PT680512E

PT680512E - Uma molécula provida de imunidade activadora das células e derivada de um lipopolissacarídeo meningocócico, métodos para a sua preparação, uma vesícula de membrana externa provida com grupo de polipepetídeos

Info

Publication number: PT680512E
Application number: PT93921120T
Authority: PT
Inventors: Peter Andre Van Der Ley; Jan Theunis Poolman; Peter Hoogerhout
Original assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 2007-09-25
Also published as: AU4835193A; ATE364702T1; FI951535L; DE69334147T2; EP0680512B1; EP0680512A1; NL9201716A; AU684720B2; FI951535A7; DK0680512T3; WO1994008021A1; NO321651B1; JPH08501940A; CA2146145A1; CA2146145C; ES2289739T3; NO951181D0; DE69334147D1; NO951181L; FI951535A0

Description

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A presente invenção refere-se a uma molécula activadora das células B que provê imunidade derivada de um lipopolissacarídeo meningocócico (LPS), compreendendo a dita molécula pelo menos um epítopo, compreendendo a dita molécula pelo menos a parte comum da parte do oligossacarideo (região do núcleo) dos lipopolissacarideos que são específicos de pelo menos dois imunotipos meningocócicos. A invenção refere-se também a métodos para a sua preparação, tanto sinteticamente como através das técnicas de ADN recombinante. Além de que, a presente invenção refere-se a uma vesícula de membrana externa que compreende uma molécula das reivindicações de 1 a 3. A invenção refere-se também a uma vacina que compreende a dita molécula e/ou a dita vesícula de membrana externa. Um método para preparar a vesícula da membrana externa entra também dentro do campo de protecção da presente invenção. E sabido que as vacinas de polissacarídeos capsulares purificados (CPS) podem induzir à imunidade protectora. Esta imunidade depende da idade da pessoa vacinada e tem uma curta duração. As desvantagens intrínsecas dos polissacarídeos capsulares como vacinas são iludidas pelos processos clássicos da ligação dos polissacarídeos capsulares ou oligossacarídeos deles derivados com proteínas (Goebel, W.F., & O.T. Avery 192 9 J. Exp. Med. 50:533-550 e Cruse, J.M. & R.E. Lewis (Ed) 1989 Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Krager. 10:1-196). A ligação dos polissacarídeos às proteínas resulta numa mudança do carácter deste tipo de antigénio de timo-independente a timo- 1 dependente. Geralmente, este tipo de conjugados proteicos de polissacarideos ou oligossacarideo são muito imunogénicos nas crianças pequenas e podem induzir a memória. Vários exemplos de conjugados sacarídeos-peptídicos conhecidos são os seguintes:

Os conjugados de polissacarideos capsulares (CPS) de H_„ influenza b com toxóide tetânico (TT) são conhecidos a partir do Pedido de Patente holandesa 8602325.

Os conjugados dos polissacarideos capsulares do grupo A e C meningocócicos foram preparados com toxóide tetânico, os ditos conjugados parecem ser muito imunogénicos em ratos e coelhos ( [Beuvery, E.C, A. Kaaden, V. Kanhai & A.B. Leussink; 1983. Physicochemical and immunological characterization of meningococcal group A and C polysaccharide-tetanus toxoid conjugates prepared by two methods. Vaccine 1:31-36], [Beuvery. E.C, w.F. Miedema, R. van Delft & K. Haverkamp. 1983. Preparation and immunochemical characterization of meningococcal group C polysaccharide tetanus toxoid conjugates as a new generation of vaccines. Infect. Immun. 40:39-45] e [Jennings, H.J. & H.C. Lugowski. 1981. Immunochemistry of groups A, B and C meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates. J. Immunol. 127:1011-1018]). O Meningococcus Grupo B é um grupo bacteriano que causa mais de 50% dos casos de doença meningocócica em muitos paises é um grupo bacteriano cujos polissacarideos capsulares não induzem à reacção imunológica ou induzem a pouca reacção imunológica. (Poolman et al., The Lancet, September 1986, Pages 555-558).

Consequentemente, têm-se realizado investigações para o Meningococcus grupo B para os conjugados sacarídeos-peptídicos que poderiam ser úteis numa vacina dado que os polissacarideos capsulares deste grupo não deram nenhuma reacção imunológica contra as bactérias Gram-negativas nos animais testados nem nas pessoas voluntárias. Consequentemente, os conjugados sacarideos-peptídicos foram realizados com polissacarídeo capsular modificado e com proteínas portadoras f [Jennings, H.J., R. Roy, & A. Gamian. 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific igG antibodies in mice using an N-proprionylated B polysaccharide tetanus toxoid conjugate vaccine. J. Immunol. 137:1708-1713] e [Jennings. H.J. 1989. The capsular polysaccharide of group B Neisseria maningitidis as a vehicle for vaccine development. In Cruse. J.M., & R.E Lewis, Conjugate Vaccines. Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Krager. 10:151-165]).

Como suspeitamos que os anticorpos anti grupo B (em particular igG) demonstram reacçoes cruzadas in vivo com antigénios hospedeiros e como a utilização de um conjugado de peptídeos e sacarideos compreendendo um polissacarídeo capsular modificado de Meningococo de grupo B poderia consequentemente levar a provocar uma doença auto-imunológica, a maioria da investigação está dirigida a uma vacina contra o Meningococo do grupo B dirigida â utilização potencial de componentes subcapsulares como por exemplo proteínas da membrana externa (OMP) e lipopolissacarídeos (LPS).

Assim Jennings et al. descrevem conjugados do toxóide tetânico (TT) com oligossacarideos desfosforilados (OS*) derivados do LPS meningocócico. A imunogenicidade destes conjugados 0S*-TT foi examinada em coelhos (Infect. Immun. 43:407-412). Aqui a fosfoetanolamina foi removida dos oligossacarideos meningocócicos (OS) mediante o tratamento com fluoreto de hidrogénio. Os oligossacarideos desfosforilados foram seguidamente ligados ao toxóide tetânico. 0 conjugado da proteína OS de imunotipo l3 assim obtido foi pouco imunogénico em coelhos o que pode provavelmente ser explicado como resultado da remoção dos grupos PEA.

Verheul et al., in Infection and Immunity, March 1991, pages 843-851, descrevem a preparação dos conjugados da proteína OS meningocócica com toxóide tetânico, em que os grupos de fosfoetanolamina dos oligossacarídeos foram mantidos.

Os conjugados oligossacarídeos-peptídicos, em que a parte sacarídea e a parte peptídica procedem de organismos diferentes (principalmente um peptídeo do tétano ou da difteria) têm a desvantagem de que a sensibilidade exacerbada ou tolerância para a dita parte peptídica (portadora do tétano ou da difteria) se possa produzir e consequentemente possa levar a uma resposta reduzida à parte activadora das células B. Consequentemente, para esta finalidade têm sido procurados conjugados sacarídeos-peptídicos providos com peptídeos portadores homológicos. Este conjugado sacarídeos-peptídicos não só activará a memória das células B mas também reactivará a memória das células T depois do contacto com o microrganismo em questão. São conhecidos os conjugados sacarídeos-peptídicos que compreendem um peptídeo portador homólogo. Paton et al. descrevem a conjugação do toxóide de pneumolisina ao polissacarídeo capsular do tipo Streptococcus pneumoniae 19F (Infection and Immunity, July 1991, pages 2297-2304).

Também são conhecidos os conjugados sacarídeos-peptídicos que compreendem um peptídeo portador homólogo que compreende uma parte sacarídea derivada de um lipopolissacarídeo (LPS) de

bactérias Gram-negativas como parte activadora das células B providas de imunidade. Este conjugado de peptídeos e de sacarídeos oferece como vantagem a possibilidade de fazer uma vacina que proporcione imunidade contra as bactérias Gram- negativas, cujos polissacarídeos capsulares não proporcionam nenhuma ou insuficiente reacção imunológica. Um conjugado de peptídeos e sacarídeos compreendendo um lipopolissacarídeo como parte activadora das células B providas com a imunidade tem ainda, desvantagens adicionais. Um lipopolissacarídeo contém 4 partes tóxicas e um conjugado de peptídeos e sacarídeos compreendendo um lipopolissacarídeo com partes tóxicas será também tóxico.

Cryz. J.C. et al., In Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, vol. 10, páginas 166-189 descrevem vacinas contra Pseudomonas aeruginosa que compreendem um conjugado de peptídeos e sacarídeos compreendendo um lipopolissacarídeo destoxificado de Pseudomonas aeruginosa de imunotipo 5 cujo lipopolissacarídeo está acoplado a várias proteínas portadoras. As proteínas portadoras podem ser homólogas ou não homólogas. As proteínas portadoras mencionadas neste artigo são toxóides tetânicos, toxina A e folículo piloso de Pseudomonas aeruginosa. O LPS de Pseudomonas aeruginosa segundo este artigo foi feito inócuo para remover os ácidos gordos ligados ao éster do lipídio A, de forma a que a parte 0 polissacarídea serologicamente activa pudesse ser incorporada num conjugado de peptídeos e de sacarídeos. Este LPS destoxificado (D-LPS) foi convertido num éster activo pelo acoplamento a N-hidroxisuccinimida e seguidamente o éster activo foi ligado a uma proteína que tinha sido provida com um separador (1,4-diaminobutano) para simplificar o acoplamento. O conjugado D-LPS-TA não foi imunogénico, no entanto o conjugado D-LPS-folículo piloso e o conjugado D-LPS-TT sim que foram imunogénicos.

Boons et al., num artigo (Bioorganic and Medicinal Chemistry

Letters, vol. 1. No. 6, pages 303-308, 1991) descrevem que um conjugado de peptídeos e sacarídeos (SPC) com dois domínios essenciais imunológicos (isto é os epítopos B e T responsáveis da especificidade dos anticorpos e da actividade auxiliar T) que estão ligados covalentemente com um separador artificial o qual foi feito como parte do desenvolvimento de uma vacina com uma amplia acção contra N. meningitidis. Neste conjugado conhecido a função do epítopo B é provida por um fragmento da região IC do imunotipo LPS-6 (IC=núcleo interno). Um peptídeo compreendendo 5 um epitopo das células T está seleccionado para induzir uma resposta das células auxiliares T homólogas (memória). A parte do peptideo compreendendo o epitopo das células T dos SPC homólogos conhecidas é a parte 47-59 de uma OMP meningocócica descrita por Wiertz E.J.H.J. et al., (in Proceedings of the Eleventh American Peptide symposium, ed. River, J.E.; Marshall, G.R.; ESCOM, Leiden, 1990). As desvantagens conhecidas destas SPC são as necessárias complicadas e caras sínteses químicas que por um lado obstaculizam a produção a grande escala por razões económicas e por outro lado só utilizam uma parte da acção imunológica de OMP porque só um pequeno fragmento de OMP que compreende uma parte activadora das células T, em relação às duas partes activadoras das células B e T.

Até aos nossos dias parecia impossível acoplar uma parte sacarídea a uma OMP completa ou a um grande fragmento de OMP compreendendo mais de um epitopo sem mudar a sua estrutura ou a sua composição, o que reduziria a actividade imunológica do OMP.

Além de que, é conhecido que os microrganismos que produzem OMP's as incorporam na sua membrana numa configuração determinada em que uma parte da OMP está ancorada à membrana e umas partes sobressaem em forma de anéis. Uma configuração específica é requerida para a actividade imunológica das partes activadoras das células T e B presentes na OMP. Frederiksen J.H. et al., in NIPH ANNALS, volume 14, number 2, December 1991, nas páginas 67-79 em particular 69-71, descrevem que os microrganismos podem ser tratados de maneira que "formem um flictena", isto é que formem vesículas da membrana externa (OMV's) . Estas vesículas da membrana externa estão providas com um grande número de OMP's na sua superfície e oferecem a possibilidade de serem utilizadas como um componente potente da vacina dado que uma grande quantidade de OMP's está presente na conformação requerida para a actividade imunológica. No entanto, várias desvantagens de outras vacinas que compreendem somente OMP como componente activador da actividade imunológica, são 6 também válidas para este tipo de componente da vacina. As vacinas de OMV conhecidas parecem ser capazes de prover protecção intermédia nos seres humanos, isto é de 5 0 a 8 0% de protecção. A presente invenção tenta resolver os problemas existentes nos diferentes componentes de vacinas conhecidas. Inicialmente, a investigação foi dirigida para descobrir uma molécula activadora de uma célula B que seja pequena e simples de obter, que não seja tóxica e que possa ainda induzir imunidade contra mais de um LPS do tipo imunológico. A presente invenção está também dirigida a uma molécula activadora das células B providas com imunidade derivada de um lipopolissacarídeo meningocócico (LPS), compreendendo a dita molécula pelo menos um epítopo, e pelo menos a parte comum da parte oligossacaridea (região do núcleo) dos lipopolissacarideos que são específicos para pelo menos dois imunotipos meningocócicos, preferencialmente os imunotipos L2 e L3 e nos que a galactose está ausente na parte activadora das células B, assim como nos derivados da molécula com capacidade para induzir a reacção imunológica.

Um exemplo adequado desta molécula é uma molécula derivada do núcleo L2 de um LPS meningocócico e que tem seguinte estrutura:

I 1

Os anticorpos podem ser induzidos contra esta estrutura os são especificamente bactericidas para os imunotipos L2 e L3, os imunotipos mais prevalentes. Outro exemplo adequado desta molécula é uma molécula derivada do núcleo L3 e tem a seguinte estrutura: I t 2 i

I

Esta estrutura é também Útil para induzir a reacção imunológica contra os dois imunotipos, L2 e L3. Surpreendentemente, foi descoberto que um anticorpo que era conhecido por exibir reactividade cruzada nos vários imunotipos meningocócicos, mas do qual se desconhecia qual era a estrutura que ele reconhecia, pode ligar as duas estruturas moleculares como o anteriormente indicado. As duas estruturas moleculares anteriormente indicadas diferem dos epitopos postulados até hoje para L2 e L3 na ausência da galactose. Os epitopos postulados até à data não são completamente necessários para induzir anticorpos bactericidas com reactividade cruzada nos vários imunotipos meningocócicos. 0 anticorpo utilizado para ilustrar o anterior é o mN8D6A e este está descrito em Infection and Immunity, October 1988, pages 2631-2638 (por Kim. J. J., Mandrell. R.E., Zhen, H., Westerink, M. A.J., Poolman, J. T. & Griffiss, J. M.). Neste artigo é indicado que o anticorpo poderá ser ligado ao LPS da estirpe de N. meningiditis 28 do grupo A em dot blots e com múltiplos componentes com vários pesos moleculares obtidos a partir de 28 estirpes em immunoblots.

As moléculas de acordo com a invenção podem formar uma parte de conjugados sacarídeos-peptídicos de maneira habitual, em que, por exemplo, elas são ligadas ao toxóide tetânico ou a outro portador conhecido adequado na tecnologia das vacinas. Vantajosamente um conjugado sacarídeo-peptídico que compreende uma molécula de acordo com a invenção também compreende uma parte peptídica com pelo menos um epitopo activador das células auxiliares T, preferencialmente a dita parte peptídica compreende pelo menos uma proteína homóloga ou um fragmento peptídico derivado de uma proteína homóloga, em que homólogo significa que ambos epítopos activadores das células B e das células auxiliares T derivam desse microrganismo. Uma vesícula da membrana externa à qual um conjugado de peptídeo e de sacarídeo que compreende uma molécula de acordo com a invenção tenha sido adicionado ou tenha sido incorporado como parte activadora das células B é uma forma de realização adequada, dita forma de realização pode ser vantajosamente utilizada numa vacina. Preferencialmente, uma vesícula da membrana externa à qual tenha sido adicionada uma molécula ou um conjugado de peptídeo e de sacarídeo compreendendo essa molécula, ou em que essa molécula tenha sido incorporada compreende OMP da classe I ou fragmentos de OMP da classe I como parte activadora das células auxiliares T. A presente invenção refere-se também a métodos para preparar derivados de lipopolissacarídeos deste tipo de acordo com a invenção. Para isso, é possível aplicar mutagénese, técnicas de ADN recombinante, divisão enzimática ou síntese química. 0 método via técnicas de ADN recombinante compreende a obtenção da molécula a partir de uma estirpe de produção mutada ou seleccionada que produz pelo menos LPS sem galactose. Para isso, uma estirpe meningocócica mutada que não produz galactose pode ser vantajosamente aplicada. Em particular, pode ser aplicada

uma estirpe de produção que não produz ou produz uma gaiE enzimática não funcional. Frosch, M., Weisgerber. C. & Meyer, T.F., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) pages 1669-1673 determinaram para N. meningitidis qual a parte do genoma de N. meningitidis compreende os genes para a produção de CPS. Esta parte foi clonada no plasmídeo pMF32.35 e descobriram que este plasmídeo também compreende sequências que codificam a biossíntese do LPS. Uma estirpe meningocócica em que este 9 plasmídeo foi integrado foi depositada em 2 9 de Julho, 1993 em CBS Baam, Holanda, com o número CBS 401.93. Para um técnico sem dúvida nenhuma que lhe é possível aplicar as técnicas de ADN habituais via uma ou mais mutilações ou delecções nesta parte do MM meningocócico para impedir a produção da galactose. Especificamente é possível aplicar uma ou mais mutilações ou delecções no locus de cps que esteja presente neste plasmídeo impedindo assim a expressão de qualquer galE ou galE funcional. Com sondas que compreendem uma parte da sequência que codifica uma parte da enzima galE, a localização do gene galE pode ser determinada de forma simples, seguidamente pode ser realizada a mutagénese ou delecção para obter uma sequência que não expresse nenhuma galE ou nenhuma galE funcional. 0 produto da expressão deste locus de cps mutada produzirá um lipopolissacarídeo sem galactose. Como habitualmente um vector de expressão pode subsequentemente ser feito compreendendo esta cassete de cps mutada ou a sua parte relevante. Agora o facto de fabricar uma estirpe de produção com a ajuda da sequência de nucleotídeos mutadas ou com o vector da expressão que compreende essa sequência está baseada em que um técnico logre utilizar os protocolos habituais da tecnologia do ADN recombinante. Vantajosamente a estirpe de produção meningocócica mutada em que uma delecção na cassete de cps do tipo selvagem foi realizada e que foi trocada por uma cassete de cps mutada pode ser feita de uma maneira simples.

Adicionalmente, a invenção está dirigida a solucionar o problema de acoplar OMP com uma molécula das reivindicações de l a 3 com actividade imunológica sem prejudicar a actividade imunológica da OMP, de maneira a que possa ser obtido o componente da vacina compreendendo mais de uma parte activadora das células auxiliares T. Consequentemente a presente invenção está dirigida a uma vesícula de membrana externa provida com polipeptídeos que têm pelo menos a actividade imunológica das proteínas da membrana externa (OMP's) ligada a uma membrana, estando a dita vesícula da membrana externa caracterizada por os polipéptídeos 10 serem OMP' s ou fragmentos de OMP ancorados à membrana com uma mutação num dos anéis da superfície da OMP da qual o polipeptídeo foi derivado. Preferencialmente a invenção está dirigida a esta vesícula da membrana externa, em que os polipeptídeos são OMP's ou fragmentos da OMP ancorados à membrana com uma mutação num dos anéis da superfície da OMP da classe 1 da qual o polipeptídeo foi derivado. Em particular, a invenção está dirigida a esta vesícula da membrana externa em que o polipeptídeo compreende pelo menos uma mutação num dos anéis 2, 3, 5, 6, 7 ou 8.

Foi descoberto que a aplicação das mutilações nestes anéis não reduz a actividade imunológica da OMP da classe 1 ligada à membrana. Deste modo é oferecida a possibilidade de prover mutações nestas localizações que permitem o acoplamento específico da OMP a outro componente desejado, preferencialmente um componente com actividade imunológica adicional na posição da mutação. Poder-se-á considerar que uma vesícula da membrana externa de acordo com a invenção é uma vesícula de membrana externa que foi activada para o acoplamento. A mutação está preferencialmente localizada num dos anéis 6 ou 7. Estes anéis estão localizados na estrutura terciária da OMP nas posições mais adequadas em relação aos anéis 1 e 4, compreendendo os ditos anéis vários epítopos importantes da OMP. A mutação pode consistir em pelo menos a presença de um aminoácido adicional com uma cadeia lateral reactiva num dos anéis 2, 3, 5, 6, 7 ou 8. Esta poderá ser uma inserção, delecção ou substituição num dos anéis. A mutação preferida é a substituição dado que a situação natural é a que mais a ela se parece. A forma que adquire a mutação não é crítica, no entanto a sua localização é crítica.

Como a OMP natural não tem cisteína e o grupo sulfidrilo é um bom grupo reactivo, preferencialmente este aminoácido é incorporado. Outros aminoácidos como a lisina são possíveis, no entanto a presença deste tipo de aminoácidos na OMP nativa oferece várias posições de reacção na OMP para o acoplamento e consequentemente o SPV's resultante terá que ser rastreado para determinar qu&iÉ foram as que sofreram a conjugação na localização desejada. Na maioria dos casos a incorporação de grupos protectores conduz a complicadas reacções químicas com um grande risco de desnaturalização do polipeptídeo.

Como o indicado, o polipeptídeo pode compreender uma OMP completa e também um fragmento da OMP. 0 fragmento da OMP deverá possuir o comprimento suficiente e uma estrutura tal para que possa ser ancorado à membrana de um microrganismo e que possua pelo menos actividade imuno activadora, preferencialmente tanta ou mais que a OMP nativa correspondente da qual tenha sido derivada. Uma OMV de acordo com a invenção que é a preferida compreende uma molécula de acordo com a invenção e/ou um conjugado de sacarídeo-peptídico e compreendendo uma molécula de acordo com a invenção.

Uma aplicação de uma OMV de acordo com a invenção é a produção de um componente de vacina que compreenda também uma parte do sacarídeo conjugado. 0 produto do acoplamento de uma parte do sacarídeo a uma parte polipeptídica da vesícula da membrana externa activada para acoplamento, a vesícula da membrana externa (OMV) que compreende um conjugado sacarídeo-peptídico (SPC) , isto é a chamada vesícula sacarídea-peptídica (SPV) apresentará uma actividade imunológica maior que as vesículas da membrana externa existente que compreende OMP. Consequentemente, a SPV possuirá uma actividade imunológica mais amplia e maior que as SPC's conhecidas. Outra vantagem é que o mecanismo natural com o qual um microrganismo é ancorado às OMP's na membrana pode ser utilizado de forma económica e simples para produzir um componente de vacina com actividade imunológica mais 12 amplia e mais forte. A presente invenção está dirigida a uma SPV tal e como foi descrita. O acoplamento preferido é o de uma parte peptídica de uma vesícula de membrana externa activada a uma parte sacarídea, compreendendo a dita parte sacarídea pelo menos uma parte activadora das células B providas com imunidade com pelo menos um epítopo derivado de um lipopolissacarídeo (LPS) de uma bactéria Gram-negativa e uma vesícula de membrana externa que compreende um fragmento duma parte activadora de células B com pelo menos um epítopo isolado de uma bactéria Gram-negativa. A invenção também compreende uma SPV provida de polipeptídeos com pelo menos a actividade imunológica de OMP, formando os ditos polipeptídeos uma parte de conjugados sacarídeo-peptídicos, em que a parte sacarídea e a parte peptídica deste conjugado estão ligadas no lugar da mutação num dos anéis 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 do polipeptídeo.

Uma SPV que compreende a "região do núcleo" de LPS ou um fragmento derivado da mesma como parte activadora das células B da parte sacarídea será mais seguro como componente de uma vacina que uma SPV que compreende um conjugado sacarídeo-peptídico e compreendendo LPS nativo devido à ausência de partes tóxicas. Adicionalmente, este "núcleoN que contém o conjugado sacarídeo-peptídico tem a vantagem de que este pode conter um maior número de diferentes partes activadoras das células B do "núcleo" de LPS do que um SPC com LPS nativo que é tóxico quando o componente tóxico como por exemplo o lipídio A é incorporado demasiado. O lipopolissacarídeo meningocócico é tóxico e compreende três partes. Na figura 1 é ilustrado um LPS meningocócico. A parte do lipídio A é tóxica e a unidade lacto-n-neotetraose pode provavelmente levar à indução de auto anticorpos. A parte oligossacarídea de LPS meningocócico, a chamada "região do núcleo" não i tóxica. A região chamada B região do núcleo 13 interno" é a parte da 3 região do núcleo " da parte oligossacarídea de LPS meningocócico na que a unidade lacto-n-neotetraose está ausente. Um conjugado sacarideo- peptídico que compreende uma parte activadora de células B, que compreende o -Μ&Ιδό-* oligossacarídeo do Meningococo ou um fragmento dele derivado é um exemplo adequado de um SPC que pode ser uma parte de um SPV de acordo com a invenção.

De facto, um conjugado sacarídeo-peptídico e que compreende uma parte sacarídea derivada do lipídio A tóxico carente de Meningococo e também carente da unidade completa lacto-n-neotetraose foram descritos por Boons et al., no entanto, neste componente de vacina conhecido a parte do sacarideo é ligada a um fragmento derivado da OMP compreendendo somente um epítopo da célula T e o SPC não forma uma parte de uma vesícula da membrana externa.

Para uma SPV de acordo com a invenção, o LPS nativo que deve ser aplicado pode ser isolado e posteriormente o lipídio A e uma parte da unidade de tetraose podem ser removidos. 0 lipopolissacarídeo meningocócico (LPS) pode por exemplo ser isolado pelo método de extracção com água quente e fenol de Westphal (Westphal, 0. & Jann. J.K., 1965; Methods Carbohydr.

Chem. 5. 83-91). Resumindo o LPS é hidrolizado em ácido acético a 1% até que a floculação se dê. O lipídio A é removido por centrifugação os oligossacarídeos são purificados numa coluna de Biogel. Posteriormente, o oligossacarídeo principal pode ser unido à parte peptídica. 0 "núcleo" oligossacarídeo ou um seu derivado operativo obtido com este método pode ser incorporado numa vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção.

Em virtude de que a obtenção de uma parte activadora das células B derivada do LPS nativo é um processo tedioso e que a purificação completa do oligossacarídeo é também 14 problemática a parte activadora de células B da parte sacarídea de uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção pode ser sintetizada. Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção pode consequentemente compreender uma parte activadora de células B sintéticas na parte sacarídea. É também possível obter uma parte activadora das células B não tóxica da SPV derivada de um LPS por via bioquímica, como por exemplo a mutagénese ou divisão enzimática. Esta via é possível se via os métodos moleculares biológicos é feita uma estirpe que seja capaz de produzir um lipídio A alterado e/ou lacto-n-neotetraose. Em qualquer caso, a galactose terminal da lacto-n-tetraose terá que ser removida e poder-se-á fazer de forma simples a produção de uma estirpe mutada que não produza galactose para ser incorporada no LPS, de acordo com o anteriormente indicado para a preparação de uma molécula de acordo com a invenção. Em particular a presente invenção está também dirigida a uma SPV de acordo com as várias formas de a realizar que foram exaltadas, em que a parte sacarídea compreende uma molécula activadora de células B provida de imunidade com pelo menos um epítopo derivado de um lipopolissacarídeo meningocócico (LPS) compreendendo a dita molécula pelo menos a parte comum da parte oligossacarídea (região do núcleo) dos lipopolissacarídeos que são específicos para pelo menos dois imunotipos meningocócicos preferencialmente os imunotipos L2 e L3 e em que a galactose está ausente desde a parte activadora das células B, assim como dos derivados da molécula com capacidade para induzir a reacção imunológica.

As vesículas sacarídeo-peptídicas e de acordo com a invenção podem ser conjugadas por um separador. Este provê a vantagem de que nenhuma reacção intra-molecular se dá entre os grupos reagentes na parte sacarídea e na parte peptidica. As reacções deste tipo podem nomeadamente levar a uma estrutura terciária alterada da parte sacarídea e/ou da parte peptidica resultando numa deterioração da actividade imunológica. 15 Vários epítopos específicos do imunotipo do LPS devem a sua actividade à presença de pelo menos um grupo de fosfoetanolamina (PEA). Consequentemente, de acordo com a invenção uma vesícula sacarídeo-peptídica em que os grupos PEA da parte activadora de células B da parte sacarídea compreende grupos amino livres é a preferida. Um exemplo desta vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção que compreende uma parte activadora de células B imune específica na parte sacarídea, é uma vesícula sacarídeo-peptídica que compreende LPS de Meningococo com imunotipo L3 na parte sacarídea. Esta vesícula sacarídeo-peptídica que compreende um epítopo imune específico do imunotipo L3 preferencialmente compreenderá uma parte activadora de células B com grupos PEA com grupos amino livres.

Vantajosamente as vesículas sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção compreendem uma parte sacarídea que compreende uma parte activadora de células B que pode dar uma reacção cruzada com mais de um imunotipo. Uma vacina compreendendo esta vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção proverá a protecção contra mais de um imunotipo.

Até hoje são conhecidos doze lipopolissacarídeos diferentes para estirpes meningocócicas (que correspondem a 12 imunotipos). As diferenças dos imunotipos do LPS meningocócico foram localizadas na parte oligossacarídea do LPS ("região do núcleo").

Recentemente as estruturas completas primárias dos oligossacarídeos para os imunotipos .. L s,< L3, Ls e L6 foram postuladas; estas estão ilustradas na figura 2 (Difabio J.L. et al. , 1990, Structure of the 1¾ and L6 core oligosaccharide of Neisseria meningitidis. Can. J. Chem. 86:1029-1034; Jeimings, H.J. et al., 1987, Structure and Immunochemistry of meningococcal lipopolysaccharides, Anthonie van Leeuwenhoek 53:519-522; Michon, F. et al., 1990, Structure of the L5 lipopolysaccharide core oligosaccharide of Neisseria meningitidis. J. Biol. Chem. 256:7243-7247; Verheul, A.F.M. et al., Infection and Immunity (1991), 51: p 3566-3573). As 16 estruturas das moléculas maiores L*-* L2/ L3 estão indicadas na figura 3.

Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção que compreende um ou mais oligossacarídeos com as estruturas ilustradas na figura 2 é útil como componente de uma vacina dirigida contra pelo menos um imunotipo meningocócico. Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção que compreende pelo menos a parte activadora de células B de pelo menos um dos oligossacarídeos da figura 2 na dita parte sacarídea consequentemente pode vantajosamente ser utilizada como componente de uma vacina dirigida contra pelo menos um imunotipo meningocócico.

Os oligossacarídeos dos imunotipos no que se refere à composição monossacarídea, diferem da quantidade e posição dos grupos fosfoetanolamina (PEA) e do grau de acetilação de a(l-2) ligadas à unidade ou outras unidades. Para muitos imunotipos a estrutura básica do oligossacarídeo é a mesma (figura 1 e figura 2) .

Como os oligossacarídeos do "núcleo" de LPS meningocócico exibem conformidade para vários imunotipos o compreende mais de um epítopo imunotipo específico. Um SPV de acordo com a invenção que compreende este como a parte activadora de células B da parte sacarídea será o preferido. Este SPV de acordo com a invenção pode ter um efeito activador de células B ao mesmo tempo em vários imunotipos diferentes. Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção que pode ter um efeito activador de células B ao mesmo tempo para vários imunotipos pode também compreender um fragmento derivado que compreende mais de um epítopo imunotipo específico. É também possível incorporar somente a parte relevante do oligossacarídeo como fragmento num SPV de acordo com a invenção, provendo uma imunidade especifica a um imunotipo especifico. É também possível incorporar mais do que uma parte activadora de células B na parte sacarídea de um SPV de acordo com a invenção de forma a que este SPV compreenda várias partes providas com imunidade específica e por conseguinte possa prover imunidade para vários imunotipos específicos.

As partes activadoras das células B da parte sacarídea com uma acção que provê imunidade específica contra vários imunotipos ou partes activadoras de células B da parte sacarídea que tem uma acção que provê imunidade reactiva podem ser vantajosamente incorporadas na parte sacarídea de uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção. Foi possível sintetizar oligossacarídeos bem definidos com uma complexidade e peso molecular cada vez maiores, de forma a que os oligossacarídeos que compreendem uma ou mais estruturas activadoras de células B possam ser sintetizados.

Sobre o Meningococo é sabido que os imunotipos L3 e L2 provocam aproximadamente 70% e 30% respectivamente da meningite meningocócica do grupo B. Consequentemente, as vesículas sacarídeo-peptídicas de acordo com a invenção que compreendem pelo menos partes activadoras das células B dos imunotipos L3 e/ou L2 na parte sacarídea da vesícula sacarídeo-peptídicas são as preferidas.

Uma vesícula sacarídeo-peptídicas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma parte activadora das células B da parte sacarídea que é um derivado de: {íIJ »1*1Μ}Ιίφ » k^HMÍisg» »· £t*$Í - S " ' í i ¢: - 3¾¾ . :J ,. 1 ... ..'I ... . * - tm. .. . . . s ... * . s «HNlfeMs·

Uma vesícula sacarídeo-peptídica que é preferida é uma SPV que compreende uma parte activadora de células B na parte sacarídea que pelo menos exibe reacção cruzada com dois imunotipos de bactérias Gram-negativas. Um exemplo desta vesícula sacarídeo-peptídica exibe pelo menos reacção cruzada com os imunotipos meningocócicos L2 e L3. Consequentemente esta vesícula sacarídeo-peptídica compreende uma molécula com a seguinte estrutura

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Uma vesícula sacarídeo-peptídica que é também preferida é uma SPV que compreende uma parte activadora de células B na parte sacarídea que pelo menos exibe reacção cruzada com os imunotipos do Meningococo 1¾ e L3.

Uma vesícula sacarídeo-peptídica que exibe reacção cruzada com pelo menos os imunotipos L1; e L3 compreende pelo menos o oligossacarídeo ramificado p-D-Glcp(l-4)-[L-a-D-Hepp(1-3)) -L-a- 19 D-Hepp) como parte activadora das células B na parte sacarídea. Um exemplo adequado desta vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção ainda compreende um grupo PEA no 0-3 da unidade heptosil do oligossacarídeo ramificado β-D-Glcp(1-4)-[L-a-D-Hepp(l-3) -L.a-d-Hepp) .

Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção que exibe reacção cruzada com mais imunotipos que L;, L2 e L3 compreende pelo menos o oligossacarídeo ramificado β-D-Glcp(1-4)-[L -a-D-Hepp(1-3)]-L-a-Hepp) provido com um separador que provê uma ligação com pelo menos outra parte activadora das células B imunotipo específica com pelo menos um epítopo como parte activadora das células B na parte sacarídea.

Uma SPV de acordo com a invenção pode compreender uma parte sacarídea que está sintetizada e/ou modificada em relação a uma parte activadora de células B natural como a parte activadora de células B para um determinado imunotipo. Preferencialmente esta parte activadora de células B sintetizada e/ou modificada exibirá reacção cruzada com vários imunotipos e/ou dará uma reacção imunológica melhorada em relação à parte correspondente do LPS natural. Em qualquer caso a galactose terminal (figura 2) deverá ser removida por via enzimática, ou via a manipulação genética, através da mutação. Como o acima indicado, a completa ausência de galactose nestas estruturas é uma forma de realização possível, que poderá ser obtida por um técnico especializado através da tecnologia do ADN recombinante.

Esta parte activadora de células B sintetizada e/ou modificada pode aumentar através da adição e/ou da delecção selectiva de determinados grupos e/ou unidades de açúcar.

Uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção preferencialmente compreenderá uma proteína da membrana externa (OMP) ou um fragmento derivado de uma OMP como parte do peptideo. Preferencialmente um SPV de acordo com a invenção compreenderá uma OMP de Meningococo de classe I devido a que esta OMP pode induzir a anticorpos protectores, não possui uma tendência a bloquear os anticorpos contra outras proteínas e não exibe uma variação antigénica demasiado grande. Muitos sítios de reconhecimento de células T humanas foram investigadas na proteína da membrana externa de classe I de Meningococo H44/76, fazendo com que esta seja uma estirpe de partida adequada para OMP a ser utilizada. 0 objecto deste Pedido de Patente refere-se a um método para preparar uma vesícula de membrana externa de acordo com a invenção. Este método compreende as seguintes fases: 1) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipeptídeo é expressa numa bactéria; 2) a bactéria é cultivada em condições conhecidas para produzir vesículas da membrana externa como o descrito por Friedriksen J.H. et al., em NIPH ANNALS, volume 14, number 2, December páginas 67-79, em particular nas páginas 69-71 e os fragmentos da membrana assim criados com o polipeptídeo podem opcionalmente ser isolados.

Para preparar uma SPV de acordo com a invenção posteriormente 3) os fragmentos da membrana formadas na fase 2 podem ser providas com os conjugados sacarídeo-peptídicos acoplando o polipeptídeo com a parte do sacarídeo desejado.

Para preparar uma OMV ou uma SPV de acordo com a invenção a sequência de nucleótidos requerida para a fase 1) a ser utilizada pode ser uma sequência de nucleótidos recombinante que codifica uma OMP de classe I ou um fragmento da mesma com pelo menos a actividade imunológica da OMP de classe I, em que quando 21 comparada com a correspondente sequência natural uma mutação foi criada num dos anéis de superfície. A mutação num dos anéis 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 em particular nos anéis 6 e 7. A mutação resulta num codão para pelo menos um aminoácido que tem uma cadeia lateral reactiva específica num dos anéis de superfície. Em particular a mutação resulta num codão para cisteína. Uma parte sacarídea obtida por tecnologia de ADN recombinante ou através de uma via sintética pode ser utilizada no método para preparar uma SPV de acordo com a invenção. Em particular uma molécula de acordo com a invenção que é obtida como o descrito em qualquer parte da presente pode ser utilizada como parte sacarídea.

Para acoplar uma parte sacarídea a uma OMV de acordo com a invenção em particular a uma OMV-SH provida com grupo cisteína, o seguinte programa de reacção pode ser seguido: núcleo-KDO-CO-NH-X-Br + OMV-SH —+ conjugado

Mais especificamente a reacção pode ser executada como segue: BrCH2-CO-NH- (0¾)^¾¾ (substância 1, excesso) + OS-KDO+EDC+ sulfo-NHS—> OS- - -C0-CH2Br (substância 2) . A substância 2 foi submetida a filtração em gel e posteriormente substância 2 + OMV-SH —+ conjugado.

Outra possibilidade para executar a ligação é com BrCH2-CO-NH-tOfe) (substância 3, excesso) + OS-SH (como o descrito em Andre Verheul's thesis, pages 34 and 35, Meningococcal LPS derived oligosaccharide protein conjugate vaccines October 29, 1991, Utrecht). Este resulta em OS- - -CO- 22 CH2Br (substância 2*) . Esta foi submetida a filtração em gel ou opcionalmente simplesmente enxaguar com 1¾. A substância 2* pode posteriormente ser convertida ao conjugado com OMV-SH. Como a substância 3 é lipofílica a modificação de OS-SH se dá numa mistura de um tampão aquoso com um solvente orgânico, como por exemplo dioxana. Por esta razão a reacção de OMV-SH com a substância 3 seguida após a purificação pela incubação com OS-SH é menos atractiva.

Para uma ligação especifica dos hidratos de carbono a presença de grupos adequados como por exemplo um grupo amino (-MHsJ, ácido carboxilico (-COOH), tiol (-SH) ou um aldeído (CHO) é necessário dentro do antigénio do hidrato de carbono (Dick, W.E. et al., 1989, Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens. In

Cruse J.M. & R.E. Lewis, Conjugate vaccines, Contrib. Microbiol. Immunol., Basel, Krager, 10:48-114). Estes grupos podem estar presentes no antigénio mas na maioria das vezes devem ser incorporados via métodos químicos ou enzimáticos. Ê preferível utilizar um método de ligação que resulte tanto quanto possível numa pequena modificação do antigénio do hidrato de carbono e da proteína. A incorporação de um separador específico é propícia a este fim. É preferível destruir o epítopo ou epítopos presente(s) ou gerar neo antigénios dominantes imunológicos indesejados o menos possível. A influência do método de ligação nas características imunológicas de uma vesícula de oligossacarídeo-peptídica é grande se são utilizados oligossacarídeos pequenos (Hoppner, W., et al., 1985, Study on The carbohydrate specificity of antibodies formed in rabbits to synthetic glycoprotein with the carbohydrate Structure of asialoglycophorin A. Mol. Immunol. 12:1341-1348).

Muitas das vacinas conhecidas estão baseadas em polissacarídeos capsulares ou 0 antigénios que consistem em unidades repetitivas monossacacarídeas de 1 a 8, para minimizar a influência da ligação com a utilização de oligossacarídeos maiores. O LPS meningocócico não contém unidades repetitivas e consequentemente 23 a selecção do método de ligação com autilização do LPS meningocócico em particular será importante para as características imunológicas e imunoquímicas do conjugado resultante.

Preferencialmente o sacarídeo está ligado ao peptídeo via um separador que contém os grupos terminais reagentes tais como NH2 e COOH. A utilização de um separador em vesículas sacarídeo-peptídicas de acordo com a invenção tem a vantagem de que a estrutura terciária da parte do sacarídeo não está alterada, o qual é importante para a actividade imunológica do sacarídeo.

Nos oligossacarídeos meningocócicos dois grupos estão disponíveis para serem utilizados na ligação desse oligossacarídeo a um péptido portador: o grupo amino livre do grupo fosfoetanolamina (grupo PEA) e o grupo ácido carboxílico da unidade KDO (figura 1). Preferencialmente o grupo PEA deveria não ser utilizado na ligação dado que este grupo provavelmente compreende parte de vários epítopos específicos do imunotipo. Consequentemente, é preferível numa vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção manter os grupos fosfoetanolamina com grupos amino livres. Habitualmente os conjugados sacarídeo-peptidicos podem ser feitos baseados na ligação do grupo ácido carboxílico do oligossacarídeo aos grupos amino livres do peptídeo. Quando este método é aplicado com o oligossacarídeo meningocócico este pode resultar na ligação do oligossacarídeo ao oligossacarídeo ou do oligossacarídeo aos grupos de ácido carboxílico do peptídeo pelo grupo PEA do oligossacarídeo. Jennings et al. (Infect. Immun. 43:407-412) resolveu este problema removendo os grupos PEA através do tratamento com fluoreto de hidrogénio. Os oligossacarídeos desfosforilados foram posteriormente ligados ao toxóide tetânico mediante a incorporação de β-(4-aminofenil)etilamina como separador no terminal de redução via a aminação redutiva (o qual conduz à perda da estrutura anelar de KDO), seguida da activação do grupo amino com tiofosgénio seguida da ligação ao toxóide tetânico. Estes conjugados com o imunotipo L2, Ls e Lio foram muito imunogénicos em coelhos enquanto que os de L3 foram pouco imunogénicos. Para este Último grupo a perda dos grupo s PEA e/ou estrutura anelar do grupo KDO parece ser importante para a imunidade e é preferível fazer uma vesícula sacarídeo-peptídica com o oligossacarídeo L3 de Meningococo em que o grupo s PEA e a estrutura anelar KDO do oligossacarídeo meningocócico tenha sido modificado o menos possível.

Os métodos anteriormente mencionados não são os bastantes para preparar uma vesícula sacarídeo-peptídica de acordo com a invenção em que a célula B que activa a actividade da parte sacarídea depende da presença de um ou de vários grupos fosfoetanol (PEA). São necessárias medidas adicionais para preparar estas vesículas sacarídeo-peptídicas.

Uma possibilidade para a preparação de uma vesícula sacarídeo-peptídica, que de acordo com a invenção resolve o problema anteriormente mencionado, é a utilização da parte sacarídea que tinha obtido sinteticamente.

Com as técnicas actuais é possível sintetizar oligossacarídeos. Adicionalmente, de acordo com o anteriormente descrito no objecto deste Pedido de Patente, no caso das vesículas sacarídeo-peptídicas que compreendem oligossacarídeos derivados de um LPS pode ser vantajoso o facto de sintetizar a parte activadora de células B que está presente no "núcleo interno" do LPS. Outra vantagem da parte sacarídea obtida sinteticamente é baseada na possibilidade de incorporar o mínimo de sacarídeo que funciona como parte activadora de células B no SPC de acordo com a invenção. Adicionalmente, é também possível sintetizar uma parte sacarídea que compreenda um oligossacarídeo mínimo com imunidade reactiva cruzada para prover actividade. É ainda possível sintetizar partes activadoras de células B para prover uma melhor actividade imunológica do que a dos oligossacarídeos naturais. É mais simples colocar o separador num lugar especifico com a parte sacaridea obtida sinteticamente. É também possível incorporar um ou mais grupos fosfoetanol na parte activadora de células B da parte sacaridea para obter uma actividade imunológica aumentada.

Com o fim de posicionar o separador num lugar específico no sacarídeo é preferível prover os grupos reagentes do sacarídeo com grupos protectores antes que o separador seja unido. 0 grupo reactivo onde a ligação com o separador se dá não está provido com um grupo protector. Este método impede que os grupos que são essenciais para a actividade que provê a imunidade sejam removidos ou alterados durante a ligação do separador. A descrição está também dirigida a uma sequência de nucleótidos que codifica a OMP recombinante ou um fragmento da OMP recombinante que é perceptível da OMP não recombinante ou um fragmento sem OMP pelo menos por uma mutação num dos anéis 2, 3, 6, 7 ou 8 da OMP. Em particular a invenção está dirigida a esta sequência de nucleótidos com uma mutação num dos anéis 6 ou 7. E preferível uma sequência que também inclua os determinantes antigénicos mais importantes localizados nos anéis 1 e 4. A sequência de nucleótidos pode compreender uma inserção, delecção ou alteração de pelo menos um codão como mutação, preferencialmente uma mutação que pelo menos conduz à formação de um codão que inclui um aminoãcido adicional com um grupo lateral reactivo num dos anéis 2, 3, 6, 7 ou 8 em comparação com a sequência de aminoácidos da OMP correspondente ou fragmento da OMP. Adicionalmente a sequência de nucleótidos de acordo com a invenção compreende preferencialmente um dodón que codifica a dsteína. A descrição está também dirigida a um vector de expressão que compreende a sequência de nucleótidos para OMP ou um fragmento de OMP de acordo com a invenção assim como a um micro organismo que compreende a dita sequência de nucleótidos e/ou dito vector de expressão de acordo com a invenção. A descrição está também dirigida a um polipeptídeo que pelo menos tem a actividade imunológica de OMP, dito polipeptídeo está caracterizado pela presença de um aminoácido adicional com uma cadeia lateral reactiva num dos anéis da superfície, em particular os anéis 2, 3, 5, 6, 7 ou 8, em comparação com a correspondente OMP nativa ou um fragmento correspondente da OMP nativa. Um polipeptídeo com um aminoácido com uma cadeia lateral específica reactiva no anel 6 ou 7 é o preferido porque estes anéis terão um impedimento mínimo para a estrutura terciária de OMP dos anéis 1 e 4 quando uma parte sacarídea é ligada.

Preferencialmente um polipeptídeo de acordo com a invenção compreende como aminoácido uma cisteína. Como a OMP nativa não compreende cisteína é possível a ligação à cisteína de forma muito específica num polipeptídeo de acordo com a invenção. A incorporação de uma lisina adicional é também uma das possibilidades, no entanto não é preferida devido à presença de mais de uma lisina na OMP nativa e consequentemente também no polipeptídeo. Consequentemente a ligação proverá mais de um conjugado e requererá um rastreio para o conjugado correcto.

Um conjugado sacarídeo-peptídico que pelo menos compreende um epítopo de uma OMP caracterizada pela presença de um polipeptídeo de acordo com a invenção está também dentro do âmbito da invenção, assim como uma vacina que compreende numa quantidade eficaz uma vesícula de membrana externa, uma SPV, um polipeptídeo ou um conjugado sacarídeo-peptídico de acordo com a invenção.

Adicionalmente, a descrição está dirigida a uma sequência de

nucleótidos que compreende material que codifica o LPS 27 meningocócico, sendo a dita sequência de nucleótidos perceptível da sequência de nucleótidos de tipo selvagem pelo menos por uma mutação ou delecção pela qual o produto de expressão da sequência de nucleótidos mutada não compreende galE ou não compreende galE funcional contrariamente à sequência de nucleótidos de tipo selvagem. Esta sequência de nucleótidos pode compreender uma mutação no locus do cps de ADN meningocócico ou ADN equivalente dele derivado, por exemplo no ADN derivado de N.meningiditis como o plasmídeo pMF32.25 que foi integrado na estirpe meningocócica CBS 401.93 e depositado no CBS em Baarn a 29 de Julho de 1993. Preferencialmente esta sequência compreende uma mutação na região D ou E. Um vector de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos do material que codifica o LPS meningocócico de acordo com a invenção, assim cmo um microrganismo que compreende essa sequência de nucleótidos e capaz de expressar essa sequência entra dentro do âmbito da presente invenção. Em particular, uma estirpe meningocócica mutagenizada que produz LPS sem um teor de galactose entra dentro do âmbito da presente invenção assim como uma vacina que compreende esse microrganismo ou molécula de acordo com a invenção.

EXEMPLO I

As proteínas de membrana externa de classe 1 são utilizadas para o desenvolvimento de uma vacina contra os meningococos B. Estas proteínas contém naturalmente duas áreas variáveis (=epítopos), que unem os anticorpos bactericidas. Estes epítopos estão colocados em dois anéis 1 e 4 que estão expostos na superfície. Quatro estirpes meningocócicas foram feitas com epítopos extra nos anéis 5 e 6 da proteína de classe 1 (ver quadro A), a partir da qual é evidente que a inserção nos anéis 5 e 6 é possível sem desvantagens para os epítopos em 1 e 4. Todas as estirpes têm os epítopos naturais da estirpe de origem nos anéis 1 e 4, 28 nomeadamente os epítopos Pl.5 e Pl.2. Adicionalmente, a estirpe J007 tem um epítopo Pl.7 extra e a estirpe J016 tem um epítopo P1.16 extra, enquanto que a estirpe J716 tem dois epítopos extra, ο Pl.7 e ο P1.16 no anel 6. Finalmente, a estirpe P016 tem um epítopo P1.16 extra no anel 5. Todas estas estirpes são capazes de ligar os anticorpos monoclonais na superfície da célula.

QUADRO A cadeia meningocócica anel 1 anel 4 anel 5 anel 6 J007 Μ , 1 M,2 Pl... 7 J016 Pl. s Pi, 2 Pl, M J716 Pi. 5 ti, t ,1€ PO 16 Pi, 5 pi, 2 j PI v 16

Com a ajuda desta informação estirpes meningocócicas novas podem ser produzidas contendo mutações em OMP, ditas estirpes podem ser utilizadas para produzir vesículas de membrana externas (_Omv's) que consistem em fragmentos da membrana externa e em certas circunstâncias segregadas por N. meningitidis. Estes fragmentos podem posteriormente ser ligados a lps. As OMV's podem servir de vacina contra os meningococos B. 1.1 A estrutura da OMP de classe 1

As OMP's de classe l são proteínas do poro catião selectivas [15] . A proteína tem de comprimento aproximadamente 374 aminoácidos e está precedida por um peptídeo sinal de 19 aminoácidos [1] , Um modelo para a topologia da proteína na membrana externa prevê oito anéis expostos na superfície (ver figura 4) .

As sequências da transmembrana foram mantidas entre as distintas porinas de Neisseria e formam uma estrutura de folha B. Os anéis hidrófilos expostos na superfície exibem uma grande variação no comprimento e sequência. Quando as diferentes OMP's de classe 1 são comparadas as sequências exibem uma homologia de 90%. A variação nas sequências parece localizar-se no primeiro e quarto anel. Estes são referidos como regiões variáveis ou epítopos. Pareceu que os anticorpos bacterianos ligavam os epítopos nos anéis 1 e 4, o qual corresponde ao facto de que estes anéis são os mais compridos (ver figura 4). Estes dois epítopos determinam a especificidade do subtipo da OMP de classe 1 [6]. 1.2 Incorporação de epítopos extra na OMP de classe meningocócica 1

Quando os diferentes epítopos das OMP's de classe 1 são comparados, podem ser distinguidos no total de 10 epítopos específicos de subtipos diferentes. Os oligonucleotídeos com "extremidades coesivas" são sintetizados para dois epítopos, o P1.7 e P1.16. Estes oligonucleotídeos foram posteriormente colocados no anel 5 e no anel 6 do gene da OMP de classe 1. A incorporação dos oligonucleotídeos P1.7 e P1.16 no gene da OMP de classe 1 provê estirpes novas com epítopos extra na OMP de classe 1. Estas estirpes deste modo compreendem o epítopo P1.5 no anel 1 e o epítopo P1.2 no anel 4. Os novos epítopos incorporados, Pl. 7 e P1.16 foram colocados no anel 5 ou 6. A expressão dos epítopos incorporados nas estirpes novas foram subsequentemente observadas com ELISA na totalidade da célula e comparada com a expressão da estirpe de origem. Posteriormente os complexos da membrana externa (OMC's) foram isolados das estirpes novas e a estirpe de origem as quais são utilizadas na imunização de ratos. 1.3 Materiais O ADN & plasmídeo utilizados: - o plasmídeo pTZ19R é um plasmídeo derivado de Pharmacia, que codifica entre outros a resistência a Amp (Ampr) e o gene lac Z'. 0 plasmídeo utilizado 2-2ASE é um derivado de pTZ19R. Este plasmídeo contém um inserto de 1.9 kB com uma parte do gene da OMP de classe 1 da estirpe meningocócica 2996 (Pl.5,2), do aminoácido 100. Este inserto está localizado no sítio EcoRl do Sítio de Clonação Mútipla (=MCS) de pTZ19R. Através de uma delecção no Sítio de Clonação Múltipla a partir do sítio Sall do sítio EcoRl (onde o inserto começa), o gene de classe 1 entra no mesmo marco de leitura que o derivado lac Z' de pTZl9R. O gene de OMP de classe 1 neste plasmídeo contém um sítio de restrição Kpnl no anel 5. - outro plasmídeo pPH204 usado é de novo um derivado de 2-2ASE. O gene da OMP de classe 1 neste plasmídeo contém um novo sítio de restrição Kpnl, nomeadamente no anel 6 em vez de no anel 5. O sítio Kpnl original no anel 5 foi substituído por um sítio de restrição BamHI e posteriormente um sítio Kpnl foi feito no anel 6 por mutagénese PCR [17] .

As enzimas utilizadas:

As enzimas utilizadas foram todas derivadas de Boehringer Mannheim, conjuntamente com os tampões subministrados. - Kpnl (vol. act. : 10 11/μ].} , com o tampão de incubação L. - Spel (vol. act.: 10 com o tampão de incubação H. - Sna BI (vol. act.: 8 Ο/μΙΚ com o tampão de incubação M. - T4 ADN ligase (vol. act.: 1 U/μΙ) , com o tampão de T4 ADN ligase.

Com os correspondentes tampões de incubação: - tampão M (lx) : 10 mM de Tris-HCl; 10 mM de MgCl^ 50 mM de

NaCl; 1 mM de ditioeritritol (DTE), pH 7.5 (a 37°C). - tampão L (lx) : 10 mM de Tris-HCl; 10 mM de lmM de ditioeritritol (DTE), pH 7.5 (a 37°C). - tampão H (lx) : 50 mM de Tris-HCl; 10 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl; 1 mM de ditioeritritol (DTE) pH 7.5 (a 37°C) - tampão T4 ADN ligasa (lOx): 660 mM Tris-HCl; 50 mM de MgCl2, 50 mM de ditioeritritol; 10 mM de ATP; pH 7.5 (a .

Os anticorpos monoclonais utilizados dirigidos nos epitopos e tipos de LPS:

QUADRO B

| tipo monoclonal ou de LPS tipo, subtipo PI. 2 subtipo especifico PI M122, I§M PI. 5 PI. 7 PI. 16 Imunotipo ai LI específico de LPS L3 ( 7.9) L3 (7.9) WBItC L5 L6(4.9) «iis Lll,12 L8, 10, 11, 12 3A12-E1 L3, 7,8,9 L9, 10 Lipidio A todos os monoclonais foram derivados de RIVM.

Os outros materiais estão mencionados nos métodos (1.4) . 32

As estirpes bacterianas utilizadas: - E. coli K12 (NM522: esta estirpe bacteriana é Hsd (=não contém sistema de modificação da restrição). estirpe meningocócica H44/76 B' (PI .7/16): esta estirpe bacteriana é uma mutante carente de classe 3 carente de cápsula de ÍSM/7Ê (Pl.7/16). - estirpe menigocócica B" (PI .5,2) : esta estirpe bacteriana é uma mutante carente de cápsula 844/T§ (Pl.7,16), a qual foi transformada com a proteina de classe 1 de 2996 (Pl.5,2) [17]. 1.4 Métodos 1.4.1 Controlo de pFH204 através da transformação em meningococos. 0 plasmideo construído pPH204 (P1.2) foi transformado na estirpe meningocócica H44/76 B" (PI.7.16). Aqui o epítopo P1.16 no anel 4 de B- foi trocado com o epitopo P1.2 do plasmideo pPH204.

Com a ajuda de blotting e inmunoblotting da colónia (ver mais à frente) as colónias P1.2* foram isoladas provendo a estirpe J072 depois do controlo com SDS-PAGE, Western e inmunoblotting, ver também no quadro B em Resultados (1.5). 1.4.2 Incorporação de epitopos extra em OMP de classe meningocócica 1 1.4.2.1 Incorporação de oligonucleotídeos em os plasmídeos pPH204 e 2 ASE 0 gene da OMP de classe 1 utilizado no plasmideo pPH204 contém um sitio de restrição para Kpnl na parte que codifica o anel 6. Um oligonucleotideo com extremidades coesivas de Kpnl que codifica o epitopo P1.7 de acordo com o abaixo indicado e na preparação & inserção de oligonucleotideos (1.4.3) foi nele colocado. Através da incorporação do oligonucleotideo o sitio de restrição Kpnl desapareceu e um único sitio de restrição Spel foi criado. Este plasmideo é denominado constructo pJB007. 2.1 oligonucleotideo do epitopo Pl. 7 com extremidades coesivas de Kpnl (sequência id 1) : N Q Q A S 0 Q qgc cac m tct ooc caa 3;'~SATS£|TT£ CCG CCG C0Q ASA CCO S5T V A A 0 R A L enzima de restrição: A/CTAGT TGATC/A Spel Após a inserção do oligonucleotideo V K V T CTT AAA 07T |*Τ|ΜΜ>$' CAA ITT CAA N L N $ enzima de restrição: GGTAC/C C/CATGG Kpnl no plasmideo, o sitio Kpnl desaparece e um único sitio Spel aparece: esquerda (sequência id 2): direita (sequência id 3) : 5'-CGTAC|GAAC GGC-3' 5'-GTT ACT|AGTACC-3' 31 -CCATGC|TTG CCG-5' 3'-CAA TGA|TCATGG-5'

Da mesma maneira um oligonucleotideo com extremidades coesivas Kpnl foi colocado no anel 6 que codifica o epitopo P1.16 como o abaixo indicado em preparação & inserção de oligonucleotideos (1.4.3). Através da incorporação do oligonucleotideo no sitio de restrição Kpnl que também aqui desaparece, no entanto um único sitio de restrição SnaBI foi criado. Este plasmideo é denominado constructo pJB0l6. 2.2 oliqonucleotídeo do epítopo P1.16 com extremidades coesivas de Kpnl (sequência id 4) : YTKPTNNNLTL ACC Μ A GAC ACC MC MC AAC TTO ACC TG8 ΤΪΤ CTO TTQ TTO TTO MC TYÕ

I M f V s f v ? 8 O Q enzima de restrição:

TAC/GTA

ATG/CAT

SnaBI enzima de restrição:

GGTAC/C

C/CATGG

Kpnl A partir da inserção do oligonucleotídeo no plasmídeo, o sitio Kpnl desaparece e um único sitio SnaBI aparece: esquerda (sequência id 5) : 5 ' -CGTACGITAT ACC-3 ' 3 ' -CCATGCIATA TGG-5 ' direita (sequência id 6) 5'-ACC TTGIAGTACC-3 * 3 1 -TGG AACITCATGG-5 '

Subsequentemente um oligonucleotídeo com extremidades coesivas de Spel por detrás do oligonucleotídeo PI.7 foi colocado no anel 6 no constructo pJB007. pelo qual o oligo codifica o epítopo P1.16 como o abaixo ilustrado. Assim o sítio de restrição Spel desapareceu através da incorporação do oligonucleotídeo. Este plasmídeo é denominado constructo pJB716. 2.3 oliqonucleotídeo do epítopo P1.16 com extremidades coesivas de Spel (sequência id 7) :

YTKDTNNHLTL 5’-ctagc|tat m m gac acc aac aac aac m acc m\t$ Mata m τπ m mo m m ttq aac i i t v i V· v- v ta u q enzima de restrição:

A/CTAGT

TGATC/A

Spel

Cortando o oligonucleotídeo incorporado do epitopo P1.7 com Spel seguida de uma inserção com o oligonucleotídeo do epitopo P1.16 (com extremidades coesivas Spel) o sítio Spel desaparece: esquerda (sequência id 8): direita (sequência id 9) : $ ' ···ACmMsS - T&T &€€% s TISITÇTAGT-O 1 .3' «TSITOM 'TOM *· MSâaia-I’ O gene da OMP de classe 1 utilizado no plasmídeo 2-2ASE contém um sítio de restrição Kpnl na parte que codifica o anel 5. Um oligonucleotídeo P1.16 foi nele colocado. Através da incorporação o sítio de restrição Kpnl desapareceu. Este constructo é denominado pPH016.

QUADRO C constructo no anel 6 no anel 5 pJB007 PI. 7 pJB016 P1.16 pJB716 Pl.7.16 ρΡΗΟΙβ P1.16 1.4.2.2 Transformação dos constructos « E. coli

Subsequentemente, foi efectuada transformação dos quatro constructos em E. coli K12 NN522 (ver mais à frente). Os transformantes cresceram sob pressão selectiva de 100 pg/ml de ampicilina. O plasmídeo foi isolado das colónias formadas (ver mais à frente) e a presença dos constructos correctos foi controlada. O constructo PJB007 foi controlado para o sítio Kpnl desaparecido e o sítio Spel formado. 0 constructo pJB016 foi controlado para o sítio Knpl desaparecido e para o sítio SnaBI formado e o constructo pJB716 foi controlado para o sítio Spel desaparecido. Com a ajuda de SDS-PAGE, Western blotting & ínmunoblotting (ver mais à frente) com os anticorpos monoclonais adequados foi observado se as inserções dos epítopos PI. 7 e Pl. 16 foram bem sucedidas e portanto apresentavam anticorpos de expressão e de ligação. 1.4.2.3 Transformação de constructos em meningococos

Subsequentemente os constructos (pJB007, pJB016, pJB716) foram utilizados para transformar a estirpe meningocócica (Pl.5,2), e que portanto se deu a recombinação do ADN meningocócico cromossómico e o constructo. Com a ajuda do blotting e unoblotting da colónia (ver mais à frente) as colónias P1.7* e ο P1.16* foram isoladas dando como resultado as estirpes desejadas depois do controlo com SDS-PAGE, Western & ínmunoblotting, ver também quadro C em resultados. 1.4.2.4 Controlo das estirpes novas com ELISA na totalidade da célula

Foi observado o grau em que os epítopos incorporados foram expressos nas estirpes J007, J016, J716, J072 e P016, e esta expressão foi comparada com a expressão das estirpes originais. 1.4.3 Preparação & inserção de oligonucleotideos

Os oligonucleotideos não fosforilados complementares como o acima indicado, foram sintetizados no sintetizador de ADN de Applied

Biosysttems 3814. A hibridação deu-se adicionando os oligonucleotideos complementares em concentrações iguais, aquecendo a 95°C e posteriormente arrefecendo à temperatura ambiente. Esta conduziu a oligos com as extremidades coesivas correctas. 0 plasmídeo foi digerido com a enzima correcta, após o qual os oligonucleotideos foram ligados com a ajuda dos T4 ligados no plasmídeo durante 24 horas a 15°C (na proporção 200 37 ng oligo/1 μ9 de plasmídeo). A mistura das ligações foi posteriormente aquecida a 80°C e lentamente arrefecida até à temperatura ambiente para permitir a incorporação do oligonucleotideo. Com a incorporação do oligo no plasmídeo o sítio de restrição utilizado desaparece. A mistura de ligação foi consequentemente cortada com esta enzima, e pela qual os produtos fechados sobre si mesmos sob os plasmídeos foram linearizados. Após a transformação em E. coli Kl2 NM522 (ver mais à frente) estes fragmentos lineares foram degradados, de forma a que todos os transformantes tivessem uma inserção. Com a ajuda de SDS-PAGE, Western, blotting & inmunoblotting (ver mais à frente) com anticorpos monoclonais contra os epítopos novos os transformantes foram seleccionados para a orientação correcta do oligonucleotideo incorporada. 1.4.4 Transformação em E. coli K12 NM522 A transformação de ADN plasmídeo em E. coli foi efectuada de acordo com a referência [13] . Para essa transformação foi utilizado um E. coli K12 NM522 que cresceu no meio de caldo de Luria (Trypton 10 g/1; extracto de levedura 5 g/1: NaCl 10 g/i, pH 7,0) a 37°C. Depois da transformação do E. coli este foi colocado em placas num meio de nutrição sólido que consiste num meio L8 com 1.5% (m/v) agar, (Noble Difco) . Para a selecção de resistência à ampicilina foi adicionado ao meio 100 μg/ml de ampicilina (Sigma), depois do qual o crescimento se deu a 30°C para impedir a formação de satélites. 1.4.5 Isolamento do plasmídeo O isolamento do plasmídeo de E. coli foi efectuado de acordo com o método da lise alcalina [13]. 1.4.6 Electroforese em gel de agarose A electroforese em gel de agarose foi efectuada de acordo com a referência [13] . Para a sua realização foi aplicada 1% (m/v) (Sigma No A-9539) para um gel normal e um 1.2% (m/v) de agarose de fusão baixa (Nusieve GTG, FMC Bioproducts) para um gel preparatório. 0 tampão TBE (RIVM) concentrado lx foi aplicado como tampão para estes géis: 0, 089 M Tris, 0, 089 M de ácido bórico, 0,002 M de EDTA (pH 8.3). O marcador de massa molecular aqui utilizado foi o lambda digest HindIII (Boehringer Mannheim) com fragmentos com o tamanho de 125, 564, 2021, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp. Uma solução de sacarose a 30% (m/v) com azul de bromofenol a 0.25% (m/v) serviu como tampão de carga (5x) . A electroforese foi executada a 10 V/cm. Seguidamente os fragmentos foram corados com 0.5 μ5/πι1 de brometo de etidio e fotografados. 1.4.7 Transformação em meningococos

Uma placa com meningococos foi cultivada durante 24 horas com C02 a 5% e tecido húmido a 37°C. As células da placa totalmente cultivada foram posteriormente ressuspendidas em 10 ml de meio de Muller Hinton (RIVM) com 10 mM de MgCl2 a 37°C. A suspensão bacteriana foi seguidamente diluída 1:5 no meio de Mtiller Hinton, após a qual foi adicionado 1 pg/ml de ADN plasmídeo. Depois da incubação durante 3 horas a (Π-Ο* io4 diluição em PBS estéril (com 0,01 M de fosfato, solução fisiológica tamponada pH 7.2; RIVM) e de se dar a disposição em placas foi realizada numa placa de agar gonocócico (* suplemento 3) . Depois do cultivo durante toda o noite os transformantes correctos foram seleccionados com a ajuda do blotting da colónia. Ver à continuação, em blotting da colónia. 1.4.8 Transferência (Blotting) da colónia

As células de uma placa meningocócica completamente coberta foram transferidas a uma membrana com 0,45 μΜ de nitrocelulose (Schleicher & Schuell) . Seguidamente as células bacterianas foram postas em PBS (solução salina fisiológica com tampão de fosfato, pH 7.2; RIVM) com 0,1% Tween 80 (monooleato de polioxietileno de sorbitano, Merck) e inactivadas durante 1 hora a 56°C. Seguidamente as células em excesso foram tiradas e a mancha foi tratada como no inmunoblotting (ver mais à frente) .

1.4.9 SDS PAGE 0 SDS PAGE foi efectuado de acordo com a referência [8] . 0 gel estava composto por 5% (m/vol) de gel por compactação de acrilamida e 11% (m/vol) de gel de resolução de acrilamida. As proteínas de referência utilizadas (RIVM) têm os tamanhos 14, 20, 30, 43, 6 7 e 94 kD. Todas as amostras para o SDS page consistiam em células completas.

Para as células de E. coli estas foram cultivadas durante 24 horas a 37°C num meio de LB com 100 μg/ml ampicilina, com e sem 1 mM de IPTG (=-isopropil-B-D-tiogalactopiranosido, Sigma). Seguidamente 1,5 ml da suspensão foi centrifugada. O granulado foi suspendido em 70 μΐ de H20 ao qual foi adicionado 130 μΐ de tampão de carga ÍTris/fíCl 0.625 M pH 6,8, 10% SDS; 50% glicerol; 0,01% azul de bromofenol; B-mercapto-etanol=2:4:4:2:1) , A mistura foi seguidamente incubada durante 10 minutos a 95°C.

Para as células meningocócicas, as células duma placa totalmente cultivada (durante 24 horas, com 5% de C02 e tecido húmido a 37°C) foram dissolvidas em 10 ml de PBS (com 0,01 M fosfato, com tampão de solução fisiológica salina, pH 7.2; RIVM), inactivada durante 30 minutos a 56°C e centrifugada (10 minutos a 4000 rpm). O granulado foi suspendido em 500 μΐ de H20. 170 μΐ de tampão de carga e de 0 a 35 μΐ de RV3 foram adicionados a 35 e a 70 μΐ de suspensão bacteriana, volume total de 200 μΐ. Esta mistura foi aquecida durante 10 minutos a 95°C e posta em gel. 0 tampão de electroforese utilizado estava composto por 50 mM Tris/HCl (pH 8.3); 380 mM glicina; 0.1% SDS. A electroforese foi realizada a uma corrente constante de 40 mA. Após a electroforese, os géis ou foram: 1. corados durante 1 hora a 56°C com azul brilhante de Coomassie (0.1% (p/vol) a 10% (vol./vol) de ácido acético e a 30% (vol./vol) de metanol) e descorados durante pelo menos 1 hora a 56°C numa solução com 10% (vol./vol) de ácido acético e 5% (vol./vol) de metanol. 2. marcados numa membrana de nitrocelulose de 0,2 μΜ (Schleicher & Schuell), ver mais à frente em Western blotting. 1.4.10 Western e Iimanoblotting

As proteínas separadas em SDS PAGE foram transferidas a uma membrana de nitrocelulose de 0.2 μΜ (Schleicher & Schuell) com a ajuda do Electroblotter A de Ancos Semi Dry, durante 1 hora a 0,8 mA/cm2 gel, com 25 mM Tris/HCl (pH 8,3); 192 mM glicerina; 20% metanol; 0,0375% SDS como tampão blot. Seguidamente o blot foi enxaguado durante um quarto de hora em PBS (solução fisiológica salina de tampão fosfato, pH 7,2) com 0.1% Tween 80 (Merck). Seguidamente os blots foram enxaguados durante meia hora em PBS 0,1% Tween e 0.3% caseína (hidrolizada, N-Z-AmineA, ICN Bioehemicals). Os blots foram seguidamente incubados durante pelo menos 1 hora em PBS/0,1% T^él/®f3% caseína com o anticorpo monoclonal contra o epítopo que deveria ser detectado. Depois da incubação esta foi enxaguada 3x 10 minutos com PBS/0,1% Tween e seguidamente incubada durante média hora com o conjugado da proteína A e peroxidase (diluída 1:10.000) [9] .

Depois de novamente enxaguado durante 3x 10 minutos com PBS/0,1% Tween e lx com H20 a mistura do substrato/peróxido de hidrogénio: 30 ml de substrato A (substrato A: tampão de fosfato/citrato; 0,02 m Na2 HP04 e 0,01 M de ácido cítrico 1:1. pH 5,0) com 10 ml de substrato B (substrato B: 24 mg tetrametilbenzidina e 80 mg DONS (Dioctil-sulfosuccinato) foram adicionados em 10 ml de etanol a 96%) e 20 μΐ de peróxido de hidrogénio a 30% (Merck) . Passados poucos minutos tiras verde/azul ficaram visíveis nos blots em que os anticorpos estavam ligados às proteínas. Seguidamente os blots foram enxaguados 3x com H20 e fotografadas. 1.4.11 ELISA na totalidade da célula

Uma placa com meningococos cresceu durante 24 horas com C02 a 5% e tecido húmido a 37°C. As células foram seguidamente ressuspendidas em 5 ml de PBS (solução fisiológica salina de tampão fosfato, pH 7,2; RIVM) e inactivadas durante 30 minutos a 56°C. Seguidamente a suspensão foi diluída até uma QPS3S de 0,1. As placas de microtitulação (Titertek PVC placas de micro-ensaio com fundo em U) foram cheias com 100 μΐ suspensão /poço (revestimento). A suspensão foi seca durante 24 horas a 37°C ou durante 2 dias à temperatura ambiente. As placas foram enxaguadas 3x com PBS com 0.1% Tween (Merck) pouco antes da sua utilização. 100 μΐ de solução com a diluição de anticorpos monoclonais em PBS/0.1% Tween/0.5% Protifar (Nutricia) foram adicionados por poço e incubada durante 1 hora a 37°C. As placas foram enxaguadas 3x com PBS/0,1% Tween. Posteriormente os poços foram cheios com 100 μΐ de conjugado de proteína A e peroxidase (RIVM; 1:100000 x diluição) ou conjugado anti IgM* (RIVM; 1:2000x diluído em PBS/0,1% Tween/0,5% Protifar) suspensão/poço e foram incubados durante 1 hora a 37°C. Depois de o enxaguar 3x com PiS/Cb II Tween 100 μΐ de substrato C (substrato C: 1 ml de tetrametilbenzidina (6mg/ml de álcool 96%) e 22 μΐ de H202 30% (Merck) em 60 ml tampão de NaAc 0.11 M) foi adicionado por poço, depois da qual se deu a incubação durante 10 minutos. A reacção 42 foi parada por bloqueio com 100 μΐ 2M H2S04 /poço. As absorções foram lidas com uma leitor de ELISA (Biokinetics Reader EL312e de Bio-Tek Instruments) a 450 nm.

1.4.12 Isolamento de OMP

Uma placa com meningococos cresceu durante 24 horas a 37°C com C02 a 5% e tecido húmido. As células foram seguidamente ressuspendidas em 5 ml de meio liquido meningocócico (RIVM) e divididas em dois frascos com 200 ml de meio meningocócico (RIVM). Estes frascos foram agitados durante 24 horas a 37°C. As células foram inactivadas 30 minutos a 56°C, seguidamente estas foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos (modelo Beckman J-21B, rotor JA-14). O liquido da parte superior foi descartado e 10 ml 0,01 M Tris/HCl pH 8.0 foi adicionado a cada granulado. Após a ressuspenção dos granulados as suspensões foram ligadas num tubo de 50 ml. O tubo foi colocado em água gelada e seguidamente submetido a durante 15 minutos a vibração ultra-sónica (Branson Sonifier 250, posição 4, 50%). Seguidamente foi realizada uma centrigfugação durante 30 minutos a 4000 rpm (Heraeus Christ Minifuge GL com rotor permanente). O líquido da parte superior foi centrifugado durante 1 hora a 30.000 rpm e a 10°C (Sorvall ARC-1 ultracentrifugue Oil Turbine Drive (OTD)- 65, rotor 70 Ti). Seguidamente o granulado foi ressuspendido em 4 ml de sarcosil a 1% em Tris/HCl pH 8.0 e centrifugado durante 15 minutos a 5000 rpm (Heraeus Minifuge). O líquido da parte superior foi centrifugado durante 1 hora a 30.000 rpm e a 10°C (Sorvall ultracentrifugue, rotor T865.1). Depois de verter a parte superior do líquido, o granulado foi dissolvido em 2 ml 0.01M t / v> v X pH 8,0. Posteriormente a produção foi controlada determinando o teor da proteína (com o BCA* reactivo do ensaio de proteínas de Pierce, protocolo de acordo com o fabricante). Após o qual as OMP's foram postas num teor de proteína de 1 mg/ml em Tris/tampão e completadas até 50 μΐ/tubo. A pureza foi determinada com a ajuda de um gel SDS-PAA a 11% e ELISA. 1.5 Resultados 1.5.1 Controlo de pPH204 através da transformação em meningococos

Para verificar como o plasmídeo pPH204 se manteve intacto, este plasmideo foi transformado na estirpe meningocócica M44/7& B‘. Aqui o epitopo Pl.2 do plasmideo pPH204 foi trocado pelo epitopo PI. 16 da estirpe H44/76. A selecção dos transformantes correctos deu-, se por meio das colónias e inmunoblotting, em que as colónias de P1.2* foram isoladas. As colónias proveram a estirpe J072 depois do controlo com a ajuda de SDS-PAGE, Western inmunoblotting (ver figura 5 e 6, 7, 8 e 9) . Esta estirpe tem o epitopo Pl.7 no anel 1 e o epitopo Pl.2 no anel 4. 1.5.2 Inserção do oligonucleotídeo Pl.7 no sítio Kpnl de pPh204 0 oligonucleotídeo para o epitopo Pl.7 foi colocado no sítio Kpnl de pPH204 seguidamente o constructo pJB007 resultante foi transformado em E. coli K12 NM522. 0 plasmídeo foi isolado das colónias resultantes. 0 material do plasmídeo isolado foi controlado para a desaparição do sítio de restrição Kpnl e para a presença do novo sítio de restrição Spel, ver figura 10. Em todos os transformantes controlados o sítio de restrição Kpnl tinha desaparecido e o novo sítio de restrição Spel estava presente. Os transformantes foram postos em SDS PAGE. Depois do Western inmunoblotting com anticorpos monoclonais dirigidos contra o epitopo Pl.7; foram seleccinados 3 transformantes que compreendiam o oligonucleotídeo na orientação correcta, figuras 11, 12, 13, 14 e 15. 1.5.3 Inserção do oligonucleotídeo P1.16 no sítio Kpnl de pPH204 O oligonucleotídeo para o epítopo P1.16 foi colocado no sítio Kpnl de pPH204 (constructo pJB016) e posteriormente transformado. Os plasmídeos dos transformantes foram controlados para a desaparição de sitio Kpnl e o novo sítio SnaBI, ver figura 10. Três transformantes com o epítopo P1.16 na orientação correcta foram seleccionados com Western inmunoblotting, ver figura 11, 12, 13, 14 e 15. 1.5.4 Inserção do oligonucleotídeo P1.16 no sítio Spel de pJB007 O oligonucleotídeo para o epítopo P1.16 foi colocado no sítio Spel de PJB007 (constructo pJB716) e transformado. Os plasmídeos dos transformantes foram controlados para a desaparição do sítio Spel, ver figura 10. 1 transformante com o oligonucleotídeo na orientação correcta foi seleccionado com Western inmunoblotting, verfiguras 11, 12, 13, 14 e 15.

1.5.5 Inserção do oligonucleotídeo Pl.16 no sítio Kpnl de 2-2ASE O oligonucleotídeo para o epítopo Pl.16 foi colocado no sitio Kpnl do plasmídeo 2-2ASE (constructo pPH016) e transformado. Os plasmídeos dos transformantes foram controlados para a incorporação correcta do oligonucleotídeo (dados não incluídos) [17] . 1.5.6 Transformação dos constructos em meningococos

Posteriormente os quatro constructos pJB007, pJB016, pJB716 e pPH016 foram transformados na estirpe meningocócica A806fc B' (Pl.5.2). A selecção dos transformantes correctos deu-se por meio da colónia e inmunoblotting, pela qual as colónias P1.7+ e Pi > 1€"’ foram isoladas. Esta deu-se depois de controlar as estirpes de acordo com o quadro D, ver também figuras 5, 6, 7, 8 e 9.

Quadro D estirpes meningocócicas construídas estirpe meningocócica no anel 1 no anel 4 no anel 5 no anel 6 J007 P1.5 P1.2 PL·? JMS PlvS PL·! áfn« PI ,s Pl. i PlrT.lP Pl. 7 PL·! pois •FL| Pl · 1 ' Pl,!* 1.5.7 ELISA na totalidade da célula A expressão dos epítopos incorporados nas estirpes novas foi observada e comparada com as estirpes de origem A8-6* (Pl.5.2) e H44/76 (Pl.7.16), ver figura 16 e quadro D. 1.6 Conclusão & discussão

Nesta série de testes quatro estirpes novas meningocócicas foram feitas com epítopos extra nos anéis 5 e 6. As estirpes J007 e J016 respectivamente contêm o epítopo 1.7 e ο P1.16 no anel 6, enquanto que J716 transporta os epítopos P1.7 e Pl.16. A estirpe P016 contém o epítopo Pl.16 exclusivamente no anel 5. A ELISA realizada na totalidade célula mostra que os anticorpos monoclonais dirigidos contra os epítopos incorporados se ligam bem ou relativamente bem a totalidade das células em comparação com as estirpes de origem Μ44-/ΊΜ e A ELISA mostra que as novas OMP's de classe 1 podem ser transportadas completamente intactas à membrana externa, senão nenhuma ligação aos anticorpos monoclonais se daria. Quando a estirpe H44/76 é comparada com as quatro estirpes com epítopos extra nos anéis 5 e 6, o epítopo Pl. 7 parece que em todos os casos se liga igualmente bem. Não é importante se o epítopo P1.7 está colocado nos anéis 1, 5 ou 6.

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[24] Saukonen K., Leionen M., Abdillahi H. & Poolman J.T., Comparative Evaluation of potentional components for group B meningococcal vaccin by passive protection in the infant rat and in vitro bacterial assay, Vaccin. vol. 7, August 1989, p. 325-328.

[U] Tomassen J., Verraeij P., Struyvé M., Benz R. & Poolman J.T., Isolation of Neisseria meningitidis mutants deficient in class 1 (PorA) and class 3 (PorB) outer membrane proteins, Infection and Immunity, May 1990, p. 1355-1359.

[lá] Tsai C.M., Frasch C.E. and Mocca L.F., Five structural classes of major outer membrane proteins in Neisseria meningitidis. J. Bacteriol., 1981, no. 146. p. 69-78.

[17] P. van der Ley, personal Information.

EXEMPLO II RESUMO:

Neste exemplo é descito a criação de uma proteína de membrana externa mutada, dita OMP oferece uma possibilidade de ligação a uma ligação da OMP de classe 1 à parte oligossacarídea do lipopolissacarídeo. Por esta razão um oligonucleotídeo gue codifica uma cisteína é incorporado num sítio de restrição existente do gene da proteína da classe 1, dito oligo é seguidamente transformado num mutante carente de cápsula da estirpe meningocócica H44/76, H44/76-B. Depois da transformação, a incorporação da cisteina não pareceu ter nenhuma influência na expressão do epítopo ou na produção da OMP de classe 1. A selecção dos anéis 5 e 6 foi determinado pelo facto de gue estes não contêm uma quantidade importante de epítopos da classe 1 e pela manutenção da actividade imunológica ilustrada no exemplo I depois de as mutações terem sido providas nestes anéis. O controlo do resultado da incorporação foi realizado com base na expressão do epítopo dos transformantes resultantes. 2.1 MATERIAL:

Plasmídeo utilizado: 0 plasmídeo utilizado, pPH204 foi derivado do plasmídeo pTZ19R de Pharmacia.

VISÃO GERAL DA CRIAÇÃO DOS PLASMÍDEOS UTILIZADOS

PTZ19R parte de 1,9 kb da proteína de classe 1 | colocada no sítio Eco R1. As bases | entre Eco R1 e Sal foram eliminadas

P2.24S-E sítio Κρη I no anel 5 da class 1 ! convertido em sítkrBanvHI.

Novo Κρη I feito no anel 6.

pPH20ií I — Oligo que codifica o resíduo de cisteína ligado no sítio Kpnl no anel 6.

Criado novo sítio Pstl. Sítio anterior pPH2oii-s Kpnl desapareceu

Enzimas utilizadas: - Kpnl (vol. act. : 10 U/pl ) ; com tampão de incubação L. - Pstl (vol. act.: 10 ;· com tampão de incubação H. - T4 ADN-ligase (vol. act.: 1 O/p.1 ) ; com tampão T4 ADN LIGASE. A composição do tampão de incubação correspondente, ver quadro 1,

Quadro E: Composição dos tampões utilizados

Componentes do tampao em mml/h H Ίτ ÍB-kiClx 10 X -.V *\s ·.*· 1D0 Ditioeriteritol 1 1 ATP pi m 3 7 ·' C: '1 o 5 I A1'M·· li Qsâ.ss

As enzimas e tampões são derivadas de BOEHRINGER MANNHEIM. Bactérias utilizadas:

Escherichia coli K12 NM522: esta estirpe não compreende um sistema de modificação da restrição.

Estirpe meningocócica: H44/76-B'. Este é o mutante de H44/76 que carece de cápsula.

Monoclonais utilizados: ver quadro F. QUADRO F: monoclonais utilizados monoclonal dirigidos contra iwiecxauí* PI x t Pl,7 M8S€ÍÍ0.: PI v Todos os monoclonais utilizados sao derivados a partir de RIVM.

Membrana utilizada: PARA WESTERN BLOT:

Um meio de BIO RAD Trans Blot Transfer membrana de nitrocelulose pura.

Blotting Filter Paper; 0,45 micron Lot. No. : 4072/87020.

Cat. No. : 162-0113 . PAE& 0 BLOT DAS COLÓNIAS: SCHLEICHER & SCHUELL BA 85/22, 0,45 micron. diâmetro: 82 mm.

Ref. No.: 406 216 2.2 #ISK)I 2,2.1 EIBlIMlrtO DOS aLIGO^UCLEOlÍDEOÍi:.·.

Os oligonucleotídeos complementares não fosforilados (OLIGO) (ver abaixo) foram adicionados numa concentração de 1 μ9/100 μΐ cada, e aquecidos a 95°C. Depois do aquecimento a mistura pode ser arrefecida lentamente até à temperatura ambiente. Como o arrefecimento se deu lentamente, a hibridização dos oligonucleotídeos complementares pode dar-se [5]. Desta maneira, foram criados os oligos com as extremidades coesivas correctas, isto é extremidades coesivas de Kpnl. m mmmmçM a···©; [0132] 0 oligonucleotideo que codifica a Cisteina com extremidades coesivas Kpnl (sequência id 10) :

Oly Cyi Ser Ser Φ- c OOC TGC AGC CTA AC7T $ mê f Ala Ala Ala End Sítio de restrição para Kpnl: 5'-GGTACC-3' 3'-CCATGG-51 Sítio de restrição para PstI: 5'-CTGCAO-3' 31 -GACGTC-5' 52 0 oligonucleotídeo está composto por dois oligonucleotídeos monocatenários:

Oligo Cl (sequência id 11): 5'-GGG CTG CAG CCT AAG TAC-3'

Oligo C2 (sequência id 12): 5'-TTA GGC TGC AGC CCG TAC-3' 2ΛΛ ligação oss m

Os plasmideos foram submetidos a digestão com a enzima correcta e posteriormente separados em gel de baixa fusão 1,2% a partir dos plasmideos que não foram cortados. Depois o gel foi corado com brometo de etidio e os plasmideos cortados foram cortados do gel. Seguidamente, o ADN plasmídeo cortado foi novamente isolado do gel de agarose com a extracção de fenol e a precipitação de etanol (8] .

Metade dos plasmideos isolados foi tomada para a ligação dos oligos. A mistura da ligação estava composta da seguinte forma: 50 μΐ de ADN plasmídeo cortado; 20 μΐ de mistura de oligo hibridizado. 10 μΐ tampão de ligação; 4 μΐ T4 ligase; 16 μΐ de dH20. Após a incubação da mistura de ligação durante 24 horas (o/n) a 16°C a mistura foi concentrada por precipitação de etanol. Seguidamente os produtos de ligação foram separados num gel de baixa fusão a 1.2% e os produtos da ligação foram cortados e seguidamente foram isolados em gel por extracção de fenol e precipitação de etanol. 2,2 3: FiTSlO M EXCESSO Df OLIGOS :

Depois do isolamento dos produtos de ligação do gel estes foram aquecidos a 65°C de forma a que o oligo de excesso se fundisse. Arrefecendo lentamente a mistura poderia dar-se novamente a hibridização entre as partes complementares do oligo ligado ao plasmídeo. .$.4 DÓi MBMÍngQS BICS&DOi 10ÍII M MMÓS:

As soluções foram posteriormente recortadas com a enzima de restrição original de forma a que os plasmideos fechados sobre si mesmos se abrissem de novo. Este recorte poderia dar-se ao memsmo tempo que a incorporação do oligo tenha mudado o sitio de restrição original para um sitio de restrição diferente. Depois do corte, foram criarom plasmideos lineares sem oligo e plasmideos circulares com um oligonucleotideo incorporado. Como apenas o ADN plasmídeo circular pode ser recebido por H.coli, em principio somente os transformantes que contêm o oligo podem surgir. im e. oii;

Procedimento de transformação ver: [8] .

Depois da transformação, os transformantes foram colocados em placas com meios de nutrição com um meio de caldo de Luria (L.B) , aos quais se lhes adicionou 100 pg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37°C, após o qual os transformantes foram colocados em placas desde as colónias individuais em meios de nutrição de L.B. com ampicilina e foram novamente incubados durante 24 horas e depois as colónias individuais foram transferidas ao meio liquido de L.B com ampicilina, esta mistura foi incubada durante 24 horas a 37 °C sob agitação e foi utilizada para o isolamento do plasmídeo (ver mais à frente). 2.2.6 ISOLAMENTO DO PLASMÍDEO: O isolamento do plasmídeo dos transformantes foi efectuado de acordo com o método de lise alcalina [8]. ISKSBffe te HjâMÍBSOS REeOMSIWTSi:

Para controlar se o oligonucleotideo estava presente nos plasmideos, foi realizada uma digestão com a enzima de restrição que codifica o novo sitio de restrição. Uma digestão foi também realizada com a enzima de restrição que codifica o sitio de restrição que deveria desaparecer, de forma a que se pudesse determinar com base no modelo de restrição num gel de agarose se o sitio de restrição antigo tinha desaparecido e se o sitio novo estava realmente presente. A composição da proteína dos transformantes positivos foi controlada com electroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAAGE). 2.2.8 SDS PAAGE: 0 SDS PAAGE foi realizado de acordo com o protocolo da referência [8] . Um gel de acrilamida a 11% foi utilizado como gel de separação, um gel de acrilamida a 5% foi utilizado como gel de concentração.

Procedimento com E. coli.

Os transformantes positivos cresceram para a electroforese durante 24 horas num meio líquido de LB com (100 pg/rrtl) de ampicilina com e sem IPTG {=isopropíl-8-D-tiogalactopiranosido (Sigma}. 1,5 ml do cultivo o/n foi centrifugado, depois do qual o granulado foi ressuspendido em 40 μΐ dH20, ao qual foi adicionado 10 μΐ de tampão de carga { 250mM tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% ditiotreitol, 50% glicerol; 0,05% de azul de bromofenol), seguidamente a suspensão foi aquecida durante 10 minutos a 95°C e posta em gel.

Procedimento com meningococos

Para os meningococos as células cresceram durante 24 horas numa atmosfera húmida com C02 a 5% numa placa meningocócica enriquecida com isovitalex foram suspendidas em 10 ml de PBS (0.01M de solução fisiológica salina de tampão fosfato, pH 7,2: RIVM). A suspensão obtida foi seguidamente aquecida durante 30 minutos a 56 °C, de forma a que os meningococos fossem desactivados e seguidamente a suspensão foi centrifugada (10 minutos a 4000 rpm) . O granulado foi suspendido em 40 μΐ dH20 e ao qual 10 μΐ de tampão de carga foi novamente adicionado, seguidamente a suspensão foi aquecida durante 10 minutos a 95°C e posta em gel. O tampão de electroforese aplicado tinha a seguinte composição: 50mM Tris/HCl (pH 8,3); 380mM glicina. 0,1% SDS. A electroforese foi realizada com 20mA por gel.

Depois da electroforese o gel foi: 1) corado com azul brilhante de Coomassie (1 hora a 56°C) , e depois corado com 10% H&c/S (vol./vol. % metanol (3 vezes 30 minutos a 56 "C).

Depois da transferência, o blot foi enxaguado durante um quarto de hora em PBS com 0,1% de Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano, Merck). Seguidamente o blot foi enxaguado durante média hora com PBS, ao qual tinha sido adicionado Tween 80 a 0,1% e hidrolizado de caseína a 0,3% (N-Z Amine A, ICN Biochemicals), seguidamente deu-se a incubação durante uma hora com monoclonais dissolvidos em PBS/0,1% Tween 80/0,3% caseína, contra o epítopo a ser detectado. Depois, o blot foi enxaguado 3 vezes durante 10 minutos com PBS/0,1% Tween 8 0 depois do qual este foi incubado durante média hora com o conjugado proteína A e peroxidase, e diluído 1:10.000 com Tween 80/0,3% caseína. Seguidamente foi novamente enxaguado 3 vezes 10 minutos com PBS/0,1% Tween 80 e uma vez com dH20, depois do qual foi adicionada a mistura do substrato de peróxido de hidrogénio (20 μΐ 30% peróxido de hidrogénio, Merck; 30ml substrato A: tampão fosfato/citrato; 0,02 M de Na2HP04 e 0,01M ácido cítrico (1:1) pH=5,0; 10 ml de substrato B: 80mg

Dioctil-sulfoccinato (DONS) ; 24mg de tetra-metilbenzidina (TMB) em 10 ml de etanol a 96%).

Passados alguns minutos, ficaram visíveis umas tiras azuis na posição em que os anticorpos monoclonais se tinham ligado às proteínas correspondentes. Depois os blots foram enxaguados outras 3 vezes com água e seguidamente foram fotografadas ou foram mantidas às escuras até que fossem fotografadas.

Os meningcocos cresceram durante 24 horas em agar GC (Difco) , enriquecido com isovitalex a 37°C numa atmosfera húmida com C02 a 5% (3) . As células da placa completamente coberta foram ressuspendidas em lOml de meio de Mui ler Hinton (RIVM) , com 10 mM de Hgcl* a 37°C. Posteriormente a suspensão foi diluída 1:5 no meio de Mui ler Hinton com lOmM de %€!·> e foi adicionado 1 μ9/ιη1 de ADN plasmídeo. Seguidamente deu-se a incubação durante 3 horas a 3 7°C depois da qual a suspensão bacteriana foi 104 vezes diluida com PBS estéril e colocado em placas numa placa de GC. Depois do cultivo durante 24 horas os transformantes correctos foram seleccionados através do blot da colónia. ζλλι blot m od&ôra.:

As colónias de uma placa coberta durante 24 horas a 37°C numa atmosfera húmida com 0¾ a 5% foram transferidas a uma membrana de nitrocelulose de 0,45 micron (Schleicher & Schuell). Seguidamente o blot foi aquecido durante 30 minutos em Tween 80 a 56 °C de forma a que os meningococos fossem desactivados. Depois do aquecimento as bactérias em excesso foram tiradas. Para o procedimento seguinte ver a técnica de Western ou de inmunoblot.

2.2.12 O ISOLAMENTO DA OMP

Uma placa com meningococos cresceu durante 24 horas a 37°C numa atmosfera húmida com C02 a 5% após o qual as células foram ressuspendidas em 5ml de meio meningocócico. 200 ml de meio meningocócico foi semeado com 2,5 ml da mistura. Estes 200ml foram activados durante 24 horas a 37 °C, após o qual os meningococos foram inactivados por incubação durante média hora a 56°C. Seguidamente os meningococos foram granulados mediante a centrifugação do meio durante 10 minutos a lO.OOOrpm (centrifugador: centrikon T-324; rotor A6.9). O sobrenadante foi vertido e o granulado foi ressuspendido em lOml 0.01M fr.ÍE/lCl pH 8.0. Seguidamente esta solução foi submetida a vibração ultra-sónica durante 15 minutos (Branson Sonifier 250, posição 4, 50%) na que a solução foi colocada num banho de gelo. Pósteriormente a solução sonifiçada foi centrifugada durante 10 minutos a 5000 rpm (centrifugador: centrikon T-324, rotor A8.20). O sobrenadante foi seguidamente centrifugado durante uma hora a 20.000 rpm. e a 10°C (centrifugador: centrikon T-324; rotor M:,20). O granulado assim formado foi ressuspendido em 4 58 ml de sarcosilo a 1% em 0,01M Tris/HCl pH 8,0, após o qual a centrifugação foi realizada durante 5 minutos a 5000 rpm. O sobrenadante foi seguidamente centrifugado durante uma hora a 20.000 rpm. e a 10°C (centrikon T-324 centrifugador, rotor A8,20). O granulado formado foi ressuspendido em 1 ml 0,01 M TriéynO, pH 8,0. A produção foi determinada com o procedimento Microassay (BioRad). A pureza das OMP's foi controlada com SDS PAAGE,

2.2.13 CONTROLO DO TRANSFORMANTE COM A AJUDA DA REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE: 1" . Dia:

Os meningococos para ser submetidos a PCR foram semeados numa placa GC, enriquecida com isovitalex, e cultivados durante 24 horas numa atmosfera húmida com C02 a 5% a 37°C. 2°. Dia:

Foi feita uma suspensão celular de cada uma das estirpes que deviam ser submetidas a PCR mediante a resuspensão de pequenos flocos de bactérias em 1 ml de água destilada estéril e aquecendo posteriormente esta suspensão durante 10 minutos a 95°C. A solução resultante foi seguidamente ligeiramente centrifugada e mantida em gelo. A mistura reactiva tinha a seguinte composição: - 10 μΐ tampão (500 mM KC1. 100 mM Tris/HCl pH 8,3, 15 mM MgCl2, 0.1% { p/vol } gelatina). - 200 μΜ de cada um dos dNTPs. 100 mg de cada um dos iniciadores. - suspensão celular de 25 μΐ. - encher até 100 μΐ com água destilada estéril. - 100 μΐ de óleo mineral.

As condições da RCP foram as seguintes: ver quadro G

QUADRO G: Condiçoes daPCR mia. mim. smn, i i | sielo M*c 72 j | i $ f 1 : 2 j ___________i | 2 ·· 30 incl. 1 1 2 !

Depois do 30" ciclo as amostras foram mantidas 8 minutos adicionais a 72°C para fazer com que todo o ADN presente nas amostras seja bicatenário.

Depois da PCR as amostras foram submetidas a uma extracção de fenol e uma precipitação de etanol para obter o ADN produzido na forma pura. 3o. Dia: 10% do ADN purificado foi electroforado num gel de agarose 1,0% para observar o resultado. A partir deste, deverá ser evidente se o nucleótido incorporado está presente no ADN. 2.2. RESULTADOS: . a.. i dds - f»Ét£»s iieies s i> ccLt* 0 oligonucleotídeo hibridizado foi ligado em pPH204 cortado com Kpnl e seguidamente o conjunto foi transformado em E. coli K12 NM522. Os plasmideos foram isolados dos transformantes resultantes. Os plasmideos isolados foram cortados com Kpnl e PstI e pósteriormente electroporados em gel de agarose a 0,8%, ver figura 16. QUADRO H: Ilustração adicional da figura 16 observações não cortado número da pista descrição da amostra 1,6,11,21,26 i ÂDN plasmideo recombinante

sitio Kpnl deveria ter desaparecido

recombinante digerido con Kpnl

através da incorporação do oligo um segundo sitio PstI deu recombinante digerido 1 resultado, agora um com Kpnl fragmento do plásmido foi cortado

Marcador lambda

HindIIl digest A partir da formação de um fragmento de aproximadamente 600 pares de bases do PstI digerido e a desaparição do sitio Kpnl é evidente que o oligo foi incorporado em pPH204.

Os transformantes foram posteriormente cultivados durante 24 horas a 37°C num meio liquido de L.B. com 1 mM IPTG e 100 μ5/πι1 de ampicilina. As proteínas bacterianas foram seguidamente separadas com a ajuda de SDS PAGE e seguidamente o inmunoblotting foi utilizado para ver se o oligo tinha sido incorporado na orientação correcta. Com a utilização do blotting o tamanho da proteína de classe 1 foi observada pela demonstração do epítopo P1.2 com o monoclonal MN16C13F4, ver figuras 18 e 19.

Os transformantes nas pistas n°. l, 3, 5, 7, 9, 11 mostram uma banda proteica que se propagou menos que os transformantes nas pistas restantes. Isto indica que a proteína produzida é maior do que a dos transformantes das pistas n°. 2, 4, 6, 8, 10. Os transformantes nas pistas ímpares compreendem o oligonucleotídeo na orientação correcta e os das pistas pares na orientação incorrecta, criando deste modo um codão de detenção que resulta numa proteína mais pequena.

Os plasmídeos dos transformantes positivos foram seguidamente transformados em |M4/?6í B“, uma mutante carente de cápsula de H44/76. Os transformantes foram seleccionados por blotting da colónia para o epítopo P1.2 com o monoclonal MN16C13F4. As proteínas da membrana externa dos transformantes puros foram isoladas. A pureza foi controlada mediante SDS PAAGE e inmunoblotting, ver figuras 20 e 21. Foi também controlado se o rácio entre a proteína de classe 1 e as outras proteínas tinham mudado com os transformantes. Este pareceu não ser o caso (resultados não incluídos).

Seguidamente foi controlado se o epítopo P1.16 tinha desaparecido dos transformantes, como um teste os monoclonais contra os epítopos P1.2 e PI. 7 foram incluídos assim como a estirpe 1M4/76 B~ como estirpe de teste figura 22. A partir da figura é evidente que o monoclonal MN5C11G dirigida contra o epítopo P1.16, só reage com a estirpe de origem. 0 monoclonal MN14C11.6 dirigido contra o epítopo PI.7 reage com a estirpe de origem e os transformantes. MN16C13F4 dirigido contra o epítopo Pl.2 somente reage com os transformantes. aíi A introdução bem sucedida de um resíduo de cisteína na proteína de classe 1 de H44/76-B' é evidente a partir dos seguintes resultados: 1) Após a incorporação do oligonucleotídeo o sítio Kpnl desapareceu e foi formado um sítio novo PstII. 2) Após a transformação em H44/76-B esta mudou de Pl.7.16 a PI.7,2 o qual é indicativo de que o gene que codifica a proteína de classe 1 presente no plasmídeo pPH204 em cujo gene o oligo tinha sido incorporado foi introduzido no Meningococo. A incorporação da cisteína não parece ter uma influência na produção da proteína de classe 1 considerando a quantidade produzida pelo Meningococo. A expressão do epítopo para bactérias também parece que se manteve normal. 2.5 LISTA BIBLIOGRÁFICA PARA 0 EXEMPLO 2: 1 FRASCH, C.E. 1977. Role of protein serotype antigens in protection against disease due to Neisseria meningitidis. J. Infect. Dis. 136 (suppl) S84-S90. 2 FRASCH, C.E., W.D. ZOLLINGER and J.T. POOI»? 1985. antigens of Neisseria meningitidis and a proposed scheme for designation of serotypes. Rev. Infect. Dis. 7:504-510. 63 3 GRIFFISS. J.M., B.L. BRANDT. D.D. BROUD. D.K. GOROFF and C.J. BAKER. 1984. Immune response in infant chiem to disseminated infections with Neisseria meningitidis. J. Infect.Dis. 150:71-79. 4 KIM J.J., R.E. MANDRELL, H. ZHEN, M.A.J. HESTERINK, J.T. POOLMAN and J.M. GRIFFISS Electromorphic characterization and description of conserved epitopes of the lipooligosaccharides of group A Neisseria meningitidis, Infect. Immun. 56:2631-2638. 4A KLUGMAN, K.P., GOTSCHLICH, E.C. and BLAKE, M.S. 1989. 1989. Sequence of the structural Gene (rmpM) for the class 4 outer Membrane Protein of Neisseria meningitidis. Homology of the protein to Gonococcal protein III and Escherichia coli OmpA and Construction of meningococcal strains that lack Class 4 protein. Infect. and Immun., July 1989. P2066-2071. 5 LAY P. VAN DER, PERSONAL INFORMATION. 5A MAIDEN, M.C.J., J. SUKER A.J. MCKENNA. J.A. BYGRAVES AND I.M. FEAVERS, 1991. COMPARISON OF THE CLASS 1 OUTER MEMBRANE PROTEINS OF EIGHT SEROLOGICAL REFERENCE STRAINS OF NEISSERIA MENINIGITIDIS. MOLEC. MICROBIOL. 1991. 3:5:P727-736. 6 POOLMAN, J.T. 1990. POLYSACCHARIDES AND MEMBRANE VACCINES. BACTERIAL VACCINES, P57-86 (70). 7 POOLMAN, J.T., C.T.P. HOPMAN, and H.C. ZANEN. 1982. Problems in the defenition of meningococcal serotypes. FEMS Microbiol. Lett. 13:339-348. 8 SAMBROOK, FRITSCH. MANIATIS. Molecular Cloning, a laboratorium manual, second edition, Cold Spring Harbour Laboratory. N.Y. Pl.25-1.28, Pl.82-1.85, P6.3-6.16, P6.18-6.19, P18.47-18.55. M 1989.

9 SAUKONEN, K.,M. LEINONEN, H. ABDILLM

Comparative Evaluation of components for group B meningococcal 64

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(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3333 BN (ií) TÍTULO DA INVENÇÃO: uma molécula provida de imunidade activadora das células B derivada de um lipopolissacarídeo 65 meningocócico, métodos para a sua preparação, uma vesícula de membrana externa provida com grupo de polipepetídeos com (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (IV) FORMA DE LEITURA INFORMÁTICA: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID R*:s 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) ΑΝΤΙ-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: epítopo P1.7 de OMP de classe meningocócica 1 com extremidades coesivas de Kpnl 66 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: GAACGGCGGC GCCTCTGGCC AAGTTAAAGT TACTAGTAC 39 Ç2| INFORMAÇÃO DA SEQ ID 1ΓΜΟ Zt (i) CARACTERfSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) topologia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) ANTI-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 5' terminais do epitopo pl. 7 como o presente no PJB007 (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB007 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID W; 2: GGTACGAACG GC 12 Í2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 3:

{&) M IIOuInCSO €7 (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNC (iii) ANTI-SENTIDO: não (Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 3' terminais do epítopo pl. 7 como o presente no pJB007 (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB007 OKCCPICAC m SBQOÉMI1A: GTTACTAGTA CC 12 SEQ IS Ν ' λ (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID : 4: (i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear til! TIRO DE ^DLÉCODJV Ãllfc (iii) ANTI-SENTIDO: não (Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: epítopo P1.16 de OMP da classe meningocócica 1 com extremidades coesivas de Kpnl (XÍ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° : 4: GTATACCAAA GACACCAACA ACAACTTGAC CTTGAGTAC 3 9 (i) sraiM&çÃo m saa ip n*t s s CARACTERfSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) TOPOLOGIA: linear (iii) ANTI-SENTIDO: não (Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 5! terminais do epitopo pl.16 como o presente no pjBoie (ví1) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB016 (XX) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID ÍP s 5: GGTACGTATA CC 12 (2) IlPOSmçIõ DA SEQ ID N° : 6: (i) CARACTERfSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) TOPOLOGIA: linear iill TÍFO Dl liDlJCUM; Ã!» (iii) ANTI-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 3' terminais do epitopo pl.16 como o presente no pjBoie (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB016 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6 : ACCTTGAGTA CC 12 i2) immmmçM) da seq id n°: i: 70 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única (D) topologia: linear !ii} firo m MQiieoLâ: » (iii) ANTI-SENTIDO: não (vi3 FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: epítopo PI.16 de OMP de classe meningocócica com extremidades coesivas de Spel

Ui) OESCIIÇAO HÁ SEQUÊNCIA; Í1Q IP !T?í CTAGCTATAC CAAAGACACC AACAACAACT TGACCTTGT 39 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N° : 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico ξ'Ο) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear ÍHÍ TIPO 01 MOOiCOLà: ADOc (iii) ANTI-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 5' terminais do epítopo pl.16 como o presente no pJB716 (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB716 fxif RESíTRIÇÂO l?k SEmiMOlAi SiQ IS P: $ * ACTAGCTATA CC 12 ttí INFÓEMAÇÃD m SBQ ID SP í 9* (i) CARACTERfSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

Ui) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) WTI-SENTIDO: não <Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: 3' terminais do epítopo pl.16 como o presente no pJB716 72 (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: pJB716 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID 9: ACCTTGTCTA GT 12 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID rs 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) tipo: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear C' í.1.1 TIPO "m MOláffiLA: Mlfc (iíi) HIPOTÉTICO: não (iii) ANTI-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: oligonucleotideo complementar cl-c2 que codifica a cisteina com extremidades coesivas de Kpnl complementar à OMP de classe 1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10: GGGCTGCAGC CTAAGTAC 18

Ul IMFGRMÃÇIO m BEQ. 3» IT ; ilú i 3» I· ύϊ% :li-FQtíÉ^J'C.iÃ:; (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) TIPO DE CADEIA: Única ÍD) TOPOLOGIA: linear .(li 3 TIK3 m MOLÉCULA: &DMç (iii) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: oligo que codificam a cisteína com extremidades coesivas Kpnl (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: cl-oligo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11: GGGCTGCAGC CTAAGTAC 18 12} ÍNFOP^l&ÇÃO D&. SEp ID SC l$t (i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico 74 (C) TIPO DE CADEIA: únics (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNe (iíi) ΑΝΤΙ-SENTIDO: não (vi) FONTE ORIGINAL: com (A) ORGANISMO: oligo que codifica a cisteína oligos extremidades coesivas Kpnl (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: c2-allgo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: TTAGGCTGCA GCCCGTAC 18

Lisboa, 13 de Setembro de 2007. -BMWmCXM CltMMB m. DSSOSIÇ&0

Esta lista de referências citada pelo Titular é unicamente para a conveniência do leitor. Não forma parte do documento do Pedido de Patente européia. Apesar de que as referências tenham sido cuidadosamente compiladas, erros e omissões não podem ser excluídos e a EPO renúncia a qualquer responsabilidade no que a estes se refere.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição * MiMtóiS :ίάί}£3!

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Claims

1. Molécula activadora de células B provida com imunidade derivada de um lipopolissacarídeo meningocócico (LPS) com pelo menos um epítopo, compreendendo a dita molécula pelo menos a parte comum da parte oligossacaridea (região do núcleo) dos lipopolissacarideos específicos para pelo menos dois imunotipos meningocócicos, preferencialmente imunotipos L2 e L3, caracterizada por a galactose estar ausente na parte activadora das células B, assim como derivados da molécula com capacidade de indução da reacção imunológica e sem galactose na parte activadora das células B.

2. Molécula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita molécula ser derivada do núcleo L3 e ter a seguinte estrutura: 1 *· t I t l

3. Molécula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a molécula ser derivada do núcleo L2 e ter a seguinte estrutura: I t t·

4. Método para preparar uma molécula de acordo com quaisquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por nele serem utilizadas técnicas de ADN recombinante.

5. Método para preparar uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por, a molécula ser obtida partir de uma estirpe de produção mutagenizada ou seleccionada que produz pelo menos LPS sem galactose.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por uma estirpe meningocócica que não produz galactose ser utilizada como estirpe de produção.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por uma estirpe meningocócica ser utilizada como estirpe de produção que tem uma mutação ou uma delecção numa região D ou E de um locus de cps menigocócico do tipo selvagem como o que está presente num fragmento de ADN no plasmídeo pMF32.35 na estirpe depositada com o número de registo CBS 401.93.

8. Método para preparar uma molécula de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a molécula ser obtida por uma via sintética.

9. Conjugado sacarideo-peptidico (SPC) compreendendo pelo menos uma molécula de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 3 como parte sacaridea, estando a dita parte sacaridea conjugada a uma parte peptídica com pelo menos um epitopo activador das células auxiliares T, compreendendo a dita parte peptidica preferencialmente pelo menos uma proteína homóloga ou um fragmento peptídico derivado de uma proteína homóloga, caracterizado por homólogo significar que os epítopos activadores das células B e das células auxiliares T são derivados a partir desse microrganismo.

10. Vesícula da membrana externa que compreende uma molécula de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 3 e/ou um conjugado sacarídeo- peptídico de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a dita vesícula da membrana externa preferencialmente uma OMP da classe I ou fragmentos de OMP da classe I como epítopo activador das células auxiliares T.

11. Vesícula da membrana externa de acordo com a reivindicação 10 provida com um grupo de polipeptídeos que têm pelo menos a actividade imunológica das proteínas da membrana externa (OMP's) ligadas a uma membrana caracterizada por pelo menos um polipeptídeo do grupo ser uma OMP ancorada I membrana com uma mutação num dos anéis ou fragmentos da superfície da OMP, sendo por exemplo este polipeptídeo pertencente ao grupo da OMP da classe I ancorada à membrana ou um fragmento da OMP de uma OMP da classe I ancorada à membrana e sendo por exemplo uma OMP recombinante ou fragmento da OMP.

12. Vesícula da membrana externa de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a vesícula da membrana externa compreender pelo menos uma molécula de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 3 e/ou um conjugado sacarídeo- peptídico de acordo com a reivindicação 9 como parte activadora das células B com pelo menos um epítopo.

13. Vesícula da membrana externa de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12; caracterizada por pelo menos um polipeptídeo do grupo ser uma OMP ancorada à membrana ou fragmento da OMP que tem uma mutação num anel ou nos anéis de superfície 2, 3, 5, 6, 7 ou 8; preferencialmente 6 ou 7.

14. Vesícula da membrana externa de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 13, caracterizada por a mutação compreender a presença de pelo menos um aminoácido com uma cadeia lateral especifica reactiva, sendo o dito aminoácido por exemplo a cisteína. 3

15. Vesícula da membrana externa de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 14, caracterizada por o polipeptídeo ser reconhecido para pelo menos dois fenotipos HLA.

16 . Vesícula da membrana externa de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 15, caracterizada por esta estar provida com conjugados sacarídeo- peptídicos que compreendem um polipeptídeo como parte perptídea e na qual o polipeptídeo é conjugado com a parte sacarídea no lugar da mutação, compreendendo a dita parte sacarídea uma parte activadora das células B com pelo menos um epítopo derivado a partir de uma bactéria Gram-negativa, sendo a dita parte activadora das células B derivada da parte oligossacarídea (núcleo interno) de um LPS meningocócico.

17. Vesícula da membrana externa (OMV) de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 16, caracterizada por a parte sacarídea ser via separador acoplada à parte peptídica.

18. Vesícula da membrana externa (OMV) de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 16, caracterizada por a parte sacarídea ser conjugada com a parte peptídica mantendo os grupos amino livres na parte activadora das células B dos grupos fosfoetanolamina (PEA) presentes na parte sacarídea, onde por exemplo pelo menos um grupo PEA foi introduzido na parte sacarídea da parte activadora das células B com pelo menos um epítopo antes da conjugação.

19. Método para preparar uma vesícula da membrana externa de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 11 a 20, caracterizado por pelo menos: L) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipeptídeo ser expressa numa bactéria; 2) a bactéria ser cultivada em circunstâncias conhecidas per se com as quais produz a vesícula da membrana externa e as vesículas da membrana externa delas formadas com o polipeptídeo serem opcionalmente isoladas, preferencialmente o método adicionalmente compreende 3) prover as vesículas da membrana externa resultante da fase 2 com conjugados sacarídeo- peptídicos acoplando o polipeptídeo à parte sacarídea desejada, sendo a dita parte sacarídea preferencialmente obtida mediante técnicas de ADN recombinante ou por uma via sintética.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a parte sacarídea ser obtida a partir de uma estirpe de produção mutagenizada ou seleccionada que produz pelo menos a parte sacarídea sem galactose, sendo esta estirpe por exemplo uma estirpe meningocócica não produz galactose, preferencialmente uma estirpe meningocócica com uma mutação ou uma delecção numa região D ou E de um locus de cps menigocócico do tipo selvagem como o que está presente num fragmento de ADN no plasmídeo pMF32.35 na estirpe depositada com o número de registo CBS 401.93.

21. Estirpe mutada meningocócica caracterizada por esta ter uma mutação ou uma delecção numa região D ou E de um locus de cps meningocócico do tipo selvagem como o que está presente num fragmento de ADN no plasmídeo pMF32.35 na estirpe depositada com o número de registo CBS 401.93.

22. Vacina, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes componentes: uma molécula de acordo com as reivindicações de 1 a 3; um conjugado sacarídeo-peptídico de acordo com a reivindicação uma vesícula da membrana externa de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 10 a 18; uma vesícula da membrana externa obtida através do método da reivindicação 19 ou da reivindicação 20; um microrganismo de acordo com a reivindicação 21. Lisboa, 13 de Setembro de 2007.