PT751782E - Utilização de um anticorpo não neutralizador específico para a subunidade beta da hormona luteinizante para aumentar a fertilidade - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO UTILIZAÇÃO DE UM ANTICORPO NÃO NEUTRALIZADOR ESPECÍFICO PARA A SUBUNIDADE BETA DA HORMONA LUTEINIZANTE PARA AUMENTAR A FERTILIDADE" A presente invenção refere-se à utilização de um anticorpo não neutralizador que se liga à subunidade da hormona luteinizante e que reduz, mas não elimina, a actividade de hormonas glicoproteicas no receptor da hormona luteinizante, mesmo que esteja presente numa concentração que lhe permita ligar-se à totalidade das referidas hormonas glicoproteicas presentes, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a estimular a fertilidade em mamíferos do sexo feminino ao estimular a produção da hormona estimulante do folículo.

As revelações referidas aqui para ilustrar o contexto da invenção e para fornecer pormenores adicionais quanto à sua prática estão, por motivos de conveniência, referidas numericamente no texto seguinte e respectivamente agrupadas na bibliografia em apêndice. A família das hormonas glicoproteicas (1) consiste em três glicoproteínas , heterodiméricas presentes na glândula pituitária anterior, onde são produzidas. As hormonas glicoproteicas consistem na hormona luteinizante (também conhecida como lutropina ou LH) , hormona estimulante do folículo (folitropina ou FSH) e hormona estimulante da tiróide (também conhecida como tirotropina ou TSH) . As hormonas de humanos são conhecidas como hLH, hFSH e hTSH, respectivamente. Nalgumas espécies, uma hormona glicoproteica estruturalmente semelhante à LH, 2 denominada gonadotropina coriónica ou CG, é produzida pela placenta e libertada para a circulação. Em humanos, esta hormona glicoproteica é denominada hCG. Nos primatas também se encontram quantidades significativas de todas as hormonas na forma de produtos de excreção na urina. Após a menopausa, quando a secreção de LH e FSH pela pituitária anterior está grandemente aumentada, encontram-se na urina quantidades significativas de LH e FSH. Extractos de gonadotropina da urina de mulheres na menopausa são denominados gonadotropinas da menopausa humana (hMG). Ao contrário da hCG, que interage como a LH com receptores da LH mas apenas fracamente com receptores da FSH, a hMG interage com receptores da LH e FSH. A actividade dual da hMG deve-se à presença de hLH, hFSH e seus metabolitos no extracto urinário. As urinas de mulheres grávidas e na menopausa são grandes fontes de actividades de gonadotropinas e têm aplicações comerciais importantes.

As gonadotropinas como a FSH, LH e, nalgumas espécies, CG desempenham um papel importante no processo reprodutivo (1-6), ao passo que a hormona estruturalmente relacionada TSH é importante para a função da tiróide (1) . Tanto a LH como a FSH são essenciais para a puberdade e função reprodutora normal. A ausência de uma quantidade suficiente de FSH, LH ou hCG em alturas apropriadas resulta em infertilidade ou término da gravidez. Quantidades excessivas destas hormonas podem resultar em puberdade prematura ou hiper-estimulação das gónadas. Nos indivíduos do sexo masculino, a FSH é essencial para o início e manutenção da espermatogénese (7, 8). A neutralização imunológica da FSH conduz a diminuição da espermatogénese e perda de fertilidade. Nos indivíduos do sexo feminino, a FSH é essencial para o desenvolvimento folicular conducente 3 à produção do gâmeta feminino na ovulação. A doença do ovário poliquistico é uma causa comum de infertilidade em mulheres e é um estado caracterizado por desenvolvimento folicular incompleto. Habitualmente, a fertilidade pode ser restabelecida por administração de FSH ou hMG. A fertilidade também pode ser frequentemente restabelecida por tratamentos com anti-estrogénios, compostos que inibem o efeito de realimentação negativa de estrogénios sobre a secreção de FSH, desse modo permitindo o aumento dos níveis de FSH. Em indivíduos do sexo masculino, a LH é necessária para a puberdade e, na sua ausência, há uma falha na aquisição dos atributos sexuais e da fertilidade de um adulto. A LH é maioritariamente responsável pela síntese de androgénios nos testículos. Estes esteróides exercem uma influência benéfica na espermatogénese, e níveis anormalmente elevados de androgénios podem manter a espermatogénese depois de ter sido iniciada (9). Em indivíduos do sexo feminino, a LH é essencial para a ovulação e formação do corpo lúteo. A LH também exerce uma influência sinergética com a FSH no desenvolvimento do folículo (4) e é bem conhecido que promove a síntese de androgénios foliculares. Estes androgénios servem de precursores para a formação de estrogénios estimulada pela FSH. A LH também pode aumentar o efeito da FSH sobre células da granulosa, particularmente nas últimas fases da maturação do folículo quando as células da granulosa adquiriram receptores da LH. A hCG produzida pelo trofoblasto é importante para a manutenção da secreção de progesterona pelo corpo lúteo durante a fase inicial da gravidez humana. As actividades clínicas destas hormonas e suas aplicações são extensamente revistas em vários manuais de referência, incluindo o de Yen e Jaffe (2). 4

As diferenças dos efeitos da FSH e LH e as interacções endócrinas complexas entre as duas hormonas fazem com que tenham acções sinergéticas sobre o desenvolvimento folicular e sintese de estradiol (4). Por exemplo, a produção de estrogénios ovariana normal deve-se ao efeito da LH na formação de androgénios e à influência da FSH sobre a conversão de androgénios em estradiol. Por sua vez, o estradiol pode suprimir a secreção de FSH pela glândula pituitária. Durante o ciclo menstrual normal, os niveis de FSH diminuem à medida que o foliculo aumenta e segrega quantidades crescentes de estradiol. Quando os niveis de estradiol atingem uma quantidade suficiente durante a fase folicular, podem desencadear um aumento da secreção de LH pela glândula pituitária, que causa a ovulação. A razão de actividades de LH/FSH, bem como os niveis hormonais absolutos no sangue, são importantes para funções reprodutoras, como a maturação do foliculo e ovulação do número apropriado de oócitos durante os ciclos menstrual e éstrico.

Se bem que a secreção de LH e FSH possa ser inibida por hormonas esteróides, a secreção de FSH é habitualmente mais sensível do que a secreção da LH à regulação de realimentação negativa por estrogénios. De facto, em muitas espécies, níveis elevados de estrogénios podem aumentar a secreção de LH, particularmente se os níveis de progesterona forem baixos. A administração de anti-estrogénios, compostos que destroem a regulação de realimentação negativa normal do estradiol sobre a secreção de FSH, conduz frequentemente a libertação acrescida de FSH e produção aumentada de gâmetas. Clinicamente, os anti-estrogénios são amplamente utilizados para aumentar a probabilidade de ovulação em mulheres com doença do ovário 5 poliquístico. Infelizmente, uma vez que os efeitos negativos do estradiol sobre a secreção de FSH são parcialmente responsáveis pelo controlo do número de foliculos que se desenvolvem até ao ponto da ovulação, a destruição da realimentação negativa normal da FSH por estrogénios pode resultar em números inapropriados de óvulos libertados. Um mecanismo que resultasse em secreção aumentada de FSH sem eliminar o controlo de realimentação negativa da secreção de FSH teria aplicação importante no aumento da fertilidade. A FSH purificada é capaz de estimular o desenvolvimento do folículo em mulheres, particularmente quando alguma LH endógena também está presente. A razão FSH/LH é a mais elevada na altura do ciclo menstrual quando se inicia o desenvolvimento folicular. No entanto, ambas as hormonas são essenciais para a fertilidade. A neutralização imunológica da LH conduz a infertilidade em indivíduos do sexo masculino e feminino (10-12). Da mesma forma, verificou-se que a neutralização imunológica da CG, uma hormona que actua via receptores da LH, bloqueia a fertilidade em primatas (13-16). Não foi previamente mostrado que anticorpos para a LH estimulam a fertilidade.

Foi mostrado que anticorpos monoclonais para a hCG (denominados hCG-mAb) inibem a ligação da hCG ao seu receptor in vitro (17). Dependendo da localização dos seus epítopos, os hCG-mAbs têm diferentes capacidades para inibir a ligação da hCG a receptores da LH. Ο B105 e B110 são exemplos de anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos na hCG e LH que permanecem expostos quando as hormonas se ligam a receptores da LH (17) . Complexos das hormonas com estes anticorpos monoclonais ligam-se a 6 receptores da LH, se bem que com menor afinidade do que as hormonas livres. Consequentemente, estes anticorpos inibem a ligação das hormonas a receptores da LH. No entanto, o grau máximo de inibição observado na presença de anticorpo em excesso é menor do que 100% e inferior ao de anticorpos que formam complexos com as hormonas que não se ligam a receptores da LH. Na presença de B105 ou B110 suficientes, a quantidade de hormona necessária para induzir uma resposta biológica aumenta. Assim, mesmo um excesso maciço de qualquer um dos anticorpos suficiente para se ligar virtualmente a todas as hCG ou LH livres no ensaio é incapaz de evitar uma resposta a qualquer uma das hormonas quando as concentrações dos complexos hormona-anticorpo excedem um nível limite.

Como discutido antes, verificou-se há vários anos que a neutralização imunológica da LH previne a fertilidade. Este fenómeno ocorre porque os anti-soros que foram utilizados nestes estudos neutralizaram a actividade biológica da LH. No entanto, quando se utilizam anti-soros ou anticorpos apropriados, como B105 ou B110, a actividade biológica da LH não é eliminada. Ao invés, é reduzida numa quantidade predeterminada. Quando isto acontece, a síntese de androgénios é decrescida. Uma vez que os androgénios são precursores dos estrogénios, a síntese de estrogénios também é reduzida. O decréscimo de estradiol tem um impacto maior sobre a secreção de FSH do que sobre a secreção de LH. A secreção de FSH será aumentada, isto conduzirá a uma razão FSH/LH acrescida e ao aumento do desenvolvimento folicular. Em indivíduos do sexo feminino, esta razão FSH/LH irá conduzir a um aumento do desenvolvimento do folículo. Em indivíduos do sexo masculino, esta razão 7 FSH/LH irá conduzir a um aumento da função das células de Sertoli e aumento da espermatogénese.

Uma abordagem para aumentar a fertilidade que se baseia na redução dos niveis da LH não foi utilizada previamente. Em parte, isto deve-se aos muitos relatos de que anticorpos para a LH inibem a fertilidade e porque eram previamente desconhecidos métodos para preparar e seleccionar anticorpos que reduzam, mas não neutralizem, a actividade da LH. Assim, não seria de esperar que esta abordagem à fertilidade tivesse êxito. Como será discutido mais tarde, esta abordagem para aumentar a fertilidade tem várias vantagens relativamente às técnicas presentes, principalmente em mulheres que produzem e libertam LH e FSH a partir das suas glândulas pituitárias. Uma vez que a redução dos niveis de LH não destrói as relações de realimentação endócrina normais entre o estradiol e a FSH sobre a função da pituitária, é muito menos provável que induza hiper-estimulação do ovário do que as técnicas existentes. Isto significa que haverá menos necessidade de monitorizar os pacientes de forma dispendiosa e exigente. Adicionalmente, apenas um ou, no máximo, poucos tratamentos serão necessários para induzir fertilidade.

Outro método novo para aumentar a fertilidade consiste em empregar um antagonista da LH durante a fase folicular do ciclo menstrual. É conhecido, desde há vários anos, que as cadeias oligossacarídicas das hormonas glicoproteicas são essenciais para a sua capacidade de induzirem transdução do sinal (1). Hormonas glicoproteicas sem resíduos de hidratos de carbono têm capacidade enfraquecida para induzir uma resposta biológica. Estes análogos podem ser utilizados para bloquear a ligação da LH aos seus 8 receptores. Isto irá reduzir a actividade da LH em circulação e, desse modo, aumentar a fertilidade. Verificou-se que gonadotropinas desglicosiladas têm tempos curtos de semi-vida biológica e verificou-se não serem úteis para a sua aplicação original pretendida, nomeadamente para inibir a fertilidade ao reduzir a síntese de progesterona luteínica e causando aborto. Ao mover os resíduos de hidratos de carbono para posições alternadas da hormona, removendo sinais de glicosilação (isto é, as sequências de aminoácidos Asparagina-X-Treonina ou Asparagina-X-Serina, em que X é qualquer aminoácido excepto Prolina) de um sítio e criando sinais de glicosilação em sítios alternados das subunidades e , é possível conceber análogos com actividade agonista reduzida que têm tempos de semi-vida suficientemente longos para serem úteis. Adicionalmente, ao preparar gonadotropinas de cadeia simples nas quais as subunidades e estão covalentemente ligadas, é possível aumentar a estabilidade das hormonas em circulação. Isto deve-se às actividades de ligação a receptores e aos tempos de semi-vida no plasma das gonadotropinas heterodiméricas serem maiores do que para qualquer uma das subunidades. A ligação covalente evita a dissociação das duas subunidades em circulação.

Se bem que a estimulação da fertilidade seja importante para restabelecer a fertilidade em casais inférteis, a inibição da fertilidade é frequentemente desejável como método de planeamento familiar. Adicionalmente, a inibição da fertilidade é útil na produção comercial de gado, uma vez que elimina a necessidade de castração ou evita o desenvolvimento do cio em gado mantido no local de distribuição da forragem. A inibição da fertilidade noutros animais, incluindo cães e gatos, também é desejável como 9 substituição da extracção dos ovários ou castração. A inibição da fertilidade em cavalos também é preferível à castração, particularmente se puder ser invertida. Como notado acima, a fertilidade pode ser inibida por administração de anticorpos neutralizadores para a LH ou FSH. Também pode ser inibida utilizando uma vacina para induzir a formação destes anticorpos. Devido à acção da hCG na manutenção da gravidez, é de esperar que tratamentos conducentes a secreção ou actividade decrescida da hCG também causem infertilidade. Nas mulheres, seria mais desejável inibir a fertilidade por inibição da hCG do que da hLH ou hFSH. Isto acontece porque os tratamentos que neutralizaram a hLH ou hFSH causam cessação da função ovariana e aceleram o aparecimento de problemas associados à menopausa. Em gado e outros animais domésticos, é mais importante inibir a LH para prevenir a puberdade ou não ocorrer cio. Como notado antes, anticorpos apropriados para gonadotropinas coriónicas conseguem inibir a fertilidade em primatas e mulheres, e o desenvolvimento de anticorpos para a hCG tem sido reconhecido como um método potencial importante de contracepção desde há muitos anos (18). Uma vez que a hCG é produzida por um grande número de cancros humanos e porque anticorpos para a hCG conseguem destruir esses tumores, a imunização também teria um impacto benéfico na terapia ou prevenção de cancros (19).

Foram feitas várias tentativas para conceber essa vacina contraceptiva à base da hCG, tomando em consideração as diferenças entre a hCG e as outras hormonas glicoproteicas (14, 18). Infelizmente, o desenvolvimento da vacina tem sido dificultado pelas homologias estruturais entre todas as hormonas glicoproteicas. 0 imunogene preferido deve ser altamente antigénico mas não deve 10 induzir anticorpos que reajam de forma cruzada com as outras glicoproteinas, como a FSH, LH ou TSH humanas. Com base no conhecimento das actividades das hormonas glicoproteicas esboçado acima, uma vacina que tenha induzido anticorpos que tenham interagido com a LH, FSH ou TSH também terá causado infertilidade e/ou inibição da função da tiróide. Infelizmente, a neutralização da LH ou FSH também resulta na cessação dos ciclos menstruais normais e na perda de produção de estrogénios que está associada à fertilidade nas mulheres. É provável que o término da função ovariana resulte em desenvolvimento prematuro de osteoporose e outros problemas associados à menopausa. A inibição da função da tiróide conduz a hipotiroidismo. Semelhanças das estruturas da hCG e hLH tornaram particularmente difícil conceber um imunogene apropriado que não gerasse anticorpos que reagissem de forma cruzada. Foram dedicados muitos esforços à preparação de anticorpos contra o terminal C único da subunidade da hCG, uma vez que esta porção da molécula não se encontra na hLH (1) . No entanto, esta região não é muito antigénica. Esforços para conceber imunogenes também empregaram péptidos obtidos da subunidade (14), conjugados da subunidade com outras proteínas (20) ou heterodímeros contendo conjugados da subunidade da hCG e subunidades ovinas (18). Infelizmente, a maior parte destes imunogenes não é muito eficaz, sendo necessário um imunogene melhor para tornar este método prático. A dificuldade em conceber uma vacina à base da hCG pode ser apreciada entendendo as estruturas das hormonas glicoproteicas. Todas as hormonas glicoproteicas têm uma subunidade comum. Não obstante a conformação de partes da subunidade diferir em todas as hormonas e poder ser 11 reconhecida por anticorpos monoclonais seleccionados (21), porções da subunidade têm a mesma conformação em cada hormona glicoproteica. Assim, muitos anticorpos para a subunidade reconhecem a LH, FSH, hCG e TSH. Uma vez que anticorpos anti-subunidade são frequentemente capazes de bloquear as actividades das hormonas (22), é provável que um imunogene que tenha induzido uma resposta para a subunidade tenha efeitos secundários indesejados. Em consequência, a maior parte das estratégias para conceber uma vacina contraceptiva são dirigidas para a subunidade específica para hormonas da hCG. A subunidade da hCG está relacionada mais de perto com a subunidade da hLH. Muitos anticorpos dirigidos contra a subunidade da hCG intacta também se combinarão com a subunidade da LH. Não obstante as subunidades das outras hormonas diferirem consideravelmente da subunidade da hCG, alguns dos resíduos em todas as subunidades são idênticos, existindo a possibilidade, se bem que pequena, de alguns anticorpos anti-subunidade também reagirem de forma cruzada com estas hormonas. Os 31 aminoácidos do terminal carboxi da subunidade da hCG (CTP) não estão relacionados com nenhum dos resíduos das outras hormonas glicoproteicas. Teoricamente, anticorpos para esta região não conseguem induzir qualquer reacção cruzada com as outras hormonas. Como esperado, quando se utiliza esta região como imunogene, são desenvolvidos anticorpos que não reagem de forma cruzada com nenhuma das outras hormonas glicoproteicas. Infelizmente, os anticorpos que são produzidos para péptidos CTP sintéticos não se ligam à hCG com afinidade elevada. Em parte, isto deve-se à observação de que esta região da hCG contém quatro sítios potenciais de glicosilação ligada a serina e está altamente 12 glicosilada. Suplementarmente, grande parte desta região da hCG não é essencial para a interacção com receptores da LH. Assim, os anticorpos dirigidos contra o CTP da hCG ligam-se a complexos hCG receptor e são, maioritariamente, do tipo não neutralizador. Em consequência, não inibem a acção da hCG, de modo semelhante a anticorpos como ο B101 (22) que evitam que a hCG se ligue a receptores da LH.

Também foram feitos esforços para conceber anticorpos contra outras porções da subunidade da hCG. Uma região que foi extensamente investigada é a que se encontra entre os resíduos cisteína 38 e 57. Sabe-se que esta porção da proteína forma um laço grande, e estudos mostraram que este laço é capaz de estimular a esteroidogénese (23, 24) . Assim, seria de antecipar que anticorpos contra este laço fossem do tipo neutralizador. De facto, ο B101, um anticorpo que se verificou reconhecer resíduos presentes neste laço (22, 25, 26), é capaz de neutralizar a actividade da hCG. 0 problema de utilizar esta estrutura em laço é o facto dos anticorpos que são produzidos terem, muitas vezes, baixa afinidade. Adicionalmente, uma vez que a hCG e a hLH são semelhantes nesta região da molécula (isto é, diferem apenas em três aminoácidos), espera-se que a imunização com este laço produza de anticorpos contra a hLH. De facto, ο B101, um anticorpo que se liga a esta região da molécula, tem uma afinidade inaceitavelmente elevada para a hLH.

Esforços recentes para identificar a estrutura terciária das hormonas glicoproteicas dependeram da caracterização dos sítios de ligação de painéis de anticorpos monoclonais (26). Foram identificados anticorpos que previnem a actividade biológica da hCG ou que 13 neutralizam apenas parcialmente a sua actividade biológica. Como esboçado no exemplo 7 da presente especificação, estes anticorpos e outros semelhantes podem ser utilizados para conceber imunogenes com o potencial de neutralizar a hCG mas não a hLH, utilizando o procedimento de selecção positiva e um de selecção negativa esboçado nos exemplos 6 e 7 apresentados abaixo. Não obstante a hormona ter sido cristalizada, pois uma estrutura cristalina seria muito importante para determinar os tipos de imunogenes que dariam origem a uma resposta imunológica de titulo elevado para partes particulares da molécula, dificuldades na resolução da estrutura cristalina excluíram esta abordagem. Assim, no presente estado do conhecimento da estrutura da hCG não há nenhum método bom que possa ser utilizado para prever o tipo de imunogene que seria mais eficaz.

Outro método útil para aumentar a fertilidade consiste em aumentar os níveis de actividade da FSH. Um modo de consegui-lo consiste em administrar doses pequenas de folitropinas de actuação prolongada • Estas podem ser preparadas acoplando moléculas com actividade de folitropina a moléculas com tempos de semi-vida longos no plasma (isto é, imunoglobulinas) ou preparando análogos de gonadotropinas de cadeia simples com actividade de folitropina (Tabelas 1 e 2) . Isoladamente, ou em combinação com anticorpos para a LH e/ou antagonistas da LH, estas hormonas facilitam o desenvolvimento do folículo em mulheres com doença do ovário poliquístico. A imunização passiva contra a LH tem potencial para estimular a super-ovulação em espécies de animais domésticos; todavia, a concentrações de anticorpos mais 14 14 elevadas, a imunização passiva e activa contra a LH bloqueia a ovulaçao (66). A Figura 1 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros na ligaçao de hLH etiquetada de forma radioactiva a receptores da LH. A Figura 2 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros na capacidade da hLH para induzir esteroidogénese in vitro. A Figura 3 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros na capacidade da hLH para induzir esteroidogénese in vivo. A Figura 4 mostra vectores que podem ser utilizados em estratégias de modelo/selecção por exclusão. A Figura 5 mostra os tipos de imunogenes com antigenicidade acrescida para utilização na imunização activa contra a LH, hCG ou FSH. o análogo "primers" A Figura 6 ilustra a sequência codificadora para #1 da gonadotropina de cadeia simples e (sublinhados). A Figura 7 ilustra a sequência codificadora para o análogo #2 da gonadotropina de cadeia simples e "primers" (sublinhados). A Figura 8 ilustra a sequência codificadora para o análogo #3 da gonadotropina de cadeia simples e "primers" (sublinhados). 15 A Figura 9 ilustra a preparação de uma região codificadora da subunidade alfa sem sequências de sinal oligossacaridicas. A Figura 10 ilustra a preparação de uma região codificadora da subunidade beta sem sequências de sinal oligossacaridicas ligadas a asn. A Figura 11 ilustra a sequência codificadora para o análogo #la da gonadotropina de cadeia simples. A presente invenção refere-se à utilização de um anticorpo não neutralizador que se liga à subunidade da hormona luteinizante e que reduz, mas não elimina, a actividade de hormonas glicoproteicas nos receptores da hormona luteinizante, mesmo que esteja presente numa concentração que lhe permita ligar-se a todas as referidas hormonas glicoproteicas presentes, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a estimular a fertilidade em mamíferos do sexo feminino por estimulação da produção da hormona estimulante do folículo. A presente invenção refere-se à utilização de anticorpos não neutralizadores que se ligam à subunidade da hormona luteinizante para aumentar a fertilidade ao reduzir, mas não eliminar, as actividades de hormonas glicoproteicas em circulação com actividade de lutropina (LH). Uma vez que moléculas com actividade de lutropina são essenciais para a fertilidade, esperar-se-ia que o bloqueio das suas actividades diminuísse, em vez de aumentar, a fertilidade. No entanto, verifica-se habitualmente que as lutropinas aumentam a produção de esteróides que conseguem 16 reduzir a secreção de folitropinas (FSH), hormonas que desempenham papéis importantes na fertilidade. Em consequência, a redução das actividades das lutropinas conduz a um aumento dos níveis de folitropinas e/ou das razões folitropina/ lutropina. Quando a actividade da LH é reduzida mas não abolida, o aumento da actividade da FSH e/ou da razão FSH/LH conduz a produção acrescida de gâmetas e fertilidade elevada em humanos e animais. A presente invenção também revela métodos novos de concepção e/ou selecção de anticorpos para porções específicas de proteínas, incluindo a LH e a gonadotropina coriónica humana (hCG), para permitir que as suas actividades biológicas sejam reduzidas para graus desejados. Apresentam-se aqui exemplos que ilustram como conceber anticorpos e imunogenes contra porções específicas de gonadotropinas seleccionadas, incluindo aqueles anticorpos e imunogenes com estruturas muito semelhantes. Os anticorpos e imunogenes terão aplicações para aumentar a fertilidade.

Adicionalmente, A presente invenção também se refere à preparação de moléculas que podem ligar-se a receptores da LH e FSH e que têm acções intensificadoras da fertilidade ou inibidoras da fertilidade, dependendo da altura da administração. Algumas destas são moléculas que irão ligar-se a receptores da LH e bloquear a acção da LH. Quando estas forem administradas na fase folicular, irão suprimir a actividade da LH, desse modo suprimindo a secreção de androgénios e estrogénios. Consequentemente, os níveis de FSH irão aumentar e a fertilidade será intensificada. Quando forem administradas após a ovulação e durante a fase luteinica do ciclo menstrual, irão suprimir a actividade da hCG e provocar o fim da gravidez. Adicionalmente, a presente invenção 17 refere-se à preparação de moléculas que têm a capacidade para inibir as acções da FSH e de FSH e LH. Estas moléculas serão úteis para tratar mulheres com tecido ovariano hiperactivo, muitas vezes em resultado da terapia com gonadotropinas. A hiper-estimulação do ovário é potencialmente fatal, e estes análogos ligam-se a receptores da FSH ou a receptores da FSH e LH, suprimindo o desenvolvimento suplementar do ovário.

De acordo com a presente invenção são proporcionadas aplicações para melhorar a fertilidade em humanos e animais através do método novo que consiste em inibir a actividade da lutropina utilizando imunização passiva ou activa. Estudos prévios mostraram que o bloqueio das acções da LH conduzirá à inibição da fertilidade. Mostra-se aqui que anticorpos apropriados para a LH podem ser utilizados para restabelecer ou estimular a fertilidade. Esta abordagem deve reduzir o risco de hiper-estimulação e permitir uma regulação mais normal da fertilidade com menos monitorização. São proporcionados vários métodos para produzir e testar os anticorpos ou anti-soros necessários para promover a fertilidade. São disponibilizados outros métodos para alterar a razão FSH/LH, incluindo métodos de administração de FSH ou de administração de anti-estrogénios. Contudo, o procedimento esboçado aqui baseado na utilização de anti-LH tem vantagens importantes relativamente a estes outros métodos. 0 grau de inibição máxima pode ser cuidadosamente determinado para cada anticorpo por realização de testes in vitro. Assim, independentemente da quantidade de anticorpo administrada, pode prevenir-se a inibição da actividade da LH abaixo de um nivel predeterminado por escolha apropriada 18 do anticorpo. Por exemplo, ο B105 reduz os níveis efectivos da hLH por um factor aproximadamente de 4, ao passo que o B110 irá reduzir os níveis efectivos da hLH por um factor aproximadamente de 2. A redução dos níveis da LH permitirá o aumento dos níveis da FSH. À medida que os níveis de FSH aumentam, provocarão o desenvolvimento folicular e a produção de estrogénios. Quando estes níveis tiverem atingido as concentrações fisiológicas características de desenvolvimento apropriado do folículo, irão inibir negativamente a secreção de mais FSH. Assim, o tratamento descrito aqui retém os aspectos muito importantes de auto-regulação ausentes em métodos existentes, que dependem da administração de FSH ou de anti-estrogénios para estimular a fertilidade. Suplementarmente, ao contrário da indução da ovulação com GnRH (hormona de libertação de gonadotropinas) ou de análogos da GnRH, o método baseado em anti-LH não requer a infusão pulsátil de uma hormona ou análogo de hormona. Este tratamento oferece a vantagem potencial de um único ou, no máximo, de poucos tratamentos durante vários dias. Isto será particularmente importante na regulação da ovulação em humanos ou animais. Em humanos, este método deve ser muito apropriado para o tratamento de doença do ovário poliquístico, muitas vezes caracterizada por níveis inapropriadamente elevados de LH. À medida que os níveis de LH forem reduzidos, os níveis de FSH irão aumentar e ocorrerá desenvolvimento do folículo. No entanto, à medida que ocorre o desenvolvimento do folículo, os níveis crescentes de estrogénios irão bloquear a secreção de FSH adicional. Assim, a tendência para promover o desenvolvimento de demasiados folículos, com as suas potenciais consequências perigosas, será minimizada. 19

Também são aqui proporcionados métodos para produzir um imunogene especifico que se baseiam na utilização de anticorpos modelo e de exclusão. A utilização destes anticorpos permitirá conceber uma resposta imunológica especifica para dominios particulares de uma proteína. Este método terá aplicação na indução ou inibição da fertilidade, como ilustrado aqui. Uma vez que anticorpos contra a hCG podem inibir o crescimento tumoral, este método também deve ser útil para conceber vacinas necessárias para inibir o desenvolvimento ou progressão de tumores que segregam a hCG. 0 método também deve ser aplicável em qualquer sistema onde seja necessário um imunogene específico. Não há nada de único na estrutura dos anticorpos que os torne úteis para induzir fertilidade para além do facto de se ligarem à hLH ou outra LH. Assim, será de esperar que porções dos anticorpos que retêm a capacidade para se ligarem à LH também tenham actividade semelhante. Estes incluem fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 ou anticorpos de cadeia simples. 0 fragmento Fab é uma porção de um anticorpo que contém o sítio de ligação de antigenes e é gerado por digestão com papaína. 0 fragmento F(ab'>2 é uma porção de um anticorpo que contém dois sítios de ligação de antigenes e é gerado por digestão com pepsina.

Preferivelmente, as administrações da composição farmacêutica para aumentar a fertilidade são efectuadas durante a fase folicular do mamífero e, mais preferivelmente, durante a fase folicular do ciclo menstrual. 20 A hormona glicoproteica a ser regulada na presente invenção é um reagente numa reacção entre correspondentes de ligação. Os correspondentes de ligação são proteínas que têm afinidade de ligação específica entre si. Um correspondente de ligação é um agente apto a ligar-se seleccionado do grupo que consiste num antigene e um hapteno. 0 agente apto a ligar-se preferido é um antigene. O outro correspondente de ligação é um agente de ligação seleccionado do grupo que consiste num anticorpo e uma proteína de ligação específica. 0 agente de ligação preferido é um anticorpo.

Antigenes são substâncias que são capazes, em condições apropriadas, de induzir a formação de anticorpos e de reagir especificamente, de alguma forma detectável, com os anticorpos induzidos desse modo. Antigenes podem ser substâncias solúveis, como toxinas e proteínas estranhas, ou substâncias em partículas, como bactérias ou células de tecidos. Em geral, antigenes são substâncias de elevado peso molecular, tais como proteínas e hidratos de carbono simples e conjugados.

Anticorpos são moléculas de imunoglobulinas com uma sequência de aminoácidos específica que lhes permite interagir apenas com o antigene que induziu a sua síntese em tecido linfóide ou com um antigene intimamente relacionado com esse antigene. Imunoglobulinas são proteínas constituídas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas.

Os anticorpos não neutralizadores utilizados na presente invenção podem ser administrados a mamíferos, por exemplo, animais ou humanos, em quantidades eficazes para conferirem a actividade desejada. Uma vez que a actividade 21 dos compostos e o grau do efeito terapêutico desejado variam, o nivel de dosagem do composto empregue também irá variar. A dosagem real administrada também será determinada por factores geralmente reconhecidos, tais como o peso corporal do paciente e a hiper-sensibilidade individual do paciente particular. Assim, a dosagem unitária para um paciente particular (homem) pode variar desde uma dosagem tão baixa quanto cerca de 0,1 g por kg de peso corporal, que o técnico pode titular para obter o efeito desejado. Uma dose minima preferida para a titulação é 1 g/kg de peso corporal. A presente invenção é suplementarmente ilustrada pelos exemplos seguintes que não se pretende que limitem o âmbito efectivo das reivindicações. Todas as partes e percentagens presentes nos exemplos e ao longo da especificação e reivindicações são por peso da composição final, a menos que especificado em contrário.

Apesar de métodos de vacinação e de métodos para conceber uma vacina destinada a estimular a fertilidade em mamíferos não estarem abrangidos pela presente invenção, mantêm-se os Exemplos que se referem ao desenvolvimento de antigenes eficazes na indução de anticorpos para a LH, incluindo Exemplos que se referem a análogos úteis como compostos de partida para a concepção de vacinas, pois essa revelação ilustra a concepção de imunogenes para induzirem anticorpos úteis na presente invenção.

Agentes de ligação que reduzem as actividades biológicas da hormona luteinizante e da gonadotropina coriónica humana, para permitir a redução das suas actividades biológicas para niveis desejados. 22

Exemplo 1

Utilização de anticorpos anti-LH para induzir fertilidade

Uma vez que alguns anticorpos anti-hormonas inibem a actividade biológica das hormonas prevenindo a ligação da hormona a receptores ou aumentando o seu metabolismo, serão úteis para reduzir o nível de hormona activa em circulação. Anticorpos para a LH são capazes de aumentar a razão entre FSH e LH biologicamente activas em circulação. Em parte, isto deve-se ao facto de reduzirem a actividade da LH. Adicionalmente, uma vez que a LH é uma hormona que estimula a síntese de substratos esteróides que podem ser convertidos em estrogénios (4), o decréscimo da actividade da LH será acompanhado de um decréscimo de estrogénios. 0 decréscimo dos níveis de estrogénios irá reduzir a inibição da secreção de FSH, e os níveis da FSH irão aumentar. Em consequência, em indivíduos do sexo feminino, o desenvolvimento folicular será aumentado. Nos indivíduos do sexo masculino, a espermatogénese será aumentada. Nem todos os anticorpos têm a capacidade para reduzir os níveis da LH de uma forma não neutralizadora. Anticorpos que neutralizam completamente as acções da LH irão impedir a fertilidade a menos que sejam administrados de um modo limitador (isto é, a quantidade total de anticorpo administrada é inferior à quantidade total da LH em circulação); em consequência, não estão incluídos no âmbito da presente invenção. Os anticorpos não neutralizadores são preferidos para aumentar a fertilidade uma vez que podem ser administrados numa quantidade em excesso relativamente à quantidade total de LH. Estão incluídos no âmbito da invenção. Assim, mesmo que a maior parte da LH possa estar ligada aos anticorpos, a actividade da LH é reduzida mas não neutralizada. Uma vez que há LH mais do que suficiente para o desenvolvimento do 23 folículo, a redução parcial da actividade da LH não evita o desenvolvimento do folículo. Adicionalmente, a quantidade acrescida de estrogénios que é produzida à medida que aumenta o desenvolvimento do folículo irá imitar o controlo de realimentação normal da secreção da FSH, prevenindo a hiper-estimulação do ovário. A administração de 10 g - 10 mg de anticorpo de afinidade elevada (isto é, Ka > 5 χ 107 M-1) será suficiente para induzir fertilidade em mulheres com doença do ovário poliquístico. A identificação e caracterização de anticorpos apropriados são ilustradas no exemplo 2.

Exemplo 2

Identificação e selecção dos melhores anticorpos para a LH

Nem todos os anticorpos que inibem a actividade da LH serão igualmente úteis para o tratamento de infertilidade. Por exemplo, concentrações elevadas em excesso de anticorpos como ο B101, que se ligam à hCG e LH (apesar de o fazerem com afinidade mais baixa) , podem prevenir a ligação das hormonas a receptores da LH (22). Quando presentes em excesso, os anticorpos que previnem a ligação da LH ou hCG aos seus receptores "neutralizam" a actividade biológica da hormona. Se bem que a neutralização da LH seja seguida de um decréscimo dos níveis de androgénios e estrogénios e de um aumento dos níveis da FSH, uma vez que a LH é necessária para a fertilidade, a redução da actividade da LH abaixo do nível mínimo necessário para a fertilidade irá evitar a fertilidade, desde que esteja presente um excesso do anticorpo. De facto, foi mostrado que anticorpos neutralizadores ou antigenes que induzem a produção de anticorpos neutralizadores inibem a fertilidade em animais (10). Seria possível administrar quantidades 24 limitadas de anticorpos neutralizadores para reduzir as concentrações da LH para um nível predeterminado ou para inverter o efeito inibidor de um anticorpo neutralizador por administração de um anticorpo anti-idiotípico. No entanto, devido às variações entre indivíduos, seria difícil determinar a quantidade de anticorpo necessária para obter o efeito desejado a menos que fosse desejada inibição quase completa da actividade da LH ou a menos que fossem efectuadas medições da FSH e/ou função gonadal (por exemplo, determinando os níveis de esteróides no plasma). Se bem que sejam exequíveis, a necessidade de efectuar estas medições reduz o carácter atractivo da utilização de anticorpos que neutralizam completamente a actividade da LH para aumentar a fertilidade. Também poderiam administrar-se anticorpos neutralizadores para prevenir a acção da LH temporariamente até os níveis da FSH terem aumentado. Então, o anticorpo neutralizador em excesso poderia ser removido administrando um anticorpo anti-idiotípico para neutralizar anticorpos anti-LH, com a finalidade de restabelecer a fertilidade, ou ultrapassando o efeito do anticorpo utilizando LH ou CG, ou utilizando uma quantidade de anticorpo que fosse suficientemente degradada para permitir a acção do aumento súbito da LH a meio do ciclo. No entanto, esta abordagem é mais complexa do que a utilização de anticorpos não neutralizadores ilustrada abaixo.

Os anticorpos utilizados na presente invenção inibem a actividade da LH mas não conseguem bloquear completamente a sua acção, mesmo quando presentes em concentrações suficientes para se ligarem à totalidade da LH presente na circulação. Estes anticorpos são habitualmente capazes de se ligarem à hormona livre, bem como a complexos hormona- 25 receptor. Inibem a acção da hormona ao diminuírem a afinidade da hormona para o seu receptor, ao reduzirem a actividade da hormona ligada e/ou ao aumentarem a eliminação da hormona . Exemplos desses anticorpos incluem Β105 e B110. Estes anticorpos reduzem as actividades biológicas das hormonas em extensões diferentes (17) e podem ser adquiridos à Universidade de Columbia, Nova Iorque, NI, ou UMDNJ-Escola Médica de Robert Wood Johnson, Piscataway, NJ. Outros anticorpos comercialmente disponíveis incluem 518B7 (disponibilizado pela Dr. Janet Roser, Universidade da Califórnia em Davis, Davis, CA) e ZMCG7 (disponibilizado pela Pierce Chemical Co., 3747 North Meridian Road, Rockford, IL). Uma vez que complexos destes anticorpos com a hCG podem ligar-se a receptores, o grau de inibição é limitado mesmo na presença de um excesso maciço de anticorpo. A quantidade de inibição pode ser determinada a partir de ensaios in vitro simples antes da sua utilização in vivo. Por exemplo, verificou-se que um excesso maciço de B110 reduz a actividade da hCG apenas em cerca de metade, ao passo que um excesso maciço de B105 reduziu a actividade da hCG em cerca de três quartos. Cada um destes anticorpos liga-se à hLH, sendo de esperar que tenham a mesma influência sobre a actividade da hLH.

Pode proceder-se do modo seguinte à identificação de anticorpos apropriados a partir de um painel de anticorpos monoclonais preparados contra a hLH. Estes anticorpos podem ser obtidos por procedimentos comuns (22, 27-32) imunizando ratinhos com hLH, hCG ou LH de outras espécies, fragmentos de LH ou hCG, LH ou hCG parcialmente ou completamente desglicosilada ou análogos da LH ou hCG capazes de induzirem uma resposta imunológica para a espécie desejada de LH. Estes anticorpos também podem ser obtidos por 26 selecção de anticorpos artificiais (33-36). Esta mesma estratégia pode ser utilizada para identificar anticorpos para a LH de virtualmente qualquer outra espécie. Também pode ser utilizada para identificar anti-soros com propriedades semelhantes. Estes anti-soros podem ser produzidos em resposta a análogos da LH ou hCG ou podem ser obtidos por adsorção imunológica ou remoção de componentes de anticorpos indesejáveis.

Podem identificar-se anticorpos possuindo as caracteristicas inibidoras desejadas medindo as suas capacidades para inibir a ligação da LH a receptores da LH. Este tipo de ensaio pode ser efectuado pelo experimentado na área respeitante à medição da ligação de receptores, e o exemplo seguinte refere-se ao modo como é possível seleccionar anticorpos para a hLH. Claramente, isto também é aplicável a qualquer espécie de LH para a qual estejam disponíveis anticorpos. Uma vez que a hLH se liga bem a receptores da LH de roedores, não é necessário utilizar no ensaio receptores da LH humana, apesar dos receptores da LH humana também funcionarem. Um primeiro passo simples consiste em monitorizar a influência do anticorpo na ligação de hLH etiquetada de forma radioactiva a receptores da LH luteínicos do ovário de rato. Pode preparar-se a hLH etiquetada de forma radioactiva incubando 10 g de hLH com 500 Ci de Na125I, durante 30 segundos a 4 °C, num pequeno tubo de vidro que foi revestido com 1,5 g de Iodo-Gen® (Pierce Chemical Co.). A 125I-hLH e 125I que não reagiu são separados por filtração em gel. Podem preparar-se os receptores administrando 50 IU de gonadotropina do soro de

éguas prenhas, também conhecida como PMSG ou CG equina (obtida da Sigma Chemical Co., St. Louis MO) a ratos Sprague-Dawley fêmeas com 23-26 dias de idade. A PMSG 27

estimula o desenvolvimento do foliculo. Aproximadamente 56-65 horas mais tarde, os animais recebem 25 IU de hCG (também obtida da Sigma Chemical Co.), para provocar a formação de corpos lúteos. Os ovários altamente luteinizados são removidos uma semana depois e são homogeneizados num tampão contendo Tris 40 mM (pH 7,4) e MgCl2 5 mM. Recolhe-se uma fracção nuclear e membranar em bruto do homogenato por centrifugação do homogenato a 1000 x g durante 2 0 minutos a 4 °C. Esta é lavada uma vez por nova suspensão no tampão Tris - MgCl2 e sedimentando-a novamente a 1000 χ g durante 20 minutos a 4 °C. O grânulo final (denominado "grânulo do homogenato ovariano") é novamente suspenso no tampão Tris - MgCl2 utilizando um volume de 2 ml por cada ovário presente no inicio da homogeneização. Uma quantidade de grânulo do homogenato ovariano aproximadamente igual a 1/20 de um ovário (isto é, aproximadamente 5 mg de material em 100 1 de tampão) é

adicionada a tubos contendo aproximadamente 1-2 ng de hLH iodada de forma radioactiva (isto é, aproximadamente 100 000 cpm) e quantidades diferentes de anticorpo (isto é, variando desde 1 pg até 10 g ou mais) . Depois dos tubos terem sido incubados durante o tempo suficiente para permitir que a LH etiquetada de forma radioactiva se ligue aos receptores (isto é, 30-60 minutos a 37 °C ou durante a noite à temperatura ambiente) , as etiquetas radioactivas ligadas aos receptores e livres são separados diluindo a mistura reaccional para 2 ml com solução de NaCl a 0,9%, centrifugando a mistura e aspirando o sobrenadante. Determina-se a quantidade de hLH etiquetada de forma radioactiva ligada a receptores da LH ovarianos de rato analisando o grânulo num contador gama. Seria de esperar observar os tipos de inibição mostrados na Figura 1. Alguns anticorpos inibirão completamente a ligação da hLH 28 etiquetada de forma radioactiva na mesma extensão de um excesso maciço de hLH ou hCG não etiquetada, ao passo que outros não irão inibir a ligação ou poderão mesmo potenciar a ligação quando presentes um vasto excesso molar relativamente à hLH etiquetada de forma radioactiva. Estes dois tipos de anticorpos são menos desejáveis do que aqueles anticorpos que suprimem a ligação da hLH num nivel intermédio (comparar Figura 1). Assim, os anticorpos mais úteis irão inibir a ligação da LH etiquetada de forma radioactiva mas não tanto quanto um excesso maciço de LH não etiquetada. Anticorpos que inibem a ligação da LH etiquetada de forma radioactiva tanto quanto um excesso maciço de LH não etiquetada também serão úteis, mas serão necessários cuidados maiores para assegurar que o anticorpo não irá suprimir demasiado a actividade da LH quando utilizado in vivo. Se for neutralizada demasiada actividade da LH aquando do aumento súbito da LH, resultará infertilidade. causam produção

Outro procedimento útil para identificar anticorpos com a capacidade desejada para reduzir a actividade da LH consiste em efectuar um teste in vitro para determinar se os anticorpos inibem o efeito da hLH sobre a biossintese de esteróides. Neste ensaio podem utilizar-se testículos de roedores machos. Um exemplo típico que utiliza a hLH está ilustrado na Figura 2. Prepara-se uma suspensão de células de Leydig de rato em bruto utilizando colagenase como descrito (37) e incubam-se as células com quantidades variáveis de LH e dos anticorpos a serem testados. Passadas aproximadamente 2-4 horas a 37 °C, mede-se o teor de testosterona dos tubos por radioimunoensaio. Quando concentrações crescentes de hLH são incubadas com as células de Leydig, causam produção acrescida de 29 testosterona e darão origem a uma curva de resposta à dose típica, na qual concentrações de hLH de 1-10 pM serão suficientes para aumentar a produção de esteróides em aproximadamente 50% do nível máximo (ver Figura 2, curva A) . Os anticorpos mais úteis são identificados pela sua capacidade para inibir a esteroidogénese induzida pela LH. Quando se adicionam à LH diferentes anticorpos monoclonais antes da hormona ser adicionada às células, verificar-se-á que alguns reduzem a capacidade da LH para estimular a formação de testosterona. Os anticorpos inibidores mais úteis irão deslocar a curva de resposta à dose para valores de menor sensibilidade (ver Figura 2, curvas B e C). Se bem que o grau do deslocamento dependa inicialmente da concentração do anticorpo, um excesso maciço de anticorpo (isto é, mais de 100 vezes maior do que a quantidade máxima de hLH utilizada) não irá prevenir a formação de testosterona induzida pela LH. Os anticorpos menos úteis irão prevenir a estimulação da formação de testosterona quando o anticorpo estiver presente num excesso molar de 100 vezes (ver Figura 2, curva D). Este tipo de ensaio irá detectar anticorpos que inibem a actividade da LH ao reduzir a sua ligação a receptores da LH e também irá detectar anticorpos que inibem a actividade da LH ligada. Exemplos de anticorpos úteis incluem B105, B110, 518B7 e ZMCG7, mencionados acima. Será necessário modificar estes anticorpos como descrito abaixo antes de poderem ser utilizados repetidamente em mulheres.

Depois de anticorpos ou anti-soros terem sido seleccionados e de se ter verificado que satisfazem os critérios descritos acima e ilustrados nas Figuras 1 e 2, devem ser testados quanto à sua capacidade para inibir as acções da LH in vivo. Administra-se a ratos machos um grande excesso de anticorpo (isto é, 100 g ou mais). Vinte 30 minutos depois, alguns dos ratos são tratados com veiculo isoladamente (controlo) e outros recebem hLH ou LH de estrutura semelhante ou igual à do animal onde o anticorpo se destina a ser utilizado. Uma hora mais tarde medem-se os níveis de testosterona no plasma por radioimunoensaio. Um exemplo típico está ilustrado na Figura 3. Os anticorpos ou anti-soros úteis na presente invenção irão reduzir a potência da hLH mas não irão prevenir a sua actividade, mesmo quando presentes em excesso relativamente à quantidade total de LH administrada. Este ensaio irá detectar anticorpos que reduzem a actividade da hormona ao inibirem a ligação da LH a receptores, ao inibirem a actividade da LH ligada e/ou ao aumentarem a eliminação da LH. Independentemente da causa da inibição in vivo, os anticorpos ou anti-soros úteis na presente invenção não irão prevenir a actividade de níveis elevados de LH mesmo quando estão presentes em excesso relativamente à LH em circulação. Este efeito pode ser monitorizado medindo a capacidade do soro para se ligar à hLH iodada de forma radioactiva após a administração do anticorpo. Uma amostra de soro (0,01 - 1 1) é diluída para 25 1 com uma solução contendo NaCl a 0,9%, 1 mg/ml de albumina do soro bovino e tampão de fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,2). A este sistema adicionam-se 25 1 de LH iodada de forma radioactiva (aproximadamente 50 nCi contendo aproximadamente 1 ng) . A solução resultante é incubada durante 30 minutos a 37 °C. Adiciona-se uma solução de imunoglobulina G (IgG) de cabra anti-ratinho (disponibilizada pela Cappel, Organon Teknia Corp., West Chester, PA) contendo 2 g de IgG em 50 1 da solução de NaCl-albumina descrita acima e incuba-se a solução resultante durante 90 minutos a 37 °C ou durante a noite a 4 °C. A esta solução adicionam-se 100 1 de IgGsorb 1% (obtido da The Enzyme Center, Inc., 36 Franklin St., 31

Malden, MA) reconstituídos em água. Esta suspensão é misturada durante 30 minutos a 22 °C e depois é diluída por adição de 3 ml da solução de NaCl-albumina, que está gelada. Centrifuga-se a mistura durante 10 minutos a 2000 χ g a 4 °C. Aspira-se o sobrenadante e mede-se a radioactividade do grânulo num contador gama. Como controlo negativo utiliza-se soro de um animal que não foi imunizado de forma activa nem passiva. Como controlo positivo utilizam-se 0,1 - 1 ng do anticorpo que foi originalmente injectado no animal. A radioactividade medida no grânulo do controlo negativo é subtraída da medida no controlo positivo e da medida em grânulos das amostras de soro que estão a ser testadas. Quando se comparam os valores resultantes para o controlo positivo e para as amostras de soro, o soro que contém anticorpo em excesso relativamente à LH será capaz de precipitar imunologicamente pelo menos 1%-10% da LH iodada de forma radioactiva como controlo positivo. A administração de anticorpos para a hLH em humanos irá reduzir as concentrações efectivas da LH em circulação. A quantidade máxima de redução depende da localização do sítio de ligação do anticorpo na LH. A redução da actividade da LH diminui a secreção de hormonas do ovário e testículos e, desse modo, reduz a inibição de realimentação da FSH. Em consequência, os níveis de FSH aumentam e a fertilidade é intensificada. Anticorpos para a hLH que reagem de forma cruzada com LH de outra espécie ou anticorpos que foram seleccionados pela sua capacidade para se ligarem à LH de outra espécie e que reduzem, mas não eliminam, a actividade da hormona terão efeitos semelhantes na outra espécie. Os anticorpos mais apropriados para serem utilizados em humanos serão aqueles que têm regiões de 32 arcabouço ("framework") e constantes semelhantes às imunoglobulinas humanas e que, por eles próprios, não são antigénicos ou são apenas fracamente antigénicos quando injectados em humanos. Podem preparar-se anticorpos adequados "humanizando" anticorpos monoclonais de ratinho (isto é, substituindo as regiões de arcabouço e constantes de ratinho por sequências semelhantes presentes em imunoglobulinas humanas). Procedimentos para fazê-lo são bem conhecidos na área (38-40). Outros métodos de preparação de anticorpos adequados incluem imunização de primatas, como o macaco Cynomolgus (41), seguido de isolamento e clonagem de linfócitos isolados (42). As imunoglobulinas destes primatas têm regiões de arcabouço semelhantes às imunoglobulinas humanas. Anticorpos monoclonais preparados a partir destes animais devem servir como bom ponto de partida para anticorpos que possam ser utilizados em humanos.

Exemplo 3 Métodos alternativos para obter e seleccionar anticorpos desejados

Muitos anticorpos que são capazes de inibir parcialmente a actividade da hLH têm propensão para se ligarem à hLH ou outras moléculas de LH que foram adsorvidas em superfícies de plástico ou outras superfícies. Em consequência, o rastreio de anticorpos desejados é muitas vezes facilitado pela monitorização da capacidade dos anticorpos para se ligarem à hLH ou outra LH que esteja adsorvida em placas de microtítulo de plástico ou a LH que esteja ligada a complexos LH receptor. Pode efectuar-se do modo seguinte o rastreio de anticorpos que se ligam à hLH que está adsorvida numa superfície de 33 plástico. As cavidades de uma placa de microtítulo de plástico são revestidas com 50 1 de uma solução contendo 0 ou 1 g de hLH em NaCl 0,9% - tampão de fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,2). Isto permite que a hLH seja adsorvida na superfície da placa de microtítulo. Após 1 hora a 37 °C, as soluções são removidas e substituídas por 200 1 de NaCl 0,9% - tampão de fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,2) contendo 200 g de albumina do soro bovino durante mais de 1 hora a 37 °C. Com este passo, a maior parte dos sítios de adsorção remanescentes é preenchida. A solução de albumina é removida e substituída por 50 1 de NaCl 0,9% - tampão de fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,2) contendo 50 000 - 100 000 dpm do anticorpo monoclonal de teste etiquetado com 125I. A etiquetagem do anticorpo monoclonal é efectuada utilizando Iodo-Gen ou outro agente oxidante (22, 43) como descrito acima para a LH utilizando 10 g de anticorpo e 500 Ci de Na125I, com a excepção do tempo reaccional ser prolongado para 1-5 minutos. Após 1 hora a 37 °C, remove-se o fluido e mede-se a radioactividade ligada à superfície da placa de microtítulo num contador gama. Verificar-se-á que os anticorpos com uma probabilidade elevada de serem úteis para inibir a actividade da hLH estarão ligados às cavidades revestidas com hLH em maior quantidade do que os ligados às cavidades não revestidas com hLH. Este ensaio também irá detectar outros tipos de anticorpos, devendo realizar-se um rastreio suplementar dos anticorpos positivos como esboçado abaixo ou como no exemplo 2.

Se bem que a ligação a complexos LH-receptor não garanta que um anticorpo seja útil para neutralizar parcialmente a actividade da LH, muitos dos anticorpos utilizados na presente invenção ligam-se a complexos LH-receptor. Assim, é possível rastrear inicialmente 34 anticorpos desejáveis medindo a sua capacidade para se ligarem a complexos LH-receptor. Este ensaio é essencialmente igual ao Bio-IRMA que foi descrito previamente (44) e pode ser conduzido de uma forma sequencial ou simultânea. No Bio-IRMA simultâneo, adicionam-se 0,025 Ci - 0,1 Ci do anticorpo de teste iodado de forma radioactiva (isto é, preparado como descrito acima) a um homogenato ovariano de rato (isto é, preparado como descrito acima) e quantidades crescentes de LH, incluindo 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 e 1000 ng. Após 1 hora a 37 °C, a parte membranar do homogenato é sedimentada num grânulo por centrifugação a 1000 χ g durante 10-20 minutos, o sobrenadante é aspirado e a radioactividade do grânulo é determinada num contador gama. Os anticorpos que se ligam a complexos LH receptor serão detectados pela sua capacidade acrescida para se ligarem a membranas incubadas com pelo menos uma das concentrações de LH relativamente ao ensaio em branco (isto é, sem LH adicionada) . No Bio-IRMA sequencial, as membranas são primeiramente incubadas com a LH durante 1 hora a 37 °C, são lavadas por centrifugação e aspiração como descrito acima e depois são incubadas com 50 000 - 100 000 dpm de anticorpo iodado de forma radioactiva. Após uma incubação adicional durante 1 hora a 37 °C, as fracções de anticorpo ligado e livre são separadas por centrifugação e aspiração como descrito acima e a radioactividade do grânulo é contada num contador gama. Os anticorpos mais úteis ligar-se-ão aos complexos LH-receptor. No entanto, este procedimento é apenas um método de rastreio útil; um teste mais conclusivo de um anticorpo envolve a utilização de um ensaio biológico in vitro, como o baseado na formação de testosterona que é descrito no Exemplo 2. 35 A propensão dos anticorpos mais úteis para se ligarem a superfícies que contêm LH ou a complexos de LH e receptores da LH também pode facilitar o isolamento de linfócitos após imunização de macacos ou ratinhos utilizando um procedimento de aderência sobre plástico ("panning"). Neste procedimento, adicionam-se linfócitos a superfícies de plástico que foram revestidas com albumina do soro humano, ou outra proteína que evite a ligação inespecífica, expondo-as a soluções contendo 1 mg/ml de albumina do soro humano em NaCl 0,9% - tampão de fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,2) durante mais de 1 hora a 37 °C. Em seguida, os linfócitos que não se ligam a estas superfícies são adicionados a superfícies que são revestidas expondo-as a hLH e depois a albumina do soro humano como acima. A quantidade de hLH utilizada não é crítica, desde que material suficiente tenha ficado adsorvido no plástico. Isto pode ser conseguido utilizando 20-50 g de hLH/ml. Contudo, quantidades menores e maiores também funcionarão. Os linfócitos que se ligam a superfícies revestidas com LH são seleccionados e são submetidos quer a fusão com células de mieloma para preparar hibridomas (30), transformação com Epstein-Barr ou outro vírus, clonagem em fagos lambda (36) ou então células isoladas são seleccionadas para clonagem por reacção em cadeia de polimerase (42). Os anticorpos que são produzidos são sujeitos a rastreio como esboçado no exemplo 2. Estas estratégias aumentam a percentagem de anticorpos que serão desejáveis.

Também podem seleccionar-se muitos anticorpos que são capazes de inibir parcialmente a LH por intermédio de um processo que depende da sua capacidade para se ligarem a LH que está ligada a receptores da LH. Após a imunização de ratinhos ou macacos com hLH, as células do baço e outros 36 linfócitos são isolados e dispostos em camadas em monocamadas de células eucarióticas que expressam receptores da LH. Estas monocamadas de células podem ser preparadas por transfecção das células com vectores de expressão capazes de expressar cDNA de receptores da LH de rato (45), humano (46), porcino (47) ou outro por métodos comuns na área (48, 49). Os linfócitos que aderem às monocamadas são deitados fora. Os linfócitos que não aderem às monocamadas são adicionados a monocamadas de células semelhantes que expressam receptores da LH contendo hLH ou outra LH. Estas podem ser preparadas adicionando 100 ng de hLH ou outra LH às monocamadas durante a noite a 4 °C e removendo por lavagem a hormona que não se ligou. Os linfócitos que aderem a estas células são seleccionados e são submetidos quer a fusão com células de mieloma para preparar hibridomas (30), transformação com Epstein-Barr ou outro virus ou clonagem por reacção em cadeia de polimerase (42). Os anticorpos que são produzidos são sujeitos a rastreio como esboçado no exemplo 2. Estas estratégias também irão aumentar a percentagem de anticorpos que serão desejáveis. Apesar desta estratégia à base de receptores ser mais fastidiosa do que uma estratégia baseada no rastreio de linfócitos em superfícies de plástico revestidas com LH, irá originar uma percentagem mais elevada de anticorpos úteis.

Exemplo 4

Utilização de anticorpos para tratar a síndroma do ovário poliquístico A síndroma do ovário poliquístico (PCO) caracteriza-se por desenvolvimento incompleto do folículo e por incapacidade de uma mulher para ovular normalmente. O ovário contém muitos folículos imaturos pequenos, em que 37 poucos, se é que algum, progride até ao ponto da ovulação na ausência de intervenção clinica. Muitas vezes, estas mulheres têm níveis elevados de androgénios e uma razão elevada de LH/FSH relativamente a mulheres férteis com ciclos normais. Há dois procedimentos principais para induzir a ovulação em mulheres com PCO. Estes incluem a administração de FSH para induzir rapidamente o desenvolvimento do foliculo ou de anti-estrogénios para facilitar a secreção de FSH pela glândula pituitária anterior. Não obstante ambos os tratamentos conseguirem induzir a ovulação, têm o risco de induzir ovulações múltiplas, pois contornam a realimentação negativa normal de estrogénios que regula a secreção da FSH. Em resultado, mulheres tratadas com estes agentes são habitualmente monitorizadas de forma cuidadosa para prevenir a hiper-estimulação, um efeito secundário do tratamento potencialmente letal. A administração de 10 g - 10 mg de um anticorpo não neutralizador para a LH que provoque um aumento transitório e auto-limitador da secreção de FSH induzirá ovulação com menos riscos de hiper-estimulação do que o tratamento com gonadotropina. O efeito é transitório porque o anticorpo será metabolizado ou será eliminado da circulação de qualquer outro modo, perdendo-se a sua eficácia em 1-2 semanas após a administração. O tratamento é auto-limitador porque o efeito de realimentação negativa do estradiol sobre a secreção de FSH não será eliminado. Assim, à medida que os níveis de FSH aumentam e estimulam o desenvolvimento do foliculo, a secreção de estradiol irá aumentar e inibir aumentos suplementares da secreção de FSH.

Exemplo 5 38

Indução da ovulação por tratamento com uma ou duas doses Não há métodos bons que possam ser utilizados para induzir a ovulação em mulheres com PCO que envolvam apenas um tratamento simples ou duplo. A maior parte dos tratamentos desta síndroma requer múltiplos tratamentos com FSH, FSH mais LH ou hCG, hMG, ant i-estrogénios, GnRH ou várias combinações destes agentes. Algumas abordagens também empregaram antagonistas da GnRH para reduzir os níveis em circulação de LH e FSH, de modo que foi possível induzir ovulação por tratamento com hormonas exógenas. Uma única administração de uma concentração elevada do anticorpo do tipo descrito e utilizado aqui pode induzir a ovulação. Isto deve-se ao facto do anticorpo poder ser administrado de forma segura num excesso maciço e ao facto, uma vez que os anticorpos têm tempos de semi-vida longos no plasma, do anticorpo continuar a ser eficaz no aumento dos níveis da FSH durante vários dias. Devido ao efeito de realimentação natural do estradiol sobre a secreção de FSH, a secreção de FSH será controlada pelos estrogénios produzidos pelo folículo à medida que o folículo se desenvolve. Quando o folículo dominante tiver sido seleccionado e os níveis de estradiol tiverem aumentado, grande parte do anticorpo terá sido eliminado da circulação. 0 anticorpo não irá interferir com as acções do aumento súbito da LH necessárias para a ovulação por um ou mais de vários motivos. Em primeiro lugar, a quantidade de LH libertada é excessiva relativamente à quantidade necessária para a ovulação. Em segundo lugar, o anticorpo só irá reduzir a actividade da LH, não irá neutralizá-la. E em terceiro lugar, quando ocorrer o aumento súbito da LH, grande parte do anticorpo terá sido eliminada da 39 circulação. Assim, ao tratamento com o anticorpo seguir-se-á o desenvolvimento do foliculo e a ovulação.

Exemplo 6

Antigenes que induzem anti-soros inibidores apropriados A administração de anticorpos apropriados ilustrada no Exemplo 1 pode ser utilizada para aumentar a fertilidade. No entanto, uma vez que esta imunização é "passiva", irá requerer a administração repetida de anticorpo para manter os níveis do anticorpo elevados durante mais do que vários dias ou semanas. 0 aumento a curto prazo (por exemplo, dias) é suficiente para induzir a ovulação em mulheres ou para aumentar o número de ovulações em animais num ou nalguns ciclos. Quando for desejado suprimir parcialmente a actividade da LH e, desse modo, aumentar a fertilidade durante períodos de tempo mais longos ou durante vários ciclos, é útil induzir uma resposta imunológica que cause a formação activa de anticorpos contra a LH. Para obter os anticorpos mais úteis é necessário conceber um imunogene capaz de induzir uma resposta a uma porção da molécula da LH semelhante à reconhecida pelo B105, B110 ou outros anticorpos que formam complexos com a LH que retêm alguma actividade da LH. Imunogenes apropriados são derivados da subunidade da LH, uma vez que esta subunidade é única da LH. A subunidade é comum à LH, TSH e FSH. A sua conformação parece diferir ligeiramente nas hormonas (21); em consequência, também podem preparar-se anticorpos úteis contra a subunidade . No entanto, a sua utilização não está abrangida na presente invenção, uma vez que anticorpos para a subunidade alfa têm o potencial de inibir as acções das três hormonas. Se a resposta imunológica for dirigida contra a hFSH, poderá não aumentar a fertilidade e poderá 40 causar infertilidade. Quando for desejável imunizar activamente mulheres contra a hLH para aumentar a fertilidade, deve ter-se o cuidado de prevenir a indução de anticorpos para a hCG. Anticorpos para a hCG têm o potencial de reduzir a fertilidade (ver abaixo). Habitualmente, isto não é um problema da imunização passiva descrita acima, uma vez que os anticorpos administrados para a LH são usualmente eliminados da circulação antes da altura da hCG ser necessária para a fertilidade.

Antigenes capazes de induzir a formação de anticorpos contra uma porção da LH que não neutralize a sua actividade (isto é, a resposta imunológica desejada) contêm uma sequência derivada de uma porção da subunidade da LH. Muitas vezes, esta região da subunidade beta permanece exposta depois da LH se ligar a receptores da LH. Para serem muito antigénicos, os imunogenes também devem conter sequências que são estranhas para a pessoa ou animal a ser imunizado. Se for utilizada para a imunização a subunidade completa da LH, poderão ser produzidos anticorpos que inibem completamente a actividade da LH. Títulos elevados de anticorpos neutralizadores podem resultar em infertilidade ou podem ter outras consequências negativas, como indução de menopausa prematura ou diminuição da dimensão ou função dos testículos. A melhor escolha de resíduos da subunidade beta da LH que devem ser incluídos no imunogene consiste naqueles que permanecem expostos quando a hormona se liga a receptores da LH. Estes incluem a porção da hormona perto dos resíduos 74-77, uma região da hormona reconhecida por anticorpos que se ligam às subunidades da hLH ou hCG e complexos hLH- ou hCG-receptor (26, 50) . Regiões da subunidade que não devem ser utilizadas para a imunização incluem sequências perto 41 dos resíduos 89-92 e 47-51. Estas sao as localizações dos sítios de ligação de anticorpos que neutralizam a actividade. A concepção de um antigene sintético mínimo inclui resíduos da subunidade da hLH expostos quando a LH está ligada a receptores da LH. Alguns destes incluem Pro73-Arg74-Gly75-Val76-Asp77-Pro78-Val79-Val80-Ser81. Péptidos sintéticos contendo estas sequências podem ser acoplados a grandes moléculas transportadoras e utilizados para imunização utilizando métodos bem conhecidos na área (14— 16, 51-53). Os anticorpos não neutralizadores produzidos irão combinar-se com a hLH e inibir a sua actividade biológica.

Muitas vezes, a capacidade de antigenes peptídicos pequenos para induzir uma resposta imunológica de título elevado é baixa. 0 que se segue ilustra como criar um antigene mais eficaz na indução de anticorpos para regiões da hLH que permanecem expostas quando a hormona se liga a receptores da LH. Pode utilizar-se uma abordagem semelhante para conceber imunogenes para qualquer proteína, incluindo LH de outros vertebrados. É bem conhecido que os melhores imunogenes são aqueles que diferem substancialmente de proteínas presentes num animal mas que retêm a configuração terciária do epítopo ou epítopos para os quais se deseja uma resposta imunológica. Pode preparar-se um imunogene apropriado modificando a subunidade da hLH de modo que i) retenha a capacidade para se ligar ao B105 e/ou outros anticorpos que inibem parcialmente as acções da hLH, ii) perca a capacidade para se ligar a anticorpos que neutralizam a actividade da LH e iii) seja antigénico. Também podem conceber-se imunogenes apropriados partindo de 42 uma proteína diferente da subunidade beta da LH e modificando-a de modo a adquirir a capacidade para se ligar ao B105 e/ou outros anticorpos que inibem parcialmente as acções da hLH. Anticorpos que inibem parcialmente as acções da hLH são denominados anticorpos "modelo" e são utilizados para monitorizar e/ou seleccionar positivamente quanto à retenção dos epítopos desejados. Bons exemplos de anticorpos modelo são aqueles que se verifica serem eficazes no aumento da fertilidade, como esboçado no exemplo 2. Outros anticorpos, denominados anticorpos de "exclusão", são utilizados para seleccionar contra análogos de antigenes contendo epítopos indesejáveis. Exemplos de anticorpos de "exclusão" são aqueles que neutralizam completamente a actividade biológica da hLH e/ou que evitam a sua ligação aos seus receptores. Há duas estratégias globais diferentes, que serão denominadas "A" e "B", para construir os antigenes utilizando uma estratégia de selecção positiva/negativa baseada em anticorpos modelo e de exclusão. Na abordagem "A", parte-se da subunidade da LH e utiliza-se mutagénese aleatória para produzir substituições em regiões da molécula fora do epítopo reconhecido pelo anticorpo "modelo". As novas moléculas que são produzidas são expressas (ver abaixo) e monitoriza-se a sua capacidade para se ligarem ao anticorpo modelo. As que continuam a ligar-se ao anticorpo modelo e que têm mutações nas outras regiões da molécula são utilizadas numa segunda ronda de mutagénese numa porção diferente da molécula. Continua-se este processo até todas as regiões da proteína, exceptuando a envolvida no sítio de ligação de anticorpos (por exemplo, B105), terem sido modificadas. Os análogos finais irão ligar-se a anticorpos modelo mas não a anticorpos de 43 exclusão. Numa variante deste procedimento, parte-se de uma quimera da hormona que se liga ao anticorpo modelo. Podem preparar-se essas quimeras partindo de uma espécie diferente da LH que se sabe não se ligar a anticorpos modelo nem induzir uma resposta imunológica neutralizadora para a hLH. Exemplos deste tipo de imunogene são quimeras das subunidades da da LH humana e LH bovina. Estas incluem a subunidade da LH bovina que foi modificada substituindo prolina 74 por arginina, o resíduo presente na subunidade da LH humana nesta posição. Resíduos da hLH são substituídos por regiões homólogas das diferentes espécies da LH, para criar o sítio de ligação dos anticorpos modelo. Identificam-se as regiões homólogas alinhando as sequências da hLH e das outras LH pelas posições dos seus resíduos cisteína altamente conservados, como mostrado por Pierce e Parsons (1).

Na abordagem "B" utiliza-se uma molécula do arcabouço que não está relacionada ou é apenas vagamente semelhante à estrutura das subunidades das hormonas glicoproteicas. Isto pode incluir qualquer proteína contendo estruturas de laço, como as encontradas nas dobras de imunoglobulinas ou entre as hélices em proteínas de feixe de quatro hélices. A sequência da hLH entre os resíduos 65-85 é substituída por um dos laços por procedimentos comuns de mutagénese. Quando esta proteína é produzida num vector de expressão de E. coli adequado (por exemplo, um dos vectores T7 que podem ser adquiridos à Novagen), pode ser testada quanto à sua capacidade para se ligar a anticorpos monoclonais que se ligam a complexos hLH-receptor. Uma vez que apenas uma porção dos resíduos que formam o epítopo estará presente na proteína expressa, a sua afinidade será mais baixa do que afinidade da hLH para o anticorpo. 44

Para melhorar a selectividade e afinidade das proteínas preparadas nas abordagens "A" ou "B" pode utilizar-se um sistema de expressão bacteriano ou bacteriofágico (34, 36, 55-58). Em qualquer dos casos, preparam-se bibliotecas de análogos mutantes e selecciona-se o mutante com a afinidade mais elevada para ο B105, B110 ou outro anticorpo modelo semelhante que se verifica ser útil no exemplo 2. Adicionalmente, também pode utilizar-se selecção negativa utilizando anticorpos ou anti-soros neutralizadores que se verificou não serem úteis no exemplo 2. Este procedimento irá minimizar a capacidade do antigene para induzir anticorpos indesejáveis quando utilizado numa vacina. A descrição seguinte aplica-se a um método de selecção baseado na expressão em fagos, mas o experimentado na área da preparação e rastreio de bibliotecas pode facilmente adaptá-lo para praticamente qualquer sistema de expressão. Um sistema favorável para selecção é basea-se na coloração de proteínas (59). Também podem utilizar-se vários sistemas diferentes de expressão em fagos. Um deles envolve utilizar um vector (isto é, pX-M13gIII) semelhante a phGH-M13gIII (34) . Quando se utiliza a abordagem "A" discutida anteriormente, este novo vector, denominado pA-M13gIII, contém a subunidade da hLH ou uma quimera da subunidade da hLH-LH em vez das sequências codificadoras da hormona de crescimento de phGH-M13gIII (Figura 4). Quando se utiliza a abordagem "B" discutida anteriormente, as sequências codificadoras da hormona de crescimento de phGH-M13gIII são substituídas por um gene que codifica uma molécula não relacionada com a subunidade da hLH exceptuando a inclusão das sequências codificadoras da subunidade beta da hLH perto do resíduo 74, dando origem a um novo vector 45 denominado pB-M13gIII. A sequência codificadora da região do vector que codifica as sequências "B" também contém sítios de restrição que permitem utilizar mutagénese por cassete ou outros tipos de mutagénese para permitir a introdução de sequências aleatórias. Quando se introduzem sequências aleatórias nas regiões codificadoras dos vectores pA-M13gIII ou pB-M13gIII e se utilizam os vectores para transformar E. coli, será criada uma biblioteca de mutantes. Estas proteínas mutantes podem ser expressas na superfície de partículas de fagemídeos M13 na forma de proteínas de fusão do gene III por adição do fago auxiliador M13K07 a E. coli. Estas partículas de fagemídeos ligar-se-ão ao anticorpo proporcionalmente às afinidades das proteínas modificadas "A" ou "B" para o anticorpo. Um método conveniente para seleccionar partículas de fagemídeos que se ligam a anticorpos modelo consiste em utilizar um protocolo de ensaio em fase sólida. Neste ensaio, utiliza-se o anticorpo modelo para revestir uma superfície como descrito (22) e depois adiciona-se uma solução contendo as partículas de fagemídeos. As partículas de fagemídeos que não se ligam à superfície podem ser deitadas fora. As partículas que se ligam ao anticorpo presente na superfície podem ser removidas do anticorpo adicionando tampões de pH baixo (isto é, pH 3) e ser utilizadas para transformar novamente E. coli. Quando for desejada uma selecção negativa, podem substituir-se os anticorpos modelo pelos anticorpos de exclusão na superfície. Neste caso, as partículas que se ligam à superfície são deitadas fora. Este processo é repetido várias vezes e, em seguida, as regiões codificadoras de vários genes para as proteínas "A" e "B" são sujeitas a sequenciação de DNA. Deste modo podem identificar-se sequências críticas para a ligação ao anticorpo modelo. 46

Adicionalmente, se forem utilizados anticorpos de exclusão, é possível seleccionar contra epítopos indesejáveis. Também é possível identificar substituições noutras porções da molécula que têm pouco ou nenhum efeito na conformação da região de ligação de anticorpos desejada. Quando se utilizam moléculas codificadas por estas sequências para imunizar animais ou humanos, irão induzir a formação de anticorpos que reagem de forma cruzada com a hLH. Uma vez que estes anticorpos irão reconhecer uma porção da molécula que se sabe ficar exposta depois da hLH se ligar aos seus receptores, serão capazes de inibir as acções da hLH mas não de prevenir completamente a sua actividade biológica.

Nalguns casos podem não estar disponíveis anticorpos modelo e anticorpos de exclusão. Nestes casos é possível criar anti-soros modelo e anti-soros de exclusão, que podem substituir os anticorpos utilizando a estratégia seguinte. Preparam-se corpos lúteos do ovário de rato por tratamento de ratos fêmeas com PMSG e hCG como descrito anteriormente. Estes corpos lúteos são incubados com hLH, para permitir que a hormona se ligue aos receptores da LH presentes nas membranas. Em seguida, as membranas são lavadas, para remover a hLH livre, e as membranas são incubadas com os anti-soros. Depois, anticorpos que ficam ligados à hLH que está ligada aos receptores da LH membranares são separados do restante dos anti-soros por lavagem das membranas. Estes anticorpos são libertados por tratamento das membranas a um pH inferior a 5. Este tratamento liberta os anticorpos e a hLH dos receptores. Os anticorpos são separados da hLH por filtração em gel, ou outro método, e seguidamente podem ser utilizados como modelos. Os anticorpos remanescentes no soro depletado de anticorpos modelo podem servir de anticorpos de exclusão. 47

Exemplo 7 A\imento da actividade imunológica

Durante a imunização activa contra a LH cria-se uma resposta autoimune dirigida a sítios. Assim, é essencial utilizar proteínas altamente antigénicas. Isto pode ser facilitado utilizando a abordagem de modelo/exclusão descrita no exemplo 6 para tornar o imunogene tão estranho quanto possível. Adicionalmente, é desejável tornar a molécula multivalente, para aumentar as hipóteses de interagir com o sistema imunológico. Um método bom para tornar a molécula multivalente consiste em adicionar resíduos ao terminal C ou ao terminal N que provoquem a formação de uma hélice que consiga formar um motivo de super-hélice com outras moléculas. As regras para conceber sequências peptídicas que formam motivos de super-hélice são bem conhecidas na área (60, 61). Adicionalmente, também é possível utilizar sequências de ocorrência natural de proteínas que se sabe formarem motivos de super-hélice, tais como as presentes na proteína hemaglutinina do vírus influenza, laminina, GCN4 ou qualquer uma de várias proteínas diferentes. Também é possível adicionar resíduos ao terminal C ou ao terminal N que resultem na formação de uma hélice tripla semelhante à presente no colagénio. Estas hélices triplas permitirão a combinação de três ou mais moléculas de antigenes. Também podem empregar-se outras estratégias para aumentar a antigenicidade do imunogene, incluindo acoplamento dos imunogenes extremidade-a-extremidade para formar uma poliproteína. Como esboçado (Figura 5), é possível, utilizando esta estratégia, conceber uma proteína com qualquer número de unidades de repetição. 48

Os anticorpos utilizados na presente invenção que inibem sem neutralizar a actividade da LH interagem habitualmente com a subunidade livre e também com o heterodimero. Assim, ao preparar imunogenes para induzir a formação destes anticorpos, é usualmente conveniente partir da subunidade livre. Em contraste, muitos anticorpos preferidos que inibem e neutralizam a actividade da hCG ligam-se melhor ao heterodimero , do que à subunidade livre da hCG. Para induzir a formação destes anticorpos é muitas vezes útil partir de um imunogene que é uma proteína de fusão preparada por acoplamento do terminal C do péptido, constituído pelos resíduos 1-114 da subunidade da hCG, ao terminal N de um agente de ligação proteico flexível, composto por seis unidades repetidas de glicina e serina. Em seguida, o terminal C desta proteína de fusão é acoplado ao terminal N dos resíduos 1-96 da subunidade bovina. Este procedimento dá origem a um único polipéptido que tem a conformação global dos resíduos da subunidade presentes na hCG e que pode ser utilizado para imunização directamente, ou que pode ser utilizado como composto de partida no exemplo 6. A administração do antigene pode ser efectuada de qualquer modo bem conhecido na área. Isto inclui injecção, injecção em adjuvantes e acoplamento do antigene a um vírus.

Exemplo 8

Pormenores da Abordagem de Teste da Presente Invenção para a hCG 1. Obtêm-se anticorpos neutralizadores preparando anticorpos monoclonais ou adquirindo-os. Também podem obter-se anti-soros neutralizadores imunizando coelhos, ou 49 outros animais, contra a hCG. Também será útil obter anticorpos ou anti-soros contra a hLH. 2. Estes anticorpos ou anti-soros são utilizados como modelos positivos e negativos para rastrear bibliotecas de mutantes da subunidade da hCG. Estas bibliotecas podem ser preparadas por mutagénese aleatória da subunidade da hCG em regiões particulares da molécula. De notar que é preferível utilizar uma subunidade da hCG que não tenha o terminal C ou que tenha uma sequência diferente nesta parte da molécula, para evitar seleccionar imunogenes não neutralizadores. Um procedimento conveniente envolve a utilização de técnicas de expressão em fagos, também listadas abaixo. No entanto, a expressão em fagos não é essencial para que a técnica funcione. 3. Primeiramente permite-se que os mutantes se liguem aos anticorpos de selecção negativa. No presente exemplo, nomeadamente o desenvolvimento de uma vacina para a hCG, isto envolve ligação aos anticorpos para a LH ou aos anti-soros para a LH, para remover mutantes estruturalmente idênticos à LH. 4. Em seguida permite-se que os mutantes que não se ligaram aos anticorpos de selecção negativa se liguem aos anticorpos de selecção positiva, nomeadamente aqueles que foram produzidos por imunização contra a hCG. Durante o processo de selecção positiva, também se adiciona subunidade livre da hCG, para eliminar anticorpos que se liguem à subunidade livre e para limitar o processo de selecção àqueles anticorpos que são específicos para dimeros. Os mutantes que não se ligam aos anticorpos de selecção positiva são deitados fora. No caso de proteínas 50 expressas em fagos, os fagos são eluídos dos anticorpos de selecção positiva e são utilizados para infectar E. coli. 5. Repete-se este processo durante várias rondas para eliminar imunogenes potenciais capazes de se ligarem aos anticorpos para a hLH e para excluir suplementarmente aqueles que têm baixa afinidade para anticorpos contra a hCG. As sequências de DNA que codificam os imunogenes são sequenciadas. Os imunogenes que diferem mais da hCG mas que retêm a capacidade para se ligarem a anticorpos ou anti-soros específicos para a hCG com afinidade elevada são utilizados a seguir. 6. Se for necessário, efectua-se uma segunda ronda de mutagénese para aumentar o número de diferenças entre o imunogene potencial e a hCG. 0 objectivo é conceber um imunogene que difira da hLH e, tanto quanto possível, da hCG mas que retenha os aspectos-chave da estrutura da hCG que lhe permitem induzir anticorpos neutralizadores com título elevado. Estes incluem as regiões da subunidade diferentes do terminal C que mais diferem da subunidade da hLH. 7. Depois de terem sido seleccionados os principais determinantes antigénicos únicos, o imunogene é tornado multivalente. Há vários métodos para consegui-lo. Um consiste em fundir o determinante a uma proteína que, ela própria, é multivalente ou que forma multímeros (por exemplo, imunoglobulinas). Outro consiste em fundir resíduos à proteína que formam motivos de super-hélice e que irão promover a associação. Quando possível, estes provêm de proteínas naturais que se sabe induzirem uma resposta imunológica (por exemplo, gripe). 51 8.A. É essencial obter títulos elevados contra a molécula da hCG intacta se for desejado prevenir a fertilidade. Isto pode requerer combinar a hCG com uma molécula que é semelhante a uma subunidade . A subunidade de outras glicoproteinas de mamífero é adequada como material de partida. 8.B. Uma molécula que também é um ponto de partida adequado é uma molécula que tem as propriedades desejáveis de ser um polipéptido simples e que retém a estrutura do heterodímero. Neste caso, também é desejável produzir mutações na porção da molécula derivada da subunidade 8.C. Os imunogenes podem ser produzidos utilizando qualquer método conveniente, como expressão em E. coli, levedura ou células de mamífero. Não é necessário que os imunogenes sejam glicosilados. Os imunogenes também podem consistir em DNA ou RNA. Também podem ser integrados nos envelopes virais. 8.D. Também não é necessário partir da subunidade da hCG. Pode partir-se de qualquer proteína. A chave consiste em utilizar a estratégia de modelo para seleccionar as proteínas desejadas. Por exemplo, pode partir-se de um feixe de quatro hélices e incorporar as sequências de aminoácidos de porções da subunidade da hCG que estão perto dos resíduos 38-57 e 91-92. Também pode partir-se de uma imunoglobulina, incluindo uma imunoglobulina que seja um anticorpo monoclonal anti-idiotípico para um anticorpo específico para a hCG. 52 A Figura 1 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros na ligação de hLH etiquetada de forma radioactiva a receptores da LH. A Figura 1 ilustra a influência de três tipos diferentes de anticorpos ou anti-soros na ligação da hLH a receptores da LH. 0 anticorpo "A" exerce pouco ou nenhum efeito sobre a ligação da hormona aos seus receptores. A sua principal influência inibidora potencial in vivo seria sobre o metabolismo da hormona. 0 anticorpo "B" tem capacidade de bloquear parcialmente a ligação da hLH a receptores da LH. Assim, apesar do anticorpo ser inibidor in vivo, mesmo um excesso muito grande deste anticorpo relativamente à LH seria incapaz a reduzir a sua actividade para menos de 40%, como mostrado aqui. De notar que se podem produzir diferentes anticorpos com diferentes capacidades para bloquear as actividades da LH (por exemplo, B105 e B110). O anticorpo "B" é um exemplo do tipo geral de anticorpo muito útil in vivo. O anticorpo "C" é um anticorpo neutralizador, uma vez que, a concentrações elevadas, pode prevenir a actividade da LH. Devido ao seu potencial para prevenir a actividade da LH, um excesso deste anticorpo inibe a fertilidade.

A Figura 2 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros sobre a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese in vitro. A Figura 2 ilustra os efeitos de três anticorpos sobre a capacidade da LH para induzir a síntese de testosterona (isto é, esteroidogénese) a partir de suspensões de células de Leydig de testículos de rato. A curva "A" ilustra a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese na ausência de anticorpos. A curva "B" ilustra a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese na presença de um excesso maciço de anticorpo que consegue reduzir a actividade da hLH 53 aproximadamente em 3 vezes. A curva "C" ilustra a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese na presença de um excesso maciço de anticorpo que consegue reduzir a actividade da hLH aproximadamente em 20 vezes. A curva "D" ilustra a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese na presença de um excesso maciço de anticorpo que consegue neutralizar a actividade da hLH. A decisão de utilizar o anticorpo "B" e/ou "C" in vivo dependerá da razão LH/FSH e da extensão em que se deseja suprimir a actividade da LH. Quando os níveis de hLH são elevados e é necessário reduzi-los ao máximo, o anticorpo "C" será preferido. Quando as razões hLH/hFSH estão apenas ligeiramente aumentadas, o anticorpo "B" será preferido. A utilização do anticorpo "D" em doses muito elevadas resulta em infertilidade. Antecipa-se que se encontrarão muitos anticorpos úteis com capacidade para reduzir a actividade da hLH ou de outra LH em células do ovário, bem como em células de testículos.

A Figura 3 é um gráfico que ilustra a influência de anticorpos e anti-soros sobre a capacidade da hLH para induzir esteroidogénese in vivo. A Figura 3 ilustra os efeitos de três anticorpos diferentes na formação de testosterona em indivíduos do sexo masculino quando são administradas i.v. quantidades maciças dos anticorpos antes de diferentes quantidades de hLH também serem administradas i.v. Em todos os exemplos ilustrados, a quantidade administrada de anticorpo excede em muito a da HLH, numa base molar. São de esperar efeitos semelhantes para os anticorpos na esteroidogénese em indivíduos do sexo feminino. A curva "A" mostra o efeito da hLH sobre a esteroidogénese na ausência do anticorpo. A curva "B" ilustra o efeito de uma quantidade maciça de anticorpo que consegue inibir a actividade da hLH no máximo em 40%. A 54 curva "C" ilustra a influência de uma quantidade maciça de anticorpo que consegue inibir a actividade da hLH no máximo em 95%. A curva "D" ilustra os efeitos de uma quantidade maciça de um anticorpo neutralizador. A Figura 4 mostra vectores que podem ser utilizados em estratégias de modelo/selecção por exclusão. A concepção destes vectores é semelhante à descrita por Bass et al. (34), e são preparados substituindo as sequências codificadoras da hormona de crescimento humano pelas de uma quimera de hLH, utilizando procedimentos de mutagénese por reacção em cadeia de polimerase que são comuns na área, tais como o procedimento de SOEing descrito por Ho et al. (63). Nesta Figura o "lac p" representa o promotor lac, stll representa a sequência líder, "hLH beta" representa a sequência codificadora da subunidade beta da LH humana desde o codão 1 até ao codão 114, "M13 gene III" representa a sequência codificadora dos codões 198-410 da proteína do gene M13 na mesma fase de leitura de stll e dos codões beta da LH humana. "Resistência Amp": é o gene de pBR322 que codifica a enzima -lactamase, "322 ori" é a origem da replicação de pBR322 e "fl ori" é a origem da replicação de M13. As mutações são feitas na porção "hLH beta" deste vector. A Figura 5 mostra os tipos de imunogenes com antigenicidade acrescida para utilização na imunização activa contra a LH. Alguns destes têm a repetição heptavalente que se sabe formar um motivo de super-hélice (painel A). Outros têm uma repetição que se sabe formar uma hélice tripla (painel B) . Estes conferem antigenicidade acrescida porque são poliméricos. Outros métodos de preparação de imunogenes poliméricos incluem preparar 55 proteínas de fusão com o terminal C (painel C) ou o terminal N de imunoglobulinas (painel D) . Um imunogene de cadeia simples constituído por uma proteína de fusão da subunidade bovina e das subunidades da hCG e hFSH terá antigenicidade acrescida em humanos.

Ilustração A: Os codões para duas ou mais repetições heptavalentes são inseridos na estrutura entre o codão 114 e o codão de terminação da subunidade da LH ou análogo. A concepção da repetição heptavalente é semelhante à descrita na referência 60. Cada repetição contém 7 aminoácidos etiquetados por ordem "A, B, C, D, E, F, G" que têm as propriedades seguintes. Os aminoácidos a e d são hidrófobos e consistem em leucina, isoleucina ou valina. Os aminoácidos E e G são aminoácidos com carga. O aminoácido E deve ter carga oposta à do aminoácido G para formarem homodímeros. Assim, se E for um glutamato, então G deve ser uma lisina. Os aminoácidos "B, C, F" podem ser praticamente de qualquer tipo que favoreça a formação de hélices. Assim, devem conter poucas, se é que alguma, prolinas ou glicinas.

Ilustração B: Os codões para 6 ou mais repetições de aminoácidos em tripleto são inseridos na estrutura entre o codão 114 e o codão de terminação da unidade . Estes tripletos codificam os aminoácidos glicina, X, Y, em que X e Y são quaisquer aminoácidos que se sabe fazerem parte da sequência do colagénio que forma uma hélice tripla.

Ilustração C: Os codões para a cadeia pesada da IgG são inseridos imediatamente a 5' do codão 1 da subunidade Quando estes genes são co-expressos com a cadeia leve da IgG lambda ou kapa, produzem uma IgG contendo duas subunidades no seu terminal C. 56

Ilustração D: Os codões para a região da cadeia pesada da IgG sem a região variável nem a primeira região constante são inseridos na estrutura entre o codão 114 e o codão de terminação da subunidade

Ilustração E: Codões para uma sequência de repetição glicina-serina (isto é, repetição GS) , como a sequência serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina, são inseridos na estrutura entre o codão 114 e o codão de terminação de um análogo da subunidade . 0 último codão deste análogo torna-se 126. Em seguida, os codões 1-96 para a subunidade bovina ou outra, ou os codões 1-92 da subunidade humana, são inseridos na estrutura entre o codão 126 e o codão de terminação da construção da subunidade contendo a cauda poli-glicina-serina. Isto forma uma gonadotropina de subunidade simples que transporta a estrutura do heterodímero da hormona glicoproteica.

Ilustração F: Codões para a subunidade humana, bovina ou de outro vertebrado, ou sequência análoga, são adicionados entre o último codão e o codão de terminação de um gene que codifica para uma repetição heptavalente contendo apenas aminoácidos de carga positiva nas posições E e G da repetição heptavalente (isto é, Repetição heptavalente #1) utilizando métodos conhecidos de qualquer perito experimentado em técnicas comuns de DNA recombinante para preparar e expressar genes. Quando este gene for expresso em células ou organismos bacterianos ou de levedura ou outros eucarióticos, produzirá uma proteina com a repetição heptavalente de carga positiva no seu terminal amino e uma subunidade ou análogo da subunidade no seu 57 terminal carboxi. Cordões para uma repetição heptavalente que codifica aminoácidos de carga negativa nas posições E e G (isto é, Repetição heptavalente #2) são adicionados entre o último codão e o codão de terminação para um análogo da subunidade . Quando este gene for expresso em células ou organismos de bactérias ou levedura ou outros eucarióticos, produzirá uma proteína com uma subunidade ou análogo no seu terminal amino e a repetição heptavalente de carga negativa no seu terminal carboxi.

Ilustração G: Mostra o heterodímero que se forma quando se misturam as proteínas com a forma descrita na ilustração F. As sequências da repetição heptavalente #1 e repetição heptavalente #2 são escolhidas para encorajar a formação de heterodímeros e reduzir a formação de homodímeros.

Ilustração H: Formam-se multímeros quando se misturam os compostos das ilustrações F e G devido à combinação das subunidades e e das repetições heptavalentes. Nas ilustrações A - Η, "N-" e "-C" referem-se ao terminal amino e ao terminal carboxi das proteínas. 0 "i" refere-se a uma unidade simples que pode estar repetida várias vezes. De notar também que, se bem que as repetições heptavalentes ilustradas aqui sejam idênticas, a utilização de repetições idênticas não é essencial. Há um grande número de proteínas contendo repetições heptavalentes não idênticas que são capazes de formar homodímeros de heterodímeros (60).

Gonadotropinas de cadeia simples com actividade de lutropina.

Exemplo 9 58

Preparação e utilização do Análogo #1 (comparar Tabela 1), uma gonadotropina de cadeia simples com actividade de lutropina. (Ver Figura 6)

As sequências codificadoras para o análogo #1 listado na Tabela 1 podem ser sintetizadas utilizando a abordagem de ligação de blocos descrita (54) ou podem ser preparadas partindo das sequências codificadoras para a subunidade da hCG e para a subunidade humana. Estas podem ser clonadas de uma biblioteca de cDNA de placenta humana. As sequências que codificam o péptido de sinal da subunidade humana são deletadas e as sequências codificadoras para as proteínas são processadas em conjunto utilizando a técnica SOEing (63) do modo seguinte: 0 "primer" #1 (100 ng) com a sequência: 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCT-3' e o "primer" #2 (100 ng) com a sequência: 3'-GGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATCG-5' são misturados com o cDNA da subunidade β da hCG (1 μg) , que serve de modelo, e efectua-se PCR durante 25 ciclos de temperatura de 94 °C (30 segundos), 50 °C (60 segundos), 72 °C (60 segundos), utilizando DNA polimerase de Pfu adquirido à Strate-gene, La Jolla, CA, dioxinucleótido trifosfatos e tampão de PCR como descrito (63). O "primer" #3 (100 ng) com a sequência: 5'- GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTCCTGATGTGCAGGATTGCCCA-3' e O "primer" #4 (100 ng) com a sequência: 3'- ACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCC T-5' são misturados com cDNA da subunidade α humana (1 μg), que serve de modelo, e efectua-se PCR durante 25 ciclos de temperatura de 94 °C (30 segundos), 50 °C (60 segundos), 72 °C (60 segundos), utilizando DNA polimerase de Pfu, dioxinucleótido trifosfatos e tampão de PCR como descrito (63) . Estas duas reacções de PCR originam produtos que 59 servem de modelos intermediários numa terceira (final) reacção de PCR, que dá origem às construções desejadas numa forma adequada para clonagem. A reacção final de PCR é efectuada misturando 1 1 dos produtos das primeiras duas reacções de PCR juntamente com o "primer" #5 com a sequência: 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGG-3 e O "primer" #6 com a sequência: 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' durante 25 ciclos de temperatura de 94 °C (30 segundos), 50 °C (60 segundos), 72 °C (60 segundos), utilizando DNA polimerase de Pfu, dioxinucleótido trifosfatos adicionais e tampão de PCR. O produto de PCR final é digerido com as enzimas de restrição Xhol e BglII e é ligado em pSVL (um vector de expressão obtido da Pharmacia, Piscataway, NJ) que foi digerido com Xhol e BamHI para criar um vector que dirija a síntese do Análogo 1. O sitio Xhol do produto de PCR irá ligar-se ao sítio Xhol de pSVL, e o sitio BglII do produto de PCR irá ligar-se ao sítio BamHI do pSVL. O sítio Xhol será regenerado e os sítios BglII e BamHI serão eliminados. Determinam-se as sequências das regiões codificadoras (isto é, entre os sítios Xbal e Kpnl, comparar Figura 6) de várias construções até se verificar que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos desejada ilustrada na Figura 6. Faz-se isto para eliminar possíveis erros que surjam em resultado de PCR e outras manipulações de DNA, sendo uma precaução comum para assegurar que se obtém a sequência desejada. Espera-se que a proteína expressa não tenha os resíduos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que fazem parte da sequência de sinal presente na subunidade β da hCG e que são removidos pela célula durante a síntese da proteína. Este vector é expresso em células COS-7 como descrito (64), e a proteína libertada para o meio é testada quanto à sua capacidade para inibir a ligação de hCG iodada 60 de forma radioactiva a anticorpos monoclonais ou a anti-soros preparados contra a hCG. A proteína produzida pelas células COS-7 irá competir com a hCG iodada de forma radioactiva para a ligação a um ou mais dos anticorpos seguintes: B101 (obtido da Universidade de Columbia), B105 (obtido da Universidade de Columbia), B107 (obtido da Universidade de Columbia) , B109 (obtido da Universidade de Columbia), A201 (obtido da Universidade de Columbia), HCU061 (obtido da Hybritech), HCZ107 (obtido da Hybritech) ou HC0514 (obtido da Hybritech), ZMCG18 (obtido da Pierce), ZMCG13 (obtido da Pierce) ou ZMCG7 (obtido da Pierce) ou 518B7 (obtido da Dr. Janet Roser, Universidade da Califórnia em Davis). A proteína libertada para o meio irá competir com a hCG etiquetada de forma radioactiva para a ligação a receptores em corpos lúteos, como descrito por Campbell, Dean-Emig e Moyle (64). É de esperar que estimule a formação de testosterona num ensaio com células de Leydig conduzido de modo semelhante ao descrito por Moyle et al. (37) e que estimule a ovulação em animais do sexo feminino e que estimule a formação de testosterona em animais do sexo masculino. Também é de esperar que este análogo seja um bom ponto de partida para utilização numa vacina contraceptiva, utilizando a abordagem de modelo esboçada no Exemplo 11. Este análogo está apresentado na Tabela 1 como Análogo #1 e contém uma sequência de ligação de GSGSGSGS. Este agente de ligação pode ser modificado digerindo o vector de expressão com enzimas endonucleases de restrição Apal e Eco47III, deitando fora a porção pequena, ligando no sítio ApaI/Eco47III, por métodos comuns, uma cassete de DNA sintético de filamentação dupla com os codões de aminoácidos desejados contendo qualquer número de codões de glicina ou serina ou outros codões de aminoácidos, sequenciando a região entre ApaI/Eco47III para confirmar 61 que foram feitas as mutações desejadas e expressando a proteína em células COS-7. Isto pode ser feito para optimizar a actividade da gonadotropina de cadeia simples. Espera-se que a proteína funcione como monómero ou que se combine para formar homodímeros activos. Adicionalmente, é de esperar que várias cópias da proteína se combinem para formar multímeros.

Exemplo 10

Preparação e utilização do Análogo #2, uma gonadotropina de cadeia simples com actividade de lutropina. (Ver Figura 7)

As sequências codificadoras para o Análogo #2 listado na Tabela 1 podem ser sintetizadas utilizando a abordagem de ligação de blocos descrita (54) ou podem ser preparadas por PCR utilizando os "primers" #1 e #7 e, como modelo, a construção de expressão descrita no Exemplo 9 e na Figura 6. A sequência do "primer" #7 é: 3'- TGGTGGGGAACTGGACACTACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. O produto de PCR final é digerido com as enzimas de restrição Xhol e BamHI e é ligado ao fragmento grande de DNA obtido por digestão da construção de expressão descrita no Exemplo 12 com Xhol e BamHI. Determinam-se as sequências das regiões codificadoras entre os sítios Xhol e BamHI de várias construções até se verificar que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos descrita na Figura 7. Isto irá assegurar que não estão presentes artefactos de clonagem na região que foi alterada. Espera-se que a proteína expressa não tenha os resíduos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que fazem parte da sequência de sinal presente na subunidade β da hCG e que são removidos pela célula durante a síntese da proteína. Este vector é expresso em células COS-7, e a proteína libertada para o meio é testada quanto 62 à sua capacidade para inibir a ligação de hCG iodada de forma radioactiva a anticorpos monoclonais ou a anti-soros preparados contra a hCG. A proteína produzida pelas células COS-7 irá competir com a hCG iodada de forma radioactiva para a ligação a um ou mais dos anticorpos seguintes: B101 (obtido da Universidade de Columbia), B105 (obtido da Universidade de Columbia), B107 (obtido da Universidade de Columbia), B109 (obtido da Universidade de Columbia), A201 (obtido da Universidade de Columbia), HCU061 (obtido da Hybritech) ou HC0514 (obtido da Hybritech), ZMCG18 (obtido da Pierce), ZMCG13 (obtido da Pierce) ou ZMCG7 (obtido da Pierce) ou 518B7 (obtido da Dr. Janet Roser, Universidade da Califórnia em Davis) . A proteína libertada para o meio irá competir com a hCG etiquetada de forma radioactiva para a ligação a receptores em corpos lúteos, como descrito por Campbell, Dean-Emig e Moyle (64). É de esperar que estimule a formação de testosterona num ensaio com células de Leydig conduzido de modo semelhante ao descrito por Moyle et al. (37) e que estimule a ovulação em animais do sexo feminino e que estimule a formação de testosterona em mamíferos do sexo masculino. Também é de esperar que este análogo seja um bom ponto de partida para utilização numa vacina contraceptiva, utilizando a abordagem de modelo esboçada no Exemplo 8. Este análogo está apresentado na Tabela 1 como Análogo #2 e contém uma sequência de ligação de GSGSGSGS. Este agente de ligação pode ser modificado digerindo o vector de expressão com enzimas endonucleases de restrição SstII e Eco47III, deitando fora a porção pequena, ligando no sítio SstII/Eco47III, por métodos comuns, uma cassete de DNA sintético de filamentação dupla com os codões de aminoácidos desejados contendo qualquer número de codões de glicina ou serina ou outros codões de aminoácidos, sequenciando a região entre SstII/Eco47III para confirmar 63 que foram feitas as mutações desejadas e expressando a proteína em células COS-7. Isto pode ser feito para optimizar a actividade da gonadotropina de cadeia simples. Espera-se que a proteína funcione como monómero ou que se combine para formar homodímeros activos. Adicionalmente, é de esperar que várias cópias da proteína se combinem para formar multímeros.

Exemplo 11

Preparação e utilização do Análogo #3, uma gonadotropina de cadeia simples com actividade de lutropina. (Ver Figura 8)

As sequências codificadoras para o análogo #3 listado na Tabela 1 podem ser sintetizadas utilizando a abordagem de ligação de blocos descrita (54) ou podem ser preparadas do modo descrito para o Análogo #2 do Exemplo 10, com a excepção dos "primers" #1 e #7 serem substituídos pelos "primers" #8 e #9 e do cDNA da subunidade β da hLH ser utilizado como modelo em vez do cDNA da subunidade β da hCG. O cDNA da subunidade β da hLH pode ser obtido por rastreio de uma biblioteca da pituitária humana. A sequência do "primer" #8 é: 5'- AT GAAAT CGAC GGAAT CAGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGC TCCAGGGGCTGCT-3' e a sequência do "primer" #9 é: 3'- GTGGGGAACTGGACACTGGTGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATC G-5'. O produto de PCR final é digerido com as enzimas de restrição Xhol e BamHI e é subclonado nos sítios Xhol/BamHI do vector de expressão criado como descrito no Exemplo 9. Determinam-se as sequências das regiões codificadoras entre os sítios Xhol e BamHI de várias construções até se verificar que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 8. Espera-se que a proteína expressa não 64 tenha os resíduos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que fazem parte da sequência de sinal presente na subunidade da hLH e que são removidos pela célula durante a síntese da proteína. Este vector é expresso em células COS-7, e a proteína libertada para o meio é testada quanto à sua capacidade para inibir a ligação de hCG iodada de forma radioactiva a anticorpos monoclonais ou a anti-soros preparados contra a hCG. A proteína produzida pelas células COS-7 irá competir com a hCG iodada de forma radioactiva para a ligação a um ou mais dos anticorpos seguintes: B101 (obtido da Universidade de Columbia), B105 (obtido da

Universidade de Columbia), A201 (obtido da Universidade de Columbia), HCU061 (obtido da Hybritech), ZMCG7 (obtido da Pierce) ou 518B7 (obtido da Dr. Janet Roser, Universidade da Califórnia em Davis) . A proteína libertada para o meio irá competir com a hCG etiquetada de forma radioactiva para a ligação a receptores em corpos lúteos, como descrito por Campbell, Dean-Emig e Moyle (64). É de esperar que estimule a formação de testosterona num ensaio com células de Leydig conduzido de modo semelhante ao descrito por Moyle et al. (37) e que estimule a ovulação em animais do sexo feminino e que estimule a formação de testosterona em mamíferos do sexo masculino. Também é de esperar que este análogo seja um bom ponto de partida para utilização na concepção de vacinas destinadas a aumentar ou inibir a fertilidade, utilizando o procedimento de modelo esboçado anteriormente. Este análogo está apresentado na Tabela 1 como Análogo #3 e contém uma sequência de ligação de GSGSGSGS. Este agente de ligação pode ser modificado digerindo o vector de expressão com enzimas endonucleases de restrição BamHI e Eco47III, deitando fora a porção pequena, ligando no sítio BamHI/Eco47III, por métodos comuns, uma cassete de DNA sintético de filamentação dupla com os codões de 65 aminoácidos desejados contendo qualquer número de codões de glicina ou serina ou outros codões de aminoácidos, sequenciando a região entre BamHI/Eco47III para confirmar que foram feitas as mutações desejadas e expressando a proteína em células COS-7. Isto pode ser feito para optimizar a actividade da gonadotropina de cadeia simples. Espera-se que a proteína funcione como monómero ou que se combine para formar homodímeros activos. Adicionalmente, é de esperar que várias cópias da proteína se combinem para formar multímeros.

Exemplo 12

Preparação de um análogo da subunidade sem sítios de glicosilação. (Ver Figura 9)

Espera-se que os Análogos 1-3 tenham 4 oligossacáridos ligados a asparagina, uma vez que têm 4 conjuntos de codões para a sequência Asparagina-X-Treonina/Serina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina. Verificou-se que a remoção dos oligossacáridos ligados a asparagina, particularmente os da subunidade , reduz a eficácia da hormona. Os sinais de glicosilação ligados a asparagina podem ser removidos da porção da subunidade das gonadotropinas de cadeia simples utilizando PCR como descrito aqui. 0 "primer" de PCR 16 com a sequência: 5'-TGCTTCTCTAGAGCATACCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTTGGTCCAAAAG CAAGTCACCT-3' e o "primer" de PCR 17 com a sequência: 3'-CAAAGTTTCACCTCGTTGTGTGCCGCACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGA ATTCCATGGCCATG-5' são utilizados numa reacção de PCR com o vector que é capaz de dirigir a expressão do Análogo 1 e que foi descrito no Exemplo 9 e Figura 6. Após 25 ciclos nas condições descritas no Exemplo 9, o produto de PCR e o 66 vector de expressão são digeridos com Xbal e Kpnl. 0 fragmento pequeno produzido por digestão do vector é deitado fora e o produto de PCR digerido é ligado no vector no seu lugar. Isto produz um vector de expressão que codifica o Análogo 11, um análogo que contém apenas 2 sinais de glicosilação ligados a Asn mas que se espera reter a sua afinidade para anticorpos e anti-soros que se ligam à hCG. Também se espera que retenha a sua afinidade para receptores da LH, como mostrado pela sua capacidade para competir com a hCG para a ligação a membranas de corpos lúteos de rato. No entanto, espera-se que tenha capacidade reduzida para induzir a transdução do sinal, especialmente quando se testa a sua capacidade para induzir a acumulação de AMP cíclico (37) . É possível criar derivados semelhantes dos Análogos 2 e 3, nos quais os oligossacáridos são removidos da porção da proteína derivada da subunidade digerindo cada um dos vectores de expressão com BamHI e Kpnl, deitando fora a porção mais pequena e ligando o pequeno fragmento BamHI/Kpnl obtido por digestão do Análogo 11. Assim, o Análogo 2 torna-se no Análogo 12 e o Análogo 3 torna-se no Análogo 13. De notar que também seria possível remover apenas um dos dois sinais de glicosilação na porção das gonadotropinas de cadeia simples derivada da subunidade simplesmente por alteração das sequências dos "primers" 16 e 17 durante a sua síntese e seguindo o protocolo esboçado aqui. Cada um destes análogos exibiria a mesma ligação de anticorpos e receptores dos seus precursores. Teriam eficácia reduzida e, em consequência, inibiriam a transdução do sinal. Os Análogos 11, 12 e 13 reduziriam a actividade da LH e estimulariam a fertilidade quando administrados na parte inicial da fase folicular do ciclo menstrual. Reduziriam a 67 actividade da hCG e iriam prevenir a fertilidade quando administrados perto da altura esperada da menstruação.

Exemplo 13

Preparação do Análogo la sem oligossacáridos ligados a asparagina. (Ver Figuras 10 e 11) A eficácia das gonadotropinas é proporcional ao seu teor de hidratos de carbono e, se bem que os Análogos 11, 12 e 13 tenham eficácia mais baixa, é possível reduzir ainda mais a sua eficácia eliminando todas as cadeias oligossacarídicas. As cadeias oligossacarídicas ligadas a asparagina podem ser eliminadas do Análogo 11 por SOEing com PCR (63), utilizando os "primers" 1 e 18 numa reacção e os "primers" 2 e 19 numa segunda reacção. O vector de expressão para o Análogo 11 serve de modelo em ambas as reacções. A sequência do "primer" #18 é: 5'- CGGGGTAGGTTCGGTGGGACCGACACCTCTTCCTCCCGACGGGG-3' e a sequência do "primer" #19 é: 3'- GTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTGCATCACCGTCAACACCACCATC-5'. Após 25 ciclos de temperatura a 94 °C (30 segundos), 55 °C (60 segundos) e 72 °C (60 segundos), 1 1 de cada reacção de PCR é misturado com o "primer" #5 e o "primer" adicional #2, novo tampão, enzima e desoxinucleótido trifosfatos. O produto da reacção, após 25 ciclos adicionais, é cortado com Xhol e BamHI e substitui o DNA original presente entre os sítios Xhol/BamHI do vector que codifica o Análogo 11. Isto é conseguido digerindo o vector com Xhol e BamHI, deitando fora o fragmento pequeno e depois ligando o fragmento grande ao produto de PCR digerido com Xhol/HamHI. Vários clones são sujeitos a sequenciação de DNA até se obter o que codifica o análogo esboçado na Figura 11, denominado Análogo la. Quando este é expresso em células 68 COS-7, a proteína produzida será reconhecida pelos mesmos anticorpos e anti-soros do Análogo 1. 0 Análogo la também irá ligar-se a receptores da lutropina, mas terá eficácia reduzida relativamente à hCG. Assim, será útil para reduzir a função da LH ou hCG. Quando administrado no início da fase folicular do ciclo menstrual, o Análogo la irá reduzir a síntese de androgénios. Em consequência, a síntese de estradiol irá diminuir, os níveis de FSH irão aumentar e a fertilidade será estimulada. 0 Análogo la também será útil para inibir a luteinização prematura do folículo. Quando administrado na fase luteínica próximo da altura esperada da menstruação, o análogo irá bloquear as acções da hCG e servir como indutor da menstruação e inibidor da fertilidade. 0 Análogo la também irá servir como bom composto de partida para conceber vacinas, utilizando a estratégia de modelo descrita anteriormente.

Exemplo 14

Preparação de outras gonadotropinas sem oligossacáridos ligados a asparagina 0 vector que codifica para o Análogo 2a é facilmente preparado a partir do Análogo la e do Análogo 12. 0 Análogo la é digerido com Kpnl e MstII e o fragmento pequeno é deitado fora. 0 fragmento grande é ligado separadamente ao fragmento pequeno preparado por digestão com Kpnl-MstII dos vectores codificadores para o Análogo 12. 0 Análogo 2a irá ligar-se aos mesmos anticorpos e receptores do Análogo 2. No entanto, a sua capacidade para induzir a transdução do sinal será reduzida. Consequentemente, servirá como inibidor. 0 Análogo 2a será maioritariamente eficaz no bloqueio da ligação de hormonas a receptores da LH. Dependendo da altura em que for administrado, o Análogo 2a 69 irá induzir fertilidade (isto é, quando for administrado na fase inicial do ciclo menstrual) ou irá inibir a fertilidade (isto é, quando for administrado próximo da altura da implantação ou menstruação esperada). A este respeito, os Análogos la e 2a terão actividades semelhantes. 0 vector que codifica para o Análogo 3a pode ser preparado por PCR de SOEing (63), no qual o Análogo 13 serve 1 de modelo. A estratégia para conceber os "primers" é semelhante à descrita para a preparação dos "primers" utilizados para modificar o vector de expressão para o Análogo la. Quando o Análogo 3a é expresso em células COS-7, as proteínas produzidas serão reconhecidas pelos mesmos anticorpos e anti-soros do Análogo 3. 0 Análogo 3a será útil para inibir a actividade de hormonas que se ligam a receptores da LH. Como tal, irá estimular a fertilidade quando for administrado no início da fase folicular. 0 Análogo 3a será útil como molécula de partida para conceber a vacina destinada a aumentar a fertilidade, utilizando a estratégia de modelo e anticorpos que conseguem neutralizar parcialmente a actividade da LH. 0 Análogo 3a também será útil como molécula de partida para conceber a vacina destinada a prevenir a fertilidade, utilizando a estratégia de modelo e anticorpos que conseguem neutralizar a actividade da LH.

Exemplo 15

Procedimento tipico para introduzir um sítio de glicosilação numa gonadotropina.

Devido à influência positiva de resíduos oligossacarídicos na estabilidade de hormonas em 70 circulação, é muitas vezes útil adicionar às proteínas cadeias oligossacarídicas extra. A adição de oligossacáridos também pode ser utilizada para prevenir interacções indesejadas de anticorpos ou receptores. As superfícies da proteína que não interagem com receptores são sítios úteis para adicionar cadeias oligossacarídicas que se destinam a estimular a função da hormona. Isto pode ter um efeito importante na modulação das actividades de hormonas glicoproteicas de cadeia simples ou na modulação das actividades das hormonas glicoproteicas , -heterodiméricas. Por exemplo, a adição de um sinal de glicosilação à subunidade da FSH nos resíduos 71-73, para criar um oligossacárido ligado a asparagina no resíduo 71, conduzirá a uma hormona com maior actividade. Inversamente, a adição de um resíduo de glicosilação nesta região da proteína depois das outras glicosilações terem sido removidas irá aumentar a sua actividade inibidora. Métodos para efectuar a mutagénese são comuns na área e variam desde a síntese total das sequências codificadoras por ligação de blocos de oligonucleótidos sintéticos (54) até PCR de SOEing (63). Já foram apresentados vários exemplos de mutagénese por PCR de SOEing.

Exemplo 16

Utilização de sequências diferentes das derivadas de subunidades humanas.

Os Análogos 1-3 e, em particular, os Análogos la-3a servirão como compostos de partida úteis para a concepção de vacinas dirigidas pelo modelo. Para o desenvolvimento de vacinas específicas para hormonas a serem utilizadas em humanos, é útil preparar análogos semelhantes aos listados na Tabela 1 com uma subunidade não humana em vez da 71 subunidade humana. Isto deve-se ao facto da subunidade bovina tornar as proteínas mais diferentes das hormonas humanas do que os análogos listados na Tabela 1. A abordagem para conceber hormonas glicoproteicas de cadeia simples é semelhante à listada nos Exemplos 9-11, com a excepção das sequências codificadoras para as subunidades não humanas substituírem as sequências da subunidade humana ilustradas. De modo semelhante, os sinais de glicosilação podem ser removidos alterando os codões para asparagina ou serina ou treonina, ou inserindo uma prolina entre a asparagina e a serina ou treonina.

Adicionalmente, quando se utiliza a estratégia de modelo para conceber imunogenes, é frequentemente desejável partir de uma molécula não humana com pouca, se alguma, afinidade para os modelos utilizados na selecção positiva e introduzir resíduos que irão resultar em selecção. Estes análogos podem ser preparados substituindo as sequências da subunidade da FSH, LH ou TSH de fontes não humanas em vez da sequência da CG humana ilustrada nos Exemplos 9-15 e Tabela 1.

Tabela 1

Estruturas de Gonadotropinas de Cadeia Simples

Análogo Composição 1 p-hCGP(1-145)-Agente de ligação-α humana(1-92)-c 2 n-hCGP(1-114)-Agente de ligação-α humana(1-92)-c 3 n-hLHp(1-114)-Agente de ligação-α humana(1-92)-c la n-hCGP(1-145)[N13X,N30X]-Agente de ligação-α humana(1-92)[N52X,N78X]-c 2a n-hCGP(1-114)[N13X,N30X]-Agente de ligação-α humana(l-92)[N52X,N78X]-c 3a n-hLHp(1-114)[N30X]-Agente de ligação α humana(1-92)[N52X,N78X]-c 72

Definições das letras e sequências da Tabela 1. "n-" refere-se ao terminal N da proteína. "c-" refere-se ao terminal C da proteína. "hCG (1-145)" refere-se aos resíduos 1-145 da sequência de aminoácidos da subunidade da hCG: smPV^^CB^mAft^mwcpYCJTmTnCAOYçrmjRVL^vi^/^ QYV€ΐmΦVXFmΐMJPQCPlmYWW$YÁVM£ÇQCAL·CmSTmÇi&P&

&H^LTCÚDPi^QDSâSSíL^PÍí$IJiSPSllLPGPSDTPlOíQ "hCG (1-114)" refere-se aos resíduos 1-114 da sequência de aminoácidos da subunidade da hCG:

SKEPli^RCRPINATI^V^GCPVCÍTV^ritCAGYCPTOTllVU3GVO»ALF QVYCNYK0Via^ll«JPGCPRGVM»¥V§TAVALSCQCAÍJCRRSTmcq<5PÃ

DHPLTCDPPR "hLM (1-114)" refere-se aos resíduos 1-114 da sequência de aminoácidos da subunidade da hLH:

SREPO^WÒJPlHAliAVmBGCPVCITVNIllCAGYCFlMhmVLQAVXJPPlJP QVVCTYI^VRFESIRIiPGCPRGVDPYVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPiCr? HPLT CDHPQ ‘ ' ‘ "N13X" refere-se à substituição do resíduo asparagina 13 da subunidade da hCG e análogos por glutamina ou outro aminoácido. "N30X" refere-se à substituição do resíduo asparagina 30 da subunidade da hCG ou hLH e análogos por glutamina ou outro aminoácido. "N52X" refere-se à substituição do resíduo asparagina 52 da subunidade humana e análogos por glutamina ou outro aminoácido. 73 "Ν78Χ" refere-se à substituição do residuo asparagina 78 da subunidade humana e análogos por glutamina ou outro aminoácido. " humana(1-92)" refere-se aos resíduos 1-92 da sequência da subunidade humana:

AP£)VQDClPECTLQEHPFFSQPGAPIIjQ<^GCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKK

VtSESTÇCVAKSYNRVTVMGGFK^EHHTACHCSTCTrHí^ "Agente de Ligação" refere-se a uma sequência contendo aminoácidos glicina e serina repetidos, como GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS ou qualquer outra sequência de aminoácidos que permita que as sequências das subunidades e da gonadotropina de cadeia simples formem um complexo em que as porções das subunidades e são combinadas com as porções das subunidades e da mesma ou de outra molécula.

Notas para a Tabela 1: 1. A ordem dos componentes da esquerda para a direita na tabela é a ordem da ocorrência dos componentes na proteína desde o terminal amino até ao terminal carboxi. 2. Devido à conservação elevada de sequências em todas as gonadotropinas de vertebrados que pode ser reconhecida pelo alinhamento dos seus resíduos cisteína, podem preparar-se gonadotropinas de cadeia simples por substituição das porções correspondentes das subunidades da hCG, hLH e hFSH por quaisquer resíduos homólogos. 3. A sequências das subunidades de gonadotropinas de outras vertebrados podem substituir a humana(1-92). Isto 74 inclui, mas não se limita aos resíduos 1-96 da subunidade bovina. 4. Como mostrado, a ordem dos componentes tem as sequências derivadas do terminal amino da subunidade das sequências derivadas da subunidade . A ordem dos componentes na tabela pode ser invertida, de modo que as sequências da subunidade sejam amino-terminais relativamente às sequências da subunidade 5. As sequências de aminoácidos estão apresentadas no código comum de uma letra excepto quando notado. 6. Podem preparar-se sequências codificadoras para todos estes análogos por métodos comuns de DNA recombinante bem conhecidos na área. Um procedimento para prepará-las é o proporcionado por Campbell et al. (54). Podem ser expressas em células eucarióticas por métodos bem conhecidos na área, utilizando vectores que foram concebidos para expressão eucariótica e que são disponibilizados pela InVitrogen, San Diego, CA. As que não contêm cadeias oligossacarídicas também podem ser preparadas em E. coli por métodos bem conhecidos na área, utilizando vectores tais como os vectores pET que podem ser adquiridos à Novagen. 7. Os sítios de glicosilação nas asparaginas 13 e/ou 30 da subunidade da hCG podem ser destruídos por substituição da asparagina como ilustrado e/ou por substituição dos resíduos 14 e/ou 31 por uma prolina e/ou por substituição dos resíduos 15 e/ou 32 por qualquer outro aminoácido diferente de serina ou treonina. 75 8. 0 sítio de glicosilação na asparagina 30 da subunidade da hLH pode ser destruído por substituição da asparagina como ilustrado e/ou por substituição do resíduo 31 por uma prolina e/ou por substituição do resíduo 32 por qualquer outro aminoácido diferente de serina ou treonina. 9. Os sítios de glicosilação nas asparaginas 52 e/ou 78 da subunidade humana podem ser destruídos por substituição da asparagina como ilustrado e/ou por substituição dos resíduos 53 e/ou 79 por uma prolina e/ou por substituição dos resíduos 54 e/ou 80 por qualquer outro aminoácido diferente de serina ou treonina. 10. Os sítios de glicosilação nas asparaginas 56 e/ou 82 da subunidade não humana podem ser destruídos por substituição da asparagina por qualquer outro aminoácido e/ou por substituição dos resíduos 57 e/ou 83 por uma prolina e/ou por substituição dos resíduos 58 e/ou 84 por qualquer outro aminoácido diferente de serina ou treonina.

Tabela 2

Propriedades e utilizações dos análogos ilustrados na

Tabela 1

Análogo Actividade Utilização 1 2 3 Ia

LH LH LH Anti-LH Anti-LH Anti-LH

Induz ovulação; Aumenta fertilidade masculina

Induz ovulação; Aumenta fertilidade masculina

Induz ovulação; Aumenta fertilidade masculina *Facilita ovulação; Termina gravidez; Reduz secreção de androgénios *Facilita ovulação; Termina gravidez; Reduz secreção de androgénios *Facilita ovulação; Termina gravidez; Reduz secreção de androgénios 76

Os compostos da presente invenção podem ser administrados a mamíferos, por exemplo, animais ou humanos, em quantidades eficazes para proporcionarem o efeito terapêutico desejado. Uma vez que a actividade dos compostos e o qrau do efeito terapêutico desejado variam, o nível de dosaqem do composto empregue também irá variar. A dosagem real administrada também será determinada por factores geralmente reconhecidos tais como o peso corporal do paciente e a hiper-sensibilidade individual do paciente particular.

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Lisboa, 27 de Novembro de 2006

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo não neutralizador que se liga à subunidade β da hormona luteinizante e que reduz, mas não elimina, a actividade de hormonas glicoproteicas nos receptores da hormona luteinizante mesmo que esteja presente numa concentração para se ligar à totalidade da referida hormona glicoproteica presente, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a estimular a fertilidade em mamíferos do sexo feminino por estimulação da produção da hormona estimulante do folículo.

2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o mamífero é um humano e a hormona luteinizante é a hormona luteinizante humana.

3. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 2, em que o anticorpo se liga à subunidade β da hormona luteinizante quando a hormona luteinizante está ligada a um receptor da hormona luteinizante.

4. Utilização de acordo com a Reivindicação 3, em que o anticorpo se liga a um dos resíduos entre as posições 70-80 da subunidade β da hormona luteinizante.

5. Utilização de acordo com a Reivindicação 4, em que o anticorpo se liga a um dos resíduos entre as posições 74-77 da subunidade β da hormona luteinizante. 2 2 das para

6. Utilização de acordo com qualquer uma Reivindicações 1 até 5, em que o anticorpo é utilizac regular a ovulação em humanos do sexo feminino. Lisboa, 27 de Novembro de 2006