PL248501B1 - Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi o niskiej jakości technologicznej - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi o niskiej jakości technologicznej (poławianych w sezonie żerowania) z wykorzystaniem proteaz trawiennych, który charakteryzuje się tym, że przed marynowaniem przez 4 do 5 doby świeże lub mrożone-rozmrożone filety śledzia o niskiej jakości technologicznej składuje się w surowym preparacie proteaz trawiennych (SPPT) i/lub nastrzykuje się surowym preparatem proteaz trawiennych (SPPT). Składowanie prowadzi się w warunkach chłodniczych (najlepiej w temperaturze 0°C -2°C) od 1 do 24 godzin (najlepiej nie więcej niż 4 - 8 godzin), w stosunku filety śledzia do surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) od 2:1 do 1:2 (masa : masa). Podczas nastrzykiwania stosuje się od 0,1% do 10% surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) względem masy filetów śledzia. Przy składowaniu i/lub nastrzykiwaniu stosuje się surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) otrzymany w sposób znany z polskiego zgłoszenia patentowego nr P.443190. Sposób wytwarzania SPPT polega na tym, że rozdrobnione przewody pokarmowe ryb miesza się z 1% - 10% wodnym roztworem etanolu w proporcji 1:1-10 (masa : objętość), mieszaninę homogenizuje się, a następnie oddziela osad. Przed dodaniem wodnego roztworu etanolu lub po oddzieleniu osadu po homogenizacji dodaje się NaCl do uzyskania jego końcowego stężenia co najmniej 3%, miesza się, a następnie oddziela się osad, aby po obu etapach uzyskać surowy preparat proteaz trawiennych z ryb.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi, zwłaszcza bałtyckich, o niskiej jakości technologicznej (poławiane w okresie żerowania) z wykorzystaniem proteaz trawiennych.

Wysoka dojrzałość mięsa marynowanych śledzi związana jest z wysoką jakością sensoryczną i wartością odżywczą, a także ułatwia trawienie, szczególnie u osób starszych i z chorobami przewodu pokarmowego. Prawidłowo dojrzałe zimne marynaty ze śledzia posiadają bardzo miękką tkankę mięśniową o charakterystycznym zharmonizowanym smaku. Dojrzewające marynaty rybne produkuje się głównie ze śledzi, których jakość technologiczna zależy od sezonu połowu ryb. Z powodu wysokiej ceny surowca przemysł rybny próbuje marynować tańszego śledzia złowionego podczas sezonu żerowania, co skutkuje niskim stopniem dojrzałości marynat.

Podczas dojrzewania filetów w kąpieli marynującej (złożonej głównie z wody, octu i soli) dochodzi do proteolizy białek, głównie wskutek działania katepsyn (endogenne enzymy mięśniowe) (Logren, N., Hiidenhovi, J., Kakko, T., Valimaa, A-L., Makinen, S., Rintala, N., Mattila, P., Yang, B., Hopia, A. 2022. Effects of Weak Acids on the Microbiological, Nutritional and Sensory Quality of Baltic Herring (Clupea harengus membras). Foods, 11(12), 1717. https://doi.org/10.3390/foods11121717). Wskutek proteolizy dochodzi do rozpadu białek na mniejsze białka, polipeptydy, oligopeptydy i wolne aminokwasy. To dzięki aktywności proteaz i powstawaniu produktów hydrolizy białek (PHB) mięso nabiera charakterystycznego smaku i zapachu. Jednakże aktywność katepsyn, a zarazem zawartość PHB zmieniają się wraz z sezonem połowu śledzia (Kołakowski, E., Bortnowska, G., Lachowicz, K., 1993. Wpływ sezonu połowu na szybkość dojrzewania marynat ze śledzia bałtyckiego. XXIV Sesja Naukowa KTiChŻ PAN, Wrocław, 36). Mniejszy stopień proteolizy objawia się także bardziej twardą i gumowatą teksturą mięsa marynat typową dla śledzia surowego. Śledzie o najniższej aktywności katepsyn są poławiane podczas sezonu żerowania i takie ryby nazywa się opornymi na dojrzewanie lub śledzie o niskiej jakości technologicznej. Zauważono także, że zmiany klimatu i problem z pokarmem w morzu dodatkowo powodują obniżenie jakości technologicznej śledzi, który staje się mniejszy i chudszy, co nazywane jest karłowaceniem śledzia.

Z tych powodów poszukuje się metod wspomagania pełniejszego i szybszego dojrzewania mięsa. W przypadku ryb solonych stosuje się preparaty enzymatyczne pochodzenia mikrobiologicznego, które mają aktywność w środowisku bliskiemu obojętnego oraz przy wysokim stężeniu soli. Niestety na rynku nie ma dedykowanych preparatów do dojrzewania marynat, które posiadają silnie kwaśno-słone środowisko. Zauważono, że śledzie o niskiej jakości technologicznej poławiane w sezonie żerowania posiadają wysoką aktywność proteaz trawiennych. Proteazy te posiadają optimum aktywności w obojętnym i zasadowym środowisku (pH 7-10), zaś w kwaśnym ich aktywność jest minimalna lub resztkowa (Klomklao, S. 2008. Digestive proteinases from marine organisms and their applications. Songklanakarin Journal of Science and Technology, 30(1), 37-46). Mimo to spróbowano wykorzystać zasadowe proteazy z ryb do poprawy dojrzewania kwaśnych marynat ze śledzi złowionych w sezonie żerowania, stosując różne metody. Pierwsza metoda polega na wykorzystaniu zjawiska przenikania proteaz z wnętrzności do mięsa podczas składowania chłodniczego całych ryb. Wraz z upływem czasu składowania całego śledzia w wodzie z lodem rosła dyfuzja proteaz trawiennych z wnętrzności do mięsa śledzia, a marynowane filety ze śledzi dłużej składowanych posiadały bardziej dojrzałe mięso (polskie zgłoszenie patentowe P.438618). Wyniki pokazały, że w pierwszym etapie składowania chłodniczego trypsyna, chymotrypsyna i karboksypeptydazy dyfundowały z wnętrzności do mięśni, rozpoczęły proteolizę mięsa w środowisku obojętnym, zaś w drugim etapie marynowania mięsa przyczyniły się do zwiększenia aktywność katepsyn. Efektem był wzrost oceny sensorycznej marynowanych filetów za smak, zapach i teksturę. Pomimo tych zalet metoda ta ma ograniczenia, gdyż wymaga od producentów marynat dodatkowego czasu przetwarzania przed właściwym marynowaniem, posiadania odpowiednio chłodzonych pomieszczeń, wytwornicy lodu i dodatkowych zbiorników do składowania ryb, co podnosi koszty lub nie jest możliwe do spełnienia w każdym zakładzie. Ponadto dłuższy czas składowania chłodniczego ryb w wodzie z lodem przed marynowaniem wpływa na obniżenie świeżości surowca i niższą wydajność masy marynowanych filetów. Zatem oszczędności uzyskane z zakupu surowca o niższej jakości są zmniejszone lub utracone przez mniejszą wydajności masy marynat, stosując tą metodę marynowania. Z tego powodu opracowano drugą metodę bez wstępnego kilkudniowego chłodzenia surowca rybnego, która polega na marynowaniu śledzi z wnętrznościami (polskie zgłoszenie patentowe P.441357). Metoda ta sprawdza się podczas marynowania jednoetapowego (klasyczna, metoda niemiecka), w przeciwieństwie do metody dwuetapowej (metoda duńska ze wstępnym nasalaniem). Zaletami metody jest stosowanie kąpieli marynującej bez konieczności zmiany stężenia soli i kwasu octowego, proces jest prowadzony przez krótki czas (najlepiej 2-4 doby), co pozwala na skrócenie procesu dojrzewania mięsa ryb opornych z 14 do 4-7 dób, w porównaniu do marynowania filetów śledzia. Sposób pozwala także na zwiększenie masy marynowanych filetów, co wraz z wykorzystaniem surowca tańszego o 20-30% poprawia opłacalność produkcji. Metoda ta ma niestety wady. Po przekroczeniu zalecanego czasu marynowania pojawia się nietypowy smak i barwa mięsa marynat z powodu wzrostu dyfuzji krwi do tkanki mięśniowej oraz wzrostu aktywności chymotrypsyny uwalniającej gorzkie produkty hydrolizy białka. Obróbkę wstępną ryb (filetowanie) można wykonać dopiero po marynowaniu, a to wymusza stosowanie tej metody w zakładzie wstępnej obróbki ryb lub wymusza użycie fileciarek w marynaciarni.

Dla konsumenta obie opisane metody wykorzystania proteaz trawiennych posiadają wadę związaną ze zbyt dużą dyfuzją krwi (hemoglobiny, Hb) z wnętrzności do mięśni, która w kwaśnym środowisku marynat ulega odtlenieniu z oksymioglobiny (Hb-Fe²⁺O2, jasnoczerwona barwa) do dezoksymioglobiny (Hb-Fe²⁺, czerwono-fioletowa barwa) oraz methemoglobiny (metHb-Fe³⁺, brunatna barwa), przez co mięso marynat nabiera niekorzystną brunatną barwę i gorzkiego smaku. Ponadto metHb, w przeciwieństwie do oxyHb, silnie wzmaga utlenianie lipidów śledzia (Andersen, E., Andersen, M.L., Baron, C.P., 2007. Characterization of oxidative changes in salted herring (Clupea harengus) during ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 9545-9553; Papuc, C.; Goran, G. V.; Predescu, C. N.; Nicorescu, V.; Stefan, G. Plant polyphenols as antioxidant and antibacterial agents for shelflife extension of meat and meat products: Classification, structures, sources, and action mechanisms. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2017, 16 (6), 1243-1268). Dla przykładu udział Hb w utlenianiu lipidów mięsa pstrąga podczas 9 dób składowania chłodniczego w 2°C wynosiło ponad 90% (Cai, H.; Grunwald, E. W.; Park, S. Y.; Lei, B.; Richards, M. P. 2013. Lipid oxidation in trout muscle is strongly inhibited by a protein that specifically binds hemin released from hemoglobin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61, 17, 4180-4187).

Wyniki z obu opisanych metod wskazują, że bezpośrednie wykorzystanie wnętrzności jako źródła proteaz trawiennych wpływa korzystnie na proces dojrzewania marynat ze śledzia, szczególnie z surowca o obniżonej jakości technologicznej, jednak wiąże się z wysoką zawartością hemoglobiny oraz szybszą dyfuzją słabiej pożądanej chymotrypsyny, w stosunku do bardziej korzystnych esteraz i karboksypeptydazy A. Dlatego opracowano surowy preparat proteaz trawiennych, który zawiera jednocześnie wysoką aktywność proteaz trawiennych przy obniżonej zawartości hemoglobiny (polskie zgłoszenie patentowe P.443190). Opracowana metoda z użyciem chlorku soli i etanolu pozwala otrzymywać surowy preparat proteaz trawiennych ekstrahowanych z wnętrzności pozostałych po filetowaniu śledzi, który zawiera kilkukrotnie mniejszą zawartość hemoglobiny w porównaniu do ekstraktu wodnego. Przeszkodą w jego zastosowaniu jest brak wiedzy jaką najlepiej zastosować metodę wprowadzania preparatu do filetów, aby wykorzystać jego zalety i jednocześnie ograniczyć wady, do których mogą należeć niższe stężenie enzymów w surowym preparacie niż we wnętrznościach oraz obecność 8% etanolu w preparacie.

W technologii rybnej zastosowanie dodatku egzogennych proteaz do surowca jest rzadko spotykane, obecnie występuje w technologii ryb solonych. Preparaty proteaz pochodzenia mikrobiologicznego dodaje się do solanki, które następnie dyfundują z roztworu do filetów. Metoda ta jest prosta w wykonaniu (bez użycia maszyn) i możliwa do zastosowania w przypadku śledzi, których filety mają grubość w zakresie 1-3 cm. Znane są również badania prowadzone już od lat 70 XIX wieku dojrzewania śledzi solonych z zastosowaniem dodatku egzogennych enzymów pochodzenia zwierzęcego. Zbadano dodatek enzymów trzustkowych wieprzowych lub wołowych (Ritskes, T.M. 1971. Artificial ripening of maatjes-cured herring with the aid of proteolytic enzyme preparations. Fish Bulletin, 69, 647-654), trypsyny lub chymotrypsyny z organów wołowych (Anonymous. 1975. Production process for salted herrings (Matjes). British Patent No 1403221), ale te preparaty enzymatyczne zawierają wysoką aktywność lipazy, przez co śledź solony uzyskuje gorszy smak (Ritskes, T.M. 1971. Artificial ripening of maatjes -cured herring with the aid of proteolytic enzyme preparations. Fish Bulletin, 69, 647-654). Dlatego dokładniej zbadano dodatek zmielonych wyrostków pylorycznych ze śledzia ( Ruiter, A. 1972. Substitution of proteases in the enzymatic ripening of herring. Annales de Technologie Agricole, 21,597-605). Wyniki pokazały, że w przypadku enzymu dodanego jako surowy ekstrakt w celu przyspieszenia dojrzewania solonych filetów śledziowych, uzyskano akceptowalny smak, ale stabilność produktu końcowego była słaba ze względu na resztkową aktywność enzymu. Problem ten nie występuje w tradycyjnych metodach długotrwałego przechowywania, ponieważ aktywność enzymu stopniowo maleje podczas przechowywania, dając dość stabilny produkt końcowy z niewielką pozostałą aktywnością enzymu. Zatem, aby uzyskać stabilne produkty śledzia solonego przy metodach szybkiego dojrzewania, konieczne jest maksymalne ograniczenie aktywności resztkowej dodanego enzymu.

Z kolei w technologii mięsnej, gdzie surowiec jest znacznie grubszy, dodatek enzymów stosuje się poprzez nastrzyk, aby enzym dotarł do środka surowca i był równomiernie rozprowadzony w całej masie surowca. Ostateczna metoda użycia enzymu zależy też od jego specyficznej aktywności, aktywności enzymu w preparacie i dostępnego czasu. W technologii marynat zimnych ze śledzi nie stosuje się dodatku żadnych preparatów proteaz do poprawy dojrzewania mięsa. Przemysł produkuje marynaty zimne z surowca o różnej jakości technologicznej i otrzymuje produkt o różnej dojrzałości mięsa. Przemysł jest świadomy problemu braku powtarzalności jakości sensorycznej marynat w okresie rocznym i tłumaczy to zmianami sezonowymi poławianego surowca. Jednak tak naprawdę problemem jest brak rozwiązań dostępnych na rynku marynat zimnych, które umożliwią otrzymywanie marynat o zbliżonej jakości bez względu na sezon połowu śledzi.

Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi o niskiej jakości technologicznej (poławianych w sezonie żerowania) z wykorzystaniem proteaz trawiennych, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że przed marynowaniem (dowolnym znanym ze stanu techniki) przez 4 do 5 doby świeże lub mrożone-rozmrożone filety śledzia o niskiej jakości technologicznej składuje się w surowym preparacie proteaz trawiennych (SPPT) i/lub nastrzykuje się surowym preparatem proteaz trawiennych (SPPT). Składowanie prowadzi się w warunkach chłodniczych (najlepiej w temperaturze 0-2°C) od 1 do 24 godzin (najlepiej nie więcej niż 4-8 godziny), w stosunku filety śledzia do surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) od 2 : 1 do 1 : 2 (masa : masa). Podczas nastrzykiwania stosuje się od 0,1 do 10% surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) względem masy filetów śledzia. Przy składowaniu i/lub nastrzykiwaniu stosuje się surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) otrzymany w sposób znany z polskiego zgłoszenia patentowego nr P.443190. Sposób wytwarzania SPPT polega na tym, że rozdrobnione przewody pokarmowe ryb miesza się z 1-10% wodnym roztworem etanolu w proporcji 1 : 1-10 (masa : objętość), mieszaninę homogenizuje się, a następnie oddziela osad. Przed dodaniem wodnego roztworu etanolu lub po oddzieleniu osadu po homogenizacji dodaje się NaCl do uzyskania jego końcowego stężenia co najmniej 3%, miesza się, a następnie oddziela się osad, aby po obu etapach uzyskać surowy preparat proteaz trawiennych z ryb. Korzystnie nastrzykiwanie wykonuje się metodą mechaniczną lub ręczną z użyciem strzykawki z igłą o grubości 1,2 mm i długości 50 mm. Korzystnie podczas otrzymywania surowego preparatu proteaz trawiennych (SPPT) do oddzielania osadu stosuje się filtrację swobodną lub wirowanie. Korzystnie podczas otrzymywania surowego preparatu proteaz trawiennych (SPPT) oba etapy prowadzi się w temperaturze chłodniczej.

Najlepszy efekt użycia SPPT jest stosując nastrzykiwanie, następnie składowanie mrożonychrozmrożonych filetów, a najmniejszy efekt uzyskuje się przez składowanie świeżych filetów. Przedstawiony sposób umożliwia dyfuzję proteaz trawiennych w głąb filetów śledziowych, które rozpoczynają proteolizę białek przed marynowaniem, uwalniają katepsyny z lizosomów i uczestniczą z katepsynami podczas marynowania filetów śledzia. Zastosowanie SPPT zamiast pozostawienia wnętrzności w całym śledziu przeciwdziała zbyt dużej dyfuzji hemoglobiny do mięśni śledzia. Marynaty otrzymane zużyciem SPPT mają większą aktywność proteolityczną, większą dojrzałość mięsa i wyższą zawartość produktów hydrolizy białka, które nadają charakterystyczne cechy sensoryczne marynat.

Przedstawiony sposób wstępnej obróbki enzymatycznej mięśni śledzia z użyciem SPPT oraz zwiększenie aktywności proteolitycznej w filetach przeznaczonych do marynowania pozwala na skrócenie czasu procesu marynowania filetów do 4-5 dób, po których można uzyskać prawidłową dojrzałość mięsa przy ograniczonym udziale hemoglobiny w filetach. Wstrzyknięcie SPPT (solenie nastrzykowe) do filetów śledzia przed marynowaniem umożliwia szybszą produkcję marynat, mniejsze zużycie SPPT, wyższą wydajność masy marynat i wyższą dojrzałość mięsa marynat w porównaniu do solenia mokrego (składowania w SPPT). Sposób według wynalazku pozwala na ograniczenie negatywnego wpływu udziału hemoglobiny na jakość sensoryczną mięsa marynowanych ryb. Zastosowanie SPPT do poprawy jakości technologicznej filetów ze śledzia o niskiej jakości nie wymaga zmiany parametrów marynowania (z wyjątkiem skrócenia czasu marynowania). W przedstawionym sposobie wykazano, że krótki czas kontaktu filetów z SPPT (do 8 godzin) ogranicza dyfuzję hemoglobiny i powstawania gorzkiego smaku i brunatnej barwy mięsa, jak miało to miejsce podczas dyfuzji składników bezpośrednio z wnętrzności do mięsa (Kamiński, P., Szymczak, M., Szymczak, B. 2022. Effects of Primary Processing and PreSalting of Baltic Herring on Contribution of Digestive Proteases in Marinating Process. Applied

Science, 12, 10877). Zaletą przedstawionej metody jest również zahamowanie aktywności proteaz trawiennych w kwaśnym środowisku marynat, dzięki czemu proteazy trawienne dokonują proteolizy tkanki mięśniowej tylko przez określony wybrany czas, głównie do czasu obniżenia pH po wniknięciu kwasu do ryby, przez co nie są one aktywne przez cały czas dojrzewania marynat, co doprowadziłoby do zbyt głębokiej dojrzałości mięsa i powstawania niekorzystnej tekstury i smaku. Zanurzeniowe solenie w SPPT może zastąpić obróbkę zamrażania-rozmrażania filetów przed marynowaniem w celu zmiękczenia mięsa. Ze względu na rosnące ceny energii elektrycznej zamrażanie ryb jest coraz droższą metodą utrwalania. Z kolei zaletą nastrzykiwania w porównaniu do solenia zalewowego jest mniejsze zużycie SPPT, mniejsza zawartość etanolu w mięsie, bezpośredni kontakt proteaz-SPPT z substratem-białkiem surowca rybnego, krótszy etap obróbki z użyciem SPPT, ograniczenie możliwości zanieczyszczenia krzyżowego. Zaletą nastrzykiwania jest też najwyższa wydajność masy marynat w porównaniu do metody składowania w SPPT przez co najmniej 8 godzin i uzyskanie lepszej dojrzałość mięsa marynat.

Sposób według wynalazku przedstawiono w poniższym przykładzie wykonania i na rysunku, Fig. 1 przedstawia schemat produkcji marynat zimnych poddanych soleniu mokremu lub nastrzykiwaniu SPPT; Fig. 2 przedstawia wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na (A) masę filetów i (B) zawartość wody w filetach przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); Fig. 3 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na (A) aktywność trypsyny i (B) karboksypeptydazy-A w filetach przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); Fig. 4 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na (A) aktywność katepsyny D i (B) L w filetach przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); Fig. 5 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na zawartość azotu niebiałkowego w filetach przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); Fig. 6 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na ogólną pożądalność mięsa marynat; Fig. 7 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na zawartość (A) frakcji peptydów i (B) frakcji aminokwasów w filetach przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); Fig. 8 - wpływ czasu solenia zalewowego w SPPT filetów świeżych (S) i filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) oraz wpływ iniekcji SPPT do filetów świeżych (NTR) na (A) twardość filetów oraz (B) barwę powierzchni filetów przed marynowaniem (białe znaczniki) i (+M) po marynowaniu (czarne znaczniki); zaś Tabela 1 przedstawia deskryptory i atrybuty stosowane podczas analizy sensorycznej mięsa marynat.

Przykład

Śledź bałtycki (Clupea harengus membras) został złowiony w czerwcu 2022 roku i został przetransportowany w polistyrenowych skrzynkach z lodem do laboratorium wciągu 24 godzin. Śledź miał długość 17,4 ±6,1 cm i masę 54,6 ±5,9 g. Dojrzałość płciowa śledzia w skali Maiera została oceniona na III stadium, zaś wskaźnik świeżości QIM oceniono na bardzo świeży (3,8 pkt. na 29) zgodnie z metodą Kamiński i in. (Kamiński, P., Szymczak, M., Szymczak, B. 2022. The effect of previous storage condition on the diffusion and contribution of digestive proteases in the ripening of marinated Baltic herring (Clupea harengus). LWT-Food Sci. Technol. 2022, 165, 113723). Śledzie zostały poddane filetowaniu, a następnie podzielono je na 2 grupy: filety świeże i filety mrożone-rozmrożone. Mrożenie polegało na zamrożeniu filetów w -20°C w workach z tworzywa PE-PA zamkniętych próżniowo po czym składowano je zamrażalniczo 3 doby. Filety śledzia po składowaniu zamrażalniczym w worku rozmrożono w wodzie o temperaturze 10°C.

Surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT)

SPPT otrzymano zgodnie z metodą opisaną w polskim zgłoszeniu patentowym P.443190. Do rozdrobnionych wnętrzności pozostałych po filetowaniu śledzia dodano 8% wag. etanol w proporcji 1 : 5 (masa : objętość), zhomogenizowano, po 30 min odwirowano (9000 g przez 10 min), a do uzyskanego supernatantu dodano stały chlorek sodu do uzyskania 6% stężenia i po 30 min ponownie odwirowano (9000 g przez 10 min). Przed użyciem supernatant / ekstrakt enzymów rozcieńczono wodą w proporcji 1 : 1 (masa : masa) otrzymując SPPT.

Składowanie filetów w SPPT

Metoda ta polegała na swobodnej dyfuzji składników SPPT do mięsa filetów. Zbadano składowanie filetów świeżych (próba S) i mrożonych-rozmrożonych (próba MRS). Składowanie wykonano poprzez umieszczenie filetów w wiaderkach wraz z SPPT w stosunku 1 : 1 (masa : masa) i całość składowano w temperaturze 2°C. Do badań i marynowania filety pobierano po 4, 8, 16 i 24 godzinach solenia zalewowego. Z jednej strony z uwagi na zawartość soli i enzymów w SPPT proces składowania filetów nazywany jest soleniem enzymatycznym na mokro. Z drugiej strony ze względu na niskie 3% stężenie soli w SPPT zastosowany proces składowania nie ma funkcji utrwalania jak w przypadku klasycznej metody solenia w stężonych solankach. Próbą kontrolną były filety świeże bez dodatku SPPT (przed składowaniem w SPPT) (Fig. 1).

Wstrzykiwanie SPPT do filetów

Metoda polegała na wstrzyknięciu SPPT do świeżych filetów (próba NTR), która w przemyśle nazywana jest soleniem nastrzykowym. Nastrzyk wykonano metodą ręczną, używając strzykawkę 25 ml z igłą o grubości 1,2 mm i długości 50 mm. Do strzykawki pobierano tylko świeży SPPT, zaś SPPT wyciekający z ryby odpływał poza rybę. Igłę wbijano do głębokości ok. 80% grubości fileta (na całej długości fileta), a następnie wyciągając igłę wciskano tłok strzykawki wykonując iniekcję SPPT. Pomiędzy wybranymi iniekcjami rybę ważono, a następnie iniekcję powtarzano, aż do momentu, kiedy masa filetów przestała rosnąć. Próbą kontrolną były filety świeże bez dodatku SPPT (Fig. 1).

Proces marynowania filetów

Wszystkie próby filetów (S, MRS, NTR) były marynowane przez 5 dób w kąpieli marynującej zawierającej 4,5% kwasu octowego i 6% chlorku sodu (procent wagowy) w temperaturze 7°C (Rys. 1). Udział masy filetów do masy kąpieli wynosił 1,5 : 1,0 (masa : masa). Marynowanie wykonano w szczelnie zamkniętych wiaderkach. Po marynowaniu filety odciekały na sicie przez 5 min. Część odciekniętych filetów poddano ocenie sensorycznej metodą Szymczak i in. (Szymczak, M., Szymczak, B., Koronkiewicz, A., Felisiak, K., Bednarek, M. 2013. Effect of cover brine type on the quality of meat from herring marinades. Journal of Food Science, 78, 4, 619-625), a pozostałe filety odskórzono, zmielono kuchenną maszynką do mielenia mięsa i dla uzyskanego farszu wykonano poniższe oznaczenia.

Aktywność proteaz trawiennych

Aktywność proteaz oznaczono w ekstraktach mięsa z próby kontrolnej, filetów nastrzykiwanych i solonych w SPPT oraz po marynowaniu filetów. Enzymy ekstrahowano z mięsa buforem TrisHCl 150 mM o pH 7,8 (1 : 10; masa : objętość), ekstrakt odwirowano (9000 g przez 10 min. w 4°C) i w supernatancie oznaczono aktywność:

• esterazową trypsyny w pH 8,2 wobec Na-p-Tosyl-L argininę metyl ester hydrochlorida (TAME) metodą Hummel (Hummel B.C.W. 1959. A modified spectrophotometric determination of Chymotrypsin, trypsin and thrombin. Canadian Journal Biochemistry and Physiology, 37, 1393-1399), 1 U zdefiniowano jako 1 μM zhydrolizowanego TAME w 1 min przy 247 nm, • chymotrypsyny w pH 7,8 wobec N-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (BTEE) metodą, Hummel (Hummel B.C.W. 1959. A modified spectrophotometric determination of Chymotrypsin, trypsin and thrombin. Canadian Journal Biochemistry and Physiology, 37, 1393-1399), 1 U zdefiniowano jako 1 μM zhydrolizowanego BTEE w 1 min przy 256 nm • karboksypeptydazy A w pH 7,5 wobec 4-Methoxyphenylazoformyl-Phe (AAFP) zgodnie z Mock et al. (Mock W.L., Liu, Y., Stanford D. J. 1996. Arazoformyl peptide surrogates as spectrophotometric kinetic assay substrates for carboxypeptidase A. Analytical Biochemistry, 239(2), 218-222), 1 U zdefiniowano jako 1 μM AAFP zhydrolizowanej w 1 min, stosując pomiar przy 350 nm.

Aktywność katepsyn

Aktywność katepsyn oznaczono w ekstraktach mięsa marynowanego śledzia zgodnie z metodą Szymczak (Szymczak, M. Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi. P.232995). Enzymy ekstrahowano z mięsa wodą destylowaną (1 : 5, masa : objętość), a następnie ekstrakt odwirowano (9000 g przez 10 min. w 4°C). W supernatancie zmierzono aktywność katepsyny D oraz katepsyny L, odpowiednio wobec substratów: Mca-GKPILFFRLK, (Dnp)-r-NH2 i Z-FR-MCA. Podczas reakcji fluorescencję mierzono stosując mikrokuwetę za pomocą spektrofluorymetru (Hitachi, F-7000, Tokio, Japonia) o długościach wzbudzenia i emisji odpowiednio przy 328 i 393 dla katepsyny D i 322 i 460 nm dla peptydaz cysternowych. Aktywność katepsyn wyrażono w jednostkach fluorescencji (Flu).

Zawartość produktów hydrolizy białka

Zawartość trzech frakcji azotowych oznaczono w 5% ekstraktach kwasu trichlorooctowego z mięsa śledzia:

• zawartość azotu niebiałkowego za pomocą metody Kjeldahla (AOAC. 1990. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 15th edition, In K. Helrich (Ed.) AOAC, Arlington, 1298), • zawartość tyrozyny [PHB (A)] i peptydów [PHB (R)] zmodyfikowaną metodą Lowry'ego (Kołakowski E. 2005. Analysis of proteins, peptides, and amino acids in foods. In S. Otles (Ed.), Methods of analysis of food components and additives, 59-96. Boca Raton: CRC Taylor & Francis).

Analiza sensoryczna

Marynowane filety poddano profilowaniu sensorycznemu przeprowadzonemu przez 7-osobowy panel sensoryczny (asesorzy), przeszkolony w analizie marynowanych śledzi zgodnie z normą ISO 11035, stosując pięciopunktową, nieuporządkowaną skalę z dokładnością do 0,1 punktu, zakotwiczoną na jej krańcach, z minimalnym i maksymalnym stopniem akceptacji. Wyższa nota oznacza lepsze cechy tekstury (0 punktów najgorsza cecha / bardzo nielubiana, 5 punktów najlepsza cecha / bardzo lubiana). W skrócie, filety bez skóry z każdej próbki podawano na porcelanowych tackach. Każdy oceniający odcinał trzy kawałki (ok. 3 cm szerokości każdy), po jednym z każdego fileta, w celu przeprowadzenia testu. Analizę filetów wykonano w zakresie od 2/10 do 6/10 długości filetów, mierząc od strony głowy. W przerwach między próbkami oceniający korzystali z wody i jasnego chleba do oczyszczania podniebienia. Podczas oceny sensorycznej oceniano cechy dla następujących deskryptorów: wygląd, smak, zapach i teksturę (ISO 5492:2008), dla których opracowano atrybuty typowe dla zimnych marynat śledziowych (Tabela 1). Ogólną ocenę każdego z deskryptora obliczono uzyskując średnią punktację ocenianych atrybutów od wszystkich asesorów. Następnie wynik ogólnej oceny deskryptora został pomnożony przez współczynnik ważkości, który wynosił dla: wyglądu: 0,1, zapachu: 0,2, smaku: 0,3, tekstury: 0,4 (Szymczak, M., Kamiński, P., Felisiak, K., Szymczak, B., Dmytrów, I., Sawicki, T. 2020. Effect of constant and fluctuating temperatures during frozen storage on quality of marinated fillets from Atlantic and Baltic herrings (Clupea harengus). LWT - Food Science and Technology, 133, 109961), a następnie uzyskane iloczyny zsumowano otrzymując ogólną pożądalność sensoryczną mięsa marynat.

Całkowita różnica barwy

Pomiar przestrzeni barwy w systemie CIE L* a* b* oceniono metodą obiektywną za pomocą kolorymetru WR18 (FRU®, Shenzhen Wave Optoelectronics Technology Co., Ltd., Shenzhen, China) w oparciu o białą standardową płytkę (L* = +92,4; a* = -0,04; b* = +1,9) stosując parametry: iluminant D65, obserwator 10°, tryb oświetlenia d/8 i kaliber 8 mm. Pomiar barwy wykonano na powierzchni mięśnia grzbietowego fileta. Całkowitą różnicę barwy (AE = [(AL*)² + (Aa*)² + (Ab*)²]⁰·⁵) obliczono dla wartościach L*, a* i b* między próbą kontrolną a poszczególnymi próbami filetów przed i po marynowaniu. Dla filetów przed marynowaniem próbą kontrolną były filety świeże S 0h, zaś po marynowaniu próbą kontrolną były marynaty S+M 0h.

Parametr twardości

TPA-twardość mięsa zmierzono wykonując analizę profilu tekstury (TPA) za pomocą analizatora tekstury TA-XTplus (Stable Micro Systems, Godalming, Wielka Brytania) na 4 marynowanych filetach dla każdej z prób. Testy twardości obejmowały dwukrotne ściskanie próbki w tym samym miejscu sondą cylindryczną P10 do 50% wysokości filetu z prędkością 5 mm<. Pomiary przeprowadzono w 4 powtórzeniach dla każdego filetu, tylko dla mięśnia grzbietowego.

Wyniki

Filety świeże (próba kontrolna) przed obróbką miały 100% masy i do nich porównano pozostałe próby. Wraz z upływem czasu zalewowego solenia w SPPT masa filetów świeżych (S) rosła uzyskując 104,6% po 24 godzinach (Fig. 2A). W przypadku mrożonych-rozmrożonych filetów (MRS) ich masa obniżyła się do 96%, z powodu zamrażalniczego wycieku, zaś podczas zalewowego solenia masa wzrosła do 105,3% po 24 godzinach, czyli bardziej niż w przypadku filetów świeżych. Najszybszy przyrost masy obserwowano do 4 godziny solenia zalewowego, odpowiednio było to o 2,8 punktu procentowego i 5 punktów procentowych, zaś w kolejnych godzinach składowania dynamika wzrostu masy zmalała. Wyższa masa filetów S niż MRS do 8 godziny solankowania była spowodowana wyciekiem zamrażalniczym w MRS, który stanowił 4% masy filetów. Po 8 godzinach solankowania różnice pomiędzy tymi próbami były małe w zakresie 1 punktu procentowego. Wzrost masy filetów wynikał z dyfuzji soli i wody z do mięsa filetów, wzrostu wodochłonności i pęcznienia białek w wyniku zjawiska ich nasalania (Fig. 2A). Potwierdzeniem tego jest stały wzrost zawartości wody wraz z czasem solankowania w filetach S oraz MRS (Fig. 2B). W przypadku metody nastrzykiwania masa filetów wzrosła do 102,5%, co oznacza, że świeże filety śledzia bałtyckiego przyjęły 25 g SPPT na każdy 1 kg surowca rybnego (Fig. 2A).

Wyniki pokazały, że stosując metodę nastrzykiwania z 1 kg preparatu można poddać nastrzykiwaniu ponad 40 kg fileta. Stosując metodę zalewową, przy stosunku masy SPPT do masy ryby 1 : 1, z 1 kg SPPT można poddać obróbce tylko 1 kg filetów. Zatem wydajność wykorzystania preparatu metodą nastrzykiwania była 40 razy wyższa niż stosując metodę zalewową. Gdyby ograniczyć zanieczyszczenie krzyżowe i namnażanie się bakterii w SPPT, to możliwe byłoby stosowanie preparatu SPPT wielokrotnie, w wyniku czego wydajność jego wykorzystania mogłaby się zwiększyć. Z drugiej strony nie wiadomo jak zachowa się aktywność proteaz w SPPT podczas jego wielokrotnego stosowania.

Po marynowaniu masa filetów we wszystkich próbach uległa obniżeniu, co jest typowe dla klasycznej metody marynowania (Fig. 2A). Zjawisko utraty wody w procesie marynowania jest wynikiem dyfuzji kwasu octowego z kąpieli marynującej do tkanki mięśniowej śledzia, który obniża pH środowiska, co wywołuje zmniejszenie wodochłonności białka (Szymczak, M., Kołakowski, E., Felisiak, K. 2015. Effect of addition of different acetic acid concentrations on the quality of marinated herring. Journal of Aquatic Food Product Technology, 24(6), 566-581). Wydajność marynowania próby kontrolnej (czas 0) z filetów świeżych (S) wyniosła 87,8%, a z filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS) 84%. Dłuży czas składowania filetów S i MRS w SPPT sprzyjał niższej masie marynat, których wydajność była odpowiednio w zakresie 86,0-80,9% i 83-81,5%, czyli o 1,8-6,9 punktu procentowego mniej w porównaniu do próby kontrolnej. Z kolei w przypadku marynat z filetów nastrzykiwanych wydajność wyniosła 86,1%, czyli o 1,7 punktu procentowego mniej w porównaniu do próby kontrolnej lub podobnie jak marynat S+M z filetów po 4 h solenia w SPPT (Fig. 2A). Ujemna korelacja pomiędzy czasem solankowania (4-24 h) a wydajnością masy marynat może wynikać z aktywności proteaz trawiennych, gdyż zhydrolizowane białko może posiadać niższą wodochłonność. Marynaty z filetów mrożonych-rozmrażanych (MRS+M) miały niższą wydajność niż z filetów świeżych (S+M) stosując solankowanie przez 4-8 h, jednak dłuższy proces solankowania przed marynowaniem (16-24 godzin) spowodował, że wydajność MRS+M była zbliżona do S+M. Prawdopodobnie było to spowodowane wzrostem zawartości wody w marynatach MRS+M z filetów dłużej solankowanych, w przeciwieństwie do marynat S+M (Fig. 2B).

Wyniki pokazały, że proteazy trawienne były aktywne już w mięsie świeżego śledzia (Fig. 3), co jest spotykane w przypadku śledzi składowanych chłodniczo po złowieniu (Kamiński, P., Szymczak, M., Szymczak, B. 2022. The effect of previous storage condition the diffusion and contribution of digestive proteases in the ripening of marinated Baltic herring (Clupea harengus). LWT - Food Science and Technology 165, 113723.). Aktywność trypsyny w surowcu (S, 0 godzin) wynosiła 59,3 U, a po zamrożeniurozmrożeniu filetów aktywność wzrosła do 70,2 U (Fig. 3A). Podczas solankowania filetów w SPPT aktywność trypsyny w próbach S i MRS malała do 24 godziny osiągając odpowiednio 31,6 U i 25,2 U. Wyższą aktywność trypsyny stwierdzono w próbach S, niż w MRS przez cały okres solankowania w SPPT. Metoda nastrzykiwania spowodowała wzrost aktywności trypsyny względem surowca o 25% do 74,0 U i były to filety przed marynowaniem z największą aktywnością trypsyny ze wszystkich zastosowanych metod obróbki przy użyciu SPPT. Prawdopodobnie najwyższa aktywność trypsyny w filetach nastrzykiwanych (NTR) była wynikiem wprowadzenia SPPT bezpośrednio do mięśni śledzia, w przeciwieństwie do dyfuzji przez cały mięsień jak miało to miejsce w próbach poddanych składowaniu w SPPT. Marynowanie obniżyło aktywność trypsyny we wszystkich próbach (Fig. 3A). Po marynowaniu najwyższą aktywność trypsyny posiadały próby S+M, szczególnie z filetów solankowanych 8 godzin (33,8 U). W próbach marynat MRS+M najwyższą aktywność 28,3 U uzyskano po 4 godzinach solankowania w SPPT, przy czym podobną aktywność 28,4 U posiadały też marynaty NST+M z filetów nastrzykiwanych (Fig. 3A).

Aktywność karboksypeptydazy-A w surowcu wynosiła 99,7 U (Fig. 3B). Mrożenie-rozmrażanie filetów, tak jak w przypadku trypsyny, spowodowało 2,1-krotny wzrost aktywności enzymu do 209,1 U. Składowanie filetów S i MRS w SPPT w większości prób wpływało na wzrost aktywności karboksypeptydazy w mięsie, najbardziej w S-16 godzin (608,5 U) oraz w MRS-24 godzin (439,2 U). Iniekcyjne wprowadzenie SPPT do filetów spowodowało wzrost aktywność karboksypeptydazy-A o 60 U do 159,6 U, w porównaniu do próby kontrolnej. Po marynowaniu aktywność karboksypeptydazy-A w większości prób wzrosła, w przeciwieństwie do trypsyny. Największy wzrost był w przypadku filetów świeżych (S), w których dłuższy czas składowania w SPPT sprzyjał około 2 razy wyższej aktywności karboksypeptydazy-A. Już pierwsze 4 godziny solankowania filetów S w SPPT zwiększyły aktywność karboksypeptydazy-A w marynatach do 950 U, zaś kolejne 20 godzin zwiększyło aktywność do 1252,2 U. W marynatach MRS+M także odnotowano najszybszy wzrost aktywności karboksypeptydazy-A do 4 godziny solankowania (488,4 U) i również najwyższa aktywność 620,9 U była po 24 godzinach. Aktywność karboksypeptydazy-A w marynatach NTR+M wzrosła w najmniejszym stopniu jedynie o 45,5 U. Podsumowując zarówno składowanie i nastrzyk filetów z użyciem SPPT przyczyniło się do znacznego wzrostu aktywności proteaz trawiennych bez zauważalnej negatywnej brunatnej zmiany barwy (ΔΕ) powierzchni filetów surowych i po marynowaniu, z wyjątkiem prób MRS 0h, w której wzrost całkowitej różnicy barwy spowodowany był wzrostem parametrów czerwoności (a*) i żółtości (b*) (Fig. 8B). Przyjmuje się, że zauważalna gołym okiem zmiana barwy występuje wtedy kiedy wartości różnicy barwy (δε) pomiędzy próba właściwą a kontrolną jest równa co najmniej 3,0. Wyniki potwierdziły, że zastosowanie SPPT wpływa na wzrost aktywności proteolitycznej bez zauważalnej negatywnej zmiany barwy filetów w porównaniu do metody składowania ryb z wnętrznościami.

Aktywność katepsyny D najniższa była w surowcu (448,6 Flu), a zamrażanie-rozmrażanie (MRS) spowodowało 3-krotny wzrost aktywności do 1323,9 Flu (Fig. 4A). Wzrost aktywności był wynikiem uszkodzenia błon lizosomów przez kryształy lodu i uwolnieniem katepsyny D do przestrzeni międzykomórkowych (Szymczak, M., Kamiński, P., Felisiak, K., Szymczak, B., Dmytrów, I., Sawicki, T. 2020. Effect of constant and fluctuating temperatures during frozen storage on quality of marinated fillets from Atlantic and Baltic herrings (Clupea harengus). LWT - Food Science and Technology, 133, 109961; polskie zgłoszenie patentowe P.415721). Składowanie filetów w SPPT do 16 godziny przyczyniło się do wzrostu aktywności katepsyny D do 2152,3 Flu dla filetów S i do 2212,7 Flu dla filetów MRS. Zatem obie próby filetów świeżych i rozmrożonych osiągnęły podobną aktywność katepsyny D, przy czym aktywność tej proteazy w filetach S najbardziej wzrosła po 8 h składowania, zaś w MRS już po 4 h. Wzrost aktywności katepsyny D podczas składowania filetów w SPPT był spowodowany dyfuzją pepsyny z SPPT (pepsyna również jest endoproteazą aspartylową jak katepsyna D, przez co rozkłada ten sam substrat użyty do pomiaru aktywności katepsyny D) oraz uwalnianiem katepsyn z lizosomów przez enzymy trawienne (Szymczak, M., Lepczyński, A. 2016. Occurrence of aspartyl proteases in brine after herring marinating. Food Chemistry, 194, 470-475). Z kolei szybsze wnikanie SPPT do filetów MRS prawdopodobnie wynika z uszkodzenia mięśni przez kryształy lodu podczas zamrażania w skutek czego proteazy trawienne z SPPT łatwiej dyfundowały w głąb mięśni śledzia. W przypadku nastrzykiwania aktywność katepsyny D również uległa zwiększeniu o 559,4 Flu i próba NTR uzyskała zbliżoną aktywność do filetów mrożonych-rozmrożonych (MRS 0 godzin). Marynowanie surowca (S-0h) spowodowało niemalże 12-krotny wzrost aktywności katepsyny D, w przypadku filetów NTR wzrost był 3-krotny, zaś dla filetów mrożonych-rozmrożonych wzrost był 2,5-krotny (Fig. 4A). Przyczyną tak dużego wzrostu aktywności katepsyny D po marynowaniu jest zmiana środowiska na kwaśne, które jest środowiskiem optymalnym dla aktywności tego enzymu lizosomalnego. Składowanie filetów w SPPT miało wpływ na wzrost aktywności katepsyny D w marynatach z filetów S, najbardziej do 4 godziny składowania (6865,2 Flu), w przeciwieństwie do malejącego trendu w marynatach z filetów rozmrożonych (Fig. 4A).

Aktywność katepsyny L w surowcu wynosiła 1237 Flu (Fig. 4B). Mrożenie-rozmrażanie i nastrzykiwanie surowca nie miało większego wpływu na aktywność tej proteazy cysteinowej w surowych filetach (Fig. 4B). Składowanie filetów w SPPT obniżyło aktywność katepsyny L w próbie S do 16 godziny (832,3 Flu), zaś w próbie MRS spadek aktywności trwał tylko do 8 godziny (700 Flu). Marynowanie surowca obniżyło aktywność katepsyny L 1,6-krotnie w próbie S+M, w próbie MRS+M aktywność zmalała 2,1-krotnie, a w NTR+M aktywność obniżyła się 2,6-krotnie. Po marynowaniu aktywność katepsyny L w próbach S+M i MRS+M odzwierciedlała zmiany przed marynowaniem, przy czym spadek aktywności w marynatach trwał krócej niż w filetach surowych. W próbie S+M aktywność zmalała do 363,3 Flu po 8 godzinach, a w MRS po 4 godziny do 355 Flu (Fig. 4B). Podsumowując składowanie filetów w SPPT miało pozytywny wpływ na wzrost aktywności jedynie katepsyny D w przypadku filetów niemrożonych przed i po marynowaniu. Podobnie pozytywny efekt występował stosując metodę nastrzykiwania.

Jednym z głównych chemicznych wskaźników enzymatycznego dojrzewania mięsa marynat zimnych jest zawartość azotu niebiałkowego (NPN), który może wskazywać na aktywność enzymatyczną i jakość sensoryczna mięsa. Surowiec (S-0h) zawierał 293,0 mg NPN, zaś po mrożeniu-rozmrażaniu (MRS-0h) zawartość NPN wzrosła do 320,6 mg, co mogło być spowodowane aktywnością proteolityczną podczas zabiegu zamrażania i rozmrażania oraz wyciekiem zamrażalniczym (Fig. 5). Składowanie filetów S i MRS w SPPT przyczyniło się do obniżenia zawartości NPN, najbardziej po 4-8 godzinach, odpowiednio o 67,8 mg i 74,6 mg (Fig. 5). Zastosowanie nastrzykiwania obniżyło NPN w filetach surowych ale tylko o 5 mg. Obniżenie NPN w filetach surowych poddanych składowaniu lub nastrzykiwaniu prawdopodobnie było wywołane wprowadzeniem SPPT, który miał niższe stężenie NPN (47 mg / 100 g) niż filety kontrolne (293 mg), czyli nastąpił efekt rozcieńczenia. W przypadku prób składowanych zauważyć można, że po spadku zawartości NPN po 8 godzinach nastąpił wzrost jego zawartości, pomimo ciągłego wzrostu masy składowanych filetów, co może wskazywać na aktywność proteolityczną wnikających do mięsa proteaz trawiennych.

Po procesie marynowania zawartość NPN w mięsie marynat uległa zmianie. Próba kontrolna marynat zawierała 276,3 mg NPN, zaś marynaty z śledzia mrożonego-rozmrożonego zawierały tych frakcji o 10 mg mniej (Fig. 5). Wszystkie marynaty ze śledzi składowanych 4-24 godzin w SPPT zawierały mniej NPN niż marynaty ze śledzi nie poddanych obróbce w SPPT. Wydłużenie czasu solankowania z 4 do 24 godzin spowodowało obniżenie zawartości NPN w przypadku śledzi świeżych oraz wzrost ze śledzi mrożonych-rozmrożonych, jednak różnice pomiędzy próbami wynosiły tylko 10-15 mg NPN. W przypadku śledzi niemrożonych zawartość NPN była wyższa po marynowaniu niż przed marynowaniem, zaś dla śledzi mrożonych-rozmrażanych było odwrotnie. Potwierdza to, że mrożenie śledzia często ma negatywny wpływ na wodochłonność i aktywność proteolityczną tkanki mięśniowej, przez co marynaty z tych śledzi mają niższą wydajność i wolniej dojrzewają (Szymczak, M. 2011. Comparison of physicochemical and sensory changes in fresh and frozen herring (Clupea harengus L.) during marinating. Journal of the Science of Food and Agriculture, 91: 68-74). Zawartość NPN nie zawsze jest wystarczająca do wskazania bardziej dojrzałych marynat, gdyż frakcja NPN ulega dyfuzji / stratom z mięsa do otaczającej kąpieli (Szymczak M., Kołakowski E. 2012. Losses of nitrogen fractions from herring to brine during marinating. Food Chemistry, 132(1), 237-243). Oznacza to, że wzrost zawartości NPN w mięsie prowadzi do większych strat NPN do kąpieli, szczególnie w śledziu mrożonym-rozmrożonym, który posiada uszkodzoną strukturę tkanki i łatwiej dochodzi do dyfuzji. Frakcja NPN zawiera wiele różnych związków azotowych, również nie pochodzących z proteolizy białek, dlatego dla lepszej oceny dojrzewania marynat oznaczono frakcję peptydów i aminokwasów obecnych w NPN.

Zawartość peptydów i aminokwasów w filetach świeżych (S) wynosiła po około 30 mg, przy czym mrożenie-rozmrażanie zwiększyło ich zawartość (Fig. 7AB). Wraz z upływem czasu składowania filetów w SPPT zawartość peptydów i aminokwasów rosła w podobnym tempie w filetach S i MRS osiągając po 24 godzinach 130-160 mg peptydów i 50-58 mg aminokwasów. Z kolei nastrzykiwanie świeżych filetów tylko nieznacznie zmieniło zawartość obu frakcji w mięsie. Obróbka filetów w SPPT spowodowała, że marynaty zawierały więcej peptydów i aminokwasów, jednak czas obróbki w SPPT dłuższy niż 4 i 8 godzinach nie zwiększał znacznie zawartości odpowiednio peptydów i aminokwasów w mięsie marynat. Ponadto marynaty z filetów S zawierały więcej peptydów niż filety MRS, a w przypadku aminokwasów było odwrotnie. W przypadku marynat z surowca nastrzykiwanego zawierały one 231,3 mg peptydów (podobnie jak MRS+M-16h) i 78,52 mg aminokwasów (podobnie jak marynaty z filetów S i MRS po 4 godzinach składowania w SPPT) (Fig. 7AB). Wysoka zawartość PHB w mięsie marynat potwierdza zarówno dyfuzję i aktywność proteaz trawiennych, co pozytywnie wpłynęło na zawartość PHB marynowanych śledzi. Marynaty z największą zawartością PHB(R) posiadały również największą aktywność trypsyny, karboksypeptydazy A i chymotrypsyny.

Ogólna pożądalność mięsa marynat S+M wykonanych z filetów S wynosiła 4,52 punktu (Fig. 7). Składowanie filetów S w SPPT wpłynęło na wyższą ocenę sensoryczną marynat, najbardziej stosując 4 godziny obróbki, po których marynaty uzyskały 4,64 punktu. Wydłużenie czasu obróbki filetów do 8-16 godzin nie zwiększyło dodatkowo pożądalności marynat, prawdopodobnie głównie z powodu negatywnego wpływu solankowania na wzrost twardości, co potwierdziła analiza TPA-twardość (Fig. 8A). Na wzrost ogólnej pożądalności sensorycznej marynat S+M do 4 godziny składowania w SPPT miał wpływ wzrost oceny wszystkich wyróżników sensorycznych (wygląd, smak, zapach, tekstura). Jednocześnie w marynatach S+M-4h stwierdzono wzrost aktywności karboksypeptydazy A (Fig. 3B) i katepsyny D (Fig. 4A), które miały istotny wpływ na wzrost oceny sensorycznej marynat (według polskiego zgłoszenia patentowego P.438618).

W przypadku marynat z filetów mrożonych-rozmrożonych ocena sensoryczna wyniosła 4,67 punktu, czyli była wyższa od marynat z surowca świeżego (niemrożonego) i porównywalna do marynat z surowca S po 4 godzinach obróbki w SPPT. Główną przyczyną wyższej oceny sensorycznej marynat z filetów rozmrożonych była poprawa tekstury oraz smaku i zapachu. Prawdopodobnie na wzrost oceny poszczególnych składowych sensorycznych próby MRS+M miała wpływ wyższa za wartość produktów hydrolizy białek (peptydów i aminokwasów) (Fig. 7AB), które odpowiadają za powstawanie charakterystycznego smaku i zapachu marynat zimnych (Sikorski, Z., Kołakowski, E. 2000. Endogenous Enzyme Activity and Seafood Quality: Influence of Chilling, Freezing, and Other Environmental Factors in: Seafood enzymes Ed.: Haard, N.F. & Simpson). W zależności od cech surowca rybnego, okresu połowu i metody marynowania marynaty otrzymane ze filetów zamrożonych-rozmrożonych mogą mieć gorszą lub lepszą ocenę sensoryczną w porównaniu do marynat ze śledzi niemrożonych (Szymczak, M. 2011. Comparison of physicochemical and sensory changes in fresh and frozen herring (Clupea harengus L.) during marinating. Journal of the Science of Food and Agriculture, 91,68-74). Przemysł często wykorzystuje mrożenie śledzi przed marynowaniem, nie tylko z powodu przepisów związanych z larwami Anisakis (Rozp. WE nr 853/2004, zał. III, sek. VIII, rozdz. III D, pkt 1-2), ale również aby zmiękczyć mięso i poprawić jakość marynat (Szymczak, M., Kamiński, P., Felisiak, K., Szymczak, B., Dmytrów, I., Sawicki, T. 2020. Effect of constant and fluctuating temperatures during frozen storage on quality of marinated fillets from Atlantic and Baltic herrings (Clupea harengus). LWT - Food Science and Technology, 133, 109961). Przedstawione wyniki pokazały, że proces mrożenia-rozmrażania może być zastąpiony przez 4 godziny składowania filetów w SPPT. Z kolei obróbka filetów MRS w SPPT od 4 do 16 godzin przyczyniła się do wzrostu oceny sensorycznej marynat do 4,76 punktu (Fig. 6), pomimo wzrostu TPA-twardości mięsa (Fig. 8A).

Marynaty (NTR+M) wyprodukowane z filetów nastrzykiwanych SPPT otrzymały jedną z najwyższych ocen 4,73 punktu w analizie sensorycznej, czyli zostały ocenione podobnie do marynat z filetów rozmrożonych (MRS+M) składowanych 8-24 godziny, i znacznie wyżej ocenione niż marynaty z filetów świeżych nawet po składowaniu w SPPT. Marynaty NTR+M i S+M nie posiadały negatywnych cech barwy i smaku pochodzących od hemoglobiny. Wyniki pokazały pozytywne zmiany w barwie filetów MRS+M 8-24 godziny, w których wzrosła jasność (L*) i jednocześnie obniżyła się czerwoność (a*) i żółtość (b*). Potwierdzeniem jest wartość różnicy barwy (AE) powyżej 3,0, co oznacza że różnica w barwie pomiędzy tymi próbami, a próbą kontrolną była zauważalna gołym okiem (Fig. 8B).

Na ocenę sensoryczną marynat składają się 4 wyróżniki, z których największy wpływ na ogólną pożądalność ma tekstura, w której oceniano 5 atrybutów, między innymi twardość. Twardość mięsa filetów przed i po marynowaniu zmierzono także metodą obiektywną, czyli testem TPA (Fig. 8A). Analiza tekstury wykazała, że TPA-twardość surowca (S-0h) wynosiła 2,2 N i podczas składowania surowca w SPPT nie uległa statystycznie istotnej zmianie. Podobnie brak wpływu SPPT na TPA-twardość nie zaobserwowano podczas składowania zamrożonych-rozmrożonych filetów (MRS), z wyjątkiem próby po 8 godzinach. Prawdopodobnie niższa TPA-twardość próby MRS 8h miała związek z dyfuzją wody z SPPT do mięsa filetów (Fig. 2B). Również w filetach nastrzykiwanych NTR nastąpiło nieistotne obniżenie TPA-twardości, które spowodowane było rozluźnieniem miomerów w skutek uszkodzenia tkanki mięśniowej podczas wstrzykiwania cieczy i wzrostu zawartości wody po iniekcji.

Po marynowaniu marynaty wytworzone z surowca S charakteryzowały się niższą twardością (4,2 N) niż marynaty z filetów mrożonych-rozmrożonych (5,74 N) (Fig. 8A). Wzrost twardości w MRS+M spowodowany był wyciekiem wody (Fig. 2B). Po 4 godzinach składowania w SPPT twardość marynat badanych obiektywną metodą uległa znacznemu obniżeniu do około 3,12 N, zarówno dla próby S+M, jak i MRS+M. Prawdopodobnie było to związane z wysoką aktywnością proteaz trawiennych (trypsyny i karboksypeptydazy A) (Fig. 3AB), katepsyny D (Fig. 4A) i jednocześnie wzrostem zawartości wody w filetach przed marynowaniem. Proteazy trawienne dyfundując z SPPT do mięśni śledzia rozłożyły część kolagenu i białek mięśniowych (m.in. miozyna, aktyna), które są głównie odpowiedzialne za twardość mięsa (Felberg, H.S., Slizyt’e, R., Mozuraityte, R., Dahle, S.W., Olsen, R. L., & Martinez, I. 2009. Proteolytic activities of ventral muscle and intestinal content of North Sea herring ( Clupea harengus) with full and emptied stomachs. Food Chemistry, 116, 40-60.). Wynikiem aktywności tych enzymów był wzrost zawartości produktów hydrolizy białek (Fig. 7AB). Wzrost udziału frakcji PHB(R) i PHB(A) koreluje z niższą twardością i poprawą oceny tekstury marynowanych filetów śledzia (Kamiński, P., Szymczak, M., Szymczak, B. 2022. The effect of previous storage condition on the diffusion and contribution of digestive proteases in the ripening of marinated Baltic herring (Clupea harengus). LWT - Food Science and Technology, 165, 1-10). W przypadku marynat z filetów nastrzykiwanych NTR+M mięso posiadało TPA-twardość pomiędzy próbami marynat S+M 0 godzin, a MRS+M 0 godzin, lub podobną do filetów MRS+M po 24 godzinach składowania w SPPT (Fig. 8A).

PL 248501 Β1

Tabela 1

Deskryptory i atrybuty stosowane podczas analizy sensorycznej mięsa marynat

Dcskryptor	Atrybut	Opis
Wygląd	Barwa Przebarwienia Kształt Rozwarstwienia Połysk	Od jasnej do ciemnej Przebarwienia, plamy Deformacja Przerw a między mięśniami lub miomerami Od matowej do połyskliwej
Zapach	Kwaśny Słodki Śledziowy Aminowy' Zjełczaly	Kwaśny, kwas octowy Słodki Typowy zapach świeżego śledzia Aminowy Utleniony7 olej rybi
Smak	Kwaśny Słony Słodki Zjełczaly Śledziowy	Kwaśny, kwas octowy Słony Słodki Utleniony olej ry bi Typowy smak świeżego śledzia
Tekstura	Spoistość Soczystość Twardość Elastyczność Ziarnistość	Siła potrzebna do rozprowadzenia mięsa w ustach Ilość soku wydzielanego podczas żucia, zdolność utrzymywania wody przez mięso podczas żucia Siła potrzebna do ściśnięcia próbki między- zębami trzonowymi Zdolność próbki do odzyskania kształtu po pierw szym ściśnięciu przez zęby trzonowe Wyczuwalność ziarnistości w próbce podczas żucia

Claims (4)

1. Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi o niskiej jakości technologicznej z wykorzystaniem proteaz trawiennych, znamienny tym, że przed marynowaniem przez 4 do 5 doby świeże lub mrożone-rozmrożone filety śledzia o niskiej jakości technologicznej składuje się w surowym preparacie proteaz trawiennych (SPPT) i/lub nastrzykuje się surowym preparatem proteaz trawiennych (SPPT), przy czym składowanie prowadzi się w warunkach chłodniczych od 1 do 24 godzin, w stosunku filety śledzia do surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) od 2 :1 do 1 :2 (masa : masa), zaś podczas nastrzykiwania stosuje się od 0,11 do 10% surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) względem masy filetów śledzia, przy czym stosuje się surowy preparat proteaz trawiennych (SPPT) otrzymany w sposób, że rozdrobnione przewody pokarmowe ryb miesza się z 1-10% wodnym roztworem etanolu w proporcji 1 :1-10 (masa : objętość), mieszaninę homogenizuje się, a następnie oddziela osad, przy czym przed dodaniem wodnego roztworu etanolu lub po oddzieleniu osadu po homogenizacji dodaje się NaCI do uzyskania jego końcowego stężenia co najmniej 3%, miesza się, a następnie oddziela się osad, aby po obu etapach uzyskać surowy preparat proteaz trawiennych z ryb.

2. Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi według zastrz. 1, znamienny tym, że nastrzykiwanie wykonuje się metodą mechaniczną lub ręczną z użyciem strzykawki z igłą o grubości 1,2 mm i długości 50 mm.

PL 248501 Β1

3. Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas otrzymywania surowego preparatu proteaz trawiennych (SPPT) do oddzielania osadu stosuje się filtrację swobodną lub wirowanie.

4. Sposób poprawy dojrzałości mięsa marynowanych śledzi według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas otrzymywania surowego preparatu proteaz trawiennych (SPPT) oba etapy prowadzi się w temperaturze chłodniczej.