JPH03500171A

JPH03500171A - 合成酵母リーダーペプチド

Info

Publication number: JPH03500171A
Application number: JP63507561A
Authority: JP
Inventors: クリスチャンセン，ラース
Original assignee: ノボ‐ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1988-09-06
Publication date: 1991-01-17
Anticipated expiration: 2013-02-04
Also published as: DE3886408T2; US5162498A; WO1989002463A1; JP2708518B2; EP0378567B1; EP0378567A1; US5316923A; DK463887D0; DE3886408D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】合成酵母リーダーペプチド本発明は合成酵母リーダーペプチド、このようなリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列、ベクターおよび形質転換した酵母株に関する。

発明の背景酵母体は、細胞内で合成されるが、しかし細胞外で機能する多くのタンパク質を産生ずる。このような細胞外タンパク質は分泌タンパク質と言われている。これらの分泌タンパク質は、小胞体（ＥＲ）の膜を横切る発現生産物の有効な方向を確実にする予備配列を含む前駆体またはプレプロティン形で細胞内に初期に発現される。予備配列は通常シグナルペプチドと言われているが、これは一般にトランスロケーションの間に所望生産物から切断される。−たん分泌経路へ入ると、タンパク質はゴルジ装置へ運ばれる。ゴルジ体からタンパクトヘ導びく異なった経路を進むか、または細胞外への径路を通り外部の培地へ分泌される（プフエファ−，ニス、アール。

Ｐｆｅｆｆｅｒ、Ｓ、Ｒ，およびロスマン、ジエイ、イー、　Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｊ、Ｅ、＋Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６　（１９８７）　８２９− ８５２）。

酵母に対し異種タンパク質の酵母における発現および分泌について幾つかのアプローチが提案されてきた。ヨーロッパ公開特許出願第００８８６３２Ａ号には、酵母に対し異種のタンパク質を発現し、処理し、そして分泌する方法、すなわち所望タンパク質とシグナルペプチドをエンコードするＤＮＡを有する発現ビヒクルで酵母体を形質転換し、形質転換体の培養物を調製し、培養物を増殖し、培養基からタンパク質を回収する方法が記載されている。シグナルペプチドは所望するタンパク質自身のシグナルペプチド、異種シグナルペプチドまたは天然および異種シグナルペプチドのハイブリッドでもよい。

酵母に対し異種のシグナルペプチドの使用が出会う問題は、異種シグナルペプチドが有効なトランスロケーションおよび／またはシグナルペプチド後の開裂を保証しないことである。

サツカロミセス　セレヴイシアエ（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＦ、（α−因子）は、１９個のアミノ酸長のシグナルま□たはプレペプチドと続＜６４個のアミノ酸長の“′リーダーパまたはプロペプチドとからなり３つのＮ−結合グリコシル化部位とそれに続＜　（Ｌｙｓ　Ａｒｇ　（Ａｓｐ／Ｇｌｕ、　Ａｌａ）ｚ−３α−因子）４を包囲する１６５個のアミノ酸のプレプロ形として合成される（クルシャン、ジェイ、　Ｋｕｒｊａｎ＋Ｊ、およびヘルスコウィッツ、アイ。

Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１．　Ｃｅ１ｌ　３０　（１９８２）　９３３−９４３）。プレプロＭＦ。

のシグナル−リーダ一部はサツカロミセス　セレヴイシアエにおける異種タンパク質の合成および分泌を得るために広く用いられている。

酵母に対し相同のシグナル／リーダーペプチドの使用はａ、ｏ、米国特許第４，５４６．０８２号明細書、ヨーロッパ公開特許出願第０１１６２０１Ａ号、０１２３２９４Ａ号、０１２３５４４八号、０１６３５２９八号および０１２３２８９４号およびデンマーク国特許第２４８４／８４号および第３６１４／８３号明細書から公知である。

ヨーロッハ特許第０１２３２８９Ａ号にはサツカロミセス　セレヴイシアエ　α −因子前駆体の使用が記載されており、一方デンマーク国第２４８４／８４号にはサツカロミセス　セレヴイシアエ　インベルターゼ　シグナルペプチドの利用が記載されそしてデンマーク国第３６１４／８３号には外来プロティン分泌のためのサツカロミセス　セレヴイシアエ　ＰＨ０５シグナルペプチドの利用が記載されている。

米国特許第４，５４６．０８２号明細書、ヨーロッパ特許第００１６２０１Ａ号、第０１２３２９４Ａ号、第０１２３５４４Ａ号および第０１６３５２９Ａ号には、サツカロミセス　セレヴイシアエ（ＭＦｃｔｌまたはＭＦ、２）からのα− 因子シグナル−リーダーを酵母において発現された異種タンパク質の分泌方法に利用する方法が記載されている。

サツカロミセス　セレヴイシアエ　ＭＦ、シグナル／リーダー配列をエンコードするＤＮＡ配列を所望タンパク質の遺伝子の５′末端と融合することによる所望タンパク質の分泌およびプロセッシングが示されている。

多数の分泌タンパク質は、２つの連続した塩基性アミノ酸のカルボキシ末端でペプチド結合を切断しうるタンパク質加水分解プロセッシングシステムを受けるような経路をたどる。

この酵素活性は、サツカロミセス　セレヴイシアエ中でＫＥＸ　２遺伝子によりエンコードされる（ジュラウス。ディ、ニー。

Ｊｕｌｉｕｓ、Ｄ、八、ら、Ｃｅ１ｌ　３７　（１９８４ｂ）、　１０７５）。

ＫＥＸ　２遺伝子生産物による生産物のプロセッシングは活性なサツ力ロミセスセレヴイシアエ接合因子α（ＭＦ、またはα−因子）の分泌に必要であるがしかし活性なサツカロミセス　セレヴイシア工接合因子ａの分泌には含まれない。

分泌の増大する証拠は真核細胞でのタンパク質の局在化における欠乏ルートであり、ここでは分泌されるべきタンパク質またはその前駆体のコンフォメーションが方法の効率性に対し重要なパラメーターである（ブフエファ一、ニス、アールおよびロスマン、ジエイ、イー、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６（１９８７）　８２９−８５２）ことは、サツカロミセス　セレヴイシアエにおける分泌のためのＭＦ、リーダーより一層効率的なリーダーを探すという結論に導びく。

したがって、本発明の目的は小さなタンパク質の酵母における分泌用のα−因子リーダ４−より効率的なリーダーを提供することである。

ヨーロッパ特許出願筒１６３，５２９号に記載されたタイプのインシュリン前駆体を用いたエム、イーゲルーミタニ（Ｍ、Ｅｇｅｌ−Ｍｉ　ｔａｎｉ）　ら、ＧＥＮＥ　（１９８８）（出版物）により記載されたタイプの競合実験において、我々は、インシュリン前駆体からシグナル−リーダーを分離するリシン−アルギニン配列で効果のないプロセッシングによるものであるらしいが、前駆体のＮ− 末端により起こされるべきインシュリン前駆体の発現および分泌において制限因子を見出した。

本発明の別の目的は、二塩基性配列におけるエンドペプチダーゼをエンコードしたＫＥＸ　２を用いて成熟タンパク質の非常に効率的なプロセッシングを確実にしこれにより成熟生産物の収量を向上させる酵母における異種タンパク質の分泌系を提供することである。

発明の簡単な記載本発明の第一の面によれば、次式（Ｉ）：Ｘ　Ｉ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ −（Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ）　、ｌ−Ｘ　２−Ａ　ｌａ −Ｇｌｕ　−Ａｓｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘａ　（１）（式中、ＸｌはＡｌａまたはＧｉｎであり；Ｘ２はＩＩｅ、アミノ酸残基１０個までのペプチド鎖、またはペプチド結合であり；Ｘ、はアミノ酸残基５個までのペプチド鎖またはペプチド結合であり；Ｘ４およびＸ、はＬｙｓまたはＡｒｇであり；ｎは１またはＯである。）を有する新規合成リーダーペプチドを提供するものである。

本発明によるリーダーペプチドの例は次のとおりであるＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−シａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ −Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｈｅ −Ｌｅｕ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−旧ｅ− Ａ　ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＡ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＩＩｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−八ｌａ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＡｌａ−Ｐｒｏ−ＶａＩ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ− Ｖａｌ−ＧＩｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−丁ｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＡｒｇおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ −Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−シａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ −Ｌｅｕ−Ｉｔｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ本発明の第二の面によれば、上記式（１）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を提供するものである。

このようなりＮＡ配列の例は第８−１０図に示される。

本発明の第三の面によれば、上流に所望生産物をエンコードするＤＮＡ配列が位置しそして適当なプロモーターおよびシグナル配列が操作可能に接続した前記式（Ｉ）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な酵母ベクターを提供するものである。

プロモーターは、酵母において転写活性を示すＤＮＡ配列であって酵母に対し相同または異種のいずれかのタンパク質をエンコードする遺伝子から由来するものであればいずれでもよい。プロモーターは酵母に対し相同であるタンパク質をエンコードする遺伝子から由来するのが好ましい。適当なプロモーターの例はサツカロミセス　セレヴイシアエ　ＭＰ、　１プロモーターである。他の適当なプロモーターはサツカロミセス　セレヴイシアエ　ＴＰＩ、　ＡＤ）ｌまたはＰＧＫプロモーターである。

本発明によるベクターは、普通、上流に上記リーダーペプチド（１’）をエンコードするＤＮＡ配列が位置するシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチドは発現した生産物を細胞の分泌経路へ確実に向けさせるシグナルペプチドであればよい。シグナルペプチドは天然産生シグナルペプチドもしくはその機能部分または合成ペプチドである。適当なシグナルペプチドはα因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼからのシグナルペプチドまたは変更したカルボキシペプチダーゼシグナルである。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は、オー、ハーゲンベクレ（０，Ｈａｇｅｎｂｉ３ｃｈｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）％３９．６４３−６４６に記載されている。カルボキシペプチダーゼシグナルはエル、ニー、ヴアールス（Ｌ、Ａ、Ｖａｌｌｓ）　ら、Ｃｅ１ｌ　４Ｂ　（１９Ｂ？）　８８７−８９７に記載されている。

所望産生物およびジグカル／リーダー配列をエンコードする遺伝子は、プロモーターたとえばＴ’ＰＩブロモ−クー（ＰＴＦυおよびターミネータ−たとえばＴＰＩターミネータ−（ＴアＰ＋）をコードするフラグメントと組み合わせる（ティ、アルバーＴ、Ａ１ｂｅｒおよびシイ、カワサキＧＪａｗａｓａｋｉ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｒｉｏｓｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔ　ＩｓｏｍｅｒａｓｅＧｅｎｅ　ｏｆ　５ａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｊ、Ｍｏ１．＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｌ　（１９８２）　４１９−４３４）。

発現プラスミドはさらに酵母２μ複製遺伝子ＲＥＰＩ−３および複製の起源ならびに１つ以上の選択可能なマーカーたとえばヨーロッパ特許出願筒８５３０３７０２．６号に記載のサツカロミセス　ボンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　Ｔ　Ｐ　Ｉ遺伝子とからなる。

本発明によるシグナルおよび／またはリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネータ−配列の連結および酵母複製に必要な情報を含む適当な酵母プラスミド中への挿入に用いられる方法はすべて当該技術分野でよく知られた手段である。

本発明の第四の面によれば、本発明によるベクターで形質転換された酵母株を提供するものである。

本発明の第五の面によれば、上流に所望生産物をエンコードするＤＮＡ配列が位置しそして適当なプロモーターとシグナル配列が接続した上記式（１）で表わされるリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された酵母株を適当な培地で培養し、その際分泌された生産物を培養基から単離することによる酵母中のタンパク質産生方法を提供するものである。

本発明方法で使用される酵母体は所望のタンパク質を高収量にて産生ずる適当な酵母体のいずれでもよい。酵母体は、たとえばシゾサツカロミセス　ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）およびサツカロミセス　ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｖａｒｕｍ）のような酵母体も使用されうるが、サツ力ロミセスセレヴイシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサツカロミセス　クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）が好ましい。

本発明方法は酵母中に多くの異なったタンパク質またはポリペプチドの産生を許す。このような化合物の例はヒトインシュリン前駆体、ヨーロッパ特許出願筒１６３，５２９号、第１９４、８６４号および第２１４，８２６号に記載のようなインシュリン類似前駆体およびグルカゴンならびにアプロチニンである。

本発明の一実施態様によれば、上記式（１）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列は所望生産物に対する遺伝子に直接接続するであろう。分泌の間リーダーペプチドが発現生産物から切断され、培養基からの所望生産物（たとえばグルカゴンまたはアプロチニン）の単離がこれ以上インビトロ転化をすることなく可能になる。

分泌の間Ｃ−末端Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基でのリーダーペプチドのさらに効果的プロセッシングを確実にするために、別のＮ−末端アミノ酸配列を有する所望生産物を発現するのが好ましい。

この追加したアミノ酸配列は後でインビトロ転化により分子の残り部分から切断されなければならない。このようなインビトロ切断の目的で、追加のペプチド鎖は所望生産物に対しＮ−末端に位置する選択的切断部位を備えている。所望生産物がメチオニンを含まない場合、所望タンパク質に隣接するメチオニンで臭素化シアノゲンが切断する。また、トリプシン様プロテアーゼを用いて所望タンパク質に隣接するアルギニンまたはりシンでアルギニンまたはりシン切断が意図される。

最後に、追加ペプチド鎖はこれが他の適当なタンパク質加水分解酵素に対する切断部位を構成するような場合このような酵素によりインビトロで切断される。

ここで使用されているように、“′酵母に対し異種のタンパク質”という表現は酵母体により作られていないタンパク質を意味する。“分泌パとは細胞壁を通って培地へ発現産物が移出することまたは少なくとも細胞膜を通過することを意味する。“プロセッシングとは、シグナル／リーダーペプチドのいかなる部分も伴なうことなく異種タンパク質を産生ずるために成熟タンパク質からのシグナル／リーダーペプチドの細胞切断を意味する。“′シグナル／リーダーペプチド”とは細胞の分泌経路へ発現生産物を向けさせるプレプロ範囲であって疎水性組成物のＮ−末端シグナル配列に続いて親水性リーダー範囲からなるものである。“′ 成熟タンパク質”とは発現ビヒクルに挿入されたＤＮＡ配列によりエンコードされるタンパク質である。成熟タンパク質は活性タンパク質もしくはポリペプチドまたはその前駆体であってさらにインビトロ転化により活性な最終生産物へ転化される。

図面の簡単な説明本発明をさらに添付の図面を用いて説明する。

第１図はｐＭＴ７４３プラスミドおよびプラスミドｐＴ７αＭＩ３の構築を示し、第２図はプラスミドｐＴ７−１７８およびｐＬａｃ１７８の構築を示し、第３図はプラスミドｐＴ７−１９３．　ｐＴ７−１９４およびｐＴ７−１９５の構築を示し、第４図はプラスミドｐＴ７−２００およびｐＬａｃ２００の構築を示し、第５図はプラスミドｐＴ７−１９６の構築を示し、第６図はプラスミドｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３の構築を示し、第７図はｐＴ？αＭＩ３のＥｃｏＲＩ−ＸｂａフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第８図はｐＴ７−１７８のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第９図はｐＴ７−１９３のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第１０図はｐＴ７−１９４のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字による相当するタンパク質を示し、第１１図はｐＴ７− １９５のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第１２図はｐＴ７−２００のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第１３図はｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質を示し、第１４図はプラスミドｐＫＦＮ３７１．　ｐＴ７２１２ｓｐｘ−３０１７およびｐＴ７α−０１７４の構築を示し、第１５図はプラスミドｐＬａＣ２１２ｓｐｘ３−０１７４およびｐＫＦＮ２１６の構築を示す。

本発明はある種のインシュリン前駆体産生を示す次の例により例示される。

詳細な説明１．プラスミドおよびＤＮＡ物質すべての発現プラスミドはＣ−ＰＯＴタイプのものである。このようなプラスミドはヨーロッパ特許出願第８５３０３７０２．６号に記載されておりそしてプラスミド安定化の目的でサツカロミセス　ボンベ　トリオース　ホスファツト　イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）を含むことが特徴的である。ＰＯＴ遺伝子を含むプラスミドは寄託された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株（ＡＴＣＣ３９６８５）から入手可能である。プラスミドはさらにサツ力ロミセスセレヴイシアエ　トリオース　ホスファツト　イソメラーゼプロモーターおよびターミネータ−（Ｐｔｒ＋およびＴＴＰ＋）を含む。これらは、シグナル／リーダー／インシュリン前駆体配列をエンコードするＥｃｏＲＩ　−、Ｘｂａ　Ｉ制限部位により定める範囲を除いてｐＭＴ７４３　（エム、イーゲルーミタニら、ＧＥＮＥ　（１９８８）（出版物）（第１図参照）と同一である。

この関係で記載されたフラグメントをコードするシグナル／リーダー／インシュリン前駆体の複合体は実際的理由のために大腸菌プラスミドｐＴ７αＭＩ３において生じた。このプラスミド（第１図参照）はρＢＲ３２２由来であり、ここでＥｃｏＲ１部位はりし・ノウポリメラーゼおよびｄＮＴＰフラッシュエンドプラスミドを用いてＥｃｏＲＩ切断部を再連結することにより除去されそしてＢａｍＨＩ　−５ｐｈ　Ｉフラグメントは上記ｐＭＴ７４３の２．２ｋｂＳｐｈ　Ｉ　 −ＢａｍＨＩフラグメントにより置き換えられる。この後者のフラグメントは、ＭＦ、リーダーおよびシグナルならびにサツカロミセス　セレヴイシアエ　トリオース　ボスファント　イソメラーゼプロモーターおよびターミネータ−配列と連結したインシュリン前駆体Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１ −２１）をエンコードする配列を含む。このＳｐＨＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントにおいて、シグナル／リーダー／インシュリン前駆体をエンコードする配列は０．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントに含まれる。次の例に記載した構築作業の一般的原則はＭＦ３リーダー配列を本発明によるリーダー配列に代えることである。

シグナル配列ならびに所望生産物の配列もまた置き換えられうる。ｐＴ７αＭＩ３のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第７図に示す。

幾つかの構築物はさらにサツカロミセス　クルイベリ（Ｓ。

Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）　α接合フェロモン遺伝子からのフラグメントを包含スる（エム、イーゲルーミタニおよびエム、トリール　ハンセン本Ｔｒｉｅｒ　Ｆ１ａｎ５ｅｎ　（１９８７）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１５．６３０６）。

最後に幾つかの合成りＮＡフラグメントが適用される。

合成りＮＡ−フラグメントはホスホロアミダイト化学および市販されている試薬を用いて自動ＤＮＡ合成機（アップライドバイオシステム　モデル３８０Ａ）中で合成された（ニス。

エル、ビューケージＳ、Ｌ、ＢｅａＩＪｃａｇｅおよびエム、エッチ、カルーサーズＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２＋１８５９−１８６９）。オリゴヌクレオチドを変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。

アニーリング前に相補的ＤＮＡ一本鎖をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰによりキナーゼ化した。

この方法で得られるフラグメントは次のようである：Ｎ０Ｒ２４３／２４４　：　ＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡＮＯＲ５１２１５１３：　へへＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＡＧＡＡＡＣＴＡＧＮＯＲ３０８／３０９　：　ＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＮＯＲ２４５／２４６　：　ＣＴＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＡＮＯＲ３４８／３５０　：　ＴＡＡＣＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＡＧＣ＾＾ＴＴＧＮＯＲ２１７／２１８　：　ＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣ使用される他の方法および物質のすべては技術知識の通常の状態である（ティ、マニアティスら（１９８２）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）。

次の例１−４は本発明による様々なシグナル−リーダー配列を用いたＢ（１−２９）−Ａｌａ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ａ　（１−２１）型インシュリン前駆体の発現および分泌を説明し、例５は前記型であるがただしＢ　（２７）位におけるアミノ酸残基がＡｒｇで置換されＡ　（２１）位におけるアミノ酸残基がＧｌｙで置換されたインシュリン前駆体の発現および分泌を説明する。以下のテキストで使用するようにＢ（１−２９）はＢ（１）ｐｈｅからＢ　（２９）Ｌｙｓまでのヒトインシュリンの短（したＢ鎖を意味し、Ａ（１−２１）はヒトインシュリンのＡ鎖を意味する。

例１ｐＬａｃ１７Ｂ構築ｐＴ７αＭＴ３の４．５　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ−χｂａＩフラグメント、１３１７ｂｐＳａｌ　Ｉ　−１（ｉｎｃ　ＩＩフラグメントおよび３３３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　”　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを合成フラグメントＮ０Ｒ２４３／２４４とともに結合し：ＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡその結果ｐＴ７−１７２を得た。

ｐＴ７−１７２の５．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ、１７２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ −ＰｖｕＩ［および２７８ｂｐ　Ｈｉｎｆ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを合成フラグメントＮ０Ｒ２４５／２４６とともに結合し：ＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＡその結゛果ｐＴ７−１７８を得た。

ｐＭＴ７４３のＳｐｈ　Ｉ　−Ｂａｍ）１１フラグメントをｐＴ７−１７８の２．２ｋｂＳｐｈ　Ｉ　−Ｂａｍ）Ｉ　Ｉフラグメントに代えるとｐＬａｃ１７８が得られる。

ｐＬａｃ１７８の構築を第２図に示す。

ｐＴ？−１７８のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第８図に示す。

ｐＬａｃ１９３−１９５構築ｐＴ７　ｃｘ　ＭＩ３の５．６　ｋｂ　Ｅｃ、ｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉおよび２０３ｂｐ　ＰＶｕ　Ｉｆ　−Ｘｂａ　１フラグメントを合成フラグメントＮ０Ｒ３０Ｂ／３０９とともに結合した。

ＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣ得られたプラスミドから２１０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｘｂａ　ＩフラグメントをｐＴ７−１７８の１３８ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＭａｅＩｆｆおよび５．６　ｋｂ　ＥｃｏＲ１−χｂａｌフラグメントならびにサツカロミセス　クリイベリＭＦｃｔ遺伝子からの以下に示すフラグメントと結合したニア４ｂｐ　Ｍａｅｎ［−ＥｃｏＲＶ、その結果ｐＴ７−１９３となる。

４７ｂｐ　Ｍａｅ　ｍ−５ａｕ３Ａ、その結果ｐＴ？−１９４となる。

３２ｂｐ　ＭａｅＩ［１−加１１、その結果ｐＴ７−１９５となる。

アンダーラインした制限端部はタレノウポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより充てんされた。これらのプラスミドの構築は第３図に示す。

ｐＭＴ７４３のＳｐｈ　Ｉ　−Ｂａａ＋ＨＩフラグメントをｐＴ７−１９３から１９５プラスミドのＳｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントに代えると、それぞれプラスミドｐＬａｃ１９３から１９５が得られた。

プラスミドｐＬａｃ１９３は次のリーダー配列をエンコードする：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ− Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。

シグナル配列はコドン適正化サツカロミセス　セレヴイシアエ　シグナル配列である（ミチ　イーゲル　ミタニＭｉｃｈｉＥｇｅｌ　Ｍｉｔａｎｉら（１９８８）同上）。ｐＴ７−１９３のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第９図に示す。

プラスミドｐＬａｃ１９４は次のリーダー配列をエンコードする：Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａ　ｌ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。

シグナル配列は上記のようである。ｐＴ７−１９４のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第１０図に示す。

プラスミドｐＬａｃ１９５は次のリーダー配列をエンコードする：Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。

シグナル配列は上記のようである。　ｐＴ７−１９５のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第１１図に示す。

例２ｐＬａｃ２００構築ｐＴ７−１９４の２１３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｄｄｅ　Ｉおよび５．９　ｋｂ　Ｈｐａ　Ｉ　−ＥｃｏＲ１フラグメントを合成フラグメントＮ０Ｒ３４８／３５０とともに結合し：ＴＡＡＣＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＡＴＴＧその結果ｐＴ７−２００を得た。ｐＭＴ７４３のＳｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　７ラグメントをｐＴ？−２００の２．２　ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントに代えるとｐＬａｃ２００が得られた。ｐＬａｃ２００の構築を第４図に示す。

プラスミドｐＬａｃ２００は以下のリーダー配列をエンコードする：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。

シグナル配列は例１のものと同じである。ｐＴ７−２００のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第１２圀に示す。

例３ｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３構築プラスミドｐＴ７−１７８を、合成りＮＡ　ＮＯＲ５４４３’　ＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＧ　５’を適用して、はとんどケイ、フリユに、Ｎｏｒｒｉｓ　ら（１９８３）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１１．５１０３−５１１２に記載されているように二重プライマー法によりインビトロで突然変異させた（第５図）。

得られたプラスミドはここで８２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｘａ＋ｎ　Ｉフラグメントの単離を可能にするＸｍｎ　Ｉ切断部位を含み、これはマウス唾液アミラーゼシグナルペプチド残基３個〜１５個をエンコードするｐＭｓＡ１０４からの３７ｂｐ　Ｘｍｎ　Ｉ　−Ａｐａ　Ｉフラグメント（オー、ハーゲンベクレＯ，Ｈａｇｅｎｂｉｉｃｈｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２８９゜６４３−６４６）とともにさらにｐＴ７−１７８の２５１ｂｐ　Ｍｓｐ　Ｉ　−Ｘｂａおよび５、６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａフラグメントおよび合成りＮＡフラグメントＮ０Ｒ２１７／２１８　：ＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣを含む連結で結合し、その結果変更マウス唾液シグナル（アミノ酸残基３−１５）を含むプラスミドｐＴ７−１９６　（第５図）が得られた。

ｐＭＴ７４３のＳｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＴ７−１９６の２．２ｋｂＳｐｈ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントに代えると、ｐＬａｃ１９６が得られた。

変更したマウス唾液アミラーゼシグナルペプチドは、Ｎ０Ｒ５２０：　ｔｃｃｃａｔｃｔｇｔｔｔｔｃｔｔｇｔｔａｔｔｇｔｃｃｔｔｇａｔｃｇｇａｔｔｃｔｇｃｔＧＧＧＣＣＣＡＮＯＲ５２１：　ｔｃｔｔｃｔｔｇｔｔａｔｔｇｔｃｃｔｔｇａｔｃｇｇａｔｔｃｔｇｃｔＧＧＧＣＣＣ／ｉ（式中、小文字のヌクレオチドは示唆したヌクレオチド９１％と他のヌクレオチドの各々３％とからなるプールから混入された。）から作られる合成アダプターＮ０Ｒ５２０Ｔまたは５２１Ｔ（第６ａ図）でＸｒ！ｌｎ　Ｉ　−Ａｐａ　Ｉフラグメントを代えることによりさらに突然変異化された。Ｎ０Ｒ５２０および５２１は自動アニールされ（アンダーラインした３′末端）、タレノウポリメラーゼとｄＮＴＰにより延長され、それぞれ９０および７２ｂｐの二本鎖ＤＮＡフラグメントが得られた。これらのフラグメントをＡｐａ　Ｉにより切断し、得られた４７ｂｐのフラグメントＮ０Ｒ５２１Ｔおよび３８ｂｐのＮ０Ｒ５２１Ｔがポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。

この方法から得られるプラスミドは大腸菌株の形質転換体から単離されそして個々にサツカロミセス　セレビシアエ株ＭＴ６６３へ形質転換された。得られた酵母形質転換体をモノクローナルマウス抗インシュリン前駆体を用いたコロニーイムノブロッティング法によりインシュリン前駆体分泌についてスクリーニングしそしてホースラディツシュペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウス■ｇＧで装飾した。最も強い反応を与える形質転換体をさらに分析した。これらのほとんどはシグナルペプチド°がＭＫＡνＦＬＶＬＳＬＩＧＦＣＷＡへ変わったプラスミドｐＬａｃ１９６ｓｐｘ３を存していた。

ＥｃｏＲ１部位からＸａｂ　Ｉに向かうマキサム−ギルバート配列決定により測定された正確なヌクレオチド配列は第１３図に示される。

ｓｐｘ　３シグナルペプチドは上記内容において得られた分泌インシュリン前駆体レベルから評価されるようにｐＬａｃ１９６の最初のシグナルペプチドより優れた２つのファクターである。

驚くべきことにＮ０Ｒ５２０Ｔ突然変異体から生ずるｓｐｘ　３は予想より短かい２つのコドンであり、これに対するただ１つの説明はＮ０Ｒ５２０の最初の一本鎖における長さの違い、またはＮ０Ｒ５２０Ｔへの途中で延長反応におけるポリメラーゼジャンプによるものにちがいない。

ｐＬａｃ１９６ｓｐｘ３のリーダーインシュリン前駆体部分をエンコードするＭａｅ　ｍ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントをｐＬａｃ２００の類似Ｍａｅ　ｍ−Ｘｂａ　Ｉフラグメントに代えるとｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３が得られた（第６ｂ図）。

プラスミドｐＬａｃ２１２ＳｐＸ３は、次のリーダー配列をエンコードする：Ｇ　ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｓｅｒ− ５ｅｒ−Ｖａ　１−　Ｇ　ｌｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ− Ｌｅｕ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− ＾１ａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。

シグナル配列は突然変異したマウス唾液シグナルである。

ｐＬａＣ２１２ｓｐｘ３のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列を第１３図に示す。

例４それぞれＢ　（１２）がＧ　Ｉ　ｎ、　Ｂ　（２７）がＡｒｇでＡ　（２１）がＧｌｙであるインシュリン類似体の前駆体をエンコードするＤＮＡは、９０ｂｐ　Ｓｔｕ　１−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを次の合成りＮＡ：ＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴ匹友匹ＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＣＧＡＴＴＣＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＧＧＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＣＡＡＴＴＡＧＡＴＣに代えることによりプラスミドｐＫＦＮ１２６（マルクーセンＭａｒｋｕｓｓｅｎら、（１９８７）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　１．２１５−２２３）から導びかれた。

得られたプラスミドｐＫＦＮ３７１から１２４ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ［［−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを単離し、これを用いてｐＴ７２１２ｓｐｘ３およびｐＴ７αＭＩ３の類似Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを代える（第１４図参照）。

これにより上記インシュリン類似物をエンコードするＤＮＡ配列を、Ｂ　（２７）がＡｒｇでＡ　（２１）がＧｌｙであるインシュリン類似物をコードする配列へ直した。ｐＭＴ７４３のｓｐｈ　１−ＢａｍＨＩフラグメントを、これらの構築物から生ずるプラスミドｐＴ７２１２ｓｐｘ３−０１７４およびｐＴ７　ｔｘ −０１７４の２．２ｋｂＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに代えるとそれぞれｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３−０１７４およびｐＫＦＮ２１６が構築された（第１５図参照）。これらのプラスミドにおいて、それぞれ２１２ｓｐｘ３およびサツカロミセス　セレヴイシアエＭＦ、リーダーがインシュリン類慎物の分泌を上記のように調製されたプラスミドは、グルコース増殖を選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有するサツカロミセス　セレヴイシアエ株へ形質転換された。

形質転換した酵母株をＹＰＤ培地（シェアマン、エフ。

Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、コールドスプリング　ハーバーラボラトリイ１９８１）で増殖した。各々６株に対しそれぞれ５ｄの培養物をＯＤ　ｂ。。がほぼ１５（はぼ４８時間）に達するまで３０°Ｃにて振とうした。遠心分離後上澄をＨＰＬＣ分析のために除き、この方法により分泌されたインシュリン前駆体の濃度をレオ　スネルＬｅｏ　５ｎｅｌ　ら（１９８７）　Ｃｈｒｏ−ｍｏｔｏｇｒａｐｈｉａ　２４．３２９−３３２により記載された方法で測定した。

様々なインシュリン前駆体の発現レベルを次の第１表および第２表にまとめた。

第１表および第２表において本発明によるリーダー配列の使用によりインシュリン前駆体の発現レベルは、同じ酵母株ではあるがしかしＭＦ、シグナル／リーダー配列の使用によるものにおいて発現され分泌された同じインシュリン前駆体の発現レベルのパーセントで示される。

第１表プラスミド　発現レベル０ｐＭＴ７４３　１００％ｐＬａｃ１９３　１６０％ｐＬａｃ１９４　２００％ｐＬａｃ１９５　９０％ｐＬａｃ２００　’　１７０％ｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３　１２０％９発現レベルは、任意に１００％としたｐＭＴ７４３の発現レベルのパーセントとして示される。

第２表プラスミド　発現レベル０ｐＫＦＮ２１６　１００％ｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３−０１７４　１５０％Ｏ発現レベルは、任意に１００％と設定したｐＫＦＮ２１６の発現レベルのパーセントとして示される。

【「０ρＩ来ＦＩＧ、　１４ ↓ ＦＩＧ、　７ＦＩＧ、　８ＡＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＡ　／Ｊ八へＴ入ＧＴＴＣ入Ａ＾　Ｃ入へＧ入＾ＧＡＴＴＡＣへＡＡＣＴＡＴＣ入ＡＴＴ　ＴＣＡＴ八Ｃ入へ入八Ｔ` へＹＬＶ　ＣＧＥＲＧＦＦＹ　ＴＰＫＡ　ＡＫＧ？ＡＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣ入　ＧＧＣＴＣＴ八Ｓ八ＦＩＧ、　９ＣＴＡＧＡＦＩＧ、　１０ＦＩＧ、　１１ＦＩＧ、　１２７２　８４　９６　１０ＥＩ　１２０丁入ＡＡＣＧＡＴＴ入入ＡＡＧ入ＡＴＧ入Ｇ、％ＴＴＴ　ＣＣＴＴ（ＴＡＴＴＴＴＴ　ＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡ　ＴＴＣＧＣＴＧＣＴＴＣb ＭＲＦ　ＰＳＩｒ　ＴＡＶＬ　）’ＡＡ５１３２　１４４　１５６　１６８　１Ｂ０ＬＩＩＡ　Ｅ’ＮＴＴ　ＬＡＮＶ　ＡＭＡＫ　ＲＦＶＩＪＯＨＬＣＧＳＨＬ　ＶＥＡＬ　Ｙ　Ｌ　ＶＣＧＥＲＧ３１２　３２４　３３６　３４８　：１６０ＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴ　ＣＣＴ入ＡＧＯＣＴＧＣＴ　ＡＡＧＧＧＴ入ＴＴＧＴＣＧ入へＣ入ＡＴＧＣＴＧＴ　入ｃｃＴｃｃ＾ＴＣＴＧＣＦ’Ｆ’Ｙ’ｒ　ＰＫＡＡ　ＫＧＩＶ　Ｉ：ＱＣＣＴＳＴＣＦＩＧ、　１３３７２　３８４　、．３９６　４０８　４２０ＦＩＧ、　１５補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年３月１日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１　特許出願の表示ＰＣＴ／ＤＫ８　Ｂ１０　Ｏ１４７２発明の名称合成酵母リーダーペプチド３　特許出願人住所　デンマーク国、デーニー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし）名　称　ノボ−ノルディスク　アクティーゼルスカブ４代理人５　補正書の提出年月日請求の範囲１９次式（Ｉ）ＸＩ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ＝Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｕ−５ｅｒ−５ｅｒ− Ｖａ　Ｉ−Ｇｌｕ−ｒ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ）ｒ＋−Ｘｚ−Ａｌａ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘｌ−Ｘａ−Ｘｓ（式中、Ｘ、はＡｌａまたはＧｌｎであり；ＸｚはＩｌｅ、アミノ酸残基１０個までのペプチド鎖、またはペプチド結合であり；Ｘ３はアミノ酸残基５個までのペプチド鎖またはペプチド結合であり；Ｘ４およびＸ、はＬｙｓまたばＡｒｇであり：そしてｎは１またはＯである。）を有する酵母における分泌のための合成リーダーペプチド。

２、　ＸｚはＩｌｅであり、ｎは１であり、そしてＸ＋、Ｘｚ。

Ｘ４およびＸ、は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。

３、　Ｘｚがペプチド鎖Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−１１ｅであり、ｎが１であり、そしてＸ＋、Ｘｓ、Ｘ４およびＸ、は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。

４、ｎがＯであり、ＸｚがＩｌｅまたはペプチド結合であり、そしてＸ、、Ｘ、、Ｘ、およびＸ、は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。

５、　次のペプチド配列：Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−５ｅｒ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ −Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＧＩｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ −Ａｒｇを有する請求項１に記載のリーダーペプチド。

６、次のペプチド配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｓｅｒ− シａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ− １１ｅ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ− Ａｒｇを有する請求項１に記載のリーダーペプチド。

７゜　次のペプチド配列：Ａ　ｌａ　−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ　−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ −Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１　ｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する請求項１に記載のリーダーペプチド。

８、次のペプチド配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−八ｓｐ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−５ｅｒ− Ｖａｔ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する請求項１に記載のリーダーペプチド。

９、次のペプチド配列：Ｇ　１ｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｓｅｒ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ− Ａｓｒ＋−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する請求項１に記載のリーダーペプチド。

１０、請求項１に記載の式（１）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。

１１、第９図においてヌクレオチド１３３〜２４６のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のＤＮＡ配列。

１２、第１０図においてヌクレオチド１３３−２１８のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。

１３、第１１図においてヌクレオチド１３３−２０３のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。

１４、第１２図においてヌクレオチド１３３−２３３のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。

１５、第１３図においてヌクレオチド１２４−２１６のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のＤＮＡ配列。

１６、上流に所望生成物をエンコードするＤＮＡ配列が位置しそしてプロモーターとシグナル配列が操作可能に接続した請求項１に記載の式（１）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な酵母ベクター。

１７、請求項１６に記載のベクターで形質転換された酵母株。

１８、請求項１６に記載のベクターで形質転換された酵母株を適当な培養基で培養しそして所望生産物を培養基から単離することからなる酵母におけるタンパク質の産生方法。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．次式（Ｉ）【配列があります】（Ｉ）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＧｌｎであり；Ｘ２はＩｌｅ、アミノ酸残基１０個までのペプチド鎖、またはペプチド結合であり；Ｘ３はアミノ酸残基５個までのペプチド鎖またはペプチド結合であり；Ｘ４およびＸ５はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてｎは１または０である。）を有する酵母における分泌のための合成リーダーペプチド。
２．Ｘ２はＩｌｅであり、ｎは１であり、そしてＸ１，Ｘ３，Ｘ４およびＸ５は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。
３．Ｘ２がペプチド鎖【配列があります】であり、ｎが１であり、そしてＸ１，Ｘ３，Ｘ４およびＸ５は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。
４．ｎが０であり、Ｘ２がＩｌｅまたはペプチド結合であり、そしてＸ１，Ｘ３，Ｘ４およびＸ５は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリーダーペプチド。
５．次のペプチド配列：【配列があります】を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
６．次のペプチド配列：【配列があります】を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
７．次のペプチド配列：【配列があります】を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
８．次のペプチド配列：【配列があります】を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
９．次のペプチド配列：【配列があります】を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
１０．請求項１に記載の式（Ｉ）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。
１１．第８図におけるヌクレオチド１３５〜２００のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。
１２．第９図においてヌクレオチド１３５〜２４６のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
１３．第１０図においてヌクレオチド１３５−２１８のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。
１４．第１１図においてヌクレオチド１３５−２０３のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。
１５．第１２図においてヌクレオチド１３５−２３３のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列。
１６．第１３図においてヌクレオチド１２４−２１６のヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
１７．上流に所望生成物をエンコードするＤＮＡ配列が位置しそしてプロモーターとシグナル配列が操作可能に接続した請求項１に記載の式（Ｉ）を有するリーダーペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な酵母ベクター。
１８．請求項１７に記載のベクターで形質転換された酵母株。
１９．請求項１７に記載のベクターで形質転換された酵母株を適当な培養基で培養し、所望のタンパク質生成物を培養基から単離する、酵母におけるタンパク質の産生方法。