PL229768B1

PL229768B1 - Zastosowanie polimeru blokowego zawierającego blok poli- (chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do neutralizacji heparyny

Info

Publication number: PL229768B1
Application number: PL412654A
Authority: PL
Inventors: Maria Nowakowska; Krzysztof SZCZUBIAŁKA; Krzysztof Szczubiałka; Kamil KAMIŃSKI; Kamil Kamiński; Andrzej MOGIELNICKI; Andrzej Mogielnicki; Bartłomiej Kałaska; Dariusz PAWLAK; Dariusz Pawlak; Emilia Sokołowska
Original assignee: Univ Jagiellonski; Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2018-08-31
Also published as: EP3307281B1; US10052347B2; EP3307281A1; US20180161361A1; PL412654A1; AU2016277192A1; WO2016200284A1; CA2987709A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polimerów blokowych zawierających blok poli(chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego) do bezpośredniej neutralizacji heparyn we krwi i płynach ustrojowych, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej i heparyny drobnocząsteczkowej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polimerów blokowych do neutralizacji heparyny.

Heparyna, substancja odkryta przez McLeana na początku XX wieku, znajduje kliniczne zastosowanie od 1937 r. i jest pierwszym opartym na polisacharydach lekiem, który znalazł się na liście leków podstawowych Światowej Organizacji Zdrowia. Heparyna jest glikozaminoglikanem (GAG) o dużej dyspersji mas cząsteczkowych i wysokim stopniu podstawienia grupami siarczanowymi (posiada największą wśród cząsteczek biologicznych gęstość ładunku ujemnego ze średnio 2,7 ładunkami ujemnymi na jednostkę powtarzalną, którą stanowią jednostka glukozaminowa i jednostka kwasu L-iduronowego). Heparyna jest wytwarzana i przechowywana w komórkach tucznych, makrofagach oraz komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych. Pozyskiwana jest z tkanek zwierzęcych, w szczególności z jelit wieprzowych i płuc wołowych. Wykazuje bardzo silne działanie hamujące krzepnięcie krwi, chociaż zaledwie jedna trzecia cząsteczek heparyny posiada właściwości przeciwkrzepliwe. Jej działanie polega na zwiększeniu zdolności antytrombiny (AT) do dezaktywowania trombiny i czynnika Xa, enzymów odpowiedzialnych za powstawanie fibryny podczas formowania się skrzepu. Heparyna jest lekiem z wyboru w sytuacjach, w których konieczne jest szybkie zahamowanie procesu krzepnięcia, np. podczas operacji chirurgicznych, w szczególności w celu zapobieżenia tworzeniu się skrzepów w urządzeniach stosowanych w krążeniu pozaustrojowym, takich jak dializatory lub oksygenatory. Posiada ona również wiele innych zastosowań terapeutycznych, np. w leczeniu niestabilnej dusznicy bolesnej lub ostrego zawału serca. Jej stosowanie może również powodować obniżenie poziomu cholesterolu i lipidów. Do oceny siły działania heparyny służą dwa testy laboratoryjne. Są to: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) i czas krzepnięcia po aktywacji (ACT). Pierwszy służy do bardziej dokładnego monitorowania mniejszych dawek i stosowany jest raczej do profilaktyki, a drugi do ogólnego działania w szerokim zakresie dawek i stosowany jest podczas zabiegów chirurgicznych.

Jednakże podawanie heparyny wiąże się z wieloma efektami ubocznymi, wśród których najczęściej spotykane są krwotoki, trombocytopenia indukowana heparyną (heparin induced thrombocytopenia, HIT), hiperkalcemia powodująca osteoporozę przy długotrwałym stosowaniu heparyny oraz wzrost stężenia aminotransferazy we krwi. Ze względu na konieczność zapobieżenia skutkom obniżenia krzepliwości krwi często zachodzi potrzeba neutralizacji lub usunięcia heparyny z krwioobiegu po uzyskaniu pożądanego działania antykoagulacyjnego. Również z powodu działań niepożądanych coraz częściej stosuje się heparyny drobnocząsteczkowe (LMWH), które dzięki krótszym łańcuchom działają głównie na czynnik Xa. W związku z różnicami w mechanizmie działania leki te są bezpieczniejsze i mają wydłużony czas działania, dzięki czemu mogą być podawane chronicznie. Ich wadą jest to, że nie mają skutecznej odtrutki i w sytuacji przedawkowania trudniej jest przywrócić pacjentowi prawidłową krzepliwość krwi. Jeżeli zachodzi potrzeba oceny siły ich działania wykonuje się oznaczenie aktywności przeciwko aktywnemu czynnikowi krzepnięcia Xa (aktywność anty-Xa).

W stanie techniki jedynym stosowanym klinicznie lekiem do neutralizacji działania heparyny jest protamina, białko wprowadzone do praktyki klinicznej prawie jednocześnie z heparyną (Fischer, A Biochem Zeit. 278, 133, 1935). Charakteryzuje się ono niezwykle wysoką zawartością aminokwasów zasadowych takich jak arginina, lizyna i histydyna, mogącą osiągać 80%. Innym polimerem, który badano pod kątem usuwania heparyny, jest poli-L-lizyna (Ma X., Mohammad S.F., Kim S.W., Biotechnology and Bioengineering, 1992, 40(4), 530-536).

Jeszcze innym podejściem do problemu neutralizacji heparyny jest jej enzymatyczna degradacja za pomocą immobilizowanej heparynazy (Kolde H.-J., Pelze H., Borzhenskaya L., Russo A., Rose M., Tejidor L., Hamostaseologie 1994, 14(1), 37-43).

Niestety, wymienione metody neutralizacji heparyny mogą powodować efekty uboczne. Protamina, jeśli nie zostanie zneutralizowana lub usunięta z krwioobiegu, może powodować niepożądane reakcje u około 10% pacjentów. Mogą one być bardzo poważne, a nawet śmiertelne, i obejmują nadciśnienie płucne, niedociśnienie tętnicze, wstrząs anafilaktyczny, trombocytopenię i granulocytopenię. Neutralizacja heparyny poprzez zastosowanie protaminy jest niekompletna i towarzyszą jej reakcje alergiczne.

Działanie przeciwzakrzepowe heparyn drobnocząsteczkowych może być zneutralizowane jedynie częściowo (maksymalnie w 60%) przez powolne dożylne wstrzyknięcie siarczanu protaminy (http://products.sanofi.us/lovenox/lovenox.html). Jednak oprócz protaminy nie ma obecnie na rynku

PL 229 768 B1 żadnych innych związków neutralizujących działanie tych antykoagulantów. Pojawienie się bezpiecznego i skutecznego antidotum dla heparyn drobnocząsteczkowych mogłyby się poszerzyć ich zastosowania o okoliczności, w których obecnie podaje się heparynę niefrakcjonowaną.

Oprócz chemicznych metod neutralizacji heparyny przeprowadzono również doświadczenia mające na celu neutralizację heparyny za pomocą metod jej fizycznego usuwania z krwi.

Urządzenia do fizycznego usuwania heparyny z krwi, w większości oparte były na zastosowaniu immobilizowanej poli-L-lizyny (Joseph B. Zwischenberger, MD, Roger A. Vertrees, BA, CCP, Robert L. Brunston, Jr., MD, Weike Tao, MD, Scott K. Alpard, MD, and Paul S. Brown, Jr., MD, The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 1998 Tom 115, Numer 3; Zwischenberger J.B., Tao W., Deyo D.J., Vertrees R. A., Alpard S.K., Shulman G., Annals of Thoracic Burgery Tom 71, Zagadnienie 1, 2001, Strony 270-277). Urządzenie do usuwania heparyny (HRD, heparin removal device), opisane w powyższych publikacjach, włączone zostało w krwioobieg pacjenta pozaustrojowo poprzez połączenie żylno-żylne.

Dokonano w nim separacji osocza, które po usunięciu z niego heparyny przez kontakt z poli-L-lizyną, było zawracane do krwiobiegu pacjenta. Pomimo obiecujących wyników eksperymentalnych, doświadczenia z zastosowaniem tego typu urządzeń są ograniczone i jak dotąd żadne z nich nie zostało wdrożone do praktyki klinicznej.

Metodą często stosowaną w celu uniknięcia komplikacji spowodowanych przez niezwiązane związki będące antagonistami heparyny, jest ich immobilizacja na podłożach polimerowych znajdujących się w urządzeniu do usuwania heparyny. Na przykład protaminę osadzono na matrycy otrzymanej przez naszczepienie polimeru akrylowego na celulozie (Hou K.C., Roy S., Zaniewski R., Shumway E. Artificial Organs 1990, 14((6), 436-442) lub wewnątrz włókien celulozowych (Wang T., Byun Y., Kim J.S., Liang J., Yang V.C. International Journal of Bio Chromatography 2001,6(2), 133-149). Wykazano, że przy przepływie krwi 100 mL/min skonstruowany bioreaktor usuwał ponad 50% podanej heparyny w ciągu 10 minut. Zastosowanie bioreaktora zawierającego immobilizowaną protaminę nie spowodowało żadnych statystycznie istotnych zmian w monitorowanych parametrach hemodynamicznych.

Inne doniesienie opisuje skuteczne usuwanie heparyny przy pomocy kulek otrzymanych z alginianu i poli-L-lizyny (M. Sunil Varghese, D. Hildebrandt, and D. Glasser, N.J. Crowther, D.M. Rubin, Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 2006, 34, 419-432). Jednakże polimerowe kulki nie mogły być stosowane in vivo.

Twórcy niniejszego wynalazku opracowali wcześniej metody neutralizacji heparyny oparte na wykorzystaniu polisacharydów w formie rozpuszczalnej do neutralizacji heparyny we krwi bez jej fizycznego usuwania (zgłoszenie P 387249) lub usieciowanych polisacharydów w formie mikrosfer do neutralizacji heparyny we krwi poprzez jej fizyczne usuwanie. Prace nad anty-heparynowym działaniem polimerów opisanych w niniejszym zgłoszeniu stanowią rozwinięcie badań opisanych w poprzednich zgłoszeniach.

Opisane powyżej metody nie rozwiązują problemu skutecznego i efektywnego neutralizowania heparyny. Stosowana w powszechnej praktyce medycznej protamina może powodować poważne skutki uboczne, natomiast podjęte próby usuwania heparyny z krwi za pośrednictwem metod fizycznego rozdziału z uwagi na ograniczenia w stosowaniu, w tym konieczność hospitalizacji pacjentów oraz brak komfortu dla pacjentów okazały się niepraktyczne.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej, skutecznej metody efektywnego neutralizowania heparyny, zarówno niefrakcjonowanej, jak i drobnocząsteczkowej, bez powodowania skutków ubocznych i dyskomfortu dla pacjenta.

Nieoczekiwanie okazało się, że cel ten może być zrealizowany poprzez wykorzystanie syntetycznych polimerów blokowych.

Istotą wynalazku jest zastosowanie polimeru blokowego zawierającego blok poli(chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do wytwarzania leku do bezpośredniej neutralizacji heparyn w krwi i płynach ustrojowych, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej i heparyny drobnocząsteczkowej.

Korzystnie, jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PEG-PMAPTAC, szczególnie korzystnie kopolimer PEG41-PMAPTAC53 lub PEG41 -PMAPTAC21.

Alternatywnie, korzystnie jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PMPC-PMAPTAC, szczególnie korzystnie kopolimer PMPC20-PMAPTAC44 lub PMPC100-PMAPTAC93.

PL 229 768 B1

Korzystnie, stosowane polimery blokowe zawierające blok PMAPTAC otrzymane są metodą polimeryzacji kontrolowanej CRP.

Polimery blokowe to typ polimerów, których łańcuchy zbudowane są z dwóch lub więcej bloków, z których każdy zbudowany jest z innych jednostek zwanych merami.

Kwas metakrylowy i jego pochodne (metakrylany) są na szeroką skalę wykorzystywane do produkcji polimerów od lat 30-tych XX wieku, a sama reakcja polimeryzacji kwasu metakrylowego znana jest od 1877 roku. Zakres zastosowań polimerów opartych na metakrylanach jest szeroki poczynając od szkła organicznego (znanego powszechnie jako „Plexiglas”) po szkła kontaktowe i elementy endoprotez. Zaletą tych polimerów jest możliwość ich otrzymywania za pomocą różnych technik polimeryzacji, w tym technikami kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej (controlled radical polymerization, CRP), np. polimeryzacji z odwracalnym addycyjno-fragmentacyjnym przeniesieniem łańcucha (Reversible Addition - Fragmentation Chain Transfer Polymerization, RAFT), wykorzystanej do syntezy polimerów będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia. Techniki CRP pozwalają na otrzymywanie polimerów o bardzo dobrze zdefiniowanej strukturze i masie cząsteczkowej. Szczególnie przydatne są do trzymywania polimerów o zaawansowanych architekturach, w szczególności polimerów blokowych.

2-(metakryloiloksy)etylofosforylocholina (MPC) to zwitterjonowa pochodna kwasu metakrylowego zawierająca w swojej budowie grupę występującą również w cząsteczkach lecytyny - fosfolipidu stanowiącego główny składnik błony komórkowej (Iwasaki Y., Ishihara K. Cell membrane-inspired phospholipid polymers for developing medical devices with excellent bio-interfaces, Science and Technology of Advanced Materials, 2012, 13(6), 064101; Ishihara, Kazuhiko, Ueda, Tomoko, Nakabayashi, Nobuo Preparation of phospholipid polymers and their properties as polymer hydrogel membranes, Polymer Journal, 1990, 22(5), 355-360). To strukturalne podobieństwo do składników błon komórkowych czyni polimery oparte na poli(2-metakryloiloksyetylofosforylocholinie) (PMPC) biokompatybilnymi i biozgodnymi. Stosowane są one szczególnie do modyfikacji powierzchni mających na celu zapobieżenie tworzeniu się biofilmów, np. bakteryjnych (Hirota K., Yumoto H., Miyamoto K., Yamamoto N., Murakami K., Hoshino Y., Matsuo T., Miyake Y., J Dent Res. 2011,90(7), 900-5) oraz skrzepów (O. Katakura, N. Morimoto, Y. Iwasaki, K. Akiyoshi, S. Kasugai Med Dent Sci 2005, 52, 115).

Glikol polietylenowy (PEG) jest polimerem szeroko stosowanym jako składnik środków czystości (np. mydeł w płynie) i kosmetyków. Stosowany jest również w medycynie do otrzymywania molekularnych układów maskujących, zmniejszających oddziaływanie mikro- i nanoobiektów w organizmach żywych, np. białka z przyłączoną cząsteczką PEG nie aktywują układu immunologicznego. Dzięki biozgodności PEG również poprawia parametry biologiczne makromolekuł, do których jest przyłączony (Kreppel, Florian; Kochanek, Stefan, Molecular Therapy 2007, 16(1), 16-29).

Korzystnie, rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że do bezpośredniej neutralizacji w krwi i płynach ustrojowych heparyn, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej lub heparyny drobnocząsteczkowej, jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PEG-PMAPTAC [polimer blokowy zawierający blok glikolu polietylenowego (PEG) i blok polichlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego)], szczególnie korzystnie kopolimer PEG41-PMAPTAC53 lub PEG41-PMAPTAC21.

Korzystnie, rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że do bezpośredniej neutralizacji w krwi i płynach ustrojowych heparyn, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej lub heparyny drobnocząsteczkowej, jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PMPCPMAPTAC [polimer blokowy zawierający blok glikolu polietylenowego (PEG) i blok poli(chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego)], szczególnie korzystnie kopolimer PMPC20-PMAPTAC44 lub PMPC100-PMAPTAC93.

Korzystnie, rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że do bezpośredniej neutralizacji w krwi i płynach ustrojowych heparyn, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej lub heparyny drobnocząsteczkowej, stosuje się polimery blokowe zawierające blok PMAPTAC otrzymane metodą polimeryzacji kontrolowanej CRP.

Polimery blokowe według wynalazku jako polimery syntetyczne otrzymane metodą polimeryzacji kontrolowanej (CRP) są też dużo lepiej zdefiniowane niż wcześniejsze materiały oparte na polimerach naturalnych (chitozan, hydroksypropyloceluloza, dekstran), a ich synteza dużo bardziej powtarzalna, i niezależna od czynników naturalnych. Stosowanie do neutralizacji heparyny polimerów według wynalazku pozwala również na uniezależnienie się od czynników naturalnych, takich jak zasobność łowisk łososia, z którego spermy pozyskiwana jest protamina, co znacząco wpływa na zwiększenie dostępności terapii dla pacjentów, którzy wymagają stosowania preparatów antyheparynowych.

PL 229 768 Β1

Szczególnie korzystnie, do bezpośredniej neutralizacji we krwi i płynach ustrojowych heparyn jako kopolimery PEG-PMAPTAC stosuje się kopolimer zawierający 41 jednostki powtarzalne w bloku PEG i 53 jednostki powtarzalne w bloku PMAPTAC (PEG41-PMAPTAC53) lub kopolimer zawierający 41 jednostki powtarzalne w bloku PEG i 21 jednostek powtarzalnych w bloku PMAPTAC (PEG41-PMAPTAC21 ).

CH,

HOOC-eCH^C

Ob rCHj-ęt;

—ecH₂-ęV

CN cI o

P)= c-o

NH (CH₂)₃Cl- l ₊

CHj | CH₃CH,

CH,

PMPC_m-5-PNŁAPTAC_fl

Struktura polimerów PMPC-PMAPTAC ch₃

H₃Co4cH₂CH₂O^-Woc/f—(-CH₂-ę-^c=o NH

PEG-6-PMAPTAC '

Urlo

I ^z ch₂cr ch₂h₃c-n-ch₃ ch₃

Struktura polimerów PEG-PMAPTAC

Zastosowanie do neutralizacji heparyny syntetycznych polimerów, posiadających dobrze określone parametry i charakterystykę, na którą można wpływać w trakcie procesu polimeryzacji, pozwala na zapewnienie powtarzalności procesu neutralizacji. Zatem zastosowanie rozwiązania według wynalazku eliminuje niedogodności związane ze stosowaniem do neutralizacji heparyny polimerów naturalnych.

Co więcej, dzięki zastosowaniu polimerów blokowych zawierających bloki odpowiednio PEG i PMAPTAC (PEG-PMAPTAC) oraz PMPC i PMAPTAC (PMPC-PMAPTAC) do neutralizacji antykoagulacyjnego działania heparyny we krwi i płynach ustrojowych można również neutralizować heparyny drobnocząsteczkowe (LMWH), czego nie można uzyskać poprzez zastosowanie protaminy oraz opracowanych wcześniej materiałów opartych na polimerach naturalnych.

Wynalazek przedstawiono na figurach, gdzie:

Fig. 1 przedstawia zależność stężenia wolnej (nieskompleksowanej) UFH od stosunku masy polimer/UFH,

Fig. 2 przedstawia wyniki pomiarów rozmiaru kompleksów tworzonych przez polimery i UFH uzyskane techniką DLS,

Fig. 3 przedstawia wyniki pomiarów rozmiaru kompleksów tworzonych przez polimery i protaminę z albuminą surowicy bydlęcej uzyskane techniką DLS,

Fig. 4 przedstawia masę zakrzepu izolowanego z tętnicy szyjnej szczura z indukowaną eksperymentalnie zakrzepicą po dożylnym podaniu buforu PBS (kontrola), 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH), 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg

PL 229 768 B1

PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH + 1,8 mg/kg PMAPTAC 198, 300 U/kg + 7,5 mg/kg Dex40-GTMAC3 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy, *** P<0,001 vs. kontrola; ^Λ P<0,05, ^ΛΛ P<0,01, ^ΛΛΛ P<0,001 vs. UFH. Dane wyrażono jako wartości średnie ± SEM.

Fig. 5 przedstawia czas krwawienia mierzony na ogonie szczurów z indukowaną eksperymentalnie zakrzepicą po dożylnym podaniu buforu PBS (kontrola), 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH), 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC 100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH + 1,8 mg/kg PMAPTAC198, 300 U/kg + 7,5 mg/kg Dex40-GTMAC3 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy, *** P<0,001 vs. kontrola; ^ΛΛ P<0,01, ^ΛΛΛ P<0,001. Dane wyrażono jako wartości średnie ± SEM.

Fig. 6 przedstawia czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) osocza pobranego od szczurów z indukowaną eksperymentalnie zakrzepicą po dożylnym podaniu buforu PBS (kontrola), 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH), 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH + 1,8 mg/kg PMAPTAC198, 300 U/kg + 7,5 mg/kg Dex40-GTMAC3 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy, *** P<0,001 vs. kontrola; ^ΛΛ P<0,01, ^ΛΛΛ P<0,001vs. UFH. Dane wyrażono jako wartości średnie ± SEM.

Fig. 7 przedstawia aktywność anty-fXa osocza pobranego od szczurów z indukowaną eksperymentalnie zakrzepicą po dożylnym podaniu buforu PBS (kontrola), 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH), 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC 100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH + 1,8 mg/kg PMAPTAC 198, 300 U/kg + 7,5 mg/kg Dex40-GTMAC3 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy, *** P<0,001 vs. kontrola; ^ΛΛ P<0,01, ^ΛΛΛ P<0,001 vs. UFH. Dane wyrażono jako wartości średnie ± SEM.

Fig. 8 przedstawia parametry morfologiczne: WBC (A), RBC (B), HGB (C), HCT (D), MCV (E), MCH (F), MCHC (G), PLT (H) oznaczone po 1 godzinie od podania PBS - grupa kontrolna, samej heparyny niefrakcjonowanej (UFH) w dawce 300 U/kg, bądź 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH +1,8 mg/kg PMAPTAC198 lub 300 U/kg + 3 mg protaminy. Wyniki przedstawione jako średnia ± SD; n = 3-7. WBC: liczba leukocytów, RBC: liczba erytrocytów, HGB: stężenie hemoglobiny, HCT: hematokryt, MCV: średnia objętość krwinki czerwonej, MCH: średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC: średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, PLT: płytki krwi.

Fig. 9 przedstawia wpływ polimerów na średnie ciśnienie krwi (MBP) 1 godzinę po podaniu 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH) + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53, 300 U/kg UFH + 9,36 mg/kg PEG41-PMAPTAC21, 300 U/kg UFH + 7,74 mg/kg PMPC 100-PMAPTAC93, 300 U/kg UFH + 2,25 mg/kg PMPC20-PMAPTAC44, 300 U/kg UFH + 1,8 mg/kg PMAPTAC198 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy.

Fig. 10 przedstawia zależność stężenia LMWH (Clexane) od stosunku masy polimer PEG41-PMAPTAC5 3/LMWH.

Fig. 11 przedstawia neutralizację wzrostu aktywności anty-Xa wywołanego przez LMWH w wyniku inkubacji z różnymi stężeniami polimeru PEG41 -PMAPTAC53 na 96 dołkowej polistyrenowej płytce.

Fig. 12 przedstawia neutralizację wydłużenia ACT wywołanego przez LMWH po podaniu polimeru PEG41-PMAPTAC53 szczurom. Mann-Whitney test. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, n = 6.

Fig. 13 przedstawia intensywność fluorescencji sondy związanej z preparatem PEG41 -PMAPTAC53 obserwowanej podczas przyżyciowego obrazowania (2A: T = 5 min; 2B: T = 15 min; 2C: T = 30 min; 2D: T = 60 min; 2E: T = 120 min).

Fig. 14 przedstawia intensywność sygnału fluorescencyjnego sondy związanej z preparatem PEG41-PMAPTAC53 obserwowaną podczas przyżyciowego obrazowania.

Fig. 15 przedstawia intensywność sygnału fluorescencyjnego sondy związanej z preparatem PEG41-PMAPTAC53 obserwowaną dla izolowanej wątroby oraz nerek.

Fig. 16 przedstawia wyniki obrazowania fluorescencji wątroby i nerek pobranych od myszy doświadczalnych otrzymujących preparat PEG41 -PMAPTAC53 w kolejnych punktach czasowych doświadczenia (narząd zlokalizowany w dolnym lewym rogu fotografii jest obrazem fluorescencyjnym narządu zwierzęcia, któremu nie podano znakowanego sondą preparatu)

PL 229 768 B1

Fig. 17 przedstawia wyniki obrazowania fluorescencji wątroby i nerek pobranych od myszy doświadczalnych otrzymujących siarczan protaminy w kolejnych punktach czasowych doświadczenia (narząd zlokalizowany w dolnym lewym rogu fotografii jest obrazem fluorescencyjnym narządu zwierzęcia, któremu nie podano znakowanego sondą preparatu).

Fig. 18 przedstawia intensywność sygnału fluorescencyjnego sondy związanej z siarczanem protaminy znakowanym rodaminą obserwowana w izolowanych narządach.

Fig. 19 przedstawia zmianę ciśnienia tętniczego krwi (A), częstości pracy serca (B), temperatury ciała (C), nasycenia krwi tlenem (D), perfuzji tkanek obwodowych (E), maksymalnej zwartości CO 2 w wydychanym powietrzu (F) oraz częstości oddechów (G) mierzonej przez godzinę od podania samej heparyny niefrakcjonowanej (UFH) szczurom w dawce 900 U/kg i PBS, bądź UFH, a następnie 3 minuty później PEG41-PMAPTAC53 w jednorazowej iniekcji lub 5-minutowej infuzji. Wyniki przedstawiono jako średnią. n = 3-7.

Fig. 20 przedstawia wpływ polimeru na parametry morfologiczne: WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT oznaczone po 30-minutowej inkubacji polimeru w stężeniu 1, 10, 100 gg/ml. Wyniki przedstawione jako zmiany procentowe w stosunku do grupy kontrolnej (PBS) średnia ± SD; n = 3. WBC: liczba leukocytów, RBC: liczba erytrocytów, HGB: stężenie hemoglobiny, HCT: hematokryt, MCV: średnia objętość krwinki czerwonej, MCH: średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC: średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, PLT: płytki krwi

Fig. 21 przedstawia parametry morfologiczne: WBC (A), RBC (B), HGB (C), HCT (D), MCV (E), MCH (F), MCHC (G), PLT (H) oznaczone po 7, 14 i 28 dniach od podania PBS - grupa kontrolna, samej heparyny niefrakcjonowanej (UFH) w dawce 300 U/kg, bądź UFH a następnie protaminy w dawce 3 mg/kg, bądź polimeru w dawce 1,95 mg/kg. Wyniki przedstawione jako średnia ± SD; n = 3-7. WBC: liczba leukocytów, RBC: liczba erytrocytów, HGB: stężenie hemoglobiny, HCT: hematokryt, MCV: średnia objętość krwinki czerwonej, MCH: średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC: średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, PLT: płytki krwi

Fig. 22 przedstawia wpływ polimeru na enzymy wątrobowe: aminotransferaza asparaginianowa (ASPAT) (A), aminotransferaza alaninowa (ALAT) (B), amylaza (C), fosfataza alkaliczna (D), kinaza kreatynowa (E) 6 godzin, 7, 14 i 28 dni po podaniu 300 U/kg heparyny niefrakcjonowanej (UFH), 300 U/kg UFH + 1,95 mg/kg PEG41-PMAPTAC53 oraz 300 U/kg UFH + 3 mg/kg protaminy.

Fig. 23 przedstawia przykładowe preparaty histologiczne płuc i wątroby szczura 1 godzinę po podaniu PBS (A, B), heparyny niefrakcjonowanej (UFH) (C, D) UFH z protaminą (E, F) lub z PEG41-PMAPTAC53 (G, H) oraz 28 dni po podaniu UFH z protaminą (I, J) lub z PEG41 -PMAPTAC53 (K, L).

Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładach wykonania, które nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie polimerów blokowych zawierających blok PMPC i blok PMAPTAC (PMPC-PMAPTAC)

a) Otrzymywanie homopolimeru PMPC (PMPC100-CTA)

15,0 g MPC rozpuszczono w 45,7 ml wody, a następnie dodano 0,142 g ditiobenzoesanu kwasu 4-cyjanopentanowego (CPD) i 71,2 mg kwasu 4,4'-azobis(4-cyjano walerianowego (V-501). Roztwór odgazowano przepuszczając argon przez 30 minut. Polimeryzację prowadzono przez 4 godziny w temperaturze 70°C. Otrzymaną mieszaninę dializowano względem wody destylowanej przez pięć dni. Otrzymany homopolimer (PMPC100-CTA) wyizolowano stosując liofilizator. Średnia liczbowa masa cząsteczkowa otrzymanego polimeru wyznaczona techniką chromatografii żelowej (GPC) wynosiła Mn =1,91 x 10⁴ g/mol, natomiast dyspersja mas cząsteczkowych (Mw/Mn) wynosiła 1,05. Polimer ten scharakteryzowano również wykonując widma ¹H NMR i na tej podstawie stwierdzono, że jego średnia liczbowa masa cząsteczkowa Mn wynosiła 2,98 x 10⁴, natomiast stopień polimeryzacji DP wynosił 100. Polimer ten posłużył do syntezy dwublokowego polimeru PMPC100-PMAPTAC93.

b) Otrzymywanie polimerów dwublokowych PMPC-PMAPTAC

W 10 ml wody rozpuszczono kolejno 1,09 g chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego (MAPTAC), 7 mg V-501 i 1 g PMPC100-CTA otrzymanego zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Roztwór odgazowano przepuszczając argon przez 30 minut. Polimeryzację prowadzono przez 6 godzin w temperaturze 70°C. Otrzymaną mieszaninę dializowano względem wody destylowanej przez dwa dni. Otrzymany polimer blokowy (PMPC100-PMAPTAC93) wyizolowano stosując liofilizator. Średnia liczbowa masa cząsteczkowa otrzymanego polimeru, wyznaczona techniką chromatografii żelowej (GPC) wynosiła Mn = 9,91 x 10⁴ g/mol, natomiast dyspersja mas cząsteczkowych (Mw/Mn) wynosiła 1,11.

PL 229 768 Β1

Polimer ten scharakteryzowano również wykonując widma ¹H NMR i na ich podstawie, stwierdzono, że masa jego średnia liczbowa masa cząsteczkowa Mn wynosiła 4,99 x 10⁴, natomiast stopień polimeryzacji bloku PMAPTAC wynosił 93.

Przykład 2

Otrzymywanie polimerów blokowych zawierających blok PEG i blok PMAPTAC (PEG-PMAPTAC)

a) Otrzymywanie homopolimeru PEG (PEG41-CTA)

5,66 g Ν,Ν'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w 100 ml dichlorometanu dodawano wkraplaczem przez 30 minut do mieszaniny zawierającej 27,4 g eteru metylowego glikolu polietylenowego (MeOPEG) o masie cząsteczkowej 2000 g/mol), 4,60 g CPD oraz ślady 4-dimetyloaminopirydyny w 100 ml dichlorometanu. Przez kolejne 20 godzin mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 40°C. Po tym czasie produkt oczyszczono z osadu dicykloheksylomocznika. Rozpuszczalnik usunięto na wyparce, a surowy produkt oczyszczono stosując chromatografię z wykorzystaniem złoża z żelu silikonowego i eluentu chloroform/metanol (95/5 v/v). ¹H NMR (CDCI3, δ): 2,17 (s, 3H), 2,4-2,74 (m, 4H), 3,38 (s, 3H), 3,45-4,25 (m, 188H), 4,27 (t, 2H), 7,40 (t, 2H), 7,57 (t, 1H), 7,90 (d, 2H). Polimerten posłużył do syntezy dwublokowego polimeru PEG41-PMAPTAC53 i PEG41 -PMAPTAC21.

b) Otrzymywanie polimeru dwublokowego PEG-PMAPTAC

W 30,3 ml wody rozpuszczono 5,96 g MAPTAC, 35,0 mg V-501 i 565 mg PEG-CTA otrzymanego zgodnie z procedurą opisaną we wcześniejszym podpunkcie. Roztwór odgazowano przepuszczając argon przez 30 minut. Polimeryzację prowadzono w temperaturze 70°C przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną wlano do acetonu w celu strącenia produktu. Polimer oczyszczono dalej poprzez dwukrotne rozpuszczenie w metanolu i strącenie acetonem. Oczyszczony polimer dwublokowy suszono 24 godziny w temperaturze 60°C. Na podstawie chromatografii żelowej (GPC) stwierdzono, ze średnia liczbowa masa cząsteczkowa wynosiła M_n =1,51 χ 10⁴ g/mol, natomiast dyspersja mas cząsteczkowych (M_w/M_n) wynosiła 1,02.

Tabela 1

Charakterystyka polimerów otrzymanych z monomerów MPC i MAPTAC

DPpMPC	DPpMAPTAC	(GPC)	Μ, (NMR)	M^!M_n
100	93	21869	50335	1.098
20	94	20700	27000	1.03
20	94	18300	27000	1.03
0	198	26302	43986	1.048

Tabela 2

Charakterystyka polimerów PEG-PMAPTAC

DPpeg	DPp^aptac	M_a (GPC)	Λ/_η (NMR)
41	27	8161	8321	1.028
41	53	11130	14061	1.022

PL 229 768 Β1

Przykład 3

Otrzymywanie homopolimeru PMAPTAC

W 30,3 ml wody rozpuszczono 5,96 g PMAPTAC, 25,0 mg V-501 i 55,1 mg CPD . Roztwór odgazowano przepuszczając argon przez 30 minut. Polimeryzacje prowadzono przez 5 godzin w temperaturze 70°C. Mieszaninę reakcyjną wlano do acetonu w celu strącenia produktu. Polimer oczyszczono dalej poprzez dwukrotne rozpuszczenie w metanolu i strącenie acetonem. Oczyszczony polimer suszono przez 24 godziny w temperaturze 60°C. Na podstawie widm ¹H NMR stwierdzono, że średnia liczbowa masa cząsteczkowa polimeru wynosiła M_n = 43986, dyspersja mas cząsteczkowych (M_w/M_n) wynosiła 1,05, a stopień polimeryzacji DP wynosił 198.

Przykład 4

Kompleksowanie heparyny niefrakcjonowanej (UFH) przez polimery PEG-PMAPTAC i PMPC-PMAPTAC

Zbadano zależność stężenia wolnej (nieskompleksowanej) heparyny niefrakcjonowanej (UFH) od stężenia polimerów blokowych PEG41-PMAPTAC53, PEG41-PMAPTAC21, PMPC100-PMAPTAC93, PMPC20-PMAPTAC44 stosując metodę spektrofotometryczną opartą na zastosowaniu Ażuru A. Wykres zależności stężenia UFH od stosunku masy polimer/UFH przedstawia fig. 1.

Obliczone na podstawie powyższych wykresów masy polimerów potrzebne do związania 1 mg heparyny zebrano w tabelce poniżej.

Tabela 3

Masy otrzymanych polimerów i protaminy potrzebne do związania 1 mg heparyny UFH

Polimer	Masa polimeru potrzebna do związania 1 mg heparyny UFH
PEG41-PMAPTAC53	0,65 mg
PEG41-PMAPTAC21	3,12 mg
PMPC20- PMAPTAC44	0,75 mg
PMPC100-PMAPTAC93	2,58 mg
protamina	1,26 mg

Przykład 5

Badanie rozmiaru kompleksów otrzymanych polimerów z heparyną UFH przy pomocy pomiarów DLS

Za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zmierzono rozmiar kompleksów polimerów z heparyną UFH w PBS. Proporcja użytych objętości i stężeń odpowiada ilości polimeru wystarczającej do całkowitego związania heparyny wyznaczonej spektrofotometrycznie. Wyniki pomiarów rozmiaru kompleksów tworzonych przez polimery i UFH uzyskane techniką DLS przedstawia fig. 2.

Stwierdzono, że kompleksy wszystkich polimerów i heparyny UFH (z wyjątkiem PEG41-PMAPTAC21) są mniejsze niż kompleksy UFH z protaminą (1300 nm), a dyspersja ich rozmiarów jest stosunkowo niewielka.

Przykład 6

Potencjał zeta badanych polimerów oraz ich kompleksów z heparyną

Wyniki pomiarów potencjału zeta badanych polimerów oraz ich kompleksów z heparyną przedstawia Tabela 4.

PL 229 768 Β1

Tabela 4

Potencjał zeta polimerów w roztworach PBS oraz ich kompleksów z heparyną

Polimer	Potencjał zeta polimeru [mV]	Potencjał zeta kompleksu polimeru z UFH [mV]
PEG41-PMAPTAC53	+7,27	-7,94
PEG41-PMAPTAC21	+9,82	+1,28
PMPC20-PMAPTAC44	+9,11	-13,13
PMPC100- PMAPTAC93	+10,95	-2,08

Przykład 7

Oddziaływanie polimerów z albuminą surowicy bydlęcej

Za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zmierzono rozmiar kompleksów tworzonych przez badane polimery i protaminę z albuminą surowicy bydlęcej. Pomiary te wykazały, że maksymalny rozmiar kompleksów tworzonych przez polimery jest znacznie mniejszy niż kompleksów tworzonych przez protaminę.

Oznacza to, że stosowanie polimerów według wynalazku jest znacznie bezpieczniejsze niż protaminy, gdyż powstające kompleksy nie będą zatykać naczyń krwionośnych, zwłaszcza naczyń kapilarnych, oraz że będą łatwiej eliminowane z organizmu. Wyniki pomiarów rozmiaru kompleksów tworzonych przez polimery i protaminę z albuminą surowicy bydlęcej uzyskane techniką DLS przedstawia fig. 3.

Przykład 8

Neutralizacja heparyny UFH przez polimery in vivo

Badania wykonano na szczurach szczepu Wistar, u których indukowano zakrzepicę tętniczą. Badane związki podano szczurom 3 minuty po podaniu heparyny. Po 10 minutach od podania heparyny rozpoczęto stymulację prądem elektrycznym (1 mA) wyizolowanej tętnicy szyjnej wspólnej szczura, którą kontynuowano przez 10 min. Po 45 minutach od zakończenia stymulacji prądem z serca pobrano krew do dalszych badań, wycięto 1 cm fragment uszkodzonej tętnicy szyjnej i wyjęto z niego uformowany zakrzep, który po 24 h suszeniu w temperaturze pokojowej, w grupie kontrolnej (grupa zwierząt, która otrzymała roztwór PBS) ważył 0,9 mg. Heparyna niefrakcjonowana podana w dawce 300 lU/kg spowodowała spadek masy zakrzepu o 41%. Wszystkie z badanych polimerów zniosły działanie przeciwzakrzepowe heparyny, podobnie do protaminy. Ich działanie wyrażone przywróceniem masy zakrzepu oraz czasu krwawienia do wartości kontrolnej przedstawia fig. 4 i fig. 5. Pobraną od zwierząt krew odwirowano, a osocze ubogopłytkowe posłużyło dalszej ocenie wpływu heparyny i badanych polimerów na parametry koagulogiczne. W grupie zwierząt leczonych heparyną czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) wydłużył się do wartości powyżej 300 sekund, a aktywność Anty-Xa wzrosła 7-krotnie. Oba parametry zostały całkowicie przywrócone do wartości kontrolnych po podaniu polimerów (fig. 6 i fig. 7, odpowiednio), a działanie większości polimerów neutralizujące wpływ heparyny na aktywność Anty-fXa było silniejsze od aktywności protaminy i DEX40-GTMAC3. W przypadku aktywności anty-fXa działanie polimerów było silniejsze od działania protaminy.

Przykład 9

Wpływ badanych polimerów na parametry krwi u szczurów z indukowaną zakrzepicą tętniczą

Zbadano jak otrzymane polimery wpływają na parametry krwi 1 godzinę po ich podaniu z heparyną niefrakcjonowaną szczurom Wistar z indukowaną zakrzepicą tętniczą. W krwi zebranej z serca szczurów z eksperymentu opisanego w Przykładzie 8 oznaczono parametry morfologiczne krwi (fig. 8). W tym eksperymencie działanie najbardziej zbliżone do protaminy posiadał polimer PEG41-PMAPTAC53 (brak istotnych zmian badanych parametrów, z równoczesnym odwróceniem wzrostu stężenia WBC wywołanego podaniem heparyny niefrakcjonowanej).

PL 229 768 B1

P r z y k ł a d 10

Wpływ badanych polimerów na ciśnienie tętnicze krwi

Najczęściej występującym niepożądanym efektem stosowania protaminy jest obniżenie ciśnienia tętniczego krwi połączone ze spowolnieniem pracy serca. Jest to szczególnie groźne w przypadku wszystkich operacji przebiegających w znieczuleniu ogólnym, kiedy dochodzi do spadku ciśnienia krwi po podaniu wziewnego środka znieczulającego i główna uwaga anestezjologa skupia się na utrzymaniu parametrów życiowych na odpowiednim poziomie.

Przeprowadzono zatem eksperyment pozwalający dokonać oceny wpływu polimerów według wynalazku i protaminy na ciśnienie tętnicze krwi. Badania wykonano na znieczulonych ogólnie (pentobarbital 50 mg/kg i.p.) szczurach szczepu Wistar, u których mierzono ciśnienie krwi bezpośrednio w tętnicy szyjnej aparatem Hugo Sachs (Plugsys, Transonics System, USA). Badane związki podano szc żurom 3 minuty po podaniu heparyny i monitorowano ciśnienie przez 60 minut (fig. 9).

Na podstawie eksperymentu stwierdzono, że polimery PEG41-PMAPTAC53 i PMPC100-PMAPTAC93 są obojętne hemodynamicznie. A zatem w przypadku podania pacjentom polimerów według wynalazku ryzyko wystąpienia hipotensji będzie znacznie ograniczone lub wyeliminowane.

Powyższe przykłady wskazują, że wszystkie z badanych polimerów skutecznie neutralizują działanie heparyny niefrakcjonowanej.

Z uwagi na podobieństwo działania wszystkich polimerów według wynalazku jak również fakt, iż polimer PEG41-PMAPTAC53 wykazuje najkorzystniejszy stosunek skuteczności działania do toksyczności do dalszych badań wybrano polimer PEG41 -PMAPTAC53, jako reprezentatywny polimer ilustrujący właściwości całej grupy polimerów według wynalazku. Jednocześnie pozwoliło to zminimalizować liczbę zwierząt używanych do eksperymentów.

Poniższe przykłady pokazują, że polimery według wynalazku mogą zastąpić stosowanie protaminy u pacjentów wymagających neutralizacji działania heparyny, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej i heparyn drobnocząsteczkowych.

P r z y k ł a d 11

Kompleksowanie heparyny drobnocząsteczkowej (LMWH, Clexane) przez polimer PEG41-PMAPTAC53

Zbadano zależność stężenia wolnej (nieskompleksowanej) heparyny drobnocząsteczkowej (LMWH, Clexane) od stężenia polimeru blokowego PEG41-PMAPTAC53 stosując metodę spektrofotometryczną opartą na zastosowaniu Azuru A. Wyniki zależności stężenia LMWH (Clexane) od stosunku masy polimer PEG41-PMAPTAC53/LMWH przedstawiono na fig. 10.

Na podstawie powyższego wykresu obliczono, że 0,85 mg polimeru PEG41-PMAPTAC53 wiąże 1 mg heparyny LMWH.

P r z y k ł a d 12

Neutralizacja heparyny drobnocząsteczkowej (LMWH) przez PEG41-PMAPTAC53 in vitro

Przykład pokazuje neutralizację przez PEG41-PMAPTAC53 wzrostu aktywności anty-Xa wywołanego przez enoksaparynę w warunkach in vitro. Wyniki obrazujące neutralizację wzrostu aktywności anty-Xa wywołanego przez LMWH w wyniku inkubacji z różnymi stężeniami polimeru PEG41 -PMAPTAC53 na 96 dołkowej polistyrenowej płytce przedstawia fig. 11

Doświadczenie pokazało, że w warunkach in vitro PEG41-PMAPTAC53 neutralizuje działanie (wyrażone wzrostem aktywności anty-fXa) enoksaparyny. Równocześnie udało się wyznaczyć stosunek polimeru do enoksaparyny, co umożliwiło odpowiedni dobór dawki w badaniach in vivo. Przykład pokazuje przewagę wynalazku nad protaminą, która zarówno u pacjentów (http://www.biomed.com.pl/plik/4bac945be0f1b-ulotka_Siarczanprotaminy.pdf) jak i w podobnym badaniu u szczurów (Shenoi at al. Sci Transl Med., 2014) neutralizuje działanie enoksaparyny jedynie częściowo.

P r z y k ł a d 13

Neutralizacja heparyny drobnocząsteczkowej(LMWH) przez PEG41-PMAPTAC53 in vivo

Badania wykonano na szczurach szczepu Wistar. Badane związki podano szczurom 5 minut po podaniu heparyny w 5 minutowej infuzji. W czasach: 0, 5, 10, 15, 30 i 60 minut zmierzono czas krzepnięcia po aktywacji (ACT) aparatem Hemochron Junior w 2 kroplach krwi uzyskanych po ucięciu końcówki ogona.

Enoksaparyna podana dożylnie w dawce 3 mg/kg spowodowała około dwukrotne wydłużenie czasu ACT. Polimer PEG41-PMAPTAC53 5 minut po podaniu przywrócił wartość ACT do stanu wyjściowego, a jego efekt utrzymał się przez cały czas trwania eksperymentu (fig. 12).

PL 229 768 B1

Jak pokazują przykłady 12 i 13 polimer PEG41-PMAPTAC53 jest środkiem zdolnym do neutralizacji heparyn drobnocząsteczkowych w 100%. Dlatego też może pełnić rolę bezpiecznego i skutecznego antidotum na przeciwzakrzepowe działanie heparyn drobnocząsteczkowych. Tym samym wskazania do stosowania heparyn drobnocząsteczkowych mogą się poszerzyć o okoliczności, w których obecnie podaje się heparynę niefrakcjonowaną.

W trakcie prac nad wynalazkiem Twórcy zaobserwowali, że polimery według wynalazku, które łączą wysoką skuteczność neutralizacji heparyn z pełną biokompatybilnością mogą stać się doskonałą alternatywą dla innych metod neutralizacji heparyny, zwłaszcza stosowanej obecnie protaminy.

Wyniki badań przedstawione w kolejnych przykładach poświadczają obserwacje Twórców.

P r z y k ł a d 14

Ocena dystrybucji tkankowej PEG41-PMAPTAC53 u myszy

Idealne antidotum powinno działać szybko (umożliwiać natychmiastową pomoc), przebywać jedynie we krwi, gdzie powinno wiązać heparynę (brak cech kumulacji w narządach zdecydowanie zmniejsza ryzyko ich uszkodzenia), a następnie zarówno związane kompleksy jak i wolny polimer powinny być jak najszybciej wydalone z moczem (szybkie i krótkie działanie ułatwia znacznie kontrolowane zastosowanie antidotum i pozwala na podawanie mniejszych dawek w razie potrzeby oraz uniknięcie sytuacji, w której zostanie podana dawka długodziałająca bez możliwości reakcji na ewentualne niekorzystne efekty antidotum). Na podstawie budowy chemicznej polimeru spodziewaliśmy się, że jak każdy jonowy związek i do tego wielkocząsteczkowy, po podaniu dożylnym rozmieści się głównie we krwi. Ważna jest również wielkość kompleksów antidotum z heparyną oraz z białkami osocza. Jak wynika z pomiarów rozmiaru kompleksy PEG41-PMAPTAC53 są mniejsze niż kompleksy protaminy. Wydaje się więc, że w porównaniu z protaminą eliminacja polimeru powinna być łatwiejsza i powinien w mniejszym stopniu kumulować się w ważnych organach, takich jak wątroba, nerki czy płuca, co w efekcie wpłynie na zdecydowanie lepszy od protaminy profil bezpieczeństwa.

W celu sprawdzenia tej hipotezy przeprowadzono badania dystrybucji reprezentatywnego polimeru PEG41-PMAPTAC53 w tkankach po podaniu myszom. Polimer został połączony z sondą Alexa Fluor®750, a następnie podany dożylnie 30 myszom szczepu NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu. Oceny dystrybucji tkankowej dokonano w 0, 5, 30, 60 i 120 minucie po podaniu znakowanego polimeru (5 zwierząt na każdy punkt czasowy) z wykorzystaniem systemu In-vivo MS FX PRO (Carestream Health INC., USA). Intensywność fluorescencji porównano w stosunku do grupy, która otrzymała rozpuszczalnik. Badany polimer jest szybko wydalany z moczem, na co wskazuje wzrost, a później spadek fluorescencji w okolicy, gdzie znajduje się pęcherz moczowy w trakcie trwania eksperymentu (fig. 13 i fig. 14). W przeciwieństwie do tego fluorescencja protaminy w okolicach pęcherza jest niewielka. Śladową obecność PEG41-PMAPTAC53 można stwierdzić jedynie w najlepiej ukrwionych narządach (wątroba i nerki), chociaż fluorescencja w tych narządach w porównaniu do wyników uzyskiwanych dla protaminy jest dużo słabsza, (fig. 15).

Przykład ten pokazuje, że polimery według wynalazku działają szybko i krótko, a co więcej, nie wykazują tendencji do kumulowania się w narządach wewnętrznych po podaniu. Z kolei protamina kumuluje się w tkance wątrobowej, stąd nie można wykluczyć jej negatywnego wpływu, a w przypadku wielokrotnego podania trwałych zmian w narządach, w szczególności tych najlepiej ukrwionych. W porównaniu z protaminą wyraźnie lepsza biodostępność polimerów według wynalazku poprawi bezpieczeństwo terapii neutralizacyjnej (działania antyheparynowego) oraz zmniejszy ryzyko ewentualnych powikłań.

Wyniki obrazowania fluorescencji wątroby i nerek pobranych od myszy doświadczalnych otrzymujących preparat PEG41-PMAPTAC53 w kolejnych punktach czasowych doświadczenia (narząd zlokalizowany w dolnym lewym rogu fotografii jest obrazem fluorescencyjnym narządu zwierzęcia, któremu nie podano znakowanego sondą preparatu) przedstawia fig. 16.

Wyniki obrazowania fluorescencji wątroby i nerek pobranych od myszy doświadczalnych otrzymujących siarczan protaminy w kolejnych punktach czasowych doświadczenia (narząd zlokalizowany w dolnym lewym rogu fotografii jest obrazem fluorescencyjnym narządu zwierzęcia, któremu nie podano znakowanego sondą preparatu) przedstawia fig. 17.

Wyniki obrazowania po podaniu znakowanej rodaminą protaminy przedstawione na fig. 15 i fig. 16 wskazują wyraźną kumulację tego związku w większej liczbie narządów. Efektem mogą być zmiany w tkance wątrobowej ujawnione w badaniu histopatologicznym.

Intensywność sygnału fluorescencyjnego sondy związanej z siarczanem protaminy znakowanym rodaminą obserwowana w izolowanych narządach przedstawiono na fig. 18.

PL 229 768 B1

P r z y k ł a d 15

Krótkotrwała ocena toksyczności krążeniowej i oddechowej polimeru PEG41-PMAPTAC53 u szczurów

Zbadano wpływ polimeru PEG41-PMAPTAC53 na kluczowe parametry życiowe organizmu szczura 1 godzinę po jego dożylnym podaniu łącznie z heparyną UFH. Przez 1 godzinę od podania heparyny UFH i polimeru monitorowano krążeniowe i oddechowe parametry, takie jak: ciśnienie tętnicze krwi, częstość pracy serca, perfuzja tkanek obwodowych, częstość oddechów, nasycenie krwi tlenem, maksymalna zwartość CO2 w wydychanym powietrzu oraz temperatura szczura. Podany w jednorazowej dożylnej dawce 3-krotnie przekraczającej dawkę skuteczną (5,85 mg/kg) PEG41-PMAPTAC53 spowodował 20% spadek ciśnienia krwi i równoczesny wzrost perfuzji tkankowej, który utrzymywał się przez 15 minut od jego podania, po czym wartości wróciły do stanu wyjściowego (fig. 19 ). Podobny efekt wywołała podana w trzykrotnie większej dawce protamina. Pozostałe parametry nie zmieniły się istotnie przez cały czas trwania eksperymentu. Zamiana jednorazowego podania PEG41-PMAPTAC53 na 5 minutową infuzję nie spowodowała zmian we wszystkich badanych parametrach po podaniu polimeru.

Zgodnie ze szczegółową charakterystyką produktu leczniczego (http://www.biomed.com.pl/plik/4bac945be0f1b-ulotka_Siarczanprotaminy.pdf) po podaniu siarczanu protaminy mogą wystąpić objawy niepożądane, głównie ze strony układu sercowo-naczyniowego. Najczęściej występuje obniżenie się ciśnienia tętniczego krwi ze spowolnieniem pracy serca. Mechanizm tych reakcji może być związany z obecnością w cząsteczce protaminy aminokwasu L-argininy, który jest endogennym prekursorem i substratem syntezy NO, jednej z najsilniej naczyniorozkurczowo działających cząsteczek. Ponadto po zastosowaniu siarczanu protaminy może dojść do zaburzeń oddychania, duszności oraz skurczu oskrzeli.

Postanowiliśmy zatem ocenić wpływ reprezentatywnego polimeru PEG41-PMAPTAC53, który nie zwiera w swojej cząsteczce L-argininy, na kluczowe parametry krążeniowe i oddechowe. Polimer PEG41-PMAPTAC53 podany w formie infuzji w dawce 3-krotnie przekraczającej dawkę skuteczną (5,85 mg/kg) nie zmienił żadnego z parametrów krążeniowo-oddechowych. A zatem w przypadku polimerów według wynalazku wyeliminowano lub znacznie obniżono ryzyko wywołania charakterystycznych dla protaminy zaburzeń krążeniowo-oddechowych.

P r z y k ł a d 16

Ocena wpływu badanego polimeru PEG41-PMAPTAC53 na krew w warunkach in vitro

Zbadano wpływ polimeru PEG41-PMAPTAC53 w warunkach in vitro na parametry morfologiczne krwi (WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT) 30 minut po inkubacji od dodania do krwi polimeru PEG41-PMAPTAC53 w stężeniach 1, 10, 100 μg/ml. Nie zaobserwowano istotnych klinicznie zmian (fig. 20).

P r z y k ł a d 17

Ocena wpływu badanego polimeru PEG41-PMAPTAC53 na parametry morfologiczne krwi w warunkach in vivo

Obdarzone ładunkiem związki wielkocząsteczkowe mogą wywoływać hemolizę. W celu określenia bezpieczeństwa stosowania polimerów według wynalazku przeprowadzono eksperyment polegający na obserwacji parametrów morfologicznych krwi po podaniu reprezentatywnego polimeru PEG41-PMAPTAC53 i niefrakcjonowanej heparyny (fig. 21). Polimer wymieszano z krwią w kontakcie z krwią w warunkach in vivo, zmierzono parametry morfologiczne krwi szczura w 7, 14 i 28 dniu po podaniu.

Badanie nie wykazało istotnych statystycznie odchyleń od norm parametrów morfologicznych krwi. A zatem polimery nie wykazują toksycznego działania na krew.

P r z y k ł a d 18

Krótkotrwała i długotrwała biochemiczna ocena toksyczności narządowej polimeru PEG41-PMAPTAC53 u szczurów

W celu określenia bezpieczeństwa stosowania polimerów według wynalazku przeprowadzono eksperyment polegający na ocenie wpływu reprezentatywnego polimeru PEG41-PMAPTAC53 oraz protaminy na funkcje najważniejszych organów wewnętrznych szczura przez okres 28 dni od jego podania. Ocena toksyczności obejmowała cotygodniowy pomiar stężenia w surowicy klasycznych markerów uszkodzeń narządowych u szczura w ciągu 28 dni od podania związku. Zarówno polimer jak i protamina nie zmieniły stężenia ocenianych parametrów biochemicznych w surowicy szczura takich jak: ASPAT, ALAT, kreatynina, amylaza, fosfataza alkaliczna, kinaza kreatynowa do 28 dni od podania (fig. 22). Wskazuje to na neutralność działania polimerów według wynalazku na funkcje organów wewnętrznych takich jak wątroba, nerki, trzustka, kości i mięśnie.

PL 229 768 B1

P r z y k ł a d 19

Krótkotrwała i długotrwała histopatologiczna ocena toksyczności narządowej polimeru PEG41-PMAPTAC53 u szczurów

Poza wizualizacją kumulacji narządowej przed dopuszczeniem każdego nowego leku do badań klinicznych należy wykonać badania toksyczności przewlekłej. W związku z charakterem podawania odtrutki (jednorazowe podanie dożylne) wydaje się, że schematem najbardziej zbliżonym do warunków klinicznych jest jednorazowe podanie dożylne i monitorowanie stanu zwierząt od 1 godziny do 28 dni od podania. Zgodnie z zaleceniami urzędów rejestracyjnych niezbędna jest ocena toksyczności poprzez pomiar podstawowej morfologii krwi oraz niezbędnych parametrów biochemicznych odzwierciedlających potencjalne zaburzenia funkcjonowania narządów wewnętrznych. Ważna jest również ocena makro- i mikroskopowa narządów wewnętrznych. Badania te mają na celu wykazanie punktów prawdopodobnej toksyczności związków w badaniach klinicznych. Wiadomo, że w przypadku podawania pacjentom protaminy, na skutek tworzenia się kompleksów protamina/heparyna we krwi, może dojść do zmian zakrzepowych, a także pobudzenia układu dopełniacza i skurczu oskrzeli. Wykazano, iż protamina może wywołać ciężki skurcz oskrzeli, co jest wynikiem wydzielania substancji bronchoaktywnych, np. histaminy. Nadciśnienie płucne spowodowane wytworzeniem się kompleksów protamina/heparyna wynika z powstałego obrzęku i związanych z tym zaburzeń perfuzyjno-wentylacyjnych, hipoksemii, aktywacji leukocytów, akumulacji płytek krwi i aktywacji układu dopełniacza.

Zbadano wpływ polimerów według wynalazku na funkcje najważniejszych organów wewnętrznych szczura, stosując w eksperymentach reprezentatywny polimer PEG41-PMAPTAC53. Płuca i wątroba były pobierane od szczurów szczepu Wistar godzinę oraz 28 dni po podaniu heparyny niefrakcjonowanej, a następnie protaminy bądź polimeru PEG41-PMAPTAC53. W grupie zwierząt otrzymujących heparynę łącznie z protaminą doszło do silnego przekrwienia płuc natomiast w wątrobie wystąpiły zmiany martwicze (fig. 23). Po 28 dniach przekrwienie płuc było nieznaczne, jednak zmiany w wątrobie utrzymywały się. W grupie szczurów otrzymujących heparynę niefrakcjonowaną i polimer PEG41 -PMAPTAC53 w płucach doszło do niewielkich przekrwień natomiast w wątrobie hepatocyty wykazywały zwiększoną kwasochłonność, drobne zmiany wodniczkowe, a miejscowo więcej jąder komórek Browicza-Kuppfera, obecne były elementy morfotyczne. Zmiany te zanikły po 28 dniach.

Histopatologiczne badanie porównawcze nie wykazało istotnie większej toksyczności narządowej polimeru PEG41-PMAPTAC53 w porównaniu do protaminy. Szybka eliminacja PEG41-PMAPTAC53 przez nerki i jednoczesne przemijające zmiany w cytoplazmie hepatocytów przemawiają za niższą nefro- i hepatotoksycznością polimerów według wynalazku. Zmiany w naczyniach płucnych po podaniu polimeru według wynalazku wynikają w głównej mierze z tworzenia się we krwi kompleksów polimer/heparyna o dużych rozmiarach. Ponieważ jednak kompleksy polimer/heparyna są mniejsze niż kompleksy protamina/heparyna, dlatego nasilenie potencjalnych zmian wywoływanych przez polimery według wynalazku będzie mniejsze od tych obserwowanych po protaminie.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie polimeru blokowego zawierającego blok polichlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do wytwarzania leku do bezpośredniej neutralizacji heparyn w krwi i płynach ustrojowych, zwłaszcza heparyny niefrakcjonowanej i heparyny drobnocząsteczkowej.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PEG-PMAPTAC, szczególnie korzystnie kopolimer PEG41 PMAPTAC53 lub PEG41-PMAPTAC21.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że jako polimer blokowy zawierający blok PMAPTAC stosuje się kopolimer PMPC-PMAPTAC, szczególnie korzystnie kopolimer PMPC20-PMAPTAC44 lub PMPC100-PMAPTAC93.
4. Zastosowanie według któregokolwiek z wcześniejszych zastrzeżeń, znamienne tym, że stosuje się polimery blokowe zawierające blok PMAPTAC otrzymane metodą polimeryzacji kontrolowanej CRP.