PT1708690T

PT1708690T - Tratamento de fenilcetonúria com bh4

Info

Publication number: PT1708690T
Application number: PT48191522T
Authority: PT
Inventors: D Kakkis Emil; I Oppenheimer Daniel; Dorenbaum Alejandro; D Price Fredric
Original assignee: Biomarin Pharm Inc
Priority date: 2003-11-17
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2016-09-19
Also published as: AU2004291149A1; HUE029533T2; ES2905305T4; US20060040946A1; BRPI0416566A; US20100009996A1; PL3138566T3; US20180256582A1; MXPA06005451A; US9993481B2; CN1905863B; CN1905863A; IL175529A; US7566714B2; AU2004291149C1; CA2545584C; CY1124931T1; EP3138566A1; DK3138566T3; SI3138566T1

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE FENILCETONÚRIA COM BH4"

Referência Cruzada a outros Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisional U.S. No. 60/520,767, submetida a 17 de Novembro de 2003.

ANTECEDENTES TÉCNICOS DA INVENÇÃO

Campo Técnico da Invenção A presente invenção é genericamente dirigida à intervenção terapêutica de distúrbios metabólicos, particularmente aqueles envolvendo o metabolismo de aminoácidos. Mais particularmente, a presente invenção é dirigida a tetrahidrobiopterina (BH4), ou opcionalmente uma forma salina relacionada, para uso no tratamento de um sujeito com fenilcetonúria (PKU), onde a BH4 é administrada oralmente uma vez por dia a uma dose diária de 5 mg/kg a 30 mg/kg, e onde a BH4 é administrada em combinação com uma dieta restrita de proteína.

Antecedentes Técnicos da Invenção e Tecnologia Relacionada

Fenilcetonúria (PKU) é um distúrbio metabólico adquirido que foi primeiramente identificado na década de 1930. Na maioria dos casos, e até meados de 1990, foi pensado se tratar de um distúrbio do metabolismo de aminoácidos resultando de uma deficiência na enzima do fígado fenilalanina hidroxilase (PAH). Deficiências na PAH por sua vez resultam num excesso de fenilalanina (Phe) no cérebro e no plasma. A deficiência em PAH ultimamente manifesta-se numa falta de tirosina, que é um precursor para os neurotransmissores.

Quando não-detetada e não-tratada precocemente na vida de uma criança, PKU leva a um dano irreversível no sistema nervoso, retardamento mental grave e desenvolvimento pobre do cérebro. Características diferentes do retardamento mental em pacientes não-tratados incluem calcificação do cérebro, pigmentação leve, peculiaridades na marcha, postura ereta, e sentada, eczema e epilepsia. Foi reportada a existência de uma perda de 50 pontos no índice IQ de crianças no seu primeiro ano de infância, sendo PKU invariavelmente acompanhado por alguma perda de IQ. Uma vez detetada, a condição é tratada através do fornecimento a uma criança de uma dieta pobre em Phe. Em adultos, os suplementos proteicos rotineiramente administrados a pacientes clássicos com PKU podem ser desprovidos de Phe com a assunção de que tais adultos irão receber quantidades suficientes de Phe através da dieta remanescente, controlada num regime restrito, de tal forma que a dieta global seja uma dieta pobre em Phe. Do mesmo modo, às mulheres grávidas que sofrem da condição está recomendada uma dieta que é pobre em Phe para evitar o risco de limitação de desenvolvimento do feto e malformação congénita (síndrome PKU maternal).

Em anos mais recentes foi demonstrado que sintomas patológicos que se manifestam a partir de condições de excesso de Phe, coletivamente referidas como hiperfenilalaninamia (HPA), podem ser divididas em múltiplos distúrbios discretos, que são diagnosticados de acordo com as concentrações plasmáticas de Pge e a responsividade a um cofator para PAH. Num nível inicial, HPAs podem ser divididas em HPA causadas como um resultado de uma deficiência no cofator 6R-L-eritro-5, 6,7, 8-tetrahidrobiopterina (BH4; PKU maligna) e HPA resultando de uma deficiência em PAH. A última categoria é adicionalmente subdividida em pelo menos três categorias dependendo da concentração plasmática de Phe na ausência de intervenção dietética ou outro tipo de intervenção terapêutica (aqui referida como concentração plasmática de Phe não-restringida). A homeostasia de plasmática normal de Phe é intimamente controlada resultando numa concentração plasmática de Phe de 60 ymol/L ± 15 ymol/L. A PKU clássica (OMIM No. 261600) é a forma mais grave de PKU e resulta de mutações nulas ou graves na PAH, que levam a concentrações plasmáticas de Phe não-restringidas superiores a 1200 ymol/L em indivíduos não-tratados. Indivíduos com PKU clássica (ou grave) deverão ser tratados com um regime de dieta restrito que é baseado numa dieta muito pobre em Phe de forma a reduzir as suas concentrações de Phe a uma gama considerada segura. Formas leves de HPA foram também caracterizadas. Uma forma menos grave de PKU é uma que manifesta no plasma concentrações de Phe de 10-20 mg/dL (600-1200ymol/L), e é geralmente designada de "PKU leve". Esta forma moderada de PKU é gerida através do uso de restrições dietéticas moderadas, p.ex., uma dieta com baixo teor proteico global, mas não necessariamente desprovida de Phe. Finalmente, HPA leve, também referida como HPA benigna ou HPA não-PKU é caracterizada por concentrações plasmáticas de Phe entre 180-600ymol/L. Os indivíduos com HPA não-PKU não são rotineiramente tratados uma vez que eles são considerados possuírem níveis plasmáticos de Phe que se encontram na gama "segura". Em todo o caso, como acima mencionado, esses níveis de Phe são ainda significativamente elevados nesses indivíduos comparativamente ao normal, sujeitos não-PKU e podem apresentar sequelas prejudiciais em pelo menos mulheres grávidas e pacientes muito jovens. Para uma revisão mais detalhada de HPA resultando de deficiência em PAH, aqueles habilitados no estado da técnica são referidos em Scriver et al., 2001 (Hyperfenilalaninamia: Fenilalanina hidroxilase Deficiency, In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 1667-1724). As normas NIH indicam que para crianças com PKU, é preferível reduzir o nível plasmático de Phe a 360-420ymol/L. HPA também resulta de defeitos no metabolismo BH4. BH4 é um cofator essencial de ambas a tirosina e triptofano hidroxilase, as enzimas de passo limitante na biossíntese dos neurotransmissores dopamina e serotonina. Os efeitos de deficiências na dopamina e serotonina são coletivamente conhecidos como HPA "atípica" ou "maligna". Assim, diagnósticos tradicionais de HPA envolveram uma determinação de a HPA é ou não um resultado da deficiência de BH4 ou da deficiência de PAH. Tipicamente, o diagnóstico de PKU é estabelecido na base de uma concentração sanguínea persistentemente elevada de Phe. Após um rastreio positivo para um nível sanguíneo elevado de Phe (Phe plasmático> 120 ymol/L; Weglage et al., J. Inherit. Metab. Dis., 25:321-322, 2002), um rastreio diferencial é realizado em que é determinado se o Phe elevado é um resultado da deficiência em BH4 ou da deficiência em PAH. O diagnóstico diferencial envolve a determinação se a concentração elevada de Phe é diminuída como um resultado da administração de BH4 (teste de administração de BH4) . O teste de administração de BH4 envolve tipicamente uma administração isolada de BH4 de, p.ex., 5-20 mg/kg a ser administrada ao sujeito que se encontre numa dieta normal (i.e., não-restringida) e determinando se o sujeito se encontra a experienciar uma diminuição nos níveis de Phe (ver p.ex., Ponzone et al., Eur. J. Pediatr. 152:655-661, 1993; Weglage et al., J. Inherit. Metab. Dis., 25:321-322, 2002.)

Tipicamente, indivíduos que respondem a um teste de administração de BH4 através de um decréscimo nos níveis de Phe plasmático são diagnosticados como possuindo um defeito na homeostasia de BH4. Contudo, existem vários relatos de pacientes com um tipo de deficiência PAH responsiva a BH4 (Kure et ai., J. Pediatr. 135:375-378, 1999; Lassker et al., J. Inherit. Metabol. Dis. 25:65-70, 2002; Linder et al., Mol. Genet. Metab. 73:104-106, 2001; Spaapen et al., Mol. Genet, and Metabolism, 78:93-99, 2003; Trefz et al., 2001). Estes sujeitos possuem níveis plasmáticos de Phe que são típicos de PKU moderada, i.e., menos do que 1000 ymol/L e tipicamente menos do que 600 ymol/L. Pacientes que apresentam PKU clássica grave não são responsivos a testes típicos de administração de BH4 de 24 horas (Ponzone et al., N. Engl. J. Med 348(17):1722-1723, 2003).

Foi sugerido que indivíduos que são responsivos a BH4 não requerem intervenção dietética, mas deverão ser tratados com BH4. Similarmente, o inverso foi sugerido para sujeitos que foram diagnosticados como não-responsivos ao teste de administração de BH4, i.e., aqueles sujeitos deveriam ser tratados com restrição dietética e não com terapia de BH4. Ponzone et al. particularmente notaram que indivíduos que apresentam fenilcetonúria aguda não responderão a terapia BH4 e tal terapia não deveria ser usada nesses pacientes (Ponzone et al., N. Engl. J. Med 348(17):1722-1723, 2003). Assim, atualmente existem regimes terapêuticos divergentes para o tratamento de HPA dependendo se o indivíduo é ou não responsivo a BH4. Além do mais, foi sugerido que muito poucos pacientes irão beneficiar de uma terapia com BH4. De facto, pensa-se que apenas indivíduos com uma forma deficiente de PAH de HPA que irão beneficiar da terapia com BH4 são aqueles com PKU moderada. Uma vez que esses indivíduos irão tipicamente possuir níveis de Phe na gama de segurança (i.e., menos do que 600μΜ) , o estádio da doença pode ser controlado usando restrição dietética moderada (ver Hanley, N. Engl. J. Med 348(17):1723, 2003). Assim, a terapia BH4 quando usada isoladamente ou em combinação com qualquer outra intervenção terapêutica, não foi considerada como uma intervenção terapêutica viável para a vasta maioria dos indivíduos com HPA. BH4 é uma amina biogénica da família das pterinas de ocorrência natural. As pterinas estão presentes em fluídos fisiológicos e tecidos nas formas reduzidas e oxidadas, contudo, apenas a 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina é biologicamente ativa. Esta é uma molécula quiral e o enantiómero-6R do cofator é conhecido como sendo o enantiómero biologicamente ativo. Para uma revisão detalhada da síntese e distúrbios de BH4, ver Blau et al., 2001 (Disorders of tetrahidrobiopterin and related biogenic aminas. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 1275-1776). Apesar da elucidação do papel da deficiência de BH4 em ΗΡΑ, o tratamento com BH4 não foi sugerido uma vez que o tratamento é bastante dispendioso, tanto quanto $30,000 por ano para um adolescente ou adulto, comparativamente com $6,000 para uma terapia dietética restringida para fenilalanina (Hanley, N. Engl. J. Med 348(17):1723, 2003). Outro problema significativo com BH4 é que o composto é instável e prontamente é suscetível a oxidação aeróbica à temperatura ambiente (Davis et al., Eur. J. Biochem., Vol 173, 345-351, 1988; Patente U.S. No. 4,701,455) e apresenta um tempo de meia-vida de menos do que 8 horas à temperatura ambiente (Berneggar e Blau, Mol. Genet. Metabol. 77:304-313, 2002).

Assim, até à data, a intervenção dietética é a intervenção terapêutica típica usada para todos os pacientes com PKU clássica grave e em muitos pacientes com PKU moderada. Tal intervenção dietética tipicamente contempla a restrição do paciente a matéria alimentar que é composta por alimentos naturais que são livres de, ou contêm em baixa quantidade, Phe. Contudo, além da eliminação de Phe, tal regime dietético elimina muitas fontes de outros aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Consequentemente, sem suplementação, tal dieta fornece proteínas inadequadas, energia, vitaminas e minerais para suportar o crescimento e desenvolvimento normal. Uma vez que PKU é uma manifestação de uma falta de tirosina, que resulta Da falta de hidroxilação de fenilalanina, a tirosina torna-se um aminoácido essencial e suplementes dietéticos para PKU deverão conter um suplemento de tirosina. Deste modo, é comum o uso de fórmulas nutricionais para suplementar as dietas de pacientes com PKU. Também, para bebés, é comum o uso de fórmulas para crianças que possuem um baixo conteúdo de Phe como fonte alimentar única ou primária

Contudo, a restrição proteica dietética é, no melhor dos cenários, uma forma ineficaz de controlar PKU em muitas classes de pacientes. Por exemplo, o tratamento é de importância vital durante a gravidez uma vez que elevados níveis de Phe podem resultar num retardamento intrauterino do desenvolvimento do cérebro. Contudo, uma dieta pobre em proteína durante a gravidez pode resultar em desenvolvimento renal retardado e pensa-se ser responsável por produzir uma redução subsequente no número de nefrónios e potencialmente leva à hipertensão na idade adulta. (D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17)1723-1724, 2003).

Um pobre cumprimento por parte do paciente de uma dieta restringida para proteínas é também um problema. As fórmulas proteicas desprovidas de Phe disponíveis possuem um sabor amargo tornando-se difícil de assegurar que o paciente consuma quantidades suficientes de proteína para manter as taxas diárias requeridas de proteína, aminoácidos, vitaminas, minerais, e semelhantes. Tal +e particularmente um problema com crianças mais velhas que podem requerer até 7 0g, peso seco, das fórmulas por dia. Por exemplo, Schuett, V. E.; 1990; DHHS Publication No HRS-MCH-89-5, relata que mais do que 40% dos pacientes com PKU nos E.U.A. com oito anos de idade ou mais não aderem ao tratamento dietético. (Patente U.S. No. 6,506,422). Muitos pacientes adolescentes falham no rigoroso seguimento da dieta restringida para proteínas devido aos receios com a atitude dos seus pares.

Steinfeld et al., Amino Acids 25:63-68, 2003 discute uma hipótese sobre o mecanismo bioquímico de BH4 responsividade na deficiência da fenilalanina hidroxilase.

Hennerman et al., Journal of Inherited Metabolic Disease 25(Suppl. 1):21, 2002 discute a responsividade parcial e total a tetrahidrobiopterina em fenilcetonúria (PKU) clássica e moderada

Muntau et al., N. Engl. J. Med 347(26):2122-2132, 2002 discute tetrahidrobiopterina como um tratamento alternativo para fenilcetonúria moderada.

Lindner et al., Molecular Genetics and Metabolism 73(1):104-106, 2001 discute que a responsividade a tetrahidrobiopterina em fenilcetonúria difere em pacientes com o mesmo genótipo.

Bernegger et al., Molecular Genetics and Metabolism 77(4):304-313, 2002 discute uma elevada frequência de responsividade a tetrahidrobiopterina entre hiperfenilalaninamias: um estudo de 1919 pacientes observado entre 1988 e 2002.

Assim, permanece uma necessidade para um medicamento terapêutico para substituir ou suplementar e aliviar as restrições dietéticas a que um paciente de PKU é submetido. A presente invenção é dirigida ao cumprimento de tal necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção descreve intervenção em distúrbios metabólicos, particularmente aqueles envolvendo o metabolismo de aminoácidos. A invenção é definida pelas reivindicações anexas. Mais particularmente, a presente invenção é dirigida a tetrahidrobiopterina (BH4), ou opcionalmente uma forma salina relacionada para uso no tratamento de um sujeito com fenilcetonúria (PKU), onde a BH4 será administrada oralmente uma vez por dia a uma dose diária de 5 mg/kg a 30 mg/kg, e onde a BH4 será administrada em combinação com uma dieta restrita de proteína. Também descritos estão métodos e composições para o tratamento de sujeitos exibindo níveis elevados de fenilalanina, por exemplo, sujeitos sofrendo de hiperfenilalanemia, fenilcetonúria moderada ou fenilcetonúria aguda clássica.

Num aspeto, a invenção descreve métodos de tratamento de fenilcetonúria aguda clássica (PKU) num sujeito compreendendo a administração a um sujeito de uma dieta restringida para proteína em combinação com uma composição compreendendo tetrahidrobiopterina (BH4), onde a administração combinada da dieta restringida para proteína e BH4 é eficaz na diminuição da concentração de fenilalanina no plasma do sujeito comparativamente com a concentração na ausência da administração combinada. Em formas de realização especificas, o sujeito é um que não manifesta uma deficiência na homeostasia de BH4. 0 sujeito pode ser um indivíduo que não manifesta sintomas da deficiência no neurotransmissor L-Dopa.

Um sujeito selecionado para tratamento de acordo com a invenção irá apresentar uma concentração plasmática elevada de Phe, com tal concentração a poder ser maior do que 1800 μΜ/L na ausência do tratamento terapêutico. Outras formas de realização contemplam que o sujeito apresente uma concentração plasmática elevada de Phe superior a 1000 μΜ na ausência de um regime terapêutico. Em formas de realização preferenciais, a administração combinada de acordo com a invenção diminui a concentração plasmática elevada de fenilalanina do sujeito a menos do que 600 μΜ. Mais preferencialmente, esta é diminuída a menos do que 500 μΜ. Ainda mais preferencialmente, a administração combinada diminui a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito a 360 μΜ ± 15 μΜ. A BH4 pode ser administrada numa quantidade entre cerca de 1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg, ou entre cerca de 5 mg/kg até cerca de 30 mg/kg. A BH4 pode ser administrada numa dose diária única ou em múltiplas doses numa base diária. Nalgumas formas de realização, a terapia com BH4 não é continua, mas BH4 é administrada numa base diária até que a concentração plasmática de fenilalanina no sujeito seja diminuída a menos do que 360 μΜ. Preferencialmente, em circunstâncias onde a concentração plasmática de fenilalanina do sujeito é monitorizada numa base diária, a BH4 é administrada quando um aumento de 10% na concentração plasmática de fenilalanina é observado. Preferencialmente, a BH4 é administrada numa forma cristalizada estabilizada de BH4 que apresenta maior estabilidade do que a BH4 não- cristalizada estabilizada, Mais preferencialmente, a forma cristalizada estabilizada de BH4 compreende pelo menos 99,5% de BH4-6R pura. Precursores tais como dihidrobiopterina (BH2) , e sepiapterina podem também ser administrados. BH4 pode ser administrada oralmente. A dieta restringida para proteina administrada de acordo com a invenção é uma que é uma dieta restringida para fenilalanina onde a administração total de fenilalanina do sujeito é restringida a menos do que 600 mg por dia. Noutras formas de realização, a dieta restringida para proteina é uma dieta restringida para fenilalanina onde a fenilalanina total é restringida a menos do que 300 mg por dia. Ainda noutras formas de realização, a dieta restringida para proteina é uma que é suplementada com aminoácidos, tais como tirosina, valina, isoleucina e leucina. Em certas formas de realização, uma dieta restringida para proteina compreende um suplemento proteico e a BH4 é fornecida na mesma composição do suplemento proteico.

Em formas de realização especificas, o sujeito é um que foi diagnosticado como possuindo uma fenilalanina hidroxilase (PAH) mutante. A PAH mutante pode compreender uma mutação no domínio catalítico de PAH. Exemplos de tais mutações incluem uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo de F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, e Y414C.

Também aqui contemplado está um método para o tratamento de uma mulher grávida possuindo hiperfenilalaninamia (HPA) compreendendo a administração a um sujeito de uma dieta restringida para proteína em combinação com uma composição compreendendo tetrahidrobiopterina (BH4), onde a administração combinada da dieta restringida para proteína e BH4 é eficaz na diminuição da concentração de fenilalanina no plasma do sujeito comparativamente com a concentração na ausência da administração combinada. Em certas formas de realização, o sujeito apresenta uma concentração plasmática não-restringida de fenilalanina superior a 180 μΜ mas inferior a 600μΜ. Noutras formas de realização, o sujeito apresenta uma concentração plasmática não-restringida de fenilalanina superior a 500 μΜ mas inferior a 1200μΜ. Ainda noutras formas de realização, o sujeito apresenta uma concentração plasmática não-restringida de fenilalanina superior a 1000 μΜ.

Também contemplado está um método de tratamento de um paciente possuindo uma concentração plasmática de fenilalanina acima do normal (p.ex., superior a ΙδΟμΜ/L e mais preferencialmente, superior a 360pM/L) compreendendo a administração ao paciente de uma composição BH4 estabilizada numa concentração eficaz para produzir um decréscimo na concentração plasmática de fenilalanina do paciente. Preferencialmente, a composição BH4 estabilizada é estável à temperatura ambiente ou mais do que 8 horas. O paciente irá presumivelmente apresentar uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 180 μΜ antes da administração de BH4. Mais particularmente, o paciente possui uma concentração plasmática de fenilalanina entre 120 μΜ e 200 μΜ. Noutras formas de realização, o paciente possui uma concentração plasmática de fenilalanina entre 200 μΜ e 600 μΜ. Ainda noutras formas de realização, o paciente possui uma concentração plasmática de fenilalanina entre 600 μΜ e 1200 μΜ. Ainda outra classe de pacientes a serem tratados são aqueles possuindo uma concentração plasmática não-restringida de fenilalanina superior a 1200 μΜ. Em formas de realização específicas, o paciente é uma criança, mais particularmente, uma criança possuindo uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ. Noutras formas de realização, a paciente encontra-se grávida e a paciente grávida possui uma concentração plasmática de fenilalanina entre cerca de 200 ym até cerca de 600 μΜ. Pacientes grávidas com uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ são candidatos particularmente atrativos para este tipo de terapia, como o sãos pacientes que do género feminino em idade reprodutiva que estejam a considerar gravidez. Nessas formas de realização, em que o paciente possui uma concentração plasmática de fenilalanina superior a 1200 μΜ, o método adicionalmente compreende a administração de uma dieta restringida para proteína ao paciente. A invenção também contempla o tratamento de um paciente possuindo fenilcetonúria, compreendendo a administração ao paciente de uma composição BH4 estabilizada numa concentração eficaz para produzir um decréscimo na concentração plasmática de fenilalanina do paciente onde o paciente foi diagnosticado como não responsivo a um teste de administração de dose isolada de BH4. Preferencialmente, o paciente é não-responsivo às 24 horas após a administração de BH4.

Outro aspeto relacionado da presente publicação fornece um teste de administração de múltiplas doses que envolve a administração de mais do que uma dose de BH4. Os dados aqui descritos demonstram que sujeitos que são considerados "não-responsivo" a um teste de administração de dose única de BH4 podem responder a doses múltiplas de BH4 com uma redução significativa nos níveis de fenilalanina. Numa forma de realização, pelo menos duas doses de BH4 que se podem encontrar entre cerca de 5 mg a 40 mg são administradas a um sujeito ao longo de um período de tempo superior a um dia, preferencialmente 7 dias.

Os métodos de tratamento de acordo com a presente invenção podem compreender a administração entre cerca de 10 mg BH4/kg peso corporal até cerca de 200 mg BH4/kg peso corporal. A BH4 pode ser administrada através de qualquer via de administração comummente usada na prática, p.ex., oralmente. A BH4 pode ser administrada diariamente ou em qualquer outro intervalo de tempo, p.ex., a cada dia alternado ou mesmo semanalmente. A BH4 é preferencialmente administrada em combinação com uma dieta restringida para proteína, e opcionalmente concorrentemente com folatos, incluindo precursores de folato, ácidos fólicos, e derivados de folato. É contemplado que BH4 será administrada como uma parte de um componente de uma formulação proteica terapêutica. A dieta restringida para proteína pode compreender uma dieta normal de produtos alimentares contendo baixo teor proteico. Alternativamente, a dieta restringida para proteína compreende a administração de uma fórmula proteica que consiste de uma dieta proteica desprovida de fenilalanina, e o sujeito obtém a sua quantidade essencial de Phe a partir de componentes remanescentes de uma dieta com muito baixo teor proteico. Em certas formas de realização, a dieta restringida para proteína é suplementada com suplementos proteicos desprovidos de fenilalanina. Mais particularmente, os suplementos proteicos desprovidos de fenilalanina compreendem tirosina ou outros aminoácidos não-essenciais. Noutras formas de realização, os suplementos proteicos podem também compreender folatos, incluindo precursores de folato, ácidos fólicos, e derivados de folato. A invenção como aqui descrita pode ser usada no tratamento de uma criança possuindo fenilcetonúria, compreendendo a administração de uma composição de BH4 estabilizada ao paciente numa concentração eficaz para produzir um decréscimo na concentração plasmática de fenilalanina na criança onde a criança se encontra entre os 0 e 3 anos de idade e a criança possui uma concentração plasmática de fenilalanina entre cerca de 360μΜ até cerca de 4800μΜ. Antes da administração de BH4, a criança possui uma concentração de fenilalanina de cerca de 1200μΜ e a administração de BH4 diminui a concentração plasmática de fenilalanina até cerca de ΙΟΟΟμΜ. Noutras formas de realização, antes da administração de BH4, a criança possui uma concentração de fenilalanina de cerca de 800μΜ e a administração de BH4 diminui a concentração plasmática de fenilalanina até cerca de βΟΟμιη. Ainda noutras formas de realização adicionais, antes da administração de BH4, a criança possui uma concentração de fenilalanina de cerca de 400μΜ e a administração de BH4 diminui a concentração plasmática de fenilalanina até cerca de 300μΜ. A invenção deverá preferencialmente reduzir a concentração plasmática de fenilalanina de uma criança até 360 ± 15 μΜ.

Também contemplada está uma composição compreendendo uma forma cristalizada, estabilizada de BH4 que é estável à temperatura ambiente ou mais do que 8 horas e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode adicionalmente compreender um suplemento proteico médico. A composição BH4 pode fazer parte de uma fórmula destinada a crianças. O suplemento proteico pode ser desprovido de fenilalanina. O suplemento proteico pode ser fortalecido com L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina a uma concentração de 20 mg/100 g suplemento, L-taurina a uma concentração de 40 mg/100 g suplemento e selénio. Ela pode adicionalmente compreender as doses diárias recomendadas de minerais, p.ex., cálcio, fósforo e magnésio. O suplemento pode adicionalmente compreender a dose diária recomendada de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de L-leucina, L-prolina, acetato de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidratada, L-triptofano, L-serina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, Ácido L-glutâmico, e Ácido L-aspártico. Adicionalmente, o suplemento pode ser fortalecido com a dose diária recomendada de vitaminas A, D e E. 0 suplemento pode compreender um conteúdo de gordura que fornece pelo menos 40% da energia do suplemento. Tal suplemento pode ser fornecido na forma de um suplemento em pó ou na forma de uma barra proteica.

Outras propriedades e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deverá ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao mesmo tempo que indicam formas de realização preferenciais da invenção, são fornecidos apenas para efeitos de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações serão evidentes para aqueles habilitados no estado da técnica desta descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS A intervenção dietética é a intervenção terapêutica usada para todos os pacientes com PKU clássica aguda e em muitos pacientes com PKU clássica aguda e em muitos pacientes com PKU moderada. Contudo, tal restrição proteica dietética leva a um fornecimento inadequado de proteína, energia, vitaminas e minerais para suportar o crescimento e desenvolvimento normal. Assim, a restrição proteica dietética é, no seu melhor, uma forma ineficaz de controlo da PKU em muitas classes de pacientes, especialmente em mulheres grávidas e em crianças jovens, ambas categorias de sujeitos que requerem quantidades elevadas de proteína comparativamente com indivíduos adultos normais. O uso de restrição dietética também é limitado pelo pobre cumprimento por parte do paciente de uma dieta restringida para proteina. Em Outubro de 2000, os Institutos Nacionais de Saúde divulgaram uma declaração de consenso sobre o rastreio e gestão de PKU em que a "pesquisa sobre alternativas não-dietéticas para o tratamento de PKU [foi] fortemente encorajada". Assim, existe uma necessidade reconhecida no estado da técnica para um medicamento terapêutico para substituir e/ou suplementar e aliviar as restrições dietéticas a que um paciente com PKU é sujeito. O presente pedido de patente descreve pela primeira vez uma intervenção farmacêutica para PKU baseada na administração de uma forma estabilizada de BH4. Os métodos e composições para a produção das referidas composições com BH4 estabilizada são descritas em maior detalhe no Exemplo 2. As composições BH4 estabilizadas

As composições BH4 estabilizadas para uso de acordo com a presente invenção compreendem cristais BH4 que são estáveis à temperatura ambiente ou mais do que 8 horas. A presente invenção contempla o uso de composições farmacêuticas de BH4 estabilizada sozinha que pode ser entregue via administração oral. As composições podem adicionalmente compreender composições BH4 em combinação com um antioxidante que auxilia na prolongação da estabilidade de uma composição BH4. Adicionalmente, discutidos em maior detalhe estão composições alimentares que podem compreender BH4. Por exemplo, composições em pó de proteínas convencionais tais como PHENEX, LOFENALAC, PHENYL-FREE e semelhantes que foram modificadas através da adição de BH4. A presente invenção contempla a intervenção terapêutica de vários fenótipos PKU através da administração de BH4 em combinação com uma dieta restringida para proteína. A BH4 a ser administrada em combinação com a dieta pode, embora não necessite obrigatoriamente, de ser uma composição BH4 estabilizada como aqui descrita. Aqueles habilitados no estado da técnica estão a par dos métodos de produção de uma composição BH4 que é instável à temperatura ambiente e à luz. Enquanto terapias usando a referida composição são limitadas pela instabilidade da composição BH4, o seu uso é ainda assim comtemplado em certas terapias de combinação onde pacientes com PKU não-responsivos a BH4 padecendo de PKU clássica aguda são tratados com um curso de tratamento com BH4 e restrição proteica dietética. Métodos e composições para realização do tratamento de distúrbios metabólicos, incluindo PKU, são aqui descritos em maior detalhe abaixo. I. Pacientes a Serem Tratados A presente invenção é dirigida ao tratamento de uma variedade de populações de pacientes HPA com métodos que compreendem o uso de composições BH4 estabilizadas, ou de composições BH4 não-estabilizadas, seja isoladamente ou em combinação com outros regimes terapêuticos, para a gestão de HPA e/ou PKU. Em particular, é contemplado que qualquer tipo de BH4, numa forma estabilizada oi outra pode ser usada para tratar essa população de pacientes que apresente concentrações de fenilalanina que são suficientemente baixas a ponto da intervenção dietética não ser normalmente usada (i.e., pacientes com HPA moderada). Tais pacientes que são propícios a tordas as formas de tratamento com composições BH4 para melhoramento dos efeitos de HPA moderada, incluem mulheres grávidas e crianças com concentrações séricas inferiores a 200μΜ. As várias populações de pacientes, e as suas diferentes necessidades terapêuticas, são discutidas em maior detalhe na presente secção.

Certas formas de realização da presente invenção são dirigidas aa tratamento de PKU aguda clássica através da administração a um sujeito de uma dieta restringida para proteína em combinação com uma composição compreendendo BH4, onde a administração combinada da dieta restringida para proteína e BH4 é eficaz na diminuição da concentração de fenilalanina no plasma do referido sujeito comparativamente com a referida concentração na ausência da referida administração combinada. Adicionalmente, a invenção também contempla o tratamento de uma mulher grávida que possui HPA através da administração à mulher de uma dieta restringida para proteína em combinação com BH4, de tal forma que a administração combinada da dieta restringida para proteína e BH4 é eficaz na diminuição da concentração de fenilalanina no plasma da mulher grávida comparativamente com a referida concentração na ausência da referida administração combinada. Em formas de realização específicas, uma terapia é contemplada para pacientes que manifestem níveis de Phe superiores a 420 μΜ.

Outras formas de realização da invenção contemplam a administração de uma composição de BH4 estabilizada a qualquer indivíduo que possui HPA, caracterizado por uma concentração plasmática de Phe superior a 180 μΜ antes da administração de BH4, numa quantidade eficaz para produzir um decréscimo na referida concentração plasmática de Phe do paciente. A invenção também pode ser usada no tratamento de pacientes com PKU que foram diagnosticados como não-responsivos a um teste de administração de BH4. A invenção será útil no tratamento de uma criança possuindo PKU caracterizada por concentrações elevadas de Phe entre superior a 300pM/L com uma composição BH4 estabilizada como aqui descrita. Por "criança", a presente invenção refere-se a um paciente que se encontra entre as idades de 0 até cerca de 36 meses.

Os dados aqui descritos demonstram que sujeitos que são considerados "não-responsivos" ao teste de administração de dose única de BH4 podem de facto responder a múltiplas doses de BH4 com uma redução significativa nos níveis de fenilanina. Assim, um teste de administração de dose múltipla pode envolver a administração de mais do que uma dose de BH4. Exemplos de testes de administração de doses múltiplas incluem a administração entre 5 e 40 mg/kg tetrahidrobiopterina, ou mais preferencialmente 10 a 20 mg/kg, ao longo de um período de tempo de pelo menos 1 dia, ou pelo menos 2 dias, ou pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 10 ou 14 dias, preferencialmente 2-14, 3-14, ou 5-10 dias, e o mais preferencialmente 7 dias. A invenção fornece o uso, de acordo com a invenção, de qualquer um dos polimorfos de tetrahidrobiopterina aqui descritos, ou preparações farmacêuticas estáveis compreendendo qualquer um dos referidos polimorfos, para tratamento de condições associadas com níveis elevados de fenilalanina ou níveis reduzidos de tirosina, que podem ser causados, por exemplo, por reduzidos níveis de atividade da fenilalanina hidroxilase, tirosina hidroxilase, ou triptofano hidroxilase. Condições associadas com níveis elevados de fenilalanina especificamente incluem fenilcetonúria, ambas moderada e aguda clássica, e hiperfenilalaninamia como acima descrita, e populações de pacientes exemplificativas incluem os subgrupos de pacientes aqui descritos assim como quaisquer outros pacientes exibindo níveis de fenilalanina acima do normal. A. Caracteristicas da PKU clássica aguda e tratamento relacionado de acordo com a presente invenção.

Como aqui acima indicado, na secção do Estado da Técnica, PKU aguda manifesta-se numa concentração plasmática de Phe superior a 1200yM/L e pode atingir valores tão altos como 4800yM/L. Pacientes que possuem este distúrbio deverão ser tratados com uma dieta desprovida de Phe de forma a baixar as suas concentrações plasmáticas de Phe a um nivel que é clinicamente aceitável (tipicamente, menos do que 600pM/L, e preferencialmente menos do que 300yM/L). Esses pacientes são apenas capazes de tolerar um máximo entre 250-350 mg de Phe por dia em regime dietético (Spaapen et al., Mol. Genet and Metab. 78:93-99, 2003). Como tal, estes pacientes são iniciados com uma fórmula de dieta restringida para Phe entre 7-10 dias após o nascimento e são carregados com esta restrição dietética para o período remanescente das suas vidas. Qualquer aliviação das restrições dietéticas rigorosas a que estes indivíduos estão sujeitos seria portanto benéfica.

Os testes usados para o diagnóstico de indivíduos com Phe clássica são descritos em maior detalha abaixo na Secção III. Estes testes revelaram que pacientes com PKU aguda clássica são não-responsivos a BH4 e requerem uma dieta pobre em fenilalanina (Lucke et al., Pediatr. Neurol. 28:228-230, 2003). Na presente invenção, contudo, é contemplado que esta classe de pacientes com PKU deveria ser tratada com BH4 como reivindicado de forma a a que a necessidade para uma dieta rigorosa desprovida de fenilalanina seja aliviada.

Assim, é contemplado que a invenção determine se o paciente padece de PKU aguda clássica através da monitorização da concentração plasmática de Phe do indivíduo. 0 paciente é então tratado através da administração de um regime combinado de uma dieta pobre em proteína e BH4, de tal forma que é produzido um decréscimo de 25% na concentração plasmática de Phe do paciente. Preferencialmente, a invenção irá produzir um decréscimo de 30% na concentração plasmática de Phe. Ainda mais preferencialmente, a invenção irá produzir um decréscimo de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou superior na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, onde um paciente com PKU clássica aguda apresenta uma concentração de Phe de 4800yM/L, um decréscimo de 90% na concentração de Phe irá produzir uma concentração plasmática de Phe de 480pM/L, uma concentração que é suficientemente baixa para requerer menor restrição dietética). É claro que, deverá ser entendido que o tratamento de acordo com a presente invenção (seja para o tratamento de PKU clássica aguda ou qualquer outra HPA aqui descrita), deverá tentar reduzir a concentração plasmática de Phe do paciente a níveis tão próximos de 360pM/L ± 15yM/L quanto possível.

Em formas de realização preferenciais, a concentração plasmática de Phe do paciente com PKU aguda clássica a ser tratado é reduzida de uma qualquer quantidade de concentração plasmática não-restringida de Phe que é superior a ΙΟΟΟμΜ/L a qualquer nível plasmático de Phe que é menor do que 600yM/L. É claro que, mesmo se o tratamento combinado com BH4 e uma dieta restringida para proteína produzir um decréscimo menor na concentração plasmática de Phe, p.ex.r até um nível entre 800yM/L até cerca de 1200yM/L, tal será visto como um resultado clinicamente útil da terapia uma vez que pacientes que possuem concentrações plasmáticas de Phe nesta gama podem gerir a doença através da simples restrição da quantidade de proteína na dieta por oposição à ingestão de uma fórmula restringida para Phe, assim resultando num forte melhoramento da qualidade de vida do indivíduo, assim como conduzindo a um maior cumprimento por parte do paciente relativamente à restrição dietética.

Qualquer aumento na quantidade dos níveis dietéticos de Phe que podem ser tolerados pelo paciente como um resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, é contemplado que como um resultado da administração da Terapia baseada em BH4, o paciente será capaz de aumentar a sua administração de Phe dietética desde 250-350 mg/dia a 350-400 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado de um paciente com PKU aguda clássica para um paciente com PKU moderada). É claro que, seria preferível que a intervenção terapêutica aqui ensinada permitisse ao paciente aumentar a sua administração de Phe dietética desde 250-350 mg/dia a 400-600 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado de um paciente com PKU aguda clássica para um paciente com PKU moderada), ou ainda mais preferencialmente, para permitir ao paciente apresentar uma administração superior a 600 mg Phe/dia (i.e., administração dietética normal). B. Caracteristicas de pacientes com PKU não-responsivos a BH4 com PKU e tratamento relacionado de acordo com a presente invenção.

Um segundo grupo de pacientes que pode ser tratado com os métodos da presente invenção é o dos indivíduos que que foram determinados possuir uma concentração plasmática elevada de Phe i.e., qualquer concentração que é superior a 200yM/L, mas que foram diagnosticados como sendo não-responsivos a terapia com BH4 (como determinado pelo teste de administração de BH4 abaixo descrito). Tais pacientes pdodem incluir aqueles indivíduos que possuem PKU moderada (i.e., concentração plasmática de Phe até 600pM/L), indivíduos que possuem PKU moderada (i.e., concentração plasmática de Phe entre 600yM/L até cerca de 1200pM/L), assim cornos pacientes que possuem PKU aguda clássica (i.e., concentração plasmática de Phe superior a 1200yM/L).

Aos pacientes que são não-responsivos a terapia com BH4, é administrado BH4 em combinação com uma quantidade reduzida de proteína na sua dieta de forma a diminuir a concentração plasmática de Phe do paciente. Os métodos da presente invenção são realizados de tal forma que a administração da terapia com BH4 produz um maior decréscimo na concentração plasmática de Phe do paciente comparativamente com o decréscimo que é produzido com o mesmo protocolo dietético administrado na ausência de uma terapia com BH4.

Em formas de realização preferenciais, aos pacientes é administrada uma composição que compreende a forma cristalizada, estabilizada de BH4 caracterizada no Exemplo 2 aqui abaixo descrito. Esta composição BH4 difere das previamente disponíveis no estado da técnica no sentido de que é mais estável à temperatura ambiente do que preparações previamente conhecidas daqueles habilitados no estado da técnica, p.ex., aquelas disponíveis em kits de administração de BH4 (Schircks Laboratories, Jona, Suiça.) Assim, uma formulação BH4 pode ser armazenada à temperatura ambiente ou a uma temperatura de refrigeração e pode reter uma maior potência do que as composições BH4 previamente disponíveis. Como tal, é contemplado que esta forma de BH4 apresentará uma maior eficácia terapêutica do que uma concentração similar das composições BH4 previamente disponíveis. Esta maior eficácia pode ser usada para produzir um resultado terapeuticamente eficaz mesmo em pacientes que foram previamente identificados como sendo não-responsivos a BH4.

Tal como o subconjunto de pacientes descritos acima na secção IA, os pacientes não-responsivos a BH4 descritos na anterior secção podem ser tratados pelas composições BH4 estabilizadas seja isoladamente ou em combinação com restrições dietéticas. As restrições dietéticas podem consistir de uma dieta que restringe a administração de Phe através do fornecimento de uma fórmula proteica médica sintética que apresenta uma quantidade diminuída de Phe ou alternativamente, a restrição dietética pode ser uma que simplesmente requer que o paciente limite a sua administração total de proteína independentemente de permitir ao paciente de ingerir alimentos normais em quantidades limitadas.

Os resultados terapêuticos preferenciais para pacientes com PKU aguda clássica na Secção IA acima são incorporados na presente secção para efeitos de referência. Os resultados terapêuticos preferenciais para pacientes com PKU moderada (i.e., pacientes que apresentam uma concentração plasmática não-restringida de Phe de βΟΟμΜ/L a 1200yM/L) incluem um decréscimo de pelo menos 25% na concentração plasmática de Phe do paciente. Preferencialmente, o método irá produzir um decréscimo de 30% na concentração plasmática de Phe. Ainda mais preferencialmente, o método irá produzir um decréscimo de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou superior na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, onde um paciente com PKU moderada clássica apresenta uma concentração de Phe de ΙΟΟΟμΜ/L, um decréscimo de 90% na concentração de Phe irá produzir uma concentração plasmática de Phe de ΙΟΟμΜ/L, uma concentração que é suficientemente baixa para requerer menor restrição dietética).

Em formas de realização preferenciais, a concentração plasmática de Phe do paciente com PKU moderada a ser tratado é reduzida de uma qualquer quantidade de concentração plasmática não-restringida de Phe que se encontra entre 600yM/L a 1200yM/L a qualquer nivel plasmático de Phe que é menor do que 300pM/L. Um tratamento particularmente preferencial com BH4 (seja isoladamente ou em combinação com uma restrição dietética) produz um decréscimo na concentração plasmática de Phe, p.ex., até um nivel entre 200yM/L até cerca de 400yM/L, que será visto como um resultado clinicamente útil da terapia uma vez que pacientes que possuem concentrações plasmáticas de Phe nesta gama podem gerir a doença através da simples restrição da quantidade de proteína na dieta por oposição à ingestão de uma fórmula restringida para Phe. De facto, em muitos estudos, é ensinado que tais pacientes podem até ter uma dieta normal.

Qualquer aumento na quantidade dos níveis dietéticos de Phe que podem ser tolerados pelo paciente como um resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, é contemplado que como um resultado da administração da terapia baseada em BH4 (seja isoladamente ou em combinação com outra intervenção terapêutica), o paciente será capaz de aumentar a sua administração de Phe dietética desde 350-400 mg/dia até 400-600 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado do de um paciente com PKU moderada para um paciente com PKU moderada) . É claro que, seria preferível que a intervenção terapêutica aqui ensinada permitisse ao paciente aumentar a sua administração de Phe dietética desde 350-400 mg/dia a 400 pata permitir ao paciente apresentar uma administração superior a 600 mg Phe/dia (i.e.r administração dietética normal).

Mesmo quando o paciente a ser tratado for um que manifeste apenas PKU moderada, i.e., apresentar uma permissividade dietética de 400-600 mg Phe administração/dia), ele beneficiará das Terapia baseadas em BH4 da presente invenção uma vez que é desejável a produção de uma concentração plasmática normalizada de Phe que é tão próxima de 360yM/L ± 15yM/L quanto possível. Para tais pacientes, os resultados terapêuticos preferenciais incluirão um decréscimo de pelo menos 25% na concentração plasmática de Phe do paciente. Preferencialmente, o método irá produzir um decréscimo de 30% na concentração plasmática de Phe. Ainda mais preferencialmente, o método irá produzir um decréscimo de 40%, 50%, 60%, ou superior na concentração plasmática de Phe do indivíduo (por exemplo, onde um paciente com PKU moderada apresenta uma concentração de Phe de 600pM/L, um decréscimo de 60% na concentração de Phe irá produzir uma concentração plasmática de Phe de 360yM/L, i.e., uma concentração normal, aceitável de Phe plasmático).

Em formas de realização preferenciais, a concentração plasmática de Phe do paciente com PKU moderada a ser tratado é reduzida de uma qualquer quantidade de concentração plasmática não-restringida de Phe que se encontra entre 400gM/L e 600yM/L a qualquer nivel plasmático de Phe que é menor do que ΙΟΟμΜ/L. É claro que, mesmo se o tratamento com BH4 (seja isoladamente ou em combinação com uma restrição dietética) produz um decréscimo menor na concentração plasmática de Phe, p.ex., até um nível entre 200yM/L até cerca de 400yM/L, tal será visto como um resultado clinicamente útil da terapia.

Qualquer aumento na quantidade dos níveis dietéticos de Phe que podem ser tolerados pelo paciente como um resultado do tratamento será considerado como sendo um resultado terapeuticamente eficaz. Por exemplo, é contemplado que como um resultado da administração da Terapia baseada em BH4 (seja isoladamente ou em combinação com outra intervenção terapêutica), o paciente será capaz de aumentar a sua administração de Phe dietética desde 400-600 mg/dia (i.e., o fenótipo de tolerância a Phe do paciente é alterado do de um paciente com PKU moderada para um paciente com HPA moderada) para permitir ao paciente apresentar uma administração superior a 600 mg Phe/dia (i.e., administração dietética normal).

Adicionalmente, mesmo se o paciente for um que apenas manifesta os sintomas de HPA não-PKU, i.e., apresenta uma concentração plasmática elevada de Phe até 600yM/L, mas que é de outra forma permitido manter uma dieta proteica normal, ele beneficiará das terapias de BH4 da invenção uma vez que foi demonstrado que concentrações elevadas de Phe apresentam efeitos significativos no IQ de tais indivíduos. Adicionalmente, como abaixo discutido, a intervenção terapêutica baseada em BH4 de sujeitos com necessidades especiais, p.ex., mulheres grávidas e crianças, é particularmente importantes mesmo se os níveis plasmáticos de Phe dos pacientes se encontrarem num nível considerado "seguro" inferior a 200yM/L. C. PKU materna e tratamento relacionado de acordo com a presente invenção. O controlo metabólico dos níveis plasmáticos de Phe em mulheres com PKU planeando a sua gravidez e aqueles que estão já grávidas é importante devido às consequências sérias do feto exposto a níveis de Phe moderadamente elevados no útero, independentemente do estado PAH do feto. O controlo terapêutico da concentração plasmática de Phe é especialmente importante no primeiro trimestre da gravidez, uma vez que a falha em atingir um controlo adequado irá resultar em distúrbios incluindo microcefalia, deficiência mental e doença cardíaca congénita.

Por exemplo, a declaração de consenso da NIH (vol 17 #3, Outubro 2000) relativa a Fenilcetonúria relatou que a exposição de um feto a níveis de Phe maternos de 3-10 mg/dL produziu uma incidência de 24% de microcefalia, Enquanto aqueles expostos a uma concentração superior de 20mg/dL (i.e., superior a 1200pM/L) apresentava uma incidência de 73% de microcefalia. Similarmente, a doença cardíaca congénita foi encontrada em mais do que 10% das crianças expostas a níveis de Phe maternos que eram superiores a 20mg/dL. Importantemente, foi descoberto que níveis de Phe superiores a 6 mg/dL decrescem significativamente o IQ da criança. Assim, é imperativo assegurar que a concentração plasmática de Phe em mulheres apresentando todas as formas de fenilcetonúria, mesmo aquelas manifestando a forma mais moderada de HPA, deverão ser controladas rigorosamente de forma a evitar o risco a síndrome de PKU materna. Contudo, os níveis-alvo aceitáveis para a concentração plasmática de Phe de mulheres PKU que foram seguidas em clínicas nos E.U.A. variaram entre 10 mg/dL e 15 mg/dL, valores que são muito mais elevados do que os níveis de 2-6 mg/dL recomendados para mulheres grávidas e os níveis de 1-4 mg/dL que são usados em clínicas britânicas e alemãs para diminuir os riscos de desenvolverem o síndrome de PKU materna.

Outra consideração importante para mulheres grávidas é a sua administração total de proteína. Durante a gravidez, é importante que as mulheres ingiram proteína suficiente uma vez que foi sugerido que uma dieta pobre em proteína durante a gravidez irá resultar em desenvolvimento renal

retardado e subsequente redução no número de nefrónios e potencialmente conduz a hipertensão na idade adulta (D'Agostino, N. Engl. J. Med. 348(17)1723-1724, 2003). A seguinte tabela fornece guias exemplificativas para a administração de proteína dietética total para vários indivíduos.

Tabela: Normas Americanas para os requerimentos proteicos dietéticos

A quantidade real de proteína ingerida depende do conteúdo de Phe da proteína. Os perfis aminoacídicos de proteínas vegetais são diferentes dos de proteínas animais. Por exemplo, com um foco em amidos e vegetais, uma regra geral de 45-50 mg/Phe por grama de proteína pode ser suficiente. Contudo, um padrão aceite para a avaliação dos aminoácidos constituintes de uma proteína é uma clara de um ovo, que contém 3,5 gramas de proteína das quais 204 mg são Phe.

Como pode ser observado a partir das normas exemplificativas acima fornecidas, nos E.U.A., a administração recomendada de proteínas para mulheres em idade reprodutiva (p.ex., com idade inferior a 51) é de 44 a 50 g/dia, Enquanto mulheres grávidas requerem ou são recomendadas a uma quantidade de cerca de 60 g/dia. No Canadá e no Reino Unido, a administração recomendada de proteína para mulheres grávidas fica na ordem de cerca de 70 g/dia e 52 g/dia. Assim, a necessidade para assegurar que os níveis de concentração plasmática de Phe em mulheres grávidas são rigorosamente controlados é adicionalmente dificultada pelo facto deste grupo de pacientes com PKU requerer mais proteína do que mulheres PKU não-grávidas de idades comparáveis.

Em consequência do que foi acima referido, é contemplado que terapias baseadas em BH4 da presente invenção serão particularmente úteis em mulheres grávidas. É contemplado que uma mulher padecendo de qualquer forma de HPA que esteja grávida ou que esteja contemplando gravidez será submetida a um curso de terapia BH4 para assegurar que os seus níveis de concentração plasmática de Phe são mantidos tão próximas de 180yM/L até cerca de 360yM/L quanto possível. Tal curso de terapia irá preferencialmente permitir às mulheres aumentarem o seu nível normal de administração proteica. A discussão dos níveis da concentração plasmática de Phe e os graus para os quais tais concentrações de Phe deverão ser diminuídas, é aqui discutido nas Secções IA e IB e são incorporados na presente secção para mulheres grávidas. D. Gestão de PKU em Crianças e tratamento relacionado de acordo com a presente invenção.

Como aqui discutido ao longo desta publicação, foi determinado que um aumento na concentração plasmática de Phe em crianças (idades de 0 a 3 anos) resulta num decréscimo significativo no IQ da criança. Contudo, como foi discutido noutro lugar nesta descrição, pacientes que possuem uma concentração plasmática elevada de Phe de 400yM/L não recebem normalmente qualquer intervenção dietética. Assim, crianças com idades de 0 a 3 anos sofrem de efeitos deletérios significativos resultantes das presentes terapias. Este pedido de patente contempla o tratamento de uma criança possuindo uma concentração plasmática não-restringida de Phe que é superior a 360yM/L ± 15yM/L com uma composição terapêutica que compreende BH4 de forma a produzir um efeito benéfico na diminuição da concentração plasmática de Phe desse sujeito.

Em formas de realização preferenciais, a criança tem idade entre 0 e 3 anos de idade e apresenta uma concentração plasmática não-restringida de Phe de cerca de 1200yM/L antes da administração de BH4 e a referida administração diminui da concentração plasmática de Phe. Preferencialmente, da concentração plasmática de Phe seja diminuída de mais de 1800 até cerca de 1500pM/L, cerca de 1200yM/L, cerca de ΙΙΟΟμΜ/L, cerca de 1000 pML, cerca de 900pM/L, cerca de 800pM/L, cerca de 700yM/L, cerca de βΟΟμΜ/L, cerca de 550pM/L, cerca de 500pM/L, cerca de 450pM/L, 400pM/L, cerca de 350pM/L, cerca de 300pM/L, cerca de 275pM/L, cerca de 250pM/L após administração. Noutras formas de realização, a criança tem idade compreendida entre 0 e 3 anos de idade e apresenta uma concentração plasmática não-restringida de Phe superior a 1200pM/L e preferencialmente, esta concentração plasmática de Phe seja diminuída até cerca de δΟΟμΜ/L, ou mais preferencialmente até cerca de 500pM/L ou ainda mais preferencialmente até cerca de 360pM/L após administração de BH4, seja isoladamente ou em combinação com a dieta. Aqueles habilitados no estado da técnica entenderão que a invenção contempla o tratamento de crianças com concentração plasmática não-restringida de Phe superior a 360pM/L com BH4 para produzir uma diminuição na referida concentração plasmática de Phes. A discussão das reduções terapêuticas na Concentração plasmática de Phe das Secções IA e IB above são aqui incorporadas para efeitos de referência. Adicionalmente, qualquer decréscimo superior a 10% da concentração plasmática inicial não-restringida de Phe irá ser considerada um resultado terapêutico para os regimes terapêuticos usados nas crianças. Deverá ser entendido que as terapias BH4 podem ser combinadas com restrições dietéticas to para efetivar o decréscimo terapêutico na Concentração plasmática de Phe na referida Crianças. II. Composições para uso no tratamento A presente invenção contempla a intervenção terapêutica de PKU/HPA. Tal intervenção é baseada inicialmente no uso de BH4. A BH4 pode ser usada isoladamente em combinação com restrições dietéticas. Adicionalmente a BH4 e/ou restrições dietéticas podem adicionalmente ser combinadas com outras composições terapêuticas que são desenhadas, por exemplo para combater outras manifestações de PKU, tais como por exemplo, grandes aminoácidos neutrais a prevenirem a acumulação de Phe no cérebro (ver Koch et al., Mol. Genet. Metabol. 79:110-113, 2003) ou suplementação com tirosina. A presente secção fornece uma discussão das composições que podem ser usadas nos tratamentos aqui contemplados. A. Composições BH4 BH4 é um cofator na Hidroxilação de Phe e anteriormente à presente invenção, foi demonstrado que menos do que 2% de pacientes possuindo um nivel elevado de Phe aquando do nascimento apresentam defeitos na síntese de BH4. Para aqueles indivíduos que foram identificados como sendo responsivos a BH4, foi sugerido que os pacientes seriam não-responsivos à intervenção dietética e assim, aqueles indivíduos foram alimentados com uma dieta normal mas foram administrados com uma terapia BH4 isoladamente. Assim, anteriormente à presente invenção, houve bastante ceticismo no estado da técnica quanto aos benefícios terapêuticos da administração de BH4 a pacientes com PKU/HPA. Contudo, como aqui discutido ao longo desta publicação, BH4 pode ser administrado para uma intervenção terapêutica de pacientes que foram diagnosticados como não-responsivos a BH4. Adicionalmente, os presentes inventores mostram que a terapia BH4 pode ser combinada com restrições dietéticas para produzir um resultado terapêutico em ambos os indivíduos que são responsivos a um teste de administração de BH4 assim como a indivíduos que são não-responsivos à administração de BH4.

As Patentes U.S. Nos. 5,698,408; 2,601,215; 3505329; 4,540,783; 4,550,109; 4,587,340; 4,595,752; 4,649,197; 4,665,182; 4,701,455; 4,713,454; 4,937,342; 5,037,981; 5,198,547; 5,350,851; 5,401,844; 5,698,408 e O pedido de patente canadiano CA 2420374 cada uma descreve métodos de produção de dihidrobiopterinas, BH4 e derivados relacionados que podem ser usados de acordo com a presente invenção. Quaisquer métodos relacionados podem ser usados para produzir composições BH4 para uso na presente invenção.

As Patentes U.S. Nos. 4,752,573; 4,758,571; 4,774,244; 4,920,122; 5,753,656; 5,922,713; 5,874,433; 5,945,452; 6,274,581; 6,410,535; 6,441,038; 6,544,994; e as Publicações das Patentes U.S. US 20020187958; US 20020106645; US 2002/0076782; US 20030032616 cada uma descrevem métodos de administração de composições BH4 para tratamentos não-PKU. Cada um desses pacientes fornece um ensinamento qenérico de métodos de administração de composições BH4 conhecidos para aqueles habilitados no estado da técnica, que podem ser adaptados para o tratamento de PKU/HPA como aqui descrita.

Adicionalmente aos métodos genéricos acima referidos para a redução de BH4, a presente invenção contempla particularmente o uso de uma composição BH4 que é uma composição BH4 estabilizada. Preferencialmente, a composição BH4 estabilizada encontra-se numa forma cristalina. Métodos de produção das composições BH4 estabilizadas para uso na presente invenção são descritas no Exemplo 2. Tal forma cristalina pode revelar-se útil como um aditivo para fórmulas proteicas convencionais para o tratamento de PKU. A forma cristalina pode também ser convenientemente produzida na forma de pastilhas, pó ou outra forma sólida para administração oral. As formas e vias de administração de BH4 são discutidas em maior detalhe na secção de Composições Farmacêuticas abaixo descrita.

Em formas de realização preferenciais, é contemplado que a invenção fornecerá a um paciente com sua necessidade relacionada, uma dose diária entre cerca de 10 mg/kg até cerca de 20 mg/kg de BH4. É claro que, uma pessoa habilitada no estado da técnica poderá ajustar esta dose para cima ou para baixo dependendo da eficácia a ser alcançada pela administração. A dose diária pode ser administrada numa dose isolada ou alternativamente pode ser administrada em doses múltiplas em intervalos convenientemente espaçados. Em formas de realização exemplif icativas, a dose diária pode ser de 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 22 mg/kg, 24 mg/kg, 26 mg/kg, 28 mg/kg, 30 mg/kg, 32 mg/kg, 34 mg/kg, 36 mg/kg, 38 mg/kg, 40 mg/kg, 42 mg/kg, 44 mg/kg, 46 mg/kg, 48 mg/kg, 50 mg/kg, ou mais mg/kg.

Independentemente da quantidade de BH4 administrada, é desejável que a administração diminua a concentração plasmática de Phe dos pacientes às concentrações divulgadas na Secção I para os vários tipos de pacientes. B. Proteina dietética

Adicionalmente à administração de BH4 e análogos relacionados a Pacientes com PKU/HPA, é contemplado que a proteina dietética dos pacientes possa também ser restringida ou modificada. Aqueles habilitados no estado da técnica estão a par das várias fórmulas proteicas comercialmente disponíveis para uso no tratamento de PKU. Tais fórmulas incluem MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2 (Ross Laboratories, Liverpool, UK) , LOFENALAC, PHENYL-FREE (Mead-Johnson), e semelhantes.

Aqueles habilitados no estado da técnica podem usar as referidas fórmulas proteicas, que são geralmente desprovidas de concentrações de Phe. As fórmulas proteicas muitas vezes são suplementadas com aminoácidos que são deficitários em pacientes com PKU. Tais aminoácidos incluem, por exemplo, L-tirosina, e L-glutamina. Foi sugerido que pode ser desejável suplementar a dieta dos pacientes com PKU com valina, isoleucina e leucina (ver Patente U.S. No. 4,252,822). Em certas manifestações clínicas, os efeitos tóxicos de PKU são causados pelo bloqueio da administração de Phe no cérebro de outros aminoácidos tais como tirosina e triptofano. Foi descoberto que a suplementação da dieta de um paciente PKU com excesso de tais aminoácidos neutrais grandes bloqueia o transporte de Phe no cérebro e diminui os níveis de Phe no cérebro. Assim, é contemplado que para a presente invenção, o regime dietético pode adicionalmente ser suplementado com composições que compreendem um ou mais desses aminoácidos (Koch et al., Mol. Genet. Metabol. 79:110-113, 2003).

Adicionalmente, tal como é conhecido, L-carnitina e taurina que são normalmente encontradas no leite humano e outros produtos alimentares de origem animal deverão ser suplementadas adicionalmente à restrição de proteína. Em certas formas de realização, a L-carnitina pode ser suplementada a 20 mg/100 g de suplemento proteico, e a taurina pode ser suplementada a 40 mg/100 g de suplemento proteico de forma a ajudar a fornecer quantidades desses fatores normalmente encontrados no leite humano e alimentos de origem animal.

Adicionalmente, aqueles habilitados no estado da técnica têm em conta a publicação "2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes" para uma listagem de outros componentes, tais como vitaminas essenciais e minerais que deverão ser suplementados ao paciente para assegurar que outros suplementos estão a ser fornecidos independentemente da restrição proteica dietética.

No que refere à Tabela apresentada na Secção IC acima para as quantidades totais de proteínas e as figuras apresentadas na Secção I em geral para as concentrações plasmáticas desejáveis de Phe, uma pessoa habilitada no estado da técnica será capaz de determinar o nível da restrição proteica dietética que é requerida e assim ajustar a dieta do paciente concordantemente. Tomando por exemplo, um homem com cerca de 11-14 anos de idade, que deverá individualmente e preferencialmente receber 45g proteína/dia. Num evento em que um indivíduo é um que apresente PKU grave clássica, a sua concentração plasmática não-restringida de Phe irá presumivelmente ser superior a 1200yM/L, e a maioria de, senão a totalidade da fonte proteica dietética para esse indivíduo pode ser na forma de um suplemento proteico em pó, que preferencialmente diminui a sua concentração plasmática de Phe a menos do que 600yM/L. Através da administração de BH4 a esse sujeito, um resultado terapêutico seria um que produz um maior decréscimo na concentração plasmática de Phe do paciente ou alternativamente, o resultado terapêutico é um em que a concentração plasmática de Phe do indivíduo é diminuída num grau semelhantes, mas esse indivíduo é capaz de tolerar a proteína a partir de uma dieta normal em vez de uma fórmula dietética.

Similarmente, um homem com cerca de 11-14 anos de idade, é um que apresenta PKU moderada, sendo possível a utilização da presente invenção para lhe fornecer a administração de 45g proteína/dia através de uma administração proteica normal em vez de uma fórmula restringida. A determinação se a invenção é eficaz irá englobar a determinação da concentração plasmática de Phe do paciente numa base regular para assegurar que a concentração plasmática de Phe permanece abaixo de pelo menos 400pM/L. Testes para a determinação de tais concentrações encontram-se abaixo descritos. Preferencialmente, concentrações de menos do que ou cerca de 360pM/L são alcançadas. III. Identificação e monitorização de Populações de Pacientes

Como aqui discutido ao longo desta publicação, será necessário em várias formas de realização da presente invenção determinar se um dado paciente é responsivo à terapia com BH4, e para determinar as concentrações de fenilalanina do paciente tanto inicialmente para identificar a classe do paciente PKU a ser tratada como durante o regime terapêutico em execução para monitorizar a eficácia do regime. Exemplos de tais métodos são aqui abaixo descritos. A. Teste de administração de BH4

De forma a identificar um paciente como sendo responsivo a BH4, aqueles habilitados no estado da técnica realizam um "teste de administração de BH4". Dois tipos de testes de administração foram usados para alcançar o diagnóstico diferencial de HPA. 0 primeiro é um simples teste oral de administração de BH4 e o segundo é um teste de administração combinada de BH4/fenilanina. 0 teste de administração de BH4 mais simples é um que ο BH4 exógeno é administrado e os efeitos da administração na diminuição da concentração plasmática de Phe são determinados. A administração intravenosa de 2 mg/kg BH4 foi inicialmente proposta por Danks et al., (Lancet 1:1236, 1976), uma vez que desde que BH4 de maior grau de pureza tornou-se disponível, tornou-se possível a realização do teste usando uma administração oral de BH4 em quantidades de cerca de 2,5 mg/kg peso corporal. Por fim, uma abordagem estandardizada foi proposta por Niederwieser et al. em que uma dose oral isolada de 7,5 mg/kg de BH4 é administrada (Eur. J. Pediatr. 138:441, 1982), embora alguns laboratórios ainda usem até 20mg BH4/kg peso corporal. Este teste permite a discriminação entre pacientes que possuem HPA devido a um deficit na BH4 ou através de uma deficiência na PAH.

De forma a produzir resultados confiáveis no teste simples de administração de BH4, os níveis sanguíneos de Phe do paciente necessitam de ser superiores a 400yM/L. Desta forma, é muitas vezes comum o paciente ser removido da dieta PKU durante 2 dias antes da realização do teste de administração. Um kit de teste para BH4 está disponível e é distribuído pelo Dr. Schircks Laboratories (Jona, Suiça). Este kit recomenda uma dosagem de 20 mg BH4/kg peso corporal cerca de 30 minutos após a administração da refeição normal.

Como acima indicado, a concentração de Phe de um paciente necessita idealmente de ser superior a 400yM/L de forma a obter uma leitura de BH4 precisa. No teste de administração combinada de BH4/fenilalanina uma administração oral de Phe (100mg/kg peso corporal) mais BH4 (20mg/kg peso corporal) permite o rastreio seletivo de todas as deficiências BH4. Tipicamente, a Phe é administrada numa dose oral e é seguida aproximadamente uma hora mais tarde por administração com BH4. Os níveis plasmáticos de Phe são monitorizados antes e em intervalos de tempo convenientes (p.ex1, 3, 5, 9, 13 e 25 horas) após a administração de Phe.

Tanto no teste simples de administração de BH4 como no teste de administração combinada de BH4/Phe, foi sugerido que um decréscimo no nível de Phe plasmático de mais do que 30% do valor de Phe plasmático antes da incubação com BH4 nas 24 horas após administração é indicativo da responsividade a BH4 (Spaapen et al, Mol. Genet, and Metabol., 78:93-99, 2003).

Outros métodos de realização do teste de administração de BH4 podem também ser usados. Exemplos de tais testes são descritos em p.ex., Muntau et al., (N. Engl. J. Med. 347(26):2002) e Berneggar e Blau (Mol. Genet. Metabol. 77:304-313, 2002) .

Em Berneggar e Blau, o teste de administração de BH4 usa 20mg/kg BH4 e amostragem sanguínea para fenilalanina e tirosina é realizada a 0, 4, 8, e 24 horas para diferenciar entre os indivíduos responsivos a BH4 e os indivíduos não-responsivos a BH4. O teste é realizado após um período de inaninação de 3 horas. Amostras de urina de neopterina e biopterina são testadas antes da realização do teste. Após uma aplicação oral de BH4-6R (20mg/kg peso corporal), a administração de comida normal é permitida durante o período de teste completo. Amostras de sangue são analisadas para medições de Phe e Tyr às 0, 4, 8 e 24 horas. Outra amostra de urina é recolhida entre as 4-8 horas. A atividade da dihidropteridina reductase pode também ser medida em qualquer momento durante o teste. Em pacientes que possuem Níveis plasmáticos de fenilalanina inferiores a 400 μΜ/L ou pacientes que já se encontrem numa dieta pobre em fenilalanina, Berneggar e Blau recomendam um teste combinado BH4-fenilalanina em que 100 mg Phe/kg peso corporal são administrados oralmente 3 horas antes da administração de BH4.

Berneggar e Blau calcularam a responsividade a BH4 como a "hidroxilação de fenilalanina" às 4 e 8 horas após administração e foi expressa como a percentagem da fenilalanina eliminada. O declive (S) dos gráficos das "taxas de hidroxilação" às 0, 4 e 8 horas são comparadas para quatro diferentes produtos BH4 e diferentes grupos de pacientes. O declive discrimina entre indivíduos não-responsivos, indivíduos moderadamente responsivos e indivíduos responsivos. Os indivíduos moderadamente responsivos (ver Figura 5 em Berneggar e Blau) necessitam de mais tempo para alcançar os valores de cut-off de 360 μΜ/L e que a eficácia da BH4 administrada depende dos níveis iniciais de fenilalanina. Estes autores recomendam que para alguns pacientes com níveis de Phe plasmático menores do que 800 μΜ/L e para a maioria dos pacientes com um nível de Phe plasmático superior a 1200 μΜ/L, uma medição de Phe deveria ter sido realizada às 21 horas. Um gráfico da Phe/S versus tempo pode ser usado para estimar o tempo necessário para alcançar os valores de Phe plasmática "segura" terapêutica inferiores a 360yM/L.

Muntau et al. (2002) também fornece exemplos de testes de administração de BH4s que podem ser usados para calsular os tempos e concentrações da administração de BH4. Novamente estes autores empregam um teste de administração combinada de BH4/Phe em que aos pacientes é dada uma refeição que contém 100 mg Phe/kg peso corporal. Uma hora após a refeição, aos pacientes é dada uma dose oral de 20mg/kg BH4 (Schirks Laboratories). As concentrações sanguíneas de Phe são determinadas espectroscopia de massa de ionização em eletrospray antes da adição de Phe como anteriormente, e a 4, 8, e 15 horas após a administração de BH4. Os recém nascidos podem ser amamentados, enquanto aos pacientes mais velhos é fornecida uma administração estandardizada de proteína (10 mg Phe/kg) entre 6-8 horas após administração de BH4. Muntau também descreve métodos para a oxidação de Phe. Após um período de inaninação de 4-horas e um período de inaninação overnight, um total de 6mg/kg 13C Phe marcado dissolvido em solução de dextrose é administrado oralmente. Amostras são então recolhidas ao longo de um período de 180 minutos e armazenadas em tubos de vidro. As amostras são então analisadas quanto ao isótopo marcado com espectroscopia de massa e a recuperação do carbono 13 é calculada (Treacy et al., Pediat. Res. 42:430-5,1997)

Muntau et al. classifica is pacientes como responsivos a BH4 quando os níveis sanguíneos de Phe 15 horas apos administração de BH4 diminuíram mais do que 30% do valor obtido antes da administração de BH4. Uma melhoria na taxa de oxidação de Phe, como determinada por medições de dióxido de carbono durante os 180 minutos do teste, foi considerada significativa quanto a suplementação com BH4 aumentou o valor da oxidação de Phe em pelo menos 15 %.

Aqueles habilitados no estado da técnica serão capazes de usar qualquer um dos métodos acima referenciados para determinar se um indivíduo será responsivo a BH4. Contudo, outros equivalentes e métodos relacionados para a determinação de responsividade a BH4 também podem ser conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica e podem ser usados em substituição dos métodos acima descritos. B. Determinação das Concentrações de Phe

Existem muitos métodos para a determinação da presença de Phe no sangue (Shaw et al., Analytical Métodos in Phenylketonuria-Clinical Bioquímica, InBickett et al. Eds. Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism, Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-561971,). Tipicamente, as concentrações de fenilalanina e tirosina são determinadas a partir do soro de um paciente usando um ensaio fluorométrico. Este ensaio depende da formação de uma substância fluorescente quando a fenilalanina é aquecida com nihidrina na presença de leucilalanina (McCaman et al., J. Lab. Clin. Med. 59:885-890,1962.) O método mais popular para a determinação das concentrações de Phe é o teste de Guthrie em que discos são perfurados com papel de filtro que foi saturado com uma amostra sanguínea do paciente. Os discos uniformes são incubados num tabuleiro de agár que foram inoculados com Bacillus subtilis e contêm um inibidor específico do crescimento de Bacillus subtilis. À medida que a fenilalanina é transferida dos discos uniformes para o agar, a Phe reverte a inibição do crescimento bacteriano assim produzindo uma área de crescimento bacteriano que pode ser correlacionada com a concentração de fenilalanina por comparação com ensaios similares realizados usando discos contendo quantidades conhecidas de Phe.

Outros métodos de quantificação da concentração de Phe incluem HPLC, espectroscopia de massa, cromatografia em camada fina e semelhantes. Tais métodos podem ser usados para determinar a concentração plasmática de Phe de um paciente antes da terapia e para monitorizar a concentração de Phe durante o regime terapêutico para determinar a eficácia relacionada. É contemplado que os níveis plasmáticos de Phe dos pacientes serão monitorizados em intervalos convenientes (p.ex., diariamente, em dias alternados ou semanalmente) através do curso temporal do regime terapêutico. Através da monitorização DOS níveis plasmáticos de Phe com tal regularidade, o clínico será capaz de avaliar a eficácia do tratamento e ajustar os requerimentos de BH4 e/ou proteína dietética concordantemente. IV. Terapia de combinação

Certos métodos da invenção envolvem o uso combinado de BH4 e a restrição proteica dietética para produzir o efeito terapêutico em pacientes com várias formas de HPA. Para alcançar o resultado terapêutico apropriado nas terapias de combinação aqui contempladas, uma pessoa genericamente administrará ao sujeito a composição BH4 e a restrição dietética numa quantidade combinada eficaz para produzir o resultado terapêutico desejado (i.e., a diminuição da concentração plasmática de Phe e/ou a capacidade de tolerar maiores níveis de administração Phe/proteína sem produzir um aumento concomitante na concentração plasmática de Phe). Este processo pode envolver a administração da composição BH4 e da composição terapêutica da proteína dietética ao mesmo tempo. Tal pode ser alcançado através da administração de uma composição isolada ou formulação proteica farmacológica que inclui todos os requerimentos de proteína dietética e também incluir a BH4 na referida formulação proteica. Alternativamente, a proteína dietética (suplemento ou dieta proteica normal) é fornecida aproximadamente ao mesmo tempo de uma formulação farmacológica (pastilha, injeção ou bebida) de BH4. A BH4 pode também ser formulada numa barra proteica ou outro produto alimentar tal como como biscoitos, panquecas, bolos, adequados para ingestão.

Noutras alternativas, um tratamento com BH4 pode preceder ou seguir-se a terapia com proteína dietética a intervalos variando desde minutos a horas. Em formas de realização onde a proteína e as composições BH4 são administradas separadamente, uma pessoa poderá genericamente assegurar que durante um período significativo de tempo não se expira a eficácia entre o tempo de cada entrega, e tal forma que BH4 ainda será capaz de exercer um efeito vantajoso no paciente. Nestas circunstâncias, é contemplado que uma pessoa poderia administrar BH4 durante cerca de 2-6 horas (antes ou depois) de uma administração da proteína dietética, com um tempo de atraso de apenas aproximadamente 1 hora a ser a mais preferencial. Em certas formas de realização, é contemplado que a terapia com BH4 será uma terapia contínua onde uma dose diária de BH4 é administrada ao paciente indefinidamente. Noutras situações, p.ex., em mulheres grávidas possuindo apenas as formas moderadas de PKU e HPA, poderá acontecer que a terapia com BH4 é apenas continuada enquanto a mulher se encontra grávida e/ou em amamentação.

Adicionalmente, além das terapias baseadas apenas na entrega de BH4 e da regulação da proteína dietética, a presente invenção também contempla uma terapia de combinação com uma terceira composição que especificamente direciona um ou mais dos sintomas de HPA. Por exemplo, é conhecido que um deficit na tirosina causado por HPA resulta numa deficiência nos neurotransmissores dopamina e serotonina. Assim, no contexto na presente invenção, é contemplado que BH4 e os tratamentos baseados em dieta de proteínas poderiam ser adicionalmente combinados com a administração de neurotransmissores L-dopa, carbidopa e 5-hidroxitriptofano para corrigir os defeitos que resultam de quantidades diminuídas de tirosina na dieta.

Adicionalmente, a terapia genética com ambos PAH (Christensen et al., Mol. Gent. And Metabol. 76: 313-318, 2002; Christensen et al., Gene Therapy, 7:1971-1978, 2000) e fenilalanina amónia-liase (PAL Liu et al., Arts. Cells. Blood. Subs and Immob. Biotech. 30(4)243-257, 2002) foi contemplada por aqueles habilitados no estado da técnica. Tais técnicas de terapia genética poderiam ser usadas em combinação com as terapias combinadas de BH4/restrição proteica dietética da invenção. Em terapias de combinação adicionais, é contemplado que a fenilase pode ser fornecida como uma enzima injetável para destruir as concentrações mais baixas de Phe no paciente. Enquanto a administração de fenilase não geraria tirosina (contrariamente à administração de PAH), tal tratamento ainda assim iria resultar na tirosina sendo um aminoácido essencial para tais pacientes. Assim, a suplementação dietética com tirosina pode ser desejável para pacientes recebendo fenilase em combinação com a terapia com BH4. V. Composições farmacêuticas

Composições farmacêuticas para administração de acordo com a presente invenção podem compreender uma primeira composição compreendendo BH4 numa forma farmaceuticamente aceitável combinada opcionalmente com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser administradas por quaisquer meio que alcancem os seus propósitos desejados. Quantidades e regimes para a administração da composição de acordo com a presente invenção podem ser determinados prontamente por aqueles rotineiramente habilitados no estado da técnica para o tratamento de PKU. Como acima discutido, queles habilitados no estado da técnica poderiam inicialmente empregar quantidades e regimes de BH4 atualmente sendo proposto num contexto médico, p.ex., aquelas composições que estão atualmente a ser propostas para a modelação da atividades NOS, ou para uso no tratamento de dor ou depressão como discutido nas patentes acima listadas na Secção II. Qualquer um dos protocolos, formulações, vias de administração e semelhantes descritos que foram usados em testes de administração de BH4 podem ser prontamente modificados para uso na presente invenção.

As composições e métodos aqui descritos não são limitados ao uso de uma forma particular de BH4. De facto, é comtemplado que as composições e métodos incluem todas as composições compreendendo qualquer forma de BH4 numa quantidade eficaz para alcançar o seu propósito desejado.

Certos aspetos terapêuticos da presente invenção contemplam uma terapia de combinação em que composições BH4 são administradas adicionalmente a uma dieta proteica modificada, as composições farmacêuticas da invenção também contemplando todas as composições compreendendo pelo menos BH4 numa quantidade eficaz para alcançar o melhoramento de um ou mais sintomas de PKU quando administrada em combinação com a dieta proteica modificada. É claro que, o sintoma mais óbvio que pode ser aliviado é que a terapia de combinação produz um decréscimo na concentração plasmática de Phe, contudo, outros sintomas tais como mudanças no IQ, função executora, concentração, comportamento estabilidade comportamental, performance profissional e semelhantes podem também ser monitorizadas. Tais indícios são monitorizados usando técnicas conhecidas para aqueles habilitados no estado da técnica.

Cristais polimórficos de (6R) L- Tetrahidrobiopterina, sal de dihidrocloreto

Foi descoberto que BH4, e em particular, o sal de dihidrocloreto de BH4, exibe polimorfismo cristalino. A estrutura de BH4 encontra-se abaixo representada:

A forma (6R) de BH4 é a forma biologicamente ativa conhecida, contudo, BH4 é também conhecida por ser instável às temperaturas ambientes. Foi descoberto que um cristal polimórfico de BH4 é mais estável, e é estável a decomposição sob condições ambientais. BH4 é difícil de manusear e é por essa razão produzido e fornecido como o seu sal de dihidrocloreto (Schircks Laboratories, Jona, Suíça) em ampolas seladas com azoto para prevenir a degradação da substância devido à sua natureza higroscópica e sensibilidade à oxidação. A Patente U.S. No. 4,649,197 divulga que a separação de (6R)- e dihidrocloreto de 6(S)-L-eritro-tetrahidrobiopterina nos seus diastéreoisómeros é difícil devido à pobre cristalinidade do dihidrocloreto de 6(R,S)-L-eritro-tetrahidrobiopterina . A patente europeia No 0 079 574 descreve a preparação de tetrahidrobiopterina, onde o dihidrocloreto de tetrahidrobiopterina sólido é obtido como um intermediário. S. Matsuura et al. descreve em Química Letters 1984, páginas 735-738 e Heterocycles, Vol. 23, No. 12, 1985 páginas 3115-3120, dihidrocloreto de 6 (R)-tetrahidrobiopterina como uma forma cristalina sólida incolor, que é caracterizada via Análise Raios-X como divulgado em J. Biochem. 98, 1341-1348 (1985). Uma rotação ótica de 6,81° foi encontrada no produto cristalino, que é muito similar à rotação ótica de 6,51° relatada para um sólido cristalino na forma de cristais brancos no Exemplo 6 de EP-A2-0 191 335.

Os resultados obtidos durante o desenvolvimento de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina indicou que um composto pode existir em diferentes formas cristalinas, incluindo formas polimórficas e solvatos. O interesse continuado nesta área requer um método eficiente e confiável para a preparação das formas cristalinas individualizadas de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina e condições de cristalização controladas para fornecer as formas cristalinas, que são preferencialmente estáveis e fáceis de manusear e o processo na produção e preparação de formulações, e para fornecer uma elevada estabilidade de armazenamento numa forma de substância ou como um produto formulado, ou que fornece formas menos estáveis adequadas como intermediários para cristalização combinada para a produção de formas estáveis

Forma polimórfica B 0 polimorfo cristalino que foi descoberto como sendo o mais estável é daqui em diante referida como a "forma B, " ou alternativamente como "polimorfo B". Os resultados obtidos durante a investigação e desenvolvimento de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina revelou que muitos sólidos cristalinos conhecidos foram preparados, mas nenhum tendo reconhecido o polimorfismo e o seu efeito na estabilidade dos cristais BH4. 0 Polimorfo B é um anidrato moderadamente hidroscópico com a maior estabilidade termodinâmica acima de cerca de 20 °C. Adicionalmente, a forma B pode ser facilmente processada e manuseada devido à sua estabilidade térmica, possibilidade para a sua preparação em condições direcionadas, a sua morfologia adequada e o seu tamanho de partícula. O ponto de fusão é próximo dos 260 °C (AHf> 140 J/g) , mas nenhum ponto de fusão claro pode ser detetado devido à decomposição antes e durante o processo de fusão. Estas propriedades extraordinárias tornam a forma polimórfica B especialmente adequada para aplicação farmacêutica, com a preparação a ocorrer a temperaturas elevadas. O polimorfo B pode ser obtido como um pó fino como um tamanho de partícula que pode variar de 0,2 ym a 500 ym. A Forma B exibe um padrão de difração de Raios-X pelo método de difração de pó, expresso em valores-d (À) a: 8,7 (vs) , 6,9 (w) , 5,90 (vw) , 5,63 (m) , 5,07 (m) , 4,76 (m) , 4,40 (m) , 4,15 (w) , 4,00 (s) , 3,95 (m) , 3,52 (m) , 3,44 (w) , 3,32 (m) , 3,23 (s) , 3,17 (w) , 3,11 (vs) , 3,06 (w) , 2,99 (w) , 2,96 (w) , 2,94 (m) , 2,87 (w) , 2,84 (s) , 2,82 (m) , 2,69 (w), 2,59 (w), 2,44 (w). A Figura 1 é um gráfico do padrão

de difração de Raios-X característico exibido pela forma B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina dihidrocloreto.

Como aqui usadas, as seguintes abreviaturas entre parênteses significam: (vs) = intensidade muito elevada; (s) = intensidade elevada; (m) = intensidade média; (w) = intensidade baixa; e (vw) = intensidade muito baixa. Um padrão de difração de Raios-X pelo método de difração de pó é exibido na Figura 1.

Foi descoberto que outros polimorfos de BH4 possuem uma estabilidade química e física satisfatória para um seguro manuseamento durante a produção e formulação assim como fornecem uma elevada estabilidade de armazenamento na sua forma pura ou em formulações. Adicionalmente, foi descoberto que para B, e outros polimorfos de BH4 podem ser preparados em quantidades muito grandes (p.ex., à escala de 100 quilogramas) e armazenadas ao longo de um período extenso de tempo.

Todas as formas cristalinas (polimorfos, hidratos e solvatos), inclusive forma cristalina B, podem ser usadas para a preparação do polimorfo B mais estável. O polimorfo B pode ser obtido por equilíbrio de fase de suspensões de formas amorfas e outras formas diferentes da forma polimórfica B, tais como polimorfo A, em solventes polares e não-aquosos adequados. Assim, as preparações farmacêuticas aqui descritas referem-se à preparação da forma polimórfica B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina .

Outras formas de BH4 podem ser convertidas na forma B através da dispersão de outra forma de BH4 num solvente à temperatura ambiente, agitando a suspensão à temperatura ambiente por um período de tempo suficiente para produzir a forma polimórfica B, depois isolando a forma cristalina B e removendo o solvente da forma isolada B. Temperaturas ambientes, como aqui usadas, significam temperaturas numa gama de 0 °C a 60 °C, preferencialmente de 15 °C a 40 °C. A temperatura aplicada pode ser alterada durante o tratamento e agitando através de um decréscimo faseado ou continuo da temperatura. Solventes adequados para a conversão de outras formas na forma B incluem mas não estão limitados a, metanol, etanol, isopropanol, outros álcoois C3 e C4, ácido acético, acetonitrilo, tetrahidrofurano, éter metil terc-butílico, 1,4-dioxano, acetato de etilo, acetato de isopropilo, outros C3-C6-acetatos, metiletilcetona e outras cetonas metil-C3-C5 alquilicas. O tempo para completar o equilíbrio de fase pode variar até 30 horas e preferencialmente até 20 horas ou menos do que 20 horas. O polimorfo B pode também ser obtido por cristalização a partir de misturas de solventes contendo até cerca de 5% água, especialmente a partir de misturas de etanol, ácido acético e água. Foi descoberto que a forma polimórfica B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por dissolução, opcionalmente a temperaturas elevadas, preferencialmente de uma forma sólida de energia inferior comparativamente com a forma B ou da forma B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina numa mistura de solventes compreendendo etanol, ácido acético e água, adição de sementes à solução, arrefecimento da suspensão obtida e isolamento dos cristais formados. A dissolução pode ser realizada à temperatura ambiente ou até 70 °C, preferencialmente até 50 °C. Podem ser usados a mistura de solventes final para dissolução ou o material inicial pode ser primeiramente dissolvido em água e outros solventes podem então ser adicionados simultaneamente ou um solvente após o outro. A composição da mistura de solventes pode compreender um rácio volume/volume de água/ácido acético: tetrahidrofurano de 1:3:2 para 1:9:4 e preferencialmente 1:5:4. A solução é preferencialmente agitada. 0 arrefecimento pode significar temperaturas entre -40 °C e 0 °C, preferencialmente entre 10 °C e 30 °C. Sementes adequadas são a forma polimórfica B de outro ciclo produtivo ou cristais possuindo uma morfologia idêntica oi similar. Após isolamento, a forma cristalina B pode ser lavada com um não-solvente tal como acetona ou tetrahidrofurano e secada de um modo convencional. O Polimorfo B pode também ser obtido por cristalização a partir de soluções aquosas através da adição de não-solventes tais como metanol, etanol e ácido acético. O procedimento de cristalização e isolamento pode ser vantajosamente realizado à temperatura ambiente sem arrefecer a temperatura. Este processo é portanto muito adequado para ser realizado a uma escala industrial.

Numa forma de realização das composições e métodos aqui descritos, uma composição incluindo a forma polimórfica B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é preparada por dissolução de uma forma sólida diferente da forma B, ou da forma B de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina dihidrocloreto em água à temperatura ambiente, adicionado um não-solvente numa quantidade suficiente para formar uma suspensão, opcionalmente agitando a suspensão por um certo periodo de tempo, e depois isolamento dos cristais formados. A composição é adicionalmente modificada na composição farmacêutica como abaixo descrito. A concentração de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina na solução aquosa pode ser de 10 a 80 % peso/peso, mais preferencialmente de 20 a 60 % peso/peso, por referência à solução. Não-solventes preferenciais (i.e., solventes úteis na preparação de suspensões de BH4) são metanol, etanol e ácido acético. 0 não-solvente pode ser adicionado à solução aquosa. Mais preferencialmente, a solução aquosa é adicionado ao não-solvente. 0 tempo de agitação após formação da suspensão pode ser até 30 horas e preferencialmente até 20 horas ou menos do que 20 horas. Isolamento por filtração e secagem é realizada num modo conhecido como acima descrito. A Forma polimórfica B é uma forma cristalina muito estável, que pode ser facilmente filtrada, secada e moída a tamanhos de partícula adequados para formulações farmacêuticas. Estas propriedades extraordinárias tornam a forma polimórfica B especialmente adequada para aplicação farmacêutica.

Forma polimórfica A

Foi descoberto que outro polimorfo cristalino de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma A," ou "polimorfo A". Polimorfo A é moderadamente higroscópico e absorve água até um conteúdo de cerca de 3 % peso/peso, que é continuamente libertado entre 50 °C e 200 °C, quando aquecido a uma velocidade de 10 °C/minuto. O polimorfo A é um anidrato higroscópico que é uma forma meta-estável relativamente à forma B; contudo, é estável ao longo de vários meses em condições ambiente se mantida num recipiente rigorosamente selado. Forma A é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica A pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Polimorfo A que exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (À) de: 15,5 (vs), 12,0 (m) , 6,7 (m) , 6,5 (m) , 6,3 (w) , 6,1 (w) , 5,96 (w) , 5,49 (m) , 4,89 (m) , 3,79 (m) , 3,70 (s) , 3,48 (m) , 3,45 (m) , 3,33 (s) , 3,26 (s) , 3,22 (m) , 3,18 (m) , 3,08 (m) , 3,02 (w) , 2,95 (w) , 2,87 (m) , 2,79 (w) , 2,70 (w) . Figura 2 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma A de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro- tetrahidrobiopterina.

Polimorfo A exibe bandas características no espectro de Raman, expressas em números de onda (cm-1) a: 2934 (w) , 2880 (w), 1692 (s), 1683 (m), 1577 (w), 1462 (m), 1360 (w) , 1237 (w), 1108 (w), 1005 (vw), 881 (vw), 813 (vw), 717 (m), 687 (m) , 673 (m) , 659 (m) , 550 (w) , 530 (w) , 492 (m) , 371 (m), 258 (w), 207 (w), 101 (s), 87 (s) cm-1.

Forma polimórfica A pode ser obtida por liofilização ou remoção de água de soluções de dihidrocloreto (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina em água. Forma polimórfica A de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por dissolução de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina à temperatura ambiente em água, (1) arrefecendo a solução a temperaturas baixas para solidificação da solução, e remoção de água sob pressão reduzida, ou (2) remoção de água da referida solução aquosa. A forma cristalina A pode ser isolada por filtração e depois secada para evaporar a água absorvida do produto. Condições e métodos de secagem são conhecidos e secagem do produto isolado ou remoção de água conforme a variante (2) aqui descrita pode ser realizada através da aplicação de temperaturas elevadas, por exemplo até 80 °C, preferencialmente na gama de 30 °C a 80 °C, sob vácuo ou temperaturas elevadas e vácuo. Antes do isolamento de um precipitado obtido na variante (2), a suspensão pode ser agitada por um certo período de tempo para equilíbrio de fase. A concentração de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina na solução aquosa pode ser de 5 a 40 % peso/peso, relativamente à solução.

Um rápido arrefecimento é preferido para obter soluções sólidas como material inicial. Uma pressão reduzida é aplicada até que o solvente seja completamente removido. A liofilização é uma tecnologia bem conhecida do estado da técnica. O tempo para completar a remoção de solvente está dependente do vácuo aplicado, que pode ser entre 0,01 e 1 mbar, o solvente usado e a temperatura de congelamento. A Forma polimórfica A é estável à temperatura ambiente ou abaixo da temperatura ambiente sob condições substancialmente desprovidas de água, o que é demonstrado com testes de equilíbrio de fase de suspensões em tetrahidrofurano ou éter metil terc-butílico agitado durante cinco dias e 18 horas respectivamente sob fluxo de azoto à temperatura ambiente. Filtração e secagem à temperatura ambiente produz a forma polimórfica A inalterada.

Forma polimórfica F

Foi descoberto que outro polimorfo cristalino de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma F, " ou "polimorfo F". Polimorfo F é moderadamente higroscópico e absorve água até um conteúdo de cerca de 3 % peso/peso, que é continuamente libertado entre 50 °C u 200 °C, quando aquecido a uma velocidade de 10 °C/minuto. O polimorfo F é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico, que é mais estável do que a forma A a temperaturas ambiente menores e menos estável do que a forma B a temperaturas mais elevadas e forma F é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica F pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Polimorfo F exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (À) a: 17,1 (vs), 12,1 (w) , 8,6 (w) , 7,0 (w) , 6,5 (w) , 6,4 (w) , 5,92 (w) , 5,72 (w) , 5,11 (w) , 4,92 (m) , 4,86 (w) , 4,68 (m) , 4,41 (w) , 4,12 (w) , 3,88 (w) , 3,83 (w) , 3,70 (m) , 3,64 (w) , 3,55 (m) , 3,49 (s), 3,46 (vs), 3,39 (s) , 3,33 (m) , 3,31 (m) , 3,27 (m) , 3,21 (m) , 3,19 (m) , 3,09 (m) , 3,02 (m) , e 2,96 (m) . Figura 3 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma F de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Polimorfo F pode ser obtido por equilibração de fase de suspensões da forma polimórfica A em solventes não-aquosos e polares adequados, que raramente dissolvem as referidas formas de energia menor, especialmente álcoois tais como metanol, etanol, propanol e isopropanol. Forma polimórfica F de dihidrocloreto (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparadas por dispersão de partículas da forma sólida A de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina num solvente não-aquoso que escassamente dissolve o referido dihidrocloreto de (6R)-L-eritro- tetrahidrobiopterina abaixo da temperatura ambiente, agitando a suspensão às referidas temperaturas por um período de tempo suficiente para produzir forma polimórfica F, depois isolando a forma cristalina F e removendo o solvente da forma isolada F. Remoção do solvente e secagem podem ser realizadas sob ar, ar seco ou um gás de proteção seco tal como azoto ou gases nobres e a ou abaixo da temperatura ambiente, por exemplo até 0 °C. A temperatura durante equilibração de fase encontra-se preferencialmente de 5 a 15 °C e o mais preferencialmente a cerca de 10 °C.

Forma polimórfica J

Foi descoberto que outro polimorfo cristalino de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma J," ou "polimorfo J". O polimorfo J é moderadamente higroscópico e absorve água quando manuseado em ar húmido. O polimorfo J é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico, e pode ser transformado novamente na forma E abaixo descrita, a partir da qual é obtida após exposição a condições de humidade relativamente altas tais como numa humidade relativa acima de 75%. Forma J é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica J pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma J exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (Ã) a: 14,6 (m), 6,6 (w) , 6,4 (w) , 5,47 (w) , 4,84 (w) , 3,29 (vs) , e 3,21 (vs) . Figura 4 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma J of (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina dihidrocloreto.

Polimorfo J pode ser obtida por desidratação da forma E a temperaturas moderadas sob vácuo. Em particular, a forma polimórfica J de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada utilizando a forma E e removendo a água da forma E através do tratamento da forma E num secador sob vácuo para obter a forma J a temperaturas moderadas que podem significar uma temperatura na gama de 25 a 70 °C, e o mais preferencialmente de 30 a 50 °C.

Forma polimórfica K

Foi descoberto que outro polimorfo cristalino de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma K, " ou "polimorfo K". Polimorfo K é moderadamente higroscópico e absorve água até um conteúdo de cerca de 2,0 % peso/peso, que é continuamente libertado entre 50 °C e 100 °C, quando aquecido a uma velocidade de 10 °C/minuto. O polimorfo K é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico, que é menos estável do que a forma B a temperaturas mais elevadas e forma K é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis, em particular forma B. Forma polimórfica K pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma K exibe um padrão caracteristico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos caracteristicos expressos em valores-d (Ã) a: 14,0 (s), 9,4 (w) , 6,6 (w) , 6,4 (w) , 6,3 (w) , 6,1 (w) , 6,0 (w) , 5,66 (w) , 5,33 (w) , 5,13 (vw) , 4,73 (m) , 4,64 (m) , 4,48 (w) , 4,32 (vw) , 4,22 (w) , 4,08 (w) , 3,88 (w) , 3,79 (w) , 3,54 (m) , 3,49 (vs), 3,39 (m) , 3,33 (vs) , 3,13 (s) , 3,10 (m) , 3,05 (m), 3,01 (m), 2,99 (m), e 2,90 (m). Figura 5 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma K de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Polimorfo K pode ser obtido por cristalização a partir de misturas de solventes polares contendo pequenas quantidades de água e na presença de pequenas quantidades de ácido ascórbico. Solventes para a mistura de solventes podem ser seleccionados de ácido acético e um álcool tal como metanol, etanol, n- ou isopropanol. Em particular, forma polimórfica K de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por dissolução de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina numa mistura de ácido acético e um álcool oo tetrahidrofurano contendo pequenas quantidades de água e uma pequena quantidade de ácido ascórbico a temperaturas elevadas, baixando a temperatura abaixo da temperatura ambiente para cristalizar o referido dihidrocloreto, isolando o precipitado e secando o precipitado isolado a temperaturas elevadas opcionalmente sob vácuo. Álcoois adequados são por exemplo metanol, etanol, propanol e isopropanol, onde o etanol é preferencial. O rácio de ácido acético para álcool ou tetrahidrofurano pode ser de 2:1 a 1:2 e preferencialmente cerca de 1:1. Dissolução de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser realizada na presença de um conteúdo maior de água e mais da mistura anti-solvente pode ser adicionada para obter uma precipitação completa. A quantidade de água na composição final pode ser de 0,5 a 5 % peso/peso e uma quantidade de ácido ascórbico pode ser de 0,01 a 0,5 % peso/peso, ambas por referência à mistura de solventes. A temperatura para dissolução pode encontrar-se na gama de 30 a 100 e preferencialmente 35 a 70 °C e a temperatura de secagem pode encontrar-se na gama de 30 a 50 °C. O precipitado pode ser lavado com um álcool tal como etanol após isolamento, p.ex., filtração. 0 polimorfo K pode ser facilmente convertido na forma mais estável B por equilibração de fase em p.ex., isopropanol e opcionalmente semeando com cristais da forma B a temperaturas acima da temperatura ambiente, tal como temperaturas de 30 a 40 °C.

Formas hidratadas de (6R) L-Tetrahidrobiopterina, sal de dihidrocloreto

Como adicionalmente descrito abaixo, foi descoberto que dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina existe como um número de hidratos cristalinos, que deverá aqui ser descrito e definido como as formas C, D, E, H, e O. Estas formas hidratadas são úteis como uma forma estável de BH4 para as preparações farmacêuticas aqui descritas e na preparação de composições incluindo polimorfos cristalinos estáveis de BH4.

Forma hidratada C

Foi descoberto que a forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma C," ou "hidrato C". A forma hidratada C é moderadamente higroscópica e apresenta um conteúdo de água de aproximadamente 5,5 % peso/peso, que indica que a forma C é monohidratada. 0 hidrato C apresenta um ponto de fusão próximo de 94 °C (AHf é cerca de 31 J/g) e a forma hidratada C é especialmente adequada como intermediário e material inicial para produzir formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica C pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma C exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (A) a: 18,2 (m) , 15,4 (w) , 13,9 (vs) , 10,4 (w) , 9,6 (w) , 9,1 (w) , 8,8 (m) , 8,2 (w) , 8,0 (w) , 6,8 (m) , 6,5 (w) , 6,05 (m) , 5,77 (w) , 5,64 (w) , 5,44 (w) , 5,19 (w) , 4,89 (w) , 4,76 (w) , 4,70 (w) , 4,41 (w) , 4,25 (m) , 4,00 (m) , 3,88 (m) , 3,80 (m) , 3,59 (s) , 3,50 (m) , 3,44 (m) , 3,37 (m) , 3,26 (s) , 3,19 (vs) , 3,17 (s) , 3,11 (m) , 3,06 (m) , 3,02 (m) , 2,97 (vs) , 2,93 (m) , 2,89 (m) , 2,83 (m) , e 2,43 (m) . Figura 6 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma hidratada C de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma hidratada C pode ser obtida por equilibração de fase à temperatura ambiente de uma forma polimórfica tal como suspensão de polimorfo B num não-solvente que contém água numa quantidade de preferencialmente cerca de 5 % peso/peso, por referência ao solvente. Forma hidratada C de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por ressuspensão de dihidrocloreto (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina num não-solvente tal como, heptano, Cl-C4-álcoois tais como metanol, etanol, 1- ou 2-propanol, acetatos, tais como acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético éteres tais como terahidrofurao, dioxano, éter metil terc-butílico, ou misturas binárias ou ternárias dos referidos não-solventes, aos quais água suficiente é adicionada para formar o monohidrato, e agitando a suspensão a ou abaixo das temperaturas ambiente (p.ex., de 0 a 30 °C) por um período de tempo suficiente para formar o monohidrato. Água suficiente pode significar de 1 a 10 e preferencialmente de 3 a 8 % peso/peso de água, por referência à quantidade de solvente. Os sólidos podem ser filtrados e secados ao ar a uma temperatura próxima da temperatura ambiente. O sólido pode absorver alguma água e assim possuir um conteúdo mais elevado de água do que o valor teórico de 5,5 % peso/peso. A Forma hidratada C é instável relativamente às formas D e B, e facilmente convertível na forma polimórfica B a temperaturas de cerca de 40 °C no ar e a humidades relativas menores. Forma C pode ser transformada no hidrato mais estável D por equilibração de suspensão à temperatura ambiente.

Forma hidratada D

Foi descoberto que outro forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma D," ou "hidrato D". A forma hidratada D é moderadamente higroscópica e pode apresentar um conteúdo de água de aproximadamente 5,0 a 7,0 % peso/peso, o que sugere que o forma D é monohidratada. 0 hidrato D apresenta um ponto de fusão próximo de 153 °C (AHf é cerca de 111 J/g) e é de muito maior estabilidade do que a forma C e é até estável quando exposto à humidade do ar à temperatura ambiente. Forma hidratada D pode assim ser usada para preparar formulações ou como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica D pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma D exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (Ã) a: 8,6 (s), 6,8 (w) , 5,56 (m) , 4,99 (m) , 4,67 (s) , 4,32 (m) , 3,93 (vs) , 3,88 (w) , 3,64 (w) , 3,41 (w) , 3,25 (w) , 3,17 (m) , 3,05 (s) , 2,94 (w) , 2,92 (w) , 2,88 (m) , 2,85 (w) , 2,80 (w) , 2,79 (m) , 2,68 (w) , 2,65 (w) , 2,52 (vw) , 2,35 (w) , 2,34 (w) , 2,30 (w), e 2,29 (w). Figura 7 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma hidratada D de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma hidratada D pode ser obtida por adição próxima da temperatura ambiente de soluções aquosas concentradas de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a um excesso de um não solvente tal como hexano, heptano, diclorometano, 1- ou 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético, éteres tais como tetrahidrofurano, dioxano, éter metil terc-butílico, ou misturas dos referidos não-solventes, e agitando a suspensão à temperatura ambiente. O sólido cristalino pode ser filtrado e depois secado sob fluxo de azoto à temperatura ambiente. Um não-solvente preferencial é isopropanol. A adição da solução aquosa pode ser realizada gota-a-gota para evitar uma súbita precipitação. Forma hidratada D de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por adição próxima da temperatura ambiente de uma solução aquosa concentrada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a um excesso de um não-solvente e agitando a suspensão à temperatura ambiente. Excesso de um não-solvente pode significar um rácio de solvente aquoso para não-solvente de 1:10 a 1:1000. Forma D contém um pequeno excesso de água, relacionado à forma monohidratada, e pensa-se que absorva água devido à natureza moderadamente higroscópica do hidrato cristalino. Forma hidratada D está condenada a ser mais estável sob os hidratos conhecidos à temperatura ambiente e uma humidade relativa de menos do que 70%. Forma hidratada D pode ser usada para formulações preparadas sob condições, onde este hidrato é estável. Temperatura ambiente pode significar 20 a 30 °C.

Forma hidratada E

Foi descoberto que outra forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma E," ou "hidrato E". A forma hidratada E apresenta um conteúdo de água de aproximadamente 10 a 14 % peso/peso, o que sugere que a forma E é dihidratada. O hidrato E é formado a temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma hidratada E é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Ela é especialmente adequada para produzir a forma J desprovida de água após secagem sob fluxo de azoto ou opcionalmente sob vácuo. Forma E é não-higroscópica e estável sob humidades relativamente consideradas altas, i.e., a humidades relativas acima de cerca de 60% e até cerca de 85%. Forma polimórfica E pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma E exibe um padrão caracteristico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos caracteristicos expressos em valores-d (A) a: 15,4 (s), 6,6 (w) , 6,5 (w) , 5,95 (vw) , 5,61 (vw) , 5,48 (w) , 5,24 (w) , 4,87 (w) , 4,50 (vw) , 4,27 (w) , 3,94 (w) , 3,78 (w) , 3,69 (m) , 3,60 (w) , 3,33 (s) , 3,26 (vs) , 3,16 (w) , 3,08 (m) , 2,98 (w) , 2,95 (m) , 2,91 (w) , 2,87 (m) , 2,79 (w) , 2,74 (w) , 2,69 (w) , e 2,62 (w) . Figura 8 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma hidratada E de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma hidratada E pode ser obtida por adição de soluções aquosas concentradas de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a um excesso de um não-solvente arrefecido a temperaturas de cerca de 10 a -10 °C e preferencialmente entre 0 a 10 °C e agitando a suspensão às referidas temperaturas. O sólido cristalino pode ser filtrado e depois secado sob fluxo de azoto à temperatura ambiente. Não-solventes são solventes tais como por exemplo hexano, heptano, diclorometano, 1- ou 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético, éteres tais como tetrahidrofurano, dioxano, éter metil terc-butilico, ou misturas dos referidos não-solventes. Um não-solvente preferencial é isopropanol. A adição da solução aquosa pode ser realizada gota-a-gota para evitar uma súbita precipitação. Forma hidratada E de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por adição de solulões aquosas concentradas de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a um excesso de um não-solvente que é arrefecido a temperaturas de cerca de 10 a -10 °C, e agitando a suspensão à temperatura ambiente.

Excesso de um não-solvente pode significar um rácio de solvente aquoso para não-solvente de 1:10 a 1:1000. Um não-solvente preferencial é tetrahidrofurano. Outro processo de preparação compreende a exposição da forma polimórfica B a uma atmosfera de ar com uma humidade relativa de 70 a 90%, preferencialmente cerca de 80%. Forma hidratada E está condenada a ser um dihidrato, através da qual alguma água adicional pode ser absorvida. Forma polimórfica E pode ser transformada no polimorfo J após secagem sob vácuo a temperaturas moderadas, que podem ser entre 20°C e 50 °C a pressões entre 0 e 100 mbar. Forma E é especialmente adequada para formulações na forma semi-sólida devido à sua estabilidade a humidades relativamente altas.

Forma hidratada H

Foi descoberto que outro forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma H," ou "hidrato E". A forma hidratada H apresenta um conteúdo de água de aproximadamente 5,0 a 7,0 % peso/peso, o que sugere que o forma H é uma forma higroscópica monohidratada. A forma hidratada H é formada a temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma hidratada H é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica H pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma H exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (A) a: 8,6 15,8 (vs) , 10,3 (w) , 8,0 (w) , 6,6 (w) , 6,07 (w) , 4,81 (w) , 4,30 (w) , 3,87 (m) , 3,60 (m) , 3,27 (m) , 3,21 (m) , 3,13 (w) , 3,05 (w) , 2,96 (m) , 2,89 (m) , 2,82 (w) , e 2,67 (m) . Figura 9 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma hidratada H de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma hidratada H pode ser obtida por dissolução à temperatura ambiente de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina numa mistura de ácido acético e água, adicionando depois um não-solvente para precipitar um sólido cristalino, arrefecendo a suspensão obtida e agitando a suspensão arrefecida por um certo período de tempo. 0 sólido cristalino é filtrado e depois secado sob vácuo à temperatura ambiente. Não-solventes são solventes tais como por exemplo hexano, heptano, diclorometano, 1- ou 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético, éteres tais como tetrahidrofurano, dioxano, éter metil terc-butílico, ou misturas dos referidos não-solventes. Um não-solvente preferencial é tetrahidrofurano. Forma hidratada H de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por dissolução à temperatura ambiente de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina numa mistura de ácido acético e uma quantidade menor daquele ade ácido acético com água, adicionando um não-solvente e arrefecendo a suspensão obtida a temperaturas na gama de -10 a 10 °C, e preferencialmente -5 a 5 °C, e agitando a suspensão à referida temperatura por um certo período de tempo. Um certo tempo pode significar de 1 a 20 horas. O rácio peso:peso de ácido acético:água pode ser de 2:1 a 25:1 e preferencialmente de 5:1 a 15:1. O rácio peso:peso de ácido acético/água para o não-solvente pode ser talvez de 1:2 a 1:5. Forma hidratada H aparenta ser monohidratada com um ligeiro excesso de água a ser absorvido devido à sua natureza higroscópica.

Forma hidratada Ο

Foi descoberto que outro forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma 0," ou "hidrato 0". A forma hidratada 0 é formada a temperaturas próximas da temperatura ambiente. Forma hidratada 0 é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica 0 pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 pm até cerca de 500 pm.

Forma 0 exibe um padrão característico de difração de

Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (Ã) a: 15,9 (w) , 14.0 (w) , 12,0 (w) , 8,8 (m) , 7,0 (w) , 6,5 (w) , 6,3 (m) , 6.00 (w) , 5,75 (w) , 5,65 (m) , 5,06 (m) , 4,98 (m) , 4,92 (m) , 4,84 (w) , 4,77 (w) , 4,42 (w) , 4,33 (w) , 4,00 (m) , 3,88 (m) , 3,78 (w) , 3,69 (s), 3,64 (s) , 3,52 (vs) , 3,49 (s) , 3,46 (s), 3,42 (s), 3,32 (m), 3,27 (m), 3,23 (s) , 3,18 (s) , 3,15 (vs) , 3,12 (m) , 3,04 (vs) , 2,95 (m) , 2,81 (s) , 2,72 (m) , 2,67 (m) , e 2,61 (m) . Figura 10 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma hidratada O de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro- tetrahidrobiopterina .

Forma hidratada O pode ser preparada por exposição da forma polimórfica F a uma atmosfera de azoto contendo vapor de água com uma humidade relativa resultante de cerca de 52% durante cerca de 24 horas. O facto que a forma F, que é um anidrato moderadamente higroscópico, pode ser usada para preparar a forma O sob 52% de humidade relativa sugere que a forma 0 é um hidrato, que é mais estável do que a forma F à temperatura ambiente e sob condições de humidade.

Formas solvatadas de (6R L-Tetrahidrobiopterina, sal de dihidrocloreto

Como adicionalmente descrito abaixo, foi descoberto que dihidrocloreto (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina existe como um número de formas solvatadas cristalinas, que deverá aqui ser descrito e definido como as formas G, I, L, M, e N. Estas formas solvatadas são úteis como formas estáveis de BH4 para as preparações farmacêuticas aqui descritas e na preparação de composições incluindo polimorfos cristalinos estáveis de BH4.

Forma solvatada G

Foi descoberto que uma forma cristalina solvatada etanólica de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma G," ou "hidrato G". A forma solvatada etanólica G apresenta um conteúdo de etanol de aproximadamente 8,0 a 12,5 % peso/peso, o que sugere que a forma G é uma forma higroscópica mono etanol solvato. A forma solvatada G é formada a temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma G é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica G pode ser preparada como um pó sólido com uma gama de tamanho de partícula média desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma G exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos caracteristicos expressos em valores-d (Ã) a: 14,5 (vs) , 10,9 (w) , 9,8 (w) , 7,0 (w) , 6,3 (w) , 5,74 (w) , 5,24 (vw) , 5,04 (vw), 4,79 (w) , 4,41 (w) , 4,02 (w) , 3,86 (w) , 3,77 (w) , 3,69 (w) , 3,63 (m) , 3,57 (m) , 3,49 (m) , 3,41 (m) , 3,26 (m) , 3,17 (m) , 3,07 (m) , 2,97 (m) , 2,95 (m) , 2,87 (w) , e 2,61 (w) . Figura 11 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma solvatada G de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina. A forma solvatada etanólica G pode ser obtida por cristalização de dihidrocloreto de L-eritro-tetrahidrobiopterina dissolvido em água e adicionando um grande excesso de etanol, agitando a suspensão obtida a ou abaixo da temperatura ambiente e secando o sólido isolado sob ar ou azoto a temperaturas próximas da temperatura ambiente. Aqui, um grande excesso de etanol significa uma mistura resultante etanol e água com menos do que 10% água, preferencialmente cerca de 3 a 6%. A forma etanolato G de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser preparada por dissolução a temperaturas próximas da temperatura ambiente como a temperaturas de 75 °C dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina em água ou numa mistura de água e etanol, arrefecendo a solução aquecida à temperatura ambiente e depois de 5 a 10 °C, adicionando opcionalmente etanol para completar a precipitação, agitar a suspensão obtida a temperaturas de 20 a 5 °C, filtrando o sólido cristalino, branco, e secando o sólido sobre o ar ou um gás de proteção tal como azoto a temperaturas próximas da temperatura ambiente. O processo pode ser realizado numa primeira variante dissolvendo dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a temperaturas próximas da temperatura ambiente numa quantidade menor de água e depois adicionando um excesso de etanol e depois agitando a suspensão obtida por um período de tempo suficiente para equilibração de fase. Numa segunda variante, dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pode ser ressuspenso em etanol, adicionando opcionalmente uma quantidade menor de água, e aquecendo a solução e dissolvendo dihidrocloreto (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina, arrefecendo a solução a temperaturas de cerca de 5 a 15 °C, adicionando mais etanol à suspensão e depois agitando a suspensão obtida por um período de tempo suficiente para equilibração de fase.

Forma solvatada I

Foi descoberto que uma uma forma cristalina de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina, solvato de ácido acético, é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma I," ou "hidrato I". 0 forma solvatada I de ácido acético apresenta um conteúdo de ácido acético de aproximadamente 12,7 % peso/peso, o que sugere que a forma I é uma forma higroscópica ácido acético mono solvato. A forma solvatada I é formada a temperaturas abaixo da temperatura ambiente. A forma solvatada I de ácido acético é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica I pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma I exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (À) a: 14,5 (m) , 14,0 (w) , 11,0 (w) , 7,0 (vw) , 6,9 (vw) , 6,2 (vw) , 5,30 (w) , 4,79 (w), 4,44 (w), 4,29 (w), 4,20 (vw) , 4,02 (w), 3,84 (w) , 3,80 (w) , 3,67 (vs), 3,61 (m) , 3,56 (w) , 3,44 (m) , 3,27 (w) , 3,19 (w) , 3, 11 (s) , 3,00 (m) , 2,94 (w) , 2,87 (w) , e 2,80 (w). Figura 12 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de Raios-X exibido pela forma solvatada I de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma solvatada I de ácido acético pode ser obtida por dissolução de dihidrocloreto de L-eritro- tetrahidrobiopterina numa mistura de ácido acético e água a uma temperatura elevada, adicionando adicionalmente ácido acético à solução, arrefecendo a uma temperatura de cerca de 10 °C, depois aquecendo a suspensão formada até cerca de 15 °C, e depois agitando a suspensão obtida por um período de tempo suficiente para equilibração de fase, que pode durar até 3 dias. O sólido cristalino é então filtrado e secado sob ar ou um gás de proteção tal como azoto a temperaturas próximas da temperatura ambiente.

Forma solvatada L

Foi descoberto que uma mistura de solvato etan+olico/forma cristalina hidratada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma L," ou "hidrato L". Forma L pode conter de 4% até 13% etanol e de 0% até cerca de 6% de água. Forma L pode ser transformada na forma G quando tratada em etanol a temperaturas de cerca de 0°C a 20°C. Adicionalmente, a forma L pode ser transformada na forma B quando tratada num solvente orgânico à temperatura ambiente (10°C a 60°C). Forma polimórfica L pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma L exibe um padrão caracteristico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos caracteristicos expressos em valores-d (A) a: 14,1 (vs), 10,4 (w) , 9,5 (w) , 9,0 (vw) , 6,9 (w) , 6,5 (w) , 6,1 (w) , 5,75 (w) , 5,61 (w) , 5,08 (w) , 4,71 (w) , 3,86 (w) , 3,78 (w) , 3,46 (m) , 3,36 (m) , 3,06 (w) , 2,90 (w) , e 2,82 (w) . Figura 13 é um gráfico do padrão caracteristico de difração de

Raios-X exibido pela forma solvatada L de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Forma L pode ser obtida por ressuspensão da forma hidratada E à temperatura ambiente em etanol e agitando a suspensão a temperaturas de 0 a 10 °C, preferencialmente cerca de 5 °C, por um período de tempo suficiente para equilibração de fase, que pode ser de 10 a 20 horas. 0 sólido cristalino é depois filtrado e secado preferencialmente sob pressão reduzida a 30°C ou sob fluxo de azoto. Análise por TG-FTIR sugere que a forma L pode conter quantidade variáveis de etanol e água, i.e., pode existir como um polimorfo (anidrato), como uma mistura de solvato etanólico/hidrato, ou mesmo como um hidrato.

Forma solvatada M

Foi descoberto que uma forma cristalina solvatada etanólica de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma M," ou "hidrato M". Forma M pode conter de 4% até cerca de 13% etanol e de 0% até cerca de 6% de água, o que sugere que o forma M é um solvato etanólico ligeiramente higroscópico. A forma solvatada M é formada à temperatura ambiente. Forma M é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis, uma vez que a forma M pode ser transformada na forma G quando tratada em etanol a temperaturas entre -10° e 15°C, e na forma B quando tratada em solventes orgânicos tais como etanol, C3 e C4 álcoois, éteres cíclicos tais como THF e dioxano. Forma polimórfica M pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma M exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (À) a: 18,9 (s), 6,4 (m) , 6,06 (w) , 5,66 (w) , 5,28 (w) , 4,50 (w) , 4,23 (w) , e 3,22 (vs) . Figura 14 é um gráfico do padrão caracterí stico de difração de Raios-X exibido pela forma solvatada M de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina. A forma solvatada etanólica M pode ser obtida por dissolução de dihidrocloreto de L-eritro- tetrahidrobiopterina em etanol e evaporação da solução sob fluxo de azoto à temperatura ambiente, i.e., entre 10°C e 40°C. Forma M pode também ser obtida por secagem da forma G sob um leve fluxo de azoto desidratado a uma velocidade de de cerca de 20 a 100 ml/min. Dependendo da extensão da secagem sob fluxo de azoto, a quantidade remanescente de etanol pode ser variável, i.e., de cerca de 3% a 13%.

Forma solvatada N

Foi descoberto que uma outra forma cristalina solvatada de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina é uma forma estável preferencial de BH4 para uso numa preparação farmacêutica como aqui descrita, que será daqui em diante referida como "forma N, " ou "hidrato N". Forma N pode conter no total até 10% de isopropanol e água, o que sugere que a forma N é um solvato de isopropanol ligeiramente higroscópico. Forma N pode ser obtida através da lavagem da forma D com isopropanol e secagem subsequente sob vácuo a cerca de 30 °C. Forma N é especialmente adequada como intermediário e material inicial para a produção de formas polimórficas estáveis. Forma polimórfica N pode ser preparada como um pó sólido com a gama de tamanhos de partícula desejada que varia tipicamente entre 1 ym até cerca de 500 ym.

Forma N exibe um padrão característico de difração de Raios-X pelo método de difração de pó com picos característicos expressos em valores-d (A) a: 19,5 (m), 9,9 (w) , 6,7 (w) , 5,15 (w) , 4,83(w), 3,91 (w) , 3,56 (m) , 3,33 (vs) , 3,15 (w) , 2,89 (w) , 2,81 (w) , 2,56 (w) , e 2,36 (w) .

Figura 15 é um gráfico do padrão característico de difração de Raios-X exibido pela forma solvatada N de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina. A forma de isopropanol N pode ser obtida por dissolução de L-eritro-tetrahidrobiopterina dihidrocloreto in 4,0 ml de uma mistura de isopropanol e água (rácio de volume de mistura de por exemplo 4:1) . A esta solução é lentamente adicionado isopropanol (IPA, por exemplo cerca de 4,0 ml) e a suspensão resultante é arrefecida a 0°C e agitada por várias horas (p. ex., cerca de 10 a 18 horas) a esta temperatura. A suspensão é filtrada e o resíduo sólido lavado com isopropanol à temperatura ambiente. O material cristalino obtido é então secado à temperatura ambiente (p.ex., cerca de 20 a 30°C) e pressão reduzida (cerca de 2 a 10 mbar) durante várias horas (p.ex., cerca de 5 a 20 horas). TG-FTIR mostra uma perda de massa de 9,0% entre 25 e 200 °C, que é atribuída a ambos isopropanol e água. Este resultado sugere que a forma N pode existir tanto na forma de um solvato isopropanol, como na forma de uma mistura de solvato isopropanol /hidrato, ou como uma forma não-solvatada contendo um apquena quantidade de água.

Para a preparação de formas polimórficas, pode ser usadas técnicas de cristalização bem conhecidas do estado da técnica, tais como agitação de uma suspensão (equilibração de fase em) , precipitação, re-cristalização, evaporação, métodos de absorção de solventes tais como água ou decomposição de solvatos. Soluções diluídas, saturadas, ou super-saturadas podem ser usadas para cristalização, com ou sem colocação de sementes como agentes de nucleação adequados. Temperaturas até 100 °C podem ser aplicadas para formar soluções. 0 arrefecimento para iniciar a cristalização e precipitação até -100 °C e preferencialmente até -30 °C pode ser aplicado. Polimorfos meta-estáveis ou formas pseudo-polimórficas podem ser usadas para preparar soluções ou suspensões para a preparação de formas mais estáveis e para alcançar concentrações mais elevadas nas soluções.

Foi surpreendentemente descoberto que a forma hidratada D é a forma mais estável entre os hidratos e as formas B e D são especialmente adequadas para serem usadas em formulações farmacêuticas. Formas B e D apresentam algumas vantagens tais como uma produção focada, bom manuseamento devido a um tamanho e morfologia de cristal conveniente, muito boa estabilidade sob condições de produção de vários tipos de formulação, estabilidade de armazenamento, maior solubilidade, e grande biodisponibilidade. Concordantemente, num método e/ou a numa composição aqui divulgada de uma forma de BH4 presente numa mistura é preferencialmente uma forma cristalina estabilizada de BH4 como é selecionada do grupo consistindo de forma cristalina polimórfica A, forma cristalina polimórfica B, forma cristalina polimórfica F, forma cristalina polimórfica J, forma cristalina polimórfica K, forma cristalina hidratada C, forma cristalina hidratada D, forma cristalina hidratada E, forma cristalina hidratada H, forma cristalina hidratada 0, solvato forma cristalina G, solvato forma cristalina I, solvato forma cristalina L, solvato forma cristalina M, solvato forma cristalina N, e combinações relacionadas. Mais preferencialmente, a forma de BH4 é para uso numa composição e método aqui divulgados, com a composição farmacêutica a incluir a forma polimórfica B e/ou forma hidratada D de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

As formas cristalinas de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina podem ser usadas conjuntamente com ácido fólico ou ácido tetrahidrofólico ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis tais como sais de sódio, potássio, cálcio ou amónio, cada um isoladamente ou adicionalmente com arginina. 0 rácio peso:peso das formas cristalinas:ácidos fólicos ou sais relacionados:arginina podem ser de cerca de 1:10:10 até cerca de 10:1:1. VI. Formulações farmacêuticas

As formulações aqui descritas são preferencialmente administradas como formulações orais. As formulações orais são preferencialmente formulações sólidas tais como cápsulas, pastilhas, comprimidos e lozengos, ou formulações liquidas tais como suspensões aquosas, elixires e xaropes. As várias formas de BH4 aqui descritas podem ser usadas directamente como pós (partículas micronizadas) , grânulos, suspensões ou soluções, ou ou podem ser combinadas conjuntamente com outros ingredientes em misturas de componentes e opcionalmente reduzir o seu tamanho, e preenchê-las em cápsulas, compostas por exemplo por gelatina dura ou mole, pastilhas comprimidas, comprimidos ou lonzengos, ou ressuspendê-las ou dissolvê-las em veículos para suspensões, elixirs e xaropes. Revestimentos podem ser aplicados após compressão à forma dos comprimidos.

Ingredientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos para os vários tipos de formulação e podem ser por exemplo agentes de ligação tais como polímeros sintéticos e naturais, excipientes, lubrificantes, surfatantes, agentes adoçantes e agentes aromatizantes, meteriais para revestimento, preservantes, corantes, agentes espessantes, adjuvantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes e veículos para os vários tipos de formulação. Exemplos não-limitantes de agentes de ligação úteis numa composição aqui descrita incluem goma adragante, acácia, amido, gelatina, e polímeros biologicamente degradáveis tais como homo- ou co-poliésteres de ácidos dicarboxílicos, alquilenoglicóis, polialquilenoglicóis e/ou ácidos carboxílicos alifáticos hidroxilo; homo- ou co-poliamidas de ácidos dicarboxílicos, alquilenodiaminas, e/ou aminoácidos carboxílicos alifáticos; co-polímeros poliéster-poliamida correspondentes, polianidridos, poliortoésteres, polifosfazeno e policarbonatos. Os polímeros bilogicamnte degradáveis podem ser lineares, ramificados, ou entrecruzados. Exemplos específicos são ácido poli-glicólico, ácido poli-láctico, e poli-d,1-láctido/glicólido. Outros exemplos para polímeros são polímeros solúveis em água tais como polioxialquilenos (polioxietileno, polioxipropileno e polímeros mistos relacionados, poli-acrilamidas e poliacrilamidas hidroxialquiladas, ácido poli-maleico e ésteres ou -amidas relacionadas, ácido poli-acrilic e ésteres ou -amidas relacionadas, álcool polivinilico e ésteres ou -éteres relacionados, poli-vinilimidazolo, poli-vinilpirrolidona, e polímeros naturais tais como quitosano.

Exemplos não-limitantes de excipientes úteis numa composição aqui descrita incluem fosfatos tais como fosfato de dicálcio. Exemplos não-limitantes de lubrificantes usados numa composição aqui descrita incluem óleos naturais ou sintéticos, gorduras, ceras, ou sais de ácidos gordos tais como estearato de magnésio.

Surfatantes para uso numa composição aqui descrita podem ser não-iónicos, aniónicos, anfotéricos ou neutrais. Exemplos não-limitantes de surfatantes úteis numa composição aqui descrita incluem lecitina, fosfolípidos, sulfato de octilo, sulfato de decilo, sulfato de dodecilo, sulfato de tetradecilo, sulfato de hexadecilo e sulfato de octadecilo, oleato de Na ou caprato de Na, 1-acylaminoetano-2-sulfónicos, tais como 1-ácido octanoilaminoetano-2-sulfónico, ácido 1-decanoilaminoetano-2-sulfónico, ácido l-dodecanoilaminoetano-2-sulfónico, ácido l-tetradecanoilaminoetano-2-sulfónico, ácido 1-hexadecanoilaminoetano-2-sulfónico, e ácido 1-octadecanoilaminoetano-2-sulfónico, e ácido taurocólico e ácido taurodesóxicólico, sais biliares e seus sais, tais como ácido eólico, ácido desóxicólico e glicocolatos de sódio, caprato de sódio ou laurato de sódio, oleato de sódio, laurilsulfato de sódio, cetilsulfato de sódio, óleo de ricino sulfatado e dioctilsulfosuccinato de sódio, cocamidopropilbetaína e laurilbetaína, álcoois gordos, colesteróis, mono- ou -distearato de glicerol, mono- ou - dioleato de glicerol e mono- ou -dipalmitato de glicerol, e estearato de polioxietileno.

Exemplos não-limitantes de agentes adoçantes úteis numa composição aqui descrita sacarose, frutose, lactose ou aspartame. Exemplos não-limitantes de agentes aromatizantes para uso numa composição aqui descrita incluem menta, óleo de palma ou aromatizantes de frutos tais como sabor a cereja ou laranja. Exemplos não-limitantes de materiais de revestimento para uso numa composição aqui descrita incluem gelatina, cera, goma-laca, açúcar ou outros polímeros biologicamente degradáveis. Exemplos não-limitantes de preservantes para uso numa composição aqui descrita incluem metil- ou propilparabenos, ácido sórbico, clorobutanol, fenol e timerosal. A forma hidratada D aqui descrita pode também ser formulada pastilha ou pó efervescente, que se desintegra num ambiente aquoso para fornecer uma solução ingerível. Um xarope ou elixir pode conter o polimorfo aqui descrito, sacarose ou frutose como agente adoçante, um preservante tal como metilparabeno, um corante e um agente aromatizante.

Formulações de libertação retardada podem também ser preparadas a partir do polimorfo aqui descrito de forma a alcançarem uma libertação controlada do agente ativo em contacto com os fluídos corporais no trato gastrointestinal, e para fornecerem um nível de agente ativo substancialmente constante e eficaz no plasma sanguíneo. A forma cristalina pode ser incorporada para este propósito numa matriz polimérica de um polímero biologicamente degradável, um polímero solúvel em água ou uma mistura de ambos, e opcionalmente surfatantes adequados. A incorporação pode significar neste contexto a incorporação de micro-partículas numa matriz de polímeros.

Formulações de libertação controlada são também obtidas através da encapsulação de micro-partículas dispersas ou micro-gotas emulsifiçadas através de tecnologias de revestimento de dispersões ou emulsões conhecidas.

Enquanto as necessidades individuais variam, a determinação das gamas ótimas de quantidades eficazes de cada componente encontra-se no âmbito do conhecimento daqueles habilitados no estado da técnica. Doses típicas de BH4 compreendem cerca de 1 até cerca de 20 mg/kg peso corporal por dia, que irá usualmente conter de cerca de 5 (1 mg/kg x 5kg peso corporal) até 3000 mg/dia (30mg/kg x 100kg peso corporal). Tal dose pode ser administrada numa dose isolada ou pode ser dividida em doses múltiplas. Enquanto uma administração contínua, diária é contemplada, pode ser desejável cessar a terapia com BH4 quando os sintomas dos níveis de Phe são reduzidos abaixo de um certo valor limiar. É claro que, a terapia pode ser reiniciada em circunstâncias em que os níveis de Phe aumentem novamente. É entendido que uma dose adequada de uma composição irá depender da idade, condição de saúde e peso do recetor da terapia, o tipo de tratamento concorrente, se presente, a frequência de tratamento, e a natureza do efeito desejado (i. e., a quantidade desejada de decréscimo na concentração plasmática de Phe) . A frequência de dosagem está também dependente nos efeitos farmacodinâmicos dos níveis de Phe. Se o efeito durar mais do que 24 horas a partir de uma dose isolada. Contudo, a dosagem mais preferencial pode ser ajustada a cada sujeito individual, tal como é entendido e determinável por uma pessoa habilitada no estado da técnica, com recurso a experimentação. Tal tipicamente envolve o ajuste de uma dose típica, p.ex., redução da dose no paciente que apresente um baixo peso corporal.

Como acima discutido, a dose total requerida para cada tratamento pode ser administrada em doses múltiplas ou numa dose isolada. A BH4 e as composições proteicas podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outros tratamentos terapêuticos dirigidos às doenças ou dirigidos a outros sintomas relacionados.

Tal como é aparente a partir da publicação aqui descrita, num amplo sentido a presente invenção contempla a aplicação clinica de uma terapia de combinação compreendendo uma primeira composição que contém uma formulação BH4 cristalizada, e uma segunda composição que contém uma formulação proteica médica (p.ex., PHENEX ou semelhante). Assim, as composições deveriam se formuladas em composições farmacêuticas adequadas, i. e., numa forma apropriada para aplicação in vivo nas referidas terapias de combinação. Genericamente, tal irá englobar a preparação de composições que são essencialmente apirogénicas, assim como livres de outras impurezas que poderão ser prejudiciais a humanos ou animais. Preferencialmente, a composição de BH4 cristalizada pode ser tal que possa ser adicionada diretamente a formulações proteicas pré-existentes usadas para o tratamento de PKU.

Uma pessoa geralmente desejará empregar sais e tampões apropriados para tornar a BH4 adequada para administração. Composições aquosas para uso de acordo com a presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de BH4 dissolvido ou disperso num veiculo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem ser administradas oralmente. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem efeitos adversos, alérgicos, ou outras reações indesejadas quando administradas a um animal ou a um humano. Como aqui usada, a expressão "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e agentes de retardamento de absorção e semelhantes. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecido do estado da técnica. Exceto em circunstâncias em que qualquer meio ou agente 'r incompatível com as composições farmacêuticas, o seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem tabém ser incorporados nas composições. Em formas de realização exemplificativas, a formulação proteica médica pode compreender xarope de milho, óleo de cártamo com elevado teor de ácido oleico, óleo de coco, óleo de soja, L-leucina, fosfato de cálcio tribásico, L-tirosina, L-prolina, acetato de L-lisina, DATEM (um emulsificante), L-glutamina, L-valina, fosfato de potássio dibásico, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidratada, L-serina, citrato de potássio, L-treonina, citrato de sódio, cloreto de magnésio, L-histidina, L-metionina, ácido ascórbico, carbonato de cálcio, ácido L-glutâmico, dihidrocloreto de L-cistina, L-triptofano, ácido L-aspártico, cloreto de colina, taurina, m-inositol, sulfato ferroso, ascorbil palmitato, sulfato de zinco, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferil, cloreto de sódio, niacinamida, tocoferóis mistos, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, cloretp de tiamina, palmitato de vitamina A, sulfato de manganês, riboflavina, cloreto de piridoxina, ácido fólico, beta-caroteno, iodeto de potássio, filoquinona, biotina, selenato de sódio, cloreto de crómio, molibdato de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. Os aminoácidos, minerais e vitaminas no suplemento deverão ser fornecidos em quantidades que fornecem as doses diárias recomendadas de cada um dos componentes.

Como aqui usada, a expressão "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e agentes de retardamento de absorção e semelhantes. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido do estado da técnica. Exceto em circunstâncias em que o meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

As composições ativas para uso de acordo com a presente invenção incluem preparações farmacêuticas clássicas de BH4 que foram aqui discutidas assim como outras conhecidas para aqueles habilitados no estado da técnica. Fórmulas proteicas, tais como, p.ex., Phenex, também são conhecidas para aqueles habilitados no estado da técnica. Administração destas composições poderá ser efetuada por qualquer via comum para a suplementação dietética. A proteína é preferencialmente administrada oralmente, tal como no caso de BH4.

Os compostos ativos podem ser preparados para administração como soluções de bases livres ou sais farmacologicamente aceitáveis em água misturados adequadamente com um surfatante tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicois líquidos, e misturas relacionadas e em óleos. Sob condições extraordinárias de armazenamento e uso, tais preparações contêm um preservante para prevenir o crescimento de microrganismos.

As composições de BH4 podem ser preparadas enquanto formas farmacêuticas adequadas para uso injetável. Tais composições incluem soluções aquosas esterilizadas ou dispersões e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Em todos os casos a deverá ser esterilizada e deverá ser fluida para facilitar a administração via seringa. Deverá também ser estável sob as condições de produção e armazenamento e deverá ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes) , misturas adequadas relacionas, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, por manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de surfatantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser feita aproximadamente por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será referível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida através do uso de composições de agentes retardadores de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Soluções injetáveis esterilizadas são preparadas por incorporação de compostos ativos na quantidade requerida de outros ingredientes acima enumerados, como requerido, seguido por esterilização via filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados num veículos esterilizado que contém o meio básico de dispersão e outros ingredientes requeridos tais como os acima enumerados. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferenciais de preparação são as técnicas de secagem por vácuo e a liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais um ingrediente adicional desejado a partir da solução previamente filtrada e esterilizada relacionada. A BH4 usada numa composição aqui descrita é preferencialmente formulada como, um sal de dihidrocloreto, contudo, é contemplado que outras formas salinas de BH4 possuam a atividade biológica desejada, e consequentemente, outras formas salinas de BH4 podem ser usadas.

Sais de adição alcalinos farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com metais ou aminais, tais como metais alcalinos e metais alcalino-terrosos ou aminas orgânicas. Sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos podem também ser preparados com um catião farmaceuticamente aceitável. Catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados de compostos são bem conhecidas por aqueles habilitados no estado da técnica e incluem catiões alcalinos, alcalino-terrosos, catiões de amónia e de amónia quaternária. Carbonatos ou hidrogenocarbonatos são também possíveis. Exemplos de metais usados como catiões são sódio, potássio, magnésio, amónio, cálcio, ou ferro, e semelhantes. Exemplos de aminas adequadas incluem isopropilamina, trimetilamina, histidina, N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilenodiamina, N-metilglucamina, e procaína.

Sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos. Exemplos de sais de adição ácidos adequados incluem os cloretos, acetatos, citratos, salicilatos, nitratos, fosfatos. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica e incluem, por exemplo, ácido acético, cítrico, oxálico, tartárico, ou mandélico, ácido clorídrico, ácido brómico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico; com ácidos orgânicos carboxílicos, ácido sulfónico, ácidos sulfatados ou fosfatados ou ácidos sulfâmicos N-substituídos, por exemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido sucínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxalico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico ou ácido isonicotónico; e com aminoácidos, tais como os 20 aminoácidos alfa envolvidos na síntese de proteínas na natureza, por exemplo ácido glutâmico ou ácido aspártico, e também o ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, etano-1,2-disulfónico, benzenosulfónico, ácido 4-metilbenzenosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, 2- ou 3-fosfoglicerato, glucose-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfâmico (com uma formação de ciclamatos), ou com outros compostos de ácidos orgânicos, tais como ácido ascórbico.

Especif icamente, os sais de BH4 com ácidos orgânicos ou inorgânicos são preferenciais. Exemplos não-limitantes de formas salinas alternativas de BH4 incluem sais de BH4 de ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido fumárico, e ácido mandélico.

A frequência da dosagem de BH4 irá depender dos parâmetros farmacocinéticos do agente e as vias de administração. A formulação farmacêutica ótima determinada por uma pessoa habilitada no estado da técnica dependerá da via de administração e a dosagem desejada. Ver por exemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042) pp 1435 1712. Tais formulações podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de eliminação in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, áreas de superfície corporal ou tamanho dos órgãos. Refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dose de tratamento apropriada é rotineiramente feita por aqueles rotineiramente habilitados no estado da técnica através de experimentação, especialmente à luz da informação dosagem e ensaios aqui descritos e de dados farmacocinéticos observados em animais ou em ensaios clínicos em humanos.

Doses apropriadas podem ser determinadas através do uso de ensaios estabelecidos para a determinação dos níveis sanguíneos de Phe em conjugação com dados relevantes de dose-resposta. O regime final de dosagem pode ser determinado pelo médico responsável, tendo em conta fatores que modificam a ação dos fármacos, p.ex., a atividade específica do fármaco, a gravidade da condição e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infeção, o tempo de administração e outros fatores clínicos. À medida que os estudos são conduzidos, informação adicional irá emergir relativamente aos níveis de dosagem apropriados e a duração do tratamento para doenças e condições específicas.

Será apreciado que a invenção pode ser útil nos campos da medicina humana e medicina veterinária. Assim, o sujeito a ser tratado pode ser um mamífero, preferencialmente humano ou outro animal. Para propósitos veterinários, sujeitos incluem por exemplo, animais de criação incluindo vacas, ovelhas, porcos, cavalos e cabras, animais de companhia tais como gatos e cães, animais exóticos e animais de zoo, animais de laboratório incluindo ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, e hámsteres, e aves tais como galinhas, perus, patos e gansos. VII. Exemplos

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar formas de realização preferenciais da invenção. Deverá ser entendido que aqueles habilitados no estado da técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas que foram descobertas pelo inventor como funcionando bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferenciais para esta prática. Contudo, aqueles habilitados no estado da técnica deverão, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas em formas de realização específicas que são divulgadas e ainda assim obter um resultado semelhantes ou igual. EXEMPLO 1

Avaliação clinica com 6R-Tetrahidrobiopterina 0 seguinte exemplo fornece orientação relativamente aos parâmetros a serem usados para a avaliação clínica de BH4 de acordo com a presente invenção. Como aqui discutido ao longo desta publicação, BH4 será usada no tratamento de HPA incluindo HPA, fenilcetonúria moderada (PKU) e PKU aguda clássica. Ensaios clínicos serão conduzidos de forma a fornecerem uma avaliação das doses orais diárias de BH4 para efeitos de segurança, farmacocinética, e resposta inicial tanto no momento inicial como em pontos temporais clinicos definidos. 0 ensaio será conduzido por um minimo de tempo, mas necessariamente limitado a, 6 semanas para recolher informação e segurança suficiente para 30 pacientes em avaliação. A dose inicial nos ensaios ira variar desde cerca de 10 até cerca de 20 mg/kg. Em circunstância em que esta dose não produza uma redução nos níveis plasmáticos de fenilalanina (Phe) num paciente, ou produzir um benefício clínico direto significativo medido como uma capacidade para aumentar a administração oral diária de Phe sem aumentos nos níveis plasmáticos de Phe, a dose deverá ser aumentada quando necessário e mantida por um período mínimo adicional de, mas necessariamente limitados a, 6 semanas para estabelecer segurança e para avaliar adicionalmente a eficácia. Doses mais baixas, p.ex., doses entre 5 to 10 mg/kg são também contempladas.

Medidas de segurança irão incluir eventos adversos, reações alérgicas, painel de química clinica completo (função renal e hepática), análises de urina, e CBC com diferencial. Adicionalmente, outros parâmetros incluindo a redução nos níveis sanguíneos de Phe, teste neuropsicológico e cognitivo, e avaliações globais serão também realizadas. O presente exemplo também contempla a determinação dos parâmetros farmacocinéticos do fármaco na circulação, e distribuição geral e tempo de meia-vida de 6R-BH4 no sangue. É antecipado que as medições ajudarão a ajustar a dose para uma resposta clínica. Métodos

Pacientes que apresentam níveis elevados de Phe plasmático irão ser submetidos ao recolher da sua história médica e a um exame físico, teste neuropsicológico e cognitivo, um conjunto estandardizado de testes laboratoriais e clínicos (CBC, Painel 20, CH50, UA) , níveis de pterinas urinárias, níveis de dihidropteridina reductase (DHPR), e um painel sanguíneo (plasma) de aminoácidos séricos. A dose humana proposta de 10 até cerca de 20 mg/kg BH4 irá ser administrada dividida em uma a três doses diárias. O paciente irá ser seguido continuamente com visitas semanais à clínica. Os pacientes irão regressar à clinica para uma avaliação completa 1 semana após completarem o período de tratamento. Caso o escalar de dose seja requerido, os pacientes irão seguir o mesmo plano de dosagem acima referido. A segurança irá ser monitorizada ao longo do ensaio.

Os pacientes selecionados irão ser randomizados para receberem BH4 ou um placebo. Após um período inicial de duas a quatro semanas, todos os participantes do estudo irão ser colocados numa dieta controlada com uma administração limitada de Phe para um período total de quatro a seis semanas. Após finalização das primeiras duas a quatro semanas na restrição dietética, todos os participantes do estudo serão cruzados na sua randomização e serão seguidos por um período adicional de duas a quatro semanas. Os níveis sanguíneos de Phe e outros parâmetros bioquímicos serão seguidos rigorosamente no final de cada período. A avaliação dos resultados neuropsicológico irão incluir medições do grau sustentado de atenção; memória de trabalho; e capacidade de realizar operações complexas. Pacientes que completaram o ensaio, e que beneficiaram da terapia através da demonstração de um decréscimo benéfico nos níveis plasmáticos de Phe, irão convidados a continuar a terapia BH4 por um protocolo de tempo estendido desde que as condições de segurança e eficácia assim o garantam, ou até aprovação da BLA.

Diagnóstico e Critérios de Inclusão/Exclusão 0 paciente pode ser do sexo masculino ou feminina, com idade de 12 anos de idade ou mais velho com um diagnóstico documentado de HPA ou PKU moderada confirmado pelo teste genético e evidência de níveis elevados de Phe no sangue. 0 estudo irá incluir HPA ou pacientes com PKU que não seguiram com exatidão o protocolo dietético. Pacientes do sexo feminino com potencial de gravidez deverão apresentar um teste de gravidez negativo (urina β-hCG) imediatamente antes de cada dosagem e deverão ser aconselhados a usar um método de contraceção medicamente aceite ao lingo do estudo. Um paciente irá ser excluído deste estudo se o paciente apresentar evidências de uma deficiência primária de BH4, tendo recebido doses múltiplas mais do que 1 semana de tratamento; se encontrar em estafo de gravidez ou amamentação; ter recebido um fármaco de investigação nos 30 dias anteriores à seleção para o estudo; ou apresentar uma condição médica; doença concorrente grave; ou outra circunstância extenuante que pode significativamente diminuir o cumprimento por parte do paciente.

Dosagem, Via e Regime

Os pacientes irão receber BH4 a uma dosagem de 5-10 mg/kg por dia. Na circunstância em que os níveis sanguíneos de Phe não sejam diminuídos por uma quantidade razoável e nenhum benefício clínico seja observado, a dose será aumentada quando necessário. O aumento da dosagem irá ocorrer apenas após todos os paciente terem sido submetidos a pelo menos 2 semanas de terapia. A dose diária de BH4 será administrada oralmente como um liquido, pó, pastilhas ou cápsulas. A dose total diária pode ser fornecida como uma dose individual ou talvez dividida em duas ou três doses diárias. Os pacientes serão monitorizados clinicamente assim como para quaisquer outras reações adversas. Se algum sintoma invulgar tiver sido observado, a administração do fármaco do estudo será parada imediatamente, e uma decisão será feita acerca da continuação do estudo.

Intervenção dietética

Após a randomização inicial e o período de tratamento de duas semanas, todos os participantes do estudo irão ser submetidos a aconselhamento dietético e seguirão uma dieta restringida para Phe complementada com suplementos alimentares médicos específicos para Phe por um período total de tempo de seis semanas. As dietas serão geridas em casa e a administração dietética irá ser registada em registos diários. As análises da administração dos nutrientes e alimentos édicos e a percentagem da administração dietética recomendada (RDI) serão comparadas entre os grupos de tratamento.

Segurança BH4 A terapia com BH4 terá determinada como sendo segura se nenhumas reações crónicas ou agudas significativas ao fármaco tiverem ocorrido durante o curso do estudo. A administração a longo-termo do fármaco irá ser determinada como sendo segura se nenhuma anormalidade significativa tiver sido observada nos exames clínicos, laboratoriais, clínicos, ou outros estudos apropriados. EXEMPLO 2

Preparação da forma cristalizada estabilizada de BH4 0 pedido provisório de Patente U.S. No. 60/520,377, intitulado "Polymorphs of (6R)-L-eritro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride" submetido a 17 de Novembro de 2003 no nome dos requerentes Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiça e Viola GROEHN de Dachsen, Suiça e atribuído à empresa Merck-Eproof referência interna número 216, e Pedido de Patente U.S. No: _, intitulado "Polimorphs of (6R)-L-eritro- tetrahydrobiopterin dihydrochloride" aqui preenchido concorrentemente a 17 de Novembro de 2004 no nome dos requerentes Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiça e Viola GROEHN de Dachsen, Suiça atribuído à empresa Merck-Eproof referência interna número 216/US CIP (ambos pedidos de Moser et al. são aqui coletivamente referidos como "Pedidos de patente de Moser" e ambos são aqui incorporados para efeitos de referência na sua totalidade. Os exemplos da descrição descrevem estudos de espectros de Raios-X e de Raman para caracterizar os polimorfos de BH4. Cada uma das composições de BH4 desse pedido de patente pode ser usada nos métodos de tratamento aqui descritos. A seguinte descrição fornece dados adicionais e uma breve caracterização de algumas das composições dos exemplos.

Resultados obtidos durante o desenvolvimento de dihidrocloreto de 6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina (ver os Pedidos de patente de Moser) indicaram que um composto pode apresentar formas polimórficas. O interessa continuado nesta área requer um método eficiente e confiável para a preparação de polimorfos individuais de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina e condições de cristalização controladas para fornecerem os polimorfos, que são preferencialmente estáveis e mais fáceis de manusear e processar na produção e preparação de formulações. Técnicas de cristalização bem conhecidas do estado da técnica para a produção de cristais de fármacos são usadas para preparar as formas polimórficas. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, técnicas tais como suspensão, precipitação, re-cristalização, evaporação, métodos de absorção de solventes tais como água ou decomposição de solvatos. Soluções diluídas, saturadas, ou super-saturadas de BH4 podem ser usadas para cristalização, com ou sem colocação de sementes como agentes de nucleação adequados. Temperaturas até 150 °C podem ser aplicadas para formar soluções do fármaco. O arrefecimento para iniciar a cristalização e precipitação até -100 °C e preferencialmente até -30 °C pode ser aplicado. Polimorfos meta-estáveis ou pseudo-formas polimórficas podem ser usadas para preparar soluções ou suspensões para a preparação de formas mais estáveis e para alcançar concentrações mais elevadas nas soluções.

Como acima discutido nos pedidos de patente de Moser, a forma polimórfica pode ser obtida por cristalização de BH4 a partir de misturas de solventes polares. Os pedidos de patente de Moser também descreve, um processo para a preparação da forma polimórfica de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina, compreendendo a dissoluçãi, opcionalmente a temperaturas elevadas, de uma forma sólida de menor energia do que a forma reivindicada de dihidrocloreto (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina numa mistura de solventes polares, adição de sementes à solução, arrefecimento da suspensão obtida e isolamento dos cristais formados. A dissolução pode ser realizada à temperatura ambiente ou até 70 °C. Mais preferencialmente a dissolução é realizada a temperaturas até 50 °C. 0 material inicial pode ser adicionado à mistura final de solventes para dissolução, ou alternativamente o material inicial primeiramente pode ser dissolvido em água e outros solventes podem então ser adicionados simultaneamente ou um solvente após o outro. A solução de BH4 é preferencialmente agitada. O arrefecimento pode significar temperaturas até -80 °C, preferencialmente de -40 °C até 0 °C. Nalgumas formas de realização, de forma a iniciar a cristalização de um polimorfo BH4, a solução pode ser semeada com agentes de nucleação. Agentes de nucleação adequados podem incluir uma porção de uma forma polimórfica de cristais de outro ciclo de produção, ou cristais possuindo uma morfologia idêntica ou similar. Após isolamento, a forma cristalina pode ser lavada com acetona ou tetrahidrofurano e secada usando técnicas comummente usadas para secagem de cristais de fármacos.

As formas polimórficas de BH4 descritas nos pedidos de patente de Moser são uma forma cristalina muito estável dos compostos. A forma polimórfica pode ser facilmente filtrada, secada e moida a tamanhos de partícula desejados para formulações farmacêuticas. Estas propriedades extraordinárias tornam esta forma polimórfica especialmente adequada para aplicação farmacêutica. A estabilidade de uma forma polimórfica de BH4 foi determinada após BH4x2HCl (a forma polimórfica) ter sido armazenada durante 8 meses num saco de armazenamento a 40°C e 75% de humidade relativa. A qualidade foi analisada em diferentes intervalos de tempo ao longo do período de 8 meses por análise de HPLC. Após 8 meses, a qualidade e estabilidade do polimorfo foi surpreendem ente similar à estabilidade observada no momento zero inicial:

Concordantemente, os pedidos de patente de Moser fornecem descrições de composições farmacêuticas compreendendo a forma polimórfica de dihidrocloreto de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Tais composições serão úteis nos métodos terapêuticos aqui descritos.

Adicionalmente aos pedidos de patente de Moser, aqueles habilitados no estado da técnica também são direcionados para as Patentes U.S. Nos. 6,596,721; 6,441,168; e 6271,374 que descrevem vários métodos e composições para produção de sais cristalinos estáveis de ácido 5-metiltetrahidrofólico e métodos e composições para a produção de formas estáveis de ácido de 6R-tetrahidrofólico e métodos e composições para a produção de formas estáveis de ácido 6S- e 6R-tetrahidrofólico. Cada uma destas patentes ensina métodos de produção de formas cristalinas de agentes e técnicas para a caracterização dos referidos agentes. Tais métodos podem ser usados na produção de formas estáveis de BH4 para uso nas composições farmacêuticas nos métodos de tratamento aqui ensinados.

Todas as composições e/ou métodos aqui divulgados podem ser produzidos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Enquanto a invenção foi descrita em termos de formas de realização preferenciais, será aparente para aqueles habilitados no estado da técnica que variações podem ser aplicadas à invenção e nos passos ou na sequência de passos do método aqui descrito. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados possam ser substituídos por agentes aqui descritos Enquanto os mesmos resultados ou resultados similares possam ser alcançados. Todos esses substitutos e modificações similares aparentes àqueles habilitados no estado da técnica encontram-se no âmbito da invenção como definida pelas reivindicações anexas. EXEMPLO 3

Administração de Tetrahidrobiopterina a Humanos com níveis séricos elevados de Phe

Um estudo aberto, de dose isolada ou múltipla foi conduzido num total de 20 pacientes para demonstrar a segurança e eficácia de tetrahidrobiopterina em humanos com níveis sanguíneos elevados de Phe fenilalanina (> 600 ymol/L). Os critérios para inclusão no estudo incluíram (1) níveis sanguíneos basais de Phe >600 ymol/L, (2) idade de pelo menos 8 anos. Critérios para exclusão do estudo incluíram (1) gravidez ou amamentação, (2) doenças ou condições concorrentes que requerem medicação ou tratamento, (3) tratamento concorrente com qualquer fármaco usado para inibir a síntese de folato, e (4) tratamento com qualquer fármaco em investigação nos 30 dias anteriores ao estudo. Cada um dos pacientes também foi identificado como possuindo uma mutação no gene da fenilalanina hidroxilase (PAH) . Sujeitos do estudo foram submetidos a avaliações basais, incluindo historial médico com avaliação de sinais e sintomas relacionados com fenilcetonúria (PKU) ou hiperfenilalaninamia (HPA), exames físicos, sinais vitais, aminoácidos séricos (i.e., fenilalanina, tirosina, e triptofano), níveis sanguíneos, e testes de laboratório rotineiros (química, hematologia, e análise de urina) antes da inclusão no estudo. 0 fármaco testado foi (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina, também conhecido como 2-amino-6-(1,2-dihidroxipropil)-5,6,7,8-tetrahidro-3H-pteridin-4-onatetrahidrobiopterina, ou sapropterina (BH4 ou 6R-BH4. 0 fármaco foi obtido em partilhas orais de 10 mg ou 50 mg a partir de Schircks Laboratories, Suíça (produto no. 11,212 dihidrocloreto de (6R)-5,6,7,8-Tetrahidro-L-biopterina). O tempo de meia-vida de Schircks 6R-BH4, sal de dihidrocloreto é de aproximadamente 3,5 horas.

Os fármacos conhecidos por inibirem a síntese de folato tais como bactrim, metotrexato, ou 5-FU não foram permitidos ser administrados durante o estudo. Antes da iniciação da dosagem 6R-BH4, um período de lavagem de 7 dias para quaisquer fármacos conhecidos por inibirem a síntese de folato. Nenhuns fármacos em investigação foram permitidos ser administrados durante a participação no estudo ou nos 30 dias anteriores ao início do estudo.

Num máximo de 4 semanas após a realização das avaliações basais, sujeitos elegíveis começaram a primeira fase do estudo. Doses isoladas crescentes de 10 mg/kg, 20 mg/kg e 40 mg/kg de 6R-BH4 foram administradas oralmente, com um período de lavagem de pelo menos 7 dias entre cada dose, e os sujeitos foram monitorizados 24 horas após cada dose. Os sujeitos foram submetidos a uma avaliação de segurança e as medições dos níveis sanguíneos de aminoácidos (i.e, fenilalanina, tirosina, e triptofano) foram realizadas antes e após 24 horas após cada dose de 6R-BH4. A pressão sanguínea foi medida a cada 30 minutos e 1 hora após cada dose. As avaliações de segurança incluíram exames físicos, sinais vitais, avaliação serial de sinais e sintomas relacionados com PKU ou HPA, registro dos eventos adversos, e monitorização de mudanças nos parâmetros laboratoriais (química, hematologia, e análise de urina). Os sujeitos foram instruídos para continuarem a sua dieta normal sem qualquer modificação, e para registarem a administração diária de comida e bebidas antes do estudo.

Após a primeira fase do estudo ter sido completada, os sujeitos entraram numa segunda fase do estudo, durante a qual receberam 10 mg/kg de 6R-BH4 diariamente numa forma de dosagem oral, para um total de 7 dias. Após um período de lavagem de 7 dias, cada sujeito recebeu 20 mg/kg de 6R-BH4 diariamente por um total de 7 dias. Durante a segunda fase do estudo, os sujeitos foram monitorizados durante a dosagem, a 24 e 72 horas após a primeira dosagem, e no sétimo dia de dosagem a cada um dos dois níveis de dosagem. A monitorização incluiu uma avaliação de segurança como acima descrita, medição dos níveis sanguíneos séricos de aminoácidos (i.e, fenilalanina, tirosina, e triptofano) e avaliação da administração oral de fenilalanina e tirosina. Os sujeitos foram instruídos a continuar a sua dieta normal sem qualquer modificação, e a registarem a administração diária de comida e bebidas ao longo do estudo.

Após uma dose única de 6R-BH4 (10 mg/kg), o Phe sanguíneo diminuiu 10% ± 0,26% do valor basal. Doses isoladas de 6R-BH4 a 20 mg/kg e 40 mg/kg apresentaram decréscimos médios de 17% ± 0,28% e 27% ± 0,25% respetivamente. A redução nos níveis sanguíneos de Phe aparentou ser dependente de dosagem.

Figura 16 mostra os níveis médios de fenilalanina nos angue após administração diária de 10 e 20 mg/kg 6R-BH4 durante 7 dias, em 14 de 20 pacientes que responderam ao tratamento. Para os propósitos deste estudo, um decréscimo de 30% nos níveis sanguíneos de Phe foi considerado "responsivo", embora pacientes que tenham exibido um decréscimo menor também tenham beneficiado ainda assim do tratamento com BH4. 0 ensaio clínico de 7 dias mostrou um decréscimo sustentado na concentração sanguínea de Phe em 70% dos pacientes (14/20) tomando 20 mg/kg. Desses 14 pacientes, 10 (71%) responderam favoravelmente à dosagem 10 mg/kg/dia. A tirosina no sangue foi observada aumentar em alguns mas não todos os pacientes; alguns pacientes apresentaram aumentos de >80% no valor basal de tirosina. As respostas individuais nos níveis de Phe às doses múltiplas de 10 mg/kg BH4 são apresentadas em 11 adultos (Figura 17) e 9 crianças (Figura 19) . As respostas individuais fos níveis sanguíneos de Phe às doses múltiplas de 20 mg/kg BH4 foram demonstradas em 11 adultos (Figura 18) e em 9 crianças (Figura 20).

Assim, um teste de administração de doses isoladas foi inadequado para identificar pacientes que responderam ao tratamento com BH4 com uma redução no nível sanguíneo de Phe na ordem dos 30% ou mais. Um teste de administração de 7 dias identificou com sucessos uma elevada percentagem de pacientes responsivos. O teste de administração de 20 mg/kg, o teste de administração de 6R-BH4 identificou 70% dos pacientes com PKU que responderam a 20 mg/kg de BH4. Dos 14 indivíduos responsivos, 71% também apresentaram uma redução superior a 30% no nível sanguíneo de Phe com a dosagem mais reduzida de 10 mg/kg 6R-BH4.

Lisboa, 8 de setembro de 2016

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Tetrahidrobiopterina (BH4), ou opcionalmente uma forma salina relacionada, para uso no tratamento de um sujeito com fenilcetonúria (PKU) , onde a BH4 será administrada oralmente uma vez por dia a uma dose diária de 5 mg/kg A 30 mg/kg, e onde a BH4 será administrada em combinação com uma dieta restrita de proteína
2. A BH4 para uso em tratamento da reivindicação 1, onde a referida BH4 é formulada como um sal de dihidrocloreto.
3. A BH4 para uso em tratamento da reivindicação 1 ou 2, onde a dose diária é de 10 mg/kg a 20 mg/kg.
4. A BH4 para uso em tratamento de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde a dose diária é de 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, ou 20 mg/kg.
5. A BH4 para uso em tratamento das reivindicações 1 a 4, onde o sujeito padece de PKU aguda clássica.
6. A BH4 para uso em tratamento das reivindicações 1 a 4, onde o sujeito padece de PKU moderada.
7. A BH4 para uso em tratamento das reivindicações 1 a 4, onde o sujeito apresenta uma forma mutante de fenilalanina hidroxilase (PAH).
8. A BH4 para uso em tratamento da reivindicação 7, onde a PAH mutante compreende uma mutação no domínio catalítico de PAH.
9. A BH4 para uso em tratamento da reivindicação 7, onde a mutação compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo de F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M, E390G, A395P, P407S, e Y414C.
10. A BH4 para uso em tratamento de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, onde o referido sujeito é uma mulher grávida.