PT87614B - Processo para a deteccao da predisposicao para retinoblastoma e metodo para a deteccao de um gene de retinoblastoma em tumores utilizando uma sonda de gene de retinoblastoma - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se ao âmbito de diagnóstico da propensão para o retinoblastoma utilizando um gene sonda do retinoblastoma.

A presente invenção também se refere ao âmbito dos genes sonda do retinoblastoma e â sua utilização para detectar tumores com um gene defeituoso do retinoblastoma. São exemplo: destes tumores, o osteossarcoma, o fibrossarcoma, o sarcoma de tecido mole, o carcinoma de células pequenas, o melanoma e tumores da mama.

Antecedentes da Invenção gene do retinoblastoma ê o protótipo de uma classe de genes de cancro humano recessivos os quais, se pensa estar associada com a tumorogenese a perda de actividade de ambos os alelos normais. 0 retinoblastoma (Rb) surge sob ambas as for mas, hereditária e não hereditária e, e o cancro que atinge os olhos mais comum na criança. Os casos esporádicos bilaterais são sempre hereditários, enquanto que aproximadamente 85% dos casos esporádicos unilaterais não são hereditários. Com base na análise estatística de dados clínicos, pensou-se que para o desenvolvimento do retinoblastoma eram necessários dois fe-

nómenos de mutação. Nos casos hereditários onde está presente a mutação da linha germinativa em todas as células, postulou-se ser necessário para tumorogenese uma mutação somática secundária ao acaso num retinoblastoma alvo.

A indicação inicial da natureza do primeiro fenómeno de mutação surge a partir de estudos citogenéticos de linfócitos ou fibroblastos de pacientes com retinoblastoma. Descobriu-se que um pequeno subgrupo destes pacientes possuia uma delecção que envolvia a região cromossómica 13ql4. Os dados citogênicos iniciais do tumor também implicaram o cromossoma 13 como o alvo para o segundo fenómeno mutacional. Verifica-se, frequentemente, a perda ou eliminação do cromossoma 13,in eluindo 13ql4 em retinoblastomas de pacientes com dois cromossoma 13 aparentemente de constituição normal.

Uma evidência adicional de que o segundo fenómeno tembem envolve o locus de susceptibilidade do Rb na região 13ql4, surgiu a partir de estudos de polimorfismo do comprimento do fragmento de restricção (PCFR).

Pela comparação dos genótipos de constituição normal e dos genótipos de tumor, conforme definido por PCFRs no cromossoma 13, demonstrou-se que a redução para hemizigotia ou homozigotia para todos ou parte dos alelos do cromossoma 13 e uma consequência normal no desenvolvimento do retinoblastoma. De modo semelhante, no osteossarcoma, um tumor ósseo que surge frequentemente como uma malignidade primaria adicional em pacien tes com retinoblastoma hereditário, observou-se o desenvolvimen to de homozogotia e hemizigotia, no cromossoma 13. Todos os dados disponíveis sugerem que a perda de actividade de ambos os alelos normais no locus do Rb e o factor chave no desenvolvimento do tumor. Contudo, não foi possível ate agora provar es

-3ta hipótese com segurança e utilizar este conhecimento para detectar tumores que possuem um gene defeituoso de Rb e determinar a propensão para o desenvolvimento do retinoblastoma.

Resumo da Invenção

Um dos objectivos da presente invenção Ó um método para detectar a propensão para o retinoblastoma.

Um objectivo adicional da presente invenção é um método para a detecçao de tumores com um defeito no gene do retinoblajs toma.

Um outro objectivo da presente invenção é o desenvolvimento de um conjunto para a detecçao de uma propensão para desenvolver o retinoblastoma.

Um objectivo adicional da presente invenção é o desenvolvimento de um clone de cADN e sondas.

Assim, como complemento dos objectivos precedentes for nece-se, de acordo com um aspecto da presente invenção, um método para detectar a predisposição para desenvolver retinoblastoma, que compreende os passos de hibridação de uma sonda do gene do retinoblastoma com ADN extraído a partir de um tecido alvo; e determinação da ligação da sonda com o ADN. 0 tecido alvo é tecido não tumoral e pode ser tecido de feto, assim como, tecido post-natal até tecido adulto.

Noutros aspectos pode utilizar-se o método para a detecção de tumores que contêm um gene defeituoso de retinoblastoma. Por exemplo, pode utilizar-se este método para detectar este defeito no osteossarcoma, fibrossarcoma, sarcoma de teci do mole., carcinoma de células pequenas, melanoma e carcinoma da mama.

Um outro aspecto envolve um conjunto para a detecção de uma predisposição para desenvolver retinoblastoma que compreende pelo menos um cADN específico para o gene do retinoblastoma, *

em que a referida sonda de cADN e eficaz quando se hibrida com ADN a partir de uma célula alvo para indicar a presença ou ausência do gene do retinoblastoma.

Outro aspecto inclui um clone de ADN com atê cerca de

4,6 Kb bem como dois fragmentos de restricção Eco Rl com cerca de 0,9 e cerca de 3,8 Kb.

A presente invenção ê útil na detecção de uma ampla variedade de tumores que possuem um defeito no gene do retino blastoma.

Outros objectivos adicionais, características e vantagens evidenciar-se-ão a partir da descrição seguinte, dos aspectos presentemente preferidos da presente invenção, fornecidos para o proposito da descoberta quando tomados conjuntamente com os gráficos em anexo.

Breve Descrição dos Gráficos

A presente invenção será mais facilmente entendida a partir da leitura da memória descritiva seguinte e por referência aos gráficos que a acompanham e formam uma parte desta.

A figura IA ê uma mapa de restrição do locus Rb na região H3-8.

A figura 1B ê uma análise de Mancha de Northern de células mortais da retina de feto humano.

A figura 2A ê um mapa de restrição de cADN de 4,6 Kb de um gene Rb.

-5ζ

A figura 2B apresenta a ordem linear dos fragmentos de restrição Hind III que se detectaram com diversas sondas de cADN. Cada uma das caixas representa um fragmento discreto de Hind III cujo tamanho (Kb) se indica pelo número na caixa.

A figura 3A é uma analise da mancha de Southern do ADN genomico Hind III a partir de células normais, retinoblastoma e das suas células constitucionais as quais se hibridaram com pGH2, o qual é um subclone do fragmento Eco Rl de 0,9 Kb na extremidade 5’ do clone de ADN.

Em ambas as figuras 3A e' 3B, na calha 1 são fibroblastos humanos normais de controlo; 2, LA-RB128B (tumor);

3, LA-RB128B-F (fibroblasto); 4, LA-RB165 (tumor); 5, LA-RB165-F (fibroblasto); 6, LA-RB74 (tumor); 7, LA-RB-74-F (fibroblasto);

8, LA-RB151 (tumor); 9, LA-RB151-F (fibroblasto); 10, OHS-50 (osteossarcoma); 11, LA-RB73 (tumor); 12, LA-RB125 (tumor);

x

13, LA-RB113 (tumor); 14, LA-RB157 (tumor); 15, OSV (osteossarcoma); 16, LA-RB94 (tumor); 17, LA-RB70 (tumor); 18, Y-79 (tumor); 19, LA-RB69A (tumor); 20, LA-RB69A-F (fibroblasto);

21, LA-RB99 (tumor); 22, RB120F (fibroblasto que possui uma translocação equilibrada 46, XX,t C 10, 13 J Zq22; ql4j7).

A figura 4 e uma analise de mancha Northern de ARN poliadenilado a partir de fibroblastos humanos normais de células imortais normais de retina humana, retinoblastoma e seus fibroblastos. Calha 1, Poli A-ARN; 2, células da retina de feto humano normal; 3, Ad5/HER A (células da retina humana imortais de Adenovírus 5); 4, LA-RB128B;

5, LA-RB165; 6, LA-RB74; 7, OHS-50; 8, LA-RB73; 9, LA-RB157;

10, OSV; 11, LA-RB94; 12, LA-RB70; 13, Y-79; 14, LA-RB69A;

15, LA-RB69A-F (fibroblasto); 16, LA-RB133; 17, LA-RB110;

18, LA-RB160; 19, WS 1 (fibroblasto); 20, LA-RB99.

A figura 5 apresenta o mapa de restr-ção Hind III do locus genómico Rb.

A figura 6 ê uma analise da mancha de Southern de ADN *

genómico da mama humana digerido com Hind III, calhas A, BT-549 (carcinoma ductal infiltrante, tumores da mama humana); B, T-47D (efusão pleural dum paciente com carcinoma ductal de mama);

C, DU4475 (nódulo cutâneo metastásico de mama humana); D, MDA-MB-175-VII (carcinoma ductal de mama humana); E, MDA-MB-468 (adenocarcinoma de mama humana); F, HS0578T (carcinoma ductal de mama humana); G, ZR-5-30 (carcinoma de mama humana); H,

BT-483 (carcinoma ductal de mama humana); I, MDA-MB-415 (adeno carcinoma de mama humana); J, MDA-MB-453 (carcinoma de mama humana); K, MDA-MB-157 (carcinoma de mama humana).

Figura 7 - Análise da Mancha de Southern do ADN genómico digerido com Hind III a partir de tumores da mama e de um fibrossarcoma. As calhas A-K são as mesmas da fig. 6 e as calhas L, MRMDA 231; M, SW613; N, MCF-7 (carcinoma de mama humana); 0, HSgl3T (fibrossarcoma); P, MDAMB 461; Q, MDAMB 436.

A figura 8 é uma representação esquemática do resumo das aberrações estruturais que se detectaram em quatro tumores humanos. Rb = retinoblastoma, OS = osteossarcoma, HMT = tumores de mama humana e FS = fibrossarcoma.

A figura 9A - representação esquemática do locus geno mico do gene do retinoblastoma. 0 local do enzima de restrição para Hind III apresenta-se acima e o de Eco RI apresenta-se a baixo da linha 5*3’. As caixas sombreadas representam fragmentos Hind III que contêm exões. A seta saliente aponta para os locais do enzima ou áreas que apresentam polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição. VNTR, numero variável de

-7repetições de forma encadeada. As linhas a ponteado representam regiões que não estão inteiramente caracterizadas.

A figura 9B - Sobreposição de clones de fago bactéria* no a partir do qual se deduziu o mapa do enzima de restrição da figura 2A.

A figura 9C - Posição e dimensões dos diversos subclones dos fragmentos de ADN de locus genõmico de Rb a partir de clones de fago bacteriano que se subclonaram dentro dos vectores plasmídicos PGEM.

Figura 10 - Uma porção hipotética do locus genõmico de Rb. A ãrea a sombreado representa exões. Parte das sequências nucleotídicas que cobrem as junções exão-intrão apresentam-se acima e abaixo. Para fins de diagnostico, sintetizar-se-ã um par de oligonucleõtidos de DNA a e b, de acordo com as sequências 5’-3’ no intrão.

Figura 11 - Aplicação de ensaio de protecção de ARNase para o diagnóstico de mutações numa região hipotética do genoma do Rb. (i) amplificação de ADN de uma pessoa sã ou de tecido de doente, utilizando o par de precursores a e b que flanqueiam a exão; (ii) ADN amplificado desnaturado e misturado com uma sonda ribonucleotídica marcada radioactivamente que neste caso ê tão extensa quanto o ADN amplificado; (iii) Ácidos nucleicos misturados deixados a circularizar e, então, digeridos com ARNase A. Uma porção da sonda ARN de cadeia simples digerida, mas que não digeriu ADN-ARN híbrido de cadeia dupla, (iv) 0 híbrido de cadeia dupla desnaturou-se em ADN e ARN de cadeia simples que depois se separou por electroforese num gele;

(v) Expõs-se o gele a uma película de raios X para revelar o tamanho da molécula de ARN. As fontes de ADN foram as seguin-8tes. Α, indivíduo normal; B, tecido de tumor que possui uma de lecção ou uma mutação de base simples na região flanqueada pelo oligonucleotido precursor a e b; C, células constituintes a k

partir do paciente em B; D, tecido de tumor que possui uma delecção que abrange a e/ou b; E, células constituintes de pacien te em D.

Os gráficos não estão necessariamente ã escala e determinadas características da presente invenção podem estar exageradas na escala ou apresentadas de forma esquemática tendo em vista a clarificação e concisão.

Descrição Pormenorizada

Será evidente para o especialista que diversas substituições e modificações possam fazer-se na presente invenção sem fugir ao seu âmbito e espírito.

Um aspecto da presente invenção é um método para detectar a predisposição para desenvolver retinoblastoma e que compreende os passos de hibridação de uma sonda do gene de retino blastoma com ADN extraído a partir de tecido alvo e determinação da ligação sonda com o ADN. A ligação pode medir-se segundo uma diversidade de métodos, incluindo a determinação da quan tidade da sonda que hibridava, a determinação das modificações estruturais, polimorfismo do comprimento do fragmento de restri ção e amplificação ligação-sonda pelo método PCR e avaliação do produto.

Num aspecto preferido, da presente invenção marca-se a sonda e mede-se a hibridação determinando a quantidade de material que se utilizou para a marcação da molécula híbrida. 0 especialista reconhecerá facilmente que se encontram disponíveis uma variedade de métodos biológicos moleculares para medir a própria hibridação ou o produto da hibridação.

Uma diversidade de tumores demonstraram possuir um defei to estrutural no gene do retinoblastoma. Isto verificou-se no próprio retinoblastoma e também noutras pert-rbações tumurais tais como o osteossarcoma, fibrossarcoma, sarcoma de tecido mole, carcinoma de células pequenas do pulmão, linhas de células de melanoma e tumor da mama.

Podem detectar-se os tumores que cont~em o gene defeituoso do retinoblastoma segundo um método que compreende os pas. sos: hibridação da sonda do gene de retinoblastoma com ADN extraído a partir de um tecido alvo; e determinação da ligação da sonda ao referido ADN; Por exemplo, no retinoblastoma o próprio tumor carece do gene Rb em ambos os cromossomas, enquanto as ce lulas constituintes podem carecer apenas de um gene Rb. Assim, é evidente que a disponibilidade de uma sonda de gene Rb proporciona a capacidade para detectar indivíduos que possuem predisposição para formar um retinoblastoma.

tecido alvo é a amostra que se obtém de indivíduos que se pretendem observar e a partir da qual se extraiu o ADN. Não existem limitações no tipo de tecido que se pode recolher e analisar. Por exemplo, os tecidos podem ser de tumor, sangue, fibroblastos, pele ou outros tecidos normais e podem ser tomados do tecidos fetal ao tecido adulto.

Um outro aspecto inclui um método para detecção do ADN cromossómico que codifica pelo menos uma porção do gene de retinoblastoma humano e que compreende a desnaturação do ADN cromossómico total para se obter um ADN de cadeia simples; fazer contactar o referido ADN de cadeia simples com uma sonda do ge-10-

ζ ne de retinoblastoma; e identificação da sonda de ADN híbrido para detectar o ADN cromossõmico que contêm pelo menos uma por ção do gene do retinoblastoma humano.

Um outro aspecto engloba um conjunto” para a detecção de uma predisposição para retinoblastoma que compreende, pelo menos uma sonda específica de cDNA para o gene de retinoblasto ma, em que a referida sonda de cADN ê eficaz quando se efectua a hibridação com o cADN de uma célula alvo que indica a presença ou ausência do gene de retinoblastoma. Num aspecto adicional pode incluir-se pelo menos uma célula de controlo para determinar a especificidade e reactividade. Outros aspectos do conjunto podem incluir embalagem e instruções.

especialista verificara facilmente que se podem utilizar uma diversidade de indicadores marcados com qualquer das sondas de retinoblastoma. Estes marcadores podem ser radioactivos, fluorescentes ou enzimãticos. Alem disso, o especialis ta também verificara que podem utilizar-se outros métodos para determinar a hibridação sem se utilizarem sondas marcadas. Por exemplo, o exame dos polimorfismos do comprimento do fragmento de restrição método de amplificação PCR e método de clivagem por RNAase A sondagem oligonucleotídica específica dos alelos.

Descrição do Locus Rb locus genómico Rb possui, pelo menos, 200 Kb de comprimento. Na figura 9 apresenta-se o mapa de restrição do locus genomico. As linhas a ponteado representam regiões não com pletamente caracterizadas. Isolou-se a parte restante do locus gencmico a partir de bibliotecas genõmicas humanas que se construíram no

-11bacteríõfagos EMBL3 e j^fix. Na figura 9 apresenta-se a afinidade destes clones de bacteríõfagos e o locus genõmico. Existem pelo menos 20 exões no locus genõmico. Estas exões localizam-se em 12 fragmentos de restrição Hind III conforme se apresenta na figura 9. Efectuou-se a subclonagem dos fragmentos de restrição que contêm as exões nos vectores plasmídicos PGEM4 e PGEM2. A posição dos locais Hind III apresentam-se acima da linha 5’-3' e os locais Eco Rl apresentam-se abaixo. As caixas a sombreado representam osfragmentos de ADNHindlII que contêm as exões. Os fragmentos incluem-se na sonda de cADN de 4,6Kb para o gene de retinoblastcma. A hibridaçao do ADN digerido com Hind III ou Eco Rl com um clone marcado de cADN de Rb revela vãrios fragmentos de ADN de Hind III representados pelas caixas a sombreado. Detectaram-se grandes modificações estruturais envolvendo estes frag mentos.

Método de Clivagem por Ribonuclease A (RNAase A)

- Uma pequena delecção envolvendo muito poucos núcleo tidos e uma mutação de base singular não seriam habitualmente detectãveis pela analise de manchas de Southern. Podem detectar-se estas modificações pelo ensaio por clivagem com ribonuclease A (RNAase A).

Uma vez que os defeitos estruturais nas exoês do locus genõmico Rb são as causas mais prováveis de inactivação, centrou-se o diagnóstico inicial nestas regiões. Conforme se apre senta na figura 9, cada uma das caixas sombreadas representa um fragmento de ADN Hind III que contêm a exão. Existe uma ou mais exões em cada um destes fragmentos. É provável que o numero total de exões exceda 20.

-12/ .. ί

Tendo em vista a aplicação do ensaio de clivagem da RNAase A, sintetisaram-se pares de oligonucleotidos de ADN, fig. 10. Estes pares podem ser ou partes da exão ou da região de flanqueamento em redor de cada exão. Para se analisar uma amostra de ADN para uma mutação numa exão mistura-se uma pequena quantidade da amostra de ADN com os dois oligonucleotidos a e b. Submete-se a mistura a reacção da cadeia de po limerase (RCP) utilizando o sistema de Amplificação de ADN

TM

Gene Amp de Perkm-Elmer Cetus. Este medoto permite a amplificação selectiva do ADN flanqueado pelos dois oligonucleo tidos. Desnatura-se o ADN amplificado e, depois, efectua-se a sua hibridação com um ribonucleotido de cadeia simples marcado radioactivamente, sintetisado a partir de um subclone do lo cus genomico Rb que contêm esta região. Submete-se o material hibridado a digestão com RNAase A. Toma-se como um controlo uma reacção que consiste em ADN amplificado a partir de um indivíduo normal. Fracciona-se, o produto digerido, por electrofurese em gele e detecta-se o tamanho do ribonucleotido radioac tivo por exposição a uma película de raio X. Protege-se a sequência nucleotídica da sonda de ARN radioactiva que correspon de ao ADN amplificado de um indivíduo normal, da digestão por RNAase A. Utiliza-se como padrão o tamanho do fragmento Fg de ARN, protegido (figura 11).

Para as amostras de ADN de tumor, as delecções que ocor rem na região flanqueada pelos dois oligonucleotidos pode origi nar na digestão do híbrido em dois fragmentos mais pequenos F^ e F₂, figura 11B. Nas células constituintes também podem detectar-se os dois fragmentos se a mutação ocorrer num dos ale los Rb, figura 11C. Para as amostras de ADN de tumor com delec.

-13_ >>

s ^w ções que abrangem um ou ambos os nucleótidos a e b, não ê pos. sível a amplificação do ADN. Por isso, não se protege a sonda de ARN, figura 11D. Quando se utilizam células constituintes po de haver problemas. Em tais casos ter-se-â de procurar um outro par de iniciadores oligonucleotídicos que flanqueiam a região de lectada. Uma vez que a mutação possa ser detectada no gene Rb segundo estes métodos, e possível aplicar o mesmo procedimento de detecção na vizinhança imediata da sonda.

Nos casos em que se conhece uma historia familiar, a segregação dos cromossomas que contêm os alelos que foram objecto de mutação podem identificar-se utilizando os enzimas e a sonda no gene Rb que pode detectar PCFRs.

Estudos de Ligação Utilizando Polimorfismos da Extensão do Fragmento de Restrição (PCFRs)

- Existem, pelo menos, quatro regiões no locus genõmico de Rb que apresentam frequente polimorfismo com um enzima dado. São Kpnl na região 1, e Hind III na região 2, Ith III 1 na região 4 e diversos enzimas na região 3. A região 3 ê uma região VNTR (informações encadeadas em numero variável); os enzimas RSal parecem ser particularmente úteis na detecção do polimorfismo. Os fragmentos de ADN gerados por estes enzimas podem apresentar polimorfismo de tamanho quando se hibridam com a sonda de ADN da região indicada. A segregação de um dado alelo Rb, conforme definido por estes RFLPs pode, assim, comparar-se com a segregação e incidência de retinoblastoma numa família.

Descrição do cADN de Rb e dos Clones de ADN Genõmico

A estratégia bãsica de clonagem envolve procedimentos cromossõmicos utilizando sondas na região 13ql4.1, o locus do gene de Rb. Isolaram-se, sondas livres, ao acaso, de sequências altamente repetitivas, a partir da biblioteca específica do cromossoma 13, LL 13NS01. Para identificar os clones que pertenciam à região 13ql4JL, utilizaram-se duas linhas de célu las humanas híbridas desenvolvidas no hamster. Cada uma destas linhas de células continha o cromossoma 13 com uma delecção incluindo a região 13ql4.1. Preparou-se a célula híbrida 3B6 utilizando a estirpe celular 32T que possui uma delecção cromossomica desde 13ql4.1 atê 13ql4.3 enquanto 2D12 contêm um cromossoma 13 com uma delecção de 13ql4.1 a 13q22.3.

Identificaram-se os clones que continham inserções de ADN no interior da região cromossomica de 13ql4.1 a 13ql4.3 pela ausência de hibridação de ADN a partir de 3B6 e 2D12 utilizando as inserções como sondas. Podem obter-se, mediante estratégia semelhante, duas outras sondas, H2-42 e H3-8. Para além disso, uma vez que ambos os locais ESD e Rb estão em 13ql4.1, também se isolou um clone de cADN ESD completo para se utilizar como uma sonda.

Utilizaram-se cada uma dessas sondas localizadas em 13ql4.1 como ponto de partida para procedimento bidireccional. Isolou-se um grande numero de clones utilizando estas diversas sondas. Descobriu-se, de forma interessante, que uma destas sondas, H3-8, não esta presente em diversos fagos ou bi bliotecas de cosmídeos, presumivelmente, devido ao facto de estar numa região que ê facilmente eliminada e, assim, utiliza-se para detectar fragmentos de restrição mais pequenos.

-15A figura ΙΑ apresenta um mapa de restrição desta região obtido por sobreposição de clones de diferentes fragmentos de restrição. 0 tamanho da inserção de cada clone obtido verificou-se por hibridação do clone com manchas genómicas.

Isolou-se, de modo surpreendente, uma sonda, PG4-4 que se situava muito próximo de H3-8 a qual hibridou com uma sequência de hamster. Esta conservação de sequência entre o ser humano e o hamster sugeriu que o PG4-4 contêm a sequência de clonagem de um gene. A hibridação do PG4-4 com uma mancha de mARN de diversas linhas de células imortais de retina de feto humano revelou um mARN de 4,6 quilobases (Kb), fig. IB. Utili zando o PG4-4 como uma sonda, isolaram-se diversos clones de cADN, o mais longo dos quais tinha 4,6 Kb. A figura 2A apresenta o mapa de restrição deste clone de cADN. Conforme se apresenta na figura, determinou-se a polaridade dos clones por hibridação de sondas de cadela específica com manchas de mARN. Descobriu-se que a sequência da exão no PG4-4 estava localizada entre os sítios Hpal e Eco RV proximo da extremidade 5' do cADN. Na Tabela 1 apresenta-se a sequência nucleotídica de uma sonda de 4,6 Kb.

I

-16TABELEA 1

5'

10	20	30	40
ÇCCCCCAAAA	ACGGCCGCCA	CCGCCGCCGC	TGCCGCCGCG
50	60	70	80
GAACCCCCQG	CACCGCCGCC	GCCGCCCCCT	CCTGAGGAGA
90	100	110	120
ACCCAGAGCA	GGACAGCGGC	CCGGAGGACC	TGCCTCTCGT
130	140	150	160
CAGGCTTGAG	TTTGAAGAAA	CAGAAGAACC	TGATTTTACT
170	180	190	200
GCATTATGTC	AGAAATTAAA	GATACCAGAT	CATGTCAGAG
210	220	230	240
AGAGAGCTTG	GTTAACTTGG	GAGAAAGTTT	CATCTGTGGA
250	260	270	280
TGOAGTATTG	GGAGGTTATA	ttcaaaagaa	AAAGGAACTG
290	300	310	320
TGGGGAATÇT	QTATCTTTAT	TGCAGCAGTT	GACCTAGATG
330	340	350	360
AGATGTCGTT	CACTTTTACT	GTGCTACAGA	AAAACATAGA
370	380	390	400
AATÇAGTGTC	CATAAATTCT	TTÀACTTACT	AAAAGAAATT
410	420	430	440
GATACCAGTA	CCAAAGTTGA	TAATGCTATG	TCAAGACTGT
450	460	470	480
TGAAGAAGTA	TGATGTATTG	TTTGCACTCT	TCAGCAAATT
490	500	510	520
GGAAAGGACA	TGTGAACTTA	TATATTTGAC	ACAACCCAGC
530	540	550	560
AGTTCGATAT	CTACTGAAAT	AAATTCTGCA	TTGGTGCTAA
570	580	590	600
AAGTTTCTTG	GATCACTTTT	TTATTAGCTA	AAGGGGAAGT
610	620	630	640
ATTACAAATG	GAAGATGATC	TGGTGATTTC	ATTTCAGTTA
650	660	670	680
ATGCTATGTG	TCCTTGACTA	TTTTATTAAA	CTCTCACCTC
690	700	710	720
CCATGTTGCT	CACCCAGGCG	TATAAAACAG	CTGTTATACC
730	740	750	760
CATTAATGGT	TCACCTCGAA	AACCCCAGHC	GGGTCAGAAC
770	780	790	800
AGGAGTGCAC	GGATAGCAAA	ACAACTAGAA	AATGATACAA
810	820	830	840
GAATTATTGA	AATTCTCTGT	AAAGAACATG	AATGTAATAT
850	860	870	880
AGATGAGGTG	AÀAAATGTTT	ATTTCAAAAA	TTTTATACCT
890	900	910	920
TTTATGAATT	CTCTTGGACT	TGTAACATCT	AATGGACTTC
930	940	950	960
CAGCGGTTGA	AAATCTTTCT	AAACGATACG	AAGAAATTTA

	TABELA	1 (Cont.)
970	980	990	1000
TCTTAAAAAT	AAAGATCTAG	ATGCAAGATT	atttttgcat
1010	1020	1030	1040
CATGATAAAA	CTCTTCAGAC	TGATTCTATA	GACAGTTTTG
1050	1060	1070	1080
AAACACAGAG	AACACCACGA	AAAAGTAACC	TTGATGAAGA
1090	1100	1110	1120'
GGTGAATGTA	ATTCCTCCAC	ACACTCCAGT	TAGGACTGTT
1130	1140	1150	1160
ATGAACACTA	TCCAACAATT	AATGATGATT	TTAAATTCAG
1170	1180	1190	1200
CAAGTGATCA	ACCTTCAGAA	AATCTGATTT	CCTATTTTAA
1210	1220	1230	1240
CAACTGCACA	GTGAATCCAA	AAGAAAGTAT	ACTGAAAAGA
1250	1260	1270	1280
GTGAAGGATA	TAGGATACAT	CTTTAAAGAG	AAATTTGCTA
1290	1300	1310	1320
AAGCTGTGGA	cagggttgtg	TCGAAATTGG	ATCACAGCGA
1330	1340	1350	1360
TACAAACTTG	GAGTTCGCTT	GTATTACCGA	gtaatggaat
1370	1380	1390	1400
CCATGCTTAA	ATCAGAAGAA	GAACGATTAT	CCATTCAAAA
1410	1420	1430	1440
TTTTAGCAAA	CTTCTGAATG	ACAACATTTT	TCATATGTCT
1450	1460	1470	1480
TTATTGGCGT	GCGCTCTTGA	GGTTGTAATG	GCCACATATA
1490	1500	1510	1520
GCAGAAGTAC	ATCTCAGAAT	CTTGATTCAG	GAACAGATTT
1530	1540	1550	1560
GTCTTTCCCA	TGGATTCTGA	ATGTGCTTAA	TTTAAAAGCC
1570	1580	1590	1600
TTTGATTTTT	ACAAAGTGAT	CGAAAGTTTT	ATCAAAGCAG
1610	1620	1630	1640
AAGGCAACTT	GACAAGAGAA	ATGATAAAAC	ATTTAGAACG
1650	1660	1670	1680
ATGTGAACAT	CGAATCATGG	AATCCTTTGC	ATGGCTCTCA
1690	1700	1710	1720
GATTCACCTT	TATTTGATCT	TATTAAACAA	TCAAAGGACC
1730	1740	1750	1760
GAGAAGGACC	AACTGATCAC	CTTGAATCTG	CTTGTCCTCT
1770	1780	1790	1800
TAATCTTCCT	CTCCAGAATA	ATCACACTGC	AGCAGATATG
1810	1820	1830	1840
TATCTTTCTC	CTGTAAGATC	TCCAAAGAAA	AAAGGTTCAA
1850	1860	1870	1880
CTACGCGTGT	AAATTCTACT	GCAAATGCAG	AGACACAAGC
1890	1900	1910	1920
AACCTCAGCC	TTCCAGACCC	AGAAGCCATT	GAAATCTACC
1930	1940	1950	1960
TCTCTTTCAC	TGTTTTATAA	AAAAGTGTAT	CGGCTAGCCT
1970	1980	1990	2000
ATCTCCGGCT	AAATACACTT	TGTGAACGCC	TTCTGTCTGA

TABELA 1 (Cont.)
2010	2020	2030	2040
GCACCCAGAA	TTAGAACATA	TCATCTGGAC	CCOTTCCAG
2050	2060	2070	2080
CACACCCTGC	AGAATGAGTA	TGAACTCATG	AGAGACAGGC
2090	2100	2110	2120
ATTTGGACCA	AATTATGATG	TGTTCCATGT	ATGGCATATG
2130	2140	2150	2160
CAAAGTGAAG	AATATAGACC	TTAAATTCAA	AATCATTGTA
2170	2180	2190	2200
ACAGCATACA	AGGATCTTCC	TCATGCTGTT	CAGGAGACAT
2210	2220	2230	2240
TCAAACGTGT	TTTGATCAAA	GAAGAGGAGT	atgattctat
2250	2260	2270	2280
TATAGTGTTC	TATAACTCGG	TCTTCATGCA	GAGACTGAAA
2290	2300	2310	2320
ACAAATATTT	TGCAGTATGC	TTCCACCAGG	CCCCCTACCT
2330	2340	2350	2360
TGCACCAATA	CCTCACATTC	CTCGAAGCCC	TTACAAGTTT
2370	2380	2390	2400
CCTAGTTCAC	CCTTACGGAT	TCCTGGAGGG	AACATCTATA
2410	2420	2430	2440
TTTCACCCCT	GAAGAGTCCA	TATAAAATTT	CAGAAGGTCT
2450	2460	2470	2480
GCCAACACCA	ACAAAAATGA	CTCCAAGATC	AAGAATCTTA
2490	2500	2510	2520
GTATCAATTG	GTGAATCATT	CGGGACTTCT	GAGAAGTTCC
2530	2540	2550	2560
AGAAAATAAA	TCAGATGGTA	TGTAACAGCG	ACCGTGTGCT
2570	2580	2590	2600
CTAAAGAAGT	GCTGAAGGAA	GCAACCCTCC	TAAACCACTG
2610	2620	2630	2640
AAAAAACTAC	GCTTTGATAT	TGAAGGATCA	GATGAAGCAG
2650	2660	2670	2680
ATGGAAGTAA	ACATCTCCCA	GGAGAGTCCA	AATTTCAGCA
2690	2700	2710	2720
GAAACTGGCA	GAAATGACTT	CTACTCGAAC	ACGAATGCAA
2730	2740	2750	2760
AAGCAGAAAA	TGAATGATAG	CATGGATACC	TCAAACAAGG
2770	2780	2790	2800
AAGAGAAATG	AGGATCTCAG	GACCTTGGTG	GACACTGTGT
2810	2820	2830	2840
GCACCTCTGG	ATTCATTGTC	TCTCACAGAT	GTGACTGTAT
2850	2860	2870	2880
AACTTTCCCA	GGTTCTGTTT	ATGGCCACAT	TTAATATCTT
2890	2900	2910	2920
CAGCTCTTTT	TGTGGATATA	AAATGTGCAG	ATGCAATTGT
2930	2940	2950	2960
TTGGGTGATT	CCTAAGCCAC	TTGAAATGTT	ÀGTCATTGTT
2970	2980	2990	3000
ATTTATACAA	GATTGAAAAT	CTTGTGTAAA	TCCTGCCATT
3010	3020	3030	3040
TAAAAAGTTG	TAGCAGATTG	TTTCCTCTTC	CAAAGTAAAA

TABELA 1 (Cont.)

3050	3060	3070	3080
TTGCTGTGCT	TTATGGATAG	TAAGAATGGC	CCTAGAGTGG
3090	3100	3110	3120
GAGTCCTGAT	AACCCAGGCC	TGTCTGACTA	ÇTTTGCCTTC
3130	3140	3150	3160
TTTTGTAGCA	TATAGGTGAT	GTTTGCTCTT	GTTTTTATTA
3170	3180	3190	3200
ATTTATATGT	ATATTTTTTT	AATTTAACAT	GAACACCCTT
3210	3220	3230	3240
AGAAAATGTG	TCCTATCTAT	CTTCCAAATG	GAATTTGATT
3250	3260	3270	3280
GACTGCCCAT	TCACCAAAAT	TATCCTGAAC	TCTTCTGCAA
3290	3300	3310	3320
AAATGGATAT	TATTAGAAAT	TAGAAAAAAA	TTACTAATTT
3330	3340	3350	3360
TACACATTAG	ATTTTATTTT	ACTATTGGAA	TCTGATATAC
3370	3380	3390	3400
TGTGTGCTTG	TTTTATAAAA	TTTTGCTTTT	AATTAAATAA
3410	3420	3430	3440
AAGCTGGAAG	CAAAGTATAA	CCATATGATA	CTATCATACT
3450	3460	3470	3480
ACTGAAACAG	ATTTCATACC	TCAGAATGTA	AAAGAACTTA
3490	3500	3510	3520
CTGATTATTT	TCTTCATCCA	ACTTATGTTT	TTAAATGAGG
3530	3540	3550	3560
ATTATTGATA	GTACTCTTGG	TTTTTATACC	ATTCAGATCA
3570	3580	3590	3600
CTGAATTTAT	AAAGTACCCA	TCTAGTACTT	GAAAAAGTAA
3610	3620	3630	364.0
AGTGTTCTGC	CAGATCTTAG	GTATAGAGGA	CCCTAACACA
3650	3660	3670	3680
GTATATCCCA	AGTGCACTTT	CTAATGTTTC	TGGGTCCTGA
3690	3700	3710	3720
AGAATTAAGA	TACAAATTAA	TTTTACTCCA	TAAACAGACT
3730	3740	3750	3760
GTTAATTATA	GGAGCCTTAA	TTTTTTTTTC	ATAGAGATTT
3770	3780	3790	3800
GTCTAATTGC	ATCTCAAAAT	TATTCTGCCC	TCCTTAATTT
3810	3820	3830	3840
GGGAAGGTTT	GTGTTTTCTC	tggaatggta	CATGTCTTCC
3850	3860	3870	3880
ATGTATCTTT	TGAACTGGCA	ATTGTCTATT	TATCTTTTAT
3890	3900	3910	3920
TTTTTTAAGT	CAGTATGGTC	TAACAÇTGGC	ATGTTCAAAG
3930	3940	3950	3960
CCACATTATT	TCTAGTCCAA	AATTACAAGT	AATCAAGGGT
3970	3980	3990	4000
CATTATGGGT	TAGGCATTAA	TGTTTCTATC	Tgattttgtg
4010	4020	4030	4040
CAAAAGCTTC	AAATTAAAAC	AGCTGCATTA	GAAAAAGAGG
4050	4060	4070	4080
CGCTTCTCCC	CTCCCCTACA	CCTAAAGGTG	TATTTAAACT

TABELA 1 (Cont.)

4090	4100	4110	4120
atctgtgtga	TTAACTTATT ’ -	TAGAGATGCT	GTAACTTAAA
4130	4140	4150	4160
ATAGGGGATA	TTTAAGGTAG	CTTCAGCTAG	CTTTTAGGAA
41*70	4180	4190	42Ό0
AATCACTTTG	CCTAACTCAG	AATTATTTTT	AAAAAGAAAT
4210	4220	4230	4240
CTGGTCTTGT	TAGAAAACAA	AATTTTATTT	TGTGCTCAGT
4250	4260	4270	4280
TAAGTTTÇAA	ACTTACTATT	TTGACAGTTA	TTTTGATAAC
4290	4300	4310	4320
AATGACACTA	GAAAAÇTTGA	CTCCATTTCA	TCATTGTTTC
4330	4340	4350	4360
TGCATGAATA	TCATACAAAT	CAGTTAGTTT	TTAGGTCAAG
4370	4380	4390	4400
GCCTTACTAT	TTCTGGGTCT	TTTGCTACTA	AGTTCACATT
4410	4420	4430	4440
AGAATTAGTG	CCAGAATTTT	AGGAACTTCA	GAGATCGTGT
4450	4460	4470	4480
ATTGAGATTT	CTTAAATAAT	GCTTCAGATA	TTATTGCTTT
4490	4500	4510	4520
ATTGCTTTTT	TGTATTGGTT	AAAACTGTAC	ATTTAAAATT
4530	4540	4550	'4560
GCTATGTTAC	TATTTTCTAC	AATTAATAGT	TTGTCTATTT
4570	4580
TAAAATAAAT	TAGTTGTTAG 3'

Esta sonda de cADN consiste em, pelo menos, 20 exões. Assim, podem efectuar-se sondas múltiplas mais pequenas (fragmentos) a partir desta grande sonda. Alêm disso, o especialista verificara que derivados desta sonda, por exemplo, sequências degeneradas ou sequências com poucas modificações no par de bases simples funcionarão como sondas eficazes.

Parte da extremidade 5’ do gene de Rb carece do clone genõmico. Esta parte que inclui o promotor e parte da primeira exão apresenta-se na Tabela 2.

TABELA 2

5'

10	20	30	‘40
CCGCGAGGTG	ATTAGCAGAT	TATTCCTCTG	CGGGGCCCGA
50	60	70	80
GAGTCTTCCC	TATCAGACCC	CGGGATAGGG	ATGAGGCCCA
90	100	110	120
GCAGTCACCC	ACCAGACTCT	TTGTATAGCC	CGTTAAGTGG
130	140	150	160
ACCCGGCCGT	GAGGGGGTGG	TTCTGGGTAA	AAGACGTCCG
170	180	190	200
GGCCGCGCCG	GATGCCTCCT	GGAAGGCGCC	tggacccacg
210	220	230	240
CCAGGTTTCC	CACTTTAATT	CCTCATGACT	TAGCGTCCCA
250	260	270	280
GCCCGCGCAC	CGACCAGCGC	CCCAGTTCCC	CACAGACGCC
290	300	310	320
GGCGGGCCCG	GGAGCCTCQG	ACGTGAGCGG	CGGGCGGAAG
330	340	350	360
TGACGTTTTC	CCGCGGTTGG	ACGCGGCGCT	CAGTTGÇCGG
370	380	390	400
GCGGGGGAGG	GCGCGTCCGG	TTTTTCTCAG	GGGACGTTGA
410	420	430	440
AATTATTTTT	GTAACGGGAG	TCGGGAGAGG	ACGGGGCGTG
450	460	470	480
CCCCGACGTG	CGCGCGCGCG	TCCTCCCCGG	CGCTCCTCAC
490	500	510	520
AGCCTTCGCT	CGGTCCCCGG	CCGCGGAACC	GGTATGCCGC
526
CCAAAA 3'
No clone genõmico as	Tabelas 1 e	2 são contínuas pelo
que a base 1	da Tabela 1 serã a base 527	da Tabela 2.
Estas	dados mostram i	ama região CG	enriquecida entre a
extremidade 5	’ e o sítio Hpa	I. A hibridação de manchas Southern
com uma sonda	feita a partir	desta região	CG enriquecida pro-

porcionou invariavelmente um padrao manchado.

As sondas disponíveis de Rb proporcionam um meio para identificar a existência ou não de alterações estruturais no gene de Rb num dado tipo de tumor ou subjacentes a uma dado ti-Ί.2.

po de tumor. Por consequência, ê possível que alguns tumores respondam de modo diferente â terapia com base no facto de exis_ tir ou não um defeito no gene de Rb. Também, uma vez que é evidente que a perda funcional do gene de Rb é crítica para o desenvolvimento do tumor pode ser possível tratar estes tumores mediante adição do gene ou do produto do gene dentro das células .

Análise de manchas de Southern - Extraiu-se o ADN a partir de tecidos alvo, por exemplo, tumor, sangue, fibroblasto ou outros tecidos normais. Efectua-se a digestão, separadamente, com diferentes enzimas de restrição. Separam-se os fragmentos de enzimas de restrição em gele de agarose por elec troforese, desnaturam-se e transferem-se para um filtro de nitrocelulose. Sondas marcadas de cADN do gene do Rb hibridaram com o fragmento de ADN, no filtro. Num aspecto preferencial o marcador é radioactivo e expõe-se o filtro a películas de raios X.

Se o clone de cADN é o gene de Rb putativo, detectar-se-ão anomalias estruturais no ADN de determinados retinoblas. tomas, incluindo aqueles com delecções visíveis na região 13ql4.1 Para analisar a estrutura do ADN genõmico de retinoblastomas, utilizou-se um exame de endonucleases de restricção para descobrir enzimas que gerariam fragmentos de restrição bem separados com, uma sonda de cADN. 0 Hind III gerou fragmentos de restrição bem separados no ADN humano normal que podiam detectar-se pelos subclones do clone de cADN de 4,73 Kb. Na fig. 2B apresenta-se a ordem dos fragmentos de restrição de Hind III genõmico detectáveis com uma sonda de cADN.

-23Uma vez que se utilizou uma sonda de cADN, detectar-se-ão apenas aberrações estruturais dos fragmentos de restrição que contêm a exão. Podem não ser detectadas aberrações estruturais nos fragmentos de restrição que contenham uma exão muito pequena.

Isto também ê verídico para mutações pontuais ou delec ções extremamente pequenas na exão ou nas junções de reparação. Contudo, mesmo com estas limitações observaram-se aberrações estruturais, incluindo parte ou todo o gene de Rb. Na Tabela 3 resumem-se as diversas formas de alterações estruturais.

I

TABELA 3

TUMOR '	FORMA DA DOENÇA	MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL NO GENE Rb	EXPRESSÃO DO GENE Rb E NÍVEL DE mARN
LA-RB128B	Delecçao	Delecção Homozigotica Total	Ausente
LA- RB165	Unilateral	Delecção Homozigótica 3’	Ausente
LA-RB74	Bilateral	Delecção Homozigotica Interna	Anormal
LA-RB151	Bilateral	Delecção Homozigótica Interna	ND+
OHS-50	Bilateral*	Delecção Homozigotica Interna	Anormal
LA-RB125	Unilateral	Delecção Interna de 1 Alelo	ND
LA-RB99	Unilateral	Delecção Interna de 1 Alelo	Anormal
LA-RB112	Unilateral	Delecção Total de 1 Alelo	ND
LA-RB157	Bilateral	Delecção Total de 1 Alelo	Ausente
OSV	Osteossarcoma Primário	Supressão Total de 1 Alelo	Anormal
LA-RB69A	Bilateral	Não Detectãvel	Ausente
LA-RB73	Bilateral	Não Detectá-el	Ausente
LA-RB110	Bilateral	Não Detectãvel	Ausente
LA-RB133	Bilateral	Não Detectãvel	Ausente
LA-RB160	Unilateral	Não Detectãvel	Ausente
LA-RB94	Unilateral	Não Detectãvel	Anormal
LA-RB70	Unilateral	Não Detectãvel	Reduzida
Y-79	Bilateral	Não Detectãvel	Anormal

* Osteossarcoma em pacientes com retinoblastoma bilateral. + Não determinado.

EXEMPLO 1

Examinaram-se por analise de manchas do Southern o ADN de quarenta casos de pacientes com retinoblastoma e de fibrobla^ tos dos mesmos pacientes. Para facilitar esta analise, efectuou-se a subclonagem dos fragmentos Eco Rl de 0,9 Kb e 3,8 Kb dentro do vector PGEM-4, fig. 2A. Manchas Southern de ADN geno mico isolado a partir de retinoblastomas digeridos com diferen tes endonucleases de restrição hibridaram com sondas feitas a partir destes dois subclones, PG H2 (Eco Rl de 0,9 Kb) e PG 3,8M (Eco Rl de 3,8 Kb). Também se analisaram com estas sondas o ARN poliadenilado de diversos retinoblastomas.

Um dos mecanismos pelo qual se inactivam os dois alelos é a delecção total ou parcial de ambos os alelos de Rb. Um exemplo de delecção total de ambos os alelos é proporcionado pelo tumor, LA-RB128B, a partir de um paciente com retinoblastoma bilateral. A analise citogenética de fibroblastos deste indivíduo utilizando faixa de resolução elevada uma delecção visível num cromossoma 13 desde 13ql4.1 a 13ql4.3. 0 cromosso ma 13 restante parecia normal.

Consistente com estas observações, as intensidades dos fragmentos de restrição Rb indicaram a presença de apenas uma copia simples de um locus Rb aparentemente intacto nos fibroblastos, calha 3 em ambas as figuras 3A e 3B. Estudos de RFLP utilizando sondas de cromossoma 13 acima e abaixo da região 13ql4.1 demonstraram que ambos os cromossomas 13 estavam presentes no tumor. Contudo, faltavam ambos os alelos do locus Rb, fig. 3A e 3B, calha 2. Assim, neste paciente, a primeira e segunda mutação envolveu a delecção de um dos alelos Rb.

Conforme se esperava, não puderam detectar-se trans-

crições RB no tumor, fig. 4, calha 4.

LA-RB165, representa um exemplo de uma delecção parcial. Este tumor foi obtido a partir de um paciente com doença unilateral. Conforme se apresenta na fig. 3B, calha 4, fal tam os fragmentos Hind III de 9,8 Kb, 6,2 Kb e 2,1 Kb. As intensidades dos fragmentos Rb restantes indicam a existência de uma copia apenas do locus Rb aberrante. Assim, neste tumor um alelo do gene Rb foi totalmente delectado e o outro possui uma delecção na extremidade 3’. Conforme se pode observar nas figs. 3A e B, calha 5, estão presentes nos fibroblastos duas cópias de locus Rb aparentemente intactos. Isto implica a ocorrência de dois fenómenos mutacionais diferentes nas células somáticas (isto e, o retinoblasto alvo), um resultado que é consistente com a condição unilateral (não hereditária) deste paciente com retinoblastoma. Não se detectou neste tumor transcrição Rb, fig. 4, calha 5.

Embora a correlação entre as grandes delecções estruturais e a inactivação do gene de Rb seja consistente com a transferência do gene de Rb para esta região, a delecção total homozigótica ou delecções comuns 3' não excluem a possibilidade do gene Rb estar a juzante desta região. A prova definitiva da autenticidade do gene de Rb será quer a existência de uma delecção 5¹ quer delecção interna homozogótica noutros tumores. Descobriu-se que dois retinoblastomas e um osteossarco ma possuíam tais delecções.

primeiro exemplo, tumor LA-RB74 proveio de um pacien te com retinoblastoma bilateral. Conforme se demonstra na fig.

3B, calha 6, falta o fragmento de restrição Hind III de 7,5 Kb.

Pode detectar-se uma cópia de uma nova faixa de 4,1 Kb. Neste /

tumor, reduziu-se em tamanho o Rb transcrito para 4,4 Kb, o que ê consistente com a delecção de uma exão presente no fragmento

Hind III de 7,5 Kb, em falta, Fig. 4, calha 6. 0 padrão de res% trição dos fibroblastos do mesmo paciente apresenta-se na fig. 3B, calha 7. A presença de uma cópia de cada um dos fragmentos Hind III, normal de 7,5 Kb e aberrante de 4, 1 Kb indica que este paciente possui uma delecção na linha germeninativa nesta região.

Um segundo exemplo de delecção interna homozigótica, observa-se no tumor LA-RB151, também obtido a partir de um paciente com retinoblastoma bilateral. Estudos de RFLP demonstraram que ambas as sondas de cromossoma 13, acima e abaixo do locus de Rb, eram heterozigotas nos fibroblastos e tornavam-se homozigotas nas células de tumor. No tumor faltavam ambas as cópias do Hind III de 9,8 Kb e estavam presentes duas cópias de um novo fragmento Hind III de 8,0 Kb, fig. 3B, calha 8. Da observação da intensidade do fragmento Hind III de 9,8 Kb nos fibroblastos, fig. 3B, calha 9, conclui-se que apenas estava presente nos fibroblastos uma única cópia do fragmento Hind III de 9,8 Kb.

Descobriu-se no osteossarcoma, OHS, um terceiro exemplo de delecção interna homozigótica. Obteve-se este tumor a partir de um paciente com uma história antecedente de retino blastoma. Como se pode observar na fig. 3B, calha 10, falta o fragmento Hind III de 7,5 Kb. A pequena quantidade de hibridação antecedente com o fragmento de 7,5 Kb surge, presumível, mente, a partir de um pequeno número de células normais que se contaminam.

De modo interessante, enquanto que OHS e LA-RB74 posλ2 8suem ambos uma delecção do fragmento Hind III de 7,5 Kb e trans. crições truncadas, a transcrição do gene de Rb no OHS reduziu-se para 3,9 Kb, Fig. 4, calha 7, o qual ê mais pequeno do que a do LA-RB74, fig. 4, calha 6.

tumor LA-RB125 é de um paciente com retinoblastoma unilateral esporádico. Conforme se apresenta na fig. 3B, calha 12, apenas se encontra presente uma unica copia do fragmento Hind III de 7,5 Kb, em contraste com as duas cópias da parte restante do gene de Rb. Aparentemente, um dos alelos de Rb contém uma delecção interna na região 7,5 Kb.

LA-RB99 é de um caso de retinoblastoma unilateral no qual pode detectar-se numdos alelos das Rb uma delecção interna envolvendo o fragmento Hind III de 9,8 Kb, fig. 3B, calha 21. No seu lugar gerou-se um novo fragmento de 7,5 Kb.

Podem detectar-se no tumor duas transcrições de dimensões diferentes uma de 7,0 Kb e uma com e dimensão normal de 4,7 Kb, fig. 4, calha 20. Em ambos estes casos, podia detectar-se uma anormalidade em apenas um dos cromossomas 13. Nas calhas 13, e 15 das figs. 3A e 3B apresentam-se três tumores com perda total de um dos alelos Rb. 0 LA-RB112, calha 13 era de um paciente com doença esporádica unilateral, LA-RB157, calha 14, era de um caso bilateral e OSV, calha 15 é um osteossarcoma de um paciente sem história de retinoblastoma conhecida. Em todos estes casos apenas se conservou um único locus Rb aparentemente normal. Em LA-RB157, fig. 4, calha 9 pode detectar-se pouca ou nenhuma transcrição Rb. Contudo, com OSV, pode detectar-se uma mensagem truncada de 4,2 Kb, fig. 4, calha 10.

A presença de uma extensão de uma região rica em GC na extremidade 5' do cADN complica a análise do locus genómico.

Se se estabelecer que o fragmento Hind III de 14,5 Kb, fig. 2B, contém a primeira exão do gene de Rb, então diversos dos casos de retinoblastoma possuem delecções na extremidade 5’. Contudo, se existisse ainda uma outra pequena exão em frente do fragmento Hind III de 14,5 Kb, então, estes casos representariam exemplos adicionais de delecções internas.

Aproximadamente 60% dos quarenta retinoblastomas não apresentam modificações estruturais aparentes no gene de Rb. En tre estes grupos de tumores observaram-se diversas anormalidades na expressão da transcrição de Rb. Por exemplo, nenhum dos cinco tumores seguintes exprimem uma copia de Rb: retinoblasto mas bilaterais LA-RB73, fig. 4, calha 8; LA-RB69A, fig. 4, calha 14; e o LA-RB133, fig. 4, calha 16; são todos homozigotos pa ra o cromossoma 13; o tumor bilateral LA-RB110, fig. 4, calha 17, que ê heterozigoto para as sondas polimõrficas do cromossoma 13 ambos acima e abaixo do locus de Rb; e o tumor unilateral LA-Rbl60, fig. 4, calha 18, que se torna homozigoto para uma sonda do cromossoma 13, 7D2, que também se localiza na região cromossémica 13ql4.

Também se detectaram transcrições anormais noutros casos. Por exemplo, no caso unilateral, LA-RB94 que é homozigoto para o cromossoma 13, não apresentar grandes modificações estruturais, fig. 3A e 3B, calha 16 mas possui uma pequena quan tidade de uma transcrição de Rb aparentemente maior, fig. 4, ca lha 11. Isto deve-se, presumivelmente, ã excisão de uma junção de tal modo que foi incluída uma pequena intrão no final da transcrição. LA-RB70, que também não possui modificação aparen te no locus de ADN de Rb, figs. 3A e 3B, calha 17, possui uma quantidade reduzida de uma transcrição de Rb de tamanho normal,

-30fig. 4, calha 12. Finalmente ο Y79, a linha de células de retinoblastoma mais comumente utilizada atê agora, apresentou de forma consistente, uma quantidade reduzida de uma transcrição truncada de Rb de 4,2 Kb, fig. 4B, calha 13, apesar de não se terem observado modificações significativas com as pre sentes sondas, figs. 3A e 3B, calha 18. Presumivelmente, ocorreu no locus de Rb uma delecção ainda não detectada.

Também se observou uma delecção interna homozigotica e uma transcrição de Rb truncada no osteossarcoma de um paciente com historia anterior de retinoblastoma. Estes dados são consistentes com o postulado de que o gene de Rb é responsável pelo desenvolvimento quer de retinoblastoma quer de osteossarcoma. A observação de que a maioria dos tumores não expressa o gene de Rb ao nível do ARN, proporciona um forte suporte pa ra a natureza recessiva do gene de Rb para o contencioso de que ê a perda de função de ambos os alelos de Rb que ê respon savel pelo desenvolvimento do tumor.

Em todos os casos de delecção interna examinados, as delecções envolveram sempre quer o fragmento Hind III de 7,5 Kb quer o fragmento Hind III de 9,8 Kb. Também se descobriu que uma copia do fragmento Hind III de 7,5 Kb estava alterada nos fibroblastos RB120F, fig. 3B, calha 22. Esta linha celular de fibroblastos era de um paciente com retinoblastoma bi lateral no qual ocorreu uma translocação equilibrada envolvendo as regiões cromossÕmicas 13ql4 e 10q22.

Em seu lugar detectou-se uma nova banda de 6,5 Kb.

Se estas regiões do locus do gene de Rb contiverem estruturas peculiares que as possam predispor para delecção ou translocação continuam para serem observadas.

Estes dados, LA-RB128B, LA-RB74, e LA-RB151 também pro porcionam a verificação da hipótese de dois alvos alternativos de Kn-dson. Nos casos bilaterais detectou-se facilmente nos fibroblastos a mutação do locus Rb que representa o primeiro alvo, fig. 3B, calha 3, 7 e 9, e, o segundo alvo detecta-se no tumor, fig. 3B, calhas 2, 6 e 8. No caso unilateral, LA-RB165 os dois fenômenos mutacionais, delecção 3' ou delecção total, apenas se verificaram no tumor, fig. 3B, calha 4 e não nos fi broblastos, fig. 3B, calha 5.

EXEMPLO 2

Observou-se que o gene de retinoblastoma é inactivado de forma idêntica nalguns tumores da mama, melanoma humano, carcinoma de células pequenas do pulmão, sarcoma e fibrossarcoma de tecido mole. Estas observações proporcionam a base pa ra a detecção de defeitos do gene de retinoblastoma nas células destes pacientes. As linhas de células de carcinoma de ma ma humana que se utilizaram foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. As técnicas empregues foram as previamente descritas para os retinoblastomas.

locus de Rb genõmico, fig. 5, representa-se como exões que contêm fragmentos de restrição Hind III e Sal I. Os clones de cADN dividem-se em duas porções para a síntese de sondas. A figura 6 apresenta a analise da mancha Southern do ADN genõmico digerido por Hind III de onze tumores da mama humana. Como se pode verificar, cinco destes tumores, A, C, E,

G e K, apresentam aberrações estruturais nesta região.

A figura 7 apresenta a analise de manchas de Southern de ADN genõmico digerido por Hind III de dezasseis linhas de células de tumor da mama humana, incluindo as onze amostras que se apresentam na figura 6, e uma linha de células de fibrossarcoma, calha 0.

Conforme se pode verificar a partir da figura 7, podem observar-se aberrações estruturais. Para além disso, uma linha de células de tumor da mama humana, calha A, e uma linha de células de fibrossarcoma, calha 0, apresentaram ambas, aberrações estruturais nesta porção do locus do gene de Rb.

Na figura 8 apresenta-se um resumo das modificações estruturais. Os fragmentos Hind III que contêm a exão apresentam-se na parte superior da figura enquanto que as modifi cações estruturais se apresentam na parte inferior. As delec ções internas na região do fragmento Hind III de 7,5 Kb obser vam-se facilmente em diversas amostras.

Além da delecção interna nesta região, também se obser varam outros tipos de modificações incluindo a delecção homozi gótica interna, delecção 3’, amplificação ou combinação destes. Estas aberrações estruturais nos tumores da mama humana apresentam uma semelhança surpreendente ãs que se descobriram no retinoblastoma. Utilizando a analise da mancha de Southern nove dos dezanove tumores da mama humana, um melanoma humano, SK-Mel-5 da linha celular da ATCC, dois osteossarcomas e um fibrossarcoma apresentaram aberrações estruturais. A percentagem de linhas celulares de tumor da mama com alterações estruturais ê, contudo, semelhante à do retinoblastoma.

EXEMPLO 3

Efectua-se o diagnóstico no tumor e/ou nas células constitufivas. Sempre que se encontre disponível material de tumor, testa-se, em primeiro lugar, quanto aos defeitos estru turais no gene de Rb segundo qualquer uma ou todas as técnicas aqui descritas.

Uma vez identificada a mutação, centralizam-se os esforços de diagnóstico na região que sofreu a mutação e aplicam-se nas células constitutivas. Por exemplo, ambas as cópias dos fragmentos de ADN de 7,5 Kb Hind III faltam no ADN do tumor LA-RB74. Este defeito estrutural é adquirido de modo hereditário pela célula constitucional do paciente devido ao facto de faltar nestas células uma cópia do fragmento Hind III de 7,5 Kb. Por conseguinte, para a diagnose da predispo sição para o desenvolvimento de retinoblastoma e doenças que lhe estão associadas na vizinhança imediata da sonda, centralizar-se-ão os esforços na detecção da presença ou ausência do fragmento Hind III de ADN com 7_f5 Kb.

Na ausência de material de tumor, a detecção de aber ração estrutural de Rb efectua-se nas células constitutivas. Para além disso, quando existe uma história familiar de retinoblastoma e/ou osteossarcoma, pesquisa-se a heriditariedade dos alelos polimórficos de Rb e compara-se com a incidência Rb na família.

facto de se poderem detectar facilmente as alterações estruturais no locus de Rb, com o novo clone de cADN, em aproximadamente 40% dos retinoblastomas bem como nos fibro blastos de alguns pacientes bilaterais, torna esta sonda bastantemente útil na diagnose pré-natal.

especialista reconhecerá facilmente que na medida em que se analisa o locus genõmico completo e mais sondas e metodologias se tornam disponíveis, poderão detectar-se, con sideravelmente, mais anormalidades.

A sonda de cADN será de utilidade imediata no diagnõs_ tico pré-natal em famílias que possuam uma parente com uma anormalidade estrutural detectável do gene de Rb tais como os indivíduos a partir dos quais se obtiveram os tumores LA-RB74, LA-RB151 e LA-RB128B ou a linha de fibroblastos RB120 F. Se se descobrirem alterações idênticas nas células do feto, isto indicará que o feto herdou o gene de susceptibilidade ao reti noblastoma. Tal como feto desenvolverá, quase certamente, retinoblastoma e estará sobre alto risco de contrair outras doenças malignas nos últimos anos, se a gravidez chegar ao termo.

A sonda de cADN também pode permitir a identificação de alguns dos indivíduos, estimulados em 15%, que possuem Rb esporádico unilateral que, infelizmente, possuem a forma hereditária da doença.

Também e certo que o gene de Rb desempenha uma função no desenvolvimento dos tumores referidos antes. A utilização do clone de cADN do gene de Rb para detecção dos defeitos -do gene pode, por conseguinte, ser aplicada a outras doenças malignas, incluindo os tumores da mama humana, melano mas humanos, osteossarcoma, fibrossarcoma, sarcoma de tecido mole e carcinoma de células pequenas do pulmão.

especialista verificará facilmente que a presente invenção se encontra devidamente adaptada para atingir o cbjectivo e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como

as que lhe são inerentes. Pretende-se que os métodos, procedimentos e técnicas aqui descritos que representam, presentemente, os aspectos preferenciais sejam tomados como exemplos e não limitem o âmbito da presente invenção.

As alterações e outras utilizações que possam ocorrer ao especialista e que estejam contidas no espírito da presente invenção, definem-se no âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. - Processo para a detecção da predisposição para de. senvolver retinoblastoma, caracterizado pelo facto:

   de se hibridar una sonda de gene de retinoblastoma ao DNA extraído de um tecido em estudo; e de se determinar a ligação da sonda ao referido DNA.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sonda de retinoblastoma ser marcada.
3. 3. - Processo para a detecção de tumores que contêm um defeito dos genes de retinoblastoma, caracterizado pelo facto:

   de se hibridizar uma sonda de genes de retinoblastoma ao DNA extraído de um tecido em estudo; e de se determinar a ligação da sonda ao referido DNA.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os referidos tumores serem seleccionados do grupo que consiste em retinoblastoma, osteo-sarcoma, fibro-sarcoma, sarcoma de tecidos moles, melanoma, carcinoma de células peque, nas do pulmão e carcinoma da mama.

   /
5. 5. - Processo para a detecção de DNA cromossómico que codifica para pelo menos uma porção do gene de retinoblastoma humano, caracterizado pelo facto:

   de se tratar o DNA crcmossónico total sob condições de desnaturação para se obter DNA de cadeia simples;

   de se fazer contactar o DNA de cadeia simplas assim obtido com nma sonda de gene de retinoblastoma; e de se identificar a sonda-DNA hibridizada assim obtida para detectar DNA cromossómico que contem pelo menos uma porção do gene de retinoblastoma humano.
6. 6. - Conjunto de diagnóstico para a detecção da predis. posição para retinoblastoma, caracterizado por incluir:

   pelo menos uma sonda de cDNA específica para o gene de retinoblastoma, em que a referida sonda de cDNA é eficaz quando hibridizada com DNA de uma célula em estudo para indicar a presença ou ausência do gene retinoblastoma.
7. 7. - Conjunto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se incluir, adicionalmente, pelo menos uma amostra de controlo.
8. 8. - Processo para a preparação de uma sonda de cDNA específica para o gene de retinoblastoma de até cerca de

   4,6 kb, caracterizado pelo facto de compreender a fase que con siste em hibridizar uma sonda específica para mRNA obtida a partir de linhas de células imortalizadas de fetos humanos.
9. 9. - Processo para a preparação de uma sonda de cDNA específica para o gene de retinoblastoma de até cerca de

   0,9 kb, caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em hibridizar uma sonda específica para mRNA obtida a partir de uma linha de células imortalizadas de fetos humanos e em cindir o cDNA hibridizado para a referida sonda com uma enzima de restrição.
10. 10. - Processo para a preparação de uma sonda de cDNA específica para o gene de retinoblastoma de até cerca de 3,8 kb, caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em hibridizar uma sonda específica para mRNA obtida a partir de uma linha de células imortalizadas de fetos huma nos e em cindir o cDNA hibridizado para a referida sonda com uma enzima de restrição.
11. 11. - Processo para a detecção de um gene de retinoblastoma, caracterizado pelo facto:

    de se hibridizar fragmentos, derivados, ou a sequência de cDNA de fórmula:

    5’

    XO 20 30 40 CCCCCCÀAAA acggccgcca CCGCCGCCGC 7GCCGCCGCG 50 60 70 80 GAACCCCCGG CACCGCCGCC ** f* r* r*** CCTGAGGAGA 90 100 110 120 ACCCAGAGCA GGACAGCGGC CCGGAGGACC TGCCTCTCGT 130 140 150 1=0 CAGGCTTGAG TTTGAAGAAA CAGAAGAACC TGATTTTAC7 170 130 190 200 GCA77A7G7C ÀGÀÀATTÀÀÀ \SÃ * r»,V.ÁUÀl CATGTCAGAG 210 220 230 240 AGAGAGCT7G GTTAACTTGG GAGAAAGTTT CATCTGTGGA 250 2SG 270 280 TGGAGTATTG GGAGGTTATA ilLAÀflAUr.A AAAGGAACTG 290 300 310 320 TGGGGAATCT GTATCTTTAT TGCAGCAGTT GACCTAGATG 330 340 350 360 AGATGTCGTT CACTTTTACT GTGCTACAGA AAAACATAGA 370 380 390 400 aatcagtgtc CATAAATTCT TTAACTTACT AAAAGAAATT 410 420 430 440 GATACCAGTA CCAAAGTTGA TAÀTGCTÃTG TCAAGAC-GT 450 460 470 480 TGAAGAAGTA TGATGTATTG TTTGCACTCT 7CAGCAÀA77 490 500 510 520 GGAAAGGACA TGTGAACTTA TATATTTGAC ACAACCCAGC 530 540 550 560 AGTTCGATAT CTACTGAAAT AAATTCTGCA 7TGGTGCTAA 570 580 590 600 AAGTTTCTTG GATCACTTTT TTATTAGCTA AAGGGGAAGT 610 620 630 640 ATTACAAATG GAAGATGATC TGGTGATTTC ATTTCAGTTA 650 660 670 680 ATGCTATGTG TCCTTGACTA TTTTATTAAA CTCTCACCTC 690 700 710 720 CCATGTTGCT CACCCAGGCG TATAAAACAG CTGTTATACC 730 740 750 760 CATTAATGGT TCACC7CGAA AACCCCAGHC GGG7CAGAAC 770 780 790 SQQ AGGAGTGCAC GGATAGCAAA ACAACTAGAA AATGATACA 810 820 830 340 GAATTATTGA AATTC7CTGT AAAGAACA7G AA7G7AA7AT 850 860 870 830 AGATGAGC-TG AAAAA7GT7T ATTTCAAAAA i-i.λ.λΙΛ. 890 900 910 920 T77A7GAA77 C7C77GGACT TGTAACA7CT AATGGAC77C 930 940 950 960

    CAGCGGTTGA aaatctttct AAACGATACG AAGAAA777A 970 980 990 1000 TCTTAAAAAT AAAGATC7AG A7GCAAGA77 A77777GCA7 1010 1020 1030 1040 CATGATAAAA CTCTTCAGAC TGATTCTATA GACAG77TTG 1050 1060 1070 1080 AAACACAGAG ÀACASCACGA AAAAGTAACC 77GA7GAAGA 1090 1100 1110 1120 GG7GAATG7A ATTCCTCCAC ACACTCCAGT 7AGGAC7G77 1130 1140 1150 1160 ATGAACACTA TCCAACAA77 AATGATGATT TTAAATTCAG 1170 11S0 1190 1200 CAAGTGàTCA ACC.Z-CAGAA AATCTGATTT CviA» — ú. αΛΛ 1210 1220 1230 1240 CAACTGCACA GTGAATCCAA λλ^λλλ^Χλ^ * <»*»#*% *·**/·«* Λ^νίΛΛΛΛυΛ 1250 1250 1270 1280 GTGAAGGATA CAGGATACAT C7TZAAAGAG AAA7T7GC7A 1290 1300 1310 1320 ÀAGCTGTGGA CAGGG77G7G 7CGAAAT7GG ATCACAGCGÂ 1330 1340 1350 1360 TACAAACTTG GAGTTCGC7T G7A77ACCGA GTAA7GGAAT 1370 13S0 1390 1400 CCATGCTTAA ATCAGAAGÀA GAACGATTAT CCATTCAAÀA 1410 1420 1430 1440 TTTTAGCAAA CTTCTGAATG ACAACATTTT TCATATGTCT 1450 1460 1470 1480 TTATTGGCGT GCGCTCTTGA GGTTGTAATG GCCACATATA 1490 1500 1510 1520 GCAGAAGTAC A7CTCAGAAT CTTGATTCAG GAACAGATT? 1530 1540 1550 1560 GTCTTTCCCA TGGA77CTGA ATGTGCTTAA TTTAAAAGCC 1570 1580 1590 1600 TTTGATTTTT ACAAAG7GAT CGAAAGTTTT ATCAAAGCAG 1610 1620 1630 1640 AAGGCAACTT GACAAGAGAA ATGATAAAAC ATTTAGAACG 1650 1660 1670 1580 ATGTGAACAT CGAATCATGG AATCCTTTGC ATGGC7CTCA 1690 1700 1710 1720 GATTCACCTT TATTTGATCT TATTAAACAA TCAAAGGACC 1730 1740 1750 1760 GAGAAGGACC AACTGATCAC C7TGAATC7G C77G7CC7CT 1770 1780 1790 1800 TÀATCTTCC7 CTCCAGAATA ATCACACTGC AGCAGATATG 1810 1820 1830 1840 TATCTTTÇTC CTGTAAGATC TCCAAAGAAA AAAGGTTCAA 1850 1860 1870 1880 CTACGCGTGT AAATTCTACT GCAÀATGCAG AGÀCACAAGC 1890 1900 1910 15 2 C AACCTCAGCC TTCCAGACCC ÀGAAGCCAT? GAAATCTACC 1930 1940 1950 1960 TCTCTTTCAC TGTTTTATAA AAAAGTGTAT CGGCTAGCCT 1570 1380 1990 2C3C

    ATC7CCGGC7 AAA7ACAC7T TGTGAACGCC TTCTGTCTGA 2010 2020 2030 2040 GCACCCAGAA TTAGAACATA TCATCTGGAC CCTTTTCCAG 2050 2050 2070 2080 CACACCCTGC AGAATGAGTA TGAACTCATG AGAGÀCAGGC 2090 2100 2110 2120 ATTTGGACCA AATTATGATG TGTTCCATGT ATGGCATATG 2130 2140 2150 2160 CAAAGTGAAG AATATAGACC TTAAATTCAÂ « R·>! AAlL-ítl luÍA 2170 21S0 2150 2200 ACAGCATACA AGGATCTTCC TCATGCZGZT CAGGAGACA? 2210 2220 2230 2240 TCAAACGTGT ^T^GATCAAA GAAíTAfKlrt??* 2250 22=0 2273 2233 TATAGTGTTC TATAACTCGG TCTTCATGCA gagactgaaã 2290 2300 2310 2320 ACAAATATTT 7GCAG7A7GC TTCCACCAGG CCCCCZACC7 2330 2340 2350 2360 7GCACCAATÃ CCTCACATTC CTCGAAGCCC TTACAAGTTT 2370 2330 2390 2400 CCTAGTTCAC CCTTACGGAT TCCTGGAGGG AACA7C7ATA 2410 2420 2430 2440 TTTCACCCCT GAAGAGTCCA TA7AAAÀ777 CAGAAGG7C7 2450 2460 . 2470 2480 GCCAACACCA ACAAAAATGA CTCCAAGATC AAGAATCTTA 2490 2500 2510 2520 GTATCAATTG GTGAATCA7T CGGGACTTCT GAGAAG77CC 2530 2540 2550 2560 AGAAAATAAA TCAGATGGTA TGTAACAGCG ACCGTGTGCT 2570 2580 2590 2600 CTAAAGAAGT GCTGAAGGAA GCAACCCTCC TAAACCACTG 2610 2620 2630 2640 AAAAAACTAC GCTTTGATAT TGAAGGATCA GATGAAGCAG 2650 2660 2670 2680 ATGGAAGTAA - ACATCTCCCA GGAGAG7CCA AATTTCAGCA 2690 2700 2710 2720 GAAACTGGCA GAAATGAC77 CTACTCGAAC ACGAATGCAA 2730 2740 2750 2760 AAGCAGAAAA TGAATGATAG CATGGATACC 7CAAACAAGG 2770 2780 2790 2800 AAGAGAAATG AGGATCTCAG GACCTTGGTG GACACTGTGT 2810 2820 2830 2840 GCACC7CTGG ATTCATTGTC TCTCACAGAT GTGACTGTAT 2850 2860 2870 2880 AACTTTCCCA GGTTCTGTTT ATGGCCACAT TTAATATCTT 2890 2900 2910 2920 CAGCTC7TTT 7G7GGA7ATA aaatgtgcag atgcaattgt 2930 2940 2950 2960 7TGGGTGATT CC7AAGCCAC TTGAAATGTT AGTCATTGTT 2970 2980 2990 3000 ATTTATACAA GA77GAAAAT CTTGTGTAAA TCC7GCCAT? 3010 3020 3030 3040

    TAAAAAGTTG TAGCAGATTG TTTCCTCTTC CAAAGTAAAA 3050 3060 3070 3080 TTGCTGTGCT TTATGGATAG TAAGAA7GGC CCTAGAGTGG 3090 3100 3110 3120 GAGTCCTGAT AACCCAGGCC TGTCTGACTA CTTTGCCTTC 3130 3140 3150 3160 TTTTGTAGCA íATAGGíGAT GTTTGCTCTT GTTTTTATTA 3170 3120 3130 3200 ATTTATATGT ATATTTTTTT AATTTAACAT GÀACACCCTT 3210 3220 3230 3240 AGAAAATGTG TCCTATCTAT CT7CCAAATG GAA777GA7T 3250 3260 3270 3230 GACTGCCCAT TCACCAAAAT 7A7CCTGAAC . UL-Αλ 3290 3300 3310 3320 AAATGGAIAT TATTAGAAAT TAGAAAAAAA TTACTAATTZ 3330 3340 3350 3350 TACACATTAG ACTATTGGAÀ 7C7GA7A7ÀC 3370 33SO 3390 3400 TGTGTGCTTG TTTZATAAAA TTTTGCTTTT AATTÂAÃTAÀ 3410 3420 3430 3440 AAGCTGGAAG CAAAGTATAA CCATATGATA CTATCATACT 3450 3460 3470 3480 ACTGAAACAG ATTTCÃTACC TCAGAATGTA AAAGAACTTA 3490 3500 3510 3520 CTGATTATTT TCTTCATCCA ACTTATGTTT 77AAA7GAGG 3530 3540 3550 3560 ATTATTGATA GTACTCTTGG 77777ATACC ATTCAGATCA 3570 3580 3590 3600 CTGAATTTAT AÀAGTACCCA TCTAGTACTT GAAAAAGTAA 3610 3620 3630 3640 AGTGTTCTGC CAGATCTTAG GTATAGAGGA CCCTAACACA 3650 3660 3670 3680 GTATATCCCA AGTGCACTTT CTAATGTTTC TGGGTCCTGA 3690 3700 3710 3720 AGAATTAAGA TACAAATTAA TTTTACTCCA TAAACAGACT 3730 3740 3750 3760 GTTAATTATA GGAGCC77AA TTTTTTTTTC ATAGAGATTT 3770 3780 3790 3800 GTCTAATTGC ATCTCAÀAÀT TATTCTGCCC TCCTTAATTT 3810 ' 3820 3530 3840 GGGAAGGTTT GTGTTTTCTC 7GGAATGG7A CATGTCTTCC 3850 3860 3870 3880 ATGTATCTTT TGAACTGGCA ATTGTCTATT 7A7CTTT7A7 3890 3900 3910 3320 TTTTTTAAGT CAGTATGGTC TAACACTGGC ATGTTCAAAG 3930 3940 3350 3960 CCACA77ATT TCTAGTCCAA AATTACAAGT AA7CAAGGG7 3970 3980 3990 4000 CATTATGGGT 7AGGCA77AA TGTTTCTATC 7GA7777G7G 4010 4020 4030 4040 CAAAAGC7TC AAATTAAAAC AGC7GCAT7A GAAAAAGAGG 4050 4060 4070 4030

    CGC77C7CCC

    4090

    A7C7GTGTGA

    4130

    A7AGGGGA7A

    4170

    AA7CAC77TG

    4210

    C7GGTC77GT

    4250

    7AAG7TZCAA

    4250

    AATGACAC7A

    4330

    4370

    GCCT7ACTA7

    4410

    AGAA7TAG7G

    4450

    A77GAGA7T7

    4490

    ATTGCT77T7

    4530

    GC7A7G77AC

    4570

    TAAAATAAAT

    C7CCCC7ACA

    4100

    77AAC7TA7T

    4140

    777AAGG7AG

    4180

    Cf<M Ά /“»***»* */*· XZVÀU Ml

    4220

    TAGAAAACAA

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    x. 1—π - AUnAAi

    4330

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    TAGTTGTTAG

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    4270

    4310

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    4120

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    Λ.^--ν-Λ\.·ΛΛΛ 424C

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    4350 '1EAGG7 CAAG

    435C 4400 x x— AG77CACA7T 4420 “ Λ Λ Λ ÀGGAAC77CÀ χ vx x 4470 > 4 2Λ «ISuU GC77CAGA7A TTAxTGCxT? 4510 4 520 AAAAC7GTAC ATTTAAAAT7 4550 4560 AA7 7AA7AG7 TTGTCTA77T

    e fragmentos e seus derivados, codificando os referidos fragmentos para pelo menos uma parte de um exão do gene de retinoblasto.

    ma, no DNA extraído do tecido em estudo; e de se detectar a hibridaçao.
12. 12.- Processo para a determinação da terapia para tumores, caracterizado pelo facto de se hibridizar uma sonda de ge. ne de retinoblastoma no DNA extraído do referido tumor; e de se determinar a ligação da sonda ao referido DNA, em que a terapia está dependente da presença ou ausência no tumor do gene de retinoblastoma.