PL235964B1 - Sposób wytwarzania 4’-hydroksyflawonu - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy sposobu wytwarzania 4'-hydroksyflawonu o wzorze 2. Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1, następuje O-demetylacja. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4'-hydroksyflawonu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do otrzymywania produktu będącego prekursorem leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych.

Flawony są syntetyzowane przez rośliny, wykazują istotny wpływ na wzrost i rozwój roślin, odpowiadają za ekspresję różnych genów, posiadają zdolność do zmiany aktywności enzymów [Di Carlo, G.; Mascolo, N.; Izzo, A. A.; Capasso, F. Flavonoids: old and newaspects of a class of naturaltherapeuticdrugs. Life Sciences 65:337-353; 1999.] w tym hamowania aktywności lipooksygenazy, cyklooksygenazy, monooksygenazy, czy kinaz białkowych [Gao, G.; Sofic E.; Prior R.L. antioxidant and prooxidantbehavior of flavonoids: Structure-activityrelationships. FreeRadicalBiology&Medicine, 22:749-760, 1997] oraz dodatkowo nadają barwę kwiatom i owocom. Szacuje się, że w codziennej diecie, uzupełnianej suplementami diety dostarczane jest do organizmu ok. 1 g. tych związków [Zanden J.J.; Wortelboerb H. M.; Bijlsmab S.; Punta A.; Ustab: M.; Bladerenc P. J.; Rietjensa I.M.C.M.; Cnubben N.H.P.; Quantitative structure activity relationship studies on the flavonoid mediated inhibition of muttidrug resistance proteins 1 and 2. Biochemical Pharmacology 69 (2005) 699-708]. Opisane są ich właściwości przeciwzapalne, przeciwalergiczne, przeciwutleniające, antyarytmiczne czy przeciwnowotworowe [Yao, L. H.; Jiang, Y. M.; Shi, J.; Tomas-Barberan, F. A.; Datta, N.; Singanusong, R.; Chen, S. S. Flavonoids in food and theirhealthbenefits. Plant Foods for Human Nutrition (Formerly QualitasPlantamm) 59: 113-122; 2004.].

Znany jest sposób otrzymania 4'-hydroksyflawonu w wyniku hydroksylacji flawonu katalizowany przez grzyby strzępkowe. Z konwersją 81% uzyskano ten związek w kulturze szczepu Aspergillus niger x172 [Ibrahim A-RS. Abul-hajjYJ. Microbiological transformation of flavone and isoflavone. Xenobiotica, 1990, 20,363-373].

W literaturze nie ma doniesień dotyczących zastosowania metod biotechnologicznych do uzyskania 4’-hydroksyflawou z 4’-metoksyflawonu.

Szczep Beauveria bassiana KCh J1 był wcześniej ujawniony w literaturze (Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species (Kozłowska E, Urbaniak M, Hoc N, Grzeszczuk J, Dymarska M, Stępień Ł, Pląskowska E, Kostrzewa-Susłow E & Janeczko T) [Scientific Reports vol. 8, Article number: 13449 (2018)]).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-metoksyflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 24 godziny. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnej O-demetylacji otrzymuje się 4’-hydroksyflawon, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Beauveria bassiana KChJ1.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1, następuje regioselektywna O-demetylacja w substracie. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4-hydroksyflawonu, z wydajnością izolowaną na poziomie 15% (konwersją według HPLC = 62%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 4’-metoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosuflotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksan i aceton 9:1.

PL 235 664 B1

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi: ¹H NMR (600 MHz) (DMSO) δ (ppm): 6.88 (s, 1H, H-3), 6.92-6.96 (m, 2H, H-3’, H-5’), 7.48 (ddd, 1H, J = 8.0, 7.0, 1.2 Hz, 1H, H-6), 7.75 (ddd, 1H, J = 8.4, 1.2, 0.4 Hz, H-8), 7.81 (ddd, 1H, J = 8.5, 6.9, 1.7 Hz, H-7), 7.95-7.99 (m, 2H, H-2’, H-6’), 8.03 (dd, 1H, J = 7.9, 1.7, 0.4 Hz, H-5).

¹³ C NMR (151 MHz, DMSO) δ = 104.83 (C-3), 115.97 (C-3’ and C-5’),118.39 (C-8), 121.60 (C-1’), 123.34 (C-4a), 124.75 (C-5), 125.35 (C-6), (C-2’ and C-6’), 134.06 (C-7), 155.61 (C-8a), 161.00 (C-4’), 163.09 (C-2), 176.91 (C-4).

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób; wytwarzania 4’-hydroksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4’-metoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, przy czym transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 24 godziny, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 10 dni.