JPH04500751A - 網膜芽腫の素地の検出法と網膜芽腫遺伝子プローブを用いた腫瘍中の網膜芽腫遺伝子欠陥を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 網膜芽腫の素地の検出法と網膜芽腫遺伝子プローブを用いた腫瘍中の網膜芽腫遺 伝子欠陥を検出する方法１１目ヒ矩」 この発明は網膜芽腫遺伝子プローブを用ν〜た網膜芽腫の傾向を検診するという 分野に関する。この発明番ままた網膜芽腫遺伝子プローブと網膜芽腫遺伝子の欠 陥をもった腫瘍の検出にそれを用いることに関する。これら腫瘍の例をこ番ま骨 肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫、小細胞ガン、メラノーマ、乳腺腫瘍などがある。 且里互！見 網膜芽腫（Ｒｈ）の遺伝子は両方の正常対立形質の活性の欠失が腫瘍化に関係し ていると考えられてν＼る劣性のヒトガン遺伝子の原型である。網膜芽腫（Ｒｈ ）　ｌま遺伝性でもｌｒ遺伝性でも起こり、眼に関する最も一般的な／ｈ児ガン である。 突発的に両側に起こる場合は通常遺伝性であるカ；、一方突発的な片側の場合の 約８５％は非遺伝性である。臨床データの統計的解析によれば、網膜芽腫の発生 をこｉｔ二つの変異を起こすことが必要とされている。遺伝性の場合をと＆ま胚 株の変異が全ての細胞に在り、標的の網膜芽腫をこおをする第二のランダムの体 細胞変異は腫瘍発生に必須であると考えられている。 最初の変異の性質についての最初の手掛りが網膜芽腫患者のリンパ球または繊維 芽細胞の細胞発生学的研究力為ら生れた、この患者のわずかなサブグループに染 色体領域１３ｑ１４に関する欠損があることがわかった。最初の腫瘍細胞の発生 についてのデータも第二の変異の起こる標的が染色体１３に関係していた。１３ ｑ１４を含む染色体１３の欠失あるいは部分的欠損はしばしば二つの明らかに正 常な構成染色体１３をもった患者の網膜芽腫にみられた。 第２の出来事が１３４１４領域でのＲｂ感受性遺伝子座に関しているというもう 一つの証拠は制限酵素断片長さの多形性（ＲＦＬＰ）の研究から生じた。染色体 １３のＲＦＬＰで決められるものとして正常な構成遺伝子型と腫瘍の遺伝子型を 比較することによって１３染色体の対立形質の全であるいは部分でのヘミ接合性 あるいはホモ接合性の減少が網膜芽腫の発生に一般的におこることであるという ことが示された。同様に、骨肉腫では遺伝性の網膜芽腫患者に付随的に悪性化と してしばしば起こる骨の腫瘍であるが、１３染色体のホモ接合性またはヘミ接合 性の発生が観察されている。　ＲＢ遺伝子座での正常な対立形質の活性の欠失が 腫瘍発生の鍵となる現象であることをこれまで利用できるデータ全てが示唆して いる。しかしながら、今日までこの仮説を確かに証明し、欠陥のあるＲｂ遺伝子 をもった腫瘍を検出するのにこの知見を用い、そして網膜芽腫の発生を予測させ ることはできていない。 １１しｌ［紅 本発明の目的は網膜芽腫の傾向を検出する方法である。 本発明のもう一つの目的は網膜芽腫遺伝子での欠陥をもった腫瘍の検出法である 。 本発明のさらに別の目的は網膜芽腫の発生する傾向を検出するためのキットの開 発である。 本発明のもう一つの目的はｃＤＮＡクローンとプローブの開発である。 かくして、これまでの目的に付随して、本発明の一面によれば、網膜芽腫遺伝子 のプローブを標的とする組織から採ったＤＮＡにハイブリダイズしそのプローブ がＤＮＡに結合するかどうかを測定するステップを含む網膜芽腫の発生に対する 傾向を検出する方法が提供される。この標的となる組織は非腫瘍組織であり、ま た胎児の組織でも生後から成人の組織でもよい。 その他の内容において、この方法は網膜芽腫遺伝子の欠陥をもった腫瘍を検出す るのに用いられる０例えばこの方法は骨肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫、小細胞肉 腫、メラノーマ、乳腺ガンなどの欠陥の検出に使われる。 もう一つの内容には少くとも一つの網膜芽腫遺伝子に特異的なｃＤＮＡでそのｃ ＤＮＡプローブが網膜芽腫遺伝子の有無を示すために標的とする細胞からとった ＤＮＡとハイブリダイズするとき有効であるような網膜芽腫の発生の傾向を検出 するためのキットを包含している。 もう一つの内容には約４．６ｋｂのクローン化されたｃＤＮＡと同時に約０，９ ｋｂと約３．ｆｌｋｂの二つのＥｃｏＲＩ制限酵素断片を含んでいる。 本発明は網膜芽腫遺伝子にある欠陥をもつ幅広い種類の腫瘍の検出に宵月である 。 その他の目的、特徴及び利点はここに示した発明の内容の記述及び添付した図面 と合わせれば明らかとなろう。 の　を 本発明は以下の明細書を読むこと及びその一部を成す添付図面を参照することに よってより易く理解されよう。 図ＩＡはＨ３−８領域にあるＲｂ遺伝子座の制限地図である。 正常なヒトの繊維芽細胞（ＷＳＩ）の染色体ＤＮＡからのＥｃｏＲｌ　、　Ｈｉ ｎｄｍ、ＪＩＩｌ、　Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｓａｃ　Ｉによる制限断片がシャロン２ １Ａ、　ＣＨ１７またはλｇｔＷＥｓλＢにある部位にクローン化された。Ｅｃ ｏＲＩの７．７ｋｂクローンがＥｃｏＲＩをもったｗｓｒ正常ヒト繊維芽細胞の 染色体ＤＮＡを完全に分解することによって作られた染色体ライブラリーから分 離され、バクテリオファージのラムダベクターであるシャロン２１ＡのＥｃｏＲ １部位にクローン化された。このクローンの末端に近いところで得られる反復配 列のない制限断片を次にＷＳＩからのＨｉｎｄｍ断片の染色体ライブラリーを検 索するためのプローブとして使われた。同様に、重複しているクローンをＢｇｌ 　ｍまたはＳａｃ　ＩでＷＳＩ染色体ＤＮＡを完全に分解したものから作製され た染色体ライブラリーから探索した。制限酵素切断部位は次の記号で示されてい る：　Ｒ；ＥｃｏＲＩ、　Ｓ　１ｓａｃ！、Ｐ　；ｐｓｔｌ　、　Ｂ　；Ｂｇｌ ｌｌ　；　Ｈ％Ｈｉｎｄｍ　；Ｓｐ、５ｐｈｌ　。 図ＩＢは不死化したヒトの胎児性網膜細胞のノーザンプロット解析である。アデ ノウィルス５とアデノウィルス１２からのＤＮＡで夫々形質導入することによっ て不死化したヒトの胎児の網膜細胞系統Ａｄ　５　／ＨＥＲＢ９０及びＡｄ１２ ／ＨＥＲＩ１．２４からホーリアデニル化ＲＮＡを分離した０分離したＲＮＡの 各々１０μｇを２．２Ｍのフォルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル電気泳 動で分離し、遺伝子スクリーン用膜に転写した。３２Ｐで標識した相補的ＲＮＡ はＢａｍＨＩで直鎖にしたｐＧ４−４とｐＥＳＤすなわち１．３ｋｂのヒトエス テラーゼのｃＤＮＡクローンのサブクローンを用いた標準法に従って合成された 。 ランダムプライマープローブは標準的な方法で合成された。 ハイブリダイゼーションは５０％のフオルメミド、３ＸＳＳＣ。 Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ、　０．１Ｍヘペス（ｐＨ７，４）及び０．０５％ＳＯ ５を含む液中で４２℃で行われた。洗滌は室温で２０分間２ＸＳＳＣで行なわれ 、その後０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣと０，１％ＳＤＳにより６５℃で各１時間行った。 　４．７ｋｂの形質転換体がｐＧ４−４という検出プローブ図２ＡはＲｂ遺伝子 の４．６ｋｂのｃＤＮＡの制限地図である。 ４．６ｋｂのｃＤＮＡクローンがｃＤＮＡライブラリーから分離された。制限酵 素切断部位は次のように示されている：Ｒ１、ＥｃｏＲｌ　；Ｈｐ％Ｈｐａｌ　 ；ＥＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｐｖ、　ＰｖｕＴｌ　；Ｂｇ、　ＢｇＩＩＩ　；Ｎｄ％Ｎ ｄｅｌ　ｉＮｃ、　Ｎｃｏｌ　；Ｐｓ、　Ｐｓｔｌ　；Ｈｍ、Ｈｉｎｄｍ。 図２ＢはいろいろなｃＤＮＡプローブで検出されたＨｉｎｄ■制限断片の線状の 順序を示している。夫々の箱は分割されたＨｉｎｄｌＩＩ断片でその大きさくｋ ｂ）は箱の中の数で示されている。 図３ＡはそのｃＤＮＡクローンの５′末端のＥｃｏＲＩ　Ｏ，９ｋｂのサブクロ ーンのｐＧ）１２にハイブリダイズされた正常細胞、網膜芽腫、及びそれらの構 成的な細胞のサザンプロット分析である。 図３ＢはｃＤＮＡクローンのＥｅｏＲＩ　３．８ｋｂ断のサブクローンである小 さなｐＧ３．８ｍにハイブリダイズされる正常細胞、網膜芽腫及びその構成的な 細胞のサザンプロット分析である。 図３Ａと３Ｂにおいて、レーン１は正常な対照ヒト繊維芽細胞である；　２．　 ＬＡ−ＲＢ１２８Ｂ（腫瘍）　ｉ　３　、　ＬＡ−ＲＢ１２１１Ｂ　−Ｆ（繊維 芽細胞）　；　４　、　ＬＡ−ＲＢ１６５（腫瘍）　；　５　、　ＬＡ−ＲＢ１ ６５−Ｆ（繊維芽細胞）　；　６　、　ＬＡ−ＲＢ７４（腫瘍）　；　７　、　 ＬＡ−ＲＢ７４−Ｆ（繊維芽細胞）　；　８．　ＬＡ−ＲＢ１５１（腫瘍）　； 　９　、　ＬＡ−ＲＢ１５１−Ｆ（繊維芽細胞）；　１０．０Ｈ５−５０（骨肉 腫）　；　１１．　ＬＡ−ＲＢ７３（腫瘍）：１２、　ＬＡ−ＲＢ１２５（腫瘍 ）　；　１３．　ＬＡ−ＲＢ１１２（腫瘍）　；　１４．　ＬＡ−ＲＢ１５７（ 腫瘍）　ｉ　１５．０ＳＶ（骨肉腫）　；　１６．　ＬＡ−ＲＢ９４（腫瘍）　 ；　１７゜ＬＡ−ＲＢ７０（腫瘍）　；　１８．　Ｙ−７９（腫瘍）　；　１９ ．　ＬＡ−ＲＢ６９Ａ（腫瘍）；２０、　ＬＡ−ＲＢ６９Ａ−Ｆ（繊維芽細胞） 　；　２１．　ＬＡ−ＲＢ９９（腫瘍）　；　２２゜ＲＢ−１２０Ｆ（平衡ノド れた転位であル４６．　ＸＸ、　ｔ　ｆｌＯ，１３］　［ｑ２２　；　ｑ１４］ をもった繊維芽細胞）、　図４は正常なヒト繊維芽細胞、ヒトの正常及び不死化 した網膜細胞、網膜芽腫、及びそれらの繊維芽細胞からとったポリアデニル化Ｒ ＮＡのノーザンプロット分析である。レーン１、ポリＡ−ＲＮＡ；２゜正常ヒト 胎児網膜細胞ｉ　３　、　ＡＤ　５　／ＨＥＲＡ（アデノウィルス５で不死化し たヒト網膜細胞）　；　４　、　ＬＡ−ＲＢ１２１１Ｂ　；　５　、　ＬＡ−Ｒ Ｂ１６５　；　６．　ＬＡ−ＲＢ７４　；　７．０Ｈ５−５０；　８．　ＬＡ− ＲＢ７３　；　９゜ＬＡ−ＲＢ１５７　；　１０．　Ｏ５Ｖ　；　１１．　ＬＡ −ＲＢ９４　；　１２．　ＬＡ−ＲＢ７０　ｉ　１３゜Ｙ−７９；　１４．　Ｌ Ａ−ＲＢ６９Ａ　；　１５．　ＬＡ−ＲＢ６９Ａ−Ｆ（繊維芽細胞）；１６、　 ＬＡ−ＲＢ１３３　ｉ　１７．　ＬＡ−ＲＢＩＩＯ；　Ｉｌｌ、　ＬＡ−ＲＢ１ ６０　；　１９．　ｌ５１（繊維芽細胞）　ｉ　２０．　ＬＡ−ＲＢ９９゜図５ はＲｂの染色体遺伝子座のＨｉｎｄｍ制限地図を示している。 図６はヒトの乳腺腫瘍からとった染色体ＤＮＡのＨｉｎｄｍ分解物のサザンプロ ット分析・レーンＡ、　ＢＴ−５４９（浸潤性の管ガン、ヒトの乳腺腫瘍）　； 　Ｂ、　Ｔ−４７Ｄ（乳房、管癌、胸膜浸出液）　ｉ　Ｃ，ＤＵ４４７５（転移 性の皮膚小節、乳腺−ヒト）；Ｄ、　ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−■（乳腺、管ガン 、ヒト）；Ｅ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト、乳腺、アデノカルシノーマ）　； 　Ｆ、　ＨＳＯ３７１１Ｔ（管ガン、乳腺、ヒト）　；　Ｇ、　ＺＲ−５−３０ （乳１１．ｆン、ヒト）；Ｈ％ＢＴ−４１１３（管ガン、乳腺、ヒト）　；　Ｉ 　、　ＭＤＡ−ＭＢ−４１５（アデノカルシノーマ、乳腺、ヒト）　ｉ　Ｊ　、 　ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳腺ガン、ヒト）　；　Ｋ、　ＭＤＡ−ＭＢ１５７（ 乳腺ガン、ヒト）。 図７はヒトの乳腫瘍と繊維肉腫からのＨｉａｄｍ分解された染色体ＤＮＡのサザ ンプロット分析、レーンＡ−には図６と同じであり、レーンＬ　、　ＭＲＭＤＡ ２３１　；　Ｍ、　５Ｗ６１３　；　Ｎ、　ＭＣＦ−７（乳ガン、ヒト）　ｉ　 ０．　ＨＳ９１３Ｔ（繊維肉腫）　ｉ　Ｐ　、　ＭＤＡＭＢ４６１　ｉ　Ｑ、Ｉ ＪＤＡＭＢ４３６゜ 図８は４種のヒト腫瘍に検出された構造の異常を要約したものを模式的に表わし たものである。Ｒｂ＝網膜芽腫、Ｏ３；骨肉腫、ＨＭＴ　＝ヒト乳腺腫瘍、ＦＳ ＝繊維肉腫。 図９Ａは網膜芽腫遺伝子の染色体上の座の模式図。Ｈｉｎｄ■に対する制限酵素 切断部位は５’　−３’線の上に示されておりＥｃｏＲＩのそれは５’　−３’ の線の下に示されている。斜線の箱はエクソンを含んだＨｉｎｄＩｆｆ断片を表 わしている。制限断片の長さの多形性を示す酵素切断部位または領域は矢印で示 している。 ＶＮＴＲは可変数の縦に並んだくり返し部。点線は十分解明されていない領域を 表わしている。 図９Ｂは図２Ａの制限酵素地図から推察される重複しているバクテリアのファー ジクローン。 図９０はバクテリアのファージクローンからのＲｂ染色体座のＤＮＡのいろいろ な位置と大きさのサブクローンからＰＧＥＭプラスミドベクターにサブクローン 化された。 図１ＯはＲｂ染色体座の仮定上の位置、斜線部はエクソンを示す、エクソン−イ ントロンの結合部をカバーするヌクレオチド配列の一部が上と下に示されている ０診断上の目的のためには、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの対ａ及びｂがイントロ ンの５’　−３’配列に従って合成されるだろう。 図１１はＲｂ染色体の仮定的な領域での変異を診断する目的に対するＲＮＡ５ｅ 保護検査法の適用、（ｉ）正常人または患者の組織からとったＤＮＡをエクソン に隣接したプライマーａとｂを使って増幅する１（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを変 性させ、そしてこの場合には増幅されたＤＮＡより長い放射能ラベルしたりボヌ クレオチドプロープと混合する；（川）混合された核酸は接合し、それからＲＮ ＡａｓｅＡで分解される。ＲＮＡプローブの一本鎖部分は分解されるが二本鎖と なったＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはされない；（ｉｖ）二本鎖のハイブリッド は一本鎖のＲＮＡとＤＮＡに変性され、それからゲル電気泳動によって分離され る；（Ｖ）ゲルをＲＮＡ分子の大きさを表わすためにＸ線フィルムに曝す、ＤＮ Ａの由来は次の通りである。Ａ、正常人；Ｂ、オリゴヌクレオチドプライマーａ 及びｂの隣り合った領域にある欠損または一塩基変異をもった腫瘍組織；Ｃ，Ｂ にある患者の構成細胞；Ｄ。 ａ及び／またはｂを含む欠損をもつ腫瘍組織ｉＥ、Ｄにおける患者から採った構 成的細胞。 これらの図面は必ずしも尺度を示していないし、本発明の特徴が尺度において誇 張されているだろうし、また明らかにすることと具体性のために模式化されてい る。 ■崖皇里止 この技術に通じた者にとってはこの発明の目的や精神からはなれることなく、こ こに開示した発明についているいろな置きかえや修正ができることが容易に明ら かである。 本発明の内容は標的とする組織から抽出したＤＮＡに対して網膜芽腫遺伝子のプ ローブをハイブリダイズし、そしてそのＤＮＡへのプローブの結合を測定するス テップを含む網膜芽腫の発生する素地を検出する方法である。その結合はハイブ リダイズするプローブの量を定量する。構造の変化すなわち制限断片の長さの多 形性を決定する、結合したプローブをＰＣＲ法で増幅してその産物を測定すると いったいろいろな方法で測定できる。 望ましい内容において、プローブはｉｔ［ｉｌ！され、ハイブリダイズされる分 子中の標識の量を定量することによってハイブリダイゼーションが測定される。 この技術に通じた者はハイブリダイゼーションそれ自体あるし＼はハイブリダイ ゼーションの産物を測定するのに多くの分子生物学的方法が用いられることを容 易に認識しよう。 多種類の腫瘍が網膜芽腫遺伝子の構造的欠陥をもっていることが分ってきた。こ のことは網膜芽腫自体の他に骨肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫、小細胞肺ガン、黒 色腫細胞系統、乳腺腫瘍というような腫瘍にもみられる。網膜芽腫遺伝子の欠陥 をもった腫瘍は次のようなステップを含む方法で検出される。すなわち、標的組 織から抽出したＤＮＡに網膜芽腫遺伝子のプローブをハイブリダイズし、そのＤ ＮＡへのプローブの結合を測定する。例えば、網膜芽腫では腫瘍自体構成的な細 胞では欠失したＲｂ遺伝子は一つだけであるけれども染色体にはＲｈ遺伝子に相 方とも欠陥がある。 すなわち、Ｒｂ遺伝子プローブを用いれば網膜芽腫の腫瘍を形成する素地がある 患者を検出する能力を提供していることは明らかである。 標的組織は検出すべき患者から得られ、それからＤＮＡが抽出される試料となる 。採取され１分析される組織のタイプには制限はない０例えばその組織は腫瘍、 血液、繊維芽細胞、皮膚、あるいはその他の正常組織でも胎児から成人までその 組織から採ることができる。 もう一つの内容として、一本鎖ＤＮＡを得るために染色体の全ＤＮＡを変性し、 その一本鎖ＤＮＡを網膜芽腫遺伝子プローブと接触させ、少くとも一部のヒト網 膜芽腫遺伝子を含んだ染色体ＤＮＡを検出するのにそのハイブリダイズしたＤＮ Ａ−プローブを同定するということを含むヒト網膜芽腫遺伝子の少くとも一部を コードしている染色体ＤＮＡを検出する方法がある。 さらに別の内容には網膜芽腫遺伝子に特異的な少くとも１つのｃＤＮＡプローブ でそのｃＤＮＡプローブが標的細胞からとったｃＤＮＡとハイブリダイズすると き網膜芽腫遺伝子の有無を示すのに効果的なようなｃＤＮＡプローブを含む網膜 芽腫の素地をみつけるための診断用キットが含まれている。さらに加えてその内 容には少くとも一つの対照となる細胞がその特異性と反応性を測定するために含 まれている。そのキットの内容には包装や用法の説明も含まれている。 この技術に精通する者はいろいろな標識されたマーカーが網膜芽腫プローブとと もに用いられることを容易に認識しよう、これらのマーカーは放射性であり、蛍 光性であり、あるいは酵素的でありうる。さらに、この技術に通じるものはまた 、標識したプローブを使わないその他の方法がハイブリダイゼーションを測定す るのに使えることを認識するだろう０例えば、制限断片長の多形性を調べること 、ＰＣＲ法で増幅すること、ＲＮＡアーゼＡでの分解、対立形質特異的なオリゴ ヌクレオチド検出法などがある。 Ｒｈ゛の Ｒｈ染色体遺伝子座は少くとも２００ｋｂの長さがある。その染色体座の制限地 図は図９に示されている０点線は完全に解析されていない領域を表わしている。 染色体の遺伝子座の残りの部分はバクテリオファージのλＥＭＢＬ　３とλｆｉ ｘで構築されたヒト染色体ライブラリーから分離された。染色体遺伝子座に対す るこれらのファージクローンの関係は図９に示されている。染色体座には少くと も２０のエクソンがある。これらのエクソンは図９に示されているように１２の Ｈｉｎｄｍ制限断片の中に位置している。エクソンを含んだ制限断片はプラスミ ドベクターのｐＧＥＭ　４とｐＧＥＭ　２の中にサブクローン化されている。　 Ｈｉａｄｍの切断部位は５’−３’の線の上に示され、ＥｃｏＲＩの部位はその 下に示されている。斜線のついた箱はエクソンを含んだｌｉｎｄｍ切断ＤＮＡ断 片を表わしている。その断片は網膜芽腫遺伝子に対する４、　６ｋｂのｃＤＮＡ プローブに含まれている。ＨｉｎｄＩＩ［またはＥｃｏＲｒで分解したＤＮＡを 標識したＲｈのｃＤＮＡクローンとハイブリダイゼーションを行うと斜線で示し た箱によって表わされるいろいろな旧ｎｄｍＤＮＡＩＦｒ片が示される。これら の断片を含む全体の構造変化が検出される。 リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮＡアーゼＡ）分解法−ごく少ないヌクレオチドが関 わる小さな欠落や単一塩基での変異は通常サテンプロット法では検出できないだ ろう、これらの変化はりボヌクレアーゼＡ　（ＲＮＡアーゼＡ）分解法で検出で きる。 Ｒｂ染色体座のエクソンにおける構造的な欠陥が不活性化の最もおこりやすい原 因であるので最初の診断はこの領域に向けられている０図９に示されるように、 斜線をつけた箱のどれもがエクソンを含んだＨｉｎｄｌｌｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を 表わしている。この断片の夫々の中には一つあるいはそれ以上のエクソンが存在 している。エクソンの全数は２０を超えるものと思われる。 ＲＮＡアーゼ分解法を適用するためには、何対かのＤＮＡオリゴヌクレオチドが 合成される（図１Ｏ）、これらの対はエクソンの対でもまたは各エクソンの周り に隣り合った領域からのものでもよい、エクソン中の変異についてＤＮＡ試料を 分析するために、少量のＤＮＡ試料をこの二つのオリゴヌクレオチドａ及びｂと 混合する。混合物をパーキン−エルマー・シータス社のＧｅｎｅＡｍｐ　ｏＤＮ Ａ増幅システムを使ってポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）にかける、この方法は二 つのオリゴヌクレオチドによって隣り合わされたＤＮＡの選択的増幅を行う、増 幅されたＤＮＡは変性され、それからこの領域を含むＲｈ染色体遺伝子座のサブ クローンから合成された放射性物質で標識された一本鎖のりボヌクレオチドとハ イブリダイズされる。ハイブリダイズした物はそれからＲＮＡアーゼＡによる分 解にかけられる。正常人から増幅されたＤＮＡから成る反応が対照として分析さ れる。 分解産物はゲル電気泳動によって分画され、放射活性のりボヌクレオチドの大き さがＸ線フィルムに感光させることによって検出される。正常人から増幅された ＤＮＡに相応する放射性のＲＮＡプローブのヌクレオチド配列はＲＮＡアーゼＡ による分解からは護られている。保護されたＲＮＡ断片のＦｏ（図１１）のサイ ズが標準として用いられる。 腫瘍性のＤＮＡ試料では、二つのオリゴヌクレオチドの側にある領域の中に起っ ている欠失はそのハイブリッドを分解して二つの小さな断片Ｆ１とＦ２にするこ とができる（図１１Ｂ）、構成的な細胞では二つの断片はもし変異がＲｈ対立形 質の一つに起っていたとすれば検出することができる（図１１Ｃ）、オリゴヌク レオチドａ及びｂの一つまたは相方に含まれる欠失をもった腫瘍ＤＮＡ試料では 、ＤＮＡの増幅ができない、それ故、ＲＮＡプローブは保護されない（図１１Ｄ ）、構成的な細胞を使うときは問題である。そのような場合には、欠損した領域 の近くにある別の対のオリゴヌクレオチドプライマーを探さねばならないだろう 、これらの方法によってＲｈ遺伝子に変異がみつけられると、その発端となった 人の直接装態について同じ検出法を適用することができる。祖先の系図がわかっ ている場合には、変異した対立形質を含む染色体の分離はＲＦＬＰを検出できる Ｒｂ遺伝子に酵素とプローブを使うことによって同定できる。 制限酵素地図長の多形性（ＲＦＬＰ）を用いた結合の研究−与えられた酵素で頻 度高く多形性を示す少くとも四つの領域がＲｂ染色体遺伝子座には存在する。そ れらは領域１におけるＫｐｎ　１、領域２におけるＨｉｎｄＩＩ［、領域４にお けるＴｔｈＩ［Ｉ　１及び領域３における多くの酵素である。領域３はＶＮＴＲ （可変数縦列レポート）領域で酵素Ｒ５ａ　１は多形性を検出するのに特に有効 である。これらの酵素で生成されたＤＮＡ断片は示された領域からのＤＮＡプロ ーブとハイブリダイズされるとき大きさの異なる多形性を示す、これらのＲＦＬ Ｐによって決められる与えられたＲｂ対立形質の分離は家族の中で網膜芽腫の分 離と発生について比較されよう。 ＲｂのｃＤＮＡ　ＤＮＡ　ｏ−ンについての　゛クローニングの基本的戦略には Ｒｈ遺伝子の座である１３ｑ１４．１領域についてプローブを使って染色体を一 つ一つ確めることがある。高度に反復した配列をもたないランダムプローブを１ Ｂ染色体に特異的なライブラリーのＬＬ１３ＮＳＯ１から分離した。　１３ｑ１ ４．１領域に属するこれらのクローンを同定するために二つのハムスター−ヒト 雑種細胞（３Ｂ６と２ＤＩ２）が用いられた。これらの細胞株はともに１３　ｑ 　１４．１領域に関連した１個の欠損をもった１Ｂ染色体をもっている。 雑種細胞３Ｂ６は１３　ｑ　１４．１から１３ｑ１４．３までの染色体欠損をも った細胞株３２Ｔを用いて作ら九たが、一方２Ｄ】２は１３ｑ１４．］１から１ ３　ｑ　２２．３までの欠損をもった１Ｂ染色体を含んでいる。　１３ｑ１４， １から１３ｑ１４．３までの染色体領域の中にＤＮＡ挿入部を含んだクローンを プローブとしてその挿入部を用いて３Ｂ６及び２Ｄ１２からのＤＮＡとハイブリ ダイゼーションしないことによって同定した。Ｆ２−４２とＦ３−８の二つの別 のプローブが同様な戦略の下で得ることができる。さらに、ＥｓＤとＲｈの両遺 伝子座が１３　ｑ　１４．１にあるので完全な長さをもったＥｓＤのｃＤＮＡク ローンも単離し、プローブとして使える。 １３ｑ１４．１に位置しているこれらプローブはどれも遺伝子上を二方向に進行 させる（ウオーキングさせる）出発点として使用された。この種々のプローブに よって多くの数のクローンが分離された。興味あることに、これらプローブの一 つ、Ｆ３−８はいくつかのファージやコスミドのライブラリーには存在しないこ とがわかった。おそらくは、それは簡単に脱落する領域にあるためで、従ってそ れは、より短かい制限酵素断片を検出するのに使われる。第１Ａ図は異なる制限 断片のクローンを重ねることによって得られたこの領域の制限酵素地図を示して いる。得られたクローン夫々の挿入された長さは染色体の転写物に対して、その クローンをハイブリダイズすることによって特定された。 驚くべきことに、プローブＰ　Ｇ　４−４が単離されたが、それはＦ３−８のご く近くに位置し、ハムスターの配列とハイブリダイズした。このヒトとハムスタ ーの間で配列が保たれることはＰ　Ｇ　４−４が遺伝子のクローニング配列を含 んでいることを示唆した。ＰＯ２−４をいくつかの不死化したヒトの胎児性網膜 細胞株のｍ　ＲＮ　Ａプロットとハイブリダイズさせると、４．６キロベース（ Ｋｂ）のｍＲＮＡを示した（第１Ｂ図）、その最大の長さは４．６Ｋｂであった 。第２Ａ図はこのｃＤＮＡクローンの制限酵素地図を示している。 図に示されているように、このクローンの極性はｍ　ＲＮ　Ａプロットに対して 一木調特異的ブロープをハイブリダイズすることによって決められた。ＰＯ２− ４にあるエクソン配列は、このｃＤＮＡの５′末端の近くのＨｐａｌ及びＥｃｏ ＲＶ部位の間に位置することがわかった。４．６Ｋｂプローブのヌクレオチド配 列は表１に示されている。 （以下余白） 表　１ ＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡ　ＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡ　ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣ ＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧ　ＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣ Ｔ　ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡ　ＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧ ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧ　ＴＴＴＧＡＡＧＡ ＡＡ　ＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡ ＡＡＴＴＡＡＡ　ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴ　ＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧ２１０　２２０ 　２３Ｇ　２４０ ＡＧＡＧＡＧＣＴＴＧ　ＧＴＴＡＡＣＴＴＧＧ　ＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴ　ＣＡＴ ＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＧ　ＧＧＡＧＧＴＴＡＴＡ　ＴＴＣＡＡＡＡ ＧＡＡ　ＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＴ　ＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴ　 ＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴ　ＧＡＣＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴ　ＣＡＣＴ ＴＴＴＡＣＴ　ＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡ　ＡＡＡＡＣＡＴＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＧ ＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴ　ＴＴＡＡＣＴＴＡＣ丁　ＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡ ＴＡＣＣＡＧＴＡ　ＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡ　ＴＡＡＴＧＣＴＡＴＧ　ＴＣＡＡＧ ＡＣＴＧＴ４５０　４６Ｇ　４７０　４８０ ＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡ　ＴＧＡＴＧＴＡＴＴＧ　ＴＴＴＧＣＡＣＴＣＴ　ＴＣＡ ＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡ　ＴＧＴＧＡＡＣＴＴＡ　ＴＡＴＡＴＴＴ ＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＴＡＴ　ＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴ　Ａ ＡＡＴＴＣＴＧＣＡ　ＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧ　ＧＡＴＣＡ ＣＴＴＴＴ　ＴＴＡＴＴＡＧＣＴＡ　ＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡＴ Ｇ　ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧ丁ＴＡＡＴＧＣ ＴＡＴＧＴＧ　ＴＣＣＴＴＧＡＣＴＡ　ＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＡＣ ＣＴＣＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴ　ＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧ　ＴＡＴＡＡＡＡＣＡＧ　 ＣＴＧＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＴＡＡＴＧＧＴ　ＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣ ＣＣＡＧＨＣＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡ 　ＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡ　ＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡ８１Ｇ　８２０　８３０　８４ ０ ＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡ　ＡＡＴＴＣＴＣＴＧＴ　ＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧ　ＡＡＴ ＧＴＡＡＴＡＴｆ１５０　１１６０　８７０　８８０ ＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧ　ＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴ　ＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡ　ＴＴＴ ＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＡＴＴ　ＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴ　ＴＧＴＡＡＣＡ ＴＣＴ　ＡＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＡ　ＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴ　 ＡＡＡＣＧＡＴＡＣＧ　ＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡ９７０　９Ｂ０　９９０　１００ ０ ＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴ　ＡＡＡＧＡＴＣＴＡＧ　ＡＴＧＣＡＡＧＡＴＴ　ＡＴＴ ＴＴＴＧＣＡＴｌｏｌｏ　１０２０　１０３０　１０４０ＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡ 　ＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴＡ　ＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧ１０５０ 　１Ｇ６０　１０７０　１０８０ＡＡＡＣＡＣＡＧＡＧ　ＡＡＣＡＣＣＡＣＧＡ 　ＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡ１Ｇ９０　１１００　１１１０　 １１２０ＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡ　ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴ　 ＴＡＧＧＡＣＴＧＴＴＩＨＯ１１４０１１５０１１６０ ＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡ　ＴＣＣＡＡＣＡＡＴＴ　ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴ　ＴＴＡ ＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡ　ＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡ　ＡＡＴＣＴＧＡ ＴＴＴ　ＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡ　 ＡＡＧＡＡＡＧＴＡＴ　ＡＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＡ　ＴＡＧＧ ＡＴＡＣＡＴ　ＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧ　ＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＴＧ ＧＡ　ＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧ　ＴＣＧＡＡＡＴＴＧＧ　ＡＴＣＡＣＡＧＣＧＡＴ ＡＣＡＡＡＣＴＴＧ　ＧＡＧＴＴＣＧＣＴＴ　ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＡ　ＧＴＡＡ ＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＡ　ＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡ　ＧＡＡＣＧＡＴＴ ＡＴ　ＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＡＡＡ　ＣＴＴＣ丁ＧＡＡＴＧ　Ａ ＣＡＡＣＡＴＴＴＴ　ＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＧＴ　ＧＣＧＣＴ ＣＴＴＧＡ　ＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧ　ＧＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴ　ＣＴＴＧＡＴＴＣＡＧ　ＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＴＣ ＴＴＴＣＣＣＡ　ＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡ　ＡＴＧＴＧＣＴＴＡＡ　ＴＴＴＡＡＡ ＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＴ　ＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴ　ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＴ 　ＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＴ　ＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡ　ＡＴＧ ＡＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＣＧ１６５Ｇ　＋６６０　１６７０　１６８０ ＡＴＧＴＧＡＡＣＡＴ　ＣＧＡＡＴＣＡＴＧＧ　ＡＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧＧ ＣＴＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴ　ＴＡＴＴＴＧＡＴＣＴ　ＴＡＴＴＡＡＡＣ ＡＡ　ＴＣＡＡＡＧＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＡＣＣＴＴ ＧＡＡＴＣＴＧ　ＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴ１７７０　１７８Ｇ　１７９０　１１１ ００ＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴ　ＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡ　ＡＴＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧ ＣＡＧＡＴＡＴＧｌｇｌｏ　１８２０　１８３０　１ｇ４０ＴＡＴＣＴＴＴＣＴ ＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡ　ＡＡＡＧＧＴＴＣＡＡ１８５０ 　１ｇ６０　１８７０　１１１８ＯＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴ　ＡＡＡＴＴＣＴＡＣ Ｔ　ＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧ　ＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣ１ｇ９０　１９００　１９１ ０　１９２０ＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴ 　ＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣ丁ＧＴＴＴＴＡＴＡＡ　ＡＡＡＡ ＧＴＧＴＡＴ　ＣＧＧＣＴＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴ　ＡＡＡＴＡＣＡＣ ＴＴ　ＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡ　ＴＴ ＡＧＡＡＣＡＴＡ　ＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣ ＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡ　ＴＧＡＡＣＴＣＡＴＧ　ＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣ２ ０９０２１００２１１θ　２１２０ ＡＴＴＴＧＧＡＣＣＡ　ＡＡＴＴＡＴＧＡＴＧ　ＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴ　ＡＴＧ ＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧ　ＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＴＡＡＡＴＴＣ ＡＡ　ＡＡＴＣＡＴＴＧＴＡ２１７０　２１８Ｇ　２１９０　２２００ＡＣＡＧ ＣＡＴＡＣＡ　ＡＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴ　ＣＡＧＧＡＧＡＣ ＡＴＴＣＡＡＡＣＧＴＧＴ　ＴＴＴＧＡＴＣＡＡＡ　ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴ　Ａ ＴＧＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＣＧＧ　ＴＣＴＴＣＡ ＴＧＣＡ　ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴ　ＴＧＣＡＧＴＡＴＧＣ ＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧ　ＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡＴＡ　ＣＣＴＣ ＡＣＡＴＴＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＴＴ２３７Ｇ　２３１＋０ 　２３９０　２４００ＣＣＴＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＡＣＧＧＡＴ　ＴＣＣＴＧ ＧＡＧＧＧ　ＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＴ　ＧＡＡＧＡＧＴＣＣ Ａ　ＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴ　ＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡ　ＡＣ ＡＡＡＡＡＴＧＡ　ＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡ２４９０　２５ ００　２５１Ｇ　２５２０ＧＴＡＴＣＡＡＴＴＧ　ＧＴＧＡＡＴＣＡＴＴ　ＣＧ ＧＧＡＣＴＴＣＴ　ＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡ　ＴＣＡＧＡＴ ＧＧＴＡ　ＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧ　ＡＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴ 　ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡ　ＧＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣＴＧ２６１Ｇ 　２６２０　２６３０　２６４０ＡＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＴ　 ＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡ　ＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡ　ＡＣＡＴ ＣＴＣＣＣＡ　ＧＧＡＧＡＧＴＣＣＡ　ＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧ ＣＡ　ＧＡＡＡＴＧＡＣＴＴ　ＣＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡ ＧＣＡＧＡＡＡＡ　ＴＧＡＡＴＧＡＴＡＧ　ＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＴＣＡＡＡＣ ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧ　ＡＧＧＡＴＣＴＣＡＧ　ＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧ 　ＧＡＣＡＣＴＧＴＧＴ２ｇ１０　２８２０　２８３０　２８４０ＧＣＡＣＣＴ ＣＴＧＧ　ＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴ　ＧＴＧＡＣＴＧＴＡＴ ２Ｂ５０　２１１６０　２８７０　２８８０ＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡ　ＧＧＴＴＣ ＴＧＴＴＴ　ＡＴＧＧＣＣＡＣＡＴ　ＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴ２＋１９０　２９０ ０　２９１０　２９２ＯＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴ　ＴＧＴＧＧＡＴＡＴＡ　ＡＡＡ ＴＧＴＧＣＡＧ　ＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴ２９３０　２９４Ｇ　２９５０　２９６ ０ＴＴＧＧＧＴＧＡＴＴ　ＣＣＴＡＡＧＣＣＡＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴ　ＡＧＴ ＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＡＡ　ＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴ　ＣＴＴＧＴＧＴ ＡＡＡ　ＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＴＧ　ＴＡＧＣＡＧＡＴＴＧ　 ＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡ３０５０　３０６０　３０？０　３ ０８０ＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴ　ＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧ　ＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣ ＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴ　ＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧ 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　ＡＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧＧＴ　ＴＡＧＧＣＡＴＴＡＡ　ＴＧＴ ＴＴＣＴＡＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡ ＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡ　ＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣ ＣＣＴＡＣＡ　ＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧ　ＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴ ＧＡ　ＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴ　ＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴ　ＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡ ＴＡＧＧＧＧＡＴＡ　ＴＴＴＡＡＧＧＴＡＧ　ＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧ　ＣＴＴＴ ＴＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＧ　ＣＣＴＡＡＣＴＣＡＧ　ＡＡＴ丁ＡＴＴＴ ＴＴ　ＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＴＴＧＴ　ＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡ　Ａ ＡＴＴＴＴＡＴＴＴ　ＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡ　ＡＣＴＴＡ ＣＴＡＴＴ　ＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡ　ＴＴＴＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＣＴ Ａ　ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡ　ＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡ　ＴＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧ ＣＡＴＧＡＡＴＡ　ＴＣＡＴＡＣＡＡＡＴ　ＣＡＧＴＴＡＧＴＴＴ　ＴＴＡＧＧ ＴＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＣＴＡＴ　ＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴ　ＴＴＴＧＣＴＡＣＴ Ａ　ＡＧＴＴＣＡＣＡＴＴ４４１０　４４２Ｇ　４４３０　４４４０ＡＧＡＡＴ ＴＡＧＴＧ　ＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴ　ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡ　ＧＡＧＡＴＣＧＴ ＧＴＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴ　ＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴ　ＧＣＴＴＣＡＧＡＴＡ　Ｔ ＴＡＴＴＧＣＴＴＴ４４９０　４５００　４５１０　・　４５２０ＡＴＴＧＣＴ ＴＴＴＴ　ＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴ　ＡＡＡＡＣＴＧＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴ ＧＣＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＴ　ＴＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴ４５フ０　４５１１０ ＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴ　ＴＡＧＴＴＧＴＴＡＧ　３’このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプロー ブは、少くとも２０のエクソンから成っている。すなわち、この大きなプローブ から多数の小さなプローブ（断片）を作ることができる。さらに、この技術に通 じた者はこのプローブの誘導体、例えばいくつかの単一塩基対をなくした配列あ るいは変えた配列を効果的なプローブとして働かせることも認識しよう。 Ｒｈ遺伝子の５′末端の一部は染色体のクローンから失われている。プロモータ ーと第一のエクソンの一部を含むこの部分が表２に示されている。 表２ ５′ ＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧ　ＡＴＴＡＧＣＡＧＡＴ　ＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧ　ＣＧＧ ＧＧＣＣＣＧＡ５０　６０　Ｔｏ　！１０ ＧＡＧＴＣＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＡＴＡＧＧＧ　ＡＴＧＡＧ ＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴ　ＴＴＧＴＡＴＡＧＣＣ ＣＧＴＴＡＡＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴ　ＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧ　ＴＴＣＴ ＧＧＧＴＡＡ　ＡＡＧＡＣＧＴＣＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧ　ＧＡＴＧＣＣＴＣ ＣＴ　ＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣ ＴＴＴＡＡＴＴ　ＣＣＴＣＡＴＧＡＣＴ　ＴＡＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧ ＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣ ＧＧＧＣＣＣＧ　ＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧ　ＡＣＧＴＧＡＧＣＧＧ　ＣＧＧＧＣＧ ＧＡＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＧ　ＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴ　 ＣＡＧＴＴＧＣＣＧＧ３７０　３１１０　３９θ　４００ ＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧ　ＧＣＧＣＧＴＣＣＧＧ　ＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧ　ＧＧＧ ＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴ　ＧＴＡＡＣＧＧＧＡＧ　ＴＣＧＧＧＡＧ ＡＧＧ　ＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ　 ＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧ　ＣＧＣＴＣＣＴＣＡＣ４９（１５（ｔｏ　５１０　５２ （Ｉ ＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＧＧτＣＣＣＣＧＧ　ＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＡ ＴＧＣＣＧＣＣＣＡＡＡＡ　３’ 染色体のクローンでは表１と表２は１表１の塩基１が表２の塩基５２７であるよ うに連続している。 このデータは、５′末端と０ｐａ１部位の間にＧＣに冨んだ領域があることを示 している。このＧＣに冨んだ領域から作られるプローブに対してサザンプロット のハイブリダイゼーションすると、きまって染みのようなパターンを与えた。 Ｒｈに用いられるプローブは、ある腫瘍のタイプあるいは腫瘍タイプのもつサブ セットにあるＲｈ遺伝子において構造的な変化があるかないかを確める方法を提 供している。 それ故、ある腫瘍がＲｈ遺伝子に欠陥があるかないかに基づいた治療に対してい るいろに応答することがあり得る。 また、Ｒｂ遺伝子の機能的な損失が腫瘍の発生に必須であるので、これらの腫瘍 をその遺伝子または遺伝子産物を細胞の中に加える、または戻すことによって治 療することも可能であろう。 ０ン　ロー　に 標的となる組織、例えば、腫瘍、血液、繊維芽細胞、あるいはその他の正常組織 からＤＮＡを抽出する。このＤＮＡはいろいろな制限酵素によって別々に分解さ ｈる。その制限酵素断片を電気泳動によってアガロースゲルで分離され、変性さ れ、そしてニトロセルロース濾紙に転写される。 Ｒｈ遺伝子の標識したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを濾紙上のＤＮＡ断片とハイブリ ダイズさせる。望ましい実施例においては、この標識は放射性で濾紙がＸ線フィ ルムに感光させる。 もしｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンが推定されたＲｈ遺伝子であるとすると１３　ｑ　 １４．１領域にみられる欠落をもったものを含む網膜芽腫のＤＮＡについて構造 的な異常性を検出しなければならない、網膜芽腫から採った染色体ＤＮＡの構造 を分析するためには、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブで検出されるよく分離される制限 酵素断片を生み出す酵素をみつける。ために制限エンドヌクレアーゼ探索が行わ れた。　Ｈｉｎｄｍが４．７３　ｋ　ｂのｃＤＮＡクローンのサブクローンによ って検出される正常ヒトＤＮＡのよく分離された制限断片を生成した。ｃＤＮＡ プローブに検出される染色体性のＨｉｎｄＩ［Ｉ制限断片の順序は第２Ｂ図に示 されている。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブが用いられるのでエクソンを含む制限断片の構造的な変 化だけが検出されよう、非常に小さなエクソンを含む制限断片の構造上の変化は 検出できないだろう、このことはエクソンまたはエクソンの結合部分での点変異 あるいは非常に小さな欠落についてもそうであろう。 しかしながら、これらの限界があっても、Ｒｈ遺伝子の一部分または全てを含む 構造的な変化が観察される。これらの構造上の変化のいろいろな形を表３にま上 めた。 表　３ ＬＡ−ＲＢ１２１１Ｂ　欠損　ホモ接合型の全欠損　なしＬＡ−ＲＢ１６５　一 方向性　ホモ接合型の３′欠損　なしＬＡ−ＲＢ７４　二方向性　ホモ接合型の 内部欠損　異常ＬＡ−ＲＢ１５１　二方向性　ホモ接合型の内部欠損　ＮＤ”０ Ｈ３−５０二方向性傘　ホモ接合型の内部欠損　異常ＬＡ−ＲＢ１２５　一方向 性　１対立形質の内部欠損　ＮＤＬＡ−ＲＢ９９　一方向性　１対立形質の内部 欠損　異常ＬＡ−ＲＢ１１２　一方向性　１対立形質の全欠損　ＮＤＬＡ−ＲＢ １５７　二方向性　１対立形質の全欠損　なしｏＳｖ　初代の骨肉腫　１対立形 質の全欠損　異常ＬＡ−ＲＢ６９Ａ　二方向性　検出できず　なしＬＡ−ＲＢ７ ３　二方向性　検出できず　なしＬＡ−ＲＢＩＩＯ二方向性　検出できず　なし ＬＡ−ＲＢ１３３　二方向性　検出できず　なしＬＡ−ＲＢ１６０　一方向性　 検出できず　なしＬＡ−ＲＢ９４　一方向性　検出できず　異常ＬＡ−ＲＢ７０ 　一方向性　検出できず　減少Ｙ−７９二方向性　検出できず　異常 中　二方向性の網膜芽腫の患者の骨肉腫＋　決定されていない 実施例１ ４０例の網膜芽腫患者と同じ患者の繊維芽細胞から採ったＤＮＡなサザンプロッ ト分析で検査した。この分析をするために、０．９ｋｂと３．８ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ断片をベクターＰＯＥＭ−４の中にサブクローン化した（第２Ａ図）、いろい ろな制限エンドヌクレアーゼで消化された網膜芽腫から分離された染色体ＤＮＡ なサザンプロットするとＰＧＨ２（ＥｃｏＲＩ　Ｏ，９ｋ　ｂ）とＰ　Ｇ　３． ＩＩＭ　（ＥｃｏＲＩ　３．８　ｋ　ｂ）の二つのサブクローンから作られたプ ローブとハイブリダイズした。いくつかの網膜芽腫からのポリアデニル化したＲ ＮＡもこれらのプローブで分析された。 二つのＲｂ対立形質が不活性化される機構の一つはｒｆｉＩＲｂ対立形質の全部 あるいは部分的な欠損である０両対立形質の全欠損の例は二方向性の網膜芽腫患 者から採った腫瘍ＬＡ−ＲＢ１２８Ｂにみられる。この患者の繊維芽細胞を高分 解能のバンド検出法で細胞遺伝学的に解析し１３　ｑ　１４．１から１３ｑ１４ ．３までの１３染色体における欠損が観察された。残りの１３染色体は正常にみ えた。この観察に一致して、Ｒｈの制限断片の強度が繊維芽細胞においては外観 的にインタクトのＲｂ遺伝子座について単一コピーの存在が示されたにすぎない （第３Ａ図及び第３Ｂ図のレーン３）、１３ｑ１４，１領域の上と下の１３染色 体プローブを用いたＲＦＬＰ解析研究はＰ１１３染色体とも腫瘍に存在している ことを示した。しかしながら、Ｒｂ遺伝子座の両射立形質は失われている（第３ Ａ図と第３Ｂ図、レーン２）、すなわち、この患者では一つのＲｈ対立形質の欠 落が第−及び第二の変異で関与していた。予想されるように、Ｒｈの転写は腫瘍 ではみつけられなかった（第４図、レーン４）。 ＬＡ−ＲＢ　１６５は部分的な欠損の一例を示している。この腫瘍は一方向性の 病気の患者から採取された。第３Ｂ図のレーン４に示されるように旧＋＋ｄｍの ９．８ｋｂ、６．２ｋｂ、２．ｌｋｂの断片がなくなっている。残りのＲｂ断片 の強さは変性したＲｂ座の１コピーのみが存在することを示している。すなわち 、この腫瘍ではＲｈ遺伝子の１対立形質が全部欠失して、もう一つが３′末端で 欠損している。第３Ａ図と第３Ｂ図のレーン５に示されるように、明らかにイン タクトのＲｂ遺伝子座の２コピーが繊維芽細胞には存在している。 このことは体細胞（すなわち標的の網膜芽細胞）に二つの異なる変異が起ったこ と、すなわちこの網膜芽腫患者の一方向性（非遺伝性の）状態と一致している結 果を意味している。 Ｒｈの転写はこの腫瘍ではみられなかった（第４図、レーン５）。 Ｒｂ遺伝子の全体の構造的な欠落と、その不活性化の間の相関関係はこの領域に 対するＲｈ遺伝子の役割と一致しているが、ホモ接合型の全体が欠損あるいは共 通の３′の欠損はＲｈ遺伝子がこの領域の下流であるという可能性は除けない、 Ｒｈ遺伝子を確証する決定的な証拠は他の腫瘍とであろう、事実二つの網膜芽腫 と一つの骨肉腫で、そのような欠損があることがみつけられた。 第一の例の腫瘍ＬＡ−ＲＢ７４は二方向性の網膜芽腫患者から採られた。第３Ｂ 図のレーン６に示されるように、？、５ｋｂのＨｉｎｄｍ制限断片が失われてい る。新たに１コピーの４−１ｋｂバンドが検出された。この腫瘍ではＲｂ転写は ４，４ｋｂにまで大きさが減り、失われた７、５ｋｂのＨｉｎｄｍ断片に存在す るエクソンの欠落と一致している（第４図、レーン６）、同じ患者の繊維芽細胞 の制限パターンは第３Ｂ図、レーン７に示されている。正常な？、５ｋｂと変性 した４、１　ｋ　ｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片が夫々１コピーずつ存在することは、 この患者がこの領域で生殖系列の欠損があることを示している。 ホモ接合型の内的欠損の第二の例は、これも二方向性の網膜芽腫患者から採った 腫瘍ＬＡ−ＲＢ　１５１に見られる。　ＲＦＬＰ研究によりＲｈ遺伝子座の上と 下の両方の１Ｂ染色体のプローブが繊維芽細胞ではへテロ接合型であり腫瘍細胞 中ではホモ接合型になっていることが示された。腫瘍においては９゜１１ｋｂの Ｈｉｎｄｍの２つのコピーとも失われ、新たな８．ＯｋｂのＨｉｎｄｍ断片が存 在した（第３Ｂ図、レーン８）、繊維芽細胞の９．８ｋｂのＨｉｏｄｍ断片の濃 さから判断して（第３Ｂ図、レーン９）、我々は９．８　ｋ　ｂのＨｉｎｄＩ［ Ｉ断片の単一コピーだけが繊維芽細胞にあったと結論している。 第三のホモ接合型内部欠損の例は骨肉腫ＯＨ５に見られた。この腫瘍は以前に網 膜芽腫の病歴をもっている患者から得られた。第３Ｂ図、レーン１０かられかる ように、７．５ｋｂのＨｉｎｄｍの断片が失われている。７．５ｋｂ断片に対す る少量のパフクグラウンドハイプリダイゼーションがみられるのは、ごくわずか 混入した正常細胞によるものと思われる。興味あることに、ＯＨ５もＬＡ−ＲＢ ７４も？、　５　ｋ　ｂのＨｉｎｄ■断片が欠失し、先の切られた転写をしてい るのに、ＯＨ５でのＲｈ遺伝子の転写は３，９ｋｂに減っていて（第４図、レー ン７）、これはＬＡ−ＲＢ７４のそれよりも小さい（第４図、レーン６）。 腫瘍ＬＡ−ＲＢ１２５は一方向性の突発性の網膜芽腫患者からのものである。第 ３Ｂ図、レーン１２に示されているように、１コピーだけの７，５ｋｂ　Ｈｉｎ ｄｍ断片があり、残りのＲｈ遺伝子が２コピーであるのと対照的である。明らか にＲｂ対立形質の１つは？、５ｋｂ領域において内部的欠損がある。 ＬＡ−ＲＢ９９はＨｉｎｄｍの９．１１　ｋ　ｂ断片に関する内部的欠損がＲｈ 対立形質の１つに検出される一方向性の網膜芽腫のケースから採られた（第３Ｂ 図、レーン２１）、その代りに新しい同じ７．５　ｋ　ｋの断片が生成している 。７．Ｏｋｂと正常の大きさの４．７ｋｌ＋の二つの別の大きさの転写がその腫 瘍に検出されている（第４図、レーン２Ｇ）、これらのケースはいずれも１Ｂ染 色体の１つにのみ異常が検出された。 Ｒｈ対立形質の一つが全部欠損している三つの腫瘍が（第３Ａ図と第３Ｂ図）の レーン１３．１４．１５に示されている。 レーン１３のＬＡ−ＲＢ１１２は一方向性の突発性疾患の患者から、レ−ン１４ ノＬＡ−ＲＢ１５７）に方向性ノ症例カー　ラ、Ｌ／　−ン１５　ノＯ８ｖは網 膜芽腫の病歴はわかってし１なし＼患者の骨肉腫である。これらの例の全て一つ だけの、明ら力）Ｉこ正常なＲｈ遺伝子座が残されている。ＬＡ−ＲＢ１５？） こｌ±殆んど、あるしＸ）ま全＜Ｒｂの転写が検出されない（第４図、レーン９ ）、し力）しｏＳｖでは先の切れた４、２ｋｂのメッセージカ；検出されてしＸ る（第４図、レーン１０）。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの極＜５１−末端部でＧＣの富んだ領域ののびているところがあ ることで染色体の遺伝子座の解析を複Ｍ）こしている、もし、１４．５ｋｂのＨ ｉｎｄＩＩＩ断片（第２Ｂ図）力（Ｒｂ遺伝子の最初のエクソンを含んでし鳥る と仮定すれ！ｆ、網膜芽朧の場合のいくつかは５′部分の欠損をもってνする。 し力為し、もし１４．５　ｋ　ｂのＨｉｎｄｍ断片の前をこＩＥＩの／１１さな エクソンがあるとすれば、これらの場合は内部欠損のさら）こ９ｊの例を表わす ことになろう。 ４０の網膜芽腫の約６０％がＲｈ遺伝子をこ外観上の構造変イヒな示していない 、これらの腫瘍グループをこおし１てＩま、　Ｒｈの転写発現にいろいろな異常 が観察されてν＼る０例え１１、次の５つの腫瘍のどれもがＲｂ転写を発現して し＼なし蒐、すなわち、二方向性の網膜芽腫ＬＡ−ＲＢ７３　（第４図、レーン ８）、ＬＡ−ＲＢ６９Ａ（第４図、レーン１４）、ＬＡ−ＲＢ１３３（第４図、 レーン１６）、異常は全て１Ｂ染色体がホモ接合型である。二方向性腫瘍ＬＡ− ＲＢ１１０（第４図、レーン１７）、これ！まＲｂ遺伝子座の上流及び下流の１ Ｂ染色体の多形性プローブ１こりν＼てヘテロ接合型である。そして一方向性の 腫瘍ＬＡ−ＲＢ１６０（第４図、レーン１８）、これはやはり染色体の１３　ｑ 　１４領域に位置している１３染色体プローブ７０２に対してホモ接合型になっ ている。 他の場合でも異常な転写がみられている０例えば、一方向性の症例の１３染色体 についてホモ接合型のＬＡ−ＲＢ９４は全体として構造的変化を示していない（ 第３Ａ図及び第３Ｂ図、レーン１６）が少量の明らかに、より大きなＲｂ転写が ある（第４図、レーン１１）、これはおそらくは最終の転写に小さなイントロン が含まれるような切り口が失われたためと思われる。ＲｂのＤＮＡ座に外観的変 化がないＬＡ−ＲＢ７０（第３Ａ図及び第３Ｂ図、レーン１７）は正常な大きさ のＲｂ転写の量が減っている（第４図、レーン１２）、最後に今日最も一般的に 用いられる網膜芽腫細胞系統であるＹ７９は４．２ｋｂの先のとれたＲｂ転写が 減っていることが一致してみられている（第４Ｂ図、レーン＋３）、　Ｌかしな がら、このプローブでは全体のＤＮＡ変化はみられていない、おそらくはまだ検 出されてない欠損がＲｈ遺伝子座に起こっているのだろう。 網膜芽腫の前歴のある患者からの骨肉腫でもホモ接合型の内部欠損と先のとれた Ｒｂ転写がみられた。これらのデータはＲｈ遺伝子が網膜芽腫と骨肉腫の内方の 発症をになっているという考えと一致している。大部分の腫瘍がＲＮＡレベルで Ｒｂ遺伝子を発現していないという観察は、Ｒｂ遺伝子の劣性の性質と腫瘍の発 病をになう両Ｒｈ対立形質の機能のそう夫であるという主張に強い支持を与えて いる。 調査した全ての内部欠損の場合について、常に７．５ｋｂまたは９．８ｋｂのＨ ｉｎｄｍ断片がその欠損に関係していた。１コピーのＨｉｔ＋ｄｍ７．５ｋｂ断 片がＲＢ１２ＯＦ繊維芽細胞において変えられていることがみつけられた（第３ Ｂ図、レーン２２）、この繊維芽細胞株は染色体領域の１３ｑ１４と１０　ｑ　 ２２に関してバランスのとれた転位が起こっている二方向性網膜芽腫患者からの ものであった。新しい６．５　ｋ　ｂのバンドが代わりに検出された。これらの Ｒｂ遺伝子座の領域が欠損あるいは転位を予見させる特定の構造を含むかどうか はまだ調べられていない。 このデータとＬＡ−ＲＢ１２８Ｂ、　ＬＡ−ＲＢ７４及びＬＡ−ＲＢ１５１もＫ ｎｕｄｓｏｎの２打撃仮説の立証を提供した。二方向性のケースでは最初の打撃 を表わすＲｈ遺伝子座での変異は繊維芽細胞では容易に検出され（第３Ｂ図、レ ーン３，７．９）、第二の打撃が腫瘍にみられた（第３Ｂ図、レーン２，６．８ ）、一方向性の場合のＬＡ−ＲＢ１６５では２つの変異、すなわち３′の欠損と 全欠損が腫瘍にだけ見られる（第３Ｂ図、レーン４）が、繊維芽細胞ではみられ ない（第３Ｂ図、レーン５）。 実施例２ 網膜芽腫遺伝子がある種のヒト乳腺腫、ヒト黒色腫、肺の小細胞癌、軟組織肉腫 、繊維肉腫においても同様に不活性化されることが観察されている。これらの観 察は、これらの患者の細胞中の網膜芽腫遺伝子の欠陥を検出するための基本とな っている。 用いたヒト乳腺癌細胞株は米１３ｉ！標準株集積所（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手した。用いた技法は網膜芽 腫について先に述べたとおりであった。 染色体Ｒｂ座（第５図）はＨｉｎｄｍと５ａｉｌ制限断制限台むエクソンとして 示されている。そのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンはプローブの合成のために二つの部 分に分割される。第６図は１１種のヒト乳腺腫から採った染色体ＤＮＡのＨ４ｎ ｄＩ［［消化物のサザンプロット分析を示している。見られるようにＡ、　Ｃ。 Ｅ、Ｇ、にのこれら腫瘍の中の５つがこの領域で構造の変化を示している。第７ 図は第６図にある１１試料と１種の繊維肉腫株〔レーン０〕を含む１６種のヒト の乳腫細胞腫からの染色体ＤＮＡの旧ｎｄｍ消化物のサザンプロット分析を示し ている。 第７図からみられるように、さらに加えて構造上の変化がみられる。さらに、ヒ ト乳腫瘍株（レーンＡ）と繊維肉腫株（レーンＯ）がＲｈ遺伝子座のこの部分に 構造変化を示している。 構造的な変化の要約を第８図に示した。エクソンを含んだ旧ｎｄｍ断片が上に示 され、一方その構造変化が下に示されている。７．５ｋｂのＨｉｎｄｍ断片領域 での内部欠損が多くの試料に容易に観察される。 この領域におけるホモ接合型の内部欠損に加えて、他のタイプのホモ接合型の内 部欠損、すなわちホモ接合型の３′欠損や増幅、あるいはこれらの組み合わせな どもみられる。 ヒトの乳腺腫におけるこれらの構造変化は網膜芽腫にみられるものと著しい類似 性をもっている。サザンプロット分析を用いてみると１９のヒト乳腺腫の中の９ 種、ヒト黒色腫１種、ＡＴＣＣ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−５、骨肉腫２種、繊維肉腫 １種が構造の変性を示した。それ故構造の変化した乳腺腫細胞株の比率は網膜芽 腫のそれと同じである。 実施例３ 腫瘍細胞と構成的細胞について診断を行った。腫瘍の材料が使える場合には、ま ずＲｂ遺伝子における構造的な欠陥についてこれまでに記した手法の一つ、ある いは全てを用いて検査した。一旦変異が確認されるとその変異した領域に検診の 努力を注力し、そして構成細胞に適応した。−例では旧ｎｄＩ［Ｉの７．５ｋｂ ＤＮＡ断片の二つのコピーともＬＡ−ＲＢ７４の腫瘍ＤＮＡからなくなっている 。この構造的欠陥は患者の構成細胞では旧ｎｄｍ７．５ｋｂの１コピーがなくな っているので構成細胞に内在している。それ故、祖先の直系における網膜芽腫や 関連の症病の発生させうる素性を診断するためには、Ｈｉｎｄｍの７，５ｋｂＤ ＮＡ断片があるかないかを検出することに向けられよう。 腫瘍の試料がない場合にはＲｂの構造上の変性を検出することが構成細胞につい て行われる。さらに加えて、網膜芽腫か骨肉腫の前歴がある場合には、多形性の Ｒｈ対立形質が内在していることについて調査し、そして家族のＲｂ腫瘍の場合 と比較される。 Ｒｈ遺伝子座の中にある構造の変化が網膜芽腫の約４０％と、いくつかの二方向 性の患者の繊維芽細胞において特別のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンで容易に検出され たという事実はこのプローブを生前診断において有用にしている。この技術に通 じる者は完全な染色体遺伝子座が分析され、そして多くのプローブや方法論が利 用できるようになるので、かなり多くの異常が検出されることになるということ を容易に認識しよう。 このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブは腫瘍のＬＡ−ＲＢ７４．　ＬＡ−ＲＢ１５１．　 ＬＡ−ＲＢ１２ｇＢあるいは繊維芽細胞株のＲＢ１２ＯＢが由来する患者のよう なＲｈ遺伝子の構造的な異常がみられる両親をもった家族での胎児診断にすぐに 利用されよう、もし同様な変化が胎児の細胞にみつけられれば、これは胎児がＲ ｈに感受性の遺伝子を受けついでいることを示している。そのような胎児は殆ん ど確実に網膜芽腫を起こすであろうし、もし妊娠が時期に達すれば後年その他の 悪性化、特に骨肉腫になる危険が非常に高いであろう。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブは腫瘍のＩ、Ａ−ＲＢ７４．　ＬＡ−ＲＢ１５１．　Ｌ Ａ−ＲＢ１２ｇＢや、あるいは繊維芽細胞株ＲＢ１２ＯＦが採取された患者のよ うなＲｂ遺伝子の構造上の異常が検出される両親をもつ家系の生前診断には直ち に有効であろう、もしも同じような変化が胎児の細胞にみられれば、その胎児は Ｒｂになりやすい遺伝子を受け継いでいることを示す、そのような胎児は殆んど 確実に網膜芽腫をおこし、その他の悪性化、特に骨肉腫については、もし妊娠期 が終えたなら後年非常に高い危険性をもっているといえよう。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはまた、一方向性の突発性Ｒｂがあるが不幸にしてこの病気の遺 伝型をもっているような患者の１５％とみなされている人達を見つけることがで きる。 Ｒｈ遺伝子は上述の腫瘍の発生に重要であることは明らかである。遺伝子の欠陥 の検出にＲｈ遺伝子のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを使うことが、それ故にヒトの乳 癌、メラノーマ、骨肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫あるいは小細胞肺癌等を含むそ の他の悪性化について行われよう。 この技術に通じた者は本発明が上記された、あるいはまたここに内在している目 的を実施し、その目的と利点を得るためによく適応されることを容易に評価でき ょう、ここにある方法、技法等は望ましい内容をいま代表して表わしたもので、 例示のつもりであり、従ってこれによってこの展望に制限するつもりはない、以 下に示す特許請求の範囲で規定されるこの発明の精神に包含されるような変更や 他の用途は、この技術分野に通じた者にとって行うことができよう。 （以下余白） １４．５　１．２　＋、５　６．０　５．３　４．５　７．５　５．３　９．８ 　６．２　２．１噂　１　１　：＆ へ Ｐ　μ目１ 国　Ｉ　ｌ５１ ０”　１３１ニ −　−■１ ＦＩＧ、８ ○　〒ｍ− 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．網膜芽腫遺伝子のプローブを検査すべき組織から抽出したＤＮＡにハイブリ ダイズし；そのＤＮＡとのプローブの結合を測定するステップを含む網膜芽腫の 発生の素地を検出する方法。
2. ２．検査すべき組織が非腫瘍性の組織である請求項１の方法。
3. ３．検査すべき組織が胎児の組織である請求項２の方法。
4. ４．網膜芽腫のプローブが標識されている請求項１の方法。
5. ５．網膜芽腫遺伝子のプローブを検査すべき組織から抽出したＤＮＡとハイブリ ダイズし；そのＤＮＡとのプローブの結合を測定するステップを含んだ網膜芽腫 遺伝子の欠陥をもった腫瘍を検出する方法。
6. ６．その腫瘍が網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫、黒色腫、肺の小細胞 癌、及び乳癌から成る群から選ばれる請求項５の方法。
7. ７．一本鎖ＤＮＡを得るために変性させる条件下に全染色体ＤＮＡを処理し；そ うして得られた一本鎖ＤＮＡを網膜芽腫遺伝子のプローブと接触させ；そしてそ うして作られたハイブリダイズしたＤＮＡ−プローブ結合体を少くとも一部はヒ トの網膜芽腫遺伝子をもった染色体ＤＮＡを検出する目的で同定するステップを 含む少くとも一部のヒト網膜芽腫遺伝子をコードしている染色体ＤＮＡを検出す る方法。
8. ８．網膜芽腫遺伝子に特異的な少くとも一つのｃＤＮＡプローブで、そのＤＮＡ プローブが検査すべき細胞からとったＤＮＡとハイブリダイズするとき網膜芽腫 遺伝子の有無を示すのに有効であるような網膜芽腫の発生の素地を検出するため の診断用キット。
9. ９．さらに少くとも一つの対照試料を含む請求項８のキット。
10. １０．さらに包装や使用法を含めた請求項８のキット。
11. １１．網膜芽腫遺伝子にハイブリダイズできるそのクローンが約４．６ｋｂまで のｃＤＮＡクローン。
12. １２．網膜芽腫遺伝子にハイブリダイズし、請求項１１のｃＤＮＡクローンのＥ ｃｏＲＩ断片であるそのプローブが約０．９ｋｂのｃＤＮＡプローブ。
13. １３．網膜芽腫遺伝子にハイブリダイズし、請求項１１のｃＤＮＡクローンのＥ ｃｏＲＩ断片であるそのプローブが約３．８ｋｂのｃＤＮＡプローブ。
14. １４． 【配列があります】 の配列をもつｃＤＮＡ配列及びそれからえられる網膜芽腫遺伝子のエクソンの一 つの少くとも一部をコードしている断片または誘導体。
15. １５．請求項１４のｃＤＮＡ配列またはその断片あるいは誘導体を検査すべき組 織から抽出したＤＮＡにハイブリダイズし；その結合を検出するステップを含む 網膜芽腫遺伝子の検出法。
16. １６．網膜芽腫遺伝子プローブをその腫瘍から抽出したＤＮＡにハイブリダイズ し；網膜芽腫遺伝子の腫瘍の治療がその存在の有無に左右される場合に、そのプ ローブのＤＮＡに対する結合を測定するというステップを含んだ腫瘍の治療法を 決める方法。