PT87562B - Processo para expressao de proapolipoproteina a-i humana - Google Patents

Description

PROCESSO PARA EXPRESSÃO DE PROAPOLIPOPROTEÍNA A-I HUMANA

ferente de maneira a reduzir ou a evitar a formaçao de estruturas em alfinete. Sao também referidos os processos para a preparaçao de vectores de clonagem e de expressão contendo as sequências de DNA e de culturas de células ou microorganismos transformados com os vectores de expressão, bem como os proces sos que os utilizam para a produção de proapolipoproteina A-I.

-30 presente invento esta relacionado com novas sequências de DNA recombinantes compreendendo uma sequência codificadora da proapolipoproteína A-I humana, com vectores de clonagem e de expressão contendo estas sequências de DNA, com células hospedeiras transformadas com estes vectores de expressão, assim como com processos de produção da proa, polipoproteina A-I humana utilizando as novas sequências de DNA recombinantes, os vectores e transformantes.

A apolipoproteina A-I (apo A-I) humana e o principal constituinte proteico das lipoproteinas de alta densidade (LHD) e dos quilomicrons da linfa. 0 figado e o intestino delgado sao os centros primários da sintese da apo A-I. A apo A-I é sintetizada nestes orgaos sob a forma de um precursor proteico (preproapo A-I). No interior da célula dá-se uma clivagem cotransducional do prépeptideo e a proapo A-I é secretada para o plasma e linfa.

A proapo A-I contem seis aminoácidos suplementares (Arg - His - Fen - Trp - Gin - Gin) que estão ligados ao grupo amino terminal da apo A-I. Ao atingir a região vascular, a proapo A-I e clivada in vivo por uma enzima prq teolitica especifica (apo A-I propeptidase) para dar a apo A-I madura.

A apo A-I madura e um polipeptídeo único nao glicosilado de sequência conhecida, composta por 243 aminoácidos (H.B. BREWER et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, (1978), 623-630), ela serve de cofactor para a enzima plas_ matica da lecitina: colesterol aciltransferase, que é responsável pela formaçao no plasma da maior parte dos ésteres de colesterol. As deficiências nas estruturas ou na biossíntese da apolipoproteina podem conduzir a perturbações no sistema de transporte dos lipidos plasmaticos e ao desenvolvimento de uma doença das artérias coronárias. Mostrou-se que taxas plasmáticas baixas de apo A-I e de LHD constituem um factor de risco importante para as crises cardiacas (enfarte do miocárdio) e para outras doenças arteroscleróticas vasculares. As mutações no gene codificador da apo A-I em particular, foram associadas a reduções da taxa de LHD assim como a doenças prje maturas das artérias coronárias.

A apo A-I e as LHD sao os principais constituintes do plasma que participam na transferência do colesterol dos tecidos periféricos (artérias) para o figado (cha. mado também transporte inverso do colesterol) para ser excretado pelo organismo. Sabendo-se que a acumulaçao do colesterol nas artérias é a caracteristica e o mecanismo mais importante da arterosclerose, a estimulação do transporte inverso do colesterol por meio da apo A-I poderá retardar e inverter o processo arterosclerótico e assim diminuir a incidência de crises cardiacas.

A maturaçao da proapo A-I em apo A-I pode-se produzir quantitativamente no exterior da célula com um tempo de permanência no sangue inferior a 12 horas. Sabendo-se que a proapo A-I é o principal precursor, senão o único, da apo A-I madura, ela poderá ser utilizada numa terapêutica de substituição de cada vez que as taxas de LHD diminuem, por exemplo nas deficiências hereditárias ou adquiridas. Devido a utilidade terapêutica da apo A-I em geral, os investigadores procuraram técnicas que permitissem produzir em grandes quantidades apo A-I. Tradicionalmente tais técnicas comportam a purificação da apo A-I a partir do plasma sanguineo.

Várias publicações (P. CHEUNG e L.

CHAN, Nucleic Acids Res. 11, (1983), 3703-3715; J.J. SEILHAMER et al. , DNA, .3, (1984), 309-317 e o pedido de Patente Japonesa N⁹ 96998/86) mostraram que o DNA complementar codificador da preproapo A-I pode ser preparado por técnicas de engenharia genética bem conhecidas.

-5R. LORENZETTI et al., (FEBS Lett.

194, (1986), 343-346) mostraram que a apo A-I pode ser expressa em E. coli sob a forma de uma proteína de fusão com a beta-galactosidase, nao clivável. Entretanto, as tentativas para expressar a apo A-I madura sob a forma de uma proteína nao fundida nao tiveram exito.

No pedido de Patente Japonesa N⁹ 96998/86 atrás citado, descreve-se a expressão de uma proteína semelhante à apolipoproteina A-I humana, em E. coli que foi transformada pelo plasmideo pHAIE-I contendo o gene estrutural da apo A-I sob o controle do promotor tac. No entanto, o gene estrutural está incompleto e composto pelos codoes dos aminoácidos +4 a +243, precedidos por um codão ATG de iniciaçao da traduçao. Daqui resulta que o produto de expressão obtido cori tem a metionina N-terminal (correspondente ao codão ATG) que pode provocar efeitos secundários quando do seu emprego em terapêutica.

J.B. MALLORY et al., (J. Biol. Chem. 262, (1987), 4241-4247; pedidos de patente internacionais PCT WO 86/04920 e WO 87/02062) descrevem a expressão da apolipoproteina A-I humana em células de ovário de hamster chinês (cultura de células animais). A construção utilizada contem o gene completo da preproapolipoproteina A-I humana. As células de ovário de hamster chinês parecem transformar a forma proapo na forma apo madura, pois somente 5 a 10% da proteína

-6apo A-I secretada é da proapo A-I, a restante é proteína apo A-I madura. A produtividade do sistema é relativamente fraca, uma vez que 0,5 x 10 células secretam somente 25-30 jjg/ml de apo A-I em 24 horas. No pedido de Patente internacional PCT W0 87/02062, alguns exemplos de utilização referem-se à expres | sao da apolipoproteina A-I humana em outros hospedeiros, tais como E. coli (hospedeiro bacteriano) e S_. cerevisiae (levedura) No entanto, nenhuma das construções empregues contem a imformaçao genética para a forma proapo e a proteína expressa nao é a proapolipoproteina A-I humana.

I presente invento esta relacionado com meios e métodos para preparar a proapolipoproteina A-I humana pela tecnologia de DNA recombinante, ou seja a proteína proapo A-I madura que é susceptível de ser clivada pela enzima proteolitica especifica apo A-I propeptidase. Pela espressao madura tal como aqui é utilizada, entende-se nao somente a proapo A-I humana tal qual, mas também a proteína correspondente cujo primeiro aminoácido é a metionina e cuja presença é devida ao codao ATG de iniciaçao da traduçao na construção do vector de expressão.

) 0 presente invento relaciona-se com a construção de vectores de clonagem e de expressão contendo uma sequência de DNA codificadora da proapo A-I humana, de maneira a permitir a amplificaçao e por consequência a expressão da proteina proapo A-I humana madura assim como a met-proapo ( A-I, seus conjugados de fusão ou seus conjugados com o sinal

N-terminal. Ainda, o presente invento diz respeito a culturas de células viáveis ou microorganismos geneticamente modificados que sejam portadores de tais vectores e capazes de produzir o polipeptideo proapo A-I humana. Por outro lado, o presente invento consegue a proapo A-I humana num estado fisico distinto do que se encontra ou que se isola a partir de uma fonte ou de ambientes naturais; devido ao seu método de preparaçao, a proapo A-I humana está essencialmente livre de protei nas endógenas habituais e de outros materiais ou substâncias de origem.

presente invento diz respeito à prç) dução da proapo A-I humana por meio da técnica de DNA recombinante em todos os seus aspectos e nao deve ser interpretada como estando limitada a detalhes especificos descritos e englo_ bados no quadro do invento.

Um aspecto fundamental do presente invento diz respeito à produção de uma proteina que consiste ou contem a proapo A-I humana madura e que pode portanto ser convertida, in vitro ou in vivo, em apo A-I humana madura pela acçao proteolitica da apo A-I propeptidase. 0 produto proapo A-I humano pode ser utilizado tal qual para fins terapêuticos; pode-se utilizar igualmente a met-proapo A-I, se a presença do radical metionilo fôr farmaceuticamente aceitável, porque este produto pode ser convertido natural e eficazmente na circulação sanguínea pela propeptidase natural para dar a apo A-I humana madura autêntica. Caso se pretenda, a proapo A-I humana pode ser produzida em microorganismos ou em culturas de células seleccionadas que sao capazes de tratar a metionina N-terminal e que, consequentemente, sao capazes de produzir a proapo A-I humana sob a forma que nao contem a metionina N-terminal. Como alternativa, a proapo A-I humana pode ser clivada in vitro para se obter a apo A-I humana madura, que pode ser utilizada para aplicações terapêuticas. 0 mesmo se aplica aos conjugados de fusão e aos conjugados que incluem o sinal N-ter. minai da proapo A-I; a clivagem produz a apo A-I humana autêri tica desprovida da metionina N-terminal.

Um segundo aspecto importante do presente invento reside no emprego de uma sequência modificada codificando pelo menos uma parte da molécula da proapo A-I humana; esta sequência codificadora modificada melhora a eficácia da traduçao devido à redução ou mesmo ao evitar a formaçao de estruturas em alfinete. Ê possivel que R. LORENZETTI et al. (FEBS Lett, 194, (1986), 343-346) nao tivesse podido observar a expressão de uma proteína apo A-I madura nao fundida devido às suas construções de DNA serem susceptiveis de formar de maneira apreciável estruturas em alfinete, conduzindo a uma expressão muito ineficaz. Constatou-se com surpresa que uma expressão eficaz pode ser assegurada por uma modificação adequada de alguns codoes na sequência codificadora dos aminoácidos -6 a +14 da proapo A-I humana. A expressão modificação adequada tal qual é aqui utilizada implica que alguns dos codoes naturais sejam substituídos por outros codoes que, segundo o código genetico, representam os mesmos aminoácidos, e implica, por outro lado, que todas as modificações tomadas em conjunto conduzem à redução ou mesmo a eliminação da formaçao de estruturas em alfinete. É importante assinalar que as modificações da sequência de DNA nao têm qualquer efeito na natureza do sitio de clivagem da propeptidase, desde que a sequência de aminoácidos reconhecida pela propeptidase seja preservada na cons. truçao.

Ao nível das proteinas, o presente invento diz respeito à proapo A-I humana desde que produzida a partir de uma cultura de células ou de um microorganismo geneticamente modificado. Esta proapo A-I humana pode-se apre. sentar sob a forma de uma proapo A-I madura, sob a forma de uma proapo A-I madura precedida de um residuo de metionina, sob a forma de uma proteína fundida como seja por exemplo beta-galactosidase-proapo A-I e sob a forma do composto préproapo A-I. 0 produto obtido está essencialmente livre das proteinas endógenas habituais e de outros materiais ou substâncias de origem comum à fonte natural (plasma do sangue) da proteina em questão. A cultura de células ou o microorganismo utilizado para a produção nao está limitado a linhas celulares e a microorganismo específicos: tanto as células procarioticas como as células eucarióticas podem ser empregues, incluindo-se as linhas celulares animais e humanas. Somente a titulo ilustrativo, damos aqui o exemplo da expressão na bactéria E, coli (como representante das células procarióticas) e na levedura Saccharomyces cerevisiae e nas células de inse£ tos infectadas por baculovirus (como representantes das células eucarióticas).

A nível das proteínas, o presente invento relaciona-se igualmente com a apo A-I humana obtida por tratamento com a apo A-I propeptidase da proapo A-I humana aqui preparada. Esta apo A-I será idêntica à forma autêntica da apo A-I humana madura e será desprovida de qualquer residuo de metionina N-terminal.

Ao nível da aplicaçao, o presente invento relaciona-se com composiçoes farmacêuticas que incluem a proapo A-I humana e/ou a apo A-I humana acima, e contendo por outro lado, pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável, um solvente, um diluente ou um excipiente convenientemente escolhido de acordo com a via de administraÇao e as exigências habituais da fórmulaçao de composiçoes farmacêuticas .

Ao nível do DNA, o presente invento relaciona-se com uma sequência de DNA recombinante compreendendo uma sequência que codifica a proapolipoproteina A-I humana na qual uma parte da sequência codificadora natural foi

substituída por um fragmento de DNA codificador dos mesmos aminoácidos mas consistindo numa sequência de nucleotídeos diferente, de maneira a reduzir ou a evitar a formaçao de estruturas em alfinete. De acordo com uma forma de realizaçao especifica preferida, a sequência natural codificadora dos aminoácidos -6 a +14 da proapo A-I foi substituída pela sequência (indicada apenas uma cadeia):

5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3’ a referida sequência compreendendo um codao suplementar ATG de iniciaçao da traduçao e codoes modificados para os resíduos dos aminoácidos -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 e +14.

No plano do DNA, o presente invento relaciona-se igualmente com vectores de clonagem replicáveis e vectores de expressão compreendendo a sequência de DNA recombinante referida que codifica a proapo A-I humana. 0 presente invento relaciona-se mais particularmente com os plasmideos recombinantes pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV16l2 e pNIVl6l3 cuja construção é aqui descrita em seguida. Os primeiros plasmídeos citados, pULB9291 e pDLB9292 contêm o gene estrutural modificado da proapo A-I precedido por um codao ATG e sob o controle do promotor PL do fago lambda. Estes plasmídeos sao os vectores de expressão que convêm a E. coli e comandam a sintese da proapo A-I humana, que pode ser clivada pela propeptidase para dar origem a uma apo A-I humana madura autêntica. Logo que é introduzido em E. coli, o plasmídeo pULB9296 dirige a expressão de uma proteina de fusão contendo a beta-galactosidase e a proapo A-I humana sob o controle da região do promotor lac de E. coli. Sabendo-se que o produto de fusão contem ainda a sequência de clivagem da propeptidase, ele pode ser clivado para dar a apo A-I madii

-lira humana autêntica.

plasmídeo pULB9299 é um vector de expressão que covem para especies de leveduras e contem as regiões do promotor e do terminador da transcrição do ARG3 para assegurar uma expressão eficaz numa levedura. Novamente, a pr£ apo A-I humana obtida pode ser cindida pela propeptidase para dar a apo A-I humana madura autêntica.

j 0 plasmídeo pNIV1612 contem o gene estrutural da proapo A-I fundido com a sequência de DNA do peptideo sinal da proteína OmpA de E. coli e sob o controle do promotor lpp (lipoproteina) e do promotor-operador lac. Na construção, a sequência codificadora do peptideo sinal de OmpA precede a sequência da proapo A-I sem o codao ATG de iniciação da traduçao. 0 plasmídeo é um vector de secreção apropriado para E. coli e dirige a sintese da proapo A-I humana que pode ser secretada no periplasma sem a metionina N-terminal. 0 plasmídeo pNIV1613 é um vector de transferência para a introdução da sequência de DNA da proapo A-I humana no baculovirus. Ele compreende o promotor poliedrina do baculovirus e o gene estrutural da proapo A-I, nele incluído o codao ATG de iniciaçao da traduçao. Conjuntamente com a estirpe selvagem do baculovirus (virus da poliedrose nuclear de Autographa californica, AcNPV), o plasmídeo pNIV1613 dirige a sintese da proapo A-I nas células de insectos e pode encontrar-se livre da metionina após modificações pós-traducionais nas células

I de insectos.

Finalmente o presente invento está igualmente relacionado com culturas de células e de microorga^ nismos que foram transformados por um vector de clonagem ou por um vector de expressão tal como aqui descrito e, em par-

-12ticular, com culturas de células e de microorganismos transformados que sao capazes de produzir a proapo A-I humana. A expressão transformados tal como aqui é utilizada, toma o sentido lato de modificadas geneticamente e nao está certamente limitado ao conceito estreito de transformaçao bacteriana. Dependendo da natureza do vector empregue e do hospedeiro seleccionado, pode ser utilizada qualquer técnica de eii genharia genetica compatível para obtenção da modificação genética pretendida, incluindo transfecçao, transduçao, etc.

As culturas de células e os microorganismos preparados de acordo com o invento podem ser utiliza, dos para uma produção por fermentação à escala industrial da proapolipoproteina A-I humana.

invento aqui descrito foi realizado empregando entre outras a estirpe MM 294 do microorganismo E. coli K12 (endoA, thi , hsdR, supE); esta estirpe foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC N^Q 33625) sem restrição no que respeito à sua acessibilidade. No entanto, podem ser utilizadas outras estirpes microbianas, compreenden. do estirpes conhecidas de E. coli como sejam E.coliB, E.coli x 1776 (ATCC N^Q 31537, depositada em 3 de Julho de 1979, sem restrição), E. coli AR 58, derivada de N99 (ATCC N^Q 33956) com cIII , cl 857, bio , funções delta H desprovidas de lambda, vendida por PL-PHARMACIA (J.E. MOTT et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985), 88-92; G. DEVARE et al., Cell, 36, (1984), E. coli JM1O1 (ATCC N^a 33876)(J. MESSING et al., Nucleic Acids Res-9, (1981), 309-321) ou E.coli JA 221 (lpp^_, hdsM⁺, trp Es leu B6, lac Y, recAI/F', lacl% lac⁺, pro⁺)(J. GHRAYEB et al., EMBO J. 3., (1984), 2437-2442) ou outras estirpes microbianas muitas das quais estão depositadas e acessíveis nas instituições de depósito de microorganismos conhecidas como seja a American Type Culture Collection (ATCC) - cf. as listas do catalogo ATCC. Estes microorganismos compreendem por exemplo,

Bacilli tais como Bacillus subtilis e outros Enterobacteriáce as entre as quais se pode citar, por exemplo, Salmonella Typhimurium e Serratia marcesans, utilizando plasmídeos que podem replicar-se e exprimir sequências de genes heterologos.

-13Os plasmídeos de expressão para utilização em bactérias, por exemplo E. coli, sao habitualmente obtidos a partir do plasmídeo pBR322 utilizado como vector (depositado na ATCC sob o número de acesso 37017) e inserindo de maneira apropriada a sequência do gene heterólogo ao mesmo tempo que os sinais de iniciaçao e de terminação da traduçao, na fase de leitura correcta com um promotor funcional, tirando vantagem dos sitios de restrição naturais ou criados sinte ticamente. 0 vector possuirá um ou mais genes caracteristicos de selecçao fenotípica e uma origem de replicaçao para assegu. rar a amplificaçao no hospedeiro. Novamente, a inserção heteróloga pode ser alinhada de maneira a ser expressa ao mesmo tempo que uma pré-sequência fundida, proveniente por exemplo dos genes do sistema lac.

Os vectores de expressão para baculovirus, por exemplo pAcRPó e pAcYMl (Y. MATSUURA et al♦, J. Gen. Virol 68 (1987), 1233-1250) e o baculovirus estirpe selvagem (virus da poliedrose nuclear de Antographa californica, AcNPV) sao largamente utilizados actualmente. Eles estão descritos detalhadamente na literatura e podem ser obtidos principalmente na TEXAX AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION.

De acordo com o presente invento, pode-se utilizar diferentes células de insectos como hospedei, ro para vectores de expressão compatíveis, tais como por exem pio células de Spodoptera frugiperda Sfa (M.D. SUMMER e G.E.

-14SMITH. A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect cell culture Procedures, Texas University, College Station, (1987); ATCC CRL 1711).

De acordo com o presente invento pode -se utilizar diferentes estirpes de leveduras portadoras de vectores de expressão compatíveis tais como o plasmídeo YRp7 (D.T. STINCHCOMB et al. , Nature, 282, (1979), 39-43) que é capaz de selecção e de replicaçao ao mesmo tempo em E, coli e em levedura, em particular Saccharomyces cerevisiae.

As estirpes de levedura que podem ser utilizadas sao a estirpe RH218 (G. MIOZZARI et al., J. Bacteri^ ol. 134, (1978), 48-59) depositada na American Type Culture Collection sem restrição (ATCC N^s44076), a estirpe 10S44c (T. CABEZON et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, (1984), 6594-6598) que tem o genotipo leu2-3, leu2-l12, pep4-3 (M. HOYLAERTS et al. , FEBS Lett. 204, (1986), 83-87) e a estirpe Ic 1697d (argJ; leu2-l) braditrofa para a arginina (ATCC N^e20631).

Para exprimir um gene heterologo como seja o cDNA da proapo A-I humana numa levedura, e necessário construir um plasmídeo vector contendo quatro componentes.

primeiro componente é o fragmento que permite a transformaçao ao mesmo tempo de E. coli e de levedura e que deve consequentemente conter um gene de selecçao proveniente de cada um dos organismos. Este pode ser o g_e ne responsável pela resistência a ampicilina proveniente de E. coli (cf. AmpA) e o gene leu2 proveniente da levedura. Este componente requer igualmente uma origem de replicaçao proveniente de cada um dos organismos para ser mantido como DNA de plasmídeo nos dois organismos. Esta pode ser a origem

-15de E. coli proveniente do pBR322 e a origem arsl do cromossoma

III da levedura ou a origem de replicaçao do DNA circular 2p.

segundo componente do plasmideo é uma sequência situada em 5' de um gene de levedura fortemente expresso para promover a transcrição de um gene estrutural colocado a seguir. A sequência situada em 5’ pode ser a proveniente dos genes TDH3 ou ARG3 da levedura. 0 fragmento é construído de maneira a eliminar as sequências estruturais do TDH3 ou de ARG3 que sao substituídas por uma sequência conteii do sitios de restrição alternativos como sejam os sitios de restrição Ncol ou BamHI para a ligaçao cómoda desta sequência 5’ ao gene estrutural.

terceiro componente do sistema e um gene estrutural construído de modo a conter simultaneamente um sinal de iniciaçao da traduçao ATG e um sinal de terminação da traduçao.

quarto componente é uma sequência de DNA de levedura contendo a sequência situada em 3' de um gene de levedura que contem os sinais adequados de terminação da transcriçaó e de poliadenilaçao. Por exemplo os plasmídeos que dirijem a produção da proapo A-I humana na levedura podem ser construídos inserindo fragmentos de gene para o polipeptideo proapo A-I humano no sitio BamHI do plasmideo de expres_ sao pRIT 10774 descrito no pedido de Patente Europeia N^s 151102.

As características suplementares do invento surgirão ainda no decurso da descrição que se segue das construções preferidas de vectores contendo uma sequência de DNA recombinante de acordo com o invento e das condiçoes

-16nas quais estes vectores sao utilizáveis. Agora será feita referência aos desenhos nos quais:

as figuras IA e B mostram a sequência de nucleotideos e aminoácidos da preproapo A-I humana. A sequência de nucleq tideos do RNA mensageiro da preproapo A-I humana foi determinada a partir da análise da sequência de DNA e de cDNA do clone pULB1609. Os aminoácidos previstos no peptideo sinal, no propeptideo e no polipeptideo apo A-I maduro estão indicados e numerados a partir do primeiro residuo de aminoácido da proteina apo A-I. Sublinhou-se a região correspondente à sonda de DNA sintético utilizada para isolar o clone. As abreviaturas de uma única letra usadas para desi_g_ nar os aminoácidos sao as seguintes: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutâmico; F, fenilalanjL na; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano e Y, tirosina.

a figura 2 representa o esquema de sintese de um oligonucleotideo adaptador para a construção de um fragmento de DNA codificador de 6 aminoácidos do propeptideo e dos 14 primeiros aminoácidos do polipeptideo apo A-I maduro, com o codao ATG de iniciaçao. As setas indicam os oligonucleotideos utilizados para sintetizar o fragmento Ncol - Bali de 65/61 pares de bases (pb).

a figura 3 mostra a construção do plasmideo pULB9291 que possui as regiões reguladoras de Pc lambda e a sequência de nucleotideos da proapo A-I.

a figura 4 mostra a construção do plasmídeo pULB9296 que possui o promotor lac de E. coli e uma sequência de nucleq tideos da beta-galactosidase fundida com a da proapo A-I.

-17a figura 5 mostra a construção do plasmídeo pULB9299 que possui as regiões reguladoras do ARG3 da levedura e a sequência de nucleotideos da proapo A-I.

as figuras 6A, B e C mostram a construção do plasmídeo pNIV1612 que possui as regiões reguladoras lac e lpp, a sequência codificadora do peptídeo sinal de ompA e a sequência de nucleotideos da proapo A-I.

a figura 7 mostra a construção do plasmídeo pNIV1613 que inclui a região reguladora do gene da poliedrina e a sequência dos nucleotideos da proapo A-I.

Descrição detalhada do invento

Preparaçao do RNA: o RNA total de fígado humano foi preparado pelo método do cloreto de guanidinio (R.A COX, Methods Enzymol XII, parte B, (1968), 120-129). Esta preparaçao de RNA total foi em seguida passada numa coluna de oligo (dT)-celulose para se obter os RNAs poli A totais (T. Maniatis et al., em Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). A partir de lOg de figado humano obtem-se 200 pg de RNAs poli A⁺.

-18Sintese invitro do DNA complementar (cDNA)

As reacções de transcrição reversa, partindo de 0,1 a 5 ^ug de RNAs poli A , sao iniciadas com oljí go (4T)^2_ig (cerca de 1 jjg; origem:BOEHRINGER). 0 cDNA de cadeia simples é em seguida transformado em molécula de cadeia dupla (ds cDNA) com a mesma enzima transcriptase reversa. As preparações de ds cDNA, geralmente 1 jug, sao tratadas com a nuclease SI para criar extremidades cegas. Os processos sao bem conhecidos dos técnicos da especialidade e estão descritos detalhadamente por T. MANIATIS et al., loc. cit.. 0 ds cDNA é em seguida alongado por extensões de oligo (dC) segundo o processo descrito por L. VILLA-KOMAROFF et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75 (1978), 3727-3731). Habitualmente, trata-se 100 ng de ds cDNA com a enzima desoxinucleotidilo transferase terminal. Em geral,, as extensões de um com primento de 15 bases sao adicionadas as extremidades 3’ das moléculas de ds cDNA.

Clonagem do ds cDNA alongado no vector plasmídeo pBR322

DNA do plasmideo pBR322 foi linearizado pela enzima PstI e alongado com extensões de oligo (dG) de acordo com o método descrito por R.M. LAWN et al., (Nucleic Acids Res. £, (1981), 6103-6114). 0 ds cDNA alongado pelas extensões de oligo (dC) foi misturado em proporçoes equimolares com DNA do pBR322 alongado com extensões de oligo (dG). Geralmente sao hibridadas 50 pg da mistura para recircularizar o plasmideo. As condiçoes sao bem conhecidas do téç.

nico especializado e estão descritas detalhadamente por R.M. LAWN et al. , loc-cit., A mistura de híbridaçao foi em seguida utilizada para transformar células competentes da estirpe MM294 de E. coli por exemplo, de acordo com o método descrito por R.M. LAWN et al., loc. cit.. Obtiveram-se várias centenas de transformantes através da selecçao por crescimento em meio de tetraciclina, a resistência a este antibiótico sendo levada pelo plasmídeo pBR322. Os transformantes foram também testados quanto à sensibilidade a ampicilina. Os que sao sensíveis contem um plasmídeo quimérico uma vez que a inserção do DNA estranho no vector inactiva o gene da ampicilina.

Despiste do banco de cDNA

Os transformantes de E. coli foram detectados por meio de oligonucleotideos sintéticos, marcados 32 na sua extremidade 5' com P e correspondendo a um fragmento do gene da apo A-I. A sequência de nucleotideos da apo A-I humana é conhecida (ver P. CHEUNG e L. CHAN, loc. cit. e J.J. SEILHAMER et al., loc. cit.); é consequentemente pratico sintetizar quimicamente, pelo método de N.D. SINHA et al♦,(Nucleic Acids Res. 12, (1984), 4534-4557), uma sonda de oligonucleotideos com um comprimento de 22 bases correspondendo a extremidade 5’ do gene. A sequência seleccionada e a seguinte:

5¹ —GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG—3 Antes de ser utilizado nas experiências de hibridaçao, o oligonucleotideo sintético foi fosforilado na sua extremidade 5' por meio da polinucleotideo cinase de T4 (P-L Biochemicals) e de / gama- P7 ATP. As condi, çoes de marcaçao e de hibridaçao sao bem conhecidas e estão descritas detalhadamente por T. MANIATIS et al., loc. cit. e

por A. BOLLEN et al. , (DNA,2, (1983), 255-264).

Construção dos plasmídeos de expressão

Os métodos para a preparaçao do DNA, para o isolamento dos fragmentos de DNA, assim como as condições de análise com enzimas de restrição e as condiçoes de li gaçao dos fragmentos sao conhecidas e estão descritas detalha damente por R.M. LAWN et al. , loc. cit. e por T. CABEZON et al. , loc. cit. e sao aplicáveis aqui.

A sintese dos fragmentos que ligam o promotor dos vectores de expressão à extremidade 5' do gene está descrita abaixo.

Sintese do fragmento Ncol-Ball

Na figura 2 mostra-se detalhadamente os princípios que estão na base da concepção dos oligonucleotideos 35-meros, 30-meros, 18-meros e 43-meros utilizados na sintese do fragmento Ncol-Ball de 65/61 pb. Os fragmentos siii teticos de 30-meros e 18-meros foram fosforilados nas suas extremidades 5' por meio da polinucleotideo cinase de T4 (P-L Biochemicals) . 1 jig de cada oligonucleotideo, contendo os 35-meros e 43-mero nao fosforilados foram hibridados durante 3 minutos a 95°C em acetato de sodio 300 mM (pH 7,0), depois

deixou-se arrefecer lentamente a 4°C. A mistura de hibridaçao foi utilizada tal qual no processo de clonagem para a constrii çao dos plasmideos de expressão.

Sequenciaçao do DNA

A análise da sequência do DNA foi efectuada de acordo com o método descrito por A.M. MAXAM et W. GILBERT (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, (1977), 560-564) e por F. SANGER et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74,(1977) 5463-5467).

Análise das proteínas

Sedimentos de células tendo uma densidade óptica de 1 unidade a 630 nm (1 foram obtidos em diferentes etapas durante a fermentação de estirpes portadoras dos plasmideos de expressão da proapo A-I humana, pULB9291, pULB9292, pULB9296 e pULB9299 (transformados respectivamente nas estirpes AR58 e JM101 de E, coli e na estirpe 10544C de levedura). Cada uma das amostras foi resuspensa num tampao 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, contendo 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS), ureia 6 Μ, 10Z de glicerol e 5% de 2-mercapto^ etanol e foi levada à ebulição durante 3 minutos. As amostras foram submetidas a uma electroforese em géis de poliacrilamida (U.K. LAEMMLI, Nature 227, (1970), 680-685). As proteinas to-22-

tais foram visualizadas por coloraçao com azul Coomassie e a proapo A-I humana sintetizada foi identificada por reconhecimento imunológico após transferencia electroforetica (ver A. BOLLEN et al., loc. cit.).

Construção de vectores recombinantes para a expressão da proapo A-I humana em bactéria, levedura e células de insectos infectadas por baculovirus

1. Clone de cDNA para a preproapo A-I humana:pULB1609 (figura 1).

Várias centenas de transformantes, provenientes da clonagem do ds cDNA, correspondente ao RNA poli A de figado humano, no sitio PstI do pBR322, foram testados por meio da sonda sintética apo A-I de 22-meros descrita abaixo. Um dos clones dá um sinal intenso de hibridaçao no decurso da experiência. Este clone designado pULB16O9, foi isolado e a inserção de DNA presente no plasmídeo recombinante foi caracterizada por analise da sequência do DNA. 0 seu comprimento corresponde a 878 pares de base (pb); ele codifica o polipeptideo preproapo A-I completo. Como se mostra na figura 1, o fragmento de cDNA clonado possui regiões nao codificadoras em 5’ e em 3' (19 pb e 55 pb respectivamente), a sequência de 54 pb codificadora do peptídeo precursor (aa-24 até aa-7), a sequência de 18 pb codificando o propeptideo (aa-6 até aa-1) e a sequência de 732 pb codificando a apo A-I madura (aal até aa243) e compreendendo o codao de terminação da traduçao. A sequência da proteína deduzida da sequência de DNA corresponde perfeitamente bem à sequência de aminoácidos

encontrada para a preproapo A-I a partir da proteína e a partir de clones de cDNA isolados independentemente (W.C. BARKER et al. , Comp. Biochem. Physiol. 57B, (1977), 309-315; pedido de patente Japonesa N² 96998/86; P. CHEUNG e L. CHAN, loc.cit. e J.J. SEILHAMER et al.. loc. cit.).

2. Construção de um vector de expressão bacteriano contendo a sequência do cDNA da proapo A-I humana; pULB9291 (figuras 2 e 3).

pULB9291, um plasmideo produtor da proapo A-I humana, foi construído colocando um segmento proveniente do clone pULBl609 atrás do promotor regulável P^ lambda (figura 3). A construção deste plasmideo de expressão requer a sintese de fragmentos de DNA compreendendo um sitio de restrição Ncol, um codão ATG de iniciaçao da traduçao e a sequência de nucleotideos codificadora dos aminoácidos da extremidade aminada do gene estrutural da proapo A-I humana, até ao primeiro sitio único de restrição, Bali (figura 2).

Este adaptador foi sintetizado por processos químicos (N.D. SINHA et al., loc. cit.). Prepara-se quatro oligonucleotideos sintéticos; apos terem sido hibridados, eles codificam a metionina correspondente ao codão ATG de iniciaçao da traduçao para os 6 aminoácidos correspondentes ao propeptideo e para os 14 primeiros aminoácidos da apo A-I humana madura (figura 2). 0 adaptador sintético foi concebido para minimizar a formaçao de estruturas secundárias no extremo 5' do gene. Para fazer isto, os codoes seleccionados para codificar os resíduos de aminoácidos -6, -1, 1, 3,

4, 5, 6, 7, 10, 11 e 14 nao correspondem aos codoes naturais que se observa no cDNA do clone pULB16O9.

adaptador sintético aqui descrito foi utilizado para reunir um fragmento de DNA de 744 pb, proveniente de pULBl6O9, ao promotor lambda no plasmideo de expressão pULB1221.

A construção do vector de expressão pULB1221 está descrita no pedido de patente europeia 186643. Ela inclui três etapas principais partindo do plasmideo pCQV2 está descrito por C. Queen em J. Mol. Appl. Genet. 2. (1983) 1-10 e está livremente acessível.

A escolha deste vector particular nao é obrigatória: pode-se utilizar qualquer outro vector que possua um promotor e à frente deste um sitio Ncol adequado. Cerca de 01 jig dos fragmentos sintéticos, tal como aqui descrji tos, sao ligados por meio de DNA-ligase de T4, a cerca de 1 jig do fragmento BalI-PstI de 744 pb, proveniente de pULB1609 e a cerca de 1 jag do vector plasmideo pULB1221 cortado com Ncol e Bali.

Antes de realizar a ligaçao, o fragmento BalI-PstI de 744 pb foi tratado pela DNA-polimerase de T4 de modo a transformar as extremidades protuberantes em 3' em extremidades cegas. 0 processo é bem conhecido dos especialistas na matéria e está descrito detalhadamente por T. MANIATIS et al. , loc. cit..

Após terem sido amplificados nas células competentes da estirpe AR58 de E. coli, os plasmídeos reconstruídos foram caracterizados por análise dos sitios de

restrição e por sequênciaçao do DNA dos fragmentos sintéticos e dos sítios de junção. Um plasmídeo recombinante, pULB9291, satisfaz todos os critérios porque possui os fragmentos na orientação e ordem correctas; ele foi usado para estirpes de expressão.

3. Construção de um vector de expressão bacteriano contendo as sequências fundidas correspondentes à beta-galactosidase e à proapo A-I humana : pULB9296 (figura 4).

Nesta construção, a sequência de DNA codificadora da proapo A-I humana, foi fundida na fase de lejL tura correcta â frente da sequência de DNA da beta-galactosidase. 0 gene da beta-galactosidase está presente no plasmídeo de expressão E. coli pUR288, livremente acessível (U. RUTHER e B. MULLER-HILL, EMBO J. 2 (1983), 1791-1794), que possui um promotor lac eficazmente indutivel e sítios de restrição aprq priados na sequência da beta-galactosidase. 0 plasmídeo recom binante adequado foi construído como se mostra na figura 4.

Em primeiro lugar, o DNA do plasmideo pUR288 foi, sucessivamente, cortado com BamHI, tratado com DNA-polimerase de T4 e novamente cortado com Sali. Em segundo lugar, um fragmento de DNA de 805 pb foi isolado de pULB9291 sucessivamente por digestão com Kpnl, tratamento por DNA-polimerase de T4 e finalmente digestão com Sali. Os dois fragmentos foram ligados um ao outro, em proporçoes molares, por meio de DNA ligase de T4 e o plasmideo obtido foi usado para transformar as células competentes da estirpe JM101 de E. coli, uma estirpe larga e livremente acessível (ATCC N- 33876). Os transformantes foram verificados por análise de restrição quanto à orientação correcta da sequência da proapo A-I humana relativamente ao gene

-26da beta-galactosidase e quanto à presença de um sitio BamHI reconstituído na junção das duas sequências. Isto indica que a sequência da proapo A-I humana esta bem fundida a seguir a sequência de DNA da beta-galactosidase e na fase de leitura correcta. Um dos transformantes, contendo o plasmídeo pULB9296 satisfaz todos os critérios e foi utilizada nos ensaios de expressão.

4. Construção de um plasmídeo de expressão de levedura portador da sequência de cDNA da proapo A-I humana : pULB9299 (figura 5).

Nesta construção, a sequência de cDNA codificadora da proapo A-I humana foi clonada entre os sinais do promotor e do terminador transportados por um plasmideo de expressão de levedura. 0 vector de expressão de leve, dura pRIT 10774 foi o escolhido para esta experiência. A cons truçao do plasmideo de expressão pRIT 10774 está descrito no pedido de Patente Europeia 151 102. Constroi-se, por um lado, a partir do plasmideo pRIT 10749 depositado na ATCC com o número de acesso 39133 de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, e por outro lado, a partir do vector vai-vem YEpl3 para E. coli - S. cerevisiae, descrito por J.R. BROACH et al. , em Gene, 8. (1979), 121-133 e que está acessível na ATCC com o número de acesso 37115. 0 vector pRIT 10774 pode replicar-se ao mesmo tempo em E. coli e em levedura e possui o promotor e o terminador da transcrição da ornitina carbamoil transferase (ARG3) separados por um sitio único de restrição BamHI conveniente para a inserção de um DNA estranho possuidor do seu proprio codao ATG de iniciaçao da traduçao. Por outro lado, o vector possui as sequências 2 p da levedura, marcas metabólicas para a selecção na levedura e a marca de selecção AmpA para fazer o transporte de vaivém em E. coli.

Nao é o único vector que pode ser utilizado para a expressão da proapo humana nas leveduras: qualquer outro vector para levedura portador de sinais de regulaçao pode ser utilizado e conduzirá a resultados qualitativamente semelhantes. A cons truçao ilustrada na figura 5 realiza-se como se segue. 0 DNA do plasmídeo pRIT 10774 é linearizado por meio da enzima BamHl e é tratado pela DNA polimerase de T4.

Por outro lado, um fragmento de DNA de 810 pb foi isolado de pULB9291 por digestão com as enzimas Asp718 e Sali, seguido do tratamento com DNA-polimerase de T4. Este fragmento codifica a proapo A-I humana e possui o codao ATG de iniciaçao da traduçao. Os dois fragmentos obtidos como descrito acima, sao ligados um ao outro, em proporçoes equimolares, por meio da DNA-ligase de T4 e a mistura utilizada para transformar as células competentes de E. coli MM294. Os transformantes foram controlados por análise de restrição para verificar a orientação correcta da sequência de DNA da pro. apo A-I relativamente â sequência do promotor de ARG3. Um dos transformantes contem um plasmídeo recombinante, pULB9299, que satisfaz esta condição. 0 plasmideo pULB9299 foi amplificado em E. coli e foi utilizado para transformar esferoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae, estirpe 10S44c (pep4-3, leu2-3, leu2-112);(T. CABEZON et al., loc. cit.).

emprego da estirpe Ic 1679d (ATCC N^s 20631) conduzirá a resultados qualitativamente semelhantes. Os transformantes de levedura foram em seguida testados quanto à expressão da proapo A-I humana.

5. Construção de um vector bacteriano de secreção contendo a sequência do cDNA da proapo A-I humana: pNIV1612 (figuras 6A, B e C).

Nesta construção, a sequência de DNA codificadora da proapo A-I humana foi fundida, na fase de leitura correcta, a frente da sequência de DNA do peptídeo sinal da proteina OmpA de E. coli. 0 vector de secreção pIN-III-OmpA-2 (J. GHRAYEB et al., EMBOJ. 3,(1984), 2437-2442) foi escolhido para este ensaio. Este vector e a sua estirpe hospedeira E. coli JA221 estão acessíveis quando pedidos ao Department of Biochemistry of the State University of New York, em Stony Brook.

vector de secreção possui um forte promotor lpp (lipoproteina), um fragmento do promotor-operador lac, a sequência lacl do repressor lac e sitios de restrição adequados situados imediatamente a seguir à sequência codificadora do peptideo sinal do gene ompA. 0 plasmídeo recombinante adequado foi construído como se mostra nas figuras 6A, B e C. Em primeiro lugar o vector de secreção pIN-III-ompA-2 foi linearizado com EcoRI e tratado com a DNA polimerase de T4. Em segundo lugar, um fragmento de DNA de 805 pb foi excisado de pULB9291 por digestão, sucessivamente com as enzimas de restrição Kpnl e SalI, seguido de tratamento com DNA-polimerase de T4. Este fragmento codifica a proapo A-I humana e contem o codão ATG de iniciaçao da traduçao. Os dois fragmentos obtidos como descrito atrás, foram ligados um ao outro, em proporçoes equimolares, por meio de DNA-ligase de T4 e a mistura foi usada para transformar as células competeii tes da estirpe JA221 de E.coli cultivadas em meio M9 (J.H. MILLER, em Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972, p.431) contendo 20 mg/1 de triptofano, 20 mg/1 de leucina, 2 g/1 de

lactose e 50mg/l de ampicilina. Os transformantes foram seleç. cionados quanto à sua resistência a ampicilina e testados com um oligonucleotideo sintético de 18-meros (o mesmo utilizado na sintese do adaptador como mostrado na figura 2).

Os transformantes seleccionados foram controlados por análise de restrição para verificar a orç entaçao correcta da sequência de DNA da proapo A-I relativamente à sequência do peptideo sinal transportado pelo vector de secreção (sitio EcoRI reconstituído pela junção das duas sequências). Um dos transformantes possui um plasmideo recombinante que satisfaz esta condição. A sequência excedentária proveniente da construção com o adaptador sublinhada na sequêç cia nucleotidica seguinte,

5’ GTA GCG GAG GCC GCT GAA TIC ATG AGA CAT TIC TGG 3'

Vai Ala Gin Ala Ala Glu Fen Met Arg His Fen Trp ^aa-6 foi eliminada por mutagénese dirigida. Com esta finalidade sintetizou-se o oligonucleotideo de 24-meros seguinte peptideo sinal---> ζ---proapo A-I

5' GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3'

Vai Ala Glu Ala Arg His Fen Trp

desprovido das 12 bases excedentárias e utilizou-se para eliminar a sequência excedentária de 12 bases proveniente do ada_p tador.

Para a mutagénese, utiliza-se o sistema da Amersham. Este sistema baseia-se no método de F. ECKSTEIN et al. , (Nucleic Acids Res. 13, (1985), 8765-8785). 0 método dá um elevado rendimento em placas e a eficácia e a mais elevada de que se dispõe: ate 957.

Em primeiro lugar, a região do DNA antes de ser mutagenizada é cionada num vector M13. Para este efeito, o fragmento de DNA xbal-BalI do plasmídeo recombinante pIN-III-ompA -2 possuindo o gene da proapo A-I foi inserido no vector M13mpl9 cortado com Xbal e HindIII. 0 vector M13mpl9 está disponível no comércio; pode-se procura-lo na Amersham (Buckinghamshire, Gra-Bretanha). Em seguida o oligonucleotideo de 24-meros mutagéneo é hibridado com a matriz monocatenária e alongado com o fragmento Klenow da DNA-polimerase em presença da DNA-ligase de T4, para produzir um mutante heteroduplex.

A eliminação selectiva da cadeia nao mutante foi tornada possível pela incorporação de um tionucleq tideo na cadeia mutante durante a sintese in vitro e clivagem por Ncil da cadeia nao fosforotionada. Tais clivagens apresentam sitios para a exonuclease III que digere a cadeia nao mutante. A cadeia mutante foi então utilizada como matriz para reconstruir a molécula circular de cadeia dupla, criando assim uma molécula mutante homoduplex. A mutagenese foi verificada por sequenciação da junção entre o peptideo sinal e o começo do gene da proapo A-I. 0 plasmideo recombinante pINV1612, foi reconstruído ligando o fragmento Xbal-HindIII do vector pIN-31-

-III-ompA-2 com o fragmento Xbal-Ball, a que foi retirado as 12 bases excedentárias, e com o fragmento BalI-HindIII do gene da proapo A-I.

Os três fragmentos foram ligados por meio da DNA ligase de T4 e a mistura utilizada para transformar as células competentes de E. coli JA221, como descrito mais à frente. Os transformantes foram seleccionados pela sua resistência à ampicilina e detectados com o oligonucleotideo de 18-meros atrás referido. Um dos transformantes possui um plasmídeo recombinante pNIV1612. Na construção final, a sequên_ cia codificadora do peptídeo sinal de ompA precede a sequência completa da proapo A-I sem o codao ATG (figuras 6A, B e C).

Os transformantes de E. coli sao em seguida testados quanto a expressão da proapo A-I humana.

6. Construção de um vector de transferência para a introdução da sequência do cDNA da proapo A-I humana em baculovirus: pNIV1613 (figura 7).

plasmídeo pNIV1613, portador da sequência de DNA da proapo A-I humana, foi construído colocando um segmento proveniente do clone pULB9291, á frente do promotor do gene da poliedrina do baculovirus (figura 7). Nestes ensaios, utilizou-se o vector de transferencia pAcRPó do Baculovirus (Y. MATSUURA et al., J. Gen. Virol. 67 (1986), 1515-1529); ele pode ser obtido no Department of Microbiology and Immunology da Universidade de Ottawa. 0 plasmideo possui o promotor do gene da poliedrina até ao nucleotideo -7 na sequên_ cia condutora em 5'; falta-lhe o codao ATG da poliedrina e os 170 primeiros nucleotideos da sequência codificadora da poliedrina. Á frente do nucleotideo -7 esta situado um sitio BamHI. A construção ilustrada na figura 7 foi realizada como se segue. 0 DNA do plasmideo pAcRPó foi linearizado por meio de BamHI. Entretanto um fragmento de DNA de 810pb foi excisado de pULB9291 por digestão com as enzimas de restrição Asp718 e Sall. Este fragmento codifica a proapo A-I humana e contem o codao ATG de iniciaçao da traduçao. Os dois fragmentos, em proporçoes equimolares, foram tratados em conjunto com o DNA polimerase de T4, ligados por meio de DNA-ligase de T4 e utilizados para transformar as células competentes da estirpe AR58 de E. coli. Os transformantes foram seleccionados pela sua resistência à ampicilina, detectados por meio de um oligo, 32 nucleotideo sintético 35-meros marcado com P (ver a figura 2) correspondendo a uma parte da sequência de DNA da proapo A-I e controlados por análise de restrição para verificar a orientação correcta da sequência do DNA da proapo A-I humana relativamente ao promotor do gene da poliedrina. Um dos transformantes possui um plasmideo recombinante pNIV1613, que satisfez esta condição; ele foi utilizado em ensaios de expressão .

7. Produção da proapo A-I humana pelos microorganismos trans formados.

Culturas de 20 ml da estirpe AR58 ou JM101 de E. coli transformadas respectivamente por pULB9291 e por pULB9296, foram cultivadas em meio rico suplementado com 50jig/ml de ampicilina (caldo de cultura LB, ver T. MANIATIS et al., loc. cit. para detalhes experimentais) até a densidade óptica atingir 0,6 a 630nm. No caso de pULB9291, a indução do promotor P^ lambda realiza-se levando as condiçoes iniciais

de crescimento da cultura de 30°C para 42°C, de maneira a inaç_ tivar o repressor do promotor lambda (M. ROSENBERG et al., Methods Enzymol. 101 (1983), 123-138). A indução prossegue durante 20 minutos.

No caso de pULB9296, a indução do pr£ motor lac foi realizada adicionando à cultura, incubada a 37°C, o indutor quimico IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido) até atingir uma concentração final de lmM (R. LORENZETTI et al., loc. cit.). A indução prosseguiu durante 60 minutos.

Por outro lado, as culturas de 20 ml de células de levedura 10S44c, transformadas pelo pULB9299, foram cultivadas a 30°C em meio de base azotada para levedura (Difco) suplementado com glucose (1%) até a densidade óptica atingir 0,3 a 630 nm. Nao é necessário nenhum indutor pois neste caso particular a expressão é constitutiva.

Retiram-se amostras de 1 ml das culturas atrás referidas e centrifugam-se a 15 000 g durante 5 minutos. 0s sedimentos obtidos como se segue em dodecilsulfato de sódio (SDS) fervente. Os sedimentos foram ressuspensos em 50 pl de tampao de amostra contendo SDS (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% de SDS, ureia 6M, 5% de 2-mercaptoetanol e 10% de glicerol) e aquecidos a ebulição durante 3 minutos a 100°C. Os extractos foram em seguida centrifugados a 15 ooo g durante 10 minutos. As amostras ficaram assim prontas para análise por electroforese em géis de 15% ou 7,5% de poliacr ilamida, em prt? sença de SDS, em condiçoes desnaturantes (U.K. LAEMMLI, loc. cit.) .

Depois da electroforese os géis de poliacrilamida foram brevemente lavados com 40 ml de agua dejs tilada e com 40 ml de tampao fosfato de sódio 50 mM a pH 7,5. As proteínas foram em seguida transferidas electricamente dos géis para folhas de nitrocelulose durante 2 horas a 60V e 1,5A no mesmo tampao fosfato (T: CABEZON et al., loc. cit.). As folhas de nitrocelulose foram saturadas com albumina (1%) em 50 mM de tampão fosfato de sódio a pH 7,5, depois foram incubadas à temperatura ambiente durante uma noite em presença de soro de coelho anti-apo A-I humana a uma diluição de 1/500 (e anticorpos monoclonais de ratinho anti-beta-galactosidase no caso de pULB9296) no mesmo tampao sem albumina.

As folhas sao lavadas 5 vezes com 40 ml do mesmo tampao fosfato e sao em seguida incubadas em 40 ml de tampao fosfato contendo 10|ig/ml de soro de cabra antianticorpos de coelho (ou anti-anticorpos de ratinho) e marcado com peroxidase. Após 4 horas de incubaçao a temperatura ambiente, as folhas sao novamente lavadas 5 vezes em 40 ml de tampao fosfato e sao finalmente reveladas pela adiçao de 50 ml de uma solução de um substracto cromogénico (10 mg de diaminobenzidina, 100 pl de peróxido de ureia a 10% e 100 mM de Tris-HCl a pH 7,6).

No caso de pULB9291 e de pULB9299, encontrou-se um único produto que reagiu com os anticorpos anti-apo A-I humana. Ele possui um peso molecular que está de acordo com o padrao da apo A-I natural. No caso de pULB9296, encontrou-se na dimensão prevista para a soma dos polipeptideos beta-galactosidase e proapo A-I (144 KDa), um polipeptideo de fusão que reage com o soro anti-apo A-I humana e com o soro anti-beta-galactosidase. Estas dimensões foram determinadas previamente através de uma curva de calibraçao basea_ da na migraçao de pesos moleculares padrões colocados nos mes mos géis dos extractos celulares.

Numa outra experiência, culturas de 20 ml da estirpe JA 221 de E. coli transformada por pNIV16l2 foram cultivadas em meio rico suplementado com 50 yig/ml de am picilina (caldo de cultura LB, ver T. MANIATIS et al. , loc. cit.) até a densidade óptica atingir 0,6 a 630 nm. A indução do promotor lac foi efectuada adicionando à cultura, incubada a 37°C, o indutor quimico IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido) atá à concentração final de 2mM. A indução prosseguiu durante 60 minutos. Retirou-se amostras de 1 ml destas culturas e centrifugou-se a 15 000 g durante 5 minutos. Os sedimentos obtidos foram submetidos a um choque osmotico ligeiro para libertar a fracçao periplasmática (D. KOSHLAND e D. BOTSTEIN, Cell 20, (1980), 749-760). A fracçao libertada foi suspensa no tampao de amostra contendo SDS referido atrás, mas despr£ vido de ureia, levada à ebulição, centrifugada e submetida a uma electroforese em gel de 12,5% de poliacrilamida em presença de SDS, seguido de imunodetecçao apos transferencia electrq foretica. Uma fracçao da proapo A-I sintetizada encontra-se na célula e nao no periplasma. Isto é devido quer ao facto da proapo A-I nao ser secretada quer à eficácia do choque osmótico nao ser óptima. A fracçao principal da proapo A-I encontra-se livre no meio após o choque osmótico indicando assim que a proteina é secretada pelas células.

8. Produção da proapo A-I humana pelas células de insectos infectadas por baculovírus plasmideo recombinante pNIVl6l3 foi utilizado conjuntamente com a estirpe selvagem de baculovirus para coinfectar células de Spodoptora frugiperda em cultura.

A mistura dos virus recombinantes desprovidos de poliedrina

fornece placas recombinantes. 0 virus recombinante, purificado a partir de uma placa foi utilizado para infectar células de insectos. 0 processo é bem conhecido e está descrito detalhadamente por M. D. SUMMERS e G. E. SMITH em Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect cell culture Procedures, Texas University, College Station, (1987). 0 virus recombinante foi testado quanto a produção de proapo A-I imunológicamente após transferencia electroforetica e por electro forese em gel de 12,5% de poliacrilamida em presença de SDS, após lise das células com tampao RIPA / 0,05 M de tampao Tris-HC1, pH 7,2, contendo 0,15M de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,1% de desoxicolato de sódio e lmM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)7 e tratamento com SDS fervente. Apenas um único produto reagiu com os anticorpos anti-apo A-I humana. Ele possui um peso molecular que esta de acordo com o do padrao de apo A-I natural e a proteina expressa representa o principal constituinte das proteinas totais. A concentração em proapo A-I por litro de cultura, medido por imunodifusao radial simples (G. MANCINI et al. , Immunochem. 2., (1965), 239-254) foi calculada em cerca de 100 mg.

9. Produção citoplásmica da proapo A-I humana em E. coli. Utilização de um meio minimo definido.

plasmídeo pULB9292 foi utilizado para a produção citoplasmatica de proapo A-I humana por E.coli num meio mínimo. pULB9292 foi construído trocando o fra£ mento EcoRI-Ncol do plasmídeo pULB9291, codificando o promotor P^ lambda, pelo mesmo fragmento EcoRI-Ncol do plasmídeo pOTS (M. ROSENBERG et al. , Methods Enzymol. 101, (1983), 123-37-

-138). 0 fragmento EcoRI-Ncol do vector pOTS (G.DEVARE et al., Cell 36 (1984), 43-49) contem também o promotor , eficaz e regulável, do fago lambda. Fez-se crescer em meio minimo definido culturas de 20 ml da estirpe AR58 de E. coli transformada com pULB9292. A composição do meio minimo é (por litro): 3g de Na₂HP0₄.2H₂0, 3g de KH₂P0_4> 0,5g de NaCl, lg de NH^Cl, 1,37 mM de MgS0₄.7H₂0, 29,5 pM de FeCl₃.6H₂0, 236 jiM de MnS0₄· .H₂0, lOg de glucose, 1 mg de vitamina BI, 50 mg de ampicilina, caldo de cultura LB 1/20 (v/v). As células sao cultivadas neste meio minimo até a densidade optica atingir 0,5 a 630nm.

A indução do promotor P^ lambda foi efectuada levando as condições iniciais de crescimento da cultura de 30°C para 42°C, de maneira a inactivar o repressor do promotor P^ lambda (M. ROSENBERG et al., loc. cit.). A indução prosseguiu durante 60 minutos. Retirou-se amostras de 1 ml das culturas e fizeram-se passar na prensa de French ou centrifugaram-se a 15 000 g durante 5 minutos. 0 extracto celular total obtido ou o sedjL mento foram tratados com SDS em ebulição como descrito no para, grafo 7. Após electroforese e transferencia electroforetica, encontrou-se um unico produto que reagiu com os anticorpos anti-apo A-I humana. Ele possui um peso molecular que está de acordo com o de uma amostra de apo A-I natural. A taxa de prq apolipoproteina A-I expressa no meio minimo definido represen. ta 13,5% das proteínas totais, ou seja uma concentração calculada de proapo A-I de cerca de 270 mg por litro de cultura.

10. Isolamento, purificação e caracterizaçao da proapo A-I humana produzida pelos microorganismos transformados.

10.1 Isolamento e purificação

Centrifuga-se os extractos brutos da

proapo A-I recombinante a 4 000 g durante 15 minutos e regeita-se o sedimento. Centrifuga-se o sobrenadante a 100 000 g durante duas horas. Ressuspende-se o sedimento obtido num volume mínimo de um tampao (TEN 100) composto por 20mM de Tris-HC1, pH 7,5; lmM de EDTA, lOOmM NaCl; 1,75 jig/ml de PMSF e 100 pg/ml de mertiolato de sódio (sal de sódio do ácido etilmercuri-tiossalicilico) e os volumes da suspensão e do sobrenadante sao ajustados separadamente ao volume inicial do extracto recorrendo ao mesmo tampao. Em seguida, a proteína é precipitada a partir das duas suspensões utilizando concentrações crescentes de álcool isopropilico. Determina-se por imunodifusao radial (G. MANCINI et al., loc.cit.), utilizando um padrao comercial de apo A-I, a fracçao de proteína precipitada de cada suspensão que contem a maior parte da imuno-reactividade correspondente a apo A-I humana. Cada uma das fracçoes assim obtida é pósteriormente purificada por cromatografia numa coluna de Sephacryl S200, utilizando o mesmo tampao como eluente. Recolhe-se as fracções de 0,9 ml e determina-se por imunodifusao radial, em cada uma das fracções, a quantidade de proteína total tendo uma imunoreactividade correspon dente à apo A-I. 0 peso molecular da proteína eluida nas fra£ çoes é determinada por calibraçao da coluna com padrões de pesos moleculares conhecidos como sejam a aldolase, a albumina do soro bovina, a ovalbumina, o quimotripsinogénio e o citocrómio C, em condiçoes idênticas. A pureza da proapo A-I por mg de proteína total nas fracções principais contendo a proapo A-I recombinante, expressa em mg de proteína tendo a mesma imuno-reactividade que um padrao comercial de apo A-I, foi calculada em 95%.

10.2. Caracterizaçao

10.2.1. Propriedades físicas da proapo A-I recombinante

Quando se submete a proapo A-I recom binante purificado e isolada a partir do sobrenadante e do sedimento da centrifugação a 100 000 xg, a uma focagem isoelectrica de acordo com o processo de N. CATSIMPOOLAS (Anal. Biochem. 26, (1969), 54-62) e aplicando um gradiente de pH 4 a pH 6, obteve-se uma unica banda tendo um ponto isoelectrico calculado em 4,95. A apo A-I plasmatica humana apareceu ligeiramente mais acida com um ponto isoelectrico de 4,75. Esta diferen. ça de 0,2 unidades de pH entre os valores dos pontos isoelectricos da proapo A-I recombinante e da apo A-I plasmática está de acordo com a diferença conhecida entre os valores dos pontos isoelectricos da apo A-I plasmática e da proapo A-I plasmatica, que foi divulgada como sendo igual a 0,17 (GL. MILLS et al., Lab. Tech. Biochem. Mol. Biol. 14 (1984), 244-245).

No que respeita ao peso molecular, as proapo A-I recombinantes do sedimento e do sobrenadante consistem em duas numa cadeia polipeptidica única tendo pesos moleculares idênticos iguais a 29,9 I 1,4 Kda. A apo A-I plasmatjl ca humana aparece ligeiramente mais pequena, tendo um peso molecular igual a 29,3- 1,3 Kda.

10.2.2. Determinação de uma carta de peptideos da proapo A-I recombinante por meio de BNPS-scatole.

A clivagem química foi efectuada por meio de 3-bromo-3-metil-2-/ (2-nitrofenil)tio7-3H-indolo (BNPS-scatole) de acordo com o proces. so de A. FONTAWA (Methods Enzymol. 25,(1972), 419-423). Dissolveu-se 5 a 10 jig das preparações de proteína purificada em 100 yil de uma solução a 0,15% (v/v) de fenol numa solução aquosa a 50% (v/v) de ácido acético. Em seguida, adicionou-se 50 jil de uma solução de 4,8 mg de BNPSscatole por ml de ácido acético glacial e incubou-se a 25°C durante 72 horas. Em seguida, adicionou-se 50 jil de 2-mercaptoetanol e incubou-se uma segunda vez durante 5 horas a 37°C. As amostras foram evaporadas, redissolvidas em 100 jil de água e extraídas 3 vezes com 200 pl de acetato de etilo. As fases orgânicas foram rejeitadas e as fases aquosas liofilizadas e analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

No caso de uma clivagem quimica pelo BNPS-scatole,o número e a dimensão dos fragmentos provenientes da Apo A-I podem ser mais ou menos previstos sabenso-se que, nas condiçoes experimentais usadas o BNPS-scatole corta selectivamente nos residuos de triptofano. Supondo uma eficácia de 100% em cada sitio de clivagem, o fragmento maior que se poderá esperar é um fragmento C-terminal de 15,4 Kda. Os pesos moleculares dos restantes fragmentos está compreendidos entre 0,5 e 5,3 Kda e sao consequentemen-41-

te muito pequenos para serem detectados.

No caso de uma clivagem incompleta, o fragmento de 15,4 KDa será alongado na direcçao da extremidade N-terminal, formando frag. mentos de 20,7 KDa, 23,1 KDa e 27,6 KDa respectivamente. Estas previsões verificaram-se para a apo A-I plasmática humana e para as diferentes preparações purificadas de proapo A-I recombinante.

I^a. - Processo para a preparaçao de uma sequência de DNA recombinante que codifica a proapolipoproteina A-I humana, caracterizado por se ligar a sequência natural, que codifica uma parte da proapolipoproteina A-I humana, a um fragmento de DNA codificador dos aminoácidos da par_ te restante consistindo este fragmento de DNA numa sequência de nucleotideos diferentes, da sequência codificadora natural, de maneira a reduzir ou evitar a formaçao de estruturas em alfinete.

Claims (14)

1. 2-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fragmento de DNA codificador dos aminoácidos da parte restante da proapolipoproteina A-I consistir na sequência (indicada uma única cadeia):

   5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3’ sendo a referida sequência codificadora dos aminoácidos -6 a +14 e compreendendo um codao suplementar ATG de iniciaçao da traduçao assim como codoes modificados para os residuos de aminoácidos -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11, e +14.
2. 3^â. - Processo para a preparaçao de um vector de clonagem replicável, caracterizado por se in-43- cluir uma sequência de DNA recombinante, preparada de acordo com o processo da reivindicação 1 ou 2, num vector adequado.
3. 4^a. - Processo para a preparaçao de um vector de expressão caracterizado por se ligar de modo operacional uma sequência de DNA recombinante, preparada de acordo com o processo da reivindicação 1 ou 2 e delimitada por sinais de iniciaçao e de terminação da traduçao, a uma sequên. cia de DNA reguladora.
4. 5^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de DNA reguladora compreender a região do promotor P_T do fago lambda.
5. 6^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de DNA da proapolipoproteina A-I humana ser fundida a jusante da sequência de DNA da beta-galactosidase e por a sequência de DNA reguladora compreender a região do promotor lac.
6. 7^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de DNA reguladora compreender as regiões do promotor e do terminador da transcrição do ARG3 da levedura.
7. 8^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de DNA da proapolipoproteina A-I humana desprovida do codao ATG ser fundida a jusante da sequência de DNA do peptideo sinal da proteína OmpA de E. coli e por a sequência de DNA reguladora compre ender as regiões do promotor Ipp e do promotor-operador lac.
8. 9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de DNA reguladora compreender a região do promotor do gene da poliedrina de baculovirus.
9. 10^a. - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado por se preparar um plasmideo recombinante escolhido do grupo constituído por pULB9291, _PULB9292, _PULB9296, _PULB9299, _PNIV1612 e pNIV1613.
10. 11^a. - Processo para a preparaçao de uma célula ou de um microorganismo, caracterizado por se transformar uma célula ou um microorganismo com um vector de expressão preparado de acordo com um processo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9.
11. 12^a. - Processo para a preparaçao de uma célula ou de um microorganismo, caracterizado por se

    -45transformar uma célula ou um microorganismo com um plasmideo recombinante preparado pelo processo da reivindicação 10.
12. 13^a. - Cultura de células ou micro organismo caracterizadas por terem sido transformados com um vector de expressão preparado de acordo com um processo tal como definido numa qualquer uma das reivindicações 4 a 9.
13. 14^a. - Cultura de células ou micro organismo caracterizados por terem sido transformados com um plasmideo recombinante preparado de acordo com a reivindicação 10.
14. 15^a. - Processo para a produção da proapolipoproteina A-I humana, caracterizado por se cultivar em condiçoes de cultura adequadas numa célula ou um microorga nismo transformado de acordo com a reivindicação 13 ou 14 e por se recuperar a proapolipoproteina A-I humana assim produzida .