PL233839B1 - Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR - Google Patents
Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233839B1 PL233839B1 PL410979A PL41097915A PL233839B1 PL 233839 B1 PL233839 B1 PL 233839B1 PL 410979 A PL410979 A PL 410979A PL 41097915 A PL41097915 A PL 41097915A PL 233839 B1 PL233839 B1 PL 233839B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nematodes
- species
- identification
- time pcr
- helicotylenchus
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 3
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 37
- 241001148506 Bitylenchus dubius Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000399940 Anguina tritici Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000567357 Helicotylenchus varicaudatus Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 21
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 12
- HUMHYXGDUOGHTG-HEZXSMHISA-N alpha-D-GalpNAc-(1->3)-[alpha-L-Fucp-(1->2)]-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)OC1O HUMHYXGDUOGHTG-HEZXSMHISA-N 0.000 claims description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 7
- 241001148481 Helicotylenchus Species 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 abstract description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000399949 Ditylenchus dipsaci Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000196509 Anguinidae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241001540512 Hoplolaimidae Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000380131 Ammophila arenaria Species 0.000 description 1
- 241000380490 Anguina Species 0.000 description 1
- 241000418438 Bitylenchus bryobius Species 0.000 description 1
- 241001553344 Bitylenchus parvus Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000399934 Ditylenchus Species 0.000 description 1
- 241000399948 Ditylenchus destructor Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- -1 Hae III Proteins 0.000 description 1
- 241001148488 Helicotylenchus pseudorobustus Species 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001540506 Telotylenchidae Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ujawniono sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników zbóż i traw, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Anguina tritici, Bitylenchus dubius i Helicotylenchus varicaudatus. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników zbóż i traw, metodą Real Time PCR, i w szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Anguina tritici z rodziny Anguinidae, Bitylenchus dubius z rodziny Telotylenchidae, Helicotylenchus varicaudatus z rodziny Hoplolaimidae.
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragm entu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy, lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów.
Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism). Metoda polimorfizmu długości fragmentów restryk cyjnych wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Powers T.O., Szalanski A.L., Mullin P.G., Harris T.S., Bertoldi T. i Griesbach J.A. Identification of Seed Gall Nematodes of Agronomic and Regulatory Concern with PCR-RFLP of ITS11. Journal of Nematology 33(4): 191-194. 2001 analizowali tą metodą 18 populacji należących do rodzaju Anguina. Do identyfikacji stosowali siedem enzymów restrykcyjnych Alu I, Bsr I, Eco RI, Hae III, Hha I, Hinf I i Taq I, dzięki którym udało im się identyfikować gatunki.
Cbjvh Umarao, Sharma Amita, Rao S.B. w swojej publikacji z 2009 roku RAPD-PCR Analysis of Genetic Similarity Between Males and Females of Anguina tritici. Indian Journal of Nematology, 2009
PL 233 839 Β1
39(1): 90-97 zastosowali metodę RAPD - Randomly Amplified Polymorphic DNA (metoda losowej amplifikacji polimorficznego DNA). Metoda ta wykorzystuje tylko jeden krótki (około 10-20 nukleotydów) starter, przebiega w niższej temperaturze (około 35°C), ale jednocześnie wymaga zwiększonej ilości cykli w stosunku do standardowego PCR - aż 40-50. W wyniku analizy elektroforetycznej uzyskuje się różnej długości prążki, których układ jest charakterystyczny dla osobnika i stanowi coś w rodzaju odcisku palca (fingerprint).
W pracach Wendt K.R., Vrain T.C. & Webster J.M. (1993). Separation of three species of Ditylenchus and some host races of D. dipsaci by restriction fragment length polymorphism. Journal of Nematology 25, 555-563 oraz Marek M., Zouhar M., Rysanek P. & Havranek P. (2005). Analysis of ITS sequences of nuclear rDNA and development of a PCR-based assay for the rapid identification of the stem nematode Ditylenchus dipsaci (Nematoda: Anguinidae) in plant tissues. Helminthologia 42, 49-56 zostały opisane startery i enzymy restrykcyjne do identyfkacji Ditylenchus dipsaci.
Startery do identyfikacji /7. varicaudatus opisała Schrek-Reis w 2010 roku Schreck Reis C., Vieira Dos Santos M.C., Marais M., Santos M.S., Duyts H., Freitas H., Van Der Putten W., Abrantes I.M. 2010. First record of Helicotylenchus varicaudatus Yuen, 1964 (Nematoda: Hoplolaimidae) parasitizing Ammophila arenaria (L.) in Portuguese coastal sand dunes. Phytopathol. Mediterr. 49: 212-226. Identyfikacja B. dubius wciąż opiera się na cechach morfologicznych.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi, natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywanie nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Anguina tritici, Bitylenchus dubius, Helicotylenchus varicaudatus, obejmujący następujące etapy:
1) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
2) wypłukanie nicieni z gleby;
3) izolację DNA;
4) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
5) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków nicieni w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
5’ starter 3* starter Sonda
Gatunek
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwenqa | Nazwa | Sekwencja | |
| Anguina tritici | Atrifv | tgctgtgtttgaatgttag | Atrirv | gtcggatagatgaccaac | Atri | aatccgcaccagcaacctac |
| Bitylenchus dubius | Bdufv | actggatggtaaggcatg | Bdurv | cagcttttacaccgagga | Bdu | caagaccgaactagccactgg |
| Helicotylenchus varicaudatus | Hvafv | tgctgaccgagataatgg | Hvarv | gccaaatgctttagctgta | Hva | ttacctctcacgcagcaatacg |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Anguina tritici, Bitylenchus dubius, Helicotylenchus varicaudatus, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
PL 233 839 Β1
5’ starter 3’ starter Sonda
Gatunek
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwenqa | Nazwa | Sekwencja | |
| Anguina tritici | Atrifv | tgctgtgtttgaatgttag | Atrirv | gtcggatagatgaccaac | Atri | aatccgcaccagcaacctac |
| Bitylenchus dubius | Bdufv | actggatggtaaggcatg | Bdurv | cagcttttacaccgagga | Bdu | caagaccgaactagccactgg |
| Helicotylenchus varicaudatus | Hvafv | tgctgaccgagataatgg | Hvarv | gccaaatgctttagctgta | Hva | ttacctctcacgcagcaatacg |
| Mieszanina | reakcyjna | zawiera bufor, | termostabilną Taq polimerazę, jony | magnezu, startery |
i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Atrifv (SEKW NR ID: 1), Atrirv (SEKW NR ID: 2), Atri (SEKW NR ID: 3), Bdufv (SEKW NR ID: 4), Bdurv (SEKW NR ID: 5), Bdu (SEKW NR ID: 6), Hvafv (SEKW NR ID: 7), Hvarv (SEKW NR ID: 8), Hva (SEKW NR ID: 9).
Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Anguina tritici.
Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Bitylenchus dubius.
Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Helicotylenchus varicaudatus.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Anguina tritici
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Atrifv | tgctgtgtttgaatgttag |
| Atrirv | gtcggatagatgaccaac |
| Atri | aatccgcaccagcaacctac |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Atrifv i Atrirv,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Atri znakowanej na końcu 5' barwnikiem JOE, a 3'-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
PL 233 839 Β1
| Etap | Temperatura [CC] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pre-inkubacja | 95 | 180 | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | ||
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci (2 μΙ DNA).
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 1
Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Bitylenchus dubius
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Bdufv | actggatggtaaggcatg |
| Bdurv | cagcttttacaccgagga |
| Bdu | caagaccgaactagccactgg |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Bitylenchus bryobius, Bitylenchus parvus.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 2.
Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Helicotylenchus yaricaudatus
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hvafv | tgctgaccgagataatgg |
| Hvarv | gccaaatgctttagctgta |
| Hva | ttacctctcacgcagcaatacg |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Helicotylenchus exallus, Helicotylenchus pseudorobustus, Helicotylenchus yulgaris. Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 3.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Anguina tritici, Bitylenchus dubius oraz Helicotylenchus vańcaudatus w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Anguina tritici, Bitylenchus dubius oraz Helicotylenchus varicaudatus metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
S’ starter 3' starter Sonda
Gatunek
PL 233 839 Β1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410979A PL233839B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410979A PL233839B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410979A1 PL410979A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL233839B1 true PL233839B1 (pl) | 2019-11-29 |
Family
ID=56370098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410979A PL233839B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233839B1 (pl) |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410979A patent/PL233839B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410979A1 (pl) | 2016-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12378602B2 (en) | Methods and kits for determining the efficiency of plasma separation from whole blood | |
| KR102128651B1 (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| PL233839B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| KR102654269B1 (ko) | 노제마병, 석고병 및 백묵병의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법 | |
| PL233894B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius microdorus, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| PL233885B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius brevidens, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| Jyothy et al. | REAL-TIME PCR OR QUANTITATIVE PCR (QPCR)–A REVOLUTION IN MODERN SCIENCE | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| US20150292039A1 (en) | Method to amplify nucleic acids of fungi to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232392B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus fraudulentus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231511B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus tiliae, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231509B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus tritici, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| KR101998204B1 (ko) | 전립선암 진단을 위한 디지털 pcr용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| PL232391B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus hofmanni, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233891B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232393B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paratrichodorus pachydermus, szkodnika roślin, metodą Real Time PCR | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 |