PT812593E - Vacinas contendo monofosforil-lipido a 3-o-desacilado na sua composicao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

VACINAS CONTENDO MONOFOSFORIL-LÍPIDO A 3-0-DESACILADO NA SUA COMPOSIÇÃO A presente invenção relaciona-se com novas formulações de vacinas, métodos para a sua preparação e com a sua utilidade terapêutica. O monofosforil-lípido A 3-0-desacilado (ou monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado) foi inicialmente denominado MPL-3D ou MPL-d3 para indicar que a posição 3 do extremo redutor da glucosamina é de-O-acilada. Para a sua preparação veja-sc GB 220 211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil-lípido A 3-desacilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Aqui o termo MPL-3D (ou MPL-3d) é abreviado para MPL uma vez que "MPL" é uma marca registada da Ribi Immunochcm., Montana que é usada pela Ribi para se referir sem ambiguidade ao seu produto monofosforil-lípido A 3-O-desacilado. GB 2 220 211A menciona que a endotoxicidade dos lipossacarídeos (LPS) enterobacterianos previamente usados c reduzida ao mesmo tempo que se conservam as propriedades imunogénicas. Contudo GB 2 220 211 citou estas descobertas meramente em conexão com a sistemas bacterianos (gram negativos). Não é mencionado o tamanho de partícula de MPL. De facto as partículas do monofosforil-lípido A 3-O-desacilado conhecido têm dimensões de partícula de 500 nm em excesso.

Na WO 92/16231 foi revelada a formulação da vacina compreendendo a glicoproteína gD do Vírus Herpex Simplex ou fragmentos imunológicos resultantes, em conjunto com o monofosforil-lípido A 3 desacilado. Aqui também não se faz alusão ao tamanho de partícula do monofosforil-lípido A 3- desacilado.

Na WO 92/06113 foi revelada uma formulação de vacina compreendendo HIV gp 160 ou um seu derivado tal como o gp 120 em conjunto com monofosforil-lípido A 3-O-desacilado. Não se faz nenhuma menção do tamanho de partícula de MPL. A presente invenção fomccc uma vacina compreendendo uma composição de um antigénio em conjunção com monofosforil-lípido A 3-0-desacilado(abreviado aqui a MPL) e um transportador em que o tamanho de partícula do MPL é " pequena" e em geral não excede 120 nm quando preparada.

Tal formulação é adequada para uma larga variedade de vacinas monovalentes e polivalentes.

Surpreendentemente descobriu-se que vacinas com composições de acordo com a invenção tem propriedades particularmente vantajosas como as que aqui se descrevem. Em particular as formulações são altamente imunogénicas. Adicionalmente, pode sei assegurada a esterilidade do adjuvante de formulação dado que o produto é susceptível de filtração estéril. Uma outra vantagem do MPL "pequeno” deriva das formulações com hidróxido de alumínio, dado que o MPL interage com hidróxido alumínio e o antigénio para formar uma única identidade.

Numa das realizações desta invenção, o antigénio é um antigénio virai, por exemplo um antigénio contra a infecção da hepatite (Hepatite A, B, C, D ou E) ou Herpes (HSV-1 ou HSV-2) como descrito mais adiante. Um artigo de revisão sobre vacinas modernas de hepatiteB, incluindo ura número de referências chaves, encontradas talvez no Lancet, de 12 de Maio 1990 na página 1141 ff (Prof. A.L e W.F Eddesten) veja-se também Hepatite virai e doença do fígado (Vyas, B.N, Dienstag, J.L e Hoofnagle, J.H, eds, Grune e Stratton, Inc (1984) e " Hepatite Virai e doença do fígado (Proceedings do Simpósio Internacional dc 1990, eds F.B. Hollinger, S.M: Lemon e H. Margolis, publicadas por Williams e Wilkins). Referências a HSV-1 e HSV-2 podem ser encontradas na W092/16231.

InfecçOes a vírus de hcpatitca Λ (HAV) são um problema de propagação, mas as vacinas que podem ser usadas para a imunização em massa estão disponíveis, por exemplo o produto "Havrix'' (Smithkline Becham Biologicals) que é uma vacina morta atenuada obtida da estirpe HM-175 de HAV [veja vacinas inactivas Candidatas para a Hepatite A, por F.E. André, A Hepbum e E.D.' Hondt, Prog Med.Virol. Vol 35, pag. 72-95 (1990) e a monografia do produto "Havrix" publicado pelo Smithkline Beecham Biologicals (1991)].

Flehming et al (loc cit. Paginas 56-71) têm revisto os aspectos clínicos, virologia, imunologia, e epidemiologia da Hepatite A e discutido abordagens ao desenvolvimento de vacinas contra estas infecções virais comuns.

Tal como ela utilizada aqui a expressão "antigénio HAV" refere-se a qualquer antigénio capaz de estimular a neutralização anticorpos de "HAV" no homem. O antigénio HAV pode compreender partículas de vírus vivos atenuados ou vírus de partículas inactivadas atenuadas ou também, por exemplo uma cápsula HAV ou uma proteína HAV virai a qual pode ser convenientemente obtida por tecnologia recombinante de DNA. A propagação da infecção com vírus de hepatites B (HBV) é um problema, mas vacinas que podem ser usadas na imunização em massa estão disponíveis, por exemplo o produto Engerix-B (Smithkline Beechman plc) o qual é obtido por técnicas de engenharia genética. A preparação de antigénio de superfície de Hepatite B (AgsHB) é bem documentada, veja-se por exemplo, Harford e al. em Develop. Bíol. Standard 54, página 125 (1983) Gregg et Al em Biothecnology, 5, pag. 479 (1987), EP-A- 0 226 846, EP-A-0 299-108 e referências nele incluídas.

Como usado aqui na expressão "antigenio de superfície Hepatite B" ou "AgsHB" inclui qualquer antigénio AgsHB ou fragmento resultante demonstrando a antigenicidade do antigénio de superfície HBV. É para ser tido em conta que para além da sequência de 226 ácido aminados do antigénio AgsHB S (veja-se Tiollais et Al, Nature, 317, 489 (1985) e as referências aí mencionadas) o AgsHB tal como aqui descrito pode, se desejado, conter toda ou parte de uma sequência pré-S como descrita nas referências acima mencionadas em EP-A-0 278 940. Em particular o AgsHB pode compreender um polipeptídeo consistindo numa sequência de aminoácidos incluindo resíduos 12-52 seguidos de resíduos 133-145 seguidos de resíduos 175-400 da L-proteína de AgsHB relativamente à sequência de iniciação de leitura num vírus Hepatite B de um serotipo ad (este polipeptídeo é referido como L*; veja-se 0 414 374). O AgsHB pode também incluir no âmbito desta invenção o polipeptídeo preSl-PreS2 descrito na EP 198 474 (Endotronics) ou análogos resultantes como os descritos na EP 304 578 (Mc Comick e Jones). O AgsHB, como aqui descrito pode também referir-se a mutantes, por exemplo o "Mutante de evasão" descrito na WO 91/14703 ou no Pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 511 855 Al, especialmente o AgsHB em que a substituição de aminoácido na posição 145 é de glicina por arginina.

Normalmente o AgsHB estará na forma de partícula. As partículas podem compreender por exemplo a proteína S sozinha ou podem ser partículas compostas, por exemplo (L*, S) em que L* é definida acima e S denota a proteína S de AgsHB. A dita partícula está, com vantagem, na forma em que é expressa na levedura. A Glicoproteína D do vírus Herpes Simplex está localizada no envelope virai c é também encontrada no citoplasma das células infectadas. (Eiscnbcrg R.J et al J. of Virol. 1980 35 428-435). Compreende 393 aminoácidos incluindo um sinal peptídeo e lem um peso molecular dc aproximadamente 60kD de todas as glicoproteínas envelope de HSV esta é provavelmente a melhor caracterizada (Cohen et al J. Virology 60 157-166). In vivo, é conhecida por jogar um papel central na fixação às membranas celulares. Mais ainda, demonstrou-se que a glicoproteína G está implicada em induzir anticorpos neutralizantes in vivo (Eing et al. J.Med. Virology 127: 59:65). Porém, vírus HSV2 latentes podem ser reactivados e induzir a recorrência da doença apesar da presença do elevado título de anticorpos nos soros de doentes. Toma-se portanto aparente que a habilidade para induzir anticorpos por si só é insuficiente para controlar a doença eficazmente. A glicoproteína D (xgD2t) truncada rccombinante matura ou proteínas equivalentes segregadas por células de mamíferos, é preferencialmente usada na formulação de vacinas da invenção presente. Proteínas equivalentes incluem a glicoproteína gD de HSV-1

Num aspecto preferido, a rgD2t é a glicoproteína D de HSV-2 contendo 308 aminoácidos e que compreende aminoácidos de 1 até 306 de glicoproteínas ocorrendo naturalmente com a adição de Asparaginase e Glutamina e no extremo terminal C da proteína truncada. Esta forma de proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para produzir um amino ácido proteico maturo de 283 aminoácidos. A produção dessa proteína nas células do ovário do Hamster chinês tem sido descrita na Patente Europeia da Genentech's EP-B-139 417 e Science 222 p524. e Biotecnologia pag 527 de Junho de 1984. Esta vacina quando formulada com MPL pequeno, de acordo com a presente invenção apresenta um potencial terapêutico superior se comparado ao das formulações rgD2t conhecidas.

Enquanto certas vacinas experimentalmente e comercialmente conhecidas conduzem a resultados cxcclcntcs, é um facto aceite que uma vacina óptima é a que precisa de estimular não apenas um anticorpos neutralizantes mas também estimula, o mais eficazmente possível, a imunidade celular-mediada através das células T.

Uma vantagem particular é que as formulações das vacina da invenção são muito eficazes na indução da imunidade, mesmo com doses muito baixas de antigénio.

Elas providenciam protecção excelente contra a infecção primária e recorrente e estimulam com vantagem ambas as respostas imunitárias humorais específicas (anticorpos neutralizantes) c também as mediadas pelas células efectoras (HTR).

Para fazer o monofosforil-lípido A 3-desacilado com partículas de tamanho muito pequeno, em geral não excedendo 120 nm, pode seguir-se o procedimento descrito em GB 2 220 211 para se obter o MDL-3D conhecido (ou podes ser adquirido de Ribi Immunochem MPL comercial de partículas de tamanho mais largo ) e o produto pode ser submetido a sonicação até que a suspensão fique transparente. O tamanho das partículas pode ser calculado -7- / , £ usando dispersão dinâmica de luz como descrito mais à frente. Com o fim de manter o tamanho de partículas no intervalo de 100 nm depois de ser formulado com hidróxido de sódio, podem ser adicionados o antigénio e o tampão, tween 80 ou sorbitol . Sob estas condições fica estabelecido que o MPL não se agrega em presença do tampão fosfato, como pode acontecer durante a formulação sem ele. Nesta modalidade a formulação final é mais adiante definida e caracterizada. Foi também estabelecido que sob estas condições, MPL ainda interage com o hidróxido de alumínio e o antigénio formando uma só identidade.

Uma solução transparente de MPL constitui um aspecto da invenção. Esta solução pode ser esterilizada passando-a através de um filtro.

Preferencialmente o tamanho das partículas encontra-se no intervalo 60-120 nm.

Com maior vantagem o tamanho das partículas situa-se abaixo de 100 nm. O MPL, como acima definido, está normalmente presente no intervalo de 10-200pg, preferencialmente 25-50 pg por dose em que o antigénio pode estar tipicamente presente num intervalo entre 2-50 pg por dose ou mais. A formulação da vacina da presente invenção pode conter adicionalmente imuno-estimulantes, em realizações preferidas de vacinas da presente invenção podem incluir QS21 (ás vezes referido como QA21). Trata-se de uma fracção de HPLC do extracto de saponina derivada da casca da árvore, Quillaja Saponaria Molina e o método para a sua produção é revelado na patente US 5,057 540. O transportador pode opcionalmente ser uma emulsão óleo em água, um veículo lipídico ou hidróxido da alumínio, (sal de hidróxido de alumínio).

Emulsões óleo em água, não tóxicas, contêm preferencialmente um óleo não tóxico, e.g. esqualeno e um emulsificante Tween 80, num transportador aquoso. O transportador aquoso pode ser por exemplo, tampão de fosfato. Salino.

Preferencialmente as formulações da vacina conterão um antigénio ou uma composição antigénica capaz de induzir uma resposta a um agente patogénio humano ou animal, cujo antigénio ou composição antigénica é derivada de HIV-1 (tal como gp 120 ou gp 160; veja-se WO 92/06113 e referências nela incluídas), vírus herpes tal como gD ou derivados resultantes ou proteínas precoces imediatas tal como ICP27 do HSV-1 ou HSV-2, gB (ou derivados deles resultantes) do citomegalovírus humano, ou gpll, ou III de outros vírus patogénicos, tal como vírus Sincitial respiratório, do vírus humano do papiloma ou do vírus da influenza ou contra o patogenes bacterianos, tais como a Salmonellea, Neisseria, Borrelia, por exemplo OspA ou OspB ou derivados deles resultantes, ou Clamídea ou Bordetella por exemplo, P.69, PT e FHA, ou contra parasitas tais como o plasmódio ou o Toxoplasma. As formulações de vacina da presente invenção podem conter um tumor antigénio e serem úteis como uma vacina contra o cancro.

Uma realização da invenção é o antigénio HAV (por exemplo como um Havrix) numa mistura com MPL e hidróxido de alumínio como descrito mais à frente.

Uma outra realização desta invenção é o antigénio do vírus de superfície HB (AgsHB) (por exemplo como no Engerix-B) numa mistura com MPL e hidróxido de alumínio como descrito mais a baixo.

Uma outra realização específica da invenção é o antigénio AgsHB -9- rr /“> como partículas (L*, S), definidas aqui em cima, numa mistura com hidróxido de alumínio.

Uma combinação de vacinas da Hepatite A mais Hepatite B podem ser tambcm preparadas de acordo com a invenção.

Uma outra realização desta invenção é a formulação de acordo com a invenção compreendendo glicoproteínas truncadas maturas (rgD2t) ou proteínas equivalentes como descrito mais abaixo. Mais uma realização é a formulação da invenção compreendendo um antigénio OspA ou um derivado dele resultante de Bomelia Burgdoferi, por exemplo antigénios particularmente OspA podendo ser usados antigénio das estirpes ZS7 ou B31.Outra realização é a formulação da invenção compreendendo um antigénio da gripe. Tal fornece uma da vacina da gripe melhorada especialmente se um vírus "dividido" for usado. A formulação pode ser também útil para se utilizar com partículas leves herpéticas tais como as descritas no Pedido dc Patente Internacional n.° PCT/GB92/00824 e no Pedido de Patente Internacional nO PCT/GB92/00179. É uma vantagem que a composição da invenção contenha outros antigénios para que seja efectiva no tratamento da profilaxia de uma ou mais infecções bacterianas fúngicas e virais.

Por exemplo, formulações da vacina da hepatite de acordo com esta invenção, contêm pelo menos um outro componente seleccionado de antigénios não-hepatíticos os quais são conhecidos na técnica por fornecer protecção contra um ou mais das infecções seguintes: difteria, tétano, tosse convulsa, gripe Haemophilus influenza b(Hib)) e poliomielite.

Preferencialmente a vacina de acordo com a invenção inclui AgsHB como definida mais acima.

Vacinas de combinação particular no âmbito desta invenção incluem uma formulação combinação da vacina DTP (diitérica - tetânica e pertússica)- Hepatite B, uma formulção de vacina Hib-HepatiteB, uma formulação dc vacina DTP-Hib-Hepatite B e uma vacina de formulação IPV (vacina polio inactivada) -DTP-Hib-Hepatite B.

As combinações acima podem, com vantagem, incluir uma componente que dã protecçâo contra a Hepatite A, especialmente a estirpe morta atenuada derivada da estirpe HM-175 tal como está presente no Havrix.

Componentes adequados para uso com tais vacinas são já comercialmente disponíveis e detalhes podem ser obtidos da Organização Mundial de Saúde. Por exemplo o componente IPV pode ser a vacina da polio Salk, inactivada. A vacina pertússica pode compreender a célula inteira ou conteúdos da célula. A vacina da hepatite ou a vacina combinada segunda esta a invenção é com vantagem uma vacina pediátrica.

Num aspecto adicional, a invenção fornece uma composição de vacina de acordo com a invenção para uso em terapia médica, partioularmente para uso no tratamento ou profilaxia de infecções incluindo infecções virais e bacterianas ou para o tratamento imunoterapêutico do cancro. Num aspecto preferido da vacina de acordo com a invenção é uma vacina útil para o tratamento de infecções em curso, por exemplo hepatite B ou infecções herpéticas em humanos que delas sofram. A preparação da vacina é geralmente descrita em novas tendências c desenvolvimentos em vacinas, editadas por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. A encapsulação em liposomas é descrita por exemplo por Fullerton, Patente US 4 235 877. A conjugação de proteínas com macromoléculas é revelada, por exemplo, por Likhite, Patente US 4 372 945 e por Armor et al, Patente US 4 474 757. A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos adversos significativos em vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo dos imunogenos específicos que são empregues. Geralmente espera-se que cada dose compreenda 1-1000 pg de imunogeno total preferencialmente 2-100 pg, mais preferencialmente 4-40 pg . Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser acertada por estudos padrão envolvendo a observação de títulos de anticorpos e outras respostas nos sujeitos. Seguindo uma vacinação inicial os sujeitos podem receber um reforço nas quatro semanas seguintes.

Para além disto a presente invenção providencia um método de fabrico da vacina eficaz na prevenção ou tratando a infecção, em que o método compreende misturar o antigénio com o transportador em que o tamanho de partícula do MPL é não maior que 120nm, normalmente 60-120nm, preferencialmente menos que 100 nm.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção e as suas vantagens; Exemplo 1: Preparação de MPL com uma dimensão de partícula de 60-120 nm Água para injecção é injectada em frascos contendo monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (MPL) de Ribi Immunochemm., Montana usando uma seringa para chegar à concentração de 1 a 2 mg por ml. Uma suspensão preliminar foi obtida misturando num Vortex. O conteúdo dos frascos é então transferido para tubos Corex de fundos arredondados Corex (10 ml de suspensão por tubo) e a suspensão foi submetida a sonicação usando um banho de água sonicador. Quando a suspensão se tomou clara, a dimensão das partículas foi calculada usando dispersão dinâmica da luz. (Malven Zetasizer 3). O tratamento foi continuado até que a dimensão das partículas estivesse na zona 60-120 nm.

As suspensões podem em alguns casos extremos ficar armazenadas a 4 °C sem agregação significativa até 5 meses. NaCl isotónico (0,15 M) ou NaCl isotónico com 40 mM de fosfato induz a agregação rápida, (medida >3-5 pm).

Exemplo 2: Produção de em larga escala de MPL solúvel com uma dimensão de partícula de 100 nm. O monofosforil-lípido A 3-O-desacilado liofilizado foi obtido da Immunochem Ribi e suspenso em água para injecção (API). A suspensão foi continuamente bombeada através de uma célula de fluxo de ultra-som. A célula de fluxo é tipicamente feita de vidro ou de aço inoxidável com selagem de PTFE para estar em conformidade com as recomendações BPM. O ultra-som é gerado usando um gerador de ultra-sons e uma trompa sónica de titânio (sonotrode) adquirida da Undatim Ultrasonics (Louvain-La Neuve, Bélgica). Um permutador de calor é incorporado no circuito para evitar a degradação do produto pelo calor. A temperatura de MPL entre a admissão e a saída da célula de fluxo é mantida entre + 4°C e 30 °C e a diferença da temperatura entre saída e a entrada é mantida abaixo de 20 °C. É tido em consideração que também o calor é removido à medida que o material passa através do aparelho. O aparelho usado é esquematicamente representado na figura 1. 2.1. Sonicação O pó MPL (50 a 500 mg) é suspenso em água para injecção numa concentração entre 1 e 2 mg/ml. A suspensão MPL (sob condições de agitação) é continuamente bombeada através do circuito de sonicação (veja-se figurai) a uma velocidade ente 50 a 100 ml por minuto no sentido de atingir uma temperatura de equilíbrio do sistema que é entre + 4 e + 15 °C. O espectro de frequência da cometa acústica na configuração do sistema (Energia, Célula de Fluxo, Caudal Líquido, T°) é ajustado consoante ao instruções do equipamento dadas pelo fornecedor. Limites preestabelecidos são fixados entre 19 000 Hz e 21 000Hz para o transdutor de 20 000 Hertz. O gerador permite o controlo de uma eficiência óptima da sonicação (mais transmissão de energia com menos calor) num determinado intervalo. A temperatura durante o processo é mantida abaixo dos 30 °C para impedir a degradação do MPL. O processo fica completo quando a dimensão a partícula é reduzida abaixo de 100 nm e a solução se toma transparente por inspecção visual. Durante o processo de sonicação amostras processadas são retiradas par avaliação de tamanho de partículas por espectroscopia de fotocorrelação (dispersão de luz dinâmica) usando Malvem Zetasizer tipo 3 da mesma maneira que no exemplo 1. O tempo de residência do líquido na célula de fluxo no sonicador é calculado entre 2,5 e 3,5 minutos (quadro 1), usando uma célula de capacidade de 20 ml e uma velocidade de circulação de 50 ml/min. Este caudal dá uru tempo de residência média de 25 segundos por ciclo e normalmente menos de 10 ciclos são necessários para obter o efeito desejado de MPL de partículas pequenas. 2.2 Esterilização do Processo O MPL "solubilizado" resultante é esterilizado pela filtração final sob pressão negativa através duma membrana hidrofílica PVDF de 0,22 pm. A pressão observada é usualmente abaixo 1 bar. Pelo menos 25 mg de MPL solubilizado são facilmente processados por centímetro quadrado com uma recuperação acima de 85%. 2.3 Armazenagem/ Estabilidade O solubilizado estéril de MPL é armazenado de +2° a 8o C. Os dados de estabilidade (Malvem) não mostraram nenhuma diferença significativa da dimensão de partícula depois de 6 meses de armazenagem (ver quadro 2)

Exemplo 3: Formulação da vacina de Hepatite B MPL (tamanhos de partículas menores que lOOnm) foi preparada como descrito no Exemplo 1. Hidróxido de Alumínio foi obtido de Superfos (Alhidrogel). O MPL foi novamente suspenso em água para injecções numa concentração variando entre 0,2 a 1 mg/ml por sonicação em banho de água até que as partículas atinjam um tamanho entre 80 a 500 nm medidos por correlação fotográfica de dispersão da luz. 1 a 20 μg de AgsHB (anligénio S como na Engerix B) numa solução de tampão fosfato a lmg/ml) é adsorvido em 30 a 100 pg de hidróxido de alumínio (solução a 10,38 AI 3+ mg/ml) por uma hora à temperatura ambiente com agitação. A solução é então adicionada 30 a 50 pg de MPL (solução de lmg/ml). O volume e a osmolaridade são ajustadas com 600 μΐ com água para injecção e o tampão fosfato concentrado 5x. A solução é incubada à temperatura ambiente durante uma hora e mantida a 4o C até ao utilização. A maturação da fórmula ocorre durante a armazenagem. Isto representa 10 doses injectáveis para testes em ratinhos.

Exemplo 4: Formulação da vacina da Hepatite A MPL (tamanho de partícula inferior a 100 nm) foi obtido como descrito no Exemplo 1. Obteve-se o hidróxido de alumínio de Superfos (Alhydroel). HAV (360 a 22 EU por dose) foi adsorvido previamente em alumínio hidróxido 10 % com a concentração final de (0,5 mg/ml). O MPL (12,5 a 100 pg por dose) foi adicionado à solução. O hidróxido dc alumínio remanescente foi adicionado à solução e deixado por uma hora à temperatura ambiente. Os volumes são ajustados com o tampão fosfato (fosfato lOmM, NaCl 150 mM) e a formulação final c depois armazenada a 4°C até utilização.

Exemplo 5-Comparação da Eficácia do Adjuvante de uma vacina de sub-unidade da Glicoproteína D de Herpes Recombinante Simplex 5.1. Neste estudo a habilidade de diversas formulações MPL Al(OH)3 para melhorar a imunidade protectora de uma proteína D truncada do vírus Herpcs Simplex tipo 2 (HSV2) (rgD2t) foi avaliado nos modelos profiláticos e terapêuticos de porquinho da índia. Estudos de imunogenicidade foram também realizados em primatas. O objectivo destas experiências foi o de investigar o impacto do tamanho das partículas das formulações do monofosforil-lípido A 3-O-desacilado na imunogenicidade e eficácia protectora de rgD2t AI (OH)3 em roedores c primatas. Três formulações diferentes Al(OH)3 de MPL de dimensões pequena foram testadas: A1(0H)3 MPL 100 nm (como descrito previamente)

Al(OH)J MPL 100 nm com sorbitol Al(OH)3 MPL 100 nm com tween 5.2 Preparações de Adjuvante e esquemas de imunização. 5.2.1. Formulações de antigénio

Hidróxido de alumínio foi obtido de Supcrfos (Alhydrogel, superfos, Dinamarca). MPL foi obtido de Ribi Immunochem Research Inc.

5.2.1.1. rgD2t (Al(OH)3/MPL TEA MPL foi resuspenso por sonicação em um banho de água para dar tamanhos compreendidos entre 200 a 600 nm. A preparação foi preparada de acordo com a candidatura a patente W092/16231, e foi armazenada a 4°C até utilização.

Uma dose contem 5 μg rgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 e 50pg MPL. 5.2.1.2.rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm MPL (tamanho de partícula menos de 100 nm) foi obtido como descrito no Exemplo 1. rgD2t foi absorvido em hidróxido de alumínio e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. 0 MPL foi adicionado à solução à concentração requerida c incubado ainda mais uma hora à temperatura ambiente. A preparação ficou completa com PBS para atingir uma concentração final dc 10 mM P04, 150 mM NaCl. A formulação foi ainda incubada por 30 minutos à temperatura ambiente e armazenada a 4o C até utilização.

Uma dose contém 5 μg rgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 e 50pg MPL. 5.2.1.3. rgD2t/AI(OH)3/MPL 100 nm sorbitol MPL foi preparado como descrito no Exemplo 1. rgD2t foi adsorvido em hidróxido dc alumínio e incubado durante 1 h à temperatura ambiente. Uma solução de 50% de sorbitol foi então adicionada para atingir uma concentração final de 5%. Uma solução de Tris- 10 mM foi então adicionada para preencher o volume final desejado e a solução foi incubada 1 h à temperatura ambiente com agitação. A formulação foi armazenada a 4o C até utilização.

Uma dose contém 5 pg rgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 e 50pg MPL. 5.2.1.4. rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm tween O MPL foi preparado como descrito no Exemplo 1. Com o objectivo de manter o tamanho a 100 nm, tween 80 foi adicionado à solução a uma concentração tal que será igual a 0,001 % na formulação final. A formulação é preparada como se descreve na formulação 5.2.13 acima.

Uma dose contém 5 pg rgD2t, 0,5 mg Al(OH)3 e 50pg MPL. 5.3. Experiência profiláctica de porquinhos da índia

Nestas experiências grupos de porquinhos da índia foram vacinados entre os dias 0 c 28 com 5 pg rgD2t, em duas formulações de hidróxido de alumínio diferentes. Imunizações foram dadas subcutaneamente em doses de 0,5 ml por dose. Um mês depois da segunda vacinação provocou-se a infecção nos porquinhos da índia inoculando-os intravaginalmente com 105 pfu de HSV2 estirpe MS. E foram monitorizados diariamente para o desenvolvimento de doença de HSV2 primária e recorrente (dias 4 a 39 depois da inoculação). 5.3.1 Experiências terapêuticas com porquinhos da índia

Nestas experiência porquinhos da índia foram inoculados no dia 0 com 105 pfu HSV2 estirpes MS. Depois de recuperação de infecção primária foram avaliados diariamente para doença herpética recorrente (dias 13 a 21). Vacinaram-se os porquinhos da índia aos dias 21 e 42 com a vacina rgD2t/Al(OH)3. As vacinas foram administradas subcutaneamente com dose de 0,5 ml. Animais foram monitorizados diariamente com lesões herpéticas ± 60 ou ± 84. 5.3.2 Estudos de Imunogenicidade em primatas A imunogenicidade de rgD2tAl(OH)3 combinada com MPL em sorbitol foi avaliada nos macacos Verdes Africanos. Grupos de macacos foram vacinados nos dias 0 e 28 com 20 pg rgD2t e 0,5 mg de Al(OH)3 combinadas com 50, 20 ou 5 pg MPL em sorbitol. Avaliaram-se as respostas imunitárias humorais específicas (ELISA e títulos neutralizantes) e mediadas por células efcctoras (resposta de hipersensibilidade tipo retardada: HTR). Cada grupo de macacos continha 5 animais. A formulação foi administrada intramuscularmente com uma dose de lml. A preparação das formulações foi feita como acima descrita. Animais foram sangrados ± todas as duas semanas para a determinação dc anticorpos.

As respostas HTR foram testadas 14 dias depois da segunda vacinação. A descrição do teste de pele é dada em baixo. 5.4 Visualização

Foram montados ensaios para avaliar a resposta específica a anticorpos induzida pela vacinação com formulações rgD2t Al(OH)3 MPL (determinação de títulos anti-rgD2t ELISA títulos e anti-HSV2 ncutralizante ). A eficácia protectora destas formulações gD2 foi avaliada nos modelos profiláticos e terapêuticos de porquinhos da índia. Estudos de imunogenicidade foram também conduzidos em macacos. Respostas humorais específicas respostas HTR foram avaliadas. 5.4.1 Títulos ELISA e Neutralizantes

Anticorpos anti -rgD2t títulos e actividade neutralizante anti HSV2 foram determinados de acordo com os métodos descritos na candidatura de patente N.°W092/16231. 5.4.2 Tipo de hipersensibilidade retardada (THR)

As formulações rgD2t foram também testadas pela sua capacidade de induzir uma resposta de imunidade específica das células T em macacos medida pela indução ou de respostas do tipo de hipersensibilidade retardada (THR).

Os macacos Verdes Africanos foram vacinados aos dias 0 e 28 com 20 pg de vacina de formulação gD2 administrada intramuscularmente. Foram testados na pclc 14 dias depois da segunda vacinação por injecção intradermal no ventre de 15 ou 5 pg de rgD2t em solução salina. Foram também testados tendo a solução salina como controlo. O sítio da injecção foi inspeccionado 24 e 48 horas mais tarde para eritema e endurecimento e mediu-se o tamanho destas reacções locais. 5.4.3. Modelo de provocação de infecção intravaginal do porquinho da índia O modelo porquinho da índia para a infecção genital de HSV foi descrito por L.Stanberiy et al.(J. of Infectious Diseases 1982, 146 397-403; intervirology 1985, 24: 226-231). Sumariamente, em experiências profilácticas os porquinhos da índia foram provocados intravaginalmente com 105 pfu de HSV2 estirpe MS, um mês depois da última vacinação. O decurso clínico da doença primária foi monitorizado pela observação diária da incidência e severidade das lesões da pele genital durante os dias 4-12 após o período de inoculação. Os animais foram então examinados diariamente para evidência de lesões de herpes recorrentes dos dias 13 a 39. Nas experiências terapêuticas os porquinhos da índia provocou-se a infecção no dia 0 com 105 pfu HSV2 estirpe MS. Depois da recuperação da infecção primária foram avaliados diariamente para doença herpética recorrente (dias 13 a 21) e foram subsequentemente -21 - /, tomados ao acaso de acordo com as suas pontuações de recorrências primárias c secundárias (providenciando a uma distribuição equivalente de animais com infecção severa e ligeira em cada grupo) para receber quer nenhum tratamento ou vacinação. Vacinas foram administradas nos dias 20 e 41 depois da infecção provocada. O padrão de doença recorrente foi geralmente observada até ± 70 dias depois da inoculação.

As lesões herpéticas foram quantificadas usando uma escala de pontuação para as lesões oscilando entre 0-32.

Sistema de pontuação

Tipo de lesão Pontuação Nenhuma 0 Lesões vaginais -Hemorragia 0,5 -Vermelhidão por um ou dois dias sem 0,5 hemorragia -Vermelhidão e hemorragia por um dia 1 -Vermelhidão sem hemorragia por pelo menos 1 3 dias. Vesículas Heméticos Externas -< 4 vesículas pequenas 2 ->= 4 vesículas pequenas ou só uma grande 4 vesícula -> = 4 lesões grandes 8 -Fusão de lesões largas 16 -Fusão de lesões largas em área genital externa 32

Visualização Clínica

Infecção primária

Severidade de lesão = soma das pontuações diárias nos dia 4 a 12 depois da infecção. A lesão da severidade é expressa como uma média aritmética ± SD tal como a mediana (mais apropriado para um teste não paramétrico).

As incidências da infecção primária = % de animais tendo experimentado uma pontuação de lesão máxima de 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 ou 16 (raramente 32). ; índice de infecção primária = Σΐ (pontuação máxima i) x (% de incidência) com i = 0,0,5,2,4, 8 ou 16.

Doença recorrente Número de dias da recorrência = número de dias da recorrência para os dias 13 a 39 depois da infecção. Uma recorrência é precedida e seguida por um dia sem lesão e caracterizada por pelo menos dois dias com eritema ou um dia com a vesícula). O número de dias de recorrência são expressos como média aritmética dos dias 13 a 39 depois da infecção. Os resultados são expressos como a média aritmética ± SD e medianas. 5.5 Resultados A eficiência protectora de formulações rgD2tAl(OH)3MPL foi comparada com experiências profilácticas e terapêuticas de porquinhos da índia . Estudos de imunogenicidade foram também conduzidos em primatas. O objectivo destas experiências foi comparar a imunogenicidade e a eficácia protectora de rgD2t/Al(OH)3 combinada com partículas MPL de diferentes dimensões. -23- Ρ-%» ι 5.5.1 Experiências profilácticas

Duas experiências foram realizadas para avaliar o potencial das vacinas rgD2t para fornecer protecção contra a doença HSV2 primária e recorrente quando administrada por porquinhos da índia anteriormente à inoculação intravaginal virai.

Experiência: 1 Comparação da MPL 100 nm sorbitol versus MPL TEA

Grupos de fêmeas de porquinhos da índia Hartley (200-250 g) foram imunizados nos dias 0 e 28 com 5pg rgD2t Al(OH)3 combinada com partículas MPL de pequenas dimensões (100 nm; MPL em sorbitol) ou com partículas MPL mais largas (MPL em TEA). Animais de controlo foram injectados de acordo com o mesmo protocolo com o adjuvante sozinho ou foram não tratados. Os animais foram sangrados 14 e 28 dias depois da segunda vacinação com anticorpos determinados com ELISA e ensaios neutralizantes. Provocou-se a infecção intravaginalmente 29 dias depois da segunda vacinação com 105 pfu com estirpe MS de HSV2. Depois de infectados os porquinhos da índia foram monitorizados diariamente para sinais de infecção aguda (dias 4 a 12 depois da inoculação) c para evidencia dc doença hepática recorrente (dias 13 a 39 depois da inoculação).

Indução da imunidade humoral

Como se viu no quadro 3, títulos mais elevados ELISA e neutralizantes foram induzidos quando as partículas de tamanho pequeno foram usadas na formulação rgD2tAl(OH)3.

Efeito da vacina na infecção primária de HSV2 (Quadro 3)

Quando comparados com o grupo de controlo que ficou infectado e experimentou infecção primária aguda, ambos os grupos mostraram uma redução significativa da severidade da lesão. (p< 0,00005). Observou-se uma lesão de pele significativamcnte menor no grupo vacinado rgD2t Al(OH)3 MPL de 100 nm (p< 0,06).

Efeito da vacinação na doença de HSV2 recorrente

Resultados são dados no quadro 4. Quando comparados com os controlos, ambas as vacinas são capazes de alterar o desenvolvimento de doenças herpéticas recorrentes, como medidas pela redução no número de episódios recorrentes (p< 0,02 para rgD2tAl(OH)3 MPL lOOnm).

Conclusões

Ambas as formulações são capazes de dar protecção significativa contra a infecção primária e reduzir a doença recorrente. Os resultados mostram que as formulações rgD2tAl(OH)3 que contem partículas de pequena dimensão, têm uma potente eficácia profiláctica.

Experiência 2: Eficácia de Al(OH)3 MPL lOOnm

Porquinhos da índia hartley (200-250g) foram imunizados aos dias 0 e 28 com 5 pg gD2 formulados em Al(OH)3 MPL 100 nm. Imunizações foram dadas subcutaneamente com a dose 0,5 ml. A dose de 50 pg foi usada na formulação MPL Al(OH)3. Os animais de controlo foram ou injectados de acordo com o mesmo protocolo apenas com adjuvante ou não foram tratados. -25- -25- Λ f;

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Aos 14 e 28 dias depois da segunda vacinação, os animais foram sangrados para determinação de anticorpos por ELISA e ensaios neutralizantes. Os porquinhos da índia foram inoculados a 29 dias depois da última imunização com 105 pfu de HSV2 estirpe MS intravaginalmente. a) Indução da imunidade humoral

Como demonstrado no Quadro 3, o grupo vacinado produziu bons títulos de ELISA e neutralizantes. 0 grupo de controlo não desenvolveu nenhuma resposta de anticorpos. b) Efeito da vacinação na infecção HSV2 primária (Quadro 3)

Quando comparado ao grupo de controlo que ficou infectado e experimentou infecção primária, o grupo de vacinação mostrou uma redução significativa da severidade das lesões (p < 0,0005) e incidência (p < 0,0029. Não há nenhuma evidência de lesões externas da pele em nenhum dos porquinhos da índia vacinados. c) Efeito da vacinação na doença recorrente HSV2 (Quadro 4)

Quando comparada com os controlos, a vacina rgD2tAl(OH)3MPL foi capaz de alterar o desenvolvimento da doença herpética recorrente, como indica a medida de uma redução significativa da severidade dos episódios recorrentes (p<0,00005), e da incidência dos efeitos recorrentes (p<0,01). d) Conclusões rgD2tAl(OH)3 combinada com pequenas partículas MPL é muito potente em promover protecçao para a infecção primária e recorrente de infecções de HSV2 em porquinhos da índia.

Das experiências acima descritas pode-se concluir que as formulações com MPL Al(OH)3 de partículas pequenas obtidas por duas estratégias diferentes, induzem pelo menos uma resposta profiláctica tão potente como fa/em formulações de MPL Al(OH)3 de tamanho grande. Para além disso o MPL de pequeno tamanho tem a vantagem de serem facilmente esterilizados antes do uso. 5.5.2. Experiências terapêuticas. O objectivo destas experiências era comparar o potencial terapêutico de formulações rgD2tAl(OH)3 MPL diferentes no decurso de doença herpética recorrente em porquinhos da índia com infecções HSV2 estabelecidas.

Os porquinhos da índia foram inoculados intravaginalmente no dia 0 e 105 pfu HSV2 estirpe MS e monitorizados diariamente para sinais clínicos agudos de infecção (dias 4 a 12) como também para evidência de doença herpética recorrente (dias 13 a 20). Os animais foram tomados ao acaso em grupos experimentais diferentes dc acordo com as suas pontuações primárias e recorrentes, providenciando a que uma distribuição equivalente de animais com infecção ligeira a severa em cada grupo. Porquinhos da índia sem sinais clínicos evidentes de infecção não foram inscritos no protocolo. Vacinas foram administradas subcutaneamente nos dia 21 e 42 depois da inoculação. A eficácia terapêutica de formulações rgD2tAl(OH)3 MPL foram avaliadas em três experiências diferentes.

Í^ÍÁ -27-

Experiência 1. Eficácia de rgD2tAI(OH)3 combinada com partículas mais largas MPL (MPL em TEA).

Porquinhos da índia experimentando doença recorrente foram tomados ao acaso para receber tanto 20μg rgD2tAl(OH)3 combinados com partículas de tamanho grande (MPL) ou adjuvante apenas. As vacinas foram administradas nos dias 21 e 42 após o desafio. O padrão da doença recorrente foi observada até ao dia 84.

Como ficou demonstrado no quadro 3, a formulação rgD2tAl(OH)3 MPL TEA não foi eficaz na redução da doença recorrente instalada.

Experiência 2:Eficácia de rgD2t Al(OH)3 MPL 100 nm

Dois grupos de porquinhos da índia foram ou vacinados com 20pg rgD2tAl(OH)3, combinados com partículas de MPL de pequena dimensão ou não foram tratados.

As vacinações foram dadas ao dia 20 e 41 depois da inoculação . A doença recorrente foi seguida ate ao dia 69.

Como verificado no quadro 5, em contraste com os dados experimentais onde se usaram partículas grandes de MPL, a vacinação com a vacina rgD2tAl(OH)3 MPL 100 nm alterou a recorrência de doença HSV2 estabelecida, quando comparada com o grupo de controlo, diminuindo significativamente a severidade recorrente (-39%, p<0,05) e o número de dia da recorrência (-28% p<0,l).

Experiência 3: Eficácia comparada de AI(OH)3 combinada com partículas MPL de pequeno tamanho.

Nesta experiência uma terceira estratégia para obter partículas MPL de pequeno tamanho foi usada : A adição de tween, eg tween 80.

Os grupos experimentais foram os seguintes:

Grupo 1 (n=15): 20 pg rgD2tAl(OH)3 MPL 100 nm com tween Grupo 2 (n= 15): 20 pg rgD2tAl(OH)3 MPL 100 nm com sorbitol Grupo 3 (π— 16) ; controlo

Os Controlos foram ou não tratados ou vacinados com Al(OH)3 MPL apenas.

As vacinas foram administradas nos dias 21 e 42 depois da inoculação. O padrão de doenças recorrentes foi observado até ao dia 60 depois da inoculação.

Os resultados são apresentados no Quadro 5. Um efeito terapêutico significativamente claro foi observado em animais vacinados com duas formulações rgD2tAl(OH)3 MPL. Ambas as formulações reduziram significativamente a severidade da recorrência, o número do dia de recorrência e o número dos episódios recorrentes.

Conclusões

Um efeito terapêutico muito potente contra doença genital HSV2 recorrente estabelecida foi observada nas formulações rgD2tAl(OH)3 MPL contendo pequenas partícula MPL (ca 100 nm). Por contraste este efeito terapêutico não foi observado quando partículas MPL de grandes dimensões (MPL em TE A) foram adicionadas à vacina rgD2tAl(OH)3.

Em conclusão, resultados obtidos de porquinhos da índia demonstram claramente a eficácia profiláctica de formulações rgD2t Al(OH)3 MPL contendo partículas MPL de pequenas dimensões (ca 100 nm) Esta formulações tem um efeito terapêutico potencial semelhante ao comparado ao rgD2t Al(OH)3 e combinadas com partículas MPL de grande dimensão. 5.5.3. Estudos de Imunogenicidade de rgD2tAl(OH)3 combinadas com partículas de pequeno tamanho MPL em primatas. A imunogeniciade de rgD2t Al(OH)3 combinada com as partículas de pequeno tamanho MPL (MPL 100 nm sorbitol) foi avaliada em primatas (Macacos Africanos Verdes).

Doses de 50, 20 ou 5 pg de MPL foram combinadas com 20 pg de rgD2t e Al(OH)3 (0,5mg). Duas vacinações são dadas aos 0 e 1 mês. Respostas imunitárias humorais específicas (ELISA e títulos neutralizantes) e células efectoras mediadas (HTR) foram medidas. a) Procedimento Experimental

Três grupos de macacos Africanos Verdes foram vacinados nos dias 0 e 28 com 20 pg de formulações de gD2t Hidróxido de Alumínio contendo 50, 20 ou 5 pg de MPL. Imunizações foram dadas intramuscularmente numa dose de lml. Os animais foram sangrados todas as três semanas para determinação de anticorpos por ELISA (títulos anti-gD2) e ensaios neutralizantes. A formulação das três vacinas foi também comparada na sua capacidade de induzir imunidade mediada por células T in vivo, esta medida pela indução de uma resposta de hipersensibilidade do tipo retardada (HTR). Três ma raros em cada grupo foram testados 14 dias depois da segunda vacinação com 15 ou 5 pg de gD2t, dado com solução salina no ventre. Eles também foram testados corn solução salina usada apenas como controlo. Monitorizou-se o eritema c o endurecimento no sítio da inoculação intradérmica após 24 e 48 horas. b) Resultados

Respostas serológicas e HTR estão ilustrados no Quadro 6. Grupos de macacos vacinados com a formulação gD2tAl(OH)3 contendo ou 50 ou 20 mg de MPL produziram significativamente mais anticorpos que o grupo recebendo a dose de 5 mg MPL (p< 0,003 e p<0,0008 respectivamente). Não houve nenhuma diferença significativa na ELISA ou nos títulos neutralizantes medidos nos grupos de MPL de 50 ou 20 pg. A correlação entre a dose MPL e o efeito nas respostas imune mediadas por células efectoras foram observadas. Uma forte resposta HTR foi detectada na maioria dos macacos (3/ 4) vacinados com 50 ou 20 pg formulações de MPL. Por contraste apenas um macaco do grupo 5 pg MPL desenvolveu uma resposta no teste da pele. c) Conclusões

Os dados acima descritos demonstram que o efeito adjuvante Al(OH)3 combinado com as partículas de pequeno tamanho é também eficaz em primatas e não é restrito a espécies de animais pequenos. Uma correlação entre a dose MPL e a imunogenicidade da formulação rgD2t Hidróxido de Alumínio pode ser observada em macacos, com 20 e 50 pg dando as melhores respostas serológicas e HTR.

Exemplo 6: Estudos Clínicos com Lyme e Vacinas d Hepatite B e pequeno MPL 6.1. Vacina da doença de Lyme compreendendo a fusão da proteína NS1(1-81) do vírus influenza OspA derivado do B-burgdorferi ZS7.

Preparação das Formulações 6.1.1. NSl-OspA/Hidróxido de alumínio NSl-OspA/prcparado de acordo com os procedimentos descritos em WO 93/04175 foi adsorvido em hidróxido de Alumínio e incubado 1 h à temperatura ambiente. O volume final foi ajustado com tampão fosfato (P04 10 mM, NaCl 150 mM). A formulação foi armazenada a 4o C até utilização A dose contem 10 pg NSl-OspA/500 pg de hidróxido de alumínio

6.1.2. NSl-OspA/hidróxido de alumínio/MPL NSl-OspA foi adsorvido em hidróxido de alumínio e incubado por uma hora á temperatura ambiente. MPL preparado como descrito previamente foi então adicionado à formulação e incubada novamente à temperatura ambiente por

»«**«*>vmu A -32- 1 h . A formulação foi então ajustada ao volume final com tampão fosfato (10 mM P04, 150 mN NaCl). A Formulação foi armazenada a 4°C até utilização.

Uma dose contem 10 pg NSl-OspA/500pg A1(OH)3/50 pg MPL. 6.1.3. Esquema de imunização

Voluntários humanos foram injectados três vezes intramuscularmente com lml de uma dada fórmula nos dias 0, 31 e 62. Soro foi retirado nos 30 dias pós I, II e III.

Foram então analisados por ELISA para um total de IgG e anti OspA e para a resposta de anticorpos do tipo LA-2 num teste de inibição (Demonstrou-se que LA-2Mab era um anticorpo protector contra infecção no ratinho) 6.2. Formulações AgsHB/MPL nos humanos 6.2.1. Formulações da preparação

AgsHB 20 pg hidróxido de alumínio 500 pg

AgsHB foi adsorvido na porção total final de hidróxido de alumínio e o volume final foi ajustado com tampão fosfato salino (P04 10 mM, NaCl 150 mM) a lml por dose. A formulação foi armazenada até 4°C até utilização. 6.2.2. AgsHB 20 mg/ Hidróxido de alumínio

AgsHB foi formulada como descrito previamente mas adsorvida apenas cm 100 mg de Al(OH)3. O volume final era (lml) por dose. 6.2.3. AgsHB 20 pg / Hidróxido de alumínio 100 pg/MPL 50 pg

AgsHB foi adsorvido em 100 pg de hidróxido de alumínio e incubada 1 h à temperatura ambiente. MPL foi então adicionado à concentração adquirida incubado à temperatura ambiente. A formulação foi então ajustada ao volume final (I ml por dose) com tampão apropriado e armazenado a 4o C até utilização 6.2.4 Esquema de imunização

Voluntários humanos (20 por grupo) foram injectados I.M. com 1 ml de uma das formulações dadas. Os soros foram colectados nos meses 0,1, 3 e 6. Foi analisado para anticorpos neutralizantes com o teste da Abbot disponível comercialmente. 6.3 RESULTADOS. O Quadro 8 mostra que o MPL usado em combinação com hidróxido de alumínio e NSl-OspA na forma de partículas de 100 nm é eficiente a produzir títulos de anticorpos mais elevados dc natureza inibitória dos que o antigénio de hidróxido d alumínio e que a cinética de seroconversão é mais rápida.

Isto estabelece que para um antigénios solúvel como o NSl-OspA, em humanos, MPL formulado como partículas pequenas mantém as propriedades de adjuvantes que já exibia em animais com outros antigénio solúveis. -34- Α 4 ί /<(\ 1 Ο Quadro 7 mostra que ο efeito do adjuvante perdido por redução da quantidade da formulação de hidróxido de alumínio presente nas formulações de Hepatite B podem ser recuperadas adicionando MPL na forma descrita nesta patente. O MPL também melhora a velocidade de reconversão.

Exemplo 7: Combinação de formulações de vacina - Hepatite B +Hepatite A

AgsHB é adsorvido em 90% da quantidade final de hidróxido de alumínio (0,5 mg/ml) e incubada durante a noite à temperatura ambiente. O pH é ajustado a 6.2 e a preparação deixada 14 dias à temperatura ambiente para maturação. O antigénio da Hepatite A com 360 a 2EU por dose, na forma de derivado inactivo da estirpe HM-175 (como no Havrix) é pré-adsorvido em 10% de hidróxido de alumínio, concentração final (0,5 mg/ml). O hidróxido de alumínio remanescente (0,5 mg/ml) é então adicionado à solução e deixado por uma hora à temperatura ambiente sob agitação. O HAV adsorvido no hidróxido de alumínio é então adicionado à formulação AgsHB. MPL (tamanhos de partícula menos de 100 nm) é adicionado à solução HAV/AgsHB a uma concentração final de 1,25 a 100 pg por dose de lml, sendo o volume ajustado ao volume final de dose e a formulação é armazenada a 4 ° C até utilização.

Exemplo 8 : Vacinas combinadas contendo antigénios adicionais

Vacinas combinadas podem ser preparadas adicionando uma ou mais dos antigénios necessários das formulações descritas no exemplo 2 ou Exemplo 3 ou 4 acima.

Exemplo 9: Aumento da Imunidade Humoral e Indução da Imunidade celular-mediada pela imunização de ratinhos com AgsHB formulada com Hidróxido de alumínio e MPL. 9.1 Efeito de Al(OH)3 +indução de anticorpos anti AgsHB.

Ratinhos Balb/c foram imunizados pela via intradérmica com AgsHB recombinante adsorvido em Al(OH)3 com MPL como adjuvante. Murganhos foram imunizados duas vezes com formulações AgsHB/Al/MPL e a resposta do anticorpo foi medida depois das primeiras e segundas doses. O Ig foram medidos por ELISA ou AUSAB kit (Abbot Lab,II) e a atenção particular foi dada à indução do isótopo IgG2 uma vez que este isótopo é sobretudo induzido pela secreção do Interferão-g. A indução deste tipo de isótopo indirectamente reflecte a activação da imunidade mediada por células, nomeadamente a activação da Thl. A razão AgsHB/MPL foi investigada assim como o tamanho das partículas MPL. 9.1.1. Experiência I- Efeito da dose MPL (> 500 nm) na imunogenicidade do rec. NSl-OspA adsorvido no Al(OH)3.

Grupos de 10 ratinhos fêmea Balb/c foram injectados pela via subcutânea com 2,5 mcg de recAgsHB adsorvido sobre os 50 mcg de A1+++ (como Al(OH)3) e quantidades crescentes de MPL (3,1 a 50 mcg) com tamanho de partícula 500nm. Os ratinhos foram injectados duas vezes num volume de 100 mel e a duas semanas de intervalo. Estes foram sangrados semanas depois da primeira injecção (sangramento parcial) e uma semana depois do reforço. Mediram-se os títulos totais de anti HBs IgG e IgG2a específicos foram medidos pelo método ELISA usando recAgsHB como capturante de antigénio. Os títulos foram expressos como o recíproco da diluição correspondendo a 50% do valor máximo (diluição do ponto médio). Os valores indicam simultaneamente um aumento de IgG e IG2a específicas com o aumento das doses de MPL, particularmente para doses de 12,5 a 50 mcg. O efeito é visto para ambas as respostas primárias e secundário e é particularmente óbvio para IgG2a (um aumento superior a 20 vezes) indirectamente indicando a secreção de interferão g induzido pela imunização com MPL. 9.1.2. Experiência II-Comparação de lotes clínicos de recAgsHB adsorvido contendo ou não MPL (> 500 nm)

Foram preparados três lotes clínicos de recAgsHB adsorvido em Al(OH)3: Lote DSH16 não continha nenhum MPL e serviu como controlo. Lote DSAH501 e 502 foram preparados de maneira similar (20 mcg de recAgsHB adsorvidos em 0,5 mg de A1+++ como Al(OH)3 mas continha 50mçg (> 500 nm)

Os três lotes foram injectados subcutaneamente em grupos de 10 ratinhos (200 mel contendo 2,5 mcg AgsHB, 100 mcg A1+++ e 6,25 mcg MPL), duas vezes com intervalos de duas semanas. Os ratinhos foram sangrados no dia 14 e uma semana depois do reforço. Anticorpos Anti-HBs foram medidos usando kit AUSAB ou um ELISA da casa tanto para IgG ou IgG2a. Os resultados são dados no quadro 2. Eles indicam que, duas semanas depois da Ia injecção os dois lotes contendo MPL induzem uma resposta anti-HBs (12,4 e 41,9 mlU/ml) enquanto que o lote que não contem MPL apenas induz uma resposta marginal (0,75 mlU/ml). O número de respostas é também mais elevado com MPL (9/10 e 9/10 versus 1/10 em ausência de MPL). O efeito do MPL é confirmado depois do reforço, uma vez que os títulos obtidos para os lotes DSAR501 e 502 são aproximadamente 6 vezes maiores que os observados sem MPL.

Isto indica que, pelo menos nos ratinhos, MPL(>500nm) pode melhorar tanto a cinética de resposta anti HBs e como o nível da resposta anti-HBs.

Estes resultados foram confirmados quando se mediram IgG específicas e IgG2a depois da imunização com lotes DSAH16 (sem MPL) e DSAR502 (com MPL): o título anti HBs IgG é 5 (resposta primária) e 3 (resposta secundária) vezes maior que o MPL presente.

Para a resposta de IgG2a, o efeito de MPL é ainda mais notável, pelo menos depois de uma segunda dose , indicando a indução preferencial de IgG2a. Isto indirectamente reflecte a activação da imunidade celular -mediada (secreção do interferon-gama) pela preparação contendo MPL. 9.1.3. Experiência ΠΙ: efeito da dose MPL (<100 nm) na imunogenicidade de AgsHB recombinante AgsHB adsorvida sobre Al(OH)3.

Gmpos de 10 ratinhos (Balb/c, com sete semanas de idade) foram injectados subcutaneamente com 1 meg de AgsHB recombinate adsorvido em 50 mcg de A1+++ (como Al(OH)3) e na presença de quantidades crescentes (3,1 a 25 mcg) de MPL (< 100 nm) . Os ratinhos foram injectados duas vezes a duas semanas de intervalo com um volume de 200 mel. Foram sangrados duas semanas depois da primeira injecção e uma semana depois do reforço. A resposta anti-HBs foi avaliada por ELISA (total Ig, IgG, IgG2a) nas amostras de soro reunidas. Os títulos foram expressos como diluições no ponto-médio (recíproca das diluições dando 50% dos valores mais altos). Os resultados indicam que tão poucos como 3,1 mcg de MPL induzem um forte aumento da resposta de anticorpos tanto para respostas primárias como secundárias. A resposta culmina de 6,25 mcg c diminui depois para tomar similar à encontrada sem MPL quando doses elevadas de MPL (25 mcg) são usadas. O padrão da resposta de anticorpos é similar para IgG, IgG2a e Ig total. Contrasta com os resultados obtidos para o MPL de tamanho mais elevado (> 500 nm) e mostra que partículas de pequena dimensão (< 100 nm) são mais eficientes que as de maior tamanho (>500 nm) (pelo menos para a resposta imunitária humoral), uma vez que MPL é necessário para obter o efeito máximo A maior actividade das partículas de pequenas dimensões é confirmada em várias experiências.

Tal como demonstrado para partícula de maior dimensão MPL (> 500 nm), o efeito adjuvante é maior para IgG2a do que para o total de IgG ou Ig. Para o efeito máximo da resposta secundária (6,25 mcg de MPL), há um aumento em 25 vezes da IgG2a enquanto o aumento para o IgG ou Ig foi de 7,6 e 4,3 respectivamente. 9.2. Indução da Imunidade celular-mediada pelo recAgsHB adsorvido em Al(OH)3- efeito do MPL.

Se a imunidade humoral é suficiente para proteger contra a Hepatite B, a indução de imunidade celular-mediada (CTL, Thl) pode ser de importância particular para o tratamento da doença.

Novas formulações são necessárias contudo para as vacinas terapêuticas uma vez que Al(OH)3 é capaz de melhorar a imunidade humoral mas não a imunidade cclular-mediada. Nós temos investigado o efeito de MPL na indução de células Thl capazes de segregar IL-2 e o interferon g(i.e gama) em ratinhos Balb/c imunizados com recAgsHB adsorvido em A1(0H)3. 9.2.1. Experiência I- efeito de MPL(> 500 nm) ou indução de células Thl após imunização de ratinhos Balb/c com AgsHB adsorvido em Àl(OH)3

Um grupo 10 ratinhos Balb/c (fêmeas, com cinco semanas) foram imunizadas pela injecção em cada almofada da pata de 30 mel contendo 10 meg de AgsHB, 15 meg de Al+++(Al(OH)3) e 15 meg de MPL. Murganhos de controlo foram injectados similarmente com a mesma quantidade de recAgsHB quer misturados FCA (controlo positivo) ou quer adsorvidos em Al(OH)3 sem MPL (controlo negativo).

Seis dias depois da imunização, os ratinhos foram mortos c os nódulos linfáticos do popliteu foram removidos. As células nodais linfáticas (CNL 2,105/ml) foram cultivadas por diferentes períodos do tempo (24 h a 74 h) em meio RPMI suplementado com 1% de soro negativo de ratos contendo 5 mcg/ml de recAgsHB. Depois de se terminar a cultura, a quantidade de IL-2, INF-g e IL-4 segregados no meio foram medidos. A IL-2 foi estimada pela sua capacidade para estimular a proliferação (avaliada pela incorporação de 3H- timidina) de uma linha CTL dependente de IL-2 (células VDA2 ) e o título foi expresso como índex de simulação (SI= quantidade de 3H-timidina incorporado em células estimuladas/ quantidade de 3H-timidina incorporada células não estimuladas). A quantidade de IL-4 e INF-g foi medida usando kits de ELISA comercial (Hollanda Biotecnology para IFN-g e Endogen para IL-4). Os títulos foram expressos em pg de IFN-g/ml.

Os resultados indicam que nenhuma quantidade significativa de IL-2, IL-4 ou INF-g é segregada por CNL de ratinhos imunizados com AgsHB adsorvido cm A1(0H)3. Pelo contrário valores elevados de IL-2 (I.S.= 38 às 48 h) uma quantidade significativa de INF-g são segregadas por CNL de ratinhos imunizados com AgsHB adsorvidos sobre Al(OH)3+MPL. Esta secreção é similar (INF-g) ou mais elevada (IL-2) à que é observada para ratinhos imunizados com AgsHB + FCA e a secreção in vitro ocorre mais cedo.

Nenhum IL-4 foi detectado depois da imunização com AgsHB adsorvido em AI(OH)3 mesmo em presença de MPL.

Este perfil de secreção indica que células específicas Thl (IL-2, INF-g) têm sido induzidas por imunização com AgsHB adsorvido em presença de MPL mas não na ausência de MPL. Contudo, nenhum Th2 (11-4) foi detectado nesta condições de imunização. 9.2.2. Experiência II- Efeito da dose de MPL (< lOOnm) na indução de células Thl depois da imunização de ratinhos Balb/c com AgsHB adsorvido Al(OH)3

Grupos de 5 ratinhos Balb/c foram imunizados em cada um das -41 - /< y? Γ*; . V 7 c duas almofadas das patas com 30 mel contendo lOmcg de recAgsHB adsorvidos com 15mcg AL+++ (como Al(OH)3 e com quantidades maiores de MPL (100 nm, 0 a 15 mcg).

Seis dias depois da injecção os ratinhos foram sacrificados e as cclulas nodais linfáticas (CNL) do popliteu foram cultivadas até 2,106 células/ml num meio de cultura RPMI suplementado com soro negativo de ratos por diferentes períodos de tempo (24 h a 96/25) contendo 5 mcg/ml de recAgsHB. A secreção de IL-2 foi medida pela estimulação da proliferação de células VDA2 e a concentração de IL-2 expressa em Index de estimulação (SI); A secreção de INF-g foi medida usando um kit comercial expresso em pg/ml.

Verificou-se que a secreção de IL-2 foi dramaticamente aumentada por uma dose menor de MPL (7,5 mcg) e um efeito máximo obtido para (15 mcg de MPL). A secreção de IL-2 é geralmente mais importante às 24 horas do que às 48 ou 72 horas. A secreção INF-g está ausente quando AgsHB é adsorvida em Al(OH)3 na ausência de MPL. Uma dose pequena (7,5 mcg) dc MPL induz a secreção de INF-g e mais uma vez o efeito máximo efeito é obtido por 15 mcg de MPL. Contrariamente ao que é observado para o IL-2, a secreção de INF-g é atrasada na cultura e aumenta com o tempo até às 96 horas.

Tomados em conjunto estes dados indicam que MPL (menos de 100 nm) é um indutor poderoso de Thl quando combinado com AgsHB adsorvido em A1(0H)3. O efeito da formulação contendo AgsHB adsorvido em A1(0H)3 e MPL na indução de tanto a imunidade humoral como a celular-mediada foi investigado em ratinhos Balb/c. Os resultados indicam que o MPL claramente melhora a cinética da resposta anti-HBs uma vez que muitos mais anticorpos anti-HBs são encontrados depois das imunizações primárias e secundárias. A qualidade de anti-HBs é também modificada e uma indução preferencial de igG2a foi observada, reflectindo indirectamente a secreção de INF-g e portanto a indução da imunidade celular-mediada. A avaliação directa da indução as células Thl por formulações contendo AgsHB, A1(0H)3 e MPL claramente indica que MPL é um indutor potente de células Thl segregando tanto IL-2e INF-g. Este tipo de formulação é portanto importante no desenvolvimento de vacinas terapêuticas.

Ambos os resultados foram obtidos usando partículas de dimensões inferiores a 100 nm.

Yeja-se os resultados das experiências acima descritas nos Quadros 9-14 mais adiante. 13. Conclusões

No seu todo os resultados sugerem que MPL dc pequenas dimensões é um imuno-estimulante melhorado em primatas incluindo o homem, relativamente ao MPL de grandes dimensões. Isto combinado com a capacidade de fazerem lotes esterilizados em larga escala, toma o MPL de pequenas dimensões um imuno-estimulante adequado para uma variedade de vacinas para o homem e animal.

Quadro 1:

Partículas MPL e recuperação de filtração usando parâmetros de sonicação diferentes.

Ensaio n.° Concentração (mg/ml) Tempo residência total na célula de fluxo (min) Dimensão de partícula antes de filtração (nm) Recuperação depois da filtração 16 1 2,5 92 104 17 1 3 79 78,5 18 1 3,5 95 86,4 19 1 2,8 77 N.A 20 1 2,8 98 N.A.

Quadro 2

Estabilidade da dimensão de partícula de uma solução MPL estéril por Espectroscopia correlacionai de fotão (Malvern) a 1 mg/ml

Ensaio n.° Dimensão de partícula depois da filtração (nm) Tamanho da partícula depois dc estabilidade a 4°C (nm) 8 dias 1 mês 3 meses 6 meses 9 94 81 74 88 82

§ «c«O X z HM 3O cá oo. u: o -J o £ -44-

TÍTULOS AB (GMT) INFECÇÃO PRIMÁRIA Pt Index*** 130 886 IZ) CS 1 680 INCIDÊNCIA % DA PONTUAÇÃO DAS LESÕES ** Ό o o l/D O O CS 00 o o o O o o r- LZ O o o <N 33 IZ) CN O O O 00 o o o 0,5 OO o o fO o c> os 42 00 09 o SEVERIDADE DA LESÃO* Mediana | <s </“> sn O 31,5 Arith.mean±SD Ή CS CS 4,6 ± 6,3 oo m H m vf 0,5 ± 0,7 28,5 ±29,1 28 D POST III i NEUTRA 673 OO m <50 969 O m í ELISA 10439 5454 <100 -j 21039 <100 FORMULAÇÃO Experiência 1 rgD2tAI(OH)3/MPL sorbitol o, ro X o 'w' <N £ l-i Controlos Experiência 2 O o 0h m w o 3 CS P Ofi Ui Controlos O Ps CS M O O D # II p? & 11 CS II tí h ϋ CS m 7-1 cs Soma da pontuação das lesões do dia 4 ao 12 depois da infecção * Pontuação das lesões: Nenhuma lesão (0), lesões vaginais (0,5 ou 1), vesículas na pele externa (2,4,8 oul6) **Indexde Infecção primária = Σί (pontuação. Max i) x(incidência %); comi = 0,0,5, 1,2,4,8,16 <n •st-

Quadro 4 < U·zw o Q <z «<υ·<zo<> sfaw

<POS-o H2 EI P po a P z£ r* y.

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*Soma da pontuação das lesões do dia 21 a 60 pós-infecçâo **Número de dias os animais experimentaram lesões recorrentes para os dias 21 a 60 pós-infecção *** Número de Episódio de recorrência para os dias 21 a 60 pós-infecção. Um episódio é precedido e seguido por um dia sem lesão e caracterizado por um eritema que dura 2 dias (pontuação = 0,5) ou 1 dia com vesículas externas (pontuação >=2). Terapêutica de Imunoterapia. Injecção subcutâ nea aos dias 21 e 42 pós -infecção. Análise estatística: Teste de soma Wilcoxon vrs controlos adjuvante (não significativo pa p> 0,1 :ns). Sorb significa sorbitol -47-

Quadro 6

IMUNOGEMCIDADE DE RGD2T HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO MPL 100NM (SORBITOL) NOS PRIMATAS RESULTADOS SEROLÓGICOS E HTR VACINA MACACO N° RESPOSTA DE ANTICORPOS RESPOSTA HTR ENDURECIMENTO j i ) TÍTULO DE ELISA TITULO NEUTRA gD2 g D2 PBS 5pg 15pg KQ 100 18630 800 - + ++ 20 pg gD2t KQ 101 5554 1600 - - - Hidróxido de KQ 102 14870 800 - -H- +++ Alumínio 50pg MPL KQ 103 5486 1600 - -1-4* +4-+ KQ 104 16270 1600 ND ND ND GMT 10655 1213 20 pg gD2t KQ 105 16170 800 - + ++ Hidróxido de KQ 106 4389 800 - - - Alumínio KQ 107 20440 1600 - ++ +++ 20pg MPL KQ 108 5613 800 - + + KQ 109 6765 1600 ND ND ND GMT 8876 1056 20 pg gD2t KQ 110 2486 200 - - - Hidróxido de KQ 111 9918 800 - ++ +++ Alumínio KQ 112 2526 400 - - - 5pg MPL KQ 113 7137 400 - - - KQ 114 8396 400 ND ND ND GMT 5181 400 * Medido 14 dias depois II/GMT= Média geométrica do título Título de ELISA = Título do ponto médio Título NEUTRA= recíproco da diluição do soro dando protecção contra o efeito citopatogénico ** Teste de pele no dia 14 post II Endurecimento, Leitura às 24 horas + = lmm -H—1-5 mm -H-+=>5 mm

Título max 1 0 58 1 565 1 0 56 320 0 66 605 ! Título min. I O *—1 Γ" © <—< (N Ο ^ Ό GMT Ο Ό § 0 4 24 <=> Ξ £ 1 1 i ° 50 95 0 I 36,8 94,7 001 09 0 Γ----—---- Seroconversão 61 01 0 ! o c- “ Λ rs © 0 4-H (N £ 20 20 20 ο ον σ\ «—4 r-H 20 20 20 1 Tempo ] 1 Hidróxido de Alumínio (500 μg) HBsAg pre PI (mês 1) ΡΠ (mês 3) Hidróxido de Alumínio (100 μg) HBsAg pre PI (mês 1) PH (mês 3) Hidróxido de Alumínio (100 pg) HBsAg pre PI (mês 1) ΡΠ (mês 3) -48-

Quadro 8 00 ο Γ" (Ν Tf (Ν CN ο Tf rn ϊΛ <Ν C\ Ό (Ν Ο Q co Νβ υ ti rí P-i < Ο. ζ/3 Ο Ό Ο Ό *οδ5 < Ο. 00ζ, Τ3 Ο Τ3 *3 ο t— Όκ

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GTM Anti.IIBs (mlU/ml) i »—1 V“T »< 96,7 89,2 0,75 ri *—1 °v. r—1 Dose de MPL (mcg) I j o 6,25 1 mo cs^ VO Dose deAgsHB sobre AI(OH)3 »o ri *n rí ri QJ ·*» o d t-H rJ Ό o o Ό m X Pá Pá < <! C (/3 C/3 C/3 Q Q Q

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O H w b b ff» e •~ Ό cs s θ' SECREÇÃO INVITRO 72h NT NT <40 <40 IL-4(pg/ml 48h NT NT ί <40 <40 ! 1 24h NT NT <40 <40 i oj P~ b 72h 385 <125 <125 280 t I 48h i-i <125 1 1 <125 ! <125 280 £ MH 24h <125 <125 <125 <125 IL-2 (SI) 72h O, (N^ o OO θ' b" 48h Ολ 00^ ^ 00 Çs) T—t y—< CO 24h m c- o « < r. (S) M l-b FORMULAÇÃO FCA FCA A1(0H)3 A1(0H)3+ MPL (30 mcg) í Dose de AgsHB (mcg/ratinho) 20 20 20 Depois da Imunização tal como descrita no texto, os nódulos das células linfáticas foram cultivado com 5mcg recAgsHB/ml para os períodos indicados de tempo e a secreção de IL-2, INF-g e IL-4 foram medidos usando respectivamente Células de linha T VDA2 e 2 kits ELISA comerciais. so

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Lisboa, 18 de Outubro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um adjuvante de composição compreendendo uma suspensão aquosa estável de partículas de monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) sendo as dimensões de partículas 3D-MPL suficientemente pequenas para serem filtradas através de uma membrana hidrofílica 0,22 pm.
2. 2. Um adjuvante com a composição como a reivindicada em 1, compreendendo adicionalmcnte um imuno-estimulante.
3. 3. Um adjuvante com a composição reclamada em 2 em que o imuno-estimulante adicional compreende QS21.
4. 4. Um adjuvante de composição como a reivindicada nas reivindicações 1 a 3 para uso como medicamento.
5. 5. Um processo para a manufactura do adjuvante de composição compreendendo partículas de monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), compreendendo a suspensão em meio aquoso na ausência de Trielilamina (TEA), caractcrízada em partículas de monofosforil-lípido A 3-0-desaciladoD-MPl que como mencionado, sejam capazes de ser filtradas através de uma membrana hidrofílica de 0,22pm.
6. 6. Partículas de monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) capazes de serem filtradas através de membrana de 220 nm, obtidas por um processo consistindo de sonicação de monofosforil-lípido A 3-O-desacilado em água para injecção, fazendo o bombeamento através de uma célula de fluxo de ultra-sons. -2-
7. 7. Partículas de monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D- MPL) capazes de serem filtradas por uma membrana de 220 nm, obtida por um processo consistindo de sonicação monofosforil-lípido A 3-O-desacilado em água, na ausência de trietilamina, por bombeamento através uma célula de fluxo de ultra-sons.

   Lisboa, 18 de Outubro de 2001

   ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA