PL249139B1

PL249139B1 - 6-Bromo-8-nitro-4’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawon i sposób wytwarzania 6-bromo-8-nitro-4’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawonu

Info

Publication number: PL249139B1
Application number: PL447068A
Authority: PL
Inventors: Martyna Perz; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2023-12-12
Filing date: 2023-12-12
Publication date: 2026-03-02
Also published as: PL447068A1

Abstract

6-Bromo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób wytwarzania 6-bromo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, który charakteryzuje się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-bromo-8-nitroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-bromo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 przedstawiony na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

6-Bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, zwłaszcza w zwalczaniu bakterii gram-dodatnich, jako związek wazoprotekcyjny oraz jako związek hepatoprotekcyjny stosowany zwłaszcza w preparatach farmaceutycznych.

Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1.5 ujawniony w literaturze (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8:13449).

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

Istotą wynalazku jest 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-bromo-8-nitroflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie.

6-Bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 4 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1.5, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przy C-4’. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz przy wykorzystaniu mikroorganizmu niebędącego patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 6-bromo-8-nitroflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 4 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

PL 249139 Β1

Na tej drodze otrzymuje się 4,3 mg 6-bromo-8-nitro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 (wydajność 5,53%). Stopień konwersji substratu według HPLC > 95%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-ds)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz]	H
7,00 (s)		3	5,12 (d)	7,8	1”
8,50 (d)	2,5	5	3,51 (m)		2”
8,64 (d)	2,5	7	3,66 (m)		3”
8,10 (m)		2’	3,24 (m)		4”
8,10 (m)		6’	3,57 (m)		5”
7,28 (m)		3’	3,88 (m) 3,70 (m)		6”
7,28 (m)		5’	4,79 (d)	3,3	C2”-OH
			4,50 (d)	3,5	C3”-OH
			3,85 (m)		C6”-OH
			3,57 (s)		C4”-OCH3

Wykonane badania modelowania aktywności 6-bromo-8-nitro-4’-O-/l-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu przy użyciu platformy Way2Drug antiBac-Pred wykazały, że związek może hamować wzrost bakterii patogennych takich jak Pseudomonas fluorescens (z prawdopodobieństwem 41%) czy Listeria monocytogenes (z prawdopodobieństwem 30%). Szczepy bakterii P. fluorescens mogą powodować zakażenia dróg oddechowych i moczowych, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, kości, szpiku, stawów, oka lub ucha. Dla chorych osób z upośledzoną odpornością mogą powodować ciężkie schorzenia. Natomiast L. monocytogenes powoduje listeriozę, której głównymi objawami sąsepsa, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie mózgu, wrzód rogówki, zapalenie płuc. Analiza wykazała również, że niniejszy związek może hamować wzrost bakterii opornych na antybiotyki Acinetobacter pittii (z prawdopodobieństwem 51%), Mycobacterium ulcerans (z prawdopodobieństwem 47%) i Staphylococcus aureus subsp. aureus RN4220 (z prawdopodobieństwem 34%).

Badania in silico przy użyciu platformy PASS online wykazały, że związek może być inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glicerol z wysokim prawdopodobieństwem 91,5%. Glicerofosfotransferaza CDP-glicerol odpowiada za polimeryzację głównego łańcucha kwasu tejchojowego związanego ze ścianą komórkową bakterii gram-dodatnich. Kwas tejchojowy jest ważny w patogenezie i odgrywa kluczową rolę w oporności bakterii na antybiotyki. Kwasy tejchojowe (WTA) i przyłączone do nich podstawniki przyczyniają się do ładunku powierzchniowego i hydrofobowości komórki bakteryjnej, co z kolei wpływa na wiązanie cząsteczek pozakomórkowych. Wpływając na właściwości powierzchni komórek, WTA odgrywają zatem rolę w ochronie bakterii przed różnymi zagrożeniami i niekorzystnymi warunkami. W przypadku braku WTA bakterie są wrażliwe na wysokie temperatury i niezdolne do wzrostu w pożywkach o wysokiej zawartości soli, co wskazuje, że WTA są zaangażowane w tolerancję temperatury i stres osmotyczny. Dzięki temu 6-bromo-8-nitro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon może przyczynić się do zwalczania patogennych bakterii gram-dodatnich w organizmie człowieka (Brown, S., Santa Maria Jr, J. P., & Walker, S. (2013). Wall teichoic acids of gram-positive bacteria. Annual review of microbiology, 67, 313-336).

Według badań przeprowadzonych przez Lewin i wsp. zwiększenie rozpuszczalności w wodzie może powodować zaburzenie płaskości cząsteczek. Strategię tę zastosowano do niektórych naturalnych glikozydów flawonowych, zwłaszcza diosminy, wysoce nierozpuszczalnego flawonoidu przepisywanego jako doustny lek flebotropowy. Zakłócenie płaskości ugrupowania aglikonu przez 3-bromowanie lub chlorowanie, dając 3-bromo- i 3-chlorodiosminę, wykazało znaczny wzrost rozpuszczalności w porównaniu ze związkiem macierzystym (Lewin, Guy et al. Enhancement of the water solubility of flavone glycosides by disruption of molecular planarity of the aglycone moiety. Journal of Natural Products 76.1 (2013): 8-12). Badania te są zgodne z symulacjami przeprowadzonymi dla 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon przy zastosowaniu SwissADME, które wykazują, że związek jest rozpuszczalny, co stanowi potencjał w jego dalszym wykorzystaniu do badań w tym kierunku.

Badania in silico wykazały także, że związek może wykazywać właściwości wazoprotekcyjne (prawdopodobieństwo 74%), hepatoprotekcyjne (67%), przeciwreumatyczne (54%) czy chemoprewencyjne (50%).

Analiza 6-bromo-8-nitro-4’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu przy zastosowaniu programu SwissADME wykazała, że związek jest substratem glikoproteiny P (PGP+) co oznacza, że jest aktywnie wypompowywany z centralnego układu nerwowego do krwi. Według wykresu „BOILED-Egg” związek według przewidywań będzie biernie wchłaniany w przewodzie pokarmowym.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 6-Bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2.
2. Sposób wytwarzania 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-bromo-8-nitroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-bromo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w piątym paśmie od linii startu.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg :1 cm³.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 4 dni.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie rozwijającym chloroform:metanol w stosunku objętościowym 9:1.