PL230915B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR - Google Patents

Abstract

Ujawniono zarówno sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Ditylenchus destructor, Naccobus aberrans, Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR. W szczególności, wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Ditylenchus destructor z rodziny Anguinidae, Naccobus aberrans z rodziny Pratylenchidae oraz Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis i Trichodorus viruliferus z rodziny Trichodoridae.

Według najnowszej klasyfikacji rodzinę Anguinidae reprezentują w Polsce 34 gatunki, Heteroderidae - 17 gatunków, Meloidogynidae - 5 gatunków, Pratylenchidae - 5 gatunków, a w rodzinie Trichodoridae wykazano 11 gatunków. Wiele spośród nich to szkodniki roślin uprawnych. Porażone rośliny mają uszkodzony system korzeniowy, a zmniejszony pobór wody prowadzi do ich zamierania. Wymienione powyżej gatunki nicieni uznawane są za pasożyty lub potencjalne pasożyty roślin okopowych. Część naziemna zainfekowanej rośliny żółknie, a bulwy są mniejsze, pokryte brunatnym i plamami, co obniża ich wartość handlową. Nacobbus aberrans znajduje się na liście kwarantannowej European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO.

Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznyc h, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.

Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.

Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real-Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. I dentyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real -Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również, gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real -Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.

Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism). Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

PL 230 915 B1 wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Amiri S., Subbotin S. A. i Moens M., Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR, European Journal of Plant Pathology (2002), 108: 497-506 analizowali tą metodą łącznie prawie 60 populacji tworzących cysty nicieni. Subbotin S. A., Waeyenberge Li i Moens M. użyli w swojej publikacji Identification of cyst forming nematodes of the genus Heterodera (Nematoda: Heteroderidae) based on the ribosomal DNA-RFLP, Nematology (2000), 2 (2): 153-164 aż 26 różnych enzymów restrykcyjnych: AluI, AvaI, BamHI, BglI, BsiZI, BsuRI, Bshl236I, Bspl43I, CfoI, Ddel, EcoRI, Hpall, Hindlll, Hinfl, KpnI, MvaI, Pstl, PvuII, Psal, Sali, SfuI, SspI, ScrFI, TaqI, Tru9I i XbaI, dzięki czemu wyodrębnili 27 różnych gatunków i typów nicieni w próbie. Ponadto, badania populacji nicieni z wykorzystaniem PCR-RFLP prowadzili Garcia D., Garcia G., Montero Z., Salazar L., Brenes A. i Gómez-Alpizar L. w pracy Morphological and molecular identification of potato cyst-forming nematode Globodera pallida in soil samples from Costa Rica, Revista Latinoamericana de la Papa (2009), 15 (1): 38-45. Subbotin S. A., Halford P. D. i Perry Roland N. w swojej publikacji z 1999 roku Identification of populations of potato cyst nematodes from Russia using protein electrophoresis, rDNA-RFLPs and RAPDs, Russian Journal of Nematology (1999), 7 (1): 57-63 dodatkowo zastosowali metodę RAPD - Randomly Amplified Polymorphic DNA (metoda losowej amplifikacji polimorficznego DNA). Metoda ta wykorzystuje tylko jeden krótki (około 10-20 nukleotydów) starter, przebiega w niższej temperaturze (około 35°C), ale jednocześnie wymaga zwiększonej ilości cykli w stosunku do standardowego PCR - aż 40-50. W wyniku analizy elektroforetycznej uzyskuje się różnej długości prążki, których układ jest charakterystyczny dla osobnika i stanowi coś w rodzaju odcisku palca (fingerprint). Metodę PCR-RAPD zastosowali również Adam M. A. M., Phillips M. S. i Blok V. C. w pracy opisującej molekularne metody identyfikacji guzaków - Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode (Meloidogyne spp.), Plant Pathology (2007), 56: 190-197.

W literaturze znana jest metoda identyfikacji z gleby nicieni szkodliwych dla roślin okopowych na podstawie reakcji multiplex PCR - Pylypenko L. A., Uehara T., Phillips M. S., Sigareva D. D., Blok V. C. Identification of Globodera rostochiensis and G. pallida in the Ukraine by PCR, European Journal of Plant Pathology (2005), 111: 39-46. Startery: PITSr3 5'-AGC GCA GAC ATG CCG CAA-3', PITSp4 5'-ACA ACA GCA ATC GTC GAG-3' oraz 5'-CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3' umożliwiły rozróżnienie Globodera rostochiensis i G. pallida. W innej pracy, Amiri S., Subbotin S. A. i Moens M. An efficient method for identification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR with specific primers, Nematol. medit. (2001), 29: 241-246, z pomocą mieszaniny dwóch uniwersalnych starterów: D3A 5'-GAC CCG TCT TGA AAC ACG GA-3' i D3B 5'-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3' oraz dwóch starterów specyficznych: TW81 5'-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3' i SGR1 5'-GTA CAT GAT CCC ACG AAG C-3' dokonali identyfikacji mątwików na podstawie regionu 28S genu.

Najnowsze podejście do molekularnych metod identyfikacji nicieni polega na zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym. Madani M., Subbotin S. A. i Moens M. w Quantitative detection of the potato cyst nematode, Globodera pallida, and the beet cyst nematode, Heterodera schachtii, using Real-Time PCR with SYBR green I dye, Molecular and Cellular Probes (2005), 19: 81-86 wykorzystali do szybkiej identyfikacji gatunku specyficzne startery i barwnik fluorescencyjny SYBR Green I. Wykorzystali oni mieszankę starterów opisanych we wcześniejszych publikacjach - 0,1 pM każdego ze starterów: SH6Mod 5'-CGT GTT CTT ACG TTA CTT CAA-3', SH4 5'-AGC ATG CGA AGG ATT GG-3', PITSp4 5'-ACA ACA GCA ATC GTC GAG-3' oraz Pal3 5'-ATG TTT GGG CTG GCA C-3', 12 pl barwnika i 4 pl DNA próbki w łącznej objętości końcowej 25 pl.

Alternatywą dla barwnika fluorescencyjnego jest sonda TaqMan zastosowana z powodzeniem do identyfikacji Globodera rostochiensis i Globodera artemisiae - Nowaczyk K., Dobosz R., Kornobis S., Obrepalska-Steplowska A., TaqMan REAL-Time PCR-based approach for differentiation between Globodera rostochiensis (golden nematode) and Globodera artemisiae species, Parasitol Res (2008), 103: 577-581. Metodę klasycznego PCR, sekwencje starterów oraz warunki reakcji umożliwiające wykrycie Ditylenchus destructor opisano w publikacjach: Subbotin S.A., Madani M., Krall E., Sturhan D., Moens M. 2005. Molecular diagnosis, taxonomy, and phylogeny of the stem nematode Ditylenchus dipsaci species complex based on the sequences of the internal transcribed spacer-rDNA. Phytopathology 95, 1308-1315; Marek M., Zouhar M., Rysanek P., Havranek P. 2005. Analysis of ITS sequences of nuclear rDNA and development of a PCR-based assay for the rapid identification of the stem nematode Ditylenchus dipsaci (Nematoda: Anguinidae) in plant tissues. Helminthologia 42, 49-56 oraz

PL 230 915 Β1

Kerkoud M., Esquibet M., Plantard O., ΑνπΙΙοη M., Guimier C., Franek M. et al. 2007. Identification of Ditylenchus species associated with Fabaceae seeds based on a specific polymerase Chain reaction of ribosomal DNA-ITS regions. European Journal of Plant Pathology 118, 323-332.

Startery oraz enzymy restrykcyjne do identyfikacji 23 gatunków nicieni metodą PCR-RFLP należących do rodzajów Nanidorus, Paratrichodorus i Trichodorus, między innymi i do identyfikacji gatunków Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus opisali Kumaria S. i Subbotin S.A. w publikacji Molecular characterization and diagnostics of stubby root and virus vector nematodes of the family Trichodoridae (Nematoda: Triplonchida) using ribosomal RNA genes. 2012. Plant Pathology. Doi: 10.1111/j. 1365-3059.2012.02598.x natomiast Maafi T.Z., Subbotin S., i Moens M. opisali startery i warunki reakcji PCR do identyfikacji Naccobus aberrans w publikacji Molecular Identification of cyst nematodes (Heteroderidae) from Iran and the phylogeny based on ITS1-rDNA sequences. 2003. Nematology 5:99-111.

W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nieidentyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Ditylenchus destructor, Naccobus aberrans, Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus, obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza,

Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:

Gatunek	5’ starter	3’ starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Dityienchits destrucłor	Ddefv	gtgacattcttcRgrgta	Dderv	aagcctttactttcatlgc	Dde	ccaatgactcgcacactcgtta
Nacobbtts aberrans	Nabfv	caacca&atacaciguc	Nabrv	caggtcgaaattcaaatatg	Nab	ctatccaacgcattcaacaacaacat
Pa ra f rieb od ort ts tere s	Ριυπ'ν	gactgtagtcttcggarttg	Pterrv	cagagattcaatcgaccaa	Pter	eCEtstcctgltaccgagttg
Trichodorus primitivits	Tprimfv	cccttgaactaggactgg	Tpriinrv	tcagccaaaagauagcac	Tprim	ccagtggaacgcatcatsacc
Trichodorus similis	Tsitnfv	gactgtaggtutcggac	Tsimrv	gacaccatagaccttcag	Tsim	acttaccgt ełcctgtcc e a
Trichodorus virulifenis	Tvirfv	ccgtgctttcatttagtc	Tvirrv	gacaccatagaccttcag	Tvir	ccactcattaaccgtacagccaa

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Ditylenchus destructor, Naccobus aberrans, Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:

Gatunek	5' starter	3' starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Ditylenchus destructor	Ddefv	gigacattctTcggrgta	Dderv	aagcctttactttcattgc	Dde	ccaatgactcgcacactcgtta
Nacf/bbiłs aberrans	Nabfv	caaccagatacactgttc	Nabrv	caggtcgaaattcaaatatg	Nab	ctatccaacgcattcaacaacaacat
Paratrichodorus teres	Ptcrfv	gaetgtagtcttcggatttg	Ptcrrv	cagagattcaatcgaccaa	Pter	ccgtgtcetgttaccga gttg
Trichodorus primilivus	Tprimfv	cccttgaactaggactgg	Tprimrv	tcagccaaaagaaagcae	Tprim	ccaglg&aacgcatcatgacc
Trichodorus similis	Tsimfv	gactgtaggtttlcggac	Tsimrv	gacaccatagaccttcag	Tsim	acttaccatgtcctgtccga
Trichodorus viruiifems	Tvirfv	ccgtgctttcatttagtc	Tvirrv	gacaccatagaccttcag	Tvir	ccactcattaaccgtacagccaa

PL 230 915 Β1

Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.

Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Ddefv (SEKW NR ID: 1), Dderv (SEKW NR ID: 2), Dde (SEKW NR ID: 3), Nabfv (SEKW NR ID: 4), Nabrv (SEKW NR ID: 5), Nab (SEKW NR ID: 6), Pterfv (SEKW NR ID: 7), Pterrv (SEKW NR ID: 8), Pter (SEKW NR ID: 9) Tprimfv (SEKW NR ID: 10), Tprimrv (SEKW NR ID: 11), Tprim (SEKW NR ID: 12), Tsimfv (SEKW NR ID: 13), Tsimrv (SEKW NR ID: 14), Tsim (SEKW NR ID: 15), Tvirfv (SEKW NR ID: 16), Tvirrv (SEKW NR ID: 17), Tvir(SEKWNR ID: 18).

Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Ditylenchus destructor.

Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Naccobus aberrans.

Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paratrichodorus teres.

Fig. 4 przedstawia krzywe amplifikacji dla Trichodorus primitivus.

Fig. 5 przedstawia krzywe amplifikacji dla Trichodorus similis.

Fig. 6 przedstawia krzywe amplifikacji dla Trichodorus viruliferus.

Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.

Przykład 1

Identyfikacja nicieni z gatunku Ditylenchus destructor.

DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:

Starter/sonda	Sekwencja
Ddefv	gtgacattcttcggtgta
Dderv	aagcctttactttcattgc
Dde	ccaatgactcgcacactcgtta

Reakcję Real-Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:

- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,

- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Ddefv i Dderv,

- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Dde znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,

- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),

- 2 μΙ DNA.

Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:

Etap	Temperatura [°C]	Czas [s]	Pomiar fluorescencji
Pre-inkubacja	95	180
Amplifikacja	denaturacja	95	30	-
przyłączanie	55	30	pojedynczy
synteza	72	30	-
Chłodzenie	40	20	-

PL 230 915 Β1

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicienia Ditylenchus dipsaci.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1. Przykład 2

Identyfikacja nicieni z gatunku Naccobus aberrans.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Nabfv	caaccagatacactgttc
Nabrv	caggtcgaaattcaaatatg
Nab	clalccaacgcattcaacaacaacat

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Rotylenchus buxophilus, Rotylenchus capitatus oraz Rotylenchus uniformis.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 2. Przykład 3

Identyfikacja nicieni z gatunku Paratrichodorus teres.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Pterfv	gactgtagtcttcggaltlg
Pterrv	cagagattcaatcgaccaa
Pter	ccgtgtcctgttaccgagttg

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Paratrichodorus pachydermus, Trichodorus primitivus oraz Trichodorus sparsus.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 3. Przykład 4

Identyfikacja nicieni z gatunku Trichodorus primitiyus.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Tprimfv	ccctlgaactaggaetgg
Tprimrv	tcagccaaaagaaagcac
Tprim	ccagtggaacgcatcatgacc

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Trichodorus sparsus oraz Trichodorus viruliferus. Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 4. Przykład 5

Identyfikacja nicieni z gatunku Trichodorus similis.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Tsimfv	gactgtaggtttlcggac
Tsimrv	gacaccatagaccttcag
Tsim	acttaccgtgtcctgtccga

PL 230 915 Β1

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera schachtii, Paratrichodorus teres, oraz Trichodorus viruliferus.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 5. Przykład 6

Identyfikacja nicieni z gatunku Trichodorus yiruliferus.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Tvirfv	ccgtgctttcatttagtc
Tvirrv	gacaccatagaccttcag
Tvir	ccactcattaaccgtacagccaa

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Trichodorus primitivus oraz Trichodorus sparsus.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 6.

Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real-Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real-Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Ditylenchus destructor, Naccobus aberrans, Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus, w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:

Gatunek 5 ’ starter 3’ starter Sonda Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Ditylenchus destructor Ddefv gtgacattcttcggtgta Dderv aagcctttactttcattgc Dde ccaatgactcgcacactcgtta Nacobbus aberrans Nabfv caaccagatacactgttc Nabrv caggtcgaaattcaaatatg Nab ctatccaacgcattcaacaacaacat Paratrichodorus teres Pterl\ gactgtagtcttcggatttg Pterrv cagagattcaatcgaccaa Pter ccgtgtcctgttaccgagttg Trichodorus primitwus Tprimfv cccttgaactaggactgg Tprimrv tcagccaaaagaaagcac Tprim ccagtggaacgcatcatgacc Trichodorus sfinifis Tsimfv gactgtaggttttcggac Tsimrv gacaccatagaccttcag Tsim acttaccgtgtcctgtccga Trichodorus viruliferus Tvirfv ccgtgctttcatttagtc Tvirrv gacaccatagaccttcag Tvir ccactcattaaccgtacagccaa

2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Ditylenchus destructor, Naccobus aberrans, Paratrichodorus teres, Trichodorus primitivus, Trichodorus similis, oraz Trichodorus viruliferus, metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:

Gatunek 5’ starter 3’ starter Sonda Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Ditylenchus destructor Ddeft' gtgacattcttcggtgta Dderv aagcctttactttcattgc Dde ccaatgactcgcacactcgtta Nacobbus aberrans Nabfv caaccagatacactgttc Nabrv caggtcgaaattcaaatatg Nab ctatccaacgcattcaacaacaacat Paratrichodorus teres Pterfy gactgtagtcttcggatttg Ptcrrv cagagattcaatcgaccaa Pter ccgtgtcctgtlaccgagltg Trichodorus primitwus Tprimfy cccttgaactaggactgg Tprimrv tcagccaaaagaaagcac Tprim ccagtggaacgcatcatgacc Trichodorus similis Tsimfy gactgtaggttttcggac Tsimrv gacaccatagaccttcag Tsim a c tt ac c g tgtc ctgtc ega Trichodorus viridiferus Tvirfv ccgtgctttcatttagtc Tvirrv gacaccatagaccttcag Tvir ccactcattaaccgtacagccaa