PT1189622E

PT1189622E - ''polímeros aniónicos utilizados como agentes ligantes de toxina e agentes antibacterianos''

Info

Publication number: PT1189622E
Application number: PT00930620T
Authority: PT
Inventors: Stephen C Schmitt
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2007-10-08
Also published as: CA2374108A1; PL352411A1; WO2000069428A3; EP1189622A2; ES2288855T3; DK1189622T3; US6270755B1; AU4840900A; IL146211A; IL146211A0; WO2000069428A2; TW592704B; KR100742433B1; NZ515226A; RU2246938C2; MY132695A; PL197157B1; EP1189622B1; HUP0201114A2; ATE367818T1

Description

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DESCRIÇÃO "POLÍMEROS ANIÓNICOS UTILIZADOS COMO AGENTES LIGANTES DE TOXINA E AGENTES ANTIBACTERIANOS"

Pedido Relacionado

Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido U.S. N°: 09/541.268, depositado em 3 de Abril de 2000 e o beneficio do Pedido Provisório N°: 60/133.875, depositado em 13 de Maio de 1999, cujo teor aqui é dado como integralmente incorporado por citação.

Antecedentes da Invenção

Muito agentes patogénicos produzem toxinas que são nocivas e, em alguns casos, letais, ao organismo hospedeiro. As toxinas produzidas por agentes patogénicos podem ser classificadas em duas categorias genéricas, exotoxinas e endotoxinas.

As exotoxinas, de um modo geral, são proteínas ou polipéptidos. Estas toxinas, que são segregadas pelo agente patogénico, podem viajar dentro do hospedeiro e provocar danos em regiões do hospedeiro distantes do local da infecção. Os sintomas associados com as exotoxinas variam muito e incluem hemólise, choque sistémico, destruição de leucócitos, vómito, paralisia e diarreia. 2

As enterotoxinas são exotoxinas que actuam sobre o intestino delgado e provocam uma secreção maciça de fluido no lúmen intestinal, levando à diarreia. As enterotoxinas são produzidas por uma variedade de bactérias, incluindo os organismos que provocam intoxicação alimentar Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e o Bacillus cereus e os agentes patogénicos intestinais Vibrio cholerae, Escherichia coli e Salmonella enteritidis.

As endotoxinas são lipopolissacáridos/lipoproteinas encontradas na camada externa das paredes celulares de bactérias gram-negativas. Estes lipopolissacáridos são ligados à membrana celular e são libertados mediante citólise. Os sintomas associados com a libertação das endotoxinas incluem febre, diarreia e vómito. Especificamente, as endotoxinas estimulam as células hospedeiras a libertar proteínas, pirogénios endógenos, que afectam a área do cérebro que regula a temperatura corporal. Para além da febre, diarreia e vómito, o animal hospedeiro pode ter uma rápida diminuição nos números de linfócitos, leucócitos e plaquetas, e entrar num estado inflamatório generalizado.

Embora as endotoxinas sejam menos tóxicas do que as exotoxinas, grandes doses de endotoxinas podem provocar a morte, geralmente por choque hemorrágico e necrose tecidual. Exemplos de bactérias que produzem endotoxinas incluem as bactérias do género Escherichia, Shigella e, especialmente, a Salmonella. 3

Em alguns casos, a doença activa causada por uma exotoxina pode ser tratada por meio da administração de uma antitoxina ao doente. Uma antitoxina compreende anticorpos contra a toxina derivada do soro de um animal, tipicamente um cavalo, que tenha sido imunizado por injecção de um toxóide, um derivado não tóxico da toxina. No entanto, a eficácia das antitoxinas é limitada porque as toxinas são rapidamente tomadas pela células e tornam-se indisponíveis aos anticorpos. Além disso, o sistema imunitário do doente pode responder a proteínas estranhas presentes na antitoxina, criando um estado conhecido como doença do soro. 0 Clostridium difficile tornou-se um dos organismos mais comuns adquiridos de forma nosocomial em hospitais e instituições de cuidados de saúde prolongados. 0 organismo, tipicamente, infecta os doentes cuja flora intestinal normal foi perturbada pela administração de um antibiótico de largo espectro. A diarreia e a colite inflamatória associadas com a infecção representam uma grave complicação médica/cirúrgica que leva a morbidade e mortalidade aumentadas e prolongam as permanências no hospital por uma média de aproximadamente três semanas. Isto é especialmente verdadeiro para os idosos e para os doentes com doenças subjacentes graves que são os mais prováveis de desenvolver a infecção. A diarreia associado com o C. difficile (CDAD) representa uma importante carga económica para o sistema de saúde, estimado, de forma conservadora, em 3-6 mil milhões de dólares por ano em custos hospitalares excedentes só nos Estados Unidos.

Actualmente, os tratamentos para a CDAD são 4 inadequados. Tais tratamentos incluem descontinuar o antibiótico que provocou a CDAD para manifestar e permitir que a flora colónica normal se recupere o mais rapidamente possível. Na maioria dos casos, no entanto, isto não é suficiente e ainda outro antibiótico, o metronidazol ou a vancomicina são utilizados para matar os organismos C. difficile. A melhora sintomática com metronidazol é lenta levando, tipicamente, de 4 a 8 dias. Além disso, pelo facto do metronidazol também alterar a flora normal erradicando a maior parte dos anaeróbios dos intestinos, 20% dos doentes tratados têm uma recidiva ou reincidência de CDAD, em geral, dentro de 1 a 2 semanas depois da interrupção da terapêutica. Nos casos graves ou reincidentes de CDAD, pode-se utilizar a vancomicina. No entanto, este fármaco tem uma taxa de recidiva semelhante à do metronidazol e também tem o potencial para o indesejável efeito secundário de provocar a selecção de enterococos e estafilococos multi-resistentes. A diarreia e a colite são um resultado directo do dano intestinal e inflamação causadas pelas Toxinas A e B do C. difficile. As Toxinas A e B produzidas pelo C. difficile danificam a mucosa intestinal e são os agentes etiológicos responsáveis pela colite inflamatória. Actualmente, não há terapêuticas disponíveis para inibir as toxinas bacterianas produzidas pelo C. difficile e que são responsáveis pela lesão e inflamação intestinais que levam à diarreia e colite. Os produtos farmacêuticos que podem inibir as Toxinas A e B são a abordagem mais lógica da terapêutica para CDAD.

Deste modo, existe uma necessidade de um método melhorado 5 para tratar um estado mediado por toxina que reduza ou elimine, de forma significativa, os problemas acima mencionados.

Sumário da Invenção

As caracteristicas essenciais e opcionais da presente invenção estão apresentadas nas reivindicações principais e sub-reivindicações anexas, respectivamente. Deste modo, em geral, a presente invenção relaciona-se com um método para inibir uma toxina num animal, tal como um ser humano, administrando ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polímero tendo uma pluralidade de grupos funcionais ácidos pendentes que estão ligados à estrutura de base do polímero por meio de um grupo espaçador. 0 grupo espaçador pode ter um comprimento na gama de 0 a cerca de 20 átomos. A toxina é, tipicamente, uma exotoxina segregada por um microrganismo patogénico, tal como uma bactéria. Numa forma de realização preferida, o polímero é substancialmente livre de anidridos ácidos.

Estão também aqui descritas composições farmacêuticas compreendendo polímeros aniónicos e métodos para o tratamento da CDAD e outras diarreias associadas a antibiótico (AAD) em mamíferos e, particularmente, em seres humanos. As composições terapêuticas da invenção, preferencialmente, tornam inactivas ambas as Toxinas A e B do C. difficile e são altamente eficazes na prevenção do desenvolvimento da CDAD (tratamento profilático), bem como para prevenir a reincidência e a recidiva da CDAD quando utilizadas como uma monoterapêutica ou quando utilizadas como co-terapêutica com antibióticos (por exemplo, o metronidazol e a vancomicina).

Os polímeros utilizados nos métodos descritos são substituídos por grupos funcionais ácidos seleccionados dos grupos ácido carboxílico, ácido sulfónico, ácido fosfónico, hidrossulfato, hidrofosfato, ácido sulfâmico e ácido borónico. Os grupos ácidos também podem estar presentes na forma de base conjugada em combinação com um catião adequado.

Numa forma de realização, o polímero a ser administrado é um copolímero caracterizado por um primeiro monómero ou unidade de repetição tendo um grupo funcional ácido pendente e um segundo monómero ou unidade de repetição tendo um grupo hidrófobo pendente. Noutra forma de realização, o polímero é caracterizado por um monómero ou unidade de repetição tendo tanto um grupo funcional ácido pendente como um grupo hidrófobo pendente. 0 polímero a ser administrado pode, opcionalmente, ser ainda caracterizado por um monómero ou unidade de repetição compreendendo um grupo hidrófilo neutro, tal como um grupo hidroxilo ou um grupo amida.

As composições terapêuticas preferidas para utilização nos métodos da invenção compreendem o poli(estirenossulfonato) e os seus sais. Os métodos preferidos da invenção incluem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção a um doente também como uma co-terapêutica com o antibiótico de largo espectro o que pode, por outro lado, precipitar o aparecimento da CDAD ou AAD, não fora pela presença da 7 composição contendo poliestireno da invenção. A co-terapêutica com um antibiótico de largo espectro não interferirá com a eficácia do antibiótico, mas, ao mesmo tempo, evitará o aparecimento da CDAD ou AAD.

Numa outra forma de realização, as composições da invenção podem ser utilizadas tanto sós como uma monoterapêutica, ou como uma co-terapêutica com metronidazol, vancomicina ou outros antibióticos utilizados para tratar a CDAD ou AAD, depois do aparecimento da doença. Em ainda outra forma de realização, as composições da invenção podem ser utilizadas sós ou como uma co-terapêutica com outros antibióticos para evitar a reincidência ou a recidiva da doença. A presente invenção tem muitas vantagens. Por exemplo, as composições utilizadas nos métodos da invenção são facilmente preparadas utilizando técnicas padrão de síntese de polímero e materiais de partida económicos. Os métodos da invenção, de um modo geral, não interferem com os antibióticos de largo espectro muitas vezes necessários para tratar outras infecções do corpo e, deste modo, podem ser utilizados em associação com antibióticos de largo espectro. Além disso, o doente pode ser protegido, simultaneamente, contra os efeitos secundários adversos de tais antibióticos de largo espectro que muitas vezes levam à CDAD ou AAD quando os reqimes de tratamento profiláticos da invenção são utilizados em associação com a administração ao doente de antibióticos de largo espectro. Do mesmo modo, os regimes de tratamento da invenção, de um modo geral, no interferem com 8 as acções do metronidazol ou da vancomicina e podem, deste modo, também ser utilizados em associação com tais tratamentos depois do aparecimento da doença ou depois do tratamento, a fim de evitar a reincidência e a recidiva da doença. Adicionalmente, as composições e métodos da invenção podem ser utilizados como uma monoterapêutica para evitar o aparecimento da doença (pofilático), para tratar a doença após o aparecimento ou para evitar a recidiva. A monoterapêutica de acordo com a invenção é particularmente vantajosa quando os doentes não podem tolerar regimes de antibióticos.

Breve Descrição dos Desenhos 0 acima mencionado e outros objectivos, características e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição mais especifica a seguir das formas de realização preferidas da invenção, conforme ilustrada nos desenhos associados nos quais os caracteres de referência iguais referem-se às mesmas partes por todas as vistas diferentes. Os desenhos não estão necessariamente à escala, sendo colocada ênfase, ao contrário, em ilustrar os principios da invenção.

As Figuras 1 e 2 descrevem os efeitos do sulfonato de poliestireno (160-246) sobre a Toxina A em dois modelos de hamsters, descritos em mais pormenor adiante. 9

Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção relaciona-se com um método para inibir uma toxina patogénica ou microbiana num doente, tal como um ser humano, administrando ao doente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polímero compreendendo uma pluralidade de grupos funcionais ácidos pendentes. 0 grupo funcional ácido pode ser ligado à estrutura de base do polímero por meio de um grupo espaçador alifático tendo um comprimento de 1 a cerca de 20 átomos.

Conforma aqui utilizado, o termo "inibir uma toxina microbiana" refere-se a inibir a actividade de uma toxina que está associada com o desenvolvimento de um estado patológico ou estado médico, em particular. A toxina microbiana é uma endotoxina ou exotoxina produzida por um microrganismo, tal como uma bactéria, um fungo, um protozoário ou um vírus. A toxina pode ser inibida por meio de qualquer mecanismo, incluindo, mas não limitado à ligação da toxina pelo polímero. Conforme aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para inibir ou prevenir, parcial ou totalmente, o dano tecidual ou outros sintomas associados com a acção da toxina no interior ou sobre o corpo do doente ou para prevenir ou reduzir o progresso adicional de tais sintomas. A presente invenção proporciona métodos e composições farmacêuticas úteis para tratar a AAD, incluindo a CDAD, e a colite. Conforme aqui utilizado, o termo "tratar" as doenças da invenção inclui: o tratamento profilático daqueles 10 mamíferos susceptíveis à AAD, CDAD ou colite inflamatória; o tratamento do aparecimento inicial da AAD, CDAD ou colite inflamatória; o tratamento da AAD, CDAD ou colite inflamatória em progresso; e o tratamento da AAD, CDAD ou colite inflamatória reincidentes, em mamíferos susceptíveis. Conforme aqui utilizado, um mamífero "susceptível" é um mamífero capaz de desenvolver a doença ou tendo uma reincidência da doença por qualquer razão, incluindo a utilização de antibióticos de largo espectro que podem destruir a flora normal levando à CDAD. As composições terapêuticas da invenção compreendem preferencialmente, o sulfonato de poliestireno, seus sais e copolímeros. O termo "monómero", conforme aqui utilizado, refere-se tanto a uma molécula compreendendo um ou mais grupos funcionais polimerizáveis antes da polimerização, como a uma unidade de repetição de um polímero. Um copolímero é referido como caracterizado pela presença de dois ou mais monómeros diferentes.

Conforme aqui utilizado, o termo "estrutura de base do polímero" ou "estrutura de base" refere-se àquela porção do polímero que é uma cadeia contínua compreendendo as ligações que são formadas entre os monómeros depois da polimerização. A composição da estrutura de base do polímero pode ser descrita em termos da identidade dos monómeros dos quais a mesma é formada, sem consideração à composição de ramificações ou cadeias laterais, a partir da estrutura de base do polímero. Deste modo, o poli(ácido acrílico) é referido como tendo uma estrutura de base de poli(etileno) 11 que é substituída por grupos ácido carboxílico (-C(O)OH) como cadeias laterais.

Um grupo "pendente" é uma unidade que forma uma porção de uma cadeia lateral ligada à estrutura de base do polímero. 0 grupo pendente é ligado à estrutura de base do polímero por meio de um grupo espaçador. 0 monómero funcionalizado por ácido compreende um grupo funcional pendente, seleccionado de um grupo ácido carboxílico, um grupo ácido sulfónico, um grupo hidrossulfato, um grupo ácido fosfónico, um grupo ácido sulfámico, um grupo hidrofosfato ou um grupo ácido borónico. Os grupos funcionais ácidos são aqui referidos como a forma protonada do ácido ou a forma parcialmente protonada. No entanto, deve ser entendido que qualquer grupo funcional ácido também pode existir na forma de base conjugada ou forma desprotonada em combinação com um catião farmacologicamente aceitável. 0 polímero a ser administrado inclui grupos funcionais ácidos tanto na forma protonada, como na forma desprotonada ou uma combinação destas. Os catiões adequados incluem iões metálico alcalinos, tais como iões de sódio, potássio e césio, iões alcalino terrosos, tais como iões de cálcio e magnésio, iões metálicos de transição e iões de amónio não substituídos e substituídos (primários, secundários, terciários e quaternários). Numa forma de realização, o catião é um ião metálico polivalente, tal como 2+ 2 + Γ7 2d 71 η 3+ -r-j 3+ 2+ T-1 3 +

Ca , Mg , Zn , AI r Bi , Fe ou Fe . 0 polímero é substancialmente livre de grupos anidridos 12 ácidos. Por exemplo, menos de 5%, preferencialmente, menos de 2%. Mais preferencialmente, nenhum dos grupos funcionais ácidos no polímero estão presentes na forma anidrida. 0 grupo funcional ácido é ligado à estrutura de base do polímero por um grupo espaçador. 0 grupo espaçador é um componente da cadeia lateral do polímero e liga o grupo funcional ácido à estrutura de base do polímero. 0 grupo espaçador pode ser linear ou ramificado, alifático, aromático ou parcialmente aromático e parcialmente alifático. Os grupos espaçadores alifáticos adequados incluem os grupos hidrocarbilo normais ou ramificados, saturados ou parcialmente insaturados, incluindo os grupos alquileno, por exemplo, os grupos polimetileno, tais como -(CH2)n~, em que n é um número inteiro de 1 a cerca de 20 e grupos cicloalquileno, tais como o grupo 1,4-ciclo-hexileno. O grupo alquileno pode estar substituído ou não substituído. Os substituintes adequados de alquileno incluem os grupos hidroxilo e átomos de halogéneo, por exemplo, átomos de flúor, cloro e bromo. Opcionalmente, o grupo alquileno também pode ser interrompido num ou mais pontos por um heteroátomo, tal como um átomo de oxigénio, azoto ou enxofre. Exemplos incluem os grupos oxaalquileno, por exemplo, (CH2) 2O [ (CH2) 2O] n (CH2) 2", em que n é um número inteiro variando de 0 a cerca de 3. 0 grupo espaçador também pode ser um grupo parcialmente insaturado, tal como um grupo alcenileno C2-C2o substituído ou não substituído ou um grupo alcenileno C2-C2o interrompido num ou mais pontos por um heteroátomo. Os grupos espaçadores aromáticos adequados incluem os grupos orto-, meta-, e para-fenileno, os grupos naftaleno e os grupos 13 bifenileno.

Numa forma de realização, pelo menos uma porção das unidades de repetição no polímero incluem ainda um grupo hidrófobo pendente. 0 grupo hidrófobo pendente pode ser um grupo hidrocarbilo C2-C24 substituído ou não substituído, saturado ou parcialmente insaturado ou um grupo arilalguilo substituído ou não substituído. Exemplos de substituintes de alquilo incluem átomos de halogéneo, tais como átomos de flúor ou cloro e grupos arilo, tais como um grupo fenilo. Os substituintes de arilo podem incluir átomos de halogéneo, grupos alquilo C1-C6 e grupos alcoxilo C1-C6. Preferencialmente, o grupo hidrófobo pendente é um grupo alquilo C2-C24 normal ou ramificado.

Numa forma de realização, o polímero a ser administrado é um homopolímero. Noutra forma de realização, 0 polímero a ser administrado é um copolímero que é caracterizado por um monómero funcionalizado por ácido e um monómero hidrófobo. 0 termo "monómero hidrófobo", conforme aqui utilizado, é um monómero que compreende um grupos hidrófobo pendente, conforme descrito acima. Os monómeros hidrófobos adequados incluem, mas não são limitados a uma alquilacrilamida C3-C24 substituída ou não substituída, tal como N-n-decilacrilamida e N-isopropilacrilamida; alquilacrilatos C3-C24 substituídos ou não substituídos, tais como n-butilacrilato e n-decilacrilato; estireno e estirenos substituídos, tais como pentafluoroestireno e 4-fluoroestireno; vinilnaftaleno e vinilbifenilo. 0 copolímero pode ter uma ampla gama de composições, compreendendo, por exemplo, de cerca de 10% 14 molar a cerca de 50% molar do monómero hidrófobo e de cerca de 90% molar a cerca de 50% molar do monómero funcionalizado por ácido.

Numa forma de realização preferida, o polímero a ser administrado é caracterizado por uma unidade de repetição que compreende um grupo funcional ácido. Nesta forma de realização, não serão conectados dois grupos funcionais ácidos no polímero a átomos da estrutura de base do polímero. Numa forma de realização, o polímero a ser administrado é caracterizado por uma unidade de repetição ou monómero da fórmula geral (CR1CHR2)-

X

Y em que X é um grupo espaçador, conforme descrito acima, ou uma ligação directa, Ri e R2, são, cada, independentemente, hidrogénio ou um grupo alquilo, preferencialmente, metilo ou etilo, e Y é um grupo funcional ácido. Exemplos de monómeros adequados deste tipo incluem ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido vinilsulfónico, ácido vinilfosfónico, ácido 3-aliloxi-2-hidroxi-l-propanossulfónico, ácido vinilacético e ésteres de álcool vinílico e álcool alílico com ácidos minerais, tais como ácidos sulfúrico, fosfórico e 15 bórico, incluindo hidrossulfato de vinilo, di-hidrofosfato de vinilo, hidrossulfato de alilo, di-hidrofosfato de alilo e bases conjugadas destes. 0 monómero também pode ser alceno polimerizado que está substituído por um grupos funcional ácido, tal como o ácido undecenóico, hidrossulfato de undecenilo e ácido undecenil sulfónico. Outros exemplos adequados incluem estireno funcionalizado por ácido, tal como sulfonato de estireno, fosfonato de estireno e ácido vinilbenzóico, vinilnaftaleno funcionalizado por ácido, tal como sulfonato de vinilnaftaleno e vinilbifenilo funcionalizado por ácido, tal como sulfonato de vinilbifenilo.

Numa outra forma de realização, o polímero a ser administrado é caracterizado por uma unidade de repetição ou monómero da fórmula geral -(CR1CHR2)-

0“C

I z

X l

Y em que Z é oxigénio ou NH e X é um grupo espaçador, conforme descrito acima. Y é o grupo funcional ácido e Ri e R2, são, cada, independentemente, hidrogénio ou um grupo alquilo, 16 preferencialmente, metilo ou etilo. Exemplos de monómeros adequados deste tipo incluem o ácido 2-acrilamidoglicólico e o ácido 2-acrilamido-2-metil-l-propanossulfónico.

Os copolimeros adequados para utilização no presente método incluem os copolimeros de ácido acrílico e um alquilacrilato C2-C2Q, tal como poli(ácido-co-n-decilacrilato acrílico) e poli(ácido-co-n-butilacrilato acrílico). Estão também incluídos os copolimeros do ácido acrílico e uma alquilacrilamida N-C2-C2(u tal como o poli (ácido-co-N-isopropilacrilamida acrílico) e o poli(ácido-co-N-n-decilacrilamida acrílico) e copolimeros do ácido acrílico com estireno ou um estireno substituído, tal como o pentafluoroestireno ou o 4-fluoroestireno.

Noutra forma de realização, o polímero a ser administrado é um copolímero compreendendo um monómero funcionalizado por ácido, um monómero hidrófobo e um monómero hidrófilo neutro. Um monómero hidrófilo neutro é um monómero que compreende um grupo polar que não é apreciavelmente ácido nem apreciavelmente básico ao pH fisiológico. Exemplos de monómeros hidrófilos neutros adequados incluem acrilamida, N-(2-hidroxietil)acrilamida, N-(3-hidroxpropil)acrilamida, 2-hidroxietilacrilato, acetato de vinilo, álcool vinílico e N-vinilpirrolidona. Um copolímero adequado deste tipo é o terpolímero poli(ácido-co-n-decilacrilato-co-acrilamida acrílico). 0 polímero a ser administrado também pode ser caracterizado por uma unidade de repetição compreendendo 17 tanto um grupo hidrófobo pendente como um grupo funcional ácido pendente. Os grupos hidrófobos adequados e os grupos funcionais ácidos adequados incluem aqueles discutidos acima. Os polímeros deste tipo incluem poli(ácido 2-alquilacrilico), em que o grupo alquilo compreende de 2 a cerca de 24 átomos de carbono. Um polímero adequado deste tipo é o poli(ácido 2-etilacrílico) ou uma base conjugada deste. 0 polimero a ser administrado também pode compreender um primeiro monómero tendo um grupo hidrófobo pendente e um grupo funcional ácido pendente e um segundo monómero neutro, hidrófilo, tal como os monómeros hidrófilos neutros previamente discutidos.

Numa forma de realização, o polimero a ser administrado compreende uma primeira unidade de repetição que compreende um grupo funcional ácido pendente e uma segunda unidade de repetição que compreende um derivado do ácido pendente, tal como um grupo amida ou um grupo éster. Exemplos adequados de polímeros deste tipo incluem poli(estirenossulfonato) , em que uma porção dos grupos sulfonato foi convertida em grupos sulfonamida ou éster sulfonato e poliacrilato, em que uma porção dos grupos carboxilato foi convertida em amida ou grupos éster. As propriedades do polímero podem variar variando a quantidade e características químicas dos grupos introduzidos no polímero por meio do processo de amidação ou esterificação. Numa forma de realização, o polímero compreende unidades de repetição tendo grupos éster pendentes, onde o grupo éster é derivado de um álcool, tal como mentol, um ácido biliar, tal como o ácido eólico ou o ácido litocólico, ou um alcanol, tal como um alcanol C4-C12 normal ou ramificado. Numa outra forma de realização, o 18 polímero compreende unidades de repetição tendo grupos amida pendentes, onde os grupos amida são derivados de uma amina, tal como uma alquilamina, por exemplo, uma alquilamina C4-C12 normal ou ramificada ou uma amonioalquilamina. As amonioalquilaminas adequadas incluem os compostos de fórmula R1 (R2) (R3)N+(CH2)nNH2, onde R1, R2 e R3 são cada, independentemente, hidrogénio, um grupo alquilo C1-C12 ou um grupo arilalquilo, e n é um número inteiro de 1 a cerca de 12.

Noutra forma de realização, o polímero a ser administrado é um copolímero compreendendo um monómero funcionalizado por ácido ou uma unidade de repetição, uma unidade de repetição catiónica e, opcionalmente, uma unidade de repetição hidrófoba e/ou uma unidade de repetição hidrófila. Por exemplo, a unidade de repetição funcionalizada por ácido, hidrófoba e neutra hidrófila pode incluir qualquer uma das unidades de repetição destes tipos discutidos acima. A unidade de repetição catiónica leva uma carga positiva sob condições fisiológicas e, preferencialmente, inclui um grupo amino ou amónio pendente. As unidades de repetição adequadas deste tipo incluem aquelas discutidas no pedido de patente U.S. Série N° 08/934.495, que aqui é dado como integralmente incorporado por citação. Os exemplos de unidades de repetição catiónica adequadas incluem alilamina N-substituída, alilamina quaternizada, dialilamina, dialilamina N-substituída, dialilamina quaternizada, vinilamina, vinilamina N-substituída, vinilamina quaternizada, N-aminoalilacrilamida e metacrilamida, N-amonioalquilacrilamida e -metacrilamida, aminoalquilacrilato e -metacrilato e amonioalquilacrilato e - 19 metacrilato. Δ proporção de unidades de repetição aniónica e catiónica pode variar amplamente, por exemplo, de cerca de 95% de monómero aniónico e 5% de monómero catiónico em relação aos monómeros totais carregados no polímero, a cerca de 5% de monómero aniónico e 95% de monómero catiónico em relação ao monómeros totais carregados, preferencialmente, 75% ou mais dos monómeros são aniónicos.

Os polímeros preferidos da invenção incluem, mas não se limitam a: poli(propenossulfato) , poli(pentenossulfato) , poli(heptenossulfato) , poli (nonenossulfato), poli(undecenossulfato) , poli (butenossulfato) , poli (hexenossulfato), poli (octenossulfato), poli(decenossulfato), poli(dodecenossulfato) poli(propenossulfonato) , poli (pentenossulfonato) , poli (heptenossulfonato), poli (nonenossulfonato), poli(undecenossulfonato) , poli poli (butenossulfonato), poli (hexenossulfonato) , poli (octenossulfonato), poli(decenossulfonato) , cenossulfonato) poli(propenofosfato) , poli (pentenofosfato), poli (heptenofosfato), poli (nonenofosfato), poli(undecenofosfato) , poli poli(butenofosfato) , poli(hexenofosfato), poli (octenofosfato), poli(decenofosfato) , (dodecenofosfato) poli (propenofosfonato) , poli (butenofosfonato), 20 20 poli (pentenofosfonato), poli (heptenofosfonato) , poli (nonenofosfonato), poli(undecenofosfonato) , poli(hexenofosfonato) , poli (octenofosfonato), poli(decenofosfonato) , poli(dodecenofosfonato) poli (estirenossulfonato), poli(estirenossulfato) , poli (estirenossulfanilato) , poli(sulfofenilalanina) , poli (tirosinassulfato), poli(sulfofenetilacrilamida) , poli (sulfofenetilmetacrilamida), poli (vinilnaftalenossulfonato) , poli(vinilnaftalenossulfato) , poli (vinilbifenilsulfonato), poli(vinilbifenilsulfato), poli(anetolossulfonato) , poli(ácido vinilbenzóico) poli(sulfofenilpropeno), poli(sulfofenilbuteno) , poli(sulfofenilpenteno), poli(sulfofenil-hexeno), poli (sulfofenil-hepteno), poli(sulfofenilocteno), poli(sulfofenilnoneno), poli(sulfofenildeceno) , poli (sulfofenilundeceno), poli(sulfofenildodeceno) poli (sulfatofenilpropeno) , poli (sulfatofenilpenteno) , poli (sulfatofenilhepteno) , poli (sulfatofenilnoneno) , poli (sulfatofenilundeceno) , poli (fosfofenilpropeno), poli (fosfofenilpenteno) , poli (fosfofenilhepteno), poli (fosfofenilnoneno), poli (fosfofenilundeceno) , poli (sulfatofenilbuteno), poli (sulfatofenilhexeno) , poli(sulfatofenilocteno) , poli (sulfatofenildeceno) , poli (sulfatofenildodeceno) poli (fosfofenilbuteno) , poli (fosfofenilhexeno), poli (fosfofenilocteno), poli(fosfofenildeceno) , poli (fosfofenildodeceno) 21 21 poli (fosfatofenilpropeno) , poli (fosfatofenilpenteno) , poli (fosfatofenilhepteno) , poli (fosfatofenilnoneno), poli (fosfatofenilundeceno) , poli (fosfatofenilbuteno), poli (fosfatofenilhexeno) , poli (fosfatofenilocteno), poli (fosfatofenildeceno) , poli (fosfatofenildodeceno) poli(vinilfenil cetona) sulfonada, poli (fenilsulfona) sulfonada, poli(4-metilestireno) sulfonado, poli(a-metilestireno) sulfonado, poli (estireno bloco-óxido de etileno-bloco-estireno)sulfonado, poli(óxido de etilenobloco-estireno bloco-óxido de etileno)sulfonado, poli(4-metoxiestireno)sulfonado, poli (difenoxifosfazeno)sulfonado, poli(óxido de etileno-bloco-estireno)sulfonado, poli (estireno-bloco-etileno)sulfonado, poli(acenaftileno) sulfonado, poli (vinilcarbazole)sulfonado, poli(estireno-co-butadieno)sulfonado, poli (estireno-bloco-(etileno-co-butileno)-bloco-estireno) sulfonado poli(ácido estirenossulfonato-co-maleico) , poli(ácido estirenossulfonato-co-acrilico) , poli(ácido estirenossulfonato-co-metacrílico) , poli(estirenossulfonato-co-acrilamidometilpropanossulfonato) , poli(ácido estirenossulfonato-co-itacónico), poli(ácido estirenossulfonato-co-vinilbenzóico) poli(cloreto de estirenossulfonato-co-dialilmetilamónio), estirenossulfonato-co-poli(estirenossulfonato-co- poli(cloreto de estirenossulfonato-co-dialildimetilamónio), poli(cloreto de dialilmetiloctilamónio), 22 alilamina), poli(estirenossulfonato-co-vinilamina), poli (cloreto de estirenossulfonato-co- vinilbenziltrimetilamónio) poli(estirenossulfonato-co-estireno) , poli(estirenossulfonato-co-octilestirenossulfonamida), poli(estirenossulfonato-co-mentilestirenosulfonato) , poli (estirenosulfonato de ácido estirenossulfonato-co-litocólico).

Os polímeros em utilização no presente método podem ser lineares ou reticulados. 0 polímero pode ser reticulado, por exemplo, pela incorporação no polímero de um co-monómero multifuncional. Os co-monómeros multifuncionais adequados incluem diacrilatos, triacrilatos e tetraacrilatos, dimetacrilatos, diacrilamidas, dialilacrilamida, di(metacrilamidas), trialilamina e ião de tetraalquilamónio. Exemplos específicos incluem diacrilato de etilenoglicol, diacrilato de propilenoglicol, diacrilato de butilenoglicol, dimetacrilato de etilenoglicol, dimetacrilato de butilenoglicol, metileno bis(metactilamida) , etileno bis(acrilamida) , etileno bis(metacrilamida), etilideno bis (acrilamida), etilideno bis(metacrilamida), pentaeritritol tetracrilato, triacrilato de trimetilolpropano, dimetacrilato de bisfenol A e diacrilato de bisfenol A. Outros monómeros multifuncionais adequados incluem polivinilarenos, tais como o divinilbenzeno. A quantidade de agente de reticulação é, tipicamente, entre cerca de 1,0% e cerca de 30% em peso, em relação ao peso do polímero, preferencialmente, de cerca de 5% a cerca de 25% em peso. 23 0 polímero também pode ser reticulado subsequentemente à polimerização. Por exemplo, uma porção dos grupos funcionais ácidos pode ser convertida a um derivado reactivo, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, os grupos ácido carboxílico e ácido sulfónico reagem com cloreto de tionilo para produzir, respectivamente, os grupos cloreto de acilo e cloreto de sulfonilo. Estes grupos reactivos podem, então, ser reagidos com uma diamina, um diálcool ou um amino álcool, preferencialmente a diamina, um diálcool ou um álcool amino, em que o amino e/ou os grupos hidroxilo são separados por uma cadeia de alquileno, tal como uma cadeia de alquileno C3-C18. Esta reacção resulta na formação de éster e/ou grupos amida numa certa cadeia polimérica que são ligados a grupos semelhantes em cadeias poliméricas adjacentes. A extensão da reticulação pode ser controlada, por exemplo, controlando a fracção dos grupos funcionais ácidos que são convertidos em grupos reactivos. 0 peso molecular do polímero não é crítico, mas, preferencialmente, é adequado para o modo pretendido de administração e permite que o polímero alcance e permaneça no interior de região alvo do corpo. Por exemplo, um método para tratar uma infecção intestinal deve utilizar um polímero de peso molecular ou grau de reticulação suficientemente alto para resistir a absorção, parcial ou completamente, desde o tracto gastrointestinal para outras partes do corpo. Preferencialmente, se for linear, o polímero a ser administrado tem um peso molecular que varia de cerca de mais de 1 a cerca de 1 milhão de Daltons ou mais, tal como 2.000 24

Daltons a cerca de 500.000 Daltons, 5.000 Daltons a cerca de 150.000 Daltons ou cerca de 25.000 Daltons a cerca de 1 milhão de Daltons. Alternativamente, o peso molecular pode ser de cerca de 100.000 a cerca de 1 milhão ou entre cerca de 400.000 a cerca de 1 milhão de Daltons.

Preferencialmente, os polímeros de utilização no presente método são, substancialmente, não biodegradáveis e não absorvíveis. Isto é, sob condições fisiológicas os polímeros não se decompõem em fragmentos que são absorvíveis por tecidos corporais. Preferencialmente, os polímeros têm uma estrutura de base não hidrolizável, que é substancialmente inerte sob condições encontradas na região alvo do corpo, tal como no tracto gastrointestinal. Um polímero particularmente preferido é o sulfonato de poliestireno. Preferencialmente, o polímero é um polímero de sulfonato de poliestireno, solúvel, não reticulado tendo um peso molecular entre cerca de 400.000 e 1 milhão de Daltons, tal como 600.000 Daltons. Alternativamente, as estruturas de base do polímero que são adequadas para a presente invenção incluem poliacrilamida, poliacrilato, poli(vinilo) e poli(etilenoimina), estruturas de base de poliestireno. Um copolímero da presente invenção pode compreender uma combinação de dois ou mais destes elementos da estrutura de base. O polímero a ser administrado também pode ser um polímero de condensação, tal como uma poliamida ou um poliéster. A quantidade de um dado polímero a ser administrado será determinada individualmente e será determinada, pelo 25 menos em parte, levando em consideração o tamanho do indivíduo, a identidade do organismo patogénico conhecido ou suspeitado, a gravidade dos sintomas a serem tratados e o resultado desejado. 0 polímero pode ser administrado só ou numa composição farmacêutica compreendendo o polímero e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmacologicamente aceitáveis. A composição farmacêutica também pode, opcionalmente, incluir um ou mais fármacos adicionais, tais como antibióticos, agentes anti-inflamatórios ou analgésicos. 0 polímero pode ser administrado por via subcutânea ou outra injecção, por via intravenosa, tópica, oral, parentérica, transdérmica ou rectal através de tubo de alimentação. Preferencialmente, o polímero ou a composição farmacêutica compreendendo o polímero é administrada por via oral. A forma na qual o polímero é administrado, por exemplo, em pó, comprimido, cápsula, solução ou emulsão dependerá da via pela qual é administrado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada numa dose única ou numa série de doses separadas por intervalos de tempo apropriados, tais como horas.

Para a administração oral, os polímeros podem ser administrados numa dosagem de cerca de 0,1 a 10 g/Kg/dia e, mais preferencialmente, de 1,0 - 7,0 g/Kg/dia e, ainda mais preferencialmente, de 2,0 a 6,6 g/Kg/dia. O polímero também pode ser administrado em associação com um ou mais agentes anti-microbianos, por exemplo, seleccionados de entre antibióticos que são conhecidos na 26 técnica. 0 antibiótico a ser administrado, de um modo geral, é seleccionado com base na identidade ou identidade suspeita do microrganismo patogénico, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, se o microrganismo patogénico for um C. parvum, um antibiótico adequado que pode ser administrado em associação com o polímero é a paromomicina. 0 polímero e o agente anti-microbiano podem ser administrados simultaneamente, por exemplo, em formas de dosagem separadas ou numa forma de dosagem única, ou em sequência separada por intervalos de tempo apropriados. oxacilina e 0 termo "agente anti-microbiano" destina-se a incluir agentes anti-bacterianos, agentes anti-fúngicos, anti-sépticos e outros. Agentes anti-microbianos adequados são conhecidos na técnica e incluem isoniazid, rifampin, pirazinamida, etambutol, eritromicina, vancomicina, tetraciclina, cloranfenicol, sulfonamidas, gentamicina, amoxicilina, penicilina, estreptomicina, ácido p-aminosalicíclico, claritromicina, clofazimina, minociclina, sulfonamidas, etionamida, cicloserina, canamicina, amicacina, capreomicina, viomicina, tiacetazona, rifabutina e as quinolonas, tais como a ciprofloxacina, ofloxacina e esparfloxicina. 0 termo "agente anti-bacteriano" inclui, mas não é limitado a: antibióticos que ocorrem naturalmente produzidos por microrganismos para suprimir o desenvolvimento de outros microrganismos e agentes sintetizados ou modificados no laboratório que têm seja actividade bactericida ou bacteriostática, por exemplo, agentes antibacterianos β-lactam incluindo, por exemplo, carbencilina; ampicilina, cloxacilina, 27 pieracilina, cefalosporinas e outras cefens incluindo, por exemplo, cefaclor, cefamandole, cefazolina, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, ceftazidima, ceftriazona e carbapenens incluindo, por exemplo, imipenem e meropenem; e glicopéptidos, macrólidos, quinolonas (por exemplo, o ácido nalidixico), tetraciclinas, aminoglicósidos (por exemplo, Gentamicina e Paromomicina) e ainda inclui agentes anti-fúngicos. De um modo geral, se um agente anti-bacteriano for bacteriostático, significa que o agente, essencialmente, interrompe o desenvolvimento celular bacteriano (mas não mata as bactérias); se o agente for bactericida, significa que o agente mata as células bacterianas (e pode interromper o desenvolvimento antes de matar as bactérias).

Deste modo, os polimeros e as composições aqui descritas podem ser utilizadas em medicina, por exemplo, na preparação de um medicamento para as terapêuticas e os tratamentos aqui descritos.

Numa forma de realização, o polímero que compreende uma pluralidade de grupos funcionais pendentes é administrado em combinação com um polímero catiónico, preferencialmente, um polímero que compreende grupos amino e/ou amónio. Exemplos de polímeros adequados deste tipo estão descritos no pedido co-pendente série N° 08/934.495, que aqui é dado como integralmente incorporado por citação. Os polímeros catiónicos adequados podem ser lineares ou reticulados. Estão incluídos os polímeros que compreendem unidades de repetição ou monómeros, tais como alilamina, dialilamina, dialilmetilamina, vinilamina, N-aminoalquilacrilamida, N- 28 aminoalquilmetacrilamida, aminoalquilacrilato, aminoalquilmetacrilato e sais de adição de ácido e seus derivados monoalquilados, dialquilados e trialquilados (quaternizados). Os polímeros catiónicos adequados incluem homopolímeros destas unidades de repetição e copolímeros incluindo, pelo menos, uma destas unidades de repetição e, opcionalmente, um ou mais monómeros hidrófobos e/ou monómeros hidrófilos neutros, conforme discutido acima. 0 polímero funcionalizado por ácido e o polímero catiónico podem ser administrados em várias proporções em peso e podem ser administrados simultaneamente, por exemplo, numa forma de dosagem única ou em formas de dosagem separadas, ou numa sequência separada por minutos ou horas. As dosagens e os métodos de administração adequados podem ser prontamente determinados por um especialista na técnica. Numa forma de realização, o polímero aniónico é poli(estirenossulfonato) e o polímero catiónico é poli(dialilmetilamina) ou poli(dialilmetilamina) no qual uma porção das unidades de repetição foi alquilada, por exemplo, com um grupo alquilo C4-C12, tal como um grupo octilo ou um grupo decilo.

Os polímeros da presente invenção podem ser preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por polimerização directa de um monómero funcionalizado por ácido ou co-polimerização de uma mistura de monómero compreendendo um monómero funcionalizado por ácido e, pelo menos, um co-monómero adicional, tal como um monómero funcionalizado por ácido, um monómero hidrófobo, um monómero hidrófilo neutro, um monómero de reticulação multifuncional ou uma combinação destes. A mistura de monómeros pode ser polimerizada, por 29 exemplo, utilizando métodos de polimerização de radical livre, catiónicos ou aniónicos que são bem conhecidos na técnica. Devido a diferenças nas proporções de reactividade de dois ou mais monómeros, a proporção molar dos monómeros no produto copolimérico pode ser diferente da proporção molar dos monómeros na mistura de reacção inicial. Esta diferença em reactividade também pode resultar numa distribuição não aleatória de monómeros ao longo da cadeia polimérica.

Os polímeros também podem ser sintetizados por substituição nucleofílica de cadeia lateral num polímero activado. Este método prossegue por meio de um polímero intermediário tendo cadeias laterais lábeis que são prontamente substituídas por uma cadeia lateral desejada. Os polímeros adequados deste tipo incluem poli(N-acriloiloxisuccinimida) (pNAS), que reage com uma amina primária para formar, por exemplo, uma poliacrilamida N-substituída. Outro polímero adequado com cadeias laterais lábeis é o poli(4-nitro-fenilacrilato) , que também forma uma poliacrilamida N-substituida depois de reacção com uma amina primária.

Por exemplo, um copolímero com uma estrutura de base de poliacrilamida compreendendo átomos de azoto amida substituídos por um grupo funcional ácido e átomos de azoto amida substituídos por um grupo hidrófobo pode ser preparado tratando o pNAS com menos de um equivalente (relativo ao monómero N-acriloiloxisuccinimida) de uma amina primária que termina num grupo funcional ácido, tal como um aminoácido, por exemplo, a glicina. Um grupo hidrófobo pode, então, ser 30 introduzido reagindo, pelo menos, uma porção dos monómeros de N-acriloiloxisuccinimida restantes com uma amina secundária, tal como uma alquilamina C2-C20· Um copolimero compreendendo ainda um monómero hidrófilo neutro pode ser preparado reagindo quaisquer monómeros de N-acriloiloxisuccinimida com, por exemplo, 2-aminoetanol ou amoníaco. Deste modo, pode-se obter prontamente, uma variedade de composições de copolímeros tratando o polímero activado com proporções diferentes de aminas seleccionadas.

Os polímeros de utilização no presente método também podem ser sintetizados por funcionalização de um polímero precursor com um grupo funcional ácido. Por exemplo, um polímero tendo cadeias laterais que incluem grupos arilo pode ser sulfonado utilizando métodos conhecidos para produzir um polímero tendo grupos ácido sulfónico pendentes. Os polímeros precursores que incluem grupos hidroxilo, tais como poli(álcool vinílico) e poli(álcool alílico) podem ser sulfonados utilizando métodos conhecidos para formar polímeros compreendendo grupos éster sulfato. Os polímeros tendo tanto os grupos funcionais como os grupos hidrófobos também podem ser sintetizados utilizando esta abordagem genérica. Por exemplo, um polímero poli(vinilareno), tal como uma poliestireno pode ser sulfonado por meio de reacção, por exemplo, com ácido sulfúrico fumegante, para formar o poli(estireno sulfonato).

Um polímero funcionalizado com ácido pode ser modificado convertendo, pelo menos, uma porção dos grupos ácidos num derivado ácido, tal como uma amida ou um éster. 31

Por exemplo, o poli(estireno sulfonato) pode ser feito reagir com uma quantidade sub-estequiométrica, com base nos grupos sulfonato, de cloreto de tionilo, convertendo, deste modo, uma porção dos grupos sulfonato em grupos cloreto de sulfonilo. 0 polimero resultante pode, por exemplo, ser feito reagir com um excesso de uma amina primária para converter os grupos cloreto de sulfonilo em grupos sulfonamida N-substituídos ou com um álcool para converter os grupos cloreto de sulfonilo em grupos éster sulfonato. A hidrofobicidade do polimero resultante pode ser variada, variando um ou ambos dos N-substituintes ou funcionalidade éster e a extensão da conversão dos grupos sulfonato em sulfonamida ou grupos éster sulfonato.

As toxinas patogénicas que podem ser inibidas por meio do método da presente invenção incluem, mas não se limitam a toxinas, tais como exotoxinas e/ou endotoxinas produzidas por Streptococcus spp., incluindo Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Streptococcus Sanguis; Salmonella spp., incluindo Salmonella enteritidis; Campylobacter spp., incluindo Campylobacter jejuni; Escherichia spp., incluindo E. coli; Clostridia spp., incluindo Clostridium difficile e Clostrldium botulínum; Staphylococcus spp., incluindo Staphylococcus aureus; Shigella spp., incluindo Shigella dysenteriae; Pseudomonas spp., incluindo Pseudomonas aeruginosa; Bordatella spp., incluindo Bordatella pertussis; Listería spp., incluindo Listeria monocytogenes; Vibrio cholerae; Yersinia spp., incluindo Yersinia enterocolitica; Legionella spp., incluindo Legionella pneumophilia; Bacíllus spp., incluindo Bacillusanthracis; Helicobacter spp.; 32

Corynebacteria spp.; Actinobacillus spp.; Aeromonas spp.; Bacteroides spp. incluindo Bacteroides fragilis; Neisseria spp., incluindo N. meningitidis; Moraxella spp., tal como Moravella catarrhalis e Pasteurella spp. Estão também incluídas toxinas protozoárias, tais como as toxinas produzidas por Entameoba histolytica e Acanthameoba; e toxinas parasitárias. 0 método da invenção também pode ser utilizado para inibir uma toxina virai, tal como uma toxina produzida por rotavírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus da influenza, vírus pólio, vírus da estomatite vesicular, vírus vaccinia, adenovírus, piavírus, togavírus (tais como os vírus sindbis e semlik forest), paramixovírus, papilomavírus. As toxinas que podem ser inibidas utilizando o método da invenção incluem as moléculas de viroporina produzidas por qualquer um destes vírus. Uma toxina preferida que pode ser inibida utilizando o método da invenção é a proteína NSP4 do rotavírus. Outras toxinas que podem ser inibidas incluem a proteína M2 da influenza, as proteínas Vpu e gp41 do VIH, a proteína 3Δ do picornavírus, a proteína 6K do togavírus, a proteína SH do vírus sincicial respiratório, a proteína D3 do coronavírus e a proteína E5 do adenovírus. A infecção pode ser uma infecção sistémica ou uma infecção localizada. Preferencialmente, a infecção fica localizada em uma ou mais das cavidades orais, o olho, o tracto gastrointestinal, incluindo a garganta, a pele e o ouvido, tal como o canal auditivo ou o ouvido médio. 33 A quantidade de um dado polímero a ser administrado será determinada individualmente e será determinada, pelo menos em parte, levando em consideração o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas a serem tratados e o resultado desejado. 0 polímero pode ser administrado só ou numa composição farmacêutica compreendendo o polímero, um veículo ou diluente aceitável e, opcionalmente, um ou mais fármacos adicionais. 0 polímero pode ser administrado sistemicamente ou não sistemicamente, por exemplo, por via subcutânea ou outra injecção, por via intravenosa, tópica, oral, parentérica, transdérmica ou rectal. A via de administração seleccionada, de um modo geral, dependerá se a infecção é sistémica ou localizada. A forma na qual o polímero é administrado, por exemplo, em pó, comprimido, cápsula, solução ou emulsão dependerá da via pela qual é administrado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada numa dose única ou numa série de doses separadas por intervalos de tempo apropriados, tais como horas. Preferencialmente, o polímero é administrado não sistemicamente, por exemplo, por via oral ou tópica, por exemplo, por meio de aplicação à pele, ao olho, tecido oral, tal como a mucosa oral, ou a mucosa gastrointestinal.

Numa forma de realização preferida, a toxina é uma exotoxina produzida por uma estirpe bacteriana patogénica. De importância particularmente patogénica são Escherichia coli, por exemplo, as estirpes 06:H-, 0157:H7, 0143 de E. coli e outros isolados clínicos, e Clostridium difficile. A E. coli 34 entero-hemorrágica (EHEC) , tal como a 0157:H7, pode causar uma diarreia com sangue, não febril, caracteristica conhecida como colite hemorrágica. A EHEC produz altos níveis de uma ou ambas de duas toxinas relacionadas que se assemelham à toxina Shiga em estrutura e função e são referidas como toxinas semelhantes à toxina Shiga (SLT I ou SLT II) . Crê-se que estas toxinas semelhantes a Shiga causam dano à mucosa intestinal, resultando na manifestação da colite hemorrágica.

Numa forma de realização preferida, a toxina ou toxinas microbianas são produzidas por Clostrídíum difficile. A C. difficile produz duas toxinas, a Toxina A e a Toxina B. A Toxina A é uma enterotoxina que estimula a infiltração de neutrófilos e a libertação de mediadores de inflamação, resultando numa secreção de fluido, permeabilidade alterada da membrana e necrose hemorrágica. A Toxina B é uma citotoxina. A C. difficile está associada a muitos casos de diarreia associada a antibióticos e a maior parte dos casos de colite pseudomembranosa, uma grave inflamação do cólon, potencialmente fatal. O tratamento da infecção causada por C. difficile, tipicamente, envolve a administração de vancomicina ou metronidazol. Numa forma de realização, o estado a ser tratado é a gastroenterite induzida por C. difficile, tal como a diarreia associada a antibióticos ou a colite pseudomembranosa. Nesta forma de realização, o polímero pode ser administrado, opcionalmente, em associação com um ou mais agentes antibióticos que são eficazes, pelo menos parcialmente, contra a C. difficile, tais como a vancomicina e o metronidazol. 35

Conforme aqui utilizado, "tratamento" da diarreia associada a C. díffícile (CDAD) inclui: o tratamento profilático daqueles doentes susceptiveis à CDAD; o tratamento no aparecimento inicial da CDAD; o tratamento da CDAD em progresso e o tratamento da CDAD reincidente em doentes susceptiveis. Conforme aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para prevenir, diminuir ou erradicar os sintomas da doença.

Numa forma de realização preferida, um regime de tratamento terapêutico/profilático de CDAD (que resulta em prevenção da doença, diminuição ou erradicação da doença depois do aparecimento, ou prevenção da reincidência da doença) compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica compreendendo o sulfonato de poliestireno, preferencialmente solúvel, sulfonato de poliestireno não reticulado e, ainda mais preferencialmente, o sulfonato de poliestireno solúvel, não reticulado tendo um peso molecular entre 400.000 a 1 milhão e, mais preferencialmente, um peso molecular de 600.000. Embora não pretendendo estar limitadas a qualquer mecanismo, as composições de acordo com a invenção ligam as toxinas, por exemplo, as toxinas produzidas por C. díffícile. A Toxina A é uma enterotoxina que estimula a infiltração de neutrófilos e a libertação de mediadores de inflamação, resultando numa secreção de fluido, permeabilidade alterada da membrana e necrose hemorrágica. A Toxina B é uma citotoxina. Crê-se que estas toxinas sejam responsáveis pelos sintomas de CDAD e a outra de AAD. 36 A presente invenção também leva em consideração um regime de tratamento profilático compreendendo administrar uma composição terapêutica compreendendo o sulfonato de poliestireno como uma co-terapêutica com a terapêutica de antibiótico de largo espectro. Conforme aqui utilizado, "co-terapêutica" significa um regime de tratamento em que dois fármacos são administrados simultaneamente ou sequencialmente, separados por minutos, horas ou dias, mas de alguma forma actuam juntos para proporcionar a resposta terapêutica desejada. A invenção será agora descrita adicional e especificamente por meio dos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

Exemplo 7 - Preparação de gel de poli (fosfato de etilenoglicolmetacrilato) reticulado a 2% 0 gel de poli(fosfato de etilenoglicolmetacrilato) foi preparado pela polimerização do fosfato de etilenoglicolmetacrilato (29,4 mmoles, 6,178 g) com divinilbenzeno ("DVB") (0,926 mmoles, 0,1319 mL) em etanol/água (50/50) utilizando cerca de 1% molar de AIBN como iniciador. O gel flexivel resultante foi dividido em 2 porções em 2 tubos de centrifugação de 50 mL e lavado 4 vezes com etanol por um total de cerca de 120 mL de etanol. O gel foi seco de um dia para o outro num forno de ar forçado a 70°C. O gel seco foi moído e peneirado e lavado 3 vezes em 37 água num tubo de centrifugação de 50 mL. O gel foi seco de um dia para o outro num forno de ar forçado a 70°C.

Exemplo 8 - Preparação de géis de poliestireno sulfonado

Os géis de poliestireno foram preparados pela polimerização do estireno com divinilbenzeno em tolueno utilizando cerca de 1% molar de AIBN como iniciador, como se segue:

Gel de poliestireno (6% de DVB). O estireno (282 mmole, 3,23 mL) foi adicionado a um frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. Adicionou-se tolueno (5 mL) e a solução foi desgaseifiçada durante 15 minutos. Foi preparada uma solução de AIBN (0,9852 g em 10 mL de tolueno) e 0,5 mL foram adicionados à solução. A solução foi desgaseifiçada adicionalmente durante 5 minutos e, depois, mantida a 60°C durante 21 horas. O gel límpido, incolor resultante foi lavado 5 vezes com etanol num tubo de centrifugação de 50 mL e seco de um dia para o outro num forno de ar forçado a 70°C.

Foram também preparados géis de poliestireno utilizando este procedimento com os seguintes níveis de reticulação: 4% de DVB; 2% de DVB; 1,5% de DVB; 1% de DVB; e 0,5% de DVB.

Sulfonação de gel de poliestireno O gel de poliestireno seco foi transferido para um frasco de vidro de 40 mL. Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (10 38 mL) e a mistura foi aquecida a 100°C durante 1 horas. Deixou-se o gel castanho, dilatado, resultante arrefecer até à temperatura ambiente e o mesmo foi lavado exaustivamente com metanol até que o pH fosse 4-5. O gel foi seco de um dia para o outro num formo de ar forçado a 70°C. O gel seco foi, então, moído num moedor de café, transferido para um tubo de centrifugação de 50 mL e lavado várias vezes com água.

Exemplo 9 - Preparação de géis de poli(2- vinilnaftaleno)sulfonado

Os géis de poli(2-vinilnaftaleno) sulfonado foram preparados pela polimerização de 2-vinilnaftaleno com divinilbenzeno em tolueno utilizando ~1% molar de AIBN como iniciador, como se segue.

Gel de poli(2-vinilnaftaleno)sulfonado (2% de DVB) 2-Vinilnaftaleno (29,4 mmoles, 4,534 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,46 microL) foram adicionados a um frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. Adicionou-se tolueno (10 mL) e a solução foi aquecida para dissolver o monómero. A solução foi desgaseifiçada durante 15 minutos. Uma solução de AIBN (0,9852 g em 10 mL em tolueno) foi preparada e 0,5 mL foram adicionados à solução de polimerização. A solução foi desgaseifiçada adicionalmente durante 5 minutos e, depois, mantida a 60°C durante 21 horas. O gel límpido, castanho resultante foi lavado com etanol (total de 2 L) por filtração por gravidade e seco durante 2 39 dias num formo de ar forçado a 70°C.

Sulfonação de gel de poli(2-vinilnaftaleno) 0 gel seco de poli(2-vinilnaftaleno) foi transferido para um frasco de vidro de 40 mL. Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (10 mL) e a mistura foi aquecida até 100°C durante 1 hora. Deixou-se o gel castanho, dilatado, resultante arrefecer até à temperatura ambiente e o mesmo foi lavado exaustivamente com metanol por filtração por gravidade até que o pH fosse 4-5. O gel foi lavado várias vezes com água. O gel foi seco durante 2 dias num formo de ar forçado a 70 °C.

Exemplo 10 - Preparação de géis de poli(4-vinilbifenil) sulfonado

Os géis de poli(4-vinilbifenil) foram preparados pela polimerização de 4-vinilbifenil com divinilbenzeno em tolueno utilizando ~1% molar de AIBN como iniciador, como se segue:

Gel de poli(4-vinilbifenil) (2% de DVB)

4-Vinilbifenil (29,4 mmoles, 5,299 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,46 microL) foram adicionados a um frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. Adicionou-se tolueno (10 mL) e a solução foi aquecida para dissolver o monómero. A solução foi desgaseifiçada durante 15 minutos. Foi preparada uma solução de AIBN (0,9852 g em 10 mL de tolueno) e 0,5 mL 40 foram adicionados à solução de polimerização. A solução foi desgaseifiçada adicionalmente durante 5 minutos e, em seguida, mantida a 60 °C durante 21 horas. O gel límpido, castanho, resultante foi lavado com etanol (total de 2 L) por filtração por gravidade e seco durante 2 dias num forno de ar forçado a 70°C.

Sulfonação de gel de poli(4-vinilbifenil) reticulado a 2% O gel seco de poli(4-vinilbifenil) foi transferido para um frasco de 40 mL. Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (10 mL) e a mistura foi aquecida até 100°C durante 1 hora. Deixou-se o gel castanho, dilatado, resultante arrefecer até à temperatura ambiente e o mesmo foi lavado exaustivamente com metanol por filtração por gravidade até que o pH fosse 4-5. O gel foi lavado várias vezes com água e, depois, foi seco durante 2 dias num formo de ar forçado a 70°C.

Exemplo 11 - Preparação de poli(estirenossulfonato-co-estireno-n-N-octilsulfonamida)

Poli (estirenossulfonato) de sódio (114,9 mmoles, 20 g) foi disperso em N,N-dimetilformamida (DMF) (100 mL, anidra). Adicionou-se cloreto de tionilo (114,9 mmoles, 9,95 mL) e a mistura foi aquecida até 60°C durante 16 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e neutralizada com NaOH (aq) a 50% até que o pH fosse de cerca de 6,5. A solução foi dialisada por tubagem de diálise SpectraPor 6-8K MWCO em 4 x 3 galões de água desionizada até que a condutividade do dialisado fosse 41 0,00 mS/cm. A amostra foi liofilizada para dar um pó branco.

Poli(estirenossulfonato) c/ 10% molar de n-octilsulfanamida

Poli (estirenossulfonato) de sódio (114,9 mmoles, 20 g) foi disperso em DMF (100 mL, anidra) . Adicionou-se cloreto de tionilo (114,9 mmoles, 9,95 mL) e a mistura foi aquecida até 60°C durante 16 horas. Adicionou-se n-octilamina (11,486 mmoles, 1,8980 mL) e a mistura foi agitada durante 5,5 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e neutralizada com NaOH (aq) a 50% até que o pH fosse de 6,1. A solução foi dialisada por tubagem de diálise SpectraPor 6-8K MWCO em 4 x 3 galões de água desionizada até que a condutividade do dialisado fosse 0,00 mS/cm. A amostra foi liofilizada para dar um pó branco.

Poli(estirenossulfonato) c/ 20% molar de n-octilsulfanamida

Poli (estirenossulfonato, Na) (114,9 mmoles, 20 g) foi disperso em DMF (100 mL, anidra). Adicionou-se cloreto de tionilo (114,9 mmoles, 9,95 mL) e a mistura foi aquecida até 60°C durante 16 horas. Adicionou-se n-octilamina (22,97 mmoles, 3,7967 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5,5 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e neutralizada com NaOH (aq) a 50% até que o pH fosse de 6,7. A solução foi dialisada por tubagem de diálise SpectraPor 6-8K MWCO em 4 x 3 galões de água desionizada até que a condutividade do dialisado fosse 0,00 mS/cm. A amostra foi liofilizada para dar um pó branco. 42

Poli(estirenossulfonato) c/ 30% molar de n- octilsulfanamida

Poli (estirenossulfonato, Na) (114,9 mmoles, 20 g) foi disperso em DMF (100 mL, anidra). Adicionou-se cloreto de tionilo (114,9 mmoles, 9,95 mL) e a mistura foi aquecida até 60°C durante 16 horas. Adicionou-se n-octilamina (34,457 mmoles, 5,6950 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5,5 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e neutralizada com NaOH (aq) a 50% até que o pH fosse de 6,5. A solução foi dialisada por tubagem de diálise SpectraPor 6-8K MWCO em 4 x 3 galões de água desionizada até que a condutividade do dialisado fosse 0,00 mS/cm. A amostra foi liofilizada para dar um pó branco.

Poli(estirenossulfonato) c/ 40% molar de n- octilsulfonamida

Poli(estirenossulfonato) de sódio (114,9 mmoles, 20 g) foi disperso em DMF (100 mL, anidra). Adicionou-se cloreto de tionilo (114,9 mmoles, 9,95 mL) e a mistura foi aquecida até 60°C durante 16 horas. Adicionou-se n-octilamina (55,131 mmoles, 7,5934 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5,5 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e neutralizada com NaOH (aq) a 50% até que o pH fosse de 6,7. A solução foi dialisada por tubagem de diálise SpectraPor 6-8K MWCO em 4 x 3 galões de água desionizada até que a condutividade do dialisado fosse 0,00 mS/cm. A amostra foi liofilizada para dar um pó branco. 43

Exemplo 12 - Síntese do sal de cálcio de poli(estirenossulfonato) A um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 500 mL foram adicionados 2 g de poli(4-estirenossulfonato de sódio) e 100 mL de água desionizada. A mistura foi agitada durante vários minutos até ser obtida uma solução homogénea. A esta solução polimérica adicionou-se 6,46 mL de uma solução 0,225 M de CaCl2- Deixou-se a mistura de reacção em agitação à temperatura ambiente durante 15 horas. A mistura de reacção foi purificada por centrifugação com membrana utilizando filtros cut-off 3K. A solução foi seca a 70°C num forno de ar forçado durante 24 horas, dando 1,4 g do polímero como um sólido esbranquiçado.

Exemplo 13 - Preparação de copolímeros de estirenossulfonato reticulado com co-monómeros hidrófobos

Os géis de poliestirenossulfonato/hidrófobos foram preparados por co-polimerização de sulfonato de estireno com acrilamida, n-butilacrilamida, n-decilacrilamida ou estireno tanto com divinilbenzeno (2%) como com N,N'-metilenobisacrilamida (8%) como reticulador, como se segue:

Gel de poliestirenossulfonato (reticulado a 2%) 44

Poliestirenossulfonato (29,4 mmoles, 5,119 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 10 mL de etanol e 10 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel limpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato-co-acrilamida (75% molar: 23% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , acrilamida (6,90 mmoles, 0,490 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 10 mL de etanol e 10 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60°C durante 18 horas. Formou-se um gel limpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato-co-n-butilacrilamida (75% molar: 23% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , n-butilacrilamida (6,90 mmoles, 0,878 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 15 mL de etanol e 5 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com 45 septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel límpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato/acrilamida/n-butilarilamida (75% molar: 11,5% molar: 11,5% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , acrilamida (3,45 mmoles, 0,245 g) , n-butilacrilamida (3,45 mmoles, 0,439 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 15 mL de etanol e 5 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel límpido, amarelo claro.

Gel de poliestirenossulfonato-co-n-decilacrilamida (75% molar: 23% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , n-decilacrilamida (6,90 mmoles, 1,458 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 15 mL de etanol e 5 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A 46 solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60°C durante 18 horas. Formou-se um gel amarelo cremoso.

Gel de poliestirenossulfonato/acrilamida/n-decilacrilamida (75% molar: 11,5% molar: 11,5% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g), acrilamida (3,45 mmoles, 0,245 g) , n-decilacrilamida (3,45 mmoles, 0,729 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 15 mL de etanol e 5 mL de água num frasco de 4 0 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel amarelo cremoso.

Gel de poliestirenossulfonato-co-estireno (75% molar: 23% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , estireno (6,90 mmoles, 0,7906 mL) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 10 mL de etanol e 10 mL de água num frasco de 4 0 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60°C durante 18 horas. 47

Formou-se um gel límpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato/acrilamida/estireno (75% molar: 11,5% molar: 11,5% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (22,5 mmoles, 3,918 g) , acrilamida (3,45 mmoles, 0,245 g) , estireno (3,45 mmoles, 0,3953 mL) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 10 mL de etanol e 10 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel límpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato-co-acrilamida (50% molar: 48% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (15,0 mmoles, 2,612 g) , acrilamida (14,4 mmoles, 1,024 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 5 mL de etanol e 15 mL de água num frasco de 4 0 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas. Formou-se um gel límpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato/acrilamida/n- 48 butilacrilamida (50% molar: 24% molar: 24% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (15,0 mmoles, 2,612 g) , acrilamida (7,2 mmoles, 0,512 g), n-butilacrilamida (7,2 mmoles, 0,916 g) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 5 mL de etanol e 15 mL de água num frasco de 4 0 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas.

Formou-se um gel limpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato/acrilamida/estireno (50% molar: 24% molar: 24% molar: reticulado a 2%)

Poliestirenossulfonato (15,0 mmoles, 2,612 g) , acrilamida (7,2 mmoles, 0,512 g), estireno (7,2 mmoles, 0,8250 mL) e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 10 mL de etanol e 10 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60 °C durante 18 horas.

Formou-se um gel limpido, incolor.

Gel de poliestirenossulfonato-co-acrilamida (25% molar: 73% molar: reticulado a 2%) 49

Poliestirenossulfonato (7,5 mmoles, 1,306 g) , acrilamida (21,9 mmoles, 1,557 g) , e divinilbenzeno (0,6 mmoles, 85,5 microL) foram dissolvidos em 5 mL de etanol e 15 mL de água num frasco de 40 mL equipado com uma tampa com septo. A solução foi desgaseifiçada borbulhando azoto através da mesma e adicionou-se 1% molar de AIBN como uma solução. A solução de polimerização foi desgaseifiçada adicionalmente e colocada num bloco de reacção aquecido a 60°C durante 18 horas. Formou-se um gel límpido, incolor.

Todas as amostras foram purificadas dividindo o gel em 2 porções em dois tubos de centrifugação de 50 mL. Os géis foram lavados um mínimo de três vezes com etanol ou até que o sobrenadante ficasse límpido e incolor. O volume total do etanol utilizado foi aproximadamente entre 75 mL e 100 mL dependendo do índice de expansão do gel. Os géis foram secos num forno de ar forçado a 60° durante 2 dias.

Os géis foram moídos num moedor de café e peneirados por peneiras de 140, 230 mesh. Uma amostra de 0,5-1 g das partículas de gel de 140-230 de tamanho foram lavadas 3 vezes com água em tubos de centrifugação de 50 mL. Algumas amostras eram altamente absorventes e tiveram de ser divididas por vários tubos. De um modo geral, o material em cada tubo foi lavado com um total de 20-80 mL de água. As amostras foram, então, lavadas 1 x com MeOH, centrifugadas, decantadas e secas durante dois dias a 70°C. O gel foi lavado com um total de 20-80 mL de água. 50

Exemplo 14 - Preparação de Poli(4-vinilbifenilsulfonato)

Polimerização de 4-vinilbifenilo 4-Vinilbifenilo (166,4 mmoles, 30 g) foi adicionado a um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 500 mL equipado com um condensador de refluxo, um termo-par J-Kem e um septo. Adicionou-se tolueno (60 mL) e a solução foi desgaseifiçada durante 1 hora. Adicionou-se AIBN (1% molar, 0,294 mmoles, 0,2733 g) e a solução foi desgaseificada durante mais 15 minutos. A mistura de polimerização foi aquecida a 60°C durante 21 horas. A solução limpida, castanha, resultante foi vertida em 2 L de metanol e agitada durante várias horas. O fino pó castanho foi filtrado e lavado 3 x em 500 mL de metanol e seco de um dia para o outro num forno de ar forçado a 70°C. Obteve-se um fino pó castanho (28,02 g, 93,40% de rendimento).

Sulfonação de poli(4-vinilbifenil)

Poli(4-vinilbifenil) foi misturado com ácido sulfúrico concentrado (100 mL) e aquecido a 100°C durante 8 horas. Eventualmente, a mistura converteu-se uma solução limpida, castanha, viscosa. A solução polimérica foi vertida em gelo e neutralizada a um pH 6,2 com NaOH aquoso a 50%. A solução foi dialisada por diálise com membrana com um peso molecular cut-off de 3,5 K em 4 vezes 5 L de água desionizada. A condutividade da diálise foi de <0,1 mS/cm. A água foi removida por destilação num evaporador rotativo para dar um sólido límpido, castanho, flocular. 51

Exemplo 15 - Preparação de Poli(2-vinilnaftalenossulfonato)

Polimerização de 2-vinilnaftaleno 2-Vinilnaftaleno (194,5 mmoles, 30 g) foi adicionado a um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 500 mL equipado com um condensador de refluxo, um termo-par J-Kem e um septo. Adicionou-se tolueno (60 mL) e a solução foi desgaseifiçada durante 1 hora. Adicionou-se AIBN (1% molar, 0,294 mmoles, 0,3195 g) e a solução foi desgaseifiçada durante mais 15 minutos. A mistura de polimerização foi aquecida a 60°C durante 21 horas. A solução limpida, castanha, resultante foi vertida em 2 L de metanol e agitada durante várias horas. O fino pó castanho foi filtrado e lavado 3 x em 500 mL de metanol e seco de um dia para o outro num forno de ar forçado a 70°C. Obteve-se um fino pó castanho (28,45 g, 94,83% de rendimento).

Sulfonação de poli(2-vinilnaftaleno)

Poli(2-vinilnaftaleno) foi misturado com ácido

sulfúrico concentrado (100 mL) e aquecido a 100°C durante 8 horas. Eventualmente, a mistura converteu-se uma solução limpida, castanha, viscosa. A solução polimérica foi vertida em gelo e neutralizada a um pH 6,4 com NaOH aquoso a 50%. A solução foi dialisada por diálise com membrana com um peso molecular cut-off de 3,5 K em 4 vezes 5 L de água desionizada. A condutividade da diálise foi de <0,1 mS/cm. A 52 água foi removida por destilação num evaporador rotativo para dar um sólido límpido, castanho, flocular.

Exemplo 16 - Poli(4-estireno sulfonato-co-(-)-mentil-4-estireno sulfonato de sódio), 5% (-)-mentol A uma mistura de poli(4-estireno sulfonato de sódio) (30,0 g; 145 mol de sulfonato) em 300 mL de DMF anidra agitada à temperatura ambiente, adicionou-se cloreto de tionilo (17,3 g; 0,145 mol). A adição foi feita lentamente assegurando que a temperatura não subia para mais de 50°C. A agitação foi continuada de um dia para o outro e, depois, um terço da mistura de reacção foi tratado com piridina (0,764 g; 00966 mol). Depois da agitação a temperatura ambiente durante 2,5 horas, adicionou-se (-)mental (0,375 g; 0,00240 mol) e a mistura de reacção resultante foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, depois, a 50°C durante 3 horas. Em seguida, a mistura foi vertida, lentamente, num litro de água contendo bicarbonato de sódio (5 g). Depois que a adição estava completa, adicionou-se mais bicarbonato de sódio até que o borbulhamento parasse e o pH estivesse neutro. Diálise exaustiva seguida por secagem com um fluxo de ar deu um sólido branco.

Exemplo 17 - Síntese de Poli(4-estireno sulfonato de sódio-co-ácido litocólico 4-estireno sulfonato), 5% ácido litocólico 53 A uma mistura de poli(4-estireno sulfonato de sódio) (30,0 g; 145 mol de sulfonato) em 300 mL de DMF anidra agitada à temperatura ambiente, adicionou-se cloreto de tionilo (IV,3 g; 0,145 mol). A adição foi feita lentamente assegurando que a temperatura não subia para mais de 50°C. A agitação foi continuada de um dia para o outro e, depois, um terço da mistura de reacção foi tratado com piridina (0,764 g; 00966 mol). Depois da agitação à temperatura ambiente durante 2,5 horas, adicionou-se ácido litocólico (0,904 g; 0,00240 mol) e a mistura de reacção resultante foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, depois, a 50°C durante 3 horas. Em seguida, a mistura foi vertida, lentamente, num litro de água contendo bicarbonato de sódio (5 g). Depois que a adição estava completa, adicionou-se mais bicarbonato de sódio até que o borbulhamento parasse e o pH estivesse neutro. Diálise exaustiva seguida por secagem com um fluxo de ar deu um sólido branco.

Foi também utilizado o ensaio de hamster in vivo, conforme descrito acima, para avaliar a eficácia dos seguintes polímeros, conforme apresentado na Tabela 1.

Exemplo 18 - Poli(3-estireno sulfonato de sódio) com 40% de Metronidazol

Dissolveu-se poli(4-estireno sulfonato de sódio) (160— 246-001, 25 g) em água desionizada (500 mL) num balde de plástico de 3 litros utilizando uma placa de agitação magnética. Numa proveta separada, de tamanho aproximado, 54 dissolveu-se o metronidazol (8,32 g) em água desionizada (600 mL) e HC1 1 M (0,75 eq) . Esta solução de metronidazol foi vertida, lentamente, na solução de poli(4-estireno sulfonato de sódio). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante, aproximadamente, 17 horas. Δ mesma foi colocada em bolsas de diálise (6K-8K MWCO) até ser obtida uma condutividade de <0,05. A solução polimérica foi seca num forno de ar forçado a 70°C. Obteve-se, aproximadamente, 22 g do polímero. A análise por HPLC demonstrou um carregamento de metronidazol de 13,8%.

Exemplo 19 - Sulfonação de poli(4-metoxiestireno)

Poli(4-metoxiestireno) (1 g) foi colocado num frasco de 30 mL. Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (5 mL) ao frasco. Com agitação, o mesmo foi aquecido até 100°C durante 8 horas. Depois de 8 horas, o polímero foi dissolvido (solução límpida, escura). Adicionou-se água desionizada (50 mL) , a amostra foi neutralizada pela adição de NaOH (solução a 50%), gota a gota. A mesma foi colocada em bolsas de diálise (6K-8K MWCO) até ser obtida uma condutividade de <0,1. A solução polimérica foi filtrada e, em seguida, foi seca em centrífuga de vácuo (speed vac.).

Exemplo 20 - Sulfonação de poli(difenoxifosfazeno)

Poli(difenoxifosfazeno) (1 g) foi colocado num frasco de 30 mL. Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (5 mL) ao 55 frasco. Com agitação, o mesmo foi aquecido até 100°C durante 8 horas. Depois de 8 horas, o polímero foi dissolvido (solução límpida, amarela). Adicionou-se água desionizada (50 mL) , a amostra foi neutralizada pela adição de NaOH (solução a 50%), gota a gota. A mesma foi colocada em bolsas de diálise (6K-8K MWCO) até ser obtida uma condutividade de <0,1. A solução polimérica foi filtrada e, em seguida, foi seca em centrífuga de vácuo (speed vac.) .

Exemplo 21 - Sulfonação do Co-polímero em Bloco de Óxido de Etileno - Estireno - Óxido de Etileno

Co-polímero em bloco de óxido de etileno-estireno-óxido de etileno (900 mg) foi colocado num frasco de 30 mL.

Adicionou-se ácido sulfúrico concentrado (5 mL) ao frasco.

Com agitação, o mesmo foi aquecido até 100°C durante 8 horas. Depois das 8 horas, o polímero não estava dissolvido.

Adicionou-se mais ácido sulfúrico concentrado (5 mL) ao frasco. O mesmo foi, então, aquecido até 110°C, com agitação, durante mais 8 horas. Isto foi repetido mais duas vezes. Um total de 20 mL de ácido sulfúrico concentrado foram adicionados (5 mL, 100°C, 8 horas; 15 mL, 110°C, 24 horas) . Adicionou-se água desionizada (50 mL) . A amostra foi neutralizada pela adição de NaOH (solução a 50%), gota a gota. A mesma foi colocada em bolsas de diálise (6K-8K MWCO) até ser obtida uma condutividade de <0,1. A solução polimérica foi filtrada (permaneceu muito material insolúvel) e, em seguida, foi seca em centrífuga de vácuo (speed vac.). 56

Exemplo 22 - Co-administração de poli(estirenossulfonato) e poli(dialilmetilamina)

Tanto o sulfonato de poliestireno solúvel como a polidialilmetilamina (PDMA) alquilada Cs, reticulada são capazes de reduzir a mortalidade provocada pela infecção com C. difficile no modelo de hamster de colite provocada por C. difficile. Estes polímeros exibem propriedades diferentes de ligação a toxina in vitro. 0 sulfonato de poliestireno liga a Toxina A de C. difficile e protege as células em cultura contra o arredondamento celular mediado pela Toxina A. A PDMA alquilada Cs reticulada liga as Toxinas A e B in vitro e pode proteger as células em cultura contra o arredondamento celular mediado por toxina. Este polímero é cerca de cinco vezes mais potente para ligar a Toxina B do que para ligar a Toxina A in vitro. Para obter-se o benefício da ligação óptima da Toxina A e B, estes polímeros foram testados em associação no modelo de hamster de colite provocada por C. difficile. 0 tratamento com o polímero teve início 24 horas antes da infecção com C. difficile. Os hamsters foram administrados com 3 doses diárias do polímero às 8 horas da manhã, às 12 horas e às 4 horas da tarde, todos os dias. Os hamsters foram tratados por um total de 7 dias com soro fisiológico (controlo), só com sulfonato de poliestireno, só com PDMA alquilada Cs, reticulada ou uma combinação dos dois polímeros administrados em doses separadas (2 doses de sulfonato de poliestireno, 1 dose de PDMA Cs). Os animais foram observados por um total de 7 dias. Nenhum dos animais tratados como o soro fisiológico sobreviveu ao tratamento. Os 57 animais tratados com sulfonato de poliestireno tiveram uma sobrevivência de 80% no dia 7 com os sobreviventes apresentando a doença suave a moderada. Os animais tratados com PDMA alquilada Cs tiveram uma sobrevivência de 50% no dia 7, com sobreviventes apresentando a doença moderada ou nenhuma. A associação do sulfonato de poliestireno e a PDMA alquilada Cs resultou numa sobrevivência de 90% no dia 7, com 80% dos animais não apresentando a doença. Deste modo, a associação do sulfonato de poliestireno solúvel e a PDMA alquilada Cs parece ser uma terapêutica para a colite provocada por C. difficile in vivo.

Exemplo 23 - Ensaios de Ligação de Toxina

ELISA

Um ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) está disponível comercialmente para o diagnóstico dos níveis da toxina de C. difficile em amostras de fezes. Este ensaio utiliza placas de microtitulação revestidas com anticorpos monoclonais purificados para as Toxinas A e B de C. difficile para ligar a toxina em solução. As toxinas ligadas são, então, detectadas com um antisoro policlonal purificado por afinidade que foi ligado com a enzima peroxidase de rábano silvestre ("HRP") . 0 anticorpo não ligado é lavado e a toxina ligada ao anticorpo é, então, detectada com um substrato corado para a HRP. O ensaio é sensível a quantidades nanométricas das Toxinas A e B. Este ensaio ELISA foi utilizado para determinar os níveis livres de toxina depois da incubação da Toxina A e B 58 purificada com uma variedade de polímeros na presença de conteúdos cecais de hamster que foram utilizados para proporcionar condições fisiologicamente relevantes predizíveis da ligação da toxina in vivo. A fim de realizar o ensaio ELISA, o polímero foi (10 mg) pesado em cada um de quatro tubos Eppendorf de 1,5 mL. 500 pL de teor cecal foram, então, adicionados a cada tubo e os tubos foram, então, misturados num Vortex e colocados no nutador durante 1 hora. 500 pL de uma solução de 200 ng/mL ou 2000 ng/mL da Toxina A ou Toxina B em tampão fosfato foram, então, adicionados a cada tubo para produzir uma concentração final da toxina de 1000 ng/mL ou 100 ng/mL. Os tubos foram, então, colocados novamente no Vortex e, em seguida, colocados no nutador durante mais uma hora. Os tubos, foram, então, centrifugados. 100 pL do sobrenadante diluído de cada tubo foram adicionados a cada poço de uma placa, evitando material sólido. 100 pL de conjugado 1 foram adicionados a cada poço. Os poços foram cobertos com um vedante de placa e incubados a 37°C durante 1 hora. Os poços foram aspirados para dentro de um receptáculo de risco biológico (reservatório contendo wescodyne ou 10% de lixívia em água) . A placa foi lavada utilizando um lavador de placas, enchendo os poços com 300 pL de tampão de lavagem. Depois da lavagem final a placa foi invertida e abanada para remover algum tampão de lavagem residual em papel absorvente. 100 pL do conjugado do passo 2 diluído foi adicionado a cada poço. A placa foi coberta e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os poços foram lavados cinco 59 vezes utilizando o lavador de placas, como acima, e, depois abanados para remover o tampão residual. 100 pL de mistura de substrato foram adicionados a cada poço, depois, o poço foi vedado e incubado durante 15 minutos, à temperatura ambiente. 150 pL de solução de paragem (stop solution) foram, então, adicionados a cada poço e a placa foi misturada suavemente pelo agitador de placa no banco. A absorvância a 450 nm foi lida imediatamente.

Ensaio de Cultura de Células

As toxinas do organismo C. difficile causam o arredondamento das células em cultura. Esta propriedade pode ser utilizada para rastrear a inibição da actividade da toxina pelos compostos poliméricos. As sensibilidades às toxinas A e B diferem entre as diferentes linhas de células. No presente caso, foram utilizadas as células Vero (linha de célula ATCC). Estas células são sensíveis a 600 pg de Toxina A e menos de 2 pg de Toxina B. O ensaio foi realizado plaqueando células Vero em placas transwell de 12 poços ou placas de microtitulação de 96 poços. As células foram semeadas 24 horas antes do teste e eram monocamadas confluentes no momento da adição da toxina. Os polímeros foram incubados (5 mg/mL) em meio de cultura de tecido (Minimal Essential Media com 10% de soro fetal bovino) com a Toxina A ou a Toxina B durante 1 hora à temperatura ambiente, com oscilação. A seguir à incubação, as amostras foram manipuladas de formas diferentes dependendo se as mesmas eram géis insolúveis ou polímeros solúveis. Os géis insolúveis são adicionados às transwells (0,5 mL/poço) , uma vez que a adição directa dos géis à monocamada iria obscurecer as 60 células, evitando a detecção do arredondamento da célula. Os polímeros solúveis foram adicionados directamente às monocamadas celulares em placas de microtitulação de 96 poços (0,1 mL/poço). As células foram incubadas a 37°C durante 18 horas e observadas para verificação do arredondamento celular. O ponto terminal do ensaio foi marcado como a concentração mais baixa de polímero que pode proteger 50% e 100% da monocamada contra o arredondamento celular em 18 horas de incubação. Os controlos incluíram um polímero activo incubado com as toxinas A e B, só as toxinas A e B e cada polímero só, sem toxina.

Ensaio do Modelo da Ansa Ileal em Rato O objectivo deste ensaio era medir a capacidade dos compostos poliméricos de evitar a acumulação de fluido mediado por Toxina A e a permeabilidade numa secção ligada do íleo do rato. Os ratos foram anestesiados e uma secção de 5 cm do íleo do rato foi ligada com uma sutura de seda. O polímero (1-5 mg) e 5 pg de Toxina A purificada foram injectados nesta secção. O rato também recebeu um injecção intravenosa de 10 pCi de H manitol como um marcador para verificar a permeabilidade intestinal. A Toxina A aumenta a permeabilidade vascular no intestino, permitindo que o manitol penetre na ansa. Quatro horas depois da injecção de Toxina A e polímero, as secções da ansa ileal foram removidas, pesadas e a acumulação total de fluido foi medida. A acumulação de 3H manitol foi medida por contagem de cintilação em líquido. Os compostos poliméricos que ligam a Toxina A bloquearão a acumulação de fluido intestinal e a permeabilidade ao 3H manitol. O ponto terminal do ensaio é a concentração de polímero que completamente inibe a acumulação 61 de fluido e a permeabilidade mediada por Toxina A. Uma modificação deste ensaio envolveu a administração do polímero por meio de gavage oral. Os ratos receberam 250 mg/kg em solução por gavage oral 90 minutos antes da preparação das ansas ileais. Δ toxina foi injectada nas ansas ileais conforme descrito acima.

Resultados

Os resultados do ensaios ELISA, cultura de células, ansa ileal de rato e ensaio de hamster estão apresentados na Tabela 1 para uma variedade de polímeros. Estão também incluídos os dados correspondentes para colestiramina, um polímero catiónico que tem sido utilizado clinicamente para neutralizar as toxinas do organismo C. difficile.

Tabela 1 - Resultados dos ensaios biológicos

Polímero Ligação de toxina (in vitro) concentração de toxina neutralizada por 5 mg/mL de solução polimérica Dose Inibidora de Ansa de rato 5 μ de Toxina A % de sobrevivência de hamster no dia 5 (directo) (gavage) Sulfonato de poliestireno de sódio A = 10 ng/mL B = 0, 004-0, 008 ng(mL 2-5 mg 250 mg/kg 90% Sulfonato de poliestireno, 15% Ca++ A = 10 ng/mL B = ND <0,5 mg ND 80% Sulfonato de poliestireno, 5% mentol A = 10 ng/mL B = 0,004 ng/mL 2,5 mg ND 90% Colestiramina A = <0,015 ng/mL >20 mg ND 10% 62

B =<0,015 ng/mL

Os dados apresentados para o modelo de hamster indicam o percentil de sobrevivência no dia 5 a seguir à inoculação com C. difficile.

Os resultados apresentados na Tabela 1 indicam que cada um dos polímeros de poliestirenossulfonato testados é mais eficaz em cada um dos ensaios do que a colestiramina.

Testes In Vivo

Protocolo Básico

Os hamsters são altamente sensíveis à infecção com C. difficile e desenvolvem uma colite fatal quando a doença é iniciada por tratamento com antibióticos. Os compostos foram avaliados pela sua capacidade de inibir a actividade das toxinas do C. difficile no modelo hamster de colite provocada por C. difficile. Hamsters machos (80-100 g) foram adquiridos da Biobreeders Inc. (Falmouth MA). Todos os animais foram mantidos em grupos de cinco em gaiolas com microisolador em leito autoclavado (Beta Chips) e dados acesso livre a alimento autoclavado e água filtrada, autoclavada. Os animais ficaram em repouso aproximadamente 1 semana depois da chegada e antes do início do estudo. Foi utilizada uma estirpe de C. difficile inicialmente isolada de uma colite provocada pelo C. difficile para infectar os animais. Esta estirpe (HUC2-4) produz níveis de moderados a elevados de toxinas in vitro e 63 in vivo. Foi preparada uma suspensão de 106-107 células bacterianas/mL de um caldo de cultura de um dia para o outro e 0,1 mL foi administrado por gavage oral no dia -1. Vinte e quatro horas mais tarde, cada animal foi injectado por via subcutânea com Cleocin Phosphatase IV® a uma dose de 10 mg/kg. Os polímeros foram administrados a grupos de dez animais, por gavage, três vezes ao dia (t.i.d.). A dose de polímeros era de 25-100 mg/dia, administrada em três doses divididas de 0,75 mL cada. A iniciação e a duração da dosagem variaram de acordo com os regimes de tratamento, conforme descrito adiante. Os animais foram observados diariamente para verificação da morbidade ou mortalidade. Os parâmetros adicionais avaliados eram a aparência geral, o tempo do aparecimento dos sinais clínicos e a presença ou ausência de diarreia ("cauda húmida"). Os animais que se considerou estarem in extremis e os animais sobreviventes no final do estudo foram mortos de forma indolor por asfixia com 100% de CO2. Os conteúdos cecais foram obtidos em alguns estudos e congelados para análise posterior de toxinas. A administração de clindamicina (no dia 0), previsivelmente, induziu a doença nos hamsters infectados com C. difficile (no dia -1) eliminado a flora colónica normal e permitindo que o C. difficile proliferasse. O C. difficile leva à colite fatal em 90-100% de hamsters infectados em 2-4 dias. O ponto terminal principal do ensaio é a protecção dos hamsters contra a mortalidade. Este é um modelo de desafio muito grave e a CDAD em hamsters é uma doença muito mais agressiva, tanto em gravidade como em decurso de tempo, em comparação com a forma humana da doença. As composições 64 farmacêuticas da invenção foram avaliadas utilizando o modelo de hamster da CDAD utilizando dois paradigmas de tratamento diferentes. No modelo profiláctico, os estudos foram concebidos para determinar o potencial para pré-tratamento com os ligantes de toxina para evitar a CDAD, apesar do desenvolvimento de uma infecção toxigénica com C. difficile. No modelo terapêutico, as composições são administradas depois do desenvolvimento da CDAD.

Modelo Profiláctico

Neste modelo foram administradas quatro dose diferentes (25, 50, 75 ou 100 mg/dia administrados por via oral em três doses de 0,750 mL) de uma composição farmacêutica de sulfonato de poliestireno (ou controlo com soro fisiológico) a hamsters Sirios dourados (dez animais por grupo de teste e dez animais por grupo de teste), por via oral durante 7 dias, do dia -2 até o dia 5. Os hamsters foram inoculados com C. difficile (estirpe Onderdonk (G69)) no dia -1 e tratados com clindamicina no dia 0. Nos animais que receberam o controlo placebo, 100% desenvolveram a doença e estavam mortos no dia 3. Em contraste, a profilaxia com a composição conduziu a uma sobrevivência de 70% e 90% dos animais nos grupos de dose de 50 mg/dia e 100 mg/dia, respectivamente. Embora todos os animais tivessem uma infecção de C. difficile produtora de toxina, a composição compreendendo o sulfonato de poliestireno efectivamente inibe as toxinas e minimiza a colite durante o período de flora do cólon alterada. A medida que a flora normal se recupera, o C. difficile parece incapaz de competir e é reduzido a um nível não patogénico. Assim 65 sendo, ter um ligante de toxina à bordo durante os estágios iniciais da exposição à toxina evita a colite antes que a mesma se desenvolva.

Modelo Terapêutico A terapêutica com polímero teve início no dia 1 a uma dose de 25, 50, 75 ou 100 mg/dia. O polímero foi administrado três vezes ao dia em 0,7-1,5 mL de soro fisiológico estéril t.i.d. desde o dia 1 até o dia 7 num total de 7 dias de tratamento. Os animais foram observados para verificação da morbidade, mortalidade e sinais clínicos da doença durante 7-14 dias depois do final do tratamento.

Modelo de Terapêutica de Combinação

Foi administrada aos animais uma combinação de 50-100 mg/dia de polímero e antibiótico num volume total de 0,75 mL de soro fisiológico com início no dia 1 (48 horas depois da administração do agente patogénico) até ao dia 5. O antibiótico era o metronidazol ou a vancomicina. A dose de metronidazol era de 21 mg/dia. A dose de vancomicina era de 3 mg/dia. A seguir a terapêutica de combinação, os animais foram doseados por mais 4 dias com 50-100 mg/dia só de polímero. Os animais foram observados para verificação da morbidade, mortalidade e sinais clínicos da doença durante 7-14 dias depois do final do tratamento. 0 metronidazol é eficaz para evitar a morte por CDAD em hamsters, desde que o fármaco seja administrado de forma activa. No entanto, no final da terapêutica, 80-90% dos animais têm uma recidiva/reincidência de CDAD e morrem em 3-6 dias de descontinuação do metronidazol. As experiências demonstram a eficácia de uma composição de sulfonato de poliestireno (PSS) administrada como tratamento depois do aparecimento da CDAD e na prevenção da recidiva. A mortalidade em consequência da recidiva com C. difficile depois da suspensão do metronidazol foi evitada em 90% dos animais tratados com uma alta dose de uma composição compreendendo sulfonato de poliestireno. A recidiva foi evitada em 70% dos animais no grupo de dose baixa de sulfonato de poliestireno. Nenhum dos animais trados com soro fisiológico sobreviveu. Apenas 20% dos animais tratados só com metronidazol sobreviveram 16 dias depois da última dose de antibiótico (os animais sobreviventes continuaram a ter diarreia no dia 21) . Deste modo, a inibição das toxinas pela composição de PSS evitou a colite e outras patologias associadas durante o tempo necessário para a flora normal recuperar-se depois da terapêutica com metronidazol parece evitar o desenvolvimento da recidiva.

Monoterapêutica com Composições de PSS O tratamento só com a composição de PSS também foi estudado e comparado com o actual padrão de cuidados, de apenas metronidazol. A composição de PSS de acordo com a invenção foi superior ao metronidazol, evitando 40% dos animais em comparação com 20% no grupo de só metronidazol. 67

Este resultado num modelo rigoroso sugere que a composição de PSS é superior ao metronidazol como uma monoterapêutica. As composições de PSS não parecem interferir com a actividade dos antibióticos.

Procedimento para Ensaio de Cultura de Células Vero:

Para todos os rastreios utilizou-se células Vero no formato de 96 poços com 4 x 104 células por poço, com 100 pL por poço. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C para serem utilizadas no dia seguinte. Todos os meios, placas, pipetas e equipamento utilizados para a cultura foram mantidos estéreis. As placas foram cobertas e pulverizadas com EtOH antes de serem colocadas na incubadora.

Rastreio Regular da Toxina A e B

Os polímeros foram pesados em tubos cónicos de 15 mL com 10 mg/mL para começar, como a concentração final nos poços de 5 mg/mL. De um modo geral, os tubos tinham cerca de 40 mg a 4 mL de meio, como diluente. O excesso foi mantido no frigorífico a 4°C no caso de ser desejado um novo teste. O meio foi pipetado para dentro dos tubos estéreis e os tubos foram então submetidos a vórtice. Se o polímero não estivesse na solução, os tubos eram colocados num banho de água a 37°C durante 15-20 minutos. Para esta experiência as concentrações finais da Toxina A eram de 10 ng/mL e a da Toxina B era de 1 ng/mL. As Toxinas e o polímero foram formados 2 X e misturados 1:1 para dar uma concentração final de 1 X para 68 ambos. Estas soluções foram feitas em tubos cónicos e colocadas em gelo.

Uma vez que os polímeros estavam completamente dissolvidos, as placas de 96 poços foram recolhidas e o meio colocado a 100 pL por poço nas fileiras G-H, bem como nas colunas 2-6 e 8-12, nas fileiras A-F. Quatro polímeros foram rastreados por placa e cada polímero tinha três fileiras, uma só para polímero e o meio, uma para Toxina A e o polímero e uma para Toxina B e o polímero. A montagem é como se segue:

Polímero 1: Só o polímero - Fileira A, col. 1-6 Polímero + A — Fileira B, col. 1-6 Polímero + B — Fileira c, col. 1-6 Polímero 2: Só o polímero - Fileira D, col. 1-6 Polímero + A — Fileira E, col. 1-6 Polímero + B — Fileira F, col. 1-6 Polímero 3: Só o polímero - Fileira A, col. 7-12 Polímero + B — Fileira c, col. 7-12 Polímero + A — Fileira B, col. 7-12 Polímero 4: Só o polímero - Fileira D, col. 7-12 Polímero + A — Fileira E, col. 7-12 Polímero + B — Fileira F, col. 7-12 do meio ter sido adicionado , 200 pL da solução polimérica foi adicionada às duas primeiras colunas em cada segmento (col. 1 ou 7) e diluída duas vezes pela placa até o final da secção (col. 6 ou 12). O meio foi adicionado às fileiras A, D e H e a Toxina A foi adicionada às fileiras B, 69 E e G (col. 1-6). A Toxina B foi adicionada às fileiras C, F e G (col. 7-12). A Toxina e o meio foram ambos adicionados a 100 pL por poço, elevando o volume total no poço para 200 pL. Δ última fileira (H) não foi utilizada no ensaio. As placas foram, então, colocadas num agitador e incubadas à temperatura ambiente durante uma hora.

As placas com as células que tinham sido mantidas de um dia para o outro na incubadora foram, então, removidas e o meio dos poços foi pipetado utilizando um aparelho de sucção a vácuo. O meio é removido de apenas uma placa de cada vez, já que as células tendem a secar durante o processo. Depois da remoção do meio, a mistura de toxina/polímero foi pipetada para as células. Adicionou-se a solução a 100 pL por poço desde a menor quantidade de toxina até os poços mais concentrados, utilizando as mesmas pontas de pipetas por todo o procedimento. As pontas da pipeta foram mudadas para cada novo lote de polímero. A fileira H foi deixada intocada e as placas foram, então, examinadas sob o microscópio para assegurar que a monocamada de células não fora danificada durante a sucção. As placas foram, então, colocadas de volta na incubadora a 37°C e verificadas 18 horas após o tratamento de polímero/toxina e graduadas para arredondamento celular, nenhum arredondamento celular ou arredondamento celular parcial (50%).

Diminuição da Dose de Toxina B

Os polímeros foram pesados a 10 mg/mL (final de 5 mg/mL) em tubos cónicos. De um modo geral, cerca de 70 mg a 7 70 mL de meio (o diluído utilizado) era adequado para completar um lote. Os polímeros foram submetidos a vórtice para formar uma solução. Os polímeros que não estavam em solução foram colocados no banho de água a 37°C durante 15-20 minutos. As soluções que ainda eram incapazes de dissolver completamente foram anotadas e géis foram formados com o procedimento de gel. A Toxina B foi feita a começar em 2 ng/mL (final de 1 ng/mL) e mantida em gelo. Foram utilizadas placas estéreis de 96 poços e foi adicionado o meio a 100 pL por poço excepto na primeira coluna. Cada polímero foi testado em três fileiras diferentes (dois polímeros por placa), a primeira fileira só para o polímero sem toxina e as duas fileiras seguintes com o polímero e a Toxina B. A fileira G era uma dose reduzida só da Toxina B e a fileira H foi deixada sem tratamento. A montagem era como se segue:

Polímero 1: Fileira A (1-12) - Só o polímero Fileira B (1-12) - Polímero com Toxina B Fileira C (1-12) - Polímero com Toxina B Polímero 2: Fileira D (1-12) - Só o polímero Fileira E (1-12) - Polímero com Toxina B Fileira F (1-12) - Polímero com Toxina B Outras Fileira d -12) - - Dose reduzida só de Toxina fileiras: B Fileira H — Não tratada 200 pL de meio ou de Toxina B foram colocados na primeira coluna (meio para as fileiras só com o polímero) e isto foi diluído duas vezes pela placa, levando mais de 100 71 pL para cada nova coluna. A mistura polimérica foi adicionada a 100 pL a todos os poços, excepto para a fileira G e Η. A fileira G substituiu 100 pL de meio e a fileira H foi deixada em branco. Estas placas foram colocadas num agitador durante uma hora e o procedimento acima mencionado foi seguido deste passo em diante.

Quando a toxina e o polímero tinham sido adicionados às células, as placas foram, então, pulverizadas com EtOH, colocadas na incubadora a 37 °C de um dia para o outro, e graduadas 18 horas mais tarde. A graduação foi positiva para o arredondamento de célula, negativo para as células normais e + /- para os poços com a morfologia pelo menos 50% normal.

Procedimento para Géis

Os géis foram feitos em duas concentrações diferentes de polímeros com concentrações de 5 ou de 10 mg/mL. As concentrações de toxinas eram a 100, 10, 1 para a Toxina A e B. Estas concentrações variaram, dependendo do tipo de polímero. Doze tubos Eppendorf foram pesados para cada polímero. As toxinas foram feitas na diluição de 1 X e 1 mL de toxina adicionada ao tubo Eppendorf apropriado. Os tubos de controlo foram utilizados só com o polímero (em todas as concentrações) e só com as toxinas. Os tubos foram, então, nutados à temperatura ambiente durante uma hora e centrifugados durante cinco minutos a 14.000 rpm. 200 pL de cada amostra foram colocados num poço em placas estéreis de 96 poços. As placas com células Vero foram removidas da incubadora e o meio foi removido por sucção (uma placa de 72 cada vez) . 100 pL da mistura de toxina/polímero foram adicionados directamente às placas com células e as placas foram cobertas e colocadas na incubadora de um dia para o outro para graduação no dia seguinte. A graduação utilizou os procedimentos acima.

Experiências de Cicatrização de Ansa de Rato

Este protocolo descreve a preparação de ansas ileais em ratos anestesiados. Este modelo experimental pode ser utilizado para testar os efeitos de agentes enterotóxicos, tais como toxinas bacterianas sobre a estrutura e a função intestinal; podem também ser determinados os efeitos dos supostos agentes protectores.

Duas ansas intestinais de cerca de 5 cm de comprimento foram preparadas em cada animal ligando o íleo com sutura de seda. Os pediculos renais foram ligados para evitar a excreção de manitol, e manitol radiomarcado (3H-manitol) injectado i.v. Em seguida, os agentes de teste (± toxina ± polímero) foram injectados nestas ansas. Quatro horas mais tarde os animais foram sacrificados e as ansas colhidas. A secreção de fluido intestinal (um índice de diarreia secretória) foi estimado pesando as ansas e medindo o seu comprimento. A permeabilidade da mucosa intestinal foi estimada medindo a acumulação de manitol radiomarcado (3H-manitol) na ansa. As amostras de tecido também foram colocadas em fixador para avaliação morfológica subsequente de lesão e inflamação da mucosa. 73

Preparação do Animal:

Ratos Wistar machos com 200-250 g foram deixados em jejum de um dia para o outro em gaiolas com fundo de arame, para minimizar a coprafagia. Água estava disponível ad libidum. As ansas ileais estavam substancialmente livres de conteúdos luminais (alimento e bile) gue se pudessem ligar ou desnaturar a toxina ou os agentes de teste utilizados.

Preparação da Solução:

Cada ansa ileal recebeu um volume de 0,5 mL de um agente ou agentes de teste em PBS. Quatro conjuntos de tubos marcados e seringas marcadas foram preparados (± toxina + polímero). A Toxina A adere a recipientes de plástico reduzindo, deste modo, a sua concentração efectiva. Por este motivo os tubos e as seringas devem ser reutilizados entre ansas.

Toxina A A Toxina A foi preparada comercialmente por TechLab Inc. e foi fornecida em frascos de 0,5 mL contendo 2 mg/mL. Cada ansa que recebeu a Toxina A foi administrada com 5 pg no total ou 2,5 pL da solução acima.

Polímero

As ansas que receberam o polímero receberam um total de 10 mg num volume de 0,5 mL de PBS (20/mL) . Novas 74 soluções/suspensões poliméricas foram preparadas antes de cada experiência. 3H-Manitol

Uma solução-mãe 1 mCi/mL de 3H-manitol (Manitol, D-[l" 3H(N)]-, NEN Catálogo N° NET101) foi refrigerada. Cada animal recebeu 10 pCi de 3H-manitol injectados i.v. num volume de 200 pL (isto é, 10 pL de solução de 3H-manitol + 190 pL de PBS por animal).

Anestesia

Os animais foram anestesiados com 35-60 mg/kg de pentobarbital i.p. (solução de 50 mg/mL). Deste modo, uma injecção i.p. de 0,2-0,3 mL anestesia um rato de 200-250 g. Como alternativa, pode ser utilizado um cocktail de cetamina/xilazina. Este cocktail pode ser preparado misturando 5,4 mL de cetamina (100 mg/mL) e 0,45 mL de xilazina (100 mg/mL). Os animais foram anestesiados com 0,25-0,3 mL deste cocktail. Foram permitidos dez - quinze minutos para que a anestesia fosse induzida. O estágio cirúrgico da anestesia foi confirmado pela falta de resposta a um estimulo doloroso (aperto do dedo do pé).

Preparação Cirúrgica

Foi feita uma incisão na linha mediana abdominal e o ceco e o intestino delgado foram exteriorizados. Um comprimento de 3,0 de seda foi colocado à volta do pediculo 75 renal esquerdo e a vasculatura foi ligada. As visceras foram, então, posicionadas de modo a expor o rim direito e o pediculo renal foi ligado, com cuidado para não danificar a veia cava. 0 ceco foi, então, posicionado de modo a visualizar o intestino delgado e a vasculatura que o supre. Foram identificados dois comprimentos de 5 cm de íleo que estavam livres de conteúdos luminais (alimento ou bile) e as ligaduras foram amarradas de modo a formar duas ansas cegas. As ansas foram, então, injectadas com os agentes de teste desejados. Os agentes foram injectados nas ansas abaixo da ligadura distai ao ceco. As visceras foram, então, posicionadas de modo a visualizar a veia cava e 200 pL da solução de 3H-manitol foram injectados i.v. Aplicou-se uma pressão leve ao local da ferida da perfuração depois da retirada da agulha para promover a coagulação. Depois da injecção de manitol as visceras foram colocadas de volta ao abdómen e as camadas de músculo e pele da ferida foram fechadas com agrafos cirúrgicos.

Injecção das Ansas Ileais 5 pg da Toxina A foram dissolvidos em 0,5 mL de PBS (± polímero) e a mistura foi carregada numa seringa e injectada numa ansa. O conteúdo da seringa foi, então, injectado, rapidamente, na ansa intestinal.

Manutenção dos Animais

Depois da cirurgia, os animais foram colocados numa gaiola em forma de caixa de sapato com aparas de madeira e 76 deixados a recuperar durante um período de 4 horas. Os animais recuperaram a consciência durante este período. Qualquer dos animais que apresentassem sinais evidentes de dor ou sofrimento foram imediatamente sacrificados.

Colheita e Processamento das Ansas

Quatro horas depois das substâncias de testes terem sido administradas, as ansas ileais foram colhidas. Os animais foram sacrificados utilizando 100% de CO2, o abdómen foi aberto e as ansas identificadas visualmente e utilizando os marcadores de sutura. Aparou-se o excesso de tecido das ansas e as mesmas foram cirurgicamente cortadas, com cuidado para não perder 0 conteúdo da ansa . As ansas foram colocadas sobre um pedaço de papel de pesar, o seu comprimento foi medido e o peso da ansa foi medido. A extremidade distai da ansa foi, então, colocada num frasco pré-pesado e a mesma foi cortada para que o conteúdo fosse recolhido. 500 pL de PBS foram, então, injectados na extremidade proximal da ansa para auxiliar na lavagem completa do conteúdo. A ansa foi, então, cortada ao meio e uma secção de 0,5 cm foi isolada, aberta e colocada em fixador.

Preparação da Amostra para Contagem de Cintilação

Os tubos foram pesados novamente para determinar 0 volume do conteúdo da ansa . Os tubos foram então submetidos a vórtice, vigorosamente, e 200 pL de amostra foram divididos 77 em partes iguais num frasco de cintilação plástico de 7 mL. Estas amostras foram misturadas com 5 mL de cocktail de cintilação Ultima Gold e submetidas a vórtice. Deixou-se as amostras equilibrar de um dia para o outro (para minimizar a quimioluminiescência) , as mesmas foram submetidas a vórtice e contadas no dia seguinte.

Ensaio MIC 0 ensaio de concentração inibitória minima (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) determina a concentração mínima de um agente anti-microbiano necessário para inibir o crescimento dos organismos de teste. Os ensaios MIC foram realizados contra um painel padrão de organismos como um instrumento de rastreio para identificar os compostos que têm actividade anti-microbiana. 0 ensaio MIC foi subsequentemente repetido contra outros painéis microbianos especializados; os compostos foram testados para verificação da actividade biocida, testados para verificação do decurso de tempo para matar, testados para verificação da toxicidade contra a cultura de tecidos de células desenvolvidas in vitro e, em alguns casos, testados para verificação da actividade anti-microbiana in vivo. 0 ensaio MIC foi realizado de acordo com o Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 1998, Vol. M100-S8, Eighth Informational Supplement, NCCLS, 940 West Valley Roas, Suite 1400, Wayne, PA 19087. 78

Em resumo, os polímeros a serem testados foram dissolvidos em soro fisiológico a 0,85% a uma concentração final de até 5000 pg/mL, o pH foi ajustado em 7,0 e a solução foi esterilizada por filtração por um filtro de 0,22 pm. Foram preparadas diluições duplas em série de polímero em caldo Mueller-Hinton com catiões divididos em partes iguais em placas de microtitulação de 96 poços. As placas foram, então, inoculadas com 5 x 105 células/poço do organismo alvo e incubadas 18-24 horas a 35°C. A densidade óptica (DO) foi, então, lida a 590 nm e o desenvolvimento do microrganismo foi graduado (DO >0,1 é considerada como sendo crescimento; DO <0,1 é considerada inibição de crescimento). O valor do MIC foi definido como a concentração mais baixa de composto que inibe o crescimento.

Os organismos testados incluem um amplo painel de estirpes de bactérias aeróbicas gram negativas e gram positivas de significado clinico, uma espécie anaeróbica única (Clostridium difficile), bem como várias estirpes de Candida spp.

Embora esta invenção tenha sido apresentada e descrita particularmente com referências às suas formas de realização preferidas, será entendido pelos especialistas na técnica que várias modificações na forma e pormenores podem ser feitas na mesma, sem afastamento do espírito e âmbito da invenção, conforme definida pelas reivindicações apensas.

Lisboa, 79

DOCUMENTOS REFERIDOS ΝΆ DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor, não sendo parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 54126800 Δ [0001] • WO 60133975 A [0001] • US 934495 A [0038] • WO 08934495 A [0050]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 1998, vol. M100-S8 [0149]

Lisboa, 24/09/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polímero, ou um seu sal com um catião farmacologicamente aceitável, para a preparação de um medicamento para tratar a diarreia associada a antibiótico num mamífero, em que o referido polímero compreende grupos funcionais ácidos pendentes ligados à estrutura de base do polímero por um grupo espaçador seleccionado entre (i) um grupo espaçador aromático, (ii) um grupo espaçador alifático linear e (iii) um grupo espaçador alifático ramificado, o referido polímero sendo substancialmente livre de grupos anidridos ácidos, em que o grupo funcional ácido é seleccionado entre grupos ácido carboxílico, grupos ácidos sulfónicos, grupos ácidos fosfónicos, grupos ácidos sulfâmicos, grupos ácidos borónicos, grupos hidrossulfato e grupos hidrofosfato e, em que o referido polímero é caracterizado por uma unidade de repetição de Fórmula 1, -(CR^HR^b X

em que X é o grupo espaçador; R1 e R2 são, independentemente, hidrogénio ou um grupo alquilo; ou R1 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo e R2 é um grupo funcional ácido; e Y é o grupo funcional ácido ou um seu sal com um 2 catião farmacologicamente aceitável, o referido polímero sendo substancialmente livre de grupos anidridos ácidos.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo espaçador é um grupo espaçador aromático.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero é caracterizado por uma unidade de repetição tendo um grupo funcional ácido pendente.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero compreende um grupo hidrófobo.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo funcional ácido é outro que não seja um grupo ácido sulfâmico.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o grupo funcional ácido é o ácido sulfónico.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que X é um grupo alquileno C2-C20, um grupo alcenileno C2-C20.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é um homopolímero.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é um copolímero. 3

10. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é um copolímero que é um terpolímero; e, opcionalmente, em que o polímero compreende ainda um monómero hidrófilo neutro; e em cujo caso, mais opcionalmente, o monómero hidrófilo neutro é seleccionado do grupo que consiste em acrilamida, metacrilamida, N-(2-hidroxietil)acrilamida e 2-hidroxietilmetacrilato.

11. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é um copolímero que é ainda caracterizado por um monómero tendo um grupo hidrófobo pendente; e, opcionalmente, em que o grupo hidrófobo é um grupo alquilo C3-C24 de cadeia linear ou ramificada, substituído ou não substituído, cíclico ou acíclico, um grupo arilo ou um grupo arilalquilo; e em cujo caso, ainda opcionalmente, em que 0 monómero hidrófobo é seleccionado entre 0 grupo que consiste em estireno, N-isopropilacrilamida, N-t-butilacrilamida, N-n-butilacrilamida, acrilato de heptafluorobutilo, N-n-decilalilamina, N-n-decilacrilamida, pentafluoroestireno, acrilato de n-butilo, acrilato de t-butilo, acrilato de n-decilo, N-t-butilmetacrilamida, n-decilmetacrilato, n-butilmetacrilato, n-hexilmetacrilato, N-n-hexilvinilamina, N-n-hexilalilamina, N-benzilalilamina, N-(ciclo-hexilmetil)alilamina e N-(n-decil)alilamina.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o monómero é seleccionado entre o grupo que consiste em ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido vinilsulfónico, ácido vinilfosfónico, ácido 3-aliloxi-2-hidroxi-7-propoanossulfónico, ácido vinilacético, hidrossulfato de 4 vinilo, di-hidrofosfato de vinilo, ácido undecenóico, hidrossulfato de undecenilo, ácido undecenilsulfónico, sulfonato de estireno e ácido vinilbenzóico; e bases conjugadas dos mesmos em associação com um catião farmacologicamente aceitável.

13. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero é administrado ao doente por via oral.

14. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero compreende sulfonato de poliestireno.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero compreende sulfonato de poliestireno de sódio.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é o sulfonato de poliestireno.

17. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é o sulfonato de poliestireno de sódio.

18. Utilização de um polímero, ou um seu sal com um catião farmacologicamente aceitável, para a preparação de um medicamento para tratar a diarreia associada a antibiótico num mamífero, em que o polímero é caracterizado por uma unidade de repetição de Fórmula II, 5 CHR2}- *

o*c I z I X Y (ii) em que R1 e R2 são, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo; ou R1 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo e R2 é um grupo funcional ácido; Z é 0 ou NH; Y é um grupo funcional ácido; e X é um grupo hidrocarbileno normal, ramificado, substituído ou não substituído, saturado ou insaturado ou um grupo hidrocarbileno normal ou ramificado, substituído ou não substituído, saturado ou insaturado em que, pelo menos um átomo de carbono está substituído por um heteroátomo, em que o grupo funcional ácido é seleccionado entre grupos ácidos carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos ácido fosfónico, grupos ácido sulfâmico, grupos ácido borónico, grupos hidrossulfato e grupos hidrofosfato.

19. Utilização de acordo com a revindicação 18, em que X é um grupo alquileno C2-C20, um grupo alcenileno C2-C20, um grupo alquileno C2-C20 interrompido num ou mais pontos por um heteroátomo, ou um grupo alcenileno C2-C20, interrompido num ou mais pontos por um heteroátomo. 6

20. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a diarreia associada com antibiótico é a diarreia associada com Clostridium difficile.

21. Utilização de acordo com a revindicação 20, em que o polímero é solúvel; e opcionalmente, em que o polímero tem um peso molecular que varia entre cerca de 400.000 e 1 milhão de Daltons; e, em cujo caso, mais opcionalmente, em que o polímero tem um peso molecular de cerca de 600.000 Daltons. Lisboa, 24/09/2007