PT88425B - Processo para a preparacao de proteinas t4 soluveis - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a sequências de DNA, moléculas de DNA recombinante e processos para a produção de proteínas T4 solúveis. Mais particularmente, a presente invenção ref£ re-se a sequências de DNA que são caracterizadas pelo facto de codificarem, na expressão em um hospedeiro unicelular apropriado, para formas solúveis de T^, o receptor na superfície de linfõcitos T₄ ⁺ ou seus derivados. De acordo com a presente invenção , as sequências de DNA, moléculas de DNA recombinante e processos desta invenção podem ser utilizados para produzir T₄ solúvel essencialmente isenta de outras proteTnas de origem humana. Esta proteína solúvel pode, depois, vantajosamente ser utilizada em composições imunoterapeuticas, profilácticas e de diagnóstico e em métodos da presente invenção.

As composições imunoterapeuticas baseadas em proteTnas

T^ solúveis e os métodos da presenta invenção são utilizáveis no tratamento de doentes imunodeficientes que sofram de doenças pr£ vocadas por agentes infecciosos cujos alvos primários são os 1i£ fõcitos T₄ ⁺. De acordo com uma forma de realização preferida , a presente invenção refere-se a composições que contêm proteínas

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Τ₄ solúveis e a métodos que são utilizáveis na prevenção, tratamento ou detecção do síndroma da imunodeficiencia adquirida, com plexos relacionados com a SIDA e infecção de HIV.

ESTADO DA TÉCNICA

A classe de células imuno-reguladoras conhecidas como 1 iji focitos de células T pode ser dividida em duas grandes classes fuji cionais, compreendendo a primeira classe células indutoras ou aux^ liares - que regulam a proliferação de células T, a libertação de linfoquina e as interacções de células auxiliares para libertação de Ig e compreendendo, a segunda classe células supressoras ou citotõxicas - que participam na eliminação regulada de células T e supressão de resposta imune. Em geral, estas duas classes de 1i£ focitos distinguem-se pela expressão de uma das duas glicoproteinas de superfície: T^ (peso molecular 55000 - 62000 daltons) que é expresso em células indutoras ou auxiliares, provavelmente como uma proteína monomerica ou Τθ (peso molecular 32000 daltons) que é expressa em células supressoras ou citotoxicas T como uma proteína dimérica.

As estruturas primarias de T^ e Tg foram deduzidas a partir das respectivas sequências de cDNA [P. J. Maddon et al. , The isolation and Nucleotid Sequence of a cDNA Encoding the T Cell Surface Protein T^: A New Member of the Immunogl obul in Gene Family, Cel1, 42, pags. 93-1 04 (1 985); D. R. Littman et al., The Isolation and Sequence of The Gene Encoding Τθ: A Molecule defifining functional Classes of T Lwmphocytes, Cel1, 40, pags.237-46 (1985)]. Ambas as sequências de proteínas citadas definem molécu

las com domínios esperados para antigenes de superfície, incluindo domínios de transmembranas e intracitoplasmicos na extremidade carboxilica da proteína. Alem disso, ambas as proteínas contem uma região terminal amino que apresenta uma impressionante homolo gia para imunoglobulina e regiões variáveis receptoras de células T e que podiam funcionar durante o reconhecimento de células alvo [ Maddon et al., supra].

Em indivíduos imunocompetentes, os linfocitos interactuam com outros tipos de células especializadas do sistema imune para conferir imunidade ou proteger contra infecção [ E. L. Reinherez e S. F. Schlossman, The Differentiation Function of Human T-cells, Cel 1 , 19, pags. 821 -27 (1 980)]. Mais especificamente, os linfocitos estimulam a produção de factores de crescimento que são críticos para um sistema imune funcional. Por exemplo , actuam para estimular células B, os descendentes de células de as_ cendencia hemopoiética, que promovem a produção de anticorpos defensivos. Também activam macrofagos (células assassinas) para atacai células hospedeiras infectadas ou células hospedeiras anormais , sob outro aspecto, e induzem monocitos (células necroforas) para cercar e destruir micróbios invasores.

Verificou-se que o alvo primário ou receptor de certos agentes infecciosos e a proteína de superfície T^. Estes agentes incluem, por exemplo, vírus e retrovírus. Quando os linfocitos são expostos a tais agentes, tornam-se não funcionais. Como consequência, o sistema de defesa imune complexo do hospedeiro Ó destruído e o hospedeiro torna-se susceptível a uma vasta gama de infecções oportunistas.

Essa imunossupressão foi observada em doentes que sofrem

do sindroma da imuno deficiência adquirida (SIDA). A SIDA é uma doença caracterizada pela imunossupressão aguda ou total e susceji tibilidade actual do hospedeiro a uma vasta gama de infecções e doenças oportunistas. Nalguns casos, a infecção da SIDA e acompa. nhada por perturbações do sistema nervoso central. A manifestação total clinica da SIDA e normalmente precedida pelo complexo relacionado com a SIDA (ARC), um sindroma que e acompanhado por sijn tomas, tais como, 1infadenopatia generalizada persistente, febre e perda de peso. 0 vírus da imunodeficiencia humana (HIV) retrc) vírus e considerado como o agente etiologico responsável pela infecção da SIDA e o seu precursor, ARC M. G. Sarngadharan et al., Detection, Isolation and contínuos Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS, Science, 224, pags. 497-508 (1984).

Entre 85 e 100% do teste da população AIDS/ARCS seropositiva para HIV G. N. Shaw et al., Molecular Characterization of Human T-Cell Leukemia (Lynphotropic) Virus Type III in the Acquired ImmuneDeficiency Syndrome, Science, 226, pags, 1165-70 (1984). 0 numero de adultos, nos Estados Unidos, infectados com HIV tem * Neste pedido de patente de invenção, utilizar-se-a a expre_s são vírus da imunodeficiencia humana (HIV), que e a designação genérica adoptada pelo subcomité de retrovírus humano de International Committee on Taxonomy of Viruses, para identificar os isolados independentes a partir dos doentes da SIDA, incluindo os vírus 1infotropicos de células T¹ humanas, do tipo III, (HTLV-III), vírus associados a 1infodenopatia (LAV), vírus da imunodef iciencia humana, do tipo 1, (HIV-1) e retrovírus associados A SIDA (ARV).

sido estimado entre 1 e 2,5 milhões D. Barnes, Strategies for an AIDS Vaccine, Science, 233 , pãgs. 1 149-53 (1986); M. Rees, The Sombre View of AIDS, Nature, 326, pãgs. 343-45 (1987) . Estas estimativas incluem 64900 indivíduos que não pertencem a um grupo identificado de risco para a SIDA S.L. Siyak and G.P. Wornser, How Common is HTLV-III Infection in de United States?, New Eng. J. Med., 313, pãgs. 1352 (1985) . A taxaiariual aparente de diagnostico para as pessoas infectadas com o vírus HIV esta compreendida entre 1 e 2% - uma taxa que pode aumentar significativamente nos próximos anos.

genoma do retrovirus, tal como HIV, contem tres regiões que codificam as proteínas estruturais. A região gag codifica pr£ teínas do núcleo do virião. A região pol codifica o DNA polimerase dependente do virião RNA (transeriptase inversa).

A Região env codifica a glicoproteína principal que se eji contra no revestimento da membrana do vírus e na membrana \citòplãsmica das células infectadas. A capacidade do vírus para se ligar aos receptores das células alvo e para proyocar a fusão das membranas de células estã relacionada coro duas propriedades do HIV controladas pelo gene env. Estas propriedades são aceites para se estabelecer uma regra fundamental na patogénese do vírus.

As proteínas env de HIV resultam de um polipeptido precur sor que, na forma madura, e cindida em uma proteína da membrana exterior glicosilada pesada de cerca de 481 aminoãcidos - gp 120e uma proteína de transmembrana mais pequena, coro cerca de 345 aminoãcidos, que pode ser glicosilada - gp 41 L. Ratner et al., Complete Nucleotide Sequence of de AIDS Virus, HTLV-III, Nature,

313, pags. 277-84 (1985). A variedade de hospedeiros do vírus HIV esta associada com células que produzem a glicoproteina de superfície. Essas células incluem linfócitos e células do cérebro P. J. Maddon et al., The Gene Encodes the AIDS Virus Receptor and is Expressed in the Immune System and the Brain, Ce 11 , 47, pags. 333-48 (1986), Após a infecção de um hospedeiro pelo vírus HIV, os linfócitos tornam-se não funcionais, A progressão dos síndromas SIDA/ARCS pode ser correlacionada com a de pleção dos linfócitos T₄ ⁺ que revelam a glicoproteína da superfí cie de-T^,' Esta depleção de células T com subsequente compromis^ so imunolÓgico pode ser atribuída a ambos os ciclos recorrentes de infecção e crescimento lítico a partir da propagação do vírus aumento mediado pelas células. Além disso, as observações clinicas sugerem que o vírus HIV e directamente responsável pelas perturbações do sistema nervoso central verificadas em muitos doentes com SIDA.

tropismo do vírus HIV para células T^⁺ ê aceite como sendo atribuído ao papel desempenhado pela glicoproteína da superfície das células como o receptor do vírus ligado ã membra. na. Porque as células se comportam como o receptor do vírus HIV, a sua sequência extracelular tem provavelmente uma acção di_ recta na ligação AO HIV. Mais especiftcamente, admite-se que o revestimento de HIV se liga seiectivamente ao(s) epítope(s) de T₄, utilizando esta interacção para iniciar a entrada na célula hospedeira A.G, Dalgelish et al., The CD^ (T^) Antigen is an Essential Component of the receptor for the AIDS Retrovirus , Nature , 312, pags, 763-67 (1984); D, Klatsmann et al,, T, - Lynphocyte T^ Molecule Behaves as the Receptor for Human Retrovirus LAV, Nature , 312, pags, 767-68 (1984), Por consequência, acre-7-

dita-se que a expressão celular de seja suficiente para ligação de HIV, com a proteína de servindo como um receptor para o vírus de HIV.

tropismo de do vírus de HIV foi demonstrado in vitro.

Quando o vírus de HIV isolado dos doentes com SIDA é cultivado em conjunto com linfócitos auxiliares T pré-seleccionados para a superfície de T^, os linfócitos são infectados de modo eficiente, provocam efeitos citopãticos incluindo formação de Synaytia mui tinuclear .e são mortos por crescimento litico D. Klatzmann et al., Selective Tropisme of Lynphadenopathy Associated Virus (LAV) for Helper - Inducer T Lynphocytes, Seience, 225, pãgs. 59-63 (1 984); F. Wong-Staal and R.C. Gallo, Human T-Lynphotropic Retro_ viruses, Nature, 317, pãgs. 395-403 (1985) . Foi demonstrado que uma versão de CDNA clonado de células humanas, quando expressas na superfície de células transfectadas a partir de estirpes de células não-T, incluindo células de murina e fibroblastroides, dota essas células com a capacidade de ligar HIV P.J. Maddon et al., The T₄ Gene Enclodes the AIDS Virus Receptor and is Expressed in the Immune System and the Brain, Cel1, 47, pags« 333-48 (1986) .

Durante o curso da infecção de HIV, o hospedeiro desenvol_ ve uma resposta imune humoval e uma resposta imune celular para o virus. Estas respostas incluem o aparecimento de anticorpos que ligam a um numero de produtos virais e que exibem efeito neutralizante ou funções citotoxicas celulares dependentes de anticorpos M. Guroff-Robert et al., HTLV-III - Neutralizing Antibodies in Pacients With AIDS and AIDS-Related Complex, Nature, 316, pãgs. 72-74 (1985); D.D.F. Barin et al., Virus Virus Envelope Protein

of HTLV-III Represents Major Target Antigen for Antibodies iri AIDS Patients, Seience, 228, pãgs.1094-96 (1985); A.H. Rook et al. , Sera from HTLV-III/LAV Antibody Positiye Individuais Mediate Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity Against HTLV-III/LAV Infected T Cells, J. Immunol., 138, pãgs. 1064-68 (1987) . Os Epitopes do revestimento de HIV foram identificados como determinantes importantes para extrair uma resposta neutralizante de anticorpo. E os determinantes na actividade (ADCC) de citotoxicidade celular dependente de anticorpo incluem env de HIV e, possivelmente, epitopes gag.

Não se dispondo de tratamentos eficazes para a SIDA, tem-se concentrado muitos esforços na preyenção da doença. Essas medidas preventivas incluem a pesquisa de anticorpos de HIV em todos os dadores de sangue, órgãos e sémen e a educação de grupos de risco elevado para a SIDA, em relação a transmissão da doença.

Tratamentos experimentais ou clínicos preyios da SIDA e das condições ARCS tem incluído a administração de drogas antivirais, tais como HPA-23, fosfonoformato, suramina, ribavirina, azidotimidina (AZT) e dideoxicitidina, que interferem aparentemente com a replicação do vírus através de inibição de transcriptase inversa. Embora cada uma destes fãrroacos exiba actiyidade contra HIV in vitro, apenas AZT demonstrou benefícios potenciais em experiências clinicas. Contudo, a administração de AZT em quaji tidades eficazes tem sido acompanhada por efeitos secundários indesejáveis e debilitantes, tais como depressão da medula Õssea. E obvio, por consequência, que a toxicidade hematológica seja um factor principal de limitação na utilização prolongada da AZT. Outros métodos propostos para o tratamento da SIDA foram realça-9-

dos no desenvolvimento de agentes que possuem actividade contra as fases no ciclo replicativo virai com excepção da transcrição inversa. Esses métodos incluem a administração de interferões ou a aplicação da tecnologia do hibridoma. A maior parte destas estratégias de tratamento são supostas requererem a co-administração de imunomoduladores, tais como a interleuquina-2.

Hoje, torna-se necessário o desenvolvimento de agentes e métodos imunoterapeuticos para o tratamento da SIDA, ARCS, infecção de HIV e outras imunodeficiencias provocadas pela depleção ou anormalidades dos linfócitos T.

Descrição da Invenção

A presente invenção soluciona os problemas referidos antes, proporcionando, em grandes quantidades, células solúveis e seus derivados solúveis que actuam como receptores para agentes infecciosos cujo alvo primário é a proteína de superfície de linfócitos T^⁺. Vantajosamente, esta invenção proporciona também células solúveis essencialmente livres de outras proteínas de origem humana e sob uma forma que não Ó contaminada por vírus, tais como os vírus HIV ou da hepatite B.

Como se vera na descrição que se segue, as sequências de DNA e as moléculas de DNA recombinante desta inyenção são capazes de dirigir, em um hospedeiro apropriado, a produção de células solúveis ou de derivados correspondentes. Os polipeptidos da presente invenção são eficazes quer quando produzidos no hospedeiro quer após subsequente derivação ou modificação, em uma variedade de composições imunoterapeuticas e métodos para tratamento de do-10-

entes imunodeficientes que sofrem de doenças provocadas por agentes infecciosos cujos alvos primários sáo os linfócitos T₄ ⁺. De acordo com varias formas de realização desta invenção, tais compt} sições e métodos relacionam-se com um receptor solúvel para HIV, proteínas de células solúveis e polipeptidos e anticorpos correspondentes . As proteínas de células solúveis e os polipeptidos desta invenção incluem formas monovalentes, bem como poliva lentes .

As composições e métodos desta invenção relativos a proteínas solúveis, polipeptidos ou peptidos e anticorpos correspondentes, são particularmente eficazes para a preyenção, tratamento ou detecção das infecções SIDA e ARC relacionadas com HIV. Mais especificamente, as composições e métodos desta invenção rel-ativc a células solúveis utilizam polipeptidos semelhantes a células solúveis - polipeptidos que interferem vantajosamente coro a interacção T^/HIV por bloqueamento ou mecanismos de ligação compe^ titivos que inibem a infecção de HIV de células que expressam a proteina de superfície de células T^. Estes polipeptidos semelhai! tes a células solúveis inibem a adesão entre linfócitos T^⁺ e — + agentes infecciosos os quais atingem linfócitos e inibem a . ~ 4- - interacçao entre linfócitos e antigenes que apresentam celulas e alvos de linfócitos T^⁺ mediadores de morte. Actuando como receptores de vírus solúveis, as composições da presente invenção podem ser utilizadas como agentes terapêuticos antivirais para inibir a ligação HIV a células T^⁺ e a formação de syncytium induzida de modo virai ao nível da ligação do receptor.

A presente invenção consegue estes objectiyos proporcionando sequências de DNA que codificam na expressão, em um hospe-11deiro unicelular apropriado proteínas solúveis* e derivados s£ lúveis correspondentes.

A presente invenção também proporciona moléculas de DNA recombinante que contem essas sequências de DNA e hospedeiros unj_ celulares transformados por elas. Esses hospedeiros permitem a produção de grandes quantidades de novas proteínas T₄ solúveis , polipeptidos, peptidos e derivados desta invenção para utilização numa larga variedade de métodos e composições terapêuticos, profj_ laticos e de diagnostico.

As sequências de DNA da presente invenção são seleccionadas do grupo que consiste em:

(a) inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380, pBG381 , p203-5, pBG391, pBG392, pBG393, pBG394, pBG395, pBG396, pBG397, P211-11, p214-10 e p215-7;

(b) As sequências de DNA que hibridizam uma ou mais das inserções de DNA referidas antes e que codificam na expressão pa_ ra um polipéptido semelhante a células solúveis; e * Neste pedidod de-patente de invenção, as designações proteína solúvel T/', célula solúvel e polipeptidos sem£ lhantes a células solúveis incluem todas as proteínas, proteí nas solúveis naturais ou recombinantes ou.derivados solúveis correspondentes e são caracterizados pela actividade imunoterapeutica (anti-retroviral) ou imunogénica de proteínas solúveis. Incluem compostos semelhantes a células solúveis de uma variedade de origens tais como proteínas solúveis derivadas de fo£ tes naturais, proteínas solúveis recombinantes e proteínas solúveis sintéticas ou semi-sintéticas.

(c) sequências de DNA que codificam na expressão para um polipeptido semelhante a células solúveis codificadas na expres^ são por uma qualquer das inserções e sequências de DNA referidas antes.

De acordo com uma forma de realização alternativa, a presente invenção descreve, também, uma sequência de DNA que compreende a inserção de DNA de p!70-2, inserção, que codifica na expre_s são para um polipeptido semelhante a T^. E, esta invenção também descreve moléculas de DNA recopbinantes e proces.sos para a produção de proteínas que utilizam essa sequência de DNA.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma auto-radiografia que representa a purifj, cação da proteína a partir de células 4937 mediante cromatogra_ fia de imunoafinidade.

A Figura 2 representa a auto-radiografia e os dados da mani cha de Western que demonstram que a proteína natural solubilizada, purificada por imunoafinidade se liga a proteína de revestj_ mento de HIV.

A Figura 3 representa a sequência nucTeõtida e a sequência de aminoácidos derivada de CDNA obtida a partir do clone 203-4 de PBL. Nesta figura, os aminoácidos são representados por codigos simples como se seguem:

Phe :	F	Leu :	L	Ile :	I	Met	: M
Vai :	V	Ser :	S	Pro :	P	Thr	: T
Ala :	A	Tyr :	Y	His :	H	Gin	: Q

Asn	: N	Lys :	K Asp	D	Glu :	E
Cys	: C	T rp :	W Arg :	R	Gly :	G
* =	posi ção	na qual	esta presente	um cÓdão	de paragem.

Na Figura 3 o início da translação da proteína í^ (AA_₂₃) esta localizado na metioniná nos nucleótidos 201-203 e o terminal N maduro está localizado na Li si na (AA3) nos nucleótidos 276-278·.

A Figura 4 ó uma representação esquemática da.construção dos clones pBG312. de cDNA (também chamados ρ171 -1 e pl70-2).

A Figura 5 é uma representação esquemática da construção do plasmideo pEClOO.

A Figura 6 representa comparações de aminoácidos nas posj_ ções 3,64 e 231 de vários clones de cDNA de T^.

As Figuras 7A e 7B representam a estrutura do domínio da proteína T^, purificada e de mutantes solúveis recombinantes.

As Figuras 8A-8D são representações esquemáticas de con_s truções de vários plasmideos intermédios e outros plasmideos uti. lizados para exprimir í^ solúvel recombinante (rs T^) de acordo com a presente invenção.

A Figura 9A é uma representação esquemática da construção do plasmideo p!99-7.

As Figuras 9B e 9C são representações esquemáticas da con^ trução do plasmideo p203-5.

A Figura 10 representa os ligantes dos oligonucleótidos

- _ ~ < sintéticos utilizados era varias construções de acordo coma preseji te invenção.

A Figura 11 descreve a sequência de nucleótidos do plasmí deo total definido por p!99-7 (P₂ routet. rs T^) e a' sua inserção rs T^. 2 e a sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequeji cia de rs T^. Isto inclui a fita (cassete) Clal-Clal que defi ne a sequência codificante de rs T^.2 perfeita Met.

A Figura 12 representa uma analise da mancha de proteina de uma indução da expressão de rs T^.2 a partir de SG936/ρ199-7.

A Figura 13 Ó uma representação esquemática da construção do plasmideo pBG368.

As Figuras 14A-14C são representações esquemáticas de con£ truções de vários plasmideos de acordo com a presente invenção.

A Figura 15 representa a sequência de nulceotidos do plas_ mTdeo pBG391.

A Figura 16 representa a sequência de nucleótidos do plas_ roideo pBG392. Nesta figura, o início da translação da proteina T₄ (AA_₂₃) ^estã localizado na roetionina nos nucleótidos 1207-1209 e 0 terminal N maduro está localizado na lisina (AA₃) no nucleõti_ do 1281-84.

A figura 17 é uma representação esquemática de construções de vários plasmideos de acordo coma presente invenção.

A Figura 18 descreve os ligantes dos oligonucleótidos siji teticos utilizados em varias construções de acordo com a presente invenção.

A Figura 19 representa a sequência de nucleotidos do pla£ rnideo pBG394.

A Figura 20 representa a sequência de nucleotidos do pla^ mídeo pBG396.

A Figura 21 representa a sequência de nucleotidos do plas_ mídeo pBG393.

A Figura 22 representa a sequência de nucleotidos do plas^ mídeo pBG395.

A Figura 23 representa um gel tingido de Coomassie de rsT^.2 purificado a partir do meio condicionado de BG380G da linha de cê lulas CHO transfectada por pBG380 do plasmideo pl96-10.

A Figura 24 é uma representação esquemática da construção do plasmideo p!96-10.

A Figura 25 ê uma representação esquemática da^construção do plasmideo pBG394.

A Figura 26 ê uma representação esquemática da construção do plasmídeo p211-11.

A Figura 27 e uma representação esquemática da construção do plasmideo p215-7.

A Figura 28 e uma representação esquemática da construção do plasmideo p218-8.

A Figura 29A representa um gel tingido de Coomassie de rsT^.113.1 purificado a partir do meio condicionado de E. coli transfectado de pBG211-ll.

A Figura 29Β é uma auto-radiografia que mostra uma análise da mancha de Western de rsT^.113.1 expressa em E. coli.

A Figura 30, painéis (a)-(c), representa a purificação do rs.l/.113.1 a partir de transformantes de E_. col i .

A Figura 31, painéis (a)-(c), representa a redrobagem de rs.T/.113.1 purificado.

A Figura 32 é uma auto-radiografia que mostra a imunoprecipitação de linhas de células CHO marcadas metabolicamente com 35

S que produzem solúvel recombinante.

A Figura 33 mostra uma análise da imuno-mancha de linhas de células C0S7 que produzem solúvel recombinante.

Na Figura 34 representam-se graficamente os resultados de um ensaio de competição entre rsT^.113.1 e rsT^.3 para se ligarem a 0KT₄A ou 0KT₄.

Nas Figuras 35-37 representam-se graficamente os resultados dos ensaios de competição entre rsT₄.lll e rsT₄«3 para se ligarem, respectivamente a 0KT₄A, Leu-3A e 0KT₄·

Na Figura 38 representa-se graficamente um ensaio ELISA para rsl/.113.1 a partir de transformantes de E. coli.

Na Figura 39 representam-se graficamente os resultados de um rádio-imunoensaio de p24 utilizando T₄ solúvel recombinante de acordo com a presente invenção.

Nas Figuras 40 e 41 apresentam-se os resultados dos ensaios de inibição de syneyti a, utilizando proteínas T₄ solúveis recombinantes de acordo com a presente invenção.

A Figura 42 e uma representação esquemática da construção do plasmideo pBiv. 1.

A Figura 43 representa a proteína solúvel recombinante bivalente produzida por pBiv. 1.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Isolou-se as sequências de DNA de acordo coro a presente invenção a partir de duas bibliotecas: uma Biblioteca de cDNA de 7gt derivada da linha de células tumorais T REX e uma biblioteca de cDNA de Xgt 10 derivada dos linfócitos do sangue periférico Porém, podia-se também ter utilizado bibliotecas preparadas a parti r de outras células que expressam T^. Estas incluem, por exemplo, Ηθ e U937. Pode-se também utilizar um banco genômico humano para isolar vários fragmentos do gene T^.

Para sondar estas bibliotecas, utilizou-se uma série de so_n das de DNA de oligonucleótidos anti-sensação sintetizadas quimica mente baseadas na sequência de proteínas T₄ descritas em Maddon et al .. (1 985), supra.

Para a sondagem, hibridizou-se as sondas de oligonucleoti dos com as bibliotecas de cDNA de acordo coro a presente invenção utilizando um ensaio de sondagem de hibridação de placas. Se-: 1eccionaram-se clones que se hibridizam com várias sondas de acordo com a presente invenção e após isolamento e subclonação das iji serções de cDNA dos clones seieccionados nos plasmideos, determinou-se as suas sequências de nucleotidos e comparou-se as sequências de aminoácidos deduzidas dessas sequências de nucleotidos para as sequências de aminoácidos referidas em Maddon et al. (1985), —1 8-

supra. Como um resultado destas comparações, determinou-se que todos os clones seieccíonados se caracterizavam por inserções de cDNA que codificam para sequências de aminoácidos de T₄ humano.

Representa-se na Figura 3 a sequência de nucleotidos de cDNA de de comprimento toai obtida a partir do clone deposita do pl70-2 e a sequência de aminoácidos deduzida a partir dela, Essa sequência de cDNA foi submetida subsequentemente a mutagen£ se dirigida ao local in vitro e a substituição do fragmento de restrição de forma a que a sua sequência de cDNA fosse idêntica a descrita por Maddon et al,

Apos a modificação da sequência de cDNA de de forma a ficar idêntica a de Maddon et al . , cortaram-se amostras em vários locais para remover as regiões de codificação dos domínios intra. citoplásmico e de transmembrana. As sequências de cDNA restantes codificaram uma T₄ solúvel que reteve a região extracelular considerada responsável pela ligação com HIV,

Construiu-se depois v-rios clones caracterizados por essas inserções de cDNA q-e codificam para T₄ solúvel humano, Essas sequências de cDNA podem ser utilizadas numa grande variedade de processos de acordo com a presente invenção. Mais em particular, essas sequências ou as suas porções óu copias sintéticas ou semi-sintêticas podem ser utilizadas como sondas de DNA para sondar outros cDNA humanos ou de animais ou bibliotecas genómicas para seleccionar por hibridação outras sequências de DNA queestão rela cionados com T₄ solúvel, Tipicamente, as condições de hibridação convencionais, por exemplo, cerca de 20° a 27° C abaixo de Tm são utilizadas nessas selecções. Porem, podem ser necessárias condi

ções menos severas quando a biblioteca e sondada com uma sonda proveniente de espécies diferentes das espécies a partir das quais a biblioteca deriva, por exemplo, a sondagens de uma biblioteca de ratinhos com uma sonda humana.

Essas inserções de cDNA, respectivas porções ou copias sintéticas ou semi-si ntêti cas podem também de ser utilizadas como materiais iniciais para preparar varias mutações. Essas mutações podem ser degeneradas, isto e, a mutação não altera a sequência de aminoacidos codificada pelo codão mutado, ou não degenerada , isto é a mutação altera a sequência de aminoacidos codificada pelo codão mutado. Ambos os tipos de mutações podem ser vantajosos na produção ou utilização de solúvel de acordo com a presente invenção. Por exemplo, estas mutações podem permitir maiores níveis de produção ou purificação mais fácil de solúyel ou maior actividade de T^.

Por todas estas razões, as sequências de DNA de acordo com a presente invenção são seleccionadas de entre o grupo que consis_ te em:

(a) inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380, pBG381, p203-5, pBG391 , pBG392 , pBG393, pBG394, pBG395 , pBG396 , pBG397 , p211-ll, p214-10 e p215-7;

(b) As sequências de DNA que se hibridizam com uma ou mais das inserções referidas antes e que codificam na expressão para um polipéptido semelhante a solúvel; e (c) As sequências de DNA que codificam na expressão pa_ ra um polipéptido semelhante a solúvel codificado na expressão

-20ί por qualquer uma das inserções e sequências de DNA referidas an- tes .

De preferência as sequências de DNA desta invenção codifi cam para um polipeptido escolhido de entre o grupo que consiste em um polipeptido da formula AA_₂₃ ’ AA peptido da formula 1-362 da Figura

AA362 da Figura 3, um poli3, um polipeptido da formula

Met -AA₁_₃₆₂ da Figura 3, um -pol i pepti do da formula AA-j _₃y^da Figura 3, um polipeptido da formula Met-AA-j _₃₇^da Figura 3, um ροΠ peptido da fórmula da Figura 3, um polipeptido da fórmula

Met-AA^_₃₇₇ da Figura 3, um polipeptido da formula AA_₂₃ ^374 da Figura 3, um polipeptido da fórmula AA_₂₃ da Figura 3 ou as porções correspondentes.

As sequências de DNA de acordo com a presente invenção co dificam, também, de preferencia, para um polipeptido escolhido do grupo que consiste em um polipeptido da formula AA__₂₈ ~AA-|₈₂ da Figura 16, um polipeptido da formula AA^ - A^₈₂ da Figura 16, um polipeptido da fórmula Met-AA-|_₁₈₂ da Figura 16, um polipeptido da formula AA_₂₃

- AA₁₈₂ da Figura 16 seguido pelos aminoãcidos asparagina-1eucina-glutaroina-histidina-serina-1eucina, um polipeptido da formula AA-j - AA-^ θ₂ da Figura 16 seguido pelos ami n£ ãcidos asparagina-1euci na-glutaroi na-histidina-serina-leucina, um polipeptido da formula Met-AA-j ^₈₂ da Figura 16 seguido pelos anri noãcidos asparagina-1eucina-glutami na-histidina-serina-leucina, um polipeptido da formula AA_₂₃ -AA-j q ₃da Figura 16, um polipeptido da formula AA^-AA^^ da Figura 16, um polipeptido da fórmula

Met-AA_{1 13} da

Figura 16, um polipeptido da formula AA_₂₃~AA₁₁₁ da

Figura 16, um polipeptido da fórmula AA^-AA^^ da Figura 16, um

polipeptido da formula Me t - AA -j _ -j -j -j da Figura 16, um polipeptido

da formula AA_₂₃ da Figura 16, um polipeptido da fórmula

AA^-AA^^ da Figura 16, um polipeptido da formula ΑΑ_₂₃ΑΑ·|da Figura 16, um polipeptido da fórmula AA^-AA^g da Figura 16, um polipeptido da fórmula Met-AA^^g da Figura 16, um polipeptido da formula ΑΑ_₂₃-ΑΑ^θ₆ da Figura 16, um polipeptido da fórmula AA-j -ΑΑ-]θθ da Figura 16, um polipeptido da formula Met-AA^^g da Figura 16, ou porções correspondentes.

Adicionalmente, as sequências de DNA desta invenção codificam para um polipeptido escolhido do grupo que consi-ste em um polipeptido da fórmula AA_₂₃~AA₃g₂ de proteína madura, um polipeptido da fórmula AA-j_₃g₂ da proteína madura, um polipeptido da formula Met-AA-]_₃g₂ de proteína T4 madura, um ípol i pépti do da fórmula AA|_₃₇₄ da proteína madura, um polipeptido da fórmula Met-AA-|_₃₇₄ da proteína madura, um polipeptido da fórmula AA^_₃₇₇ de proteína madura, um polipeptido da formula Met-AA^_₃₇₇ de proteína madura, um polipeptido da fórmula Met^^1-377 proteína madura, um polipeptido da fórmula AA ₂₃~

-AA₃₇^ de proteína madura, um polipeptido da fórmula AA_₂₃ de proteína madura ou as porções correspondentes.

As sequências de DNA de acordo coro a presente invenção também codificam para um polipeptido escolhido do grupo que con siste em um polipeptido da formula ΑΑ_₂₃-ΑΑ^θ₂ de proteína ma dura, um polipeptido da formula AA^-AA^g₂.de proteína madura, um polipeptido da fórmula Met-AA-j g₂ de proteína madura, um polipeptido da fórmula AA 23~^^182 P^ro^^e^^na Í4 madura seguido pelos aminoacidos asparagina-leucina-glutaroi na-histidi na-seri na-leucina, um polipeptido da fórmula AA^-AA₁₈₂ de proteína ma-22 dura seguido pelos aminoácidos asparagina-1eucina-glutamina-his-

ti di na-seri na-1 euci na, um polipeptido da formula Met-AA^ de proteína madura seguido pelos aminoácidos asparagina-leucina-gl utamina-histidina-serina-leucina, um polipeptido da fórmula aa_₂₃-aa₁₁₃ de proteína madura, um polipeptido da formula AA-j

-AA-j 1₃ de proteína madura, um polipeptido da formula Met-AA^11₃ de proteína madura, um polipeptido da fórmula AA_₂₃-AA-]ii de proteína madura, um polipeptido da formula AA^-AA^^ de proteína madura, um polipeptido da formula Met-AA^_^^ de pro teína T^madura, um polipeptido da fórmula AA de proteína madura, um polipeptido da fórmula ΑΑ^-ΑΑ·]₃-| de proteína ma dura, um polipeptido da formula Met-AA-jde proteina-T^ madura, um polipeptido da formula AA_₂₃-AA^g de proteína madura, um polipeptido da formula AA^AA^g de proteína madura, um polipeptido da fórmula Met-AA-j ^g de proteína madura um polipeptido da formula ΑΑ_₂₃-ΑΑ^₆θ de proteína madura um polipeptido da formula ΑΑ^-ΑΑ^θθ de proteína madura, um polipeptido da formula Met-AA^^g de proteína madura ou as porções correspondentes .

aminoácido de amino-terroinal de proteína T₄ madura isolado a partir de células T começa na lisina, o terceiro aminoácido da sequência descrita na Figura 16. Por consequência, as proteínas T₄ solúveis também incluem polipeptidos da fórmula AAg-AA₃j7 da Figura 16 ou as porções correspondentes. Esses polipeptidos incluem polipeptidos escolhidos do grupo que consiste em um polipeptido da fórmula AAg a AA₃g₂ da Figura 16, um polipeptido da formula AA₃ a AA₃?^ da Figura 16, um polipeptido da fórmula

AA₃~AA-|g₂ da Figura 16, um polipeptido da formula AAg-AA^₃ da Fi

-23gura 16, um polipeptido da formula AA^-AA^] da Figura 16, um poAAg-AAq^s da Figura 16, um polipeptido da

Figura 16 e um polipeptido da fórmula AA^As proteínas solúveis também incluem os antes precedidos por um grupo metionina N-

lipeptido da formula formula AA_o-AA_ncc da 3 166 “AA-|ii da Figura 16.

polipeptidos citados

-termi nal.

As construções da proteína solúvel de acordo com a pr<s sente invenção também podem ser produzidas trunca.ndU a sequência da proteína de comprimento total nas varias posições para rem£ ver as regiões que codificam para a transmembrana e os domínios intracitoplãsmicos, enquanto a retenção da região extracelular se considera responsável pela ligação com HIV. Mais em particular, os polipeptidos solúveis podem ser produzidos por técnicas coji vencionais de mutagénese dirigida por oligonucleõtidos; a digestão de restrição seguida por inserção de ligantes; ou atacando a parte dorsal da proteína T₄ de comprimento total com enzimas.

Alternativamente, os polipeptidos a solúveis podem ser sintetizados quimicamente por técnicas de síntese de peptidos co£ vencionais, tais como a síntese em fase sólida R.B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis. I. the Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soe,, 83, pãgs. 2149-54 (1963) .

As sequências de DNA de acordo coro a presente invenção co dificam para as proteínas solúveis e os deriyados que se consideram ligados aos antigenes do Complexo de Hi s tocoropati bi 1 i dade Priri cipal e glicoproteínas do revestimento de certos retrovirus tais como HIV. De preferencia, inibem também, a formação de syncytium

-^Zi’í /

que se considera ser o modo de propagação do yirus HIV intracelular. E podem inibir a interacção entre os linfôcitos T^⁺ e as células que apresentam antigenes e alvos de células T₄ ⁺ mediadoras da morte. De preferência, ainda podem inibir a adesão entre linfÔ eitos T^⁺ e agentes infecciosos tais como os virus HIV cujos alvos principais são os linfôcitos T^⁺’

As sequências de DNA desta invenção são também utilizáveis para a produção de i^ solúvel ou dos seus derivados codificados na expressão por elas nos hospedeiros unicelulares transfor mados por essas sequências de DNA. Como é bem conhecido na técnica, para a expressão das sequências de DNA desta:invenção, a sequência de DNA deveria ser operativamente ligada a uma sequência de controlo de expressão em um vector de expressão apropriado e utilizada nesse vector de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.

Essa ligação operativa de uma sequência de DNA de acordo com a presente invenção a uma sequência de controlo de expressão inclui, evidentemente, o fornecimento de ura sinal de inicio da translação no quadro de leitura correcto a montante da sequência de DNA. Se a sequência de DNA particular desta invenção a ser expressa não começa por uma metionina, o sinal de inicio resultara em um aminoãcido adicional - metionina - estando localizado na p£ sição N-terminal do produto. Embora esse produto que contêm metionilo possa ser utilizado directamente nas composições e métodos da presente invenção, e normalmente mais desejável remover a metionina antes da utilização. Na técnica, existem métodos apropriados para remover essas metioninas N-terroi nai s dos pol i pepti dos expressos com elas. Por exemplo, certos hospedeiros e condições

de fermentação permitem remover substancialmente todas as metioni_ nas de N-terminais in-vi vo, Outros hospedeiros necesitam de remoção in vitro da metionina N-terminal, Porem, esses métodos i n vi vo e in vitro são bem conhecidos pelos especialistas na matéria.

Pode-se utilizar uma larga yariedade de associações do vec tor de expressão/hospedeiro na expressão das sequências de DNA dejs ta invenção. São vectores de expressão utilizáveis, por exemplo, os fragmentos de sequências de DNA cromossornais, não cromossomais e sintéticas tais como vários derivados conhecidos de SV40 e pias roídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmfdeos de £, coli incluindo col EI, pCRl, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de uma larga gama de hospedeiros, por exemplo, RP4^ DNAs de fagos, por exemplo os numerosos derivados do fago ? Ρθτ exemplo , NM989 e outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos de DNA de fibra simples filamentosos, plasmídeos de leveduras tais como o plasmideo 2jj ou respectivos derivados e vectores· derivados- de associações de plasraideos e DNAs de fagos tais como plasmideos que foram modificados para utilizar DNA de fago ou outras sequências de controlo de expresão. Para expressão de células animais prefe re-se utilizar o plasmideo pBG368, um derivado de pBG312 /G. Cate et al., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells, Ce11 45, pãgs, 685-98 (1986)J que contêm o promotor po£ terior principal de adenovirus 2, Além disso, qualquer uma da larga gama de sequências de controlo de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de DNA quando operatij vamente ligadas a ela pode ser utilizada nestes vecto-res para ex

-26pressar a sequência de DNA da presente invenção. Essas sequências

de controlo de. expressão utilizãveis, incluem, por exemplo, os pro-motores anteriores e posteriores de SV40 ou o adenovirus, o sist£ ma 1 ac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, as regiões prorootoras e operadoras principais do fago A/ , as regiões de controlo de proteína de revestimento fd, o promotor para a 3^fosfoglicera^ toquinase ou outras enzimas gl icolíticas, os promotores de fosfat-ase ãcida_j5 por exemplo PhOg, os promotores dos factores que cobrem a levedura , o promotor do poliedrão do sistema de baculovirus- e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes das células procariotas ou eurocariotas ou os seus vírus e as yarias associações respectivas, Para a expressão da célula animal, preferimos utilizar uma sequência de controlo de expressão deriva, da do promotor posterior principal de adenoyirus 2.

Uma grande yariedade de células hospedeiras unicelulares são também utilizayeis na expressão de sequências de DNA desta In yenção. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros eucariotas e procariotas bem conhecidos tais coroo estirpes de E, ~colt , Pseu~ domonas, Baci 11 us, Streptomyces, fungos tais como leveduras e ce-> lulas animais tais como CHD e células de ratinho, células de maca^ co verde Africano, tais como COS 0, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 , e BMT 10, células de insectos e células humanas e eelalas de ρ 1 ajn tas em cultura de tecidos. Para expressão de células animais, pre fere-se células CHO e células COS 7,

Deve-se entender, certaroente que nem todos os vectores e sequências de controlo de expressão funcionarão igualmente bem pa ra exprimir as sequências de DNA da presente invenção . Nem todos os hospedeiros funcionam também igualmente bem com o mesmo siste-

ma de expressão.

Porem, um especialista na matéria pode fazer uma selecção entre estes yectores sequências de controlo de expressão, e hospedeiros sem experimentação excessiva e sem se afas_ tar do âmbito da invenção. Por exemplo, ao escolher um vector , deve tomar-se em consideração o hospedeiro porque o yector devera replicar nele. 0 numero de copias do vector, a capacidade para controlar esse numero de copias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vector, tal coroo marcadores antibióticos devem ser também considerados.

Ao escolher uma sequência de controlo de expressão deve-se também considerar uma variedade de factores. Estes incluem , por exemplo, a força relatiya do sistema, a sua controlabilidade e a sua compatibilidade com a sequência de DNA de acordo com a presente invenção, particularroente quanto ãs estruturas secundarias potenciais. Os hospedeiros unicelulares devem ser escolhidos em função da sua compatibilidade com o vector seleccionado , a toxicidade do produto codificado na expressão pelas sequências de DNA da presente invenção, as suas características de secreção, a sua capacidade para dobrar proteínas correctamente, as suas coji dições de fermentação e a facilidade de purificação dos produtos codificados na expressão pelas sequências de DNA desta invenção.

Entre estes parâmetros, .um especialista na matéria pode seleccionar yarias associações de vectores/sistemas de controlo de expressão/hospedeiros que vão expressar as sequências de DNA desta invenção na fermentação ou na cultura animal em larga escala, por exemplo células CHO ou células COS 7,

Os polipeptidos produzidos na expressão de sequências de DNA da presente invenção podem ser isolados a partir da fermenta ção ou culturas de células animais e purificados utilizando quaj[ quer um dos métodos convencionais. Um especialista na matéria pode seleccionar as técnicas de isolamento e purificação mais apropriadas sem se afastar do âmbito desta invenção.

Os polipeptidos produzidos na expressão de sequências de DNA desta invenção estão essencialmente isentos de outras proteínas de origem humana. Deste modo, são diferentes das proteínas purificadas a partir dos linfocitos humanos.

Os polipeptidos de caordo com a presente invenção são efj cazes em composições e métodos imunoterapeuticos. Por exemplo , os polipeptidos desta inevnção são activos na inibição da infecção por agentes cujos alvos principais são linfocitos T^⁺ por interferência com as suas interacções com esses 1infocitos-alvos. De preferencia, os polipeptidos desta invenção podem ser utilizados para saturar os locais dos receptores de dos agentes infe£ ciosos alvejados coro T^. Deste modo, exercem actividade antiviral por ligação competitiva com locais dos receptores de das superfícies das células. Este efeito é de extrema utilidade em doenças, tais como SIDA, ARC e infecção de HIV, Por consequência, os polipeptidos e os métodos desta invenção podem ser utilizados para tratar seres humanos que possuem SIDA, ARC,, infecção de HIV ou anticorpos para HIV. Alem disso, estes polipeptidos e métodos podem ser utilizados para 0 tratamento de doenças semelhantes ã SIDA provocadas por retroyirus, tais como virus de imunodefi ciejn cia siroiesca em mamíferos incluindo seres humanos.

De acordo com uma forma de realização desta invenção, pode-se utilizar anticorpos para proteínas solúveis e polipeptidos no tratamento, preyenção ou diagnostico da SIDA, ARC e infec ção de HIV.

Os polipeptidos desta invenção podem também ser utilizados em associação com outros agentes terapêuticos utilizados no tratamento da SIDA, ARC e infecção de HIV. Por exemplo, os poli* peptidos T₄ solúveis podem ser utilizados em associação com agentes anti-retrovirais que bloqueiam a transcriptase inversa, tais como AZT, HPA-23, fosfonoforroato, suramina, ribavirina e didesoxicitidina. Adicionalmente, estes polipeptidos podem ser utilizados com agentes anti-virais tais coroo interferões, incluindo interferão alfa, interferão beta é interferão gama ou inibidores de glucosidase tais coroo castanosperroina, Estas terapias de combinação utilizam vantajosamente dosagens roais baixas desses agentes evitando, desse modo, uma possível toxicidade,

Os polipeptidos de acordo com a presente invenção podem tarobem ser utilizados em técnicas de plasmaferese ou em sacos de sangue para remoção selectiva de contaroi nantes virais do sangue,. De acordo com esta forma de realização da invenção, os polipepti, dos 17 solúveis podem ser acoplados a um suporte s-õlido, compreendendo, por exemplo, gotas de vidro ou de plástico ou um filtro que é incorporado em uma unidade de plasmaferese,

Adicionalmente, as composições desta invenção podem ser utilizadas como imunossupressores eficazes na prevenção ou trata_ mento da doença do enxerto versus hospedeiro, doenças auto-imunes e rejeição de aloenxertos.

As composições desta inyenção compreendem tipicamente uma quantidade eficaz imunoterapeutica de um polipéptido de acordo com a presente invenção e um yeículo aceitãvel sob o ponto de vis^ ta farmacêutico. Os métodos terapêuticos desta invenção compreendem a fase de tratamento dos doentes com essas composições de um modo aceitãvel sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições da presente invenção para utilização nes-í tas terapias podem encontrar-se sob variadas formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem solidas, semi-sÓlidas e líquidas, tais como comprimidos, pílulas, pos, soluções líquidas ou suspensões, lipossoroas, supositórios, soluçoes injectãveis e de infusão. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições incluem também, de preferencia, veículos e adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que são conhecidos dos especialistas na matéria.

De um modo geral, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas e administradas utilizando métodos e composições semelhantes aos utilizados para outros polipeptidos importantes sob o ponto de vista farmacêutico (por exemplo, interferão alfa). Deste modo, os polipeptidos podem ser armazenados na forma liofilizada, reconstituídos com água esterilizada ime diatamente antes da administração e administrados pelas vias usuais de administração tais como as vias parenterica, subcutânea, intra_ venosa, intramuscular ou intralesão. Pode-se utilizar uma dosagem eficaz na gama compreendida entre 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo/dia, reconhecendo-se que também podem ser eficazes doses mais

-3'U elevadas ou mais baixas,

A presente inyenção diz também respeito a receptores solúveis e ã utilização em diagnóstico ou a agentes de tratamento virais que atingem ou se ligam a esses receptores. Esses recept£ res solúveis podem ser utilizados como iscas para absorver agentes virais e para deter o aumento da infecção virai. Alternativasmente os agentes assassinos dos vírus podem ser ligados a receptores de proteínas solúveis, proporcionando um modo directo de li_ bertação desses agentes para o vírus.

Mais em particular, os polipeptidos de acordo com a pres sente invenção são uti 1 izãyeis em composições e métodos- de diagnostico para detectar ou controlar o curso da infecção de HIV, Vaji tajosamente, estes polipeptidos são utilizáveis em variantes de diagnostico do yírus HIV, independenteroente da origem do agente HIV infeccioso.

Por exemplo, as proteínas solúveis e os polipeptidos de acordo com a presente invenção que possuem uma alta afinidade para HIV, podem ser utilizadas vantajosamente para aumentar a sejn sibilidade de sistemas de ensaio de HIV agora baseados em anticor pos monoclonais ou policlonais. Mais específtcaroente, as- proteínas soluyeis e os polipeptidos podem ser utilizados para pre-tratar 0 plasma do teste para concentrar qualquer HIV presente, mesmo em pequenas quantidades, de forma a que seja mais facilmente reconhecido pelo anticorpo, As proteínas solúveis e os poli_peptidos podem também ser utilizados para purificar a proteína gp 120 de revestimento de HIV,

Como alternativa, as proteínas solúveis e os· polipepti_ dos da presente invenção podem ser utilizados para substituir os anti-anticorpos de HIV actualmente utilizados em vários ensaios ,

Estas proteínas T solúveis e os polipeptidos são referidos em relação aos anti-anticorpos de HIV por duas razões. Em primeiro lugar a solúvel exibe uma afinidade para HIV de aproxiroadamen-9 τ -7 --8 te 10 , um nível que excede os valores de 10' a 10 de anticor pos contra HIV. E, embora os anti-anticorpos de HIV sejam mais susceptíveis de serem específicos para os diferentes HIV isolados, as variações de estirpes não deverão afectar um ensaio baseado na proteína solúvel visto que todos os isolados de HIV devem ser capazes de interactúar com o receptor coroo um pre-requisi to para a infecção.

Por exemplo, uma proteína solúvel ou um polipéptido po* de ser ligado a um indicador tal coroo uro enzima e utilizado num ensaio ELISA. Aqui o solúvel actua vantajosamente como uma me dida de HIV tanto em uma amostra de teste coroo ero qualquer proteí na gpl20 de revestimento isento de HIV,

As formas polivalentes de proteínas solúveis ou polipeja tidos podem também ser produzidas, por exemplo, por ligação químj ca ou técnicas de fusão geneticas aumentando ainda roais a avidez de solúvel para HIV.

Reiatiyaroente ã presente invenção, para que possa ser melhor compreendida , descrevem-se os exemplos seguintes, Estes exemplos são apenas para ilustração e não devem ser interpretados de modo nenhum coroo uma limitação ao âmbito da invenção.

-33EXEMPLOS

Purificação de Proteína solubilizada natural

Purificou-se natural a partir da linha de células U937 promonocitica derivada de um linforoa histocítico até uma pure za aproximada de 50%, mediante cromatografia de imunoafinidade do modo a seguir descrito,

Cultivararo-se células U937 /uma oferta do Dr, Scott Haromer, New England Deaconess Hospital/ a 10° células/ml em RPMI 1640, Fcs a 10%, colheram-se e lavaram-se em IX PBS, Submeteu-se a lise o aglomerado de células em Tris-HCl 20 mM (pH-7,7), NP-40 a 0,5% (um detergente não iõnico), NaDOC a 0,2%, ESTA 0,2 mM , PMSF 0,2 Mm e 5 jig/rol de BPTI a 4xl0⁷ células /ml, Devido a esta purificação ser realizada na presença de um detergente não ionico , a proteína T^, que esta norroalmente ligada ã membrana através do seu domínio de transmembrana hidrofõbo, foi isolada como uma proteína solubilizada, Torceu-se o lisado num rotor GS3 durante 10 m a 10000 rpm e armazenou-se o sobrenadante a -70°C,

Subsequentemente, pré-absorveu-se o extracto de células clarificado com Sepharose de IgG de ratinho e a'seguir com Sepharose de proteína A e passou-se depois o fluxo através de uma col£ na de imunoafinidade compreendendo um anti-antícoroo monoclonal de T^ imobilizado na Thy na posição 19, sobre 'Affigel-10 /uma oferta do Dr, Ellis Reinherz, Dana Farber Câncer Institute, Boston, Massachusetts/. Lavou-se extensivamente a coluna e eluiu-se o material ligado com glicina-HCl 50 mM (pH = 2,5)', NaCI 0,15 M ,

NP-40 a 0,5%, 5jug/nil de BPTI e EGTA 0,2 mM,

-3.4,.

Separou-se então alTquotas de 10 ji 1 de cada fracção eluída sobre SDG-PAGE a 10% sob condições de redução, coro as bandas a serem visualizadas por coloração de prata. Como se mostra na Figura 1, foi visível uma banda de 55 Kd manchada de prata. Realizaram-se, a seguir, dois ensaios na proteína 55Kd e sequenciou--se a extremidade amino da proteína para confirmar a sua iden;tifi_ cação como solubilizada natural.

Sequenciação de Proteína solubilizada natural

Determinou-se a sequência de aminoácidos da extremidade da proteína natural solubilizada, que se isolou a partir de um ex tracto detergente de células U937 por cromatografia d'· imunoafin/ dade como se descreveu antes.

As técnicas para determinação de sequências de aminoãcidos de varias proteínas e de péptidos seus derivados sã‘o bem conhecidas na técnica. Escolheu-se a degradação automatizada de Edman para determinar a extremidade amino da nossa natural solubilizada. Mais especificamente, purificou-se sobre gel e electroeluíu-se aproximadamente 5 ji g de natural solubilizada e de. pois submeteu-se a uma degradação de Edman automatizada utilizando um sequenciador em fase gasosa (Applied Biosystems 470A), Identificou-se depois os aminoácidos PTH produzidos em cada ciclo da química de Edman por cromatografia em fase líquida alta de pres^ são, em série coro o sequenciador, em um analisador de aroinoãcidos-PTH (Applied Biosystems 120A). A análise directa da proteína proporcionou informação a'cerca da sequência da extremidade amino

-35--

que, quando comparada com a sequência de aroinoícidos deduzida da sequência de cDNA da 1$ humana /Maddon et al. (1985), suprqj permitiu identificar a proteína purificada como humana,

Radioimunoensaio do solubilizado original

Para comprovar que o processo de purificação utilizado permitiu um enriquecimento em T^, testamos fracçoes da fase de eluição de imunoaf irii dade em um radi oimunoensai o de sanduíche específico para baseado no ensaio ELISA de Ρ. E. Rao et al. in Cellular Immunology, 80, pags. 310-19 (1983), Revestiu-se cada recipiente de uma tira de Remoyawell (Dynatech Labs,A1exandria , Virgínia) com 50 jli! de anticorpos OK a 10 jil/rol (ATCC^CRL8002) r>

ou M0PC195 (um controlo de ligação backgrond) em tampão de bicarbonato de sodio 0,05M (pH=9,4) a 4°C durante a noite. Lavaram-se os recipientes e depois encheram-se com FCS a 1% em PBS pa ra saturar a capacidade de ligação ã proteína do plástico. Apos remoção de uma solução FCS a 1%, adicionaram-se amostras de teste, em aliquotas de 50 Ul, aos recipientes.

Incubou-se depois as amostras durante 4-horas a tertperatu ra ambiente. Subsequentemente, removeram-se as amostras e lavaram-se os recipientes quatro vezes com Twenn-20 a 0,05% em PBS . Adicionou-se depois anticorpos marcados na da posição 19 com

125

I (50000 - 100000 rpm por recipiente) e incubaram-se os recipientes a 4°C durante a noite. Lavaram-se depois os recipientes quatro vezes e separou-se cada um deles para detecçao ^^1 ligado em um detector de raios gama de Beckman,

-3β-

Como se mostra na Figura 1, em que se representaram os va lores depois de subtracção do valor correspondente ao fundo (backgroud), a fracção do pico da proteína natural solubilj zada detectada por radioimunoensaio coincidiu com a eluição da proteína de 55 Kd vista por coloração de prata.

Ensaio de mancha de Western para T

Embora muitos anticorpos tenham sido desenvolvidos para detecção do antigene T^, nenhum deles ê uti 1 para análise da maji cha da proteína (informação pessoal do Dr, Ellis Reinherz), Com vista a desenvolver anticorpos úteis para detectar a mancha de Western de T₄ solúvel para seguir a purificação de e solúvel recombinante, cultivou-se anti-antisoro policlonal, hiperimune em coelhos, contra tres oligopeptidos sintéticos. Estes olig^o peptidos estão representados na Figura 3 como se segue:

01i gopepti do

JB-1

JB-2

JB-3

Coordenadas dos aminoacidos

44-63

133-156

325-343

Sintetizaram-se previamente estes oeí-tidos utilizando técnicas de síntese de DNA de fosfoamida convencionais. Veja-se, por exemplo Tetrahedron Letters, 22, pãgs. 1859-62 (1981 ), Sint£ tizaram-se os peptidos em um sintetizador de DNA da Applied Biosystem 380A e purificaram-se mediante electroforese de gel.

{i) Acoplamento de peptidos a BTG

Acoplou-se cada um dos peptidos § tiroglobulina (BTG) bovina da proteína do veiculo /.Sigma, St, Louis, Missouri/ de acordo com uma modificação dos procedimentos descritos em J. Roth_ bard et al. J. Exp. Med. 160, pãgs. 208-21 (1984) e R. C. Kennedy et al., Antiserum to a Synthetic Peptide Recognizes the HTLV.III Envelope Glycoproteína, Science, 231, pãgs. 1556-59 (1986).

Mais especificamente, misturaram-se 10 mg de BTG diluído em 1 ml de PBS com 1,3 mg de ester m-maleimido-benzoi1-N-hidroxi-succinimídico (MBS) em 0’,5 ml de dimetilformamida (DMF), Misturou-se bem a mistura reaccional e fez-se reagir durante cerca de 1 hora a 25°C. Subsequentemente, carregou-se a mistura para uma coluna de filtração de gel G25 Sephadex (Pharmacia, Sweden) que tinha sido pre-equi1ibrada coro PBS O,1M (pH=6,0). ColheramA

-se depois trinta fracçoes de eluição de alíquotas- de 2 mleleu-se a absorvancia de cada fracção a 280 nm (Α₂3θ1. Reuniram-se a seguir as fracçoes dos tres picos (15, 16 e 17) para criar o veículo activado.

Dissolyeram-se 10 mg de NaBH^ em 2,5 ml de solução de bo rato de sõdio 0,lM para produzir uma solução de boro-hidreto de sõdio. Subsequentemente, diluiram-se, aproximadamente, 8 mg de cada um dos peptidos T^ sintéticos, dB-l, JB-2 e JB-3 coro 1 rol de tampão de borato 0,lM e a seguir misturou-se cada solução com 200 ^1 da solução de boro-hidreto de sõdio incubando a mistura em gelo durante cinco minutos. Aqueceu-se depois cada solução de

péptido a 25°C, levou-se cada solução a pH 1 com HCl IN (de que resultou a formação de espuma) e a seguir lavou-se cada solução a um pH 7 com NaOH IN (apos a formação de espuma ter parado).

Acoplou-se, depois, cada péptido a BTG mediante adição de

1,2 ml da solução de péptido a 6 ml da solução de veiculo activa do. Deixou-se a reacção de acoplamento processar-se durante a noite incubando a mistura reaccional ã temperatura ambiente, (ii) Inoculação de Animais de teste

D^;issolveu-se cada um dos peptidos acoplados a BTG prepara, dos como se descreveu antes em adjuvante completo esterilizado de Freund até uma concentração final de 1 jjg/rol de péptido acoplado em PBS. Subsequentemente, inoculou-se cada um dos três coelhos (Nova Zelândia, branco), injectando cada coelho por via intramuscular com 500 jug de um dos peptidos acoplados, Inoculou-se um quarto coelho (Nova Zelândia, branco), do mesmo modo, coro uma mis, tura dos três peptidos acoplados, Todos os coelhos foram previa- . mente sangrados, antes do crescimento (boosting) para se estabe lecer uma linha de base media para cada resposta a ser medida. Os coelhos foram desenyolyidos durante 6 semanas com 500 jig de pepti. do acoplado em adjuyante de Freund incompleto,

Recolheu-se o soro a partir de cada coelho, roensalmente, durante 4 meses apõs a imunização, 0 soro foi a seguir testado para titular o antipeptido,

(i i i) ELISA com soro de antipeptidos contra placas revestidas por peptidos

Neste ensaio, verificou-se o antisoro desenvolvido em um animal por cada um dos peptidos JB-1 , JB-2 e JB-3 liga-se a esses peptidos. Por consequência, esses peptidos são imuiiogÓnicos e originam uma resposta nos animais de ensaio.

Para realizar o ensaio, revestimos placas de microtitulação Immulon-2 (Dynatech Labs, Alexandria, Virgínia) coro 50 jjI por cavidade de 50 jjg/ml de peptido não ligado em PBS e incubaram-se as placas durante a noite a 4°C. As placas revestidas com peptido 46R* que serviram como controlos foram tratados de modo idêntico. Lavaram-se depois os pratos 4 vezes com PBS-Tween C0,5%) e 4 vezes com água. As placas foram secas por batimento leve s£ bre toalhas de papel. Após a secagem das placas adicionaram-se 200 jul de uma solução de BCS/PBS a 5% a cada cavidade e incubaram-se às placas durante 1 hora a temperatura ambiente.

Testamos a seguir as amostras de soro dos- coelhos em placas pre-revestidas preparadas como se descreveu antes. Testámos a resposta do anticorpo ao peptido imunogenico para uma diluição * 0 Peptido 46 corresponde a aminoácidos (AA) 728-751 do gene env do genoma de HIV. A numeração do aminoaciod corresponde ao descrito para o gene env L. Ratner et al. , Complete Nucleoti_ de Sequence of the AIDS Vírus, HTLV-III, Nature, 313, págs. 277-284 (1985). 0 peptido 46 tenra sequência;

LIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDR,

-40Cz ξ

inicial de 1:100 seguida de uma série de 10 diluições em FCS/BPS a 5%.

ApÕs duas horas de incubação ã temperatura ambiente, 1 a v a_ ram-se as placas e secaram-se por absorção como se descreveu antes. Adicionaram-se a seguir 50 jjI de uma diluição de 1,1 500 de peroxidase de rabano (HRP)-anti IgG de coelho conjugado em cabra /Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania/ em FCS/PBS a 5% para cada cavidade e incubaram-se as placas ã temperatura ambien te durante 1 hora. Lavaram-se as placas com PBS-Tween a 0,5% e adicionaram-se depois 50 jj! de TMB Q,42 mM. Interromperam-se as reacções enzimaticas com 50 ju 1 de H₂S0₄2M e analisaram-se as pia. cas por espectrometria a 450 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação /Dynatech Labs, Alexandria, VirginiaJObservou-se que o anti-soro contra cada um dos péptidos JB-1, JB-2 e JB-3 se ligou ao correspondente péptido. Observou-se também que o anti-soro contra uma mistura de péptidos JB-1, JB-2 e JB-3 se liga aos péptidos JB-1 e JB-3 nas condições descritas antes. As titulações de cada um dos quatro anti-soros testados contra os péptidos na fase solida de ELISA são apresentadas a se guir onde ND representa valores não determinados:

Titulação aproximada contra:

Pepti do

JB-1

JB-2

JB-3

JB-1

1/50.OQQ

ND

JB-2 uso, ααα

ND

JB-3

1710,000

JB-1 + JB-2 + JB-3

174.0Q0

ND

177.000

!

As fracções Ig provenientes de dois dos tres soros anti-peptidos desenvolvidos contra peptidos individuais, anti-JB-1 e anti-JB-2 reconheceram a banda do antigene de 55Kd de solubilizado natural em uma análise da mancha de Western de proteína eluida a partir de uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal (anti-T₄) daThy na posição 19 descrita antes , Como no caso do radioimunoensaio de solubilizada natural, a detecção da pro teína de 55Kd coincide com a sua eluição aparente a partir de uma coluna de afinidade. Isto proporciona outra evidência de que o processo de purificação da proteína da presente invenção proporcionou um enriquecimento em T4 sblúbilizado.

Deste modo, estes soros policlonais são uteis na detecção de quantidades em nanogramas de (ambas as formas, natural e re combinante) por analise de Western.

Ligação de livre de células ao revestimento de HIV.

Testou-se a seguir T^ original solubilizada e purificada a partir de células 4937 para a sua capacidade de ligação com a proteína de revestimento de HIV, gp 160/gp 120. Para realizar este ensaio de ligação directo, incubou-se 0 extracto de células detergentes gpl60 a gp!20 marcado com S derivado de uma linha de células recombinantes 7d2 (uma oferta dos Des Mark Kowalski e William Haseltine, Dana-Farber Câncer Institute) com amostras de T^ natural solubilizada, cada uma das quais foi pre-incubada com um tipo de anticorpo monoclonal.

Mais especificamente, misturou-se 5ul de T^ solubilizada

em um tubo microfugo com 5 jig (cerca de 3 yil) de OKT^ (ATCC#CRL 8002). um anticorpo monoclonal que reconhece um epítope sobre T₄, o qual não interfere com a ligação de HIV A. Hoxie et al . , J.

Immunol. 136, pag. 361-363 (1986)Jou com 5 jjg de OKT^A (Ortho

Diagnostics 7142), um anticorpo monoclonal que interfere com ligação de HIV a células positivas de £j, Steven McDougal et al., J_· Immunol . , 137, pags, 2937-2944 (1986)J, Alternativamente misturaram-se 50jjl de solubilizada coro 5^g de gp!20 de C^HTLVIII (Dupont #NEN-9284).

Incubaram-se depois as misturas sobre gelo durante 1 hora.

Subsequentemente, adicionaram-se 150jj1 de extracto de celu3 las gpl60 marcado com gpl20 sou extracto de células de controlo

- marcado com S (pre clarificado com Sepharose de proteina-A) ás misturas de solubi1izáda anticorpo monoclonal pre-incubadas e agitaram-se os tubos durante a noite a 4°C. Precipitaram-se a se guir complexos imunes de T^/gpl60/gpl20 por adição de 30 ^jl de Sepharose de proteína-A a cada tubo e agitação durante 2 horas a 4°C para permitir que a Sepharose de proteína-A se ligue aos complexos de anticorpos. Subsequentemente, fizeram-se rolar os grãos num microfugo de Eppendorf e apos lavagens extensivas eluiram-se com 40 jil de tampão de amostra SDS a 65°C durante 10 minutos, Car regou-se a seguir 20 jul do material eluído em um gel SDS-PAGE a 7,5% que se deixou fluir sob condições de redução,

A Figura 2 representa a auto-radiografia e os resultados da mancha de Western das co-irouno-precipitações de T^/gpl60/gpl20, Na

Figura 2, as pistas 1-5 foram auto-radiografadas após tratamento com salicilato de sodio a 401 e as pistas 6-7 foram desenvolvidas em uma mancha de Western com anti-soro JB-2 de coelho,

Como se representa na figura 2, a proteína gp!60/gpl20 foi co-imune, precipitada na presença de com OKT^ (pista 5) mas não na presença de com OKT^A (pista 4), A pista 3 mostra o controlo positivo para gp!60/gpl20 utilizando um anticorpo monoclonal gp!20 de 0/HTLV III. Nenhum controlo negativo com extracto de controlo marcado com 35$ (pista 1) ou Sepharose de prroteína-A.isolada (pista 2) mostrou bandas migradouras na posição de gp!60/gp!20. Com base nas bandas que se desenvolveram na mancha de Western, a quantidade de precipitada quer com OKT^ (pista 6) quer com OKT^A(pista 7) pareceu ser semelhante.

Isto demonstra que a natural solubilizada purificada que esta naturalmente ligada a membrana pode ainda interactuar com a gl i coproteí na de HIV em solução·. Por consequência, pensa-se que a solúvel livre de células ê utilizável na prevenção da interacção de ligação entre HIV e o receptor de linfócitos de Competindo com a da superfície das células para se ligar ã proteína gpl20 do revestimento de HIV a solúvel e útil no bloqueio da infecção de HIV.

Síntese de sondas de DNA de oligonucleótidos

Foi descrita a sequência nucleotida e uma sequência de ami, noacidos deduzida para um cDNA que codifica de modo significativo a proteína humana completa (Maddon et al. (1985)', supra, A es-44^

trutura primária deduzida da proteína T₄ revela que pode ser divj dida em domínios que se apresentam a seguir:

Estrutura/1ocalização proposta

Hidrõfobo/sinal de secreção

Homologia para regiões-V/ /extracelular

Homologia para regioes-J/ /extracelular

Região glicosilada/ /extracel ul ar

Hidrõfobo/Sequencia de transmembrana

Muito hidrõfi1o/intracitoplãsmi co

Coordenadas dos ami noáci dos

-23 a -1 +1 a +94 +95 a +109 +110 a +374 +375 a +395 +396 a +435

Com base na sequência paráiós· domínios listados antes, sin tetizaram-se quimicamente sondas de DNA de oligonucleôtidos anti-sensação utilizando técnicas convencionais e síntese de DNA de fosfoamida. Ver, por exemplo, Tetrahedron Letters, 22, págs. 1859-62 (1981). Sintetizaram-se as sondas num sintetizador de DNA Applied Biosystems 380A e purificaram-se mediante electroforese de gel,

Além disso, sintetizaram-se as sondas- de forma a que se-45-

jam complementares das sequências de DNA que codificam para a sequência de aminoácidos, isto e, as sondas eram anti-sensação, para as tornar capazes de reconhecer e hibridizar as sequências cor respondentes em DNA bem como em mRNA, As sequências nucleotidas das 11 regiões seieccionadas da proteína £ correspondendo ã numeração de nucleotidos descrita em Maddon et al., (1985) supra/ foram as seguintes:

01i gonucleoti do

Coordenadas de nucleÕti do

145-171

742-765

1414^1440

427-453

1303-1329

1012-1038

97-118

10-36

1698-1724

397-423

261 -287

Antes da utilização das sondas de DNA, de acordo coro a presente invenção, para sondagem, marcou-se na extremidade 5' ca. da uma das sondas de DNA de cordão simples com P utilizando r )f-³²e7 -ATP e quinase polinucleÕtida de T^, substancialmente c£ mo descreveu A, M. Maxan e W. Gilbert, A New Method for Sequency DNA, Proc. Natl. Acad, Sei, USA, 74, pags, 560-564 (1977),

Construção de uma biblioteca de cDNA de linfócitos XgtlO do sangue periférico

Para preparar a biblioteca de cDNA de linfócitos do sangue periférico (PBL) processou-se PBL proveniente de um dador (round) de leucoforese simples através de um passo de absorção para remover monõcitos. Estimularam-se então as células não aderentes com IFN-X’ a 1000 U/ml e PHA a 10jjg/rol durante 24 horas, Isolou-se RNA a partir destas células mediante extracção com fenol /Maniatis et al., Molecular Cloning, pag, 187 (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)7 e preparou-se toRNA de poli A⁺ através de um passo (round) de cromatografia de celulose oltgo dT, Precipitou-se o RNA com etanol, secou-se sob vazio e ressuspendeu-se o RNA em lOjil de H₂0 (0,5 jig/pl), Tratou-se o RNA durante 10 minutos a temperatura ambiente em CHgHgOH (5mM de concentração final) e ji-mercaptoetanol Q0,26M), Adicionou-se depois RNA tratado o com meti 1-mercúrio a Tris-HCl 0,1 M (pH=8,3) a 43 C, Mg 0,01M , DTT 0,01M, complexo de vanadilo 2mM, 5 jig de oligo dT^₂_^₈ , KC1 20 mM, 1 mM em dCTP d GTP, dTTP, 0,5 mM em dATP, 2^Ci -³²pJdATP e 30 U 1,5 Jjl de transcriptase inversa AMV (.Seikagaku América) em um volume total de 50 jil, Incubou-se a mistura durante 3 minutos ã temperatura ambiente e depois durante 3 horas a 44°C, após o que se interrompeu a reacção mediante a adição de 2,5 jjI de EDTA 0,5M,

ExtraTu-se a mistura reaccional com um volume igual de fe nol: clorofórmio (1:1) e precipitou-se a oamada aquosa duas vezes coro 0,2 volumes de NH^ AC 10 M e 2,5 volumes de EtOH e secou-se sob yazio, 0 rendimento de cDNA foi 1,5 pg.

Sintetizou-se o segundo cordão de acordo coro os métodos de Okayama e Berg /Mol. Cell, Biol,, 2, pãg. 161 (1 982)7 e Gu bler e Hof fman ./Gene, 25, pãgs. 263-69 (1983)7* com a diferença de utilizar o fragmento grande de DNA polimerase I na síntese.

Cortou-se o cordão duplo de cDNA ressuspendendo o DNA em 80 Jul de tampão TA (acetato de Tris 0,033 M (pH=7,8); Acetato de K 0,066 M; Acetato de Mg 0,01 M; DTT 0,001 M; 50 Jig/ml de BSA) , 5 jug de RNase A, 4 unidades de RNase H, £ NAD 50 yiM, 8 unidades de ligase _E. col i , 0,3125 mM em dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 12 unidades de polimerase T^ e incubou-se a mistura reaccional durante 90 minutos a 37°C, adicionou-se 1/20 do volume de EDTA 0,5 M e extraiu-se com uma mistura de fenol: clorofórmio. Submeteu-se a cromotgrafia a camada aquosa em uma coluna Sephadex G150 eluindo-se com Tris-HCl 0,01 M, (pH='7,5), NaCl 0,1 M, EDTA 0,001 M e recolheu-se a fracção do pico pronunciado que continha o cDNA de cor dão duplo e precipitou-se com etanol. Rendimento: 0,605 Jjg de cDNA.

Ligou-se o cDNA de cordão duplo ao ligante 35/36;

5'AATTCGAGCTCGAGCGCGGCCGC3'

3' GCTCGAGCTCGCGCCGGCG5¹ utilizando processos padrão, Sei ecci onou-se, depois, o tamanho do cDNA para 800 pb e os fragmentos maiores em uma coluna Sephacril S500 e ligou-se ao vector gtlO do bacteriofago lambda digeri, do com EcoRI (uma oferta de Dr, Ellis Reinherz), Armazenaram-se aliquotas da mistura reaccional de ligação em Gigapak (Strategene)

8-

de acordo com o protocolo do fabricante, Uti 1 izou--se o fago arma zenado para infectar células BNN102 de E, co1i e plaqueram-se as células para ampliação. A Biblioteca resultante continha 1 ,125x x!0° recombinantes independentes. Sondou-se também uma bibliote, ca de cDNA de PBL no vector gtlO do bacteriofago lambda (uma ofer ta de Dr. Ellis Reinherz), que foi sintetizado a partir de mRNA proveniente de uma linha de células tumorâis T₄ ⁺ chamada REX que expressa a proteína em altos níveis Z*Acuto et al,, The Human T Cell Receptor: Appearance In Ontogeny and Biochemical Relationship of Lambda and Beter Subunits on TL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors, Cell, 34, pãgs. 717-26 (1983)7.

Sondagem das Bibliotecas

Utilizou-se, depois, tres das quatro sondas anti-sensação

- - 32 de oligonucleotidos, sintéticas marcadas com P, sondas 3, 6 e 9, para sondar em paralelo as duas bibliotecas de cDNA de XgtlO uti, lizando a técnica de sondagem de hibridação de placas descrita em R. Cate et al., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells, Cel1 , 45, pags. 685-98 (1986) com pequenas modificações. Modificou-se o processo de Cate et al, por hibridação sem cloreto de tetrameti 1 amonio para adaptar a utilização de soji das únicas em vez de misturas, para sondar os filtros de placas,

Utilizaram-se as três sondas que tinham sido previamente marcadas na extremidade 5' com £ J*- P J7-ATP de acordo com o me todo de A. Maxam e W. Gilbert, Meth Enzymol, 68, pãgs. 499-80 (1979) para sondar em paralelo a biblioteca de cDNA de PBL e a

-49biblioteca de cDNA de REX discutida antes,

Da sondagem da biblioteca de PBL isolou-se um clone de cDNA de solúvel de comprimento total - - Ar203-4 (oulgt 10. PBL.T^) -- que contem uma inserção de 3.064Kb que podia ser cliva_ da a partir de um vector XgtlO com EcoRI.

A partir da sondagem da cultura de células REX isolou-se um clone de cDNA de incompleto contendo uma inserção de cDNA de 1200 Bp. Caracterizou-se ainda, a seguir, 0 DNA destes clones por análise da sequenciação de DNA.

Sondou-se também uma biblioteca genõmica humana de bacteriõfago lambda construída no vector EMBL3 pelo Dr. Mark Pasek (Biogen Inc., Cambridge, Massachusetts) £N, Murray i n Lambda 2, eds. R. Hendrix, <J. Roberts, F. Stahl , R. Weisberg, pãgs, 3935-422 (1983)J. A cultura contem fragmentos de DNA criados pela restrição parcial de DNA cromossÕmico a partir da linha de células linfoblãstidas humanas GM1416, 48, XXXX (Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, New Jersey) com San 3a ligado a partes de EMBL3 que tinham sido submetidas a clivagem com BamHI de acordo com os processos descritos em Maniatis et al., (1982), supra. A plaqueação da biblioteca do fago, a lise e a transferencia do DNA do fago sobíe nitrocelulose realizaram-se como descreveram W, D. Benton e R. W. David, Screening of Lambda gt Recombinant Clones by Hybridation to Single Plaques in Situ, Seience, 196 pãgs. 180 (1977) e Maniatis et al., (1982), As condições de hibridação fo ram as descritas por Cate et al,, (1986), supra, excepto que se

-50excluiu o cloreto de tetrameti1amõnio (TMAC1) do tampão de gem.

Sondaram-se aproximadamente 2 milhões de placas em hibridações paralelas com a sonda 1 e a sonda 3 referidas antes. Um fa go designado CM47, que hibridizou com a sonda 3 nas primeiras soji dagens foi submetido a analise de sequência de DNA para determinar a existência e a posição de um intrão entre as sequências de codificação para os domínios de transmembrana e extracelulares previstos. Nenhuns clones dos fagos contendo sequências de foram encontrados por sondagem com a sonda 1, provavelmente porque inclui uma sequência interrompida por um intrão Z D, R, Lithian e S. N. Gettner, Nature, 325, pãgs. 453-55 (1987); e segundo as observações da Requerente/.

A analise da sequência parcial de CM47 indica que um intrão interrompe a sequência correspondente ao codão para valina (aminoácido 363) da sequência primitiva deduzida para T₄ (Figura 3 - na qual os intrões são indicados por uma linha a cheio). Este intrão define um local potencial para introduzir um codão de paragem coro vista a expressar uma forma solúvel de T^, Um outro intrão encontrado entre a sequência de codificação para interrompe o codão para arginina (aminoácido 295) e encontrou-se um terceiro intrão em CM47 entre os codãos para arginina (aminoãcido 402) e arginina (aminoácido 403) (Figura 3),

Sequenciação de clones de cDNA

Em seguida, subclonou-se DNA digerido conr EroRÍ a partir

-51^ do clone X 203-4 no vector de expressão animal pBG312 /*R, Cate et al., supraj para faci1i tar a analise cificamente, como se

XgtlO.PBL.T^ com EcoRI para estirpar 0 de 3.064Kpb que contem 0 cDNA de de sequência de cDNA incluindo a região de codificação total para indica na

Figura 4,

de sequência. Mais espe digeriu--se a seguir fragmento EcoRI-EcoRI de comprimento total,. Esta solúvel e para de comprimento total foi depositada em pl70-2,

Utilizou-se ligase para ligar 0 fragmento ao vector de expres^ são animal pBG312 /supraj que tinha sido previamente cortado com

EcoRI para formar pBG312. e pl70-2 (Figura 4), Determinou-se então a sequência de nucleõtidos do fragmento EcoRI de pBG312-=1^ utilizando a tecnologia de Maxam, Gilbert /A. M. Maxam e W. Gilbert, A New Method for sequencing DNA, Proc, Natl , Acad, Sei,

USA, 74, pags. 560-64	(1977)^7 £ver fig. 3 que representa a sequen
cia de cDNA de PBL em	comparação com a descrita por Maddon et al.
( 1985) , supraj^. Esta	analise mostrou que a copia de DNA corople-*

mentar de comprimento total de PBL de 3,064 Kpb de cDNA de coji tinha a sequência de codificação para T^, aproximadamente 200 pb de sequência não codificada na extremidade 5' e aproximadamente

1500 pb de sequência não codificada na extremidade 3',

Cortou-se, depois pBG312, coro Pst I e removeram-se as extremidades salientes, na posição 3* , resultantes- com Klenow e isolou-se um fragmento de aproximadamente 2,5 Kpb, Inseriu-se então 0 fragmento no poliligante de pBG312 (que tinha sido previamente restringido no local Smal) para formar 0 plasmideo p!70^2, que contem a sequência de cDNA de de PBL de comprimento total (ver figura 3).

Como se representa na Figura 3, o cDNA de de PB^ contem uma sequência nucleotida quase idêntica a sequência de aproximada mente 1 , 700 pb descrita por Maddon et al, (19.85), supra. 0 cDNA de 17 de PBL contem, porem, três substituições nucleõtidas que no produto de translação deste cDNA devera produzir uma proteína que contem três substituições de aminoãcidos comparada com a sequencia descrita por Maddon et al. Como se mostra na Figura 3, estas diferenças são na posição 3 do aminoácido onde a asparagina de Maddon et al. e substituída por lisina; a posição 64, onde 0 triptofano de Maddon et al. e substituído por arginina e na posição 231, onde a feni1-alanina de Maddon et al, ê substituída por se ri na.

A asparagina referida na posição 3 de Maddon et al em vez de lisina foi 0 resultado de um erro de sequenciação (Dr, Richard Axel, comunicação pessoal), 0 significado das substituições de aminoácido nas posições 64 e 231 que podem representar polimorfisumos alelicos /Ti. C. Human Immunology, 9, págs. 89-102 (1982); W. Stohl e H. G, Kunkel, Scand, J, Immunology.,2Q; págs, 273-78 (1984); N, Amino et al,, Lancet, 2, pág. 94-95 (1984); e M, Seto et al., J. Immunoll,, 132, págs, 1071-73 (1984)7; não e conhecido .

A análise da sequência de DNA £ Maxam and Gflbert, supra? da inserção em pEClOO do clone REX sugere que representa 0 produto de um erro de união porque a sequência não codificadora na posição 5I parece ter sido ligada com a seqúenciãde codificação co meçando com 0 codão GGT para glicina (aminoácido 49). (ver Figura 3 e Figura 5), A sequência de codificação de T^ em pEClOO* des-53-

de glicina (aminoácido 49) ate isoleucina (aroinoãcido 435) é idêjn ti ca à sequência de Maddon et al,, (1985) supra.

Em comparação, a analise da sequência de proteínas N-ter minai da proteína natural purificadas a partir de células 4937 apresenta um produto de expressão de T/ com asparagína como aminoãcido 3. Estas diferenças são também representadas na Figura 6 o£ de também se comparam as posições correspondentes do clone parcial proveniente da biblioteca de 3vgtlO da linha de células REX;o cl£ ne genõmico de uma biblioteca deÀEMBL3; sequências T₄ do ratinho £tourvieille et al,, Science, 234, pãgs, 610 (1986)7 e sequências de T₄ de carneiro[Classon et al,, Immunogenetj cs, 23, pãgs, 129 (198617.

Construção de mutantes de solúvel

Utilizou-se, então, a técnica da mutagenese dirigida ao local in vitro e da substituição do fragmento de restrição para modificar a sequência de codificação de cDNA de de pl70-2 em passos sequenciais idênticos aos descritos por Maddon et al,, (1985), supra. Utilizou-se a mutagénese dirigida -aos oligonucleõ tidos para modificar os aminoãcidos nas posições- 3 e 64, A seguir, * Construíu-se pEClOO por digestão incompleta do clone de cDNA de a partir da biblioteca REX com EcoRI, isolando a inserção de cDNA de 1200 pb. Ligou-se, então, ao pUC^ (Boehringer Mannheim, Indianapolis Indiana) que tinha sido previamente cortado com EcoRI para formar pEClOO.

utilizou-se a substituição do fragmento de restrição com um fragmento que inclui o codão da serina 231 de um cDNA de parcial isolado de uma linha de células de linfocitos positivos de /0, Acuto et al., Cel 1, 34, pags. 717-26 (1983)7 emXgtll (uma oferta do Dr. Ellis Reinherz), para modificar o aminoácido na posição 231. Truncou-se então a sequência de cDNA de T^ modificada para remover as regiões de codificação para os domínios 1ntracitoplasmicos e de transmembrana, Subsequentemente, construíram-se três mutantes diferentes de T^ solúvel a partir do clone de T^ de comprimento toai PBL T^ mediante inserção do ligante entre os locais de restrição com vista a aumentar a probabilidade de encontrar em piricamente uma molécula de T^ segregãvel estável, A estrutura de cada um destes mutantes está representada na Figura 7A.

A linha A da Figura 7A representa uma análise de hidropatia de T^ soluyel de comprimento total realizada utilizando um programa de computador chamado Pepplot (University of Wisconsin Genetics Computer Group) de acordo com J, Kyte e R, F, Doolittle, JL Mol. B i o 1 ., 157, págs, 105-32 (1982). A linha B representa a estrutura do domínio da proteína de comprimento total T^ £ Maddon et al. (1985) Supr4? em que S representa a sequência de sinal de secreção, V representa a sequência da região variável semelhante a imunoglobulina, J representa a sequência da região de ligação semelhante a imunoglobulina, U representa a unica sequência da região extracelular,TM representa a sequência de transmembrana e C representa a sequência da região citoplás^ . mica. Na linha B a sequência de aminoácido de transmembrana e al^ gumas sequências de flanqueamento são representadas a seguir ao domínio TM, A linha C representa a estrutura do domínio de pro-55-

teína de mutantes solúveis recombinantes rsT^.l em pBG377, rs T4.2 em pBG38Q e rs T^,3 em pBG381 , A linha D' representa a estrutura do domínio de proteína do gene rs T₄ de E. col1 (constru ção de Met-perfeita) [pl99-7) que ê eliminado para a sequência (5) de sinal N-terminal de T₄.

Construíu-se 0 primeiro dos três fragmentos do gene mutante de solúvel truncando 0 cDNA de solúvel de comprimento total nas posições correspondentes a quaisquer limites de intrão/exão ou aos limites dos domínios da proteína definidos pelas previsões da analise de hidropatia. Mais especificamente introduziram-se ligadores sintéticos no local Aval único que estã na extremidade 5' em relação ao limite do domínio extracelular/ /transmembrana para produzir um codão de paragem transi acionai na estrutura (in-frame), construindo deste modo, genes de da sequência de de comprimento total que carecem de domínios citoplãsmicos e de transmembrana,

Por exemplo, 0 mutante rs T^.l em pBG377 foi truncado por inserção de um codão de paragem a seguir ao aminoácido 362, lisina, que corresponde a posição de um intrão separando os exãos de domínio da transmembrana e extracelular. As posições deste in trão e do intrão adjacente que dividem os domínios citoplásmicos e de transmembrana foram determinados pela analise da sequência de DNA de clones de cromossõmtcos isolados da biblioteca gencj. mica^X-EMBLS descrita antes. Embora 0 significado das posições do intrão flanqueando 0 domínio de transmembrana não seja conhecido, a determinação da estrutura genética podia proporcio. nar informação importante para designar mutantes rsT^ visto que

os exãos definem frequentemente domínios funcionais ZfW. Gilbert, Why Genes in Pieces?, Nature .271,;. pâg. 501 (1978)J,

Construíu-se então,o mutante rsT^.2 em pBG380 truncando o cDNA de no limite dos domínios extracelulares e de transmembrana no aminoácido 374 e mutante rsT^.3 em pBG381 truncando 0 cDNA de no aminoácido 377, três aminoãcidos na jusante do limite do domínio extracelular/transmembrana e entre 0 domínio de transmembrana.

Utilizou-se também a técnica da routágenes-e dirigida ao local do oligonucleotido de acordo coro D, Strauss et al,, Active Site of Triosephosphate Isomerase: In Vitro Mutagenesis and Ch_a racterization of an Altered Enzyroe, Proc. Natl. Acad, Sei, USA, 82, pãgs. 2272-76 (1985), para construir um quarto mutante de solúvel a partir do clone PBL de de comprimento total. A es^ trutura deste mutante e apresendada na Figura 7A, linha D, que re presenta a estrutura do domínio de proteína do gene rsT^ de E, col_i_ (rs.T^.2 Met-perfeita) construído, depositado em p!99-7 e que ê eliminado para a sequência de sinal N-terminal (S) de T^.

Construíram-se também yários outros routantes de eliminação de soluyel para determinar qual 0 fragmento -roais pequeno da sequência de que proporciona uma proteína que se liga ao HIV. Estas construções basearam-se na convicção que apenas- a sequência do terminal amino de T₄ e requerida para ligação coro HIV, Esta convicção, por sua vez, baseou-se em obseryações em que 0 ar ticorpo monoclonal OKT^A bloqueia a infecção de células- positivas de por HIV e parece reconhecer um epítope na porção amino de

-5 7-

£ Fui ler et al, supra/ . Esses fragmentos- de T₄ que carecem de glicosilação e que sao-capazes de se ligarem a ffíV e bloquea^ rem a infecção podem ser produzidos em E. col i ou sintetizados qui mi camente.

A estrutura de cada um destes mutantes de eliminação ,e descrita na Figura 7B. Nesta Figura, a linha A descreve a estrutura de domínio da proteína de de comprimento total £ Maddon et al., ( 1985), supra; figura 1AJ. Na linha B a estrutura de proteí na dos mutantes T₄ solúveis recombinantes sao descritos como se segue: rsT^.7 em p203-5, rsT^.7 em pBG392, rsT^.8 em pBG393, rsT^.9 em pBG394, rsT^.10 em pBG395, rsT^.ll em pBG397, rsT^, 12 em pBG396, rsT^.lll em pBG215-7, rsT^,113,1 em pBG211-11 e rst^,113,2 em pBG214-10.

Construíram-se derivados de solúveis p203-5, pBG392, pBG393, pBG394 e pBG396 truncando 0 gene rsT_4<2 apôs os locais StuI nos aminoãcidos 183 e 264 de rsT₄«2, Mais especiflcamente, construíu-se 0 derivado rsT₄,7 em p203-5 e em pBG392 truncando 0 cDNA de rsT₄,2 no aminoãcido 182 e construíu-se cada um dos derivados rsT₄.9 em pBG394 e rsT₄.12 em pBG396 truncando 0 cDNA de rsT_4>2 nos aminoãcidos 113 e 166, respectivamente. Pode-se também construir cada um dos derivados rsT^.lO em pBG395 e rsT^.ll em pBG397 truncando 0 cDNA de rsT₄,2 nos aminoãcidos 131 e 145 , respecti vamente,

-58%

Expressão de e polipeptidos de solúveis em células bacteri anas

As sequências decDNA de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para transformar células hospedeiras eucariotas e procariotas mediante métodos bem conhecidos da técnica para produzir polipêptidos de solúvel recombinantes em quantj_ dades utilizáveis clnínica e comereialroente,

Por exemplo, construíu-se o vector de expressão p!99--7 como se representa na Figura 9A.

Precedeu-se a construção descrita na Figura 9A pela cons trução de vários plasmideos intermédios como se indica nas Figuras 8A-8D. Estas construções realizararo-se utilizando técnicas recombinantes convencionais. Os ligantes utilizados nessas construções são representados na Figura 10,

Como se mostra nas Figuras 8A e 88, partindo de pl70-2 que contém a sequência de DNA de de comprimento total, codif/ cando para T₄, caracterizado pelos três aminoácidos diferentes dos de Maddon et al., (1985), supra , produziu-se várias construções que dirigem a expressão de solúvel. Algumas destas construções são caracterizadas pelo facto de uma ou mais destas difje renças de aminoácidos ter sido alterada para corresponder aos res^ pectivos aminoácidos de Maddon et al . Nesta figura, bemj coroo nas outras figuras, as alterações de aroinoãcidos são salientadas por um seta.

plasmideo ρ192-6 contém a sequência de rsT^.2 Met-per feita derivada mediante mutagénese dirigida ao local do oligonu cleótido que removeu toda a sequência de sinal N-terminal de T^, como se mostra na Figura 8c, E, para proporcionar um meio conveniente de transferir a sequência de rsT^,2 Met-perfetta para os vectores de expressão E, coli, os passos descritos na Figura 8D foram realizados para produzir pl95-8, um plasmideo contendo a se quência rsT^.2 Met-perfeita flanqueada pelos locais de restrição Clal. A fita C1 a I - C1 a I de pl95-8 optimiza a distancia entre o local Ciai na posição 5' e o codão Met de iniciação. Na Figura 8D, STg rop e um plasmideo baseado em pAT153 que codifica a resistência a tetraciclina, contendo a mutação rop' que permite um nu mero de copias de plasmídeos elevado, um local de ligação ao pro-; motor e ao ribossoma do gene 32 do bacteriofago e a sequência de terminação de transcrição do gene 32,

A cliyagem de p!95-8 com Ciai produziu o fragmento util£ zado para reunir pl99-7, uma construção que dirive a expressão de rsT^.2 Met-perfeita sob o controlo do promotor (Figura 9A), Co mo o primeiro passo para construir uto vector a partir do qual a expressão de rsT^,2 está sob controlo do promotor PL, construíu-se o vector p!97-12 a partir de pl034(plrouGCSF) (Figura 9A),

Cortou-se depois p!034 com EcoRI e-BamHI para extirpar a inserção de cDNA, GCSF, e uma porção do ribossoma mu do fago M gando a sequência do local - que subsequentemente se reconstruiu com oligonucleÓtidos, Os ligantes sintéticos utilizados foram li gantes 57-60 (Fig, 10),

Ligou-se então o ligante sintético a p!034 cortado com

EcoRI/BamHI para formar pl97-l2, Podia-se, em vez disso, substituir estes passos iniciando coro qualquer vector de expressão de

E. coli apropriado contendo um local Ciai colocado de modo apropriado entre as sequências do promotor e do interruptor £teτroí·** nado 4). Cortou-se p!97-12 com Cl al e inseriu-se uma fita de Clal - Cl al contendo a sequência de cDNA de rsT^,3 em pBG381 e o interruptor de transcrição do fago derivado de pl034, A sequência desta fita e representada na Figura 11, 0 plasmideo resultap te pl99-7 contem o gene de rsT^.2 Met-perfeito nesse vector,

Alternatiyamente, podia-se derivar a sequência de rsT^,2 Met--per feita do plasmideo pBG380 depositado em relação com este pedido de patente de invenção e entalhar (gap out)' a sequência de sinal para criar p!92-6,

Testou-se para a expressão de p!99-7 coroo se segue,SG936, um mutante duplo de E, coli 1on htpr £ ATCC 39624/ /*8. Goff e A. Goldberg, ATP-Dependent Protein Degradation in E.coli¹¹, in Maxiroizing Gene Expression, W, Reznikoff e L. Gold CedsJ (1986)7 foi transformado coro p!99-7 por processos convencionais^FIariatis et al, (1982)7 para formar SG936/p199-7, um transforroante que con tem um plasmideo com o gene rsT^.2 Met-perfeita atras- do promotor PL. Os transforroantes foram séleccionados em placas de LB-agar contendo 10 mcg/rol de tetraciclina (tet), Apos marcação de várias colonias simples para isolamento simples da colonia escolheu-se uma ao acaso para testar a indução da síntese de rsT^.2. Apanhou-se uma colonia simples de uma..placa tet de'213-agãr em' 20 ml de Luria Broth (LB) e 10 mg /ml de tet num frasco de agita

-61-.

ção de 125 ml e desenvolveu-se;durante a noite numa incubadora em agitação por ar (New Brunswick Scinetific, New Jersey) a 30°C.

Iniciou-se depois, uma cultura de indução por adição de

0,5 ml da cultura da noite a 50 ml de LB e tet, num frasco de

500 ml, que se desenvolveu a 30°C numa incubadora com agitação por ar. Quando a cultura atingiu um valor de DO C^OOJ de 0,4, transferiu-se para um banho de agua ã temperatura de 42°c e agitou-se suavemente durante aproximadamente 20 minutos. Após a indução de calor a 42°C, o frasco foi transferido para uma incubadora de ar a 39°C (New Brunswick Scientific, New Jersey) onde foi agitado vi_ gorosamente a 250 rpm. Recolheram-se amostras imediatamente apÕs o choque térmico a 42°C e hora a hora durante 4 horas e, finalmeji te, após o desenvolvimento durante a noite, As amostras foram me didas durante o desenvolvimento por D0 (600) e analisadas seguindo-se SDS-PAGE durante o curso da síntese de proteínas mediante coloração de proteína por azul de Coomassie e por analise da mancha de Western com as sondas de anticorpos de antipeptidos de coelho (descritas antes). Com base no peso molecular relativo e na análise da mancha de proteína, a expressão de rs-T^,2 foi induzida a partir de SG936./p 199-7 seguindo-se a indução de calor a 42°C £Fí_ gura 12). Transformou-se pl99-7 em um vector de expressão Plmu-tet, um yector de expressão de E, coli, no local Ciai único (Ver Figura 11). As sequências de aminoácidos e de nucleõtidos· de p!99-7 estão representadas na Figura 11.

A expressão de solúyel de pl99-7 em E, colt foi medi da por análise da mancha de Western dos extractos- totais- das- celjj las seguindo-se SDS-PAGE utilizando anticorpos de anti-peptidos

2 χ

JB-1 ou anti-peptidos JB-2 policlonais de coelho como sondas (Fig,

12).

Construiu-se também o vector de expressão p2Q3^5 como se mostra na Figura 9B a seguir,

Começou-se com pl97-7 que tem a mesma sequência que o vector p!97-12 de (ver Figura 9A), excepto que existe uma delecção simples de nucleótidos na região não codificadora 5' a seguir ao promotor P^. Essa delecção que § uma delecção do nucleotido /^40-adenina- de p!97-12 (ver Figura 11) resultou de uma de lecção na região que foi construída a partir de ligantes de 57-60 (ver Figura 10). 0 pl97-7 contem o gene rsí^.2 que compreende

374 aminoãcidos. Alternativamente, podia-se também utilizar Ρ197-7 como um plasmideo de iniciação.

Cortou-se p!97-7 com Ciai, Cortou-se também p!95-8 (ver Figuras 8D e 9A) com Ciai, para remover a fita C1 a I -C1 a I. que cor^ tem a sequência de cDNA de rsí^.2. Subsequentemente, inseriu-se a fita Clal-Clal em p!97-7 para produzir p!98-2.

Digeriu-se a seguir, p!98-2 com StuI para remover 80 aminoãcidos (aminoãcido 185 até ao aminoãcido 264) de sequência de codificação da proteína madura, Metilação inesperada, porém, evitou o corte no segundo local StuI, de forma que apenas o local StuI no aminoãcido 184foi clivado, A seguir K ligação o DNA do plasmideo foi transformado em E. coli e examinaram-se vãrios clones de plasmídeos para a eliminação, utilizando processos padrão. Nenhum destes plasmídeos continha a delecção de StuI es-63-

perada.

A analise subsequente da sequência de DNA de um destes plasmideos, chamado p203-5, mostrou que dois resíduos de guanina (ver aminoácidos 183 e 184; nucleotidos 818 e 819 da Figura 3) da sequência de reconhecimento de StuI tinham sido eliminados a seguir a clivagem, devido a digestão de exonuclease provocada pela utilização da enzima StuI contaminada com exonuclease, Esta élj. minação de dinucleõtido produziu uma mudança da estrutura de trans. lação a seguir ao aminoãcido 182 (glutamina) e introduziu-se um codão de paragem a jusante dos seis codãos de aminoãciod por meio de um deslocamento da estrutura (Figura 9c). A metilação inesp£ rada do segundo local de StuI simultânea com a delecção deu ori. gem a um novo codão de paragem que produziu um gene codificando uma estrutura encurtada de 7/ solúvel recombinante, chamado rsT₄.7, A sequência de rsí^.7 codifica um segmento N-termi'nal do aminoãcido 182 da sequência de T₄ madura seguida de seis aminoácidos na extremidade C-asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina- de sequências de não-T^ e finalmente de um codão de pa. ragem TAA.

A expressão de T₄ solúvel a partir de p2Q3-5 em E. coli foi medida pela analise da mancha de Western como previamente se descreveu.

Expressão de T₄ solúvel e de pol i,peptidos de T^em célul as animais

Inseriram-se genes T₄ solúveis e o gene não modificado que codificam ligado ã membrana em um vector pBG368 de expressão anima

Mais especificamente, inseriu-se cada uma das construções dos genes solúveis em pBG368 sob o controlo transcricional do promotor posteriordo adenovirus para propõrcionar plasmídeos ' pBG377 : pBG380 e pBG381.

Fizeram-se também duas construções baseadas em pBG312 , chamadas pBG378 e pBG379 que dirigiram a expressão da proteína combinante de comprimento total. pBG378 e pBG379 codificam para a mesma proteína de comprimento total roas em pBG379 removeu-se uma porção de sequência, que não sofreu translação na posição 3‘. Subsequentemente para testar a expressão de solúvel recorobinante e de comprimento total recombinante submeteram^se a co-transfecção células de ovários de cricetos chineses (CHO) uti lizando uma de cada um desses plasmídeos e o plasmideo pAdD26,

Construíu-se, em primeiro lugar, pBG368 como se segue , Como se descreyeu na Figura 13, cortou-se o vector de expressão pBG312 da célula animal Z*R. Cate et al., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expnession of the Human Gene in Animal Cells, Cel 1, 45, pãgs, 685-98 (1986)J ^cora EcoRII e Bgl.’II para eliminar um dos dois locais de restrição EcoRI e um dos dois locais de restrição BglΓΙ (o local EcoRI na posição 0 e o local BI glI localizado aproximadamente na posição 99). 0 plasmideo resultante, pBG368, reteve um local

EcoRI na região de clonagem e um local BÓjjlI após a região de clonagem. Isto deixou um único local EcoRI e um único Bgllí no poliligante para fins de clonagem,

Mais especificamente, eliminou-se um 1 ocaVEcoRI e um lo cal BglII mediante digestão parcial e sequencial de pBG312 com

-65enzimas de restrição EcoRI e JBgT11, respectivamente. Preencheu-se com Klenow e 4 nucleotidos novamente ilgados para produzir pBG368 que contem locais de restrição únicos para enzimas EcoRI e

B_glII. Uma vez verificada a expressão transitória de solúvel construíram-se linhas de células estáveis que expressaram conti-

nuamente T . Para fazer isto, utilizou-se o hospedeiro de expre£ são celular estável, a linha de células de ovários de cricetos ch$ neses do mutante de delecção de di-hidrofolato redutase (DHFR’) ZF-Kao et al., Genetics of Somatic Mammalian Cells X Complementation Analysis of Glycine - Requiring Mutants, Proc. Natl. Acad, Sei. , 64, pãgs. 1284-91 (1969); L. Chasin e G, Urlab Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient in Di hydr.ofol ate Reductase Activity, Proc. Natl , Acad. Sei, , 77, pãgs. 4216-80 (1980)2,

Utilizando este sistema, submeteu-se a co-transfecção cada um dos genes construídos coro pAdA26 /r. J, Kaufman e Ρ. A, Sharp, Am plification and Expression of Sequences Cotransfected wi th a Modu lar Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Genes, 2* Mol , Biol, , 159, pãgs. 661-21 ( 1982)J7 contendo o gene DHFR de rato. Antes de realizar as co-transfecçoes, linearizaram-se todos os plasmideos mediante clivagem de enzimas de restrição e, antes da transfecção, misturou-se cada um dos plasmideos com pAdD26 de forma que a razão molar de pAdD26 para fosse de 1:10. Isto maximizou o n9 de copias do gene por transfectante.

Dentro da célula, ligaram-se os plasmideos em conjunto para formar polímeros que podem ficar integrados· nas sequências cromossómicas do hospedeiro por recombinaçao ilegítima , Haynes e C. Weiseroann, Constitutive, Long-Term Production of Human Inter

ferons by Hamster Cells Containing Multiple Copies of a Cloned Interferon Gene, Nucl. Aci ds Res., 11, pags-, 687-706 (1983) S,

d. Scahill et al,, Expression and Characterization of the Product of a Human Immune Interferon cDNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells, Proc. Natl. Acad, Sei. USA, 80, págs, 4654-58 (1983)7, Se 1eccionaram-se transfectantes que expressam o gene DHFR dos ratinhos em meios de cultura que carecem de nucleótidos. Submeteram-se então estes transfectantes a uma serie de concentrações crescentes de metotrexato, um análogo folato toxico que se liga a DHFR, para seleccionar níveis de células de DHFR,

A resistência ao metotrexato por expressão aumentada de DHFR e frequentemente o resultado da amplificação do gene DHFR que pode inhluir a reiteração de segmentos cromossómicos grandes, chamados unidades amplificadas £R, J, Kaufman e Ρ, A, Sharp, Amplification and Expression of Loss of Dihydrofolate Reductase Genes in a Chinese Hamster Ovary Cell Line, Molec, Cell, Biol,, 1, pags. 1069-76 (1981)7. Por consequência, a co-integração de sequências DHFR e rsT^ permitiram a amplificação de genes rsí^. As linhas de células transfectadas de modo estável foram isoladas por clonagem em meio de crescimento selectivo, sondadas· depois para expressão de T₄ com um antigene T₄ (RIA)JT D, Klatzmann et al., Nature, 312, pags , 767-768 (1984).7 e por imunoprecipitação a partir de meio condicionado após marcação metabólica da cisteí na com ³⁵S (³⁵S-Cys) .

Inseriu-se também o gene rsT^.7 deriyado de T4 solóvel com um plasmideo de expressão de células animais-, como se segue,

-67 —

Como se descreve na Figura 14C, cortou-se o plasmideo

pBG381 (Figura 14A) com EcoRI e Nhel, Cortou-se depois p!86—6 com EcoRI e Nhel para remover o fragmento de 786 pares de bases e ligou-se o fragmento pBG381 digerido para formar o plasmideo pBG391. A sequência de em pBG391 ê idêntica 5 descrita em Mad don et al, (1985) supra nas posições 64 (triptofano) e 231 (feni1alanina) e ã sequência de pBG381, Porem, na posição 3, a asparagina descrita por Maddon et al, e presente em pBG381 esta substituída por lisina, A sequência de nucleotidos de pBG391 es ta representada na Figura 15,

Digeriu-se a seguir, p203-5 com Nhel e QxanI para remover o fragmento de 483 pares bases. Inseriu-se esse fragmento em pBG391 digerido coro Nhel/Oxanl para formar o plasmideo pBG392, a construção da expressão de célula animal de rsT^,7, A sequência de em rsT^,7 contém aminoácidos idênticos aos da sequência de comprimento total de Maddon et al. nas posições de aminoãcido 64 (triptofano) e 231 (feni1alanina), Porém, na posição 3, a asparagina descrita por Maddon et al esta substituída por lisina, A sequência de nucleotidos de pBG392 esta repres-entada na Figura 16.

Na Figura 14D, representa-se a construção de outras cons· truções de expressão de célula animal contendo sequências· que codificam as delecções rsT^.9 em pBG394 e rsT^,12 em pBG396_t Essas·' construções realizaram-se utilizando técnicas de recorobinação cojn vencionais. Os ligantes utilizados nessas construções estão re^ presentados na Figura 18, As sequências de nucleÕtidos de pBG394 e pBG396 representam-se nas Figuras 19 e 2Q,

plasmideo pBG393 apresentado na Fig, 17 contem rsT^,8, a forma perfeita de rsT^.7. PBG393 contém 182 aroinoãcidos da se quencia de T₄ madura, sem os 6 aminoãcidos não-T₄ na extremidade C a seguir ao aminoácido 182, A sequência de nucleõtidos de BG393 estã representada na Figura 21, Podem-se construir outros plasmí deos de expressão de célula animal, de acordo com esta invenção, como se mostra na Figura 17, Incluem rsT^.lO em pBG395 e rsT^.ll em pBG397 (ver Figura 18 para ligantes específicos),

A sequência nucleotida de BG395 está representada na Fig_u ra 22.

Purificação de solúvel recombinante

A construção de solúvel recombinante pBG38Q expressa em células DHFR’ CHO foi desenvolvida para confluenciar em um meio de Eagles ^-modificado (Gibco) suplementado coro soro fetal de vj_ tela, a 10%, glutamina IroM e antibióticos de penicilina e estreptomicina (100jug/ml de cada um), As células foram desenvolvidas a 37°C em dois 21 Cell Factory Systems (Nunc), Lavaram-se depois as células confluentes livres de soro fetal de vitela coro meio de Eagles -modificado sem soro fetal de vitela e cultivararo-se as células nesse meio a 37°C durante 4 dias, Subsequenteroenté colheu-se o meio condicionado, filtrou-se através de um cartucho de filtro hidrofilico de 0,22ju Millipose Millidisk (Millipose j^M. CGL 305-01) e concentraram-se as proteínas segregadas em uma c£ luna de permuta ionica do tipo S rápida (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia ^17-0511^01) em tampão de MES 20 mM (pH 5,5).

Eluiram-se então as proteínas ligadas com Tris-HCl 20mM (pH7,7) e NaCl 0,3 Μ. A quantidade eluída foi subsequentemente diluída com 2 volumes de Tris-HCl 20mM (ph=7,7 e foi depois car regada para uma coluna que compreende anticorpos- monoclonais anti-T^ imobilizados na Thy posição 19, acoplados a Affigel-10 /7uma oferta do Dr. Ellis Reinherz, Dana Farber Câncer Institute, Boston, Massuchusetts_7· Lavou-se a coluna extensivamente e eluíu-se o material ligado sob a forma de fracções de 0,5 ml com glicina-HCl 50 mM (pH 2,5), NaCl 150 mM, EGTA 0,1 mM e 5^jg/ml de inibidor de tripsina pancreatica de boyino, Aprotinin (Sigma $ A1153). Utilizaram-se manchas de Western desenvolvidas com anti-soro de coelho contra peptidos JB-2 a seguir a purificação, Uti_ lizaram-se geles manchados de prata para seguir a ligação e a elui_ ção de rsT^.2 durante a croroatografia. A Figura 23 representa u;m gel manchado de Coomassie de rsí^.2 purificado,

A analise por cromatograf!a em coluna por calibração de gel do rsT^.2 purificado a partir da linha de células- de CHO trans^ fectada com pBG380, BG380G, sugeriu que rsT₄ é monomérico sob coji dições fisiológicas de pH e de concentração salina,

Sequenciação de proteína solúvel recombinante

Em seguida, determinou-se a sequência de aminoácidos N-terminal de uma T₄ solúvel recombinante, especfficamente rsT^.2, molécula purificada a partir do meio condicionado da linha de células de CHO transfectada com pBG380, BG380G, como se descreveu antes, mediante degradação de Edman automática em um sequenciador

em fase gasosa Applied Biosysteros 470A Z”R, 8. Peptnsky et al,,

J. Biol. Chem., 261, pãgs, 4239-46 (1986)7,

A sequência amino-terminal coincidiu com a sequência que tinha sido previamente determinada para natural solubilizada isolada de células U937, supra. As sequências amino-terminais de proteínas solubilizada natural (sT^) e rsT^ purificada são pro teínas Δ»2, quando comparadas com as sequências amino-terminals previstas por Maddon et al., (1985), supra, coro a extremidade am£ no madura localizada na posição 3 dessa sequência, As sequências amino-terminais de T^ natural solubilizada (sT^), T₄ solúvel recombinante rsT^.2 segregada por BG380G transfectante de CHO contendo pBG380 e a sequência de proteína deduzida por Maddon et al. (1985), supra são coroo se segue:

sT^: rsí^.2: Maddon et al. dos por	X-K-V-V-L-X-K-K-X-D-T-V-E-L-T-X-T-A-S-E N-K-V-y-L-G-K-K-G-D-T-y-E-L-T-X-T-A-S-E
Q-G-N-K-V-V-L-G Nas sequências anteriores	-K-K-G-D-T-V-E-L-T-C-T-A-S-E
, os aminoácidos são	representa-
códigos de	letras simples	como se	segue:
	Phe:	F	Leu: L	Ile:	I Met:	M
	Vai:	V	Ser: S	Pro:	P Thr:	T
	Ala:	A	Tyr: Y	Hi s :	H Gin:	Q
	Asn:	N	Lys: K	Asp:	D Glu;	E
	Cys:	C	Trp: W	Arg:	R Gly:	G
	X:	não	determinado ou	ambíguo

Construímos também pBG211-ll, um codificador para os 113 aminoácidos N-terminais da proteína solúvel , Esta construção, que codifica para uma proteína caracterizada por uma ponte de dis; sulfureto simples, entre as cisteínas nas posiçêes de aminoácido e 86, é expressa convenientemente em _E, coli.

Para construir ρ2Ί1-11 coroo se mostra na Figura 24, corta-se o primeiro pl95-8 (ver Figuras 8D e 9A) com Clal para remover a fita Cl al - Cl al que cpntem a sequência de cDNA de rsT^^, Digeriu-se depois, pAT-|53 3SH16^Amp; o plasmideo do promotor operão de triptofano a partir do interferão gama produzindo a estirpe E. coli BN374 coro Cl a I e eliminou-se o cDNA que codifica para o interferão gama, Subsequentemente, inseriu-se a fita Clal-C1al no plasmideo de E, coli cortado por Clal na parte da frente do promotor operão triptofano e ligou-se para produzir P196.10,

Coroo se mostra na Figura 25, submeteu-se pBG380 a mutagénese dirigida‘para o oligonucleotido para inserir três codãos de paragem translacionais em série seguindo a sequência de cDNA de T₄ que codifica para os aminoácidos 23 a 113 em pBG380, para produzir pBG394,

Construíu-se depois p211|-l 1 a partir dos fragmentos de ca da um dos p-196-10, pBG394 e pl034 como se mostra na Figura 26 , 0 primeiro fragmento que inclui as sequências do vector foi produzido por restrição de pl96-10 coro HindΓΓ e Ciai para remover a sequência de codificação da a partir dos aminoácidos 61 a 374 de rsT^.2 incluindo a sequência de vector a seguir a extremidade

3' do gene rsT^. 0 segundo fragmento, um segmento^HindlII - B g 111 que inclui ps codãos para os aminoácidos de 61-113 de rsT₄.9 seguido imediatamente por um tripleto de codãos de paragem em serie, foi isolado por digestão com Hi ndlII/Bgl11 de pBG394, 0 te£ ceiro fragmento, um fragmento BamHI-Clal que contem um sinal terminação transcricional T₄ de bacteriõfago ZjH. N, Kirsch e B. Allet, Nucleotid Sequences Involved in Bacteriphage T₄ Gene 32 Translational Seif-Regulation, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, pags. 4937-41 (1982)J foi isolado por digestão com BamHI/Clal de pl034. Ligou-se depois estes tres fragmentos para produzir p211-11, uma construção de que codifica para uma forma solúvel do amin£ acido 113 da proteína com asparagina na posição 3 de aminoãcido (i sto é, rsT^.113.1),

Submeteu-se depois p211-11 a mutagenese dirigida para o local de oligonucleõtido (Figura 27) para alterar o aminoacido na posição 3 de a asparagina para lisina utilizando o oligonucleõti do T₄-66:

5' ATG CAG GGT AAA

Scal

V

G G

AAA GTA GTA CTG

GGC 3'.

Isto produziu o plasmideo p214-10, um vector de solúvel do aminoacido 113 corrigido completamente que codifica para uma forma solúvel do aminoacido 113 da proteína T^, com lisina na

posição 3 do aminoãcido (isto ê, rsT^.113,2), Como se mostra na Figura 27, submeteu-se p214-10 a mutagênese dirigida para o local de oligonucleotido para eliminar a glutamina e a glicina nas posições 1 e 2 de aminoácido, respectivamente, da sequência de T₄, utilizando o oligonucleotido 1/ AID-87:

C

5' GTA TCG ATT TGG

ATG ATG AAA AAA

GTA GTA 3'.

Isto produziu p215-7, uma construção de T^ solúvel de amj noãcido 111, incluindo o promotor trp que dirige a expressão de uma forma soluyel de aminoácido 111 da proteína T^, com lisina na posição 3 de aminoácido (isto e, rsT^.lll),

Construíu-se a seguir p218-8 uma construção de aminoãcido 111 que dirige a expressão de uma forma solúvel de aminoãcido 111 de proteína T^, coro lisina na posição 3 de aminoãcido (isto é , rsT^.lll) sob o controlo do promotor como se descreveu na Figura 28.

Mais especificamente, cortou-se p!97-12 (Figura 9-A). coro Clal para remover o fragmento de 101 pb que contêm sequências- dé · ligamento e terminação . Cortou-se também p215-7 coro Clal para remover a fita Clal-Clal que contêm a sequência de cDNA de rsT^.lll e a seequência de terminação da transcrição de φτ^ £ Kirscli. e Allet, supra7. Subsequentemente, inseriu-se a fita Clal-Clal em p!97-12 cortado com Ciai para produzir p218-8,

Com yista a expressar rsT₄.113,l, transformou-se E, coli A89 com p211-11 mediante técnicas convencionais T/Maniatis et al. (1982), supraj para formar E, coli A89/p211 -11E, coli A89 é um derivado de E_. coli SG936 sensível a tetraciclina, Isolou^se £· ^c°li A 89 a partir de E.coli.SG936 de acordo com o método de S. R. Maloy e W. D. Nunn, Selection For Loss- of tetracycline Resistance by Escheri chi a col i¹¹, Bact, 145, pôgs, 110-12(1981) que se baseia na capacidade do ácido fusárico do agente de queía ção lipofílico para inibir selectivamente as estirpes resistentes. Mais especi ficamente, plaqueou-se E. col i SG396 em meto que contj[ nha, por litro, 5g de triptona, 5g de extracto de levedura, 10.g de NaCl, lOg de NaH^PO^.H^O , 50 mg de clorotetractclina-HCl, mg de ácido fusárico, 0,1 mM de ZnCl₂ e 15g de agar, As colónias que se desenvolveram a 30°C (estirpes supostas- sensíveis à tetraciclina) foram novamente testadas para a sensibilidade 3 tetraciclina em placas de L-agar que continham 5jug7rol de tetraci_ clina, Uma estirpe sensível ã tetraciclina designada A89. foi então considerada incapaz de se desenvolver em L'B agar a 42°C, verificando-se assim a presença da mutação htpR,

Os transformantes foram seieccionados pela resfstencia 3 tetraciclina, Colheu-se uma colónia simples em 20. ml de meto mínimo mais casaroinoacido a 0,2%, roais triptofano (100 jig/ml), roais tetraciclina (10jjg7ml) em um frasco de agitação de 100 rol colo**· cado nnma incubadora com agitação por ar a temperatura de 30°C e deixou-se desenvolver as células durante a noite, Na manhã segu inte, inocularam-se 40 ml de meio mínimo mais casaroinoãctdos a 0,2%, mais triptofano (lOO^g/ml) roais tetraciclina ClQ.jug7ml) com a cultura da noite a D0gQQ=0,05 ero uro frasco de 50.0 rol, As

-75células foram desenyolvi das até a fase semi 1ogarítroica e depois induzidas por granulação, lavando-se uma vez em um meio mínimo e ressuspendendo-se depois em um meio mínimo mais casareinoacidos a 0,2% mais tetraciclina (10jug/ml) na ausência de triptofano. Removeu-se ΰΟθθθ 0,6 de células apos 0,1,2,3 e 4 horas de incubação e apos desenvolvimento durante a noite.

As alíquotas foram centrifugadas e os- aglomerados de celu las foram submetidos a lise mediante ebulição em tampão de carga de gel Laemmli, Apos centrifugação para remover detritos de células, metade de cada uma das amostras foi submetida a SDS-PAGE seguido de analise da mancha de Western coro sondas de antipeptidos de coelho de acordo coro a presente inyenção ou roediante coloração da proteína coro azul de Coomassie (Figuras 29A e 29B),

Purificação de rsT^,113,1

Purificou-se a seguir rsT^,113,1 a partir de transforroante de £. coli roediante dois passos essencialroente quantitativos enyolvendo cromatografia de permuta anionica e croroatografias de filtração em gel realizadas sob condições de redução e desnaturação.

Mais especificamente, suspendeu-se 14 g de células molhadas a partir de uma fermentação em um frasco de agitação de 4 litros em 100 rol de um tampão de Tris 20 mM (pH=7,5)( contendo

sulfonilo (PMSF) 1 mM. A suspensão foi aplicada a uma prensa francesa sob 70,3 Kg7cm₂ (1000 psi} em duas· passagens- e depois

centrifugada num rotor Sa600 de 18000 g durante 15 minutos a 4°C, 0 aglomerado resultante foi solubilizado em 20 ml de um tampão de Tris 20 mM (pH=7,5) contendo ureia 7 M e 2-mercaptoetanol 10 mM , Submeteu-se depois a suspensão a ultracentrifugação a 85000 x g durante 90 minutos, a 4°C. 0 sobrenadante foi diluído mediante adição de 80 rol de tampão de Tris 20 mM (pH=7,5) contendo ureia 7 M e 2-mercaptoetanol 10 mm e aplicaram-se 40 rol da amostra a uma coluna de 3x4 cm de fluxo rápido de Sepharos-e-Q (Sigma, St, Louis, Missouri) que tinha sido pré-equi1ibrada no mesmo tampão, A coluna foi desenvolvida com um gradiente em uro volume total de 400 ml com aumento de NaCl de 0 a 0,3 M no mesmo tampão de Tris/ /ureia/2-mercaptoetanol, As fracções da coluna foram controladas por absorção a 280 nm e por conteúdo de proteína roedtante SDS-PAG'E. (15% de acri1amida), As fracções foram também analisadas por manchas de Western, A A Figura 30 painel (a) é uro croroatograma que representa a purificação de rsT^JU,! mediante cromatografia de permuta ionica, Nessa figura identificam-se os picos que contêm rsT^.113,1 . Verificou-se que rsT^, 113,,1 e eluído no início do gradiente de NaCl e separa-se bem dos contaminantes- de baixo peso molecular,

Coro yista a separar rsT^,113,1 dos contaminantes de eleva, do peso molecular, realizou-se a cromatografia de filtração coro gel de uma mistura que continha rsT^,113,1, para purificação final da proteína ate próximo da homogeneidade (>95% de pureza), Mais especificamente, preparou-se uma fracção que continha 20 mg de proteína em 50 rol e depois concentrou-se até 10 ml numa unida, de de ultracentrifugação de células agitada (Amicon, Danvers-, M, A,) utilizando uma membrana PM-30 (Amicon), Subs-equenteroenté , —7 7 —

aplicou-se 5,0 ml do concentrado a uma coluna de 1,5 x 95 cm S-300 (Sigma) equilibrada e desenvolvida coro o mesmo tampão de Tris/ureia/2-mercaptoetanol. Controlaram-se as fracções da colu^ na relativamente ã absorção a 280 nm e ao conteúdo de proteína m£ diante SDS-PAGE. As fraçcçoes foram também analisadas mediante manchas de Western e preparou-se depois, uma mistura contendo rsT^.113.1 (aproximadamente 4 mg) em 15 ml. A Figura 30, painel (b) é um cromatograma relativo B purificação de rsT^, 113,1 mediaji te separação por filtração coro gel da mistura de rsT₄,113,1, Nessa figura os picos das fracções que continham rsT₄,113.1 estão i denti fi cados.

A Figura 30, painel (c) é uma analise SDS-PAGE relativa ã purificação do derivado rsT^ mediante cromatografia e centrifugação. Na Figura 30, painel (c) os sectores descritos são;

sector A: padrões de pesos moleculares sector B: extractos de células sector C: aglomerado de célula a seguir B solubilização do extracto de células ero condições não desnja turantes sector D; sobrenadante a seguir B solubilização do extracto de células era tampão não desnaturante sector E; sobrenadante a seguir ao passo de ultracentj_ fugação sector F; mistura de Sepharose Q sector G: mistura de filtração com gel S-3Q0 —78 —

Novo tratamento (Refolding) de rsT^ . 113,1 purificado

Tratou-se de novo (refolded ) o rsT^,113,1 purificado mediante diluição e diãlise submetendo-o a condições de não-desnaturantes e oxidantes, Mais especificamente, o novo tratamento (refolding) da proteína para uma concentração de 0,5 DO (280) / /ml foi atingido mediante o processamento de diãlise contra 500 volumes de ureia 3 M, Tris (pH=7,5) 20 mM; 500 volumes de ureia 1 M, acetato de aroonio 0,1 M (pH=6,8) e finalmente o mesmo volume de uma solução salina tamponada com fosfato, Através do novo tra. tamento (refolding), as amostras da proteína foram controladas para o conteúdo relativo mediante analise espectral e mediante cromatografia em fase líquida de alta resolução (HPLC) realizada em um sistema cromatogrãfico em fase líquida 15QA (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CalifÕrnia),Uma coluna de octasililo (Aquapore Rp-300, 0,46x3,0 cm) foi equilibrada em 80% de acido trifluoroacetico a 0,1% (TFA)/agua (dissolvente AÍ e 20% de TFA a 0,085%/acetonitri1 o a 70% (dissolvente B) e desenvolveu-se com um gradiente linear de aumento de concentração de acetonitrilo dejs de 20% ate 80% (dissolvente B) durante 45 minutos a um caudal de 0,5 rol/roi n,

Como se mostra na Figura 31, painel (a), a proteína em ureia 7M, 2-roercaptoetanol 10 roM e Tris 20 mM (pH=7,5) eluiu-se a partir de uroa coluna de HPLC com acetonitrilo a 49% no gradierite. Em passos subsequentes, a partir de ureia 1 M/acetato de amõ nio 1 mM (pH=6,8) /Figura 31, painel (b)7, ate solução salina tara ponada com fosfato /Figura 31), painel (c)7, verificou-se um auroer to da percentagem de rsT^,113,1 que eluiu primeiro no gradiente

de HPLCcom acetonitrilo a 47%, A identidade do pico do início da eluição como produto oxidado foi verificada por redução de rsT^, .113.1 em soluções não caotropicas e processamento da amostra assim tratada por HPLC nas mesmas condições,

A eluição de rsT^,113,1 oxidado antes da proteína reduzida em HPLC sugere que a formação de pontes de dissulfureto simples dj_ minuem a hidrofobicidade relativa da proteína £ J, L, Browing et al., Anal. Bi ochem, 155, pags, 1 23-28 (1986//, A anãlise espectral de rsT^,113.1 foi realizada durante o novo tratamento (refolding) com yista a controlar o rendimento relativo da proteína solúvel do procedimento, Este método de tratamento permitiu recu perar aproximadamente 20% de rsT₄.113,1, A anãlise de HPLC indicou uma quantidade inferior a 15% de contaminante de proteína reduzida na preparação (Figura 30, painel (c), sector G),

Sequenciação de rsT^llS com as características iniciais recuperadas

Realizou-se então a anãlise de aminoãcidos de rsT₄,113,1 mediante degradação automatizada de Edman num sequenciador em fa se gasosa Applied Biosysteros 470A equipado com um sistema de dados 900A. Os aminoãcidos feni1 tio-hidantofna gerados no decurso da química de degradação foram analisados em série utilizando um analisador Applied Biosystems 120A PTH equipado com uma coluna de 2,1x220 mm PTH-C18, A proteína (10Jug) para análise de sequência foi aplicada a SDS-PAGE (15% de acrilamida) e electrocolorida numa membrana Imroobilon (Millipore Corp,, Bedford , Massachusetts} coroo descreveu P, Matsudaira, J, Biol, Ghero,,262, pãgs-, 10035-38

-8Q-

(1987).

A analise de aminoácidos das amostras de proteína foi re£ lizada mediante hidrólise da proteína em HC1 6N, sob vazio, duran te 24 horas a 11Q°C, Os hidrolisados foram depois analisados em um analisador de Beckman 6300 equipado com detecção pos-coluna por ninidrina. A analise da mancha de Western dos geles SDS-PAGE foi realizada por técnicas padrão utilizando anti-soro JB-1 de coelho.

A analise de sequência revelou uma sequência de terminal amino: Met-Gln-Gly-Asn-Lys-Yal-Vai--Verificou-se que a proteína rs T^.113.1 purificada continha quantidades estequiométricas de metionina de terminal amino colocada na estrutura da proteína para expressão em E. coli e uma cadeia polipeptidica intacta consistente com uma sequência derivada da construção do plasmideo. A recuperação de feniltio-hidan toíni1-metionina no primeiro ciclo da química de degradação foi 60% consistente com os rendimentos'iniciais decrotina obtidos no Edman automatizado. Esta observação exclui a possibilidade de uma percentagem significativa do rsí^.113.1 carecer de metionina de iniciação, isto ê, a N^-metionina não foi removida pela expressão de rsT^.113.1 em E. coli ou de uma analise da sequência ser prejudicada pela presença de glutamina no primeiro ciclo da química de degra dação. A análise de sequência foi realizada durante 40 ciclos e não se observou nenhuma evidência de carbanilação da lisina. A análise de aminoácidos revelou uma correleção estreita dos valores teoricos e reais para os aminoácidos, indicando assim a ausência marcada da degradação proteolítica no decurso da expressão ou purifi—81 —

/ cação ou ambos.

Imunoprecipitação de linhas de células de CHO produzindo solúvel

Testou-se o meio condicionado das células CHO -marcadas- m^e

Ο r tabolicamente coro S-Cys transfectadas com uma das construções T^ mutantes pBG377, pBG380, pBG381, construção pBG379 de T₄ recom binante de comprimento total desta invenção ou com apenas o vector, para determinar se algum deles produziu uma molécula reconhe cida pelo anti-corpo T₄ monoclonal 19 Thy. Para realizar este te£ te incubou-se cerca de IO⁷ células deCHO transfectadas coro pBG380, pBG381, pBG377, pBG379 ou cora pBG312 durante 5 horas a 37°C com 180 jjCi/ml de cisteTna marcada coro ^Dupont, New England NudT.ear/ em 4 rol de meio RPMI Cys' (Gibco). Apos marcação das células, 1 rol do meio condicionado filtrado transformou-se ero 0,5 toM com fluoreto de feni1-meti 1-sulfoni1 o e foi imunoprecfpitado com 0KT4 e Sepharose de proteína A £P, H, Sayre e E, L, Reinherz , Eur. J. Immunol., 15, pãgs. 291-95(19851/. Subsequenemente, incubou-se o meio das células marcadas com ³⁵S com 0KT4 (ATCC$CRL 8002), Imunoprecipitou-se a seguir com Sepharose de proteina A e submeteram-se os imuno-preci pi tados a SDS-PAGE sob condições rje dutoras ero geles de poliacriTarai da a 10$ Z*U, K Laemml1, Nature, 227, pags. 680-85 (19801/. Realizou-se a auto-radtografia com p£ lícula de raios X X^Omat (Eastman Kodak).

Coroo se mostra . nos sectores 3-5 da Figura 32, pBG38Q (rsT₄,2) e pBG381 (rsT^.3) dirigiram a síntese de uma proteína T₄ segregada, imune, marcada com S que foi reconhecida pelo anti-82-

ι

-corpo Τ/ de ΟΚΤ^. 0 imunopreci pi tado truncou moléculas migradas como proteínas 49Kd, um resultado consistente coro os seus pesos moleculares previstos. Em contraste, nenhum antigene pode ser detectado no meio condicionado de linhas de células transfectadas de modo estável com pBG377 (rsT^.l) ou pBG379 (rftT^), A análise da imunoprecipitação dos extractos celulares das linhas de células transfectadas com pBG377 sugere que 0 gene rsT^.l pode estar mal dobrado (misfolded) 0 que podia acontecer para um bloco na sua secreção £ M, J. Gething et al., Cel 1, 46, págs, 939--50(1986)/,

Na Figura 32, os sectores representam 0 seguinte: sector 1: imunoprecipitação do meio condicionado de células CHO co-trans fectadas de modo estável coro vectores pBG312 e pAdD26, Sector 2; branco. Sectores 3 e 4: imunoprecipitação do meto condicionado de células CHO-C.O-transfectadas de modo estável com pBG380 (rsT^.2) e pAdD26. Sectores 5 e 6: imunoprecipitação do meio coji dicionado de células CHO co-transfectadas de modo estável coro pBG381 (rsT^.3) e pAdD26. Sector 7: imunoprecipitação do meio condicionado de células CHO co-transfectadas de modo estável com 17 recorobinante de comprimento total (pBG379) e pAdD26, Na Fi gjj ra 32 a seta indica a posição prevista do solúvel a partir de pBG380 ou pBG381 relativos B migração de marcadores de peso molecular padrão.

Imunoprecipitação de linhas de células COS 7 que produzeroT^ solúvel recombinante

Expressou-se os derivados pBG392_? pBG393 e pBG394 de soluyel recombinante em células C0S7 por electroporação, es-sen—83 —

cialmente como descreveu G. Chu et al, , EIectroporation for the Efficient Transfection of Mammalian Cells with DNA, Nuc. Acids Res. , 15, págs. 131 1-26(1987). Mais especificamente, introduziram-se 20 jjg de DNA de plasmideo circular fechado e 380 jjg de veí culo (DNA de esperma de salmão agitado por som) em 3x10? células de COS 7. As células foram submetidas a electroporação utilizando um Pulsador de genes (Biorad) ajustado para 300 volts-, Subsequeji temente, incubaram-se células COS '7 em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitela, duran te 24 horas. Colheu-se depois os meios condicionados, filtrou-se através de um cartucho de filtro hidrofilo de 0,22ju Millipore MiJ lidisk (Millipore MCGL 305-01) e concentraram-se as proteínas segregadas numa coluna de permuta iõnica S rãpida (S-Sepharase Fast Flow, Pharmacia -^17-0511-01) em tampão MES 20 mM (pH=5,5).

Eluiu-se a seguir as proteínas ligadas: com Trls-Hcl 20 mM (pH=7,7) e NaCl 0,3 Μ. A mistura de eluição foi subsequentemente diluída coro 2 volumes de Tris-HCl 20 mM (pH=7,7) e carregou-se d£ pois numa coluna que compreende tanto anti-anticorpo monoclonal na posição 19 Thy e Sepharose de proteína A coroo OKT^A e Sepha_ rose de proteína A. Lavou-se a coluna extensivamente e elutu^se 0 material ligado com fracções de 0,5 ml coro gl ieina-HCl 50 roM (pH=2,5) , NaCl 150 roM, EGTA 0,1 mM e 5 jug/rol de inibidor de tri£ sina pancreático bovino, Aprotinina (Sigma, ^A1153). Os imune) precipitados foram submetidos a SDS PAGE (10% de ge!£ seguido por imunocoloração contra anti-soro de coelho desenvolvido contra 0 peptido JB-1. Utilizou-se geles corados de prata a seguir B liga, ção e eluição de rsT^ durante a cromatografia,

A Figura 33 descreve uma análise de imunomancha de pBG392 expressa transitoriamente (rsT^.7) /Sectores 10,117; pBG393 (rsT^.8) / sectores 10,117 pBG393 (rsT₄,8) £* sectores 4,7,87 ^e pBG394 (rsT₄.9) £ sector 5j, Os padrões são 50 ng de rsT^.3 puri. ficado (sector 1), 150 ng de rsT^.3 purificado (sector 2) e 250 ng de srT^.3 purificado (sector 3). A seta indica a posição esperada de migração de uma proteína com o peso molecular relativo de rsí^.7; 21000 daltons. A amostra que foi carregada no sector 4 perdeu-se e os sectores 6 e 9 estão sem resultados (blank).

Como se mostra nos sectores 10 e 11 da Figura 35, pBG392 (rsí₄,7) dirigiu a síntese de uma proteína imune segregada que foi reconhecida pelos anti anti-corpos T₄ OKT^A e 19 .T,h’.y, os sectores 4, 7 e 8 também demonstraram que pBG393(rsT₄,8) dirigiu a síntese de uma proteína imune segregada que foi reconhecida por OKÍ^A e 19Thy. Esta análise ilustra que rsí^.7 contem o epítope OKT^A, Sugere também que a região de ligação para HIV envolve resíduos de ligação nos resíduos de de terminal 182 amino,

Pelo contrário, nenhuma quantidade de solúvel podia ser detectada no meio de linhas de células transfectadas com pBG394 (rsí^.9) Z^ver sector 57. A análise de imunoprecipitação de ex tractos celulares de linhas de células transfectadas com pBG397 mostrou, porém, que rsí^.9 foi reconhecido por OKí^.A. Admite-se que rsí^.9, uma estrutura de 113 aminoácidos, liga o virus HIV e representa uma segunda geração de T₄ solãvel, uma com apenas duas cisteínas e uma das três pontes de dissulfureto,

Por consequência., rsí^.9 e produzido, facilmente em E, co85li ou sistemas de levedura.

De um modo semelhante, embora nenh.uma solúvel pudesse ser detectado nos meios de linhas de células transfectadas com pBG396 (rsT^.lZ) a analise de extractos celulares dessas linhas de células mostrou que rsí^.12 foi reconhecido por OKT^A, Deste modo, rsT^.12 pode também ligar-se ao vírus HIV.

Radio-imuno-ensaio e analise de epítopes de rsí^,113

Coro vista a determinar se o fragmento 113 de rsí^ continha determinantes estruturais para ligação a OKT^A, Leu-3A e OKT^, realizou-se a seguir o radio-imuno-ensaio e a analise de epítopes de rsí^.113 utilizando um radio-imuno-ensato de inibição competitivo ZC. J. Newby et al,, Solid-Phase Radíotmmune Assays in Handbook of Experimental Emmunology, D, M, Wein (Ed,), 1, pãgs, 34,1-34,8 (1986)J, Como OKT^A e Leu-3A bloqueiam a infecção de HIV i n vitro £ Dalglei sh et al., supra/ e ligação de a gp 1207 /160 AMcDougal et al,, supra/’, esta análise serviu como uma primeira aproximação para se saber se rsT^.113 continha ou não elementos estruturais para interacçao com HIV,

Revestiram-se, primeiro, placas de mtcrotttulação de 96 cayidades com o fundo em forma de U (Falcon) com 50 jul/cavidade de anti IgG de ratinho, desenvolvido em cabra ('Hyclone Typing Kit,

Logan, Utah) em PBS (pH=7,0) até uma concentração de 50. ^ig/ml e incubaram-se as placas, durante a noite, a 4°C, Lavaram-se as pia cas coro IxPBS e mancharam-se a seco, As placas foram, depots, b.l<?

—86 —

queadas mediante a adição de 100

IxPBS contendo 5% de albumina de soro bovino, durante 1 hora ã temperatura ambiente. Enxaguaram-se as placas com PBS, mancharam-se a seco e depois mancharam-se com 50jul de uma das tres s£ luções de anticorpos que contem OKT^ (10 jug/ml em tampão de bloqueio), OKT^A (500 ng/ml em tampão de bloqueio), como também Leu-3A (Becton-Dickison) (500 ng/ml em tampão de bloqueio). Deixaram-se repousar as placas durante 2 horas· ã temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas 3 vezes com uma solução PBS Tween-80 a 0,05% e 2 vezes com 1 xPBS e manch.aram-se a seco,

Numa placa separada, titularam-se amostras: concorrentes de rsT^,113.1 não marcado a partir de 20 yig/ml e dilufram-se duas vezes em serie não incluindo nenhum controlo concorrente), com yolumes finais em cada cavidade de 25 yjl, 0 controlo posi tivo para este ensaio foi noãci dos).

125_T

I que i a competição com rsT^.S não marcado (375 ami_ Adicionou-se, depois, 25 jil de rsT^,3 marcado com contem 10000 cpm/25jul (preparado de acordo com A, E, W. M. Hunter, Radioimmunoassay and Related Methods, Chaj) Subsequentemente, manchou-se todo o conteúdo de 50jul

Bolton e ter 2c).

de cada cavidade das placas de ensaio contendo cada uma das tres soluções de anticorpos e incubou-se durante 2 horas B temperatura ambiente. Lavaram-se as placas três vezes com solução PBS/ /Tween-80 a 0,5% e 2 vezes com 1 x PBS, manchou-se a seco e con taram-se depois as cavidades num contador dé raios gama de Beck man para radioactividade.

Como se mostrou na Fig, 34, rsT^.113,1 compete com rsT₄,3 125 marcado com I para a absorção com uma fase solida de OKT^A de —87 — / um modo que e função da dose. Adicionalmente, rsT₄,113,1 compete

125 com rsT^.3 marcado com I para a absorção com uma fase sólida de Leu-3A em uma forma dependente da dose, Relativamente ao rsT^.3 não marcado, o rsT^,113,1 exibe uma afinidade molar para aqueles anticorpos com um factor igual a 3, Na gama de concentrações compreendida entre 0,4 e 25^ug/ml testada, rsT^.113 não competiu com rsT^.3 radiomarcado para ligação a 0KT₄, Num ensaió-j semelhante observou-se que rsT^.l11 também compete com rsT^,3

125 marcado com I para ligação a OKT^A e Leu-3A, mas não a OKT^ £* Fi guras 35-377·

Com base nestes resultados, pensa-se que os epítopes para OKT^A e Leu-3A estão contidos entre os 113 aminoácidos aminoterminais de T₄. Admite-se também que 0 epítope para ligação de 0KT₄ esta localizado no terminal carboxi do polipeõtido T₄,

Por consequência, pensa-se que 0 domínio de ligação gpl20 esta localizado entre os aminoácidos 113 ou 111 araino-terminais da proteína T^. Com base nesta convicção, sintetizaram-se vários oligopeptidos. que continham sequência dentro desse domínio estrutural. Esses oligopeptidos estão representados na Figura 3 como se segue:

01 i gopeptido	Coordenadas? de aminoácido
JB-l	44-63
rsT4#6	1 8-29
rsí4#7	5-56
rsí4#8 rsí4#>9	84-97 30-63

^-88-^

Sintetizaram-se esses peptidos utilizando técnicas de síntese de fosfonamido-DNA convencionais £ tetrahedron Letters, 22, pãgs. 1859-62 (1981 Sintetizaram-se os peptidos num sin tetizador de DNA Applied Biosystems 380 A e purificaram-se através de electroforese de gel.

Ensaio ELISA para rsT^.113

Realizou-se um ensaio ELISA para rsT^,113,1 produzido por E. coli transformado por p211-11, Mediante este ensaio, fi_ zeram-se diluições na solução de bloqueio, e entre cada passo , lavaram-se as placas com PBS/Tween-20 a 0,05%, Mais especifica, mente, revestiram-se as cavidades de placas de Immulon 2 (Dyna(IgG2b) em tampão de bicarbonato 0,05 M até /cavidade e incubaram-se as placas, durante tech, Chantilly, Virginia) coro D0 0,005 (280 nroj/ml de OKT^ um volume de 50 Ju 1 / a noite, a 4°C, Bloquearam-se depois as placas com albumina de soro bovino a 5% em

PBS 200 jul/cavi dade e incubou-se durante tura ambiente,

30.

minutos-, ã temperaSubsequentemente, adicionaram-s?e 50jul de 5Q ng/ml rsí^.3 a cada cavidade, incubando durante a noite, a 4°C, de

Adicionou-se a seguir, 5Qjul/cavidade de uma mistura contendo rsT^, 113,1 e 10 ng/ml de OKT^A e incubou-se durante 2 horas e meia ã temperatura ambiente, Utilizando um Hyclone Kit (Hyclonel, realizaram-se os passos seguintes, Em primeiro lugar, adicionou-se uma gota de anti-IgG2a de ratinho de coelho a cada cavidja de e incubaram-se as placas durante 1 hora B temperatura ambiente, Adicionaram-se depois ΙΟΟ^χ,Ι de anti-IgG de coelho marcado —89 — cora peroxidase, diluíu-se a 1:4000 com tampão de bloqueio para

cada cavidade, e incubou-se durante 1 hora ã temperatura ambienPreparou-se ura reagente de substrato como se segue, Di-¾ luíu-se reagente de substrato a 1:10 em agua destilada e adicionou-se dois comprimidos de cromoforo,O-feiTil-etilenodiarói.la (OPD), por 10 ml de substrato. Deixou-se a mistura dissolver completamente misturando-a com redemoinho. Alternati varoente, pode-se utilizar um sistema de substrato de peroxidase TMB (Kirkegard & Perry Catalogue 50-76-00), Subsequentemente, adicionou-se 100^11 da solução de cromoforo a cada cavidade, incubou-se durante 10 a 15 minutos ã temperatura ambiente e depois interrompeu-se o desenvolvimento da cor com 100Jil de HpSO^ TN, Mediu-se, depois, D0 a 490 nm, utilizando um leitor de planos ELISA.

Os resultados do ensaio apresentam-se na Figura 38,

Submeteram-se a seguir as proteínas T₄ solúveis produz/ das pelas construções T de acordo coro a presente invenção a vã rios ensaios funcionais,

Ensaios da Actividade Antiviral de Τη Soluve1

A activida-e antiviral de T₄ solúvel de acordo com a presente iji venção foi calculada utilizando modificações de vários sistemas in vitro utilizados para estudar agentes- antivirais e neutral/ zar anticorpos D. Ho, et al., Recorobinant Human Enterferon

-90Alpha (A) Suppresses HTLV-III Replication in Vitro, Lancet,, pãgs. 602-04 (1985); K, Hartshorn et al,, Synergistic Inhibition of HTLV-III Replication in Vitro by Phosphonoformate and Recombi_ nant Interferon Alpha-A, Antimicrob Ag Chemoth, 30, págs, 189-91 (1986)J.

Para cada um destes ensaios, prepararam -se concentrações escalonadas de T^ solúvel e prê-i ncubaram-se com um isolado ΠΙΒ derivado de H_g de HIV /furna oferta dos Drs, M, Popovic e R, Gallo, National Câncer Institute, Bethesda, Maryland7, 0 isolado foi mantido como uma cultura infectada cronicamente em células Hg. As quantidades armazenadas dè HIV livre de células foram obtidas a partir de fluidos sobrenadantes de culturas- H_g infectadas com HTL'V-111 (condições de cultura; 1x10® células/ml com 75% de células viãyeis), Prepararam-se series de 10 diluições de T₄ solúvel recombinante variando entre 10 picogramas/ml e 10 microgramas/ml e incubaram-se com 50% de doses infecciosas de cu^ tura de tecidos (TCID₅₀) de HIV durante 1 hora a 37°C, em RPMI-1640 suplementado coro 20% de soro fetal de vitela inactivado por calor (FCS). Adicionaram-se depois 150jul de células- H_g atÕ uma concentração final de 0,5x10® células/ml que não foram infe£ tadas por HIV nas cavidades que contêm allquotas de T₄ solúvel recombinante/mistura de HIV,

preparada em triplicado em series de 2 diluições- durante 1 hora a 37°C antes da inoculação de 1,5 a 2x10® células H9 em 5 ml de

(10 mM), penicilina (25 0 Ju/níl), estreptomicina (250 jjg/ml) e 1.

L-glutamina (2 mM) . Nos dias 5,6,7,10 e 1-4 exarotnou-se cada uma das culturas relativamente aos efeitos citopaticos· caracte rísticos (CPE). A neutralização foi definida coroo a inibição de formação de syncytia comparada coro controlos-, controlo positivo utilizado foi soro de neutralização de seropositiyo HIV, coroo descreveu D. D, Ho et al,, em Huroan Immunodeficiency Virus Neutralizing Antibodies Recogntze Several Conserved Domains On the Envelope Glycoproteins, J.* Virol. , 61, pãgs. 2024-28 (1987). Os controlos negativos utilizados foram soro seronegativo HIV sozinho e também apenas tampão,

Ensaio de efeito citopãtico (CPE)

Neste ensaio, seguindo protocolos convencionais para enV saios de efeito citopãtico Z^Klatzmann et al, (1 984),'S-upra e Wong-Staal and Gallo (1985), supra J exarai nararo^se mfcroscopi ca_ mente as células Ηθ para evidenciar os efeitos citopatteos de Hiy.

+ +

CPE foi registado numa escala de 4 pontos de 1 a 4 representando 4⁺ o grau roais elevadÓ de CPE,

No décimo quarto dia as cayidades que continham T₄ solúvel recombinante de acordo coro a presente invenção (rsT₄«2 derivado da linha de células BG38Q CHO transfectada com pBG380.) para 10 Ug/ml e não apresentaram nenhuma evidencia de CPE enquanto

-92+ + o controlo negativo apresentou 1 a 3 CPE,

Radio-imunoensaio p24

Testou-se a seguir solúvel como um inibidor de replicação virai num ensaio de replicação do virus HTV de acordo com D. D. Ho et al., J. Virol., 61, pãgs. 2024-28 (1987) e J, Sodor£ ki et al . , Nature, 322, pãgs, 470-74 (1986), Realizou-se o ensaio essencialmente como se descreveu excepto que as culturas f£ ram propagadas nas cavidades do microtitulador que continha 200jul , Neste ensaio, calculou-se a capacidade dos polipeptidos T₄ solú veis da presente invenção para bloquear a replicação de HIV como se mediu através da produção de antigenes p24 de HTV. Tiravam-se amostras de sobrenadantes duas vezes por semana para o antigene p24 de HIV como se descreve a seguir.

Obteve-se um conjunto (Kit) de ensaio /*HTLV-III p24 Ra_ dioimmunoassay System, Catalogue .N9 NEK-040, NEK-040A, Biotechonoly-Systems, New Research Products, Dupont7 que contem um antigeno p24

125 de HIV marcado coro I puri ficado ,por afinidade, um anti-anticorpo p24 de coelho e um segundo anti-anticorpo de coelho desenvolvido na cabra o qual é utilizado para precipitar complexos de antigene-anticorpo. Realizou-se o ensaio de acordo coro o proto colo incluído, com o conjunto (Kit), Por consequência, misturou-se a amostra a ensaiar ou uma de uma série de quantidades de antigene p24 nao marcado coro uma quantidade fixa de p24 mar1 25 cado com I e uma quantidade limitada fixa de anti-anti corpo p24 de coelho, Incubaram-se as amostras durante a noite ã temperatura ambiente e adicionou-se depois uma composição de anti-937

-imunoglobulina de coelho desenvolvida na cabra durante 5 minutos a 40°C. Centrifugaram-se as amostras num micrÕfugo e aspi1 25 ' rou-se o fluido sobrenadante, 0 p24 marcado com I em forma de aglomerado foi quantificado para cada amostra por contagem ga

25 ma e construíu-se uma curva padrão para I p24 substituído por quantidades conhecidas de antigene adicionado a tubos padrão. Calculou-se depois o p24 marcado com ¹²⁵I substituído pelo anti_ geno presente nas amostras desconhecidas, por interpolação, utilizando a curva padrão construída a partir de quantidades conhecidas de antigeno p24 contido nas amostras padrão, Os resultados apresentam-se no Quadro a seguir,

	ENSAIO DE	p24 DE ΙΝΓΒΙΟΑΟ DA REPLICAÇAO DE HIV
	rsT^.2	soro do	CPM	% Ligado/
Di a	(Jjg/ml)	paci ente	médio	/não ligado
7	negati vo	344	8,5
	-	Posi tivo	2,237	112,4
	0,5*	-	551	19,9
	5,0**	-	1 ,766	86,6
10	-	Negati vo	230	2,2
	-	Posi ti vo	2,459	124,6
	5,0**	-	322	7,3
	-	1,980	96,3
	-	Negati vo	221	1 >θ
	-	Posi tivo	2,284	115,0
	0,5 * .	-	246	3,1
	5,0 **		1 ,988	98,7

-94·>

Estes resultados demonstram que solúvel de acordo com a invenção, para uma concentração de 5 Jag/ml, inibe completamente a replicação do yirus tal como se mediu neste ensaio padrão de 14 dias. Estes resultados estão também indicados no Fig, 39 sob a forma gráfica. Na Fig, 39, os valores foram calculados a partir de uma curva padrão de p₂^, de acordo com as instruções do Kit de ensaio.

* Acreditou-se inicialmente que esta concentração fosse de 1,0 jjg/ de que 1 unidade de absor/ml baseado na aproximação preliminar vancia a 280 nm ( Α_9βη) era equivalente a 1 mg de rsT absorvanci a ₂₈₀) era equivalente a 1 mg de rsT^.2, A a 280 nm e uma primeira aproximação comummente utia concentração de proteína, ApÕs a análise de amiproteína, porem, verificou-se que tinha um coeficieji te de extinção mais elevado do que o inicialmente suposto coro 1 lizada para noacidos da unidade A₂₈q de rsT^.2 equiyalente a 0,5 mg da proteína.

** Esta concentração foi inicialmente considerada igual a lOjug/ /ml baseado na aproximação preliminar de que T unidade de absorvancia a 280 absorvanci a nm (Α₂₈θ) era equivalente a 1 mg de rsT^.2, A a 280 nm é uma primeira aproximação comummente uti a concentração da proteína. Após a análise de amilizada, para noacidos da proteína , verificou-se, porem, que tinha um coeficiente de extinção maior do que o inicialmente suposto com 1 unji dade Α₂₈θ de rsT^.2 equiyalente a 0,5 mg de proteína,

Realizou-se um ensaio de replicação de p^₄ como se descreveu atrás, excepto que o T₄ solúvel foi adicionado a culturas infectadas durante a realimentação nos dias 3,7 e 10, com vista a manter uma concentração de rsT₄ constante através do período de infecção. Os resultados deste ensaio estão indicados no Quadro a seguir.

INIBIÇÃO DA REPLICAÇAO DE HIV COM CONCENTRAÇÃO

CONSTANTE DE rsT^

rsT4,2	P24
pjg/ml)	(ng/ml)
0,008	770
0,031	970
0,125	85
0,5	0.
5,0	Q
0	1120
não infectado	0
Estes resaultados demonstram que	quando a proteína T4 s£
lúyel de acordo com esta inyenção foi mantida a uma concentração
constante durante o período de infecção,	bastou apenas cerca de
0,125 lig/ml da proteína para bloquear substancialmente a replic-a
ção de 250 TCID5Q7ml de HIV-1.
De um modo vantajoso, a proteína	T4 solúvel de acordo com

esta inyenção, para concentrações excedendo bastante as necessã rias para bloquear a replicação virai não exeree efeitos imuno-.

-9 6 — toxico in vitro, coroo roedido pelos tres ensaios de proliferação

de linfócitos - resposta de linfócitos mista, fito-hemaglutinina e resposta estimulada de tétano,

Ensaio de inibição de Syncytia

Para estabelecer ainda o efeito de solúvel na ligação T^-HIV env calculou-se 0 efeito de duas preparações da proteína solúvel da presente invenção nas propriedades syncytiagenicas de HIV no ensaio de co-cultura. Realizou-se um ensaio de fu são celular C8166 como se descreve em B. D, Walker et al,, Proc, Natl. Acad, Sei. USA, 84, pãgs. 8120-24 (1984),

- -r

Incubaram-se 1x10 células H9 infectadas de modo crónico com HTLV-IIIB, durante 1 hora a 37°C em 5% de COg com virias co_n centrações de uma de duas preparações de rsT₄,2 em 150^1 de meio RPMI-1640 suplementado coro 20% de soro fetal de vitelo, Adiciona, ram-se a seguir 3x1o⁴ C1866 células ero 50yil de roéfo (uroa linha de linfócitos de sangue de cordão umbilical humano transformado em T₄ ⁺) £’S°droski et al em lúvel foram 0,5jjg/ml ,, supraj, ató um volume final de 0,2 ml cada cavidade. As concentrações finais das cavidades de so * e 5,0 yjg/ml* para a preparação ^1 e 1,25 jug/rol* e 12,5 jug/ml* para a preparação $ 2, Contou-se depois 0 * Estas concentrações foram inicialmente supostas coroo iguais jjg/ml, 10 jug/ml, 2,5 jug/ml e 25 jug/ml baseadas- na aproximação preliminar de que' 1 unidade de ãbsórvãnci a a. 28O..nm (Α₂₈θ) era equivalente a 1 mg de rsT₄,2, ApÕs a analise de aminoãcido da proteína, porem, verificou-se que tinha um coeficiente de extinção maior do que 0 inicialmente admitido á.endo uroa unidade de

A280 de rsT₄,2 equiyalente a 0,5 mg da proteína.

^97

n9 total de syncytia por cavidade 2 horas e 4 horas- apôs a adj ção de C8166 células a 37°C em 5% de CO^. Co-culturas paralelas utilizaram tampão isolado (controlo negativo) ou OKT^A a *25·ι

(controlo positivo) como controlos

Considerou-se resultado positivo uma redução de 50% da syncytia comparada com os controlos ao fim de um tempo em que, pelo menos, 100 syncytia 4 por 10 células Hg infectadas estavam presentes nas culturas de controlo. Os resultados deste ensaio apresentam-se a seguir, na

Fig. 40 (dados ao fim de 2 horas),

INIBIÇÃO EM ENSAIO FUSÃO DE C8166

		% de	i ni bi ção*
Preparação	ZrsTr2J (jig/rol) 0	2 horas 4 horas
tampão	0	0
rsT4.2	0,5**	30	42
rsT^.2	5,0**	54	47
rsT4.2	1 ,25**	16	21
rsT4.2	12,5**	77	55
0KT4A (25JUg/ml)	0	100	100
* Todos os ensaios	foram realizados em	triplicado e	determi nou

-se o numero médio de syncytia contado por cavidade para calcu lar a % de inibição, A % de inibição representa a diferença entre o numero médio de syncytia no controlo negativo (sem rsT^ ou OKT^A) e 0 numero médio de syncytia contado quando rsT₄ ou OKT^A estavam presentes durante 0 ensaio, dividido pela contagem media de syncytia para 0 controlo negativo e multiplicado por 100.

**

Estas concentrações foram inicialmente admitidas coroo sendo

Como se demonstrou neste quadro e na Fig, 40, a solúvel de acordo com esta invenção para concentrações de 5,0yig/ml e 12,5 jug/ml inibiu a formação de syncytia em 2 horas, quando comparado com tampão isolado. Decorridas 4 horas apõs a adição de células C8166, solúvel, para uma concentração de 12,5jug/ml . continuou a exibir mais do que 50% de formação de syncytia em comparação coro controlo negativo,

Calculou-se também o efeito de duas preparações da proteína T₄ solúyel rsT^.7 sobre as propriedades syncytiagénicas de HIV em um ensaio semelhante de co-cultura, Os resultados deste ensaio indicam-se a seguir.

(cont. pag. ant,.). 1 ug/ml,1 0 ^Jg/ml , 2,5jjg/rol e 25 jug/ml , respectivamen te, com base numa primeira aproximação de que 1 unidade de absorvância a 280 nro (Α₂₈₀), era equivalente a 1 mg de rsT^.2, Depois da analise de aminoácido da proteína, porém, verificou

-se que tinha um coeficiente de extinção mais· elevado do que o inicialmente suposto sendo uma unidade A₂80 ^rs^4*^ equivaler te a 0,5 mg da proteína.

INIBIÇÃO EM ENSAIO DE FUSÃO DE C8166

Data de ensaio: dia__]_

	rsí4.7	alíquota de 50)11/ /syncyti a	% de inibição
Preparação	(jjg/ml)	média		2 horas
Células Hg	0		0	N/A
(controlo)
Células C8166	0		0	N/A
(controlo)
Células Hg	0		118	0
infectadas coro	HIV
adicionadas a células C8166 controlo okt4a (controlo)	0		0	100
Prep. 1 de	5,0*		43	63,6
rsT4.7

* Esta concentração foi inicialmente suposta como sendo

com base na primeira aproximação de que 1 unidade de absorvancia a 280 nm ( Α^βθ). _s era equivalente a 1 mg de rsT^.2. Depois da analise de aminoacido da proteína, porém, verificou-se que tinha um coeficiente de extinção maior do que o inicialmente admitido, sendo uma unidade de A£g₀ de rsí^.2 equivalente a 0,5 mg da pro teína.

-10 0Data do ensaio: dia 13

Aliquota de 50JU17

Preparação rsT₄.7

/Syncytia media % de inibição para 2 horas-

Células Hg (controlo)	0	0	N7A
Células C8166	0	1	N/A
(controlo)
Células Hg	0	141	0

infectadas por HIV adicionadas a células C8166 ( controlo)

OKT^A (controlo) 0	0	10.0
Prep. 2 de =.5,0^	27	80,9
rsT4.7

* Esta concentração foi inicialmente suposta como sendo jpg/ml com base numa primeira aproximação de que 1 unidade de absorvãn cia a 280 nm (Α₂θ₀), era equivalente a 1 mg de rsT^.2, Depois da analise de aminoãcidos da proteína, porém, verificou-se que tinha um coeficiente de extinção maior do que o inicialmente admitido sendo uma unidade de A^gg de rsT^.2 equivalente a 0,5 mg da proteína.

-10.U

Data de Ensaio: dia 14

Preparação	rsT^.7 aliquota de 50 JjI/ (Jjg/ml) /syncytia media	% inibição apõs 2 horas
Células Hg	0 0	N/A
(controlo)
Células C8166	0 0	N/A

(controlo)

Células Hg infectadas com HIV adicionadas a células C8166 0 (Controlo)

128

100

OKT^A (controlo) 0

Prep. 1	de
rsT4.7		S 5,0*	35	72,7
Prep. 2	de	A/ = 5,0*	2	98,4

rsT^.7

Como se déterminou nestas tabelas a proteína rsT^,7 de solúvel inibiu a formação de syncytia em células- H_g infectadas com HIV.

CaleuTou-se também 0 efeito de rsT^.113.1 e rsT^.lll sobre as prooriedadessyncytiac|énicas de HIV num ensaio de co-ctH tivação . Realizou-se uma fusão de células C8166 do modo descrito em Walker et al. supra.

-10'2Incubaram-se 1x10^ células de Hg, infectadas de modo cré nico com HTLV-111B, durante 1 hora a 37°C em 5% de CO^, com 5 a 50 |jg/ml de rsT^.113.1 ou rsT^.lll em 150 Jjl de meio PPMI-1640 suple mentado com 20% de soro fetal de vitela em placas microtituladoras de 96 cavidades. Adicionou-se depois, 3xl0⁴ C8166 células as cavidades em alíquotas de 50 jul. As pTaca$~ foram' incubadas durante 2 horas a 37°C em 5% de C0₂ θ a seguir a esta incubação contou-se o numero de syncytia por cavidade.

As syncytia foram consideradas coroo células contendo um citoplasma de balão maior do que três diâmetros de células, To das as amostras foram contadas duas vezes. A co-cultura paralela utilizou OKT^A isolado ou rsT^.3 isolado para uma concentração de 25 jig/rol ((controlos positivos) ou células H_g isoladas ou células C8166 isoladas (controlos negativos), Os resultados deste ensaio estão apresentados a seguir na Figura 41.

* Esta concentração foi inicialmente considerada como sendo lOjjg/ml com base na primeira aproximação de que 1 unidade de absorvância a 280 nm (A280)’ ^era θ'!¹¹¹'^va^^ente a 1 mg de rsT^.2, Mediante a anãlise de aminoácidos da proteína, porem, verificou-se que tinha um coeficiente de extinção maior do que 0 inicialmente admitido, sendo uma unidade de A₂₈₀ de rsT_4>2 equivalente a 0,5 mg da proteína.

-103 -

INIBIÇÃO EM ENSAIO DE FUSÃO DE C8166
Preparação	rsT,(ug/ml)	l de inibição
Células Ηθ (controlo)	1 / 0	0
Células C8166 (controlo)	0	0
rsí4.113.1	1 ,25	35
rsí4«113.1	2,5	63
rsí4.113.1	4,25	63
rsí4.113,1	6,25	82
rsí4,113.1	12,5	96
rsT4.3	12,5	100
0KT4A (25 jtig/ml)	0	100

Como se yerifica no Quadro e na Figura 41, rsT^,113,1 apresentou uma inibição dependente da do$è de formação de s-yncy tia induzida por HIV, A actividade inibidora específica molar de rsT^113.1 pareceu ser reduzida de uma ordem de grandeza por comparação com a actividade anti-viral de formas- maiores de T₄ solúvel recombinante. Deste modo, enquanto rsí^.113.1 e eficaz relativamente ã neutralização da fusão celular dependente de HIV in vitro, a sua actividade inibidora específica molar diminui de um factor de 10. É indeterminado se esta quantidade de descresci mento e devida a uma regeneração incompleta da proteína derivada de E. coli, ã presença de três aminoácidos- adicionais na e^tremi-104-

dade N de rsT₄.113.1 (Met-Gln-Gly), não existentes em rsT^.2 ou rsT^.3 produzido em células de mamíferos ou I ausência de estrutura adicional em rsT^,113.1 necessário para a ligação de afinidade elevada a HIV.

Realizou-se também um ensaio de fusão de células C8166 com rsT^.lll como se descreveu para rsT₄.113,1, Os resultados deste ensaio estão apresentados a seguir.

INIBIÇÃO EM ENSAIO DE FUSÃO DE C8166

Preparação	rsT^g/ml)	% de inibição
Célula Hg (controlo)	0	0
Células C8166 (controlo)	0	0
rsí4.111	1 ,25	0
rsT^.111	2,5	40
rsí4*l 11	4,25	20
rsT4«l 11	6,25	67
rsT^.111	12,5	100
rsT^.111	25,0	100
rsT4.3	12,5	100
rsT4.3	25,0	100
0KT4A (25jjg/ml)	0	100

Como se'démonstrou neste Quadro, rsT4,lll exibiu uma ini

bição dependente da dose, de formação de synytia induzida por

HIV.	Para uma concentração de 12,5jug/ml e 25,0jug/ml, foi conse

guida a inibição completa de fusão celular,

-105 —

Cinética de injecção intramuscular de Τη solúvel

Examinou-se a cinética do aparecimento de uma proteína T^ solúvel recombinante de acordo com a presente invenção (especificamente rsT^.3 a partir da linha de células BG381 trans-fecta da com pBG381) em soro após injecção intramuscular como se segue.

Arranjaram-se dois macacos cynomolgus (Macaca fasciscularis) que não possuiam doenças infecciosas· e que gozavam de boa saúde. Cada macaco tinha sido submetido a um período de quarente na de 6 semanas antes da administração da proteína T^ solúvel, Du. rante 0 período de administração manteve-se cada macaco com uma dieta convencional de macaco cão suplementada coro fruta fresca , Colocou-se uma abertura de acesso vascular e um cateter nuroa veia femural de cada animal antes do tratamento, com vista a facilitar a colhéita de sangue.

Durante um período de 28 dias, cada animal recebeu diariamente duas vezes proteína T₄ solúyel recombinante por injecção intramuscular nos músculos grandes das- coxas e das- nádegas, Admj nistraram-se injecções a cada animal a parte, durante 8 horas e cada injecção continha um volume de 0,15 ml/Kg (0,25 mg/kg) de rsT^.S (da linha de células BG381 transformada com pBG381, para uma dose total de 0,5 mg/Kg/dia/macaco, Colheram-se amostras de soro para determinação de remoção ho dia antes- do primeiro trata mento e 1,2,4 e 8 horas após a primeira injecção, bem como 1,2,4,14 e 16 horas após a segunda injecção nos dias- 7,14 e 28,

Verificou-se que a T^ solúvel injectada por via intra-106~

muscular atingiu o nível máximo no soro entre 1 a 2 horas apôs a injecção, coro o nível a cair lentamente e a atingir metade do va. lor máximo em aproximadamente 6 horas após a injecção. De acordo com os valores obtidos para a administração intravenosa (não representados), o nível de rsT^.3 no soro deveria cair abaixo do atingido via injecção intramuscular, aproximadamente 2 horas após a injecção intravenosa. Deste modo, embora o nível máximo de rsí^.3 no soro após injecção intramuscular nao atinja o valor atingido via injecção intravenosa, é libertado lentamente para a corrente sanguínea, permanecendo detectável no soro durante um período muito mais longo. Este mecanismo de libertação lento associado com vias intramusculares de injecção è vantajoso porque fica disponível um nível maior de proteína solável durante um periõdo de tempo maior para uma dada concentração; permanecendo, deste modo, num nível controlado. A administração intramuscular de proteína solúvel e particularmente eficaz no tratamento de doentes nos estádios iniciais de infecção por HIV, em impedir a disseminação do virus ou em tratar doentes que tenham sido expos tos ao virus e que não são ainda seropositi vos,

Determinaram-se os níveis de rsT^,3 no soro utilizando um ensaio ELISA. Através deste ensaio, fizeram-se diluições em soluções de bloqueamento e entre cada passo lavaram-se as placas com PBS/0,05% de Tween-2Q, Mais especificamente, revestiram-se as cavidades de duas placas, Iromulou coro DO 0,01 (280 nro)/ro1 de

OKT^ (IgG2b) em tampão de bicarbonato 0,05 M at? um volume de 50 jjl/cayidade e incubaram-se as placas durante a noite a 4 C , BIoquearam-se depois as placas coro albumina de soro bovino a 5% em PBS, 200yil/cayi dade e incubou-se durante 30 miníitos ã terope-17ratura ambiente.

Subsequentemente, adicionaram-se 50jli 1 de amostra ou de padrão a cada cavidade, incubando durante 4 horas a’temperatura ambiente. Adicionou-se depois, 50 jul/cavidade de OKT^A para 0,1 yjg/ml e incubou-se durante a noite a 4°C. Utilizando um Hyclone Kit (H. clone), realizaram-se os seguintes passos: primeiro¹, adicionou-se a cada cavidade 1 gota de anti-IgG2a de ratinho desenvolvido no coelho e incubaram-se as placas durante 1 hora a temperatura ambiente; adicionou-se depois 100/ul de anti-IgG de coelho marcado com peroxidase, diluiu-se a 1:4000 com BSA a 5% PBS em cada cavidade e incubou-se durante 1 hora ã temperatura ambiente.

Preparou-se um reagente de substrato como se segue. Diluiu-se o reagente de substrato a 1:10 em agua destilada e adicio nou-se dois comprimidos de 0-fenil-etilenodiamina (OPD) cromÕfora por 10 ml de substrato. Deixou-se dissolver a mistura cuidadosamente, misturando com um vórtice. Alternativamente, pode ser utilizado um sistema de substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Catalogue ^ 50-76-00). Subsequentemente, adicio nou-se 100 jjI da sol uçãocromofora a cada cavidade, incubou-se d_u rante 10 a 15 minutos ã temperatura ambiente e depois interromSO^IN, Mediu-se depois a DO a 490 nm, utilizando um leitor de placas ELISA.

peu-se desenvolvimento de cor com

100 Ul de H₂

Os resultados do ensaio apresenta-se nos Quadros a ..seguir.

Formas polivalentes de Τ_Λ solúvel recombinante

Os receptores podem ser caracterizados pela sua afinidade pelos ligantes específicos de tal modo que, no equilíbrio, a afinidade intrínseca (Ka) entre os receptores monovalente e o lj gante monovalente pode ser definida como [RL]/[Rf] [Lf], onde [RL] e a concentração do receptor (R) ligado ao ligante (L) e ZRt7 θ [Lf) são as concentrações do receptor e do ligante livres, respec tivamente [P. A. Underwood, in Advances in Virus Research, ed.

K. Maramorosch et al., 34, pags. 283-309 (1988)],

Para um receptor polivalente (com uma valência n) ligado a um ligante polivalente (com uma valência m), pode-se definir uma afinidade funcional como n [R]/n [Rf] m [Lf], onde [Rb] ê a concentração dos locais de receptores ligados, e n[Rf] e m[Lf] são, respectivamente , as concentrações dos locais que ligam os receptores e os ligantes livres. 0 efeito do aumento de valência (o número de locais de ligação) e realçar a estabilidade dos complexos 1igante-receptor. A afinidade de um receptor polivalente para um ligante polivalente dependera de três factores: a associ_a ção intrínseca constante de cada local de ligação, a valência (número de locais de ligação) e a relação topicológica entre os locais de ligação do receptor e do ligante. Em algumas circuns^ tâncias, as interacções de ligação polivalentes conduzirão a uma afinidade funcional mais elevada. A diminuição da taxa de disse) ciação dos ligantes polivalentes com receptores polivalentes dã origem a um aumento da afinidade funcional [C. L. Hornick e F, Karush,„ Immunochemistry, 9, pags. 325-340 (1972); I. Otterness

-1Q8·

Macaco $ 7-91

Nível de rs*T^ (ng/ml)
Tempo (horas)	Dia 1	Di a 7 ’ Dia 14	Dia 28
0	22,7*	96,5’	1 58,0	19,8
1	278,8	199,6	360,7	238,3
2	281 ,8	366,8	306,4	441 ,1
4	214,9	246,6	363,9	393,2
5				29.0,4
8	72,3	105,0	199,4
g**	246,2
10	259,6
12	136,0
22	23,8
24	13,4
Macaco 7-92
		Nível rsT^ (ng/ml)
Tempo (horas)	Di a 1	Dia 7	Dia 14	Dia 28
0	6,7*	56,0	106,3	60,9
1	87,2	225,8	178,0	437,7
2	254,2	377,9	253,2	770,6
4	170,0	167,3	308,2	821 ,5
5				898,3
8	118,9	101,2	176,5
g**	405,1
10	523,5
12	371,5
22	48,4
24	39,4
* - fundo (	backgroud
** - segunda	injecção administrada após	a colheita	da amostra

da oitaya hora.

-110

F.Karush, Principies of Antibody Reactions, in Antibody as a tool , ed. J. J. Marchalonais e G. W. Warr, pãgs. 97-137 (1 982)].

caso mais simples de aumento da afinidade funcional por polivalencia do receptor é representado por um receptor solúvel bivalente, tal como uma molécula de anticorpo que tem dois locais de ligaçãt de ligantes idênticos, cada um capaz de ligar, independentemente, antigenes com igual afinidade. Se o antigene estiver exposto po 1ivaientemente, por exemplo, quimicamente ligado a um suporte sé lido de forma a que o espaço entre os locais antigénicos possa ser ligado em ponte (pelos braços) (arms) de ligação do anticorpo a dois antigenes, a afinidade funcional do anticorpo para o antigene ligado ao suporte solido serã maior que a afinidade intrínseca do local de ligação do anticorpo para o antigene roonovalente Crothers e H, Metzger, 1-mmunoch.emi'stry, 9, pãgs, 341-57 (1972)/. Devido ãs partículas do vírus representarem antigenes poliyalentes, a maior afinidade funcional dos anticorpos para os antigenes polivalentes é um factor importante para a neutralização do vírus dirigido ao anticorpo.

A associação de T₄ solúvel recombinante e a glicoproteína gpl20 de revestimento principal de HIV é um exemplo de receptor monovalente que se liga a ligando monovalente, A afinidade desta interacção foi medida e a associação entre e gp!2O tem uma cons tante de dissociação Kd=4xl0~^ M /L, Lasky et a 1 _t,^x-€e11, 50, pãgs. 975-88 (.1987)/,

Utilizando a analogia do anticorpo, pensasse que rsT^ po

-Π1livalente demonstrava uma maior afinidade para células infectadas com HIV, expondo gp!2O, do que rsT₄ monovalente e a relação topicologica entre gpl20 na partícula de vírus ou na superfície da célula infectada determinava o grau para o qual rsT^ polivalente exibe maior afinidade funcional do que rsT^ monovalente. Um exem pio de um rsT^ polivalente é descrito a seguir, relativamente ã produção de um rsT^ bivalente recombinante que consiste em duas repetições em série de aminoácidos 3-178 seguidas pelas 199 aminoãcidos C-terminais de rsí₄,3, De acordo com esta invenção, um receptor polivalente possui dois ou mais locais de ligação para um dado ligando. Além do mais, a afinidade intrínseca de cada local de ligação do ligando de um dado receptor polivalente não neces^ sita de ser idêntica.

Como se mostra na Figura 42, para construir rsT₄ bivalente, digeriu-se pBG391 com Nhel, que cliva apõs a valina na posição 178 em rsT₄ e removeu-se a parte saliente de Nhel na extremidade 5' com nuclease de feijão. A'seguir, clivou-se com^BglII para remover a metade do terminal C da sequência de codificação de rsT^ em pBG391, Finalmente, ligou-se um fragmentoDral-BglII que continha a sequência de codificação para aminoãcidos de rsT^ (lisina) 3 até (isoleucina) 377 para o pBG391 clivado, para criar pBiv.l, um plasmideo que codifica para uma proteína de fusão com uma duplicação em série dos 176 aminoãcidos N-terminais de rsT^, seguindo-se os 199 aminoãcidos C-terminais- de rsí₄,3. A proteína produzida por este plasmideo, contém, deste modo, dois domínios adjacentes de ligação a OKT^A ou gp!20 N-terminais (definidos pelos resíduos de aminoãcidos 3 a 111 de rsí^Jll), seguindo-se um domínio de C-terminal ligado a OKT^CFtg, 43),

-112-

pBiv. 1 foi transfectado por electroporação em células COS 7 para testar a expressão da proteína rsT₄ bivalente. Três dias mais tarde, testou-se o meio condicionado das células transfectadas em relação a presença da proteína bivalente rsT₄ por imu noprecipitação, seguindo-se a analise da mancha de Western da pr£ teína precipitada. Ambos OKT^A e 0KT₄ foram utilizados para imu noprecipitação, para determinar que o epítope OKT^ e pelo menos um dos epítopes OKT^A tivessem dobrado (folded) correctamente , Ambos os anticorpos precipitaram uma proteína de peso molecular aparente previsto (60000 d) a partir do meio con.di cionado das células.

rsT₄ bivalente pode ser purificado por purificação da irounoafinidade a partir de uma coluna de 0KT₄ e a proteína purif£ cada pode então ser utilizada para realizar ensaios de competição quantitativos coro rsT^.3, Pensa-se que a molécula bivalente de* monstraria competição equivalente contra rsT^.3 para ligação de OKTp mas de modo significativo, maior competição contra rsT^ monoyalente para ligação de QKT^A. A capacidade de T₄ solúvel recom binante bivalente para bloquear a formação de syncytium pode também ser demonstrada no ensaio de fusão de C8166. Pensa-se taro bém, que o T₄ solúvel recombinante bivalente bloquearia a formação de syncytium para concentrações significativaroente roais baixas do que rsT₄ roonovalente, coro base na afinidade funcional mais eleyada de T₄ solúvel recombinante bivalente para gp!20,

De acordo com formas de realização alternativas' desta invenção, podem ser utilizados outros métodos- para produção de rsT^ poliyalente. Por exemplo, rsT_A poliyalente podem ser produzidos

por ligação química de rsT₄ a qualquer molécula de veículo clínicamente aceitável, um polímero seleccionado do grupo que consiste em Ficoll, polieti1enoglicol ou dextrano, utilizando técnicas de ligação convencionais. Alternativamente, rsí₄ pode ser químicamen te ligado a biotina e deixa-se o conjugado de rsT^ com biotina ligar-se a avidina, resultando em avidina tetravalente/biotina/ /moléculas de rsT^. E rsT₄ pode ser covalentemente ligado a dinitrofenol (DNP) ou trinitrofenol CTNP) e o conjugado resultante precipitou com anti-DNP ou anti-TNP-Igm para formar conjugados decamédicos com uma valência de 10 para locais· de ligação de rsí^.

Alternativamente, pode-se produzir uma molécula de anti* corpo quimérica recombinante com sequências de rs-T^ substituídas para os domínios variáveis de uma qualquer ou ambas as cadeias le ve e pesada da molécula de imunoglobulina. Devido ao facto de a solúvel recombinante possuir actividade de ligação a gp!20, a construção de um anticorpo quimérico possuindo dois domínios de T₄ solúvel e domínios de região constante não modificada podia servir como um mediador do assassínio do alvo que são as células infectadas com HIV e que expressam gp 120,

Por exemplo, rsT^/IgGl quimérito pode ser produzido a par tir de dois genes quimêricos-rsT^/ cadeia quimérica leve K humana (rsT^/C^) e rsT^/ cadeia quimérica pesada gama 1 humana (rs-T^/C i)· Ambas as regiões C. e C -.foram isoladas a partir de gama-l' k gama-l ^r culturas de DNA recombinante humano e cada uma foi¹ subclonada em vectores de selecção de células animais contendo quer neo resis·tência Bacteriana quer marcadores gpt bacterianos para selecção em hospedeiros de células animais contra o antibiético ^G418 ' oú acido micofenólico, respectivamente,

-11 4Para construir os genes- quiméricos· rs-T^/C e rsT^/C^, um segmento de gene rsT^, incluindo, pelo menos, a sequência de sinal de secreção e os 110 resíduos de aminoácido de N-terminais da sequência de codificação de rsí₄ madura e incluindo um dador de união ou uma sua porção ,é colocado a montante dos exãos do domínio constante k e gama-1, Uma enzima de restrição apropriada pode ser utilizada para cortar no interior do intrão, a jusante da sequência de codificação de rsT^ desejada, proporeionando deste modo um local dador de união, Subsequentemente, uma enzima de restrição apropriada ê utilizada para cortar no interior ' dé in trãos a montante das regiões de codificação k e gama-1, A sequência rsT^ ê depois ligada ã sequência da região constante k ou gama-1, de tal forma que a sequência de intrão rsT^ seja contígua aos intrãos gama-1 e k. Deste modo, um local de união receptor e proporcionado pelo intrão da região constante k ou gama-1. Alternativamente, os genes quiméricos rsT^ podem ser construídos sem o uso de intrãos, fundindo um segmento de gene de CDNA de rsT^ apro priado directamente a regiões de codificação k ou gama-1.

Os vectores rsT./C . e rsT./C. podem ser depois co- gama-i — κ

-transfectados, por exemplo, por-electroporação em células hospedeiras linfÕídes ou não Ifnfoides. A seguir a transcrição e a translação-dos doi: genes quiméricos, os produtos do gene podem associar-se em molécu las de anticorpo quiméricas.

A expressão dos produtos de gene quiméricos pode ser medida por um ensaio imunoabsorvente ligado (ELISA) a enzima que utiliza anti-anticorpo monoclonal QKT^A como se descreveu antes ou mediante ensaios de competição para gpl20 e radio-tmunoensaios como se descreveu antes, A actividade das quimeras rsT^/IgGl pode

-115

Ζ ser medida incubando-as com células injectadas com HIV, na presen ça de complemento humano, seguido da quantificação da subsequente Π se mediada pelo complemento destas células, Alternátivamente, a actividade pode ser medida na replicaçao FTIV e ensaios de Synáytiuni como se descreveu antes.

Com vista a determinar se rsT^ Bivalente tem uma potência maior do que rsT₄ monovalente, misturou-se OKT^, a varias 'concentrações, em conjunto coro uma concentração constante de rsT₄, de forma a que a relação molar de OKT^: rsT^ varie entre 0,2 e 4. ApÕs a pre-incubação da mistura durante a noite a 4°C, adicionaram-se alíquotas ao ensaio de syncytium de HIV descrito infra. OKT^ não tem nenhum efeito neste ensaio quando utilizado isoladamente. Alem disso, a concentração de solúvel recombinante escolhida, não causou inibição neste ensaio, Por consequência, procuraram-se indicações de que a mistura OKT^/rsT^ fosse maispoten te do que rsT^ isoladamente. Observou-se que, para relações ’de OKT^: rsT₄ maiores do que 0,2, ocorreu inibição parcial ou comple ta de formação de syncytium, Admite-se que, sob condições em que moléculas de rsT₄ estejam ligadas a 1 molécula de OKT^, 'se pode verificar o maior efeito de inibição,

Deste modo, as formas monovalentes, bem como polivalentes de soluyel recombinante são utilizadas nas composições e métodos desta invenção.

Os microrganismos' e as moléculas· de DNA recombinantes preparados pelos processos de acordo com a presente invenção estão exemplificados pelas culturas depositadas colecção de cultu ras da In Vitro International, Inc,, em Linthicum, Maryland, em 2 de Setembro de 1987 e identificadas como:

-116

BG378:	E.	coli
199-7:	E.	col 1
170-2:	E.	coli
EC100:	E,	col i
BG377:	E.	col i
BG380:	E.	col i
BG381:	E.	col i

MC10617pBG378

MC1Q617pl 99-7

JA2217pl70-2

JM837pECl00

MC10617pBG377

MC10617pBG380

MC10617pBG381

A estas culturas foram atribuídos os numeros de acesso

IVI 10143-10149, respectivamente.

Alem disso, os microrganismos. e as moléculas de DNA.recombinante de acordo com a presente invenção, estão exemplificados por culturas depositadas na colecção de culturas da In Vitro International, Inc., em Linthicum, Maryland, em 6 de Janeiro de 1988 e identificados como:

BG-391:	E.	col i
BG-392:	E.	coli
BG-393:	E.	col i
BG-394:	E.	coli
BG-396:	E.	coli
203-5 :	E.	coli

MC1061/pBG391

MC1061/pBG392

MC10617pBG393

MC1061/pBG394

MC10617pBG396

SG9367p203-5.

A estas culturas foram atribuídos os némeros de acesso

IVI 10151-10156, resoectivamente.

Os microrganismos e as moléculas de DNA recombinante de acordo com esta invenção estão também exemplificados por culturas depositadas na colecção de culturas da In Vitro International, Inc., em Linthicum, Maryland, em 24 de Agosto de 1988 e identificados como:

-117 -

211-11: E, coli A89/pBG211-11

214- 10: E. coli A89/pBG214-10

215- 7 : E. coli A89/pBG215-7.

A estas culturas foram atribuídos os numeros de acesso

IVI 10183-10185, respectivamente.

Embora se tenha descrito algumas formas- de realização da presente invenção, e evidente que as construções bãsicas podem ser alteradas para proporcionar- outras formas de realização que utilizam processos e composições de acordo com a presente invenção. Deste modo, considera-se que o âmbito da presente invenção e definido pelas reivindicações em anexo e nao pelas formas de realização específicas que se apresentaram antes, a título de exemplos.

Claims (34)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de moléculas de DNA recombinante, caracterizado pelo facto de incluir uma fase de introdução, em um veículo de clonagem, de uma sequência de DNA escolhida no grupo constituído por:

   a) inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380, pBG381, p203-5, pBG391, pBG392, pBG393, pBG394, pBG395, pBG39S, pBG397, p211-ll, p214-10 e p215-7;

   b) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inser ções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a T4 solúvel; e

   c) sequências de DNA que codificam a expressão para um polipéptido idêntico a T4 solúvel codificado por expressão para qualquer das inserções de DNA e sequências anterior* estando a referida sequência de DNA ligada de um modo operacional

   -119a uma sequência de controlo de expressão na molécula de DNA recombinante e estando expressa para produzir o referido polipéptido quando se cultiva um hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA recombinante.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência de DNA (b) codificar para a expressão de um polipéptido idêntico a TU solúvel que inibe a adesão entre linfócitos TU ⁺ e agentes infectantes que visam os linfócitos T4⁺ e a interacção de linfócitos TU⁺ com células que exibem antigénios e alvos de linfócitos TU ⁺ mediados para matar.
3. 3.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

   1 ou 2, caracterizado pelo facto de se escolher a referida sequência de controlo de expressão no grupo constituído pelos promotores proximal e distai de SVUO ou adenovírus, o sistema lac, o sistema Trp, o sistema 1AC, o sistema TRC, o operador principal e regiões do promotor do fago\, as regiões de controlo de revestimento proteínico fd, o promotor para 3-fosfaglicerato-quinase ou outros enzimas glicolíticos, os promotores de fosfatase ácida, o promotor polihedro do sistema de baculovírus e os promotores dos factores de -acasalamento de leveduras.
4. 4.- Processo para a transformação de um hospedeiro, caracte rizado pelo facto de se introduzir nesse hospedeiro uma molécula

   -120- de DNA recombinante preparada pelo processo de acordo com o processo referido em uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se escolher o referido hospedeiro no grupo constituído por estirpes de E.coli, Pseudomonas, Bacillus,Streptomyces, fungos, células animais, células vegetais, células de insectos e células humanas de tecidos de cultura.
6. 6.- Processo para a preparação de polipeptidos idênticos a TU solúvel, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA recombinante e de se es colher a sequência de DNA no grupo constituído por:

   a) inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380, pBG381, p203-5, pBG391, pBG392, pBG393, pBG39U, pBG395, pBG396, pBG397, p211-ll, p21U-10 e p215-7;

   b) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inserções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel; e

   c) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel codificado para expressão de qualquer das inserções de DNA e sequências anteriores, estando a referida sequência de DNA ligada de um modo operacional a uma se

   -121- auência de controlo de expressão na molécula de DNA recombinante e sendo expressa para produzir o referido polipéptido quando se cultiva um hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se escolher o polipéptido produzido no grupo constituído por um polipéptido de fórmula AA_₂₃-AA_3g2, um polipéptido de fórmula AA.-AA_OCO, um polipéptido de fórmula Met-AA,

   1 362’ 1-362, um polipéptido de formula AA^-AA.^, um polipéptido de formula. Met-AA₁__371|, um polipéptido de fórmula AA^-AAg??, um, polipéptido de formula Met-ΑΑη_₃₇₇, um polipéptido de fórmula ^A^~23^_AA37i+’ um polipéptido de fórmula AA-₂₃.-AA₃₇₇

   -122BBE S NBaecNc laptoer anlNRpF 4221221 ///// TTTTTTTTTTAAGCACGAdrCTGCAGAAGGAAGAAAGCACCCTCCCCACTGGGCTCCTGG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AAAAAAAAAATTCGTGCTGAGACGTCTTCCTTGTTTCGTGGGAGGGGTGACCCGAGGACC

   Jri

   H n 1

   M n 1 1

   L S T T L Q X E Q S T L P T G L L V BH F N A BsaNSS Μ H n B B BM 1 apísas o a u P b bn u nlApct 1 1 4 B V vl 1 221211 1 1 K 2 1 11 /////

   TTGCAGAGCTCCAAGTCCTCACACAGATACGCCTGTTTGAGAAGCAGCGGGCAAGAAAGA

   61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

   AACGTCTCGAGGTTCAGGAGTGTGTCTATGCGGACAAACTCTTCGTCGCCCGTTCTTTCT

   A E L Q V L T Q I R L F E X Q R A R X S B B PS S H H HDHaP. 8 DBeNADNpPaS D DHNPa n g graus t dapevrlusui d ralsu 1 a aae9s X ealpaaaMs9& e aeas9 1 1 12361 1 12222241161 1 23416 J / // / nu f

   CGCAAGCCCAGAGGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCTACTGGCTCAGGCCCCTG ---------+_---—---+-----——+---------+---------+---------+ 1S0

   121

   181

   GCGTTCGGGTCTCCGGGACGGTAAAGACACCCGAGTCCAGGGATGACCGAGTCCGGGGAC

   R P C H F C G L R S L L A Q A P A *§ S H F Μ M MHM HHNc i B B n η n nan pecr a b b u 1 1 lei apiF £ V V 4 1 1 ¹³¹ nv h 2111 1 1 1 H i ne L Hl

   CCTCCCTCGGCAAGGCCACjkT3UCCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGC

   ---------+---------—+---------+---------+ 240 GGAGGGAGCCGTTCCGGTGTTACTTGGCCCCTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACG

   S L G K A T Μ N R G V PFRHLLLVL H F i HH nH M D B B n ha un n d b b P ae 41 1 β V V 1 12 Hl 1 1 1 1

   TGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAG

   241_________+_________+---------+---------+---------+---------+ 300

   ACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAGTCCCTTTCTTTCACCACGACCCGTTTTTTC

   QLALLPAA T l Q G XXV V L G X X G - R A M MH M B 1 JL b bb b a u 0 oo 0 1 1 2 22 2

   GGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGA

   301 ----+---------+---------+————--+---------+ 360

   CCCTATGTCACCTTGACTGGACATGTCGAAGGGTCTTCTTCTCGTATGTTAAGGTGACCT dtveltctasqkksiqfhwk-123
8. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se escolher o polipeptido no grupo constituído por um polipeptido de formula AA-₂₃~ΑΑ^θ₂, um polipeptido de fórmula ΑΑ₁“ΑΑ_Ί82, um polipeptido de fórmúla Met-AA₁__lg2, um polipeptido de fórmula AA seguido pelos aminoãcidos asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipeptido .de fór mula AA^-AA^g₂, seguido pelos aminoãcidos asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipeptido de fórmula

   1-182, seguido pelos aminoãcidos asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipeptido de fórmula

   AA_₂g-AA^^2, um polipeptido de fórmula ΑΑ^-ΑΑ-^θ, um polipeptido de fórmula Met-AA^_^^₃, um polipeptido de fórmula AA~ ^-AA^.^, um polipeptido de fórmula AA^-AA^^^, um polipeptido de fórmula Met-AA₁_₁₁₁, um polipeptido de fórmula ^AA~2 3^-AA131’ ^um ΡθϋΡθΡΡί do de fórmula AA^-AA^^, um polipeptido de fórmula Met-AA^.^, um polipeptido de fórmula AA ^θ-ΑΑ-^θ, um polipeptido de fórmula ^1-^145’ ^um P^ipepTído de fórmula Met-AA^^g, um polipeptido de fórmula ΑΑ_₂₃ΑΑ₁₆θ, um polipeptido de fórmula ΑΑ^-ΑΑ^θ. , um polipeptido de fórmula Μεΐ-ΑΑ^_^θθ, ou suas fracções.

   124

   TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA tf)

   < μ < u < u < 0 0 0 < U μ V 0 0 b- 0 0 < 0 0 0 μ < o < 0 u u a b* 0 0 μ μ 0 < K < 0 0 0 < 0 0 0 < μ 0 < < μ 0 o μ u 0 < < 0 0 0 < G> 0 GJ 0 0 <3 < < 0 μ < 0 < u u μ 0 o 0 0 0 0 0 < 0 CJ GJ gj 0 μ 0 0 μ μ 0 < 0 0 o 0 μ u 0 < 0 μ < 0 μ 0 a 0 α o Q μ 0 0 μ X 0 < < 0 μ 0 e u u 0 μ 0 υ μ <3 Q μ 0 0 μ < 0 μ μ < ο 0 0 0 < 0 < d 0 U 0 0 0 0 0 < μ 0 0 0 0 0 μ μ μ 0 0 0 < j 0 u < e 0 μ μ 0 υ < 0 < () < gj 0 μ- 0 0 υ α < 0 0 0 0 μ 0 0 μ μ μ· μ Ο υ μ μ 0 <j < 0 0 μ 0 μ 0 0 μ μ 0 μ μ 0 0 a -μ 0 q 0 0 0 «? 0 < u GJ μ 0 μ 0 u 0 < 0 0 0 0 0 < μ < μ < l·· 0 0 μ 0 υ ο < 0 0 0 < 0 0 μ 0 0 < 0 < u < < ο a 0 Ρ ο 0 0 < 0 Q 0 0 0 0 0 0 0 0 μ μ < μ GJ < 0 d < < 0 μ < μ 0 0 0 Q gj μ 0 0 < < 0 0 0 0 < 0 μ 0 < d < μ 0 υ 0 0 0 0 μ 0 0 μ < 0 0 < 0 0 0 μ 0 0 < 0 μ ο μ 0 0 0 0 μ < 0 < h- t- μ μ 0 0 < < 0 μ 0 < < μ 0 . < a μ O 0 μ 0 0 d d < < < μ < 0 < < 0 0 μ μ μ e < < μ μ < 0 < μ 0 0 k Q 0 0 μ μ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 μ μ 0 μ < 0 0 μ 0 μ < μ < 0 u V b* < < μ 0 < 0 0 0 0 μ μ Q μ ΰ 0 0 μ μ 0 0 < 0 0 < GJ μ < 0 < 0 < 0 0 μ 0 0 u 0 μ 0 0 < 0 μ 0 0 0 < < 0 0 < 0 μ μ 0 μ 0 0 < 0 Q μ 0 < μ 0 0 < μ < < Ο υ 0 < 0 μ μ < 0 0 0 < 0 0 υ < u μ 0 < < 0 0 0 < 0 μ < < 0 < < μ < < μ μ 0 μ ο gj < u 0 0 0 0 0 μ μ π 0 o < u μ· 0 < 0 0 < < U 0 ο < < u 0 < b· < 0 0 μ μ h 0 GJ GJ 0 0 0 < < μ μ 0 0 0 0 μ 0 0 0 μ μ 0 Q 0 0 μ 0 μ 0 μ 0 μ- U 0 0 < 0 0 υ 0 0 O m O ifí O tf) Ο tf) ο tf) ο tf) Ο •M •4 fN PM n CO «r 0 ιη <0 <0 μ

   0 0 0 « 0 0 μ μ 0 < «C 0 < < 0 < < < μ υ μ < 0 Ρ 0 0 Q μ 0 0 < 0 α < < 0 0 < μ 0 0 0 < 0 υ 0 ν 0 μ 0 0 < < 0 μ 0 0 0 0 0 0 ο 0 < < d < d μ μ < < 0 d d μ < μ 0 0 0 0 0 μ μ 0 μ υ 0 Ο υ d μ < d 0 < υ μ ΰ 0 < 0 0 0 < 0 < < 0 0 0 0 μ < 0 d ο d μ 0 < < υ U μ 0 0 μ < 0 0 ο < 0 0 Q Q 0 < 0 μ 0 υ 0 υ < d μ μ μ U μ 0 0 0 < μ < υ < u μ 0 0 μ 0 μ 0 0 υ < < 0 0 0 < 0 < < μ 0 < < 0 0 < d Ο < μ 0 < μ < μ υ 0 μ 0 μ Η < μ < 0 0 0 < υ < ο 0 0 μ 0 υ < 0 μ < υ μ < 0 0 0 0 < 0 < 0 μ 0 u 0 0 μ 0 0 < « < μ μ e μ 0 μ 0 0 < 0 0 < 0 < 0 0 μ d 0 0 < < 0 0 0 0 < 0 υ μ 0 0 < 0 0 0 ρμ < 0 0 μ 0 κ 0 ο 0 < < » 0 0 < Q « μ υ μ 0 0 0 μ μ υ 0 μ 0 < < μ μ < μ μ Um υ < μ 0 υ d υ < U d 0 μ μ υ < Ο 0 0 U 0 < 0 < 0 μ 0 < 0 < 0 d μ μ 0 < < d 0 < 0 0 ο 0 < < 0 0 0 < w 0 0 μ μ 0 d μ ΰ μ < < ο 0 U 0 0 U < μ d < υ 0 0 < < μ d < < < 0 < 0 μ 0 0 < μ 0 < < < μ 0 < μ μ μ μ 0 0 < 0 0 < 0 0 < μ μ 0 μ 0 U 0 0 0 < μ 0 μ υ 0 < 0 0 u 0 < b* 0 0 μ d 0 0 0 d μ d 0 0 U < 0 0 0 μ u 0 0 0 < 0 0 0 < < μ μ Q d d 0 0 0 μ 0 • 0 μ Ο μ μ 0 < < υ >- < 0 < d d d μ υ μ υ 0 < μ < < 0 μ d 0 0 0 d 7*u < 0 < 0 < μ < < 0 04 <ε *· 0 0 0 0 0 0 0 < 0 < o2 *1μ: 0 0 μ 0 μ μ 0 0 0 d 04 0 0 μ 0 0 < 0 μ 0 μ < 0 < G> 0 < υ 0 0 0 < μ 0 0 μ 0 0 < < μ 0 μ < ο < < 0 < 0 < VJ 0 μ 0 0 < 0 0 μ μ 0 μ < < μ 0 0 μ 0 0 0 μ 0 0 < μ 0 υ μ d μ μ 0 d μ 0 < < < 0 ο 0 Ο 0 Ο 0 O Λ Ο 0 Ο ΙΓ μ S ω 0 Φ Ο Ο «w CW fw Γ5 Η

   •125

   1401 GGGCTCCTTC ttaactaaag GTCCATCCAA GCTGAATGAT CGCGCTGACT 1451 CAaGaaGaaG CTTGTGGGAC CAAGGAAACT TTCCCCTGAT catcaagaat 1501 CTTAAGATAG aagactcaga TACTTACATC TGTGAAGTGG AGGACCAGAA 1551 GGAGGAGGTG CAATTGCTAG TGTTCGGATT GACTGCCAAC TCTGACACCC 1601 ACCTGCTTCA GGGGCAGAGC CTGACCCTGA CCTTGGAGAG CCCCCCTGGT 1651 AGTAGCCCCT CAGTGCAATG TAGGAGTCCA AGGGGTAAAA ACATACAGGG 1701 GGGGAAGACC CTCTCCGTGT CTCAGCTGGA GCTCCAGGAT AGTGGCACCT 1751 GGACATGCAC TGTCTTGCAG AACCAGAAGA AGGTGGAGTT CAAAATAGAC 'STOP CATAGTCTa|t AAfrAAAGAGG 1801 ATCGTGGTGC TAGCTTTCCA GAACCTCCAG 1851 GGGAACAGGT GGAGTTCTCC TTCCCACTCG CCTTTACAGT TGAAAAGCTG 1901 ACGGGCAGTG GCGAGCTGTG GTGGCAGGCG GAGAGGGCTT CCTCCTCCAA 1951 GTCTTGGATC ACCTTTGACC TGAAGAACAA GGAAGTGTCT GTAAAACGGG 2001 TTACCCAGGA CCCTAAGCTC CAGATGGGCA AGAAGCTCCC GCTCCACCTC 2051 ACCCTGCCCC AGGCCTTGCC TCAGTATGCT GGCTCTGGAA ACCTCACCCT 2101 GGCCCTTGAA GCGAAAACAG GAAAGTTGCA TCAGGAAGTG AACCTGGTGG 2151 TGATGAGAGC CACTCAGCTC CAGAAAAATT TGACCTGTGA GGTGTGGGGA 2201 CCCACCTCCC CTAAGCTGAT GCTGAGTTTG AAACTGGAGA ACAAGGAGGC 2251 AAAGGTCTCG AAGCGGGAGA AGGCGGTGTG GGTGCTGAAC CCTGAGGCGG 2301 GGATGTGGCA GTGTCTGCTG AGTGACTCGG GACAGGTCCT GCTGGAATCC 2351 AACATCAAGG TTCTGCCCAC ATGGTCGACC CCGGTGCAGC CAATGGCCCT 2401 GATTTGAGAT CTTTGTGAAG GAACCTTACT TCTGTGGTGT GACATAATTG 2451 GACAAACTAC CTACAGAGAT TTAAAGCTCT AAGGTAAATA TAAAATTTTT 2501 AAGTGTATAA TGTGTTAAAC TACTGATTCT AATTGTTTGT GTATTTTAGA 2551 TTCCAACCTA TGGAACTGAT GAATGGGAGC AGTGGTGGAA TGCCTTTAAT 2601 GAGGAAAACC TGTTTTGCTC AGAAGAAATG CCATCTAGTG ATGATGAGGC 2651 tactgctgac TCTCAACATT CTACTCCTCC AAAAAAGAAG AGAAAGGTAG 2701 aagaccccaa GGACTTTCCT TCAGAATTGC TAAGTTTTTT GAGTCATGCT 2751 gtgtttagta ATAGAACTCT TGCTTGCTTT GCTATTTACA CCACAAAGGA 2801 aaaagctgca CTGCTATACA AGAAAATTAT GGAAAAATAT TCTGTAACCT 2851 TTATAAGTAG GCATAACAGT tataatcata acatactgtt TTTTCTTACT 2901 CCACACAGGC ATAGAGTGTC TGCIATTAAT AACTATGCTC AAAAATTGTG 2951 TACCTTTAGC TTTTTAATTT GTAAAGGGGT TAATAAGGAA TATTTGATGT 3001 ATAGTGCCTT GACTAGAGAT CATAATCAGC CATACCACAT TTGTAGAGGT

   126

   3051 TTTACTTGCT TTAAAAAACC TCCCACACCT CCCCCTGAAC ctgaaacata 3101 AAATQAATGC AATTGTTGTT GTTAACTTGT TTATTGCAGC ttataatggt 3151 TACAAATAAA gcaatagcat CACAAATTTC ACAAATAAAG CATTTTTTTC 3201 ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT catcaatgta TCTTATCATG 3251 TCTGGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG ccggcatcac CGGCGCCACA 3301 GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 3351 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG 3401 CAGGCCCGTG GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT 3451 TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC 3501 CTAATGCAGG AGTCGCATAA gggagagcgt CGACCGATGC ccttgagagc 3551 CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG ACTATCGTCG 3601 CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG 3651 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC 3701 GATGATCGGC CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC 3751 AAGCCTTCGT CACTGGTCCC GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC 3801 ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG GGCTACGTCT TGCTGGCGTT 3851 CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT CTCGCTTCCG 3901 GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT 3951 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT 4001 AACTTCGATC ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG 4051 CGAGCACATG GAACGGGTTG GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT 4101 GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA TGGAGCCGGG CCACCTCGAC 4151 CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA CTCCAAGAAT 4201 TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT 4251 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC 4301 ATCTCGGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG 4351 AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA ggtggcgaaa CCCGACAGGA 4401 CTATAAAGAT accaggcgtt TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC 4451 TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG 4501 GAAGCGTGGC GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG 4551 7AGGTCGTTC GCTCCaaGCT GGGCTGTGTG cacgaacccc CCGTTCAGCC 4601 CGACCGCTGC gccttatccg GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA 4651 GACACGACTT atcgccactg GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTaGCAGA

   -127

   4701 GCGAGGTATG taggcggtgc TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA 4751 CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG 4001 ttaccttcgg AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC 4851 GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA 4901 AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC 4951 agtggaacga AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA 5001 AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT 5051 CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA 5101 GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC 5151 TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG 5201 CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT 5251 TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT 5301 GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG 5351 AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTG 5401 CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC 5451 GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA 5501 agcggttagc TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG 5551 CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC 5601 ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT caaccaagtc 5651 ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC ccggcgtcaa 5701 CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT gctcatcatt 5751 GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC cgctgttgag 5801 ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT tcagcatctt 5851 TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC 5901 GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT 5951 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG 6001 gatacatatt TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC 6051 ACATTTCCCC GAAAAGTGCC acctgacgtc TAAGAAACCA TTATTATCAT 6101 GacattaaCC TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT CGTCTTCAA

   ·> » .·

   -128-
9. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se escolher o polipéptido produzido tituído por um polipéptido de fórmula ΑΑ_₂₃ ^-ΑΑ₃₂₆ TU madura, um polipéptido de fórmula AA^-AA_3g2 no grupo consde proteína proteína TU madura, um polipéptido de fórmula Met-AA₁__3g2 de proteína TU madura, un polipéptido de fSrmula ΑΑ_χ-ΑΑ_{37μ de proteína Tu madura)} de fórmula Met-AA₁_₃₇₄, de proteína TU madura, de fórmula AA^-AA^? de proteína TU madura, um ^-^1-377

   AA_2₃-AA₃₇u um polipéptido um polipéptido polipéptido polipéptido polipéptido de de de fórmula fórmula fórmula

   AA_₂₃“AA₃77 de de de proteína proteína proteína

   TU

   TU

   TU madura, um madura, um madura ou suas fracções.
10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se escolher o polipéptido produzido no grupo consituído por um polipéptido de fórmula AA_₂₃“AA^g₂ Ρ^ΓΟΐβί^η& TU madura, um polipéptido de fórmula AA^-AA^_g2 de proteína TU madura, um polipéptido de fórmula Met-AA^_^_g2 de proteína TU madura, um polipéptido de fórmula AA_₂₃”AA^g₂ de proteína TU madura, seguido pelos aminoãcidos asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipentido de fórmula ΑΑ.-ΑΑ_Ί0„ de nroteína TU madura, seguido pelos aminoãcidos asparagina-leucina-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipéptido de fórmula Met-AA^_^_g2 de proteína TU madura, seguido pelos aminoãcidos asparagina-leuci na-glutamina-histidina-serina-leucina, um polipéptido de fórmula

    129AA ₀ ~ - ΑΑ_{Ί Ί} , de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula “*Z 0 XX O

    AA^-AA^-^^ ^de P^otsína TU madura, um polipeptido de fórmula

    Met-AA^ ^^2 de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula AA^-AA.^ de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula de proteína TU madura, um polipepti do de fórmula AA^^g-AA^^^ de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula AA^-AA^^q de proteína TU madura, um polipeptido de fór mula .Met-AA^_₁₃₁ de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula AA_2 3~AA^_L,g de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula AA^-AA^^2 de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula Met-AA-j.-ms de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula

    AA_₂₃AA₁₆₆, de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula Αχ'.^-AA^gg de proteína TU madura, um polipeptido de fórmula Μβΐ-ΑΑ^_^θθ de proteína TU madura ou as suas fracções.

    J
11. 11.- Processo para a preparação de um polipeptido recombinante idêntico a TU solúvel, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado com uma sequência de DNA que codifica para o referido polipeptido.
12. 12.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento e a prevenção de infecções por

    HIV, caracterizado pelo facto de se associar uma quantidade imunoterapêutica ou imunosupressora eficaz de um polipeptido escolhido no grupo constituído pelos polipeptidos produzidos pelo processo —130- de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 11, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico .
13. 13. - Processo para tratamento e prevenção de infecções por HIV em um doente, caracterizado pelo facto de se utilizar nesse doente uma composição, preparada de acordo com o processo descrito na reivindicação 12, de um modo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo e por dia.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se utilizar uma composição de tratamento por via intramuscular, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de oeso do corpo e por dia.

    )
15. 15. - Processo para detectar ou controlar uma infecção por HIV, caracterizado pelo facto de se utilizar para diagnostico uma quantidade eficaz de diagnóstico de um polipêptido preparado pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11.

    15.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para tratar ou prevenir infecções por HIV, caracte rizado pelo facto de se associar uma quantidade imunoterapêutica ou imunosupressora eficaz de um anticorpo para um polipêptido es-131- colhido no grupo constituído pelos polipeptidos produzidos pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 11, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
16. 17.- Processo para tratar ou prevenir a infecção por HIV em um doente, caracterizado pelo facto de se tratar esse doente com uma composição produzida de acordo com a reivindicação 16 de um mo do aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo e por dia.
17. 18.- Processo para purificar vírus HIV de uma amostra, ca- racterizado pelo facto de se expor essa amostra a um polipéptido escolhido no grupo constituído pelos polipeptidos produzidos pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 11.
18. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se purificar vírus HIV de uma amostra biológica.
19. 20. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recom binante, caracterizado pelo facto de se introduzir, em um veículo de clonagem, a inserção de DNA de pl70-2, a qual está ligada de um modo operacional a uma sequência de controlo de expressão na referida molécula de DNA recombinante e estã expressa para produ

    -132- zir um polipéptido idêntico a TU quando se cultiva um hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA recombinante.
20. 21. - Processo para transformar um hospedeiro, caracterizado pelo facto de se introduzir nesse hospedeiro uma molécula de DNA recombinante preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 20.
21. 22. - Processo para a preparação de polipeptidos idênticos a TU, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro trans formado por uma molécula de DNA recombinante caracterizada pela inserção de DNA de pl70-2, encontrando-se esta inserção de DNA ligada de um modo operacional a uma sequência de controlo de expressão na referida molécula de DNA recombinante e sendo expressa para produzir um polipéptido idêntico a TU quando se cultiva um hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA recombinante.
22. 23. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo.facto de se misturar uma quantidade imunoterapêutica ou imunosupressora eficaz de um receptor de proteína solúvel, como ingrediente activo, com um veículo aceitável'sob o ponto de vista farmacêutico.

    2U.- Processo para tratar doentes, caracterizado pelo facto —133- de se utilizar de um modo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico uma composição farmacêutica preparada de acordo com a rei vindicação 23, como meio de tratamento, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo e por dia.
23. 25.- Método para detectar e controlar uma infecção virai, caracterizado pelo facto de se utilizar uma quantidade de diagnõs tico eficaz de um receptor de proteína solúvel como meio de diagnóstico.
24. 26.- Processo para a preparação de moléculas de DNA recombinante, caracterizado pelo facto de se introduzir, em um veículo de clonagem, uma sequência de DNA escolhida no grupo constituído por:

    a) uma inserção de DNA de pBiv.l,

    b) sequências de DNA que hibridizam para a inserção de

    DNA de pBiv.l e que codificam por expressão para um polipêptido idêntico a TU solúvel polivalente; e

    c) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipêptido idêntico a TU solúvel polivalente codificado para a inserção de DNA de pBiv.l, estando a referida sequência de DNA ligada de um modo operacional a uma sequência de controlo de expres são na referida molécula de DNA recombinante e sen-134- do expressa para produzir o referido polipéptido quando se cultiva um hospedeiro transformado com a molécula de DNA referida antes.
25. 27.- Processo para transformar um hospedeiro, caracterizado pelo facto de se introduzir nesse hospedeiro uma molécula de DNA recombinante produzida pelo processo de acordo com a reivindicação

    26.
26. 28.- Processo para a preparação de um polipéptido polivalente idêntico a TU, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA recombinante caracterizada por uma sequência de DNA recombinante escolhida no grupo constituído por:

    a) uma inserção de DNA de pBiv.l;

    b) sequências de DNA que hibridizam para a inserção de DNA de pBiv.l e que codificam por expressão para um polipéptido semelhante a TU solúvel polivalente ; e

    c) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel poliva- lente codificado para a inserção de DNA de pBiv.l, estando a sequência de DNA referida ligada de um modo operacional a uma sequência de controlo de expressão na molécula de DNA recombinante referida

    -135- antes e sendo expressa para produzir o citado polipéptido quando se cultiva um hospedeiro transformado com a dita molécula de DNA.
27. 29.- Processo para a preparação de um polipéptido idêntico a T4 solúvel polivalente, caracterizado pelo facto:

    a) de se cultivar um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA recombinante produzida pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a -3 para produzir um polipéptido semelhante a T4-soluvel; e

    b) de se ligar o polipéptido referido a um veículo para se formar um polipéptido idêntico a TU solúvel polivalente.
28. 30.- Processo para a preparação de uma rsTU/JgGl quimérica, caracterizado pelo facto de se co-transfectar uma célula hospedeira ccm um vector de expressão caracterizado por uma sequência de DNA constituída por:

    a) uma primeira fracção que incorpora uma sequência de

    DNA codificadora para uma região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina; e

    b) uma segunda fracção que incorpora uma sequência de

    DNA escolhida no grupo constituído por:

    (i) inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pRG3S0, pBG381, p203-5, pBG391, pBG392,pBG393, pBG39U, pBG395, pBG396, pBG397, p211-ll, p214-10 e p215-7;

    (ii) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inserções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel ; e (iii) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel codificado para expressão por qualquer das inserções de DNA e sequências anteriores sendo a segunda fracção referida antes ligada a montante da primeira fracção citada; e um vector de expressão caracterizado por uma sequência de DNA que inclui:

    a) uma primeira fracção que incorpora uma sequência de DNA codificadora para uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina; e

    b) uma segunda fracção que incorpora uma sequência de

    DNA escolhida no grupo constituído por:

    (i) as inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380, pBG381, p203-5, pBG391, pBG392, pBG393, pBG39U, pBG395 , pBG396 , pBG397 , p211-ll, p21U-10 e p215-7 ;

    (ii) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inserções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU

    -137 solúvel; e (iii) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel codificado para a expressão por qualquer das inserções de DNA e sequências anteriores, estando a segunda fracção citada ligada a montante da dita primeira fracção.
29. 31.- Processo para a preparação de uma rsTU/IgGl quimérica, caracterizado pelo facto de se transfectar uma célula hospedeira com um vector de expressão caracterizado por uma primeira sequência de DNA que inclui:

    a) uma primeira fracção que incorpora uma sequência de DNA codificadora para uma região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina; e

    b) uma segunda fracção que incorpora uma sequência de DNA escolhida no grupo constituído por:

    (i) as inserções de DNA de p!99-7, pBG377, pBG380, pBG381, p203-5, pBG391, pBG392, pBG393, pBG394, PBG395, pBG396, pBG397, p211-ll, p214-10 e p215-7;

    (ii) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inserções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a T4 solúvel; e (iii) sequências de DNA que codificam por expressão

    -13S- para um polipéptido idêntico a TU solúvel codificado para expressão por qualquer das inserções de DNA e sequências anteriores, estando a segunda fracção citada ligada a montante da primeira fracção referida;

    sendo também o referido vector de expressão caracterizado por uma segunda sequência de DNA constituída por:

    a) uma primeira fracção que incorpora uma sequei cia de DNA codificadora para uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina; e

    b) uma segunda fracção que incorpora uma sequência de DNA escolhida no grupo constituído por:

    (i) as inserções de DNA de pl99-7, pBG377, pBG380. pBG381, p203-5, pBG391, pBG392,pBG393, pBG39U, pBG395, pBG396, pBG397, p211-ll, p21U-10 e p215-7:

    (ii) sequências de DNA que hibridizam para uma ou mais inserções de DNA anteriores e que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel; e (iii) sequências de DNA que codificam por expressão para um polipéptido idêntico a TU solúvel codificado para expressão por qualquer das inserções de DNA e sequências anteriores, sendo a segunda fracção referida antes unida a montante da primei-139ra fracção citada.
30. 32. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade eficaz imunoterapêutica ou iminosupressora de um polipéptido idêntico a T4 solúvel, como ingrediente activo, preparado pelo processo de acordo com uma das reivindicações 28 ou 23.
31. 33. - Processo para tratar doentes, caracterizado pelo facto de se utilizar de um modo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico uma composição preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 32, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo e por dia.
32. 34,- Processo para detectar ou para controlar o desenvolvimen to de infecção por HIV, caracterizado pelo facto de se utilizar uma quantidade eficaz de um polipéptido idêntico a TU solúvel como agente de diagnóstico preparado pelo processo de acordo com uma das reivindicações 28 ou 29.

    •
33. 35.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracrerizado pelo facto de se utilizar uma quantidade eficaz de uma rsTU/IgGl quimérica, como agente imunoterapêutico ou imunosupressor, preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 30 ou 31.

    -140
34. 36.- Processo para tratar doentes, caracterizado pelo facto se utilizar de um modo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico uma composição preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 35, em uma gama de dosagens compreendida entre cerca de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso do corpo e por dia,