3, -2 i -1 zwiększa znacząco miano komórek śledziony, przy „P” mniejszym niż 0,0017, 0,009 i 0,0036 odpowiednio dla CY, 5-FU i TX.

Ponadto MCT podany dożylnie w dniu 0 (tabela 3) istotnie zwiększa miano komórek szpiku kostnego u normalnych myszy. Jednakże jedno wstrzyknięcie dożylne MCT nie wystarcza do zwiększenia miana komórek śledziony zarówno u normalnych myszy, jak i u myszy z immunosupresją.

T a b e l a 3

Wpływ cyklofosfamidu (CY) i CY + MCT na komórki szpiku kostnego i śledziony (normalne myszy)

	Szpik kostny	Śledziona
	miano komórek (x 106)	P	miano komórek (x 106)	P
Kontrola	16 ± 3,94		94 ±11
CY	13 ± 3,92	0,17	60 ± 12	0,0014
CY + MCI (50 pmoli)	17 ± 4,28	0,87	53 ±10	0,0003
CY + MCT (12,5 pmola)	17 ± 6,15	0,95	51 ± 10	0,0002
MCT (50 pmoli)	41 ± 6,11	>0,0001	103 ± 7	0,19
MCT (12,5 pmola)	27 ± 4,19	0,0018	101 ± 11	0,31

P r z y k ł a d 13. Badania chemioochrony: Indukcja proliferacji komórek odpornościowych po podaniu MCT w dniu -3, -2 i -1 u normalnych myszy - zależność dawka - odpowiedź w warunkach in vivo

Zależność dawka - odpowiedź indukcji proliferacji, komórek odpornościowych po podaniu MCT u normalnych myszy oceniało no według protokołu opisanego w przykładzie 12.

Tabela 4 przedstawia zależność dawka - odpowiedź na traktowanie MCT podawanym doustnie w dniu -3, -2 i -1 u normalnych myszy. MCT znacząco zwiększał miano komórek szpiku kostnego i śledziony.

T a b e l a 4

Wpływ MCT na. normalne myszy

	Szpik kostny	Śledziona
	miano komórek (x 106)	P	miano komórek (x 106)	P
Kontrola	45 ± 7,3		120 ± 12,9
MCT (3,15 pmola)	52 ± 4,3	0,10	144 ± 15,8	0,018
MCT (6,25 pmola)	59 ± 11,3	0,05	134 ± 13,9	0,129
MCT (12,5 pmola)	54 ± 6	0,04	144 ± 19,8	0,04
MCT (25 pmoli)	56 ± 3,9	0,01	127 ± 17,0	0,48

PL 222 876 B1

P r z y k ł a d 14. Badania chemioochrony: Indukcja proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo: porównanie wpływu MCT z wpływem GM-CSF

Porównywano indukcję proliferacji/regeneracji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo, według protokołu opisanego w przykładzie 12.

Badania porównujące MCT i GM-CSF przeprowadzono na normalnych zwierzętach i zwierzętach z immunosupresją. W porównaniu z MCT, GM-CSF nie wpływał istotnie na miano komórek szpiku kostnego i śledziony u zwierząt z immunosupresją. Istotny wpływ GM-CSF na masę grasicy zaobserwowano tylko u normalnych myszy (fig. 8). W tym przypadku MCT wywierał podobny wpływ jak GM-CSF.

P r z y k ł a d 15. Badania chemioochrony

Wpływ trikapryliny i trikapryny na indukcję proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo oceniano według protokołu opisanego w przykładzie 12.

Oba związki, trikaprylina i trikapryna, skutecznie indukowały proliferację i ochronę komórek szpiku kostnego u myszy, które otrzymały CY (tabela 5). Nie obserwowano znaczącego wpływu na miano komórek śledziony, w porównaniu z myszami, którym podawano cyklofosfamid.

T a b e l a 5

Wpływ cyklofosfamidu (CY), CY + trikapryliny oraz CY + trikapryny na komórki szpiku kostnego i śledziony

	Szpik kostny	Śledziona
	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY
Kontrola	55 ± 9,3			113 ± 15,9
CY	22 ± 5,8	0,0001		36 ± 13,6	>0,0001
CY + trikaprylina	34 ± 7,8	0,0033	0,022	37 ± 12,6	>0,0001	0,8
CY + trikapryna	31 ± 3,8	0,0008	0,012	38 ± 6,8	>0,0001	0,7

P r z y k ł a d 16. Badania chemioochrony

Wpływ trilauryny i trimirystyny na indukcję proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo, oceniano według protokołu opisanego w przykładzie 12.

Trilauryna i trimirystyna wywierają słabe działanie (nieznaczące) na miano komórek szpiku kostnego i śledziony u myszy z immunosupresją wywołaną przez CY (tabela 6).

T a b e l a 6

Wpływ cyklofosfamidu (CY), CY + trilauryny i CY + trimirystyny na komórki szpiku kostnego i śledziony

	Szpik kostny	Śledziona
	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY
Kontrola	49 ± 7,3			105 ± 23
CY	27 ± 2,8	0,0014		19 ± 6,5	0,0007
CY + trilauryna (6,25 pM)	31 ± 6,8	0,0028	0,219	28 ± 19,5	0,0004	0,302
CY + trimirystyna (6,25 pM)	31 ± 9,9	0,0067	0,402	15 ± 4,6	0,0007	0,314

P r z y k ł a d 17. Badania chemioochrony

Wpływ kaprylanu sodu i kaprynianu sodu na indukcję proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo Oceniano według protokołu opisanego w przykładzie 1 2.

Obserwowano znaczące przyspieszenie proliferacji lub ochrony komórek szpiku kostnego u myszy, które wyjściowo otrzymały kaprylanu sodu i kaprynianu sodu, a następnie CY (fig. 9).

P r z y k ł a d 18. Badania chemioochrony: schematy stosowane po leczeniu

Badania chemioochrony przeprowadzono według protokołu opisanego w przykładzie 12, z tym, że myszy otrzymywały MCT, kaprylan sodu, kaprynian sodu lub kwas kaprynowy doustnie, w dniu 1, 2, 3 i 4 po chemioterapeutyku.

PL 222 876 B1

Znaczący wzrost miana komórek szpiku kostnego obserwowano przy zastosowaniu u myszy po leczeniu CY MCT, kaprylanu sodu i kaprynianu sodu (tabela 7). Kwas kaprynowy, zastosowany po leczeniu, indukował znaczący wzrost miana komórek śledziony i słaby wzrost miana komórek szpiku kostnego (tabela 7).

T a b e l a 7

Wpływ cyklofosfamidu (CY), CY + MCT, CY + kaprylanu sodu i CY + kaprynianu sodu, zastosowanych po leczeniu, na komórki 15 szpiku kostnego i śledziony

	Szpik kostny	śledziona
	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY
Kontrola	52 ± 6,17			110 ± 29,3
CY	19 ± 4,99	>0,0001		30 ± 9,5	0,0007
CY + MCT (12,5 pM)	26 ± 3,70	>0,0001	0,0189	38 ± 7,2	0,0014	0,163
CY + kaprylan sodu (12,5 pM)	26 ± 5,33	>0,0001	0,0455	36 ± 12,5	0.0009	0,394
CY + kaprynian sodu (12,5 pM)	29 ± 4,45	0,0001	0,0140	28 ± 6,3	0,0007	0,696

P r z y k ł a d 19. Badania chemioochrony: test immunofenotypowania

Samice myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni otrzymywały wyjściowo, doustnie w dniu -3, -2 i -1 lub dożylnie w dniu 0 różne stężenia MCT. Immunofenotypowanie prowadzono także na zwierzętach z immunosupresją. Immunosupresję osiągano za pomocą 80 mg/kg 5-fluorouracylu (5-FU) lub 100-200 mg/kg cyklofosf amidu (CY) lub; 12 mg/kg taksoteru (TX), podawanych w iniekcji w dniu 0. Myszy uśmiercano w dniu 5 przez nakłucie serca. Zebrano krew i śledziony, przygotowano zawiesiny komórkowe i erytrocyty poddano lizie w buforze ACK (155 mM NH₄CI; 12 MM NaHCO₃; 0,1 EDTA; pH 7,3) przez 5 minut. Komórki przemyto trzykrotnie w PBS, pH 7,4 i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w pożywce do hodowli tkankowej. Następnie komórki inkubowano przez 45 minut na lodzie z użyciem izotiocyjanianiu fluoresceiny (FITC) lub fikoerytryny (PE), sprzężonymi markerami powierzchni komórki, według zaleceń producenta (Gibco/BRL, Cedar lane, Boehringer Mannheim). Następnie komórki płukano w PBS, utrwalano 1% para formaldehydem i analizowano za pomocą cytometru przepływowego (Coulter XL flow Cytometer). Analizę podgrup komórek wykonywano przez oznaczenie standardowych markerów powierzchni komórek, które obejmowały: TCP (receptor limfocytów T), CD4 (limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T cytotoksyczne/supresorowe), CD11b (makrofagi), NK (komórki NK) i Ly5 (limfocyty B).

Komórki szpiku kostnego otrzymano w sposób opisany w przykładzie 1 1 . Komórki barwiono drogą inkubacji przez 45 minut w FITC lub PE, sprzężonymi markerami powierzchni komórki, według zaleceń producenta. Następnie komórki płukano w PBS, utrwalano 1% paraformaldehydem i analizowano za pomocą cytometru przepływowego (Coulter XL flow cytometer). Analizę podgrup komórek wykonywano przez oznaczenie standardowych markerów powierzchni komórek, które obejmowały: CD34 (hematopoetyczne komórki progenitorowe), CD41 (płytki krwi, megakariocyty), CD13 (mielomonocytarne komórki macierzyste, mielocyty, promonocyty) i CD38 (limfoidalne komórki macierzyste, pro-limfocyty B, pire-limfocyty B). Tabela 8 przedstawia wpływ MCT na immunofenotypowanie krwi i śledziony u normalnych myszy. W immunofenotypowania krwi MCT prowadził do słabego wzrostu podgrup komórek CD8+ i LY5+. W niektórych doświadczeniach MCT prowadził do słabego wzrostu podgrupy LY5-TCR (nie pokazano danych). W immunofenotypowaniu śledziony MCT prowadził do znaczącego wzrostu względnego odsetka komórek LY5+TCR+ i CD4+. LY5-TCR- są komórkami nie-B i nie-T, które mogą stanowić neutrofile.

MCT podany myszom z immunosupresją prowadził do wzrostu względnego odsetka komórek LY5-TCR- (prawdopodobnie neutrofili) i CD11+ (makrofagów) w immunofenotypowaniu krwi i śledziony, w porównaniu z samym cyklofosfamidem. Te podgrupy komórek wywodzą się z prekursorowej komórki mieloidalnej (tabela 9).

PL 222 876 B1

T a b e l a 8

Wpływ MCT na immunofenotypowanie krwi i śledziony u normalnych myszy

Podgrupa komórek	Kontrola	6,25 pM	12,5 pM	50 pM
Immunofenotypowanie krwi
CD8+	12,76 ± 1,23	16,41 ± 1,16 p<0,0004	-	13,18 ± 2,08 p = 0,68
LY5+	15,57 ± 6,91	24,0 ± 4,92 p<0,037	-	26,75 ± 4,11 p<0,01
Immunofenotypowanie śledziony
LY5-TCR-	13,02 ± 2,54	-	16,84 ± 10,83 p<0,0257	- .
CD4+	19,9 ± 1,09	22,25 ± 1,64 p<0,013	-	22 ± 0,47 p<0,091

T a b e l a 9

Wpływ MCT na immunofenotypowanie krwi i śledziony u myszy z immunosupresją indukowanym cyklofosfamidem (CY, 200 mg/kg)

Podgrupa komórek	CY	6,25 pM	12,5 pM	50 pM
Immunofenotypowanie krwi
LY5-TCR-	36,82 ± 9,93	-	51,67 ± 11,10 p<0,05	46,32 ± 5,63 p = 0,1254
CDI 1 +	26,41 ± 4,54	-	42,12 ± 8,77 p<0,0119	42,56 ± 8,62 p<0,0098
Immunofenotypowanie śledziony
LY5-TCR-	20,2 ± 4,05	23,92 ± 1,61 p<0,07 (słaby)	-	-
CD11 +	16,31 ± 4,85	27,47 ± 11,48 p<0,06 (słaby)	-	-

P r z y k ł a d 20. Badania chemioochrony: immunofenotypowanie szpiku kostnego

Wpływ MCT, kaprylanu sodu, kaprynianu sodu na immunofenotypowanie szpiku kostnego przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 19. Podawanie cyklofosfamidu indukuje znaczący wzrost wszystkich badanych podgrup komórek (CD34+, CD13+,CD41+ i CD38+). Dodanie MCT lub kaprylanu sodu lub kaprynianu sodu prowadzi do zwiększenia liczby komórek linii CD13+, do których należą mielomonocytarne komórki macierzyste, mielocyty i promonocyty. Ten wzrost względnego odsetka komórek CD13+ jest znamienny w porównaniu z samym cyklofosfamidem. Wyniki jednoznacznie pokazują, że MCT i inne pochodne związki indukują znaczący wzrost liczby komórek szpiku kostnego (co pokazano w poprzednich przykładach) i dodatkowo zwiększają względny odsetek prekursorów komórek fagocytarnych (PMN i monocytów). Może to prowadzić do szybszego zdrowienia po leczeniu cytotoskycznym lub lepszej ochrony przed czynnikami zakaźnymi (tabela 10).

T a b ela 10

Wpływ MCT, kaprylanu sodu i kaprynianu sodu na immunofenotypowanie szpiku kostnego u myszy z immunosupresją indukowanym cyklofosfamidem (CY, 200 mg/kg)

% Komórek	CD34+	CD13+	CD41 +	CD38+
1	2	3	4	5
Kontrola	1,1 ± 0,3	0,8 ± 0,2	1,6 ± 0,2	29,8 ± 6,5

PL 222 876 B1

Ciąg dalszy tabeli 10

1	2	3	4	5
Cyklofosfamid (CY)	10 ± 1,0	3,2 ± 0,5	4,2 ± 0,6	39,6 ± 13,6
CY + MCT	11,2 ± 1,3	4,5 ± 0,5 p<0,001	4,5 ± 0,4	42 ± 15,7
CY -t- Kaprylan sodu	11,2 ± 1,3	4,9 ± 1,2 p<0,017	4,6 ± 1,3	36 ± 9,7
CY + Kaprynian sodu	9,1 ± 3,1	4,7 ± 1,7 p<0,06	3,7 ± 0,7	44,3 ± 22,8

P r z y k ł a d 21. Badania chemioochrony

Wpływ serinolu tridekanoilu i serinolu didekanoilu na indukcję proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo oceniano według protokołu opisanego w przykładzie 12.

Jak pokazano w tabeli 11, serinol tridekanoilu znacząco zwiększał miano komórek śledziony. Nie obserwowano znaczącego wpływu na miano komórek szpiku kostnego.

T a b e l a 11

Wpływ cyklofosfamidu (CY), CY + serinolu tridekanoilu 15 oraz CY + serinolu didekanoilu na komórki szpiku kostnego i śledziony

	Szpik kostny	Śledziona
	Miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY
Kontrola	53 ± 4,8			113 ± 15,5
CY	28 ± 3,4	>0,0001		29 ± 9,2	>0,0001
CY + serionol tridekanoilu	28 ± 4,6	>0,0001	0,95	42 ± 8,4	>0,0001	0,035
CY + serinol didekanoilu	30 ± 3,8	>0,0001	0,54	36 ± 9,9	>0,0001	0,27

P r z y k ł a d referencyjny. Badania chemioochrony

Wpływ α-metylotridekanoilo-L-fukopiranozy i β-metylotridekanoilo-L-fukopiranozy na indukcję proliferacji lub ochrony komórek układu odpornościowego w warunkach in vivo oceniano według protokołu opisanego w przykładzie 1 2.

Jak pokazano w tabeli poniżej, α-metylotridekanoilo-L-fukopiranoza wykazywała słaby (nieznaczny) wpływ na miano komórek śledziony w porównaniu z myszami leczonymi samym cyklofosfamidem. Brak wpływu α-metyloancmeru był oczekiwany w świetle znanej nietrwałości α-alkylopiranozydów.

T a b e l a

Wpływ cyklofosfamidu. (CY), CY + α-metyiotridekanoilo-L-fukopiranozy i CY + β-metyiotridekanoilo-L-fukopiranozy na szpik kostny

	Szpik kostny
	miano komórek (x 106)	P/Kontrola	P/CY
Kontrola	53 ± 8,0
CY	26,2 ± 2,6	0,0058
CY + α-metylotridekanoilo-L-fukopiranoza	30,4 ± 9,3	0,0133	0,334
CY + β-metylotridckanoilo-L-fukopiranoza	34,6 ± 8,5	0,0068	0,061

P r z y k ł a d 22. Działanie przeciwnowotwórowe

6-8 Tygodniowym samicom, szczurzym C57BL/6 podawano dożylnie w dniu 0, 1x10 komórek czerniaka B16F10 z ATCC. (źródło hodowli komórkowych, Dr I.J. Fidler). Następnie zwierzętom ewentualnie podawano dożylnie MCT (25 μmola/mysz) w dniu 7, 9, 14 i 16 oraz 10 mg/kg doksorubicyny w dniu 10 i 17. Myszy uśmiercano w dniu 22. Rejestrowano masę ciała i objętość guza. Seryjne objętości guza wyznaczano na podstawie dwukierunkowych pomiarów średnicy za pomocą cyrkla, stosując

PL 222 876 B1 ₂ wzór 0,4 (a x b ), gdzie „a” to największa średnica guza, a „b” mniejsza średnica, prostopadła do poprzedniej.

Doświadczenie te wykonano w celu potwierdzenia, że MCT nie nasila rozrostu ani nie chroni komórek nowotworowych zamiast komórek układu odpornościowego.

Fig. 10 przedstawia działanie chemioochronne i działanie przeciwnowotworowe MCT, w połączeniu z subterapeutycznym stężeniem doksorubicyny w modelu czerniaka B16F10. MCT indukuje słabe zmniejszenie (T/C około 20%) objętości guza, zbliżone do obserwowanego po zastosowaniu samej doksorubicyny w subteraputycznym stężeniu (T/C około 25%). Przy zastosowaniu MCT w połączeniu z doksorubicyną obserwowano efekt addycyjny (T/C około 45-50%). Powyższe wyniki wskazują, że przy połączeniu MCT z subterapeutycznym stężeniem leku cytotoksycznego istnieje możliwość osiągnięcia skuteczności terapeutycznej.

P r z y k ł a d 23. Działanie przeciwnowotworowe

Syngeniczny guz DMBA3 (DA-3, model raka sutka) powstał ze zmiany przednowotworowej, którą traktowano 7,12-dimetylobenzoantracenem, u samic mysich BALC/c. Komórki DA-3 hodowano w jednowarstwowej hodowli komórkowej w kolbach z tworzywa sztucznego w RPMI-1640 zawierającym 0,1 mM endogennych aminokwasów, 0,1 pM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy i 100 pg/ml siarczanu gentamycyny. Następnie dodano 50 pM 2-merkaptoetanolu i 10% płodową surowicę bydlęcą. Guzy DA-3 seryjnie pasażowano w warunkach in vivo, wszczepiając 5 x 10 żywych komórek guza, aby doprowadzić do powstania miejscowych guzów nowotworowych u 6-8-tygodniowych myszy BALB/c. Zwierzęta te następnie cyklicznie badano przez obmacywanie pod kątem obecności guza.

Seryjne objętości guza wyznaczano na podstawie dwukierunkowych pomiarów średnicy za pomocą ₂ cyrkla, stosując wzór 0,4 (a x b ), gdzie „a” to największa średnica guza, a „b” mniejsza średnica, prostopadła do poprzedniej. Guzy były wyczuwalne przy obmacywaniu zazwyczaj w 7-10 dni po inokulacji.

Dwa schematy leczenia zastosowano dla oceny skuteczności i ochrony przeciwnowotworowej MCT w połączeniu z cyklofosfamidem (CY, 100 mg/kg) i taksoterem (TX, 20 mg/kg) w modelu guza nowotworowego DA-3. Myszom BABL/c wstrzykiwano komórki guza nowotworowego w dniu 0. Doustne leczenie MCT prowadzono w dniu 6, 7 i 8; dniu 13, 14 i 15; dniu 20, 21 i 23; w dniu 9 i 16 podawano dożylnie CY lub TX jako pojedynczy bolus. Od dnia 4 do dnia 23 monitorowano masę ciała i objętości guza. W 15 dniu 23 wszystkie zwierzęta uśmiercano. % T/C (stosunek leczenia do kontroli) obliczano jako stosunek objętości guza w chwili śmierci zwierzęcia w grupie otrzymującej leczenie podzielonej przez odpowiednią objętość w grupie kontrolnej, pomnożoną przez 100. Zgodnie z kryteriami MCI środek jest uznawany za skuteczny, jeśli T/C jest < 40%.

Doświadczenie to wykonano dla potwierdzenia, że MCT nie nasila rozrostu ani nie chroni komórek nowotworowych zamiast komórek układu odpornościowego. Fig. 11 pokazuje chemioochronne i przeciwnowotworowe działanie MCT, podawanego w połączeniu z subterapeutycznym stężeniem CY i TX w modelu raka sutka DA-3, MCT indukuje słabe zmniejszenie (T/C około 18%) objętości guza, w porównaniu z kontrolą. Gdy MCT stosowany jest w połączeniu z CY lub TX, nie obserwuje się powiększenia objętości guza nowotworowego. Natomiast przy zastosowaniu w połączeniu z CY, zaobserwowano odpowiedź terapeutyczna (T/C = 39,4%). Powyższe wyniki wskazują, że działanie terapeutyczne można osiągnąć podając MCT w połączeniu z subterapeutycznym stężeniem CY. Działanie to może być wynikiem ogólnego wzrostu skuteczności komórek układu odpornościowego u myszy leczonych MCT (fig. 11 i tabela 12).

Tabela 12

Wpływ MCT w połączeniu, z subterapeutycznym stężeniem cyklofosfamidu (CY, 100 mg/kg) i taksoteru (TX, 20 mg/kg) na objętość guza nowotworowego

	Objętość guza	Leczenie/Kontrola (%)
Kontrola	58,8 ± 60,1
CY	27,5 ± 15,9	46,8
TX	37,9 ± 41,5	64,5
CY + MCT	23,2 ± 13,1	39,4
TX + MCT	38,8 ± 31,0	66,1
MCT	48,5 ± 35,2	82,5

PL 222 876 B1

P r z y k ł a d 24. Działanie przeciwnowotworowe

Skuteczność przeciwnowotworową i chemioochronę oceniano według protokołu opisanego w przykładzie referencyjnym, z tym, że zastosowano leki cytotoksyczne w terapeutycznym stężeniu (cyklofosfamid, 200 mg/kg; taksoter, 30 mg/kg).

Powyższe doświadczenie wykonano w celu potwierdzenia, że MCT nie nasila rozrostu ani nie chroni komórek nowotworowych zamiast komórek układu odpornościowego. Fig. 12 pokazuje chemioochronną i przeciwnowotworową skuteczność. MCT zastosowanego w połączeniu z CY i TX w terapeutycznym stężeniu, w modelu raka sutka DA-3. MCT indukuje słabe zmniejszenie objętości guza, w porównaniu z kontrolą. Przy łącznym zastosowaniu MCT i CY lub TX, nie obserwuje się powiększenia objętości guza nowotworowego. Przy zastosowaniu leczenia CY lub CY + MCT obserwowane jest znaczne zmniejszenie objętości guza nowotworowego. Ponadto, można osiągnąć znaczącą odpowiedź polegającą na zmniejszeniu objętości guza nowotworowego przy leczeniu połączeniem MCT i TX (p<0,0327), w porównaniu z samym TX, którego efekt nie był znaczny w porównaniu z kontrolnymi myszami (p=0,1211) (tabela 13). Powyższe wyniki wskazują, te działanie terapeutyczne można osiągnąć podając MCT w połączeniu z nieistotnym terapeutycznym stężeniem TX. Działanie to może być wynikiem ogólnego wzrostu sprawności komórek układu odpornościowego u myszy leczonych MCT.

T a b e l a 13

Wpływ MCT w połączeniu z terapeutycznym stężeniem cyklofosfamidu (CY, 200 mg/kg) i taksoteru (TX, 30 mg/kg) na objętość guza nowotworowego

Leczenie	T/C (%)	P/Kontrola	P/CY	P/TX
Kontrola
MCT		0,4299
CY	18,8	0,0337
CY-MCT	22,1	0,0022	0,2928
TX	64,7	0,1211
TX-MCT	46,7	0,0327		0,5468

Zastrzeżenia patentowe

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie pochodnych glicerolu do wytwarzania leku do leczenia stanów związanych z przeszczepem szpiku lub do leczenia stanów wybranych spośród neuropenii, ran u pacjenta i mielosupresji, której przyczyną jest chemioterapia i radioterapia; przy czym pochodną glicerolu stanowi związek o wzorze I o

   II

   R-C-O—

   AY—

   BO —

   Y = O, NH I gdzie R1 oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C7 lub C9 alkil;

   O

   II

   A i B niezależnie oznaczają atom wodoru lub ^{R (} .
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym związek stanowi trigliceryd kwasu kaprylowego.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym związek stanowi trigliceryd kwasu kaprynowego.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stężenie związku we krwi wynosi powyżej 1 pM.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta mielosupresji, której przyczyną jest chemioterapia.

   PL 222 876 B1
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta mielosupresji, której przyczyną jest radioterapia.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta przewlekłej neuropenii.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta przejściowej neuropenii.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do. leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest choroba hematologiczna.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii indukowanej lekami.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest niedobór żywieniowy.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której przyczyną jest zakażenie.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta neuropenii, której, przyczyną jest radioterapia.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta ran u pacjenta.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym lek służy do indukowania mobilizacji neutrofili, co ułatwia przeszczep szpiku u pacjenta.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 1, ponadto polegające na jednoczesnym podawaniu farmakologicznie skutecznej ilości ludzkiego czynnika stymulującego kolonie, przy czym ta farmakologicznie skuteczna ilość zostaje zmniejszona w obecności związku.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, w którym czynnikiem stymulującym kolonie jest G-CSF lub GM-CSF.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 1, ponadto polegające na oddzielnym podawaniu farmakologicznie skutecznej, ilości ludzkiego czynnika stymulującego kolonie, przed/lub po podaniu związku, ale nie drogą równoczesnego podawania.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 18, w którym czynnikiem stymulującym kolonie jest G-CSF lub GM-CSF.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym lek służy do leczenia przejściowej neuropenii u zwierząt, której przyczyną jest stres związany z transportem lub podróżą.