PT904351E

PT904351E - Células animais e processos para a replicação de vírus influenza

Info

Publication number: PT904351E
Application number: PT97915627T
Authority: PT
Inventors: Albrecht Groner; Juergen Vorlop
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2010-12-28
Also published as: US6455298B1; DE69740002D1; ATE482267T1; DK0904351T3; ES2352638T3; JP2009034115A; JP2004331673A; EP2275535A1; HK1019233A1; JP2005211080A; EP0904351A1; JP2000507448A; US20080274141A1; EP0904351B1; US20030073223A1; DE19612966A1; DE19612966B4; JP2012005502A; US6656720B2; JP2012016358A

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "CÉLULAS ANIMAIS E PROCESSOS PARA A REPLICAÇÃO DE VÍRUS INFLUENZA" A presente invenção relaciona-se com células MDCK que podem ser infectadas por vírus influenza e estão adaptadas para crescer em suspensão em meio livre de soro, e com os processos para a produção de uma vacina para vírus influenza em cultura celular usando estas células. A presente revelação ainda se relaciona com vírus influenza que se podem obter com o processo descrito e com vacinas que contêm vírus deste tipo ou os seus constituintes.

Todas as vacinas da gripe que têm sido usadas desde os anos 40 até aos nossos dias como vacinas autorizadas para o tratamento de seres humanos e animais consistem em uma ou mais estirpes de vírus que têm sido replicados em ovos embrionários de galinha. Estes vírus são isolados a partir do fluido alantóico de ovos de pinto infectados e os seus antigénios são usados como vacina quer com partículas de vírus intactas ou com partículas de vírus desintegradas por detergentes e/ou solventes - denominadas vacinas de clivagem - ou como isolados, proteínas vírus definidas - denominadas vacinas de subunidades. Em todas as vacinas autorizadas, os vírus são inactivados através de processos conhecidos pelos especialistas na arte. A replicação de vírus vivos atenuados, que são testados em vacinas experimentais, também é realizada em ovos embrionários de galinha. O uso de ovos embrionários de galinha para a produção de vacinas é moroso, difícil e dispendioso. Os ovos - a partir de 1 aviários de galinhas saudáveis monitorizados por veterinários - têm que ser incubados antes da infecção, normalmente durante 12 dias. Antes da infecção, os ovos têm que ser seleccionados com respeito aos embriões vivos, porque apenas estes são adequados para a replicação dos virus. Após a infecção os ovos são incubados novamente, normalmente durante 2 a 3 dias. Os embriões que continuam vivos nesta altura são mortos por frio e o fluido alantóico é então obtido a partir de cada ovo por aspiração. Através de processos de purificação trabalhosos, as substâncias a partir dos ovos de galinha que conduzem a efeitos colaterais indesejáveis da vacina são separados dos virus, e os virus são concentrados. Como os ovos não são estéreis (livres de patogénicos), é necessário ainda remover e/ou inactivar os piogénicos e todos os patogénicos que possam estar presentes.

Os virus e outras vacinas tais como, por exemplo, virus da raiva, papeira, sarampo, rubéola, vírus da polio e vírus FSME podem ser replicados em culturas celulares. Como as culturas celulares com origem em bancos celulares testados são livres de patogénicos e, em oposição aos ovos de galinha, são um sistema de replicação de vírus definido que (teoricamente) está disponível em quantidades praticamente ilimitadas, tornando possível a replicação económica dos vírus sob determinadas circunstâncias mesmo no caso dos vírus influenza. Também é possível conseguir uma produção económica de vacinas em que o isolamento e a purificação do vírus a partir de um meio de cultura estéril e definido parecem ser mais simples do que a partir de fluido alantóico altamente proteico. 0 isolamento e a replicação de vírus influenza em ovos conduzem a uma selecção de determinados fenótipos, em que a maioria difere do isolado clínico. Pelo contrário, temos o isolamento e a replicação dos vírus nas culturas celulares, nas quais não ocorre a selecção dependente da passagem (Oxford, 2 J.S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185 - 189; Robertson, J.S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047 - 2051). Assim, para uma vacina eficaz, a replicação de virus em cultura celular também é preferida, neste aspecto, ao uso dos ovos.

Sabe-se que os virus influenza podem ser replicados em culturas celulares. Além disso, as células embrionárias de galinha e as células de hamster (BHK21-F e HKCC), células MDBK, e em particular as células MDCK têm sido descritas como células adequadas para a replicação in vitro de virus influenza (Kilbourne, E. D., in: Influenza, pages 89 - 110, Plenum Medicak Book Company - New York and London, 1987) . Por exemplo, Merten et al. (1996) advances in Experimental

Medicine and Biology, pages 141-151, revela a produção de virus influenza em células BHK-21/BRS, Vero e MDCK. As células BHK-21/BRS foram crescidas numa cultura em suspensão; as células Vero e MDCK foram crescidas em microtransportadores. Um pré-requisito para uma infecção bem sucedida é a adição de proteases ao meio de infecção, preferivelmente tripsina ou proteases semelhantes de serina, uma vez que estas proteases clivam extracelularmente a proteína precursora da hemaglutinina [HAo] na hemaglutinina activa [HAi e HA2] . Apenas a hemaglutinina clivada conduz à adsorção dos vírus influenza às células com a subsequente assimilação do vírus para dentro das células (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9 - 14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1975) 440 - 454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426 -439) e, assim, para mais um ciclo de replicação do vírus na cultura celular. A Patente US 4 500 513 descreve a replicação do vírus influenza em culturas celulares de células de crescimento aderente. Após a proliferação de células, o meio nutriente é removido e é adicionado meio nutriente fresco às células com infecção com as células com vírus influenza sendo colocadas 3 simultaneamente ou logo após. Um dado tempo após a infecção, a protease (por exemplo, tripsina) é adicionada de modo a obter uma replicação de virus óptima. Os vírus são recolhidos, purificados e processados para darem uma vacina inactivada ou atenuada. A replicação económica de vírus influenza como um pré-requisito para a produção da vacina não pode ser bem sucedida, no entanto, usando a metodologia descrita na patente acima mencionada, uma vez que a mudança de meio, a infecção subsequente, bem como a adição de tripsina que é realizada depois necessita da abertura dos frascos de cultura celular individualmente várias vezes sendo, por isso, muito trabalhoso Além disso, o risco de contaminação da cultura celular por microrganismos e vírus indesejáveis aumenta com cada manipulação dos frascos de cultura. Uma alternativa mais economicamente viável é a proliferação de células em sistemas de fermentação conhecidos pelos especialistas na arte, em que as células crescem aderentes aos microtransportadores. No entanto, o soro necessário para o crescimento das células nos microtransportadores (normalmente soro bovino fetal), contém inibidores da tripsina, de modo que mesmo neste método de produção é necessária uma variação do meio para meio livre de soro de modo a se conseguir a clivagem da hemaglutinina de influenza pela tripsina e depois uma adequada replicação dos vírus elevada. Assim, esta metodologia também requer a abertura dos frascos de cultura várias vezes e causa assim um aumento do risco de contaminação. A presente invenção está, assim, baseada no objectivo de produzir células e processos disponíveis que tornem possível a produção simples e económica de uma vacina de vírus influenza.

Este objectivo é conseguido através do fornecimento das modalidades indicadas nas reivindicações da patente. A invenção usa células MDCK que podem ser infectadas por vírus influenza e que estão adaptadas para crescimento em suspensão 4 em meio livre de soro. Descobriu-se que é possível com a ajuda de células deste tipo replicar vírus influenza em cultura de célula de um modo simples e económico. Através da utilização destas células, por um lado, uma variação do meio antes da infecção para remover o soro pode ser dispensada com, por outro lado, a adição da protease que pode ser realizada simultaneamente com a infecção. Em suma, apenas é necessária uma única abertura do frasco de cultura para infecção com vírus influenza, pelo que o risco de contaminação das culturas de células é drasticamente reduzido. 0 gasto de esforço que poderá estar associado com a variação do meio, a infecção e a subsequente adição de protease é, além disso, diminuído. Uma vantagem adicional é que o consumo de meio é marcadamente reduzido.

As células de acordo com a invenção são células que são derivadas de células MDCK (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) e, particularmente preferível, células da linha celular MDCK 33016. Esta linha celular foi depositada com o número de depósito DSM ACC2219 em 7 de Junho de 1995 de acordo com os requerimentos da Convenção de Budapeste (Budapest Convention) para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos (DSM - International Recognition Deposition of Microorganisms) para o Propósito de Patentear na Colecção Alemã de Microrganismos (Purposes of Patenting in the German Collection of Micro-organisms (DSM)), em Brunswick, República Federal Alemã, reconhecido como um local de depósito internacional. A linha celular MDCK 33016 é derivada da linha celular MDCK pela passagem e selecção com respeito à capacidade de crescimento em suspensão no meio livre de soro e a replicação de vários vírus, por exemplo, orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus e flavovirus. Por causa destas propriedades, estas células são adequadas para replicação 5 económica dos vírus influenza em cultura celular através de um processo simples e economicamente viável. A presente invenção também se relaciona com um processo para a produção de uma vacina de vírus influenza numa cultura celular, no qual as células, de acordo com a invenção, são usadas, em particular, num processo que compreende os seguintes passos: (i) proliferação das células em suspensão de acordo com a invenção descrita acima num meio livre de soro; (ii) infecção das células com vírus influenza; (iii) adição de protease pouco tempo antes, simultaneamente a ou pouco tempo após a infecção; e (iv) nova cultura das células infectadas e isolamento dos vírus influenza replicados; e (v) formulação dos vírus influenza isolados para dar uma vacina para administração a seres humanos ou animais,

Em que as células podem ser infectadas por vírus influenza e são seleccionadas a partir das células MDCK a serem adaptadas para crescimento em suspensão.

As células, de acordo com a invenção, podem ser postas em cultura no decorrer do processo em vários meios livres de soro conhecidos pelos especialistas na arte (por exemplo, meio de Iscove, meio CHO ultra (BioWhittaker) , EX-CÉLULA (JRH Biosciences)). Por outro lado, as células para replicação também podem ser postas em cultura no meio com soro usual (por exemplo, meio MEM ou DMEM com 0.5% a 10%, preferivelmente 1.5% a 5%, de soro bovino fetal) ou meio sem proteína (por exemplo, PF-CHO (JRH Biosciences)). Os frascos de cultura adequados que podem ser empregues no decorrer do processo de acordo com a invenção são todos frascos conhecidos pelos especialistas na arte, tais como, por exemplo, garrafas giratórias, garrafas rotativas ou fermentadores. 6 A temperatura para a proliferação das células antes da infecção com os vírus influenza é preferivelmente 37°C. A cultura para a proliferação das células (passo (i)) é realizada, numa modalidade preferida do processo, num sistema de perfusão, por exemplo, num fermentador com agitação, usando sistemas de retenção de células conhecidos pelos especialistas na arte, tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, filtros rotativos e similares. As células são neste caso preferivelmente proliferadas durante 2 a 18 dias, particularmente preferível durante 3 a 11 dias. A troca do meio é realizada no decorrer disto, aumentando desde 0 até aproximadamente 1 a 3 volumes do fermentador por dia. As células são proliferadas até densidades celulares bastante elevadas desta maneira, preferivelmente até aproximadamente 2 x 107 células/ml. As taxas de perfusão durante a cultura no sistema de perfusão podem ser reguladas através da contagem de células, do conteúdo de glucose, glutamina ou lactato no meio e através de outros parâmetros conhecidos pelos especialistas na arte.

Para a infecção com vírus influenza, cerca de 85% a 99%, preferivelmente 93% a 97%, do volume do fermentador é transferido com as células para um outro fermentador. As células que permanecem no primeiro fermentador podem por sua vez serem misturadas com meio e novamente replicadas no sistema de perfusão. Desta maneira, a cultura contínua de células para a replicação de vírus é válida.

Alternativamente ao sistema de perfusão, as células no passo (i) do processo de acordo com a invenção também podem preferivelmente serem postas em cultura num processo batch (descontínuo). As células de acordo com a invenção proliferam aqui a 37°C com um tempo de duplicação de 20 a 30 h até uma densidade celular de cerca de 8 a 25 x 105 células/ml. 7

Numa modalidade preferida do processo de acordo com a invenção, o pH do meio de cultura usado no passo (i) é regulado durante a cultura e está no intervalo de pH 6.6 a pH 7.8, preferivelmente no intervalo de pH 6.8 a pH 7.3.

Além disso, o valor de pCq é vantajosamente regulado neste passo do processo e está preferivelmente entre 25% e 95%, em particular entre 35% e 60% (com base na saturação do ar) .

De acordo com a invenção, a infecção das células postas em cultura em suspensão é preferivelmente realizada quando as células no processo em batch tiverem atingido uma densidade celular de cerca de 8 a 25 x 105 células/ml ou cerca de 5 a 20 x 106 células/ml no sistema de perfusão.

Numa outra modalidade preferida, a infecção das células com virus influenza é realizada com uma m.o.i. (multiplicidade de infecção) de cerca de 0.0001 a 10, preferivelmente de 0.002 a 0.5. A adição da protease que causa a clivagem da proteína precursora da hemaglutinina [HA0] e assim a adsorção dos vírus às células, pode ser realizada de acordo com a invenção pouco tempo antes, simultaneamente a ou pouco tempo depois da infecção das células com o vírus influenza. Se a adição é realizada simultaneamente com a infecção, a protease pode ser adicionada directamente à cultura celular a ser infectada ou, por exemplo, como um concentrado em conjunto com o inoculado de vírus. A protease é preferivelmente uma protease de serina, e particularmente preferível tripsina.

Numa modalidade preferida, a tripsina é adicionada à cultura celular a ser infectada até uma concentração final de 1 a 200 μρ/ιηΐ, preferivelmente 5 a 50 μρ/ιηΐ, e particularmente preferível 5 a 30 μρ/ιηΐ no meio de cultura. Durante a cultura adicional das células infectadas de acordo com o passo (iv) do processo de acordo com a invenção, a reactivação da tripsina pode ser realizada por adição fresca de tripsina no caso do 8 processo em batch ou no caso do sistema de perfusão através da adição continua duma solução de tripsina ou por adição intermitente. No último caso, a concentração de tripsina está preferivelmente no intervalo de 1 μς/ιηΐ a 80 μς/ιηΐ.

Após a infecção, a cultura celular infectada é colocada noutra cultura para replicar os vírus, em particular, até um efeito citopático máximo ou uma quantidade máxima do antigénio do vírus poderem ser detectados. Preferivelmente, a cultura das células é realizada durante 2 a 10 dias, em particular durante 3 a 7 dias. A cultura pode, por sua vez, ser realizada preferivelmente no sistema de perfusão ou no processo em batch

Numa outra modalidade preferida, as células são colocadas em cultura numa temperatura de 30°C a 36°C, preferivelmente de 32°C a 34°C, após a infecção com o vírus influenza. A cultura das células infectadas a temperaturas abaixo de 37°C, em particular nos intervalos de temperatura indicados acima, conduz à produção de vírus influenza que, após a inactivação, têm uma actividade apreciavelmente elevada como vacina, em comparação com os vírus influenza que foram replicados a 37°C na cultura celular. A cultura das células após a infecção com vírus influenza (passo (iv) ) é, por sua vez, preferivelmente realizada a pH e PO2 regulados. O pH neste caso está preferivelmente no intervalo de 6.6 a 7.8, particularmente preferível de 6.8 a 7.2, e o pC>2 no intervalo de 25% a 150%, preferivelmente de 30% a 75%, e particularmente preferível no intervalo de 35% a 60% (com base na saturação do ar).

Durante a cultura das células ou replicação dos vírus de acordo com o passo (iv) do processo, é possível uma substituição do meio da cultura celular por meio fresco recentemente preparado, concentrado de meio ou com constituintes definidos tais como aminoácidos, vitaminas, 9 fracções de lípidos, fosfatos etc. para optimizar o rendimento de antigénio.

Após a infecção com vírus influenza, as células podem ser diluídas lentamente através de mais adição de meio ou concentrado de meio durante vários dias ou podem ser incubadas durante outra perfusão com meio ou concentrado de meio que diminui de aproximadamente 1 a 3 a 0 volumes de fermentador/dia. As taxas de perfusão, neste caso, podem ser por sua vez reguladas através de meios de contagem de células, do conteúdo de glucose, glutamina, lactato ou lactato desidrogenase no meio ou outros parâmetros conhecidos pelos especialistas na arte.

Uma combinação do sistema de perfusão com um processo semi-contínuo (fed-batch) é ainda possível.

Numa modalidade preferida do processo, a recolha e isolamento dos vírus influenza replicados são realizados 2 a 10 dias, preferivelmente 3 a 7 dias, após a infecção. Para fazer isto, por exemplo, as células ou resíduos celulares são separados do meio de cultura através de meios de métodos conhecidos pelos especialistas na arte, por exemplo através de separadores ou filtros. A seguir a isto a concentração dos vírus influenza presentes no meio de cultura é realizada através de métodos conhecidos pelos especialistas na arte, tais como, por exemplo, centrifugação por gradiente, filtração, precipitação e similares.

Os vírus Influenza que são obtidos por um processo de acordo com a invenção são formulados por métodos conhecidos para dar uma vacina para administração a seres humanos ou animais. A imunogenicidade ou eficácia dos vírus influenza obtidos como vacina pode ser determinada através de métodos conhecidos pelos especialistas na arte, por exemplo, por meios de protecção conferidos na experiência do carregamento ou como títulos de anticorpo de anticorpos de neutralização. A 10 determinação da quantidade de vírus ou antigénio produzida pode ser realizada, por exemplo, através da determinação da quantidade de hemaglutinina de acordo com os métodos conhecidos pelos especialistas na arte. Sabe-se, por exemplo, que a hemaglutinina clivada liga-se a eritrócitos de várias espécies, por exemplo, a eritrócitos de galinhas. Isto torna possível uma quantificação simples e rápida dos vírus produzidos ou do antigénio formado.

Os vírus influenza obtidos por este processo podem ser usados em vacinas. As vacinas deste tipo podem opcionalmente conter os aditivos normalmente usados para vacinas, em particular substâncias que aumentam a resposta imune, i.e. os denominados adjuvantes, por exemplo, de hidróxido de vários metais, constituintes de paredes de células bacterianas, óleos ou saponinas e, além disso, excipientes usuais farmacologicamente toleráveis.

Os vírus podem estar presentes nas vacinas como partículas intactas de vírus, em particular como vírus atenuados vivos. Para este fim, os concentrados de vírus são ajustados para o título desejado e quer liofilizados quer estabilizados na forma líquida.

Numa outra modalidade, as vacinas podem conter vírus desintegrados, i.e., inactivados, ou intactos, mas inactivados Para este fim, a infecciosidade dos vírus é destruída por meio de métodos químicos e/ou físicos (por exemplo, por detergentes ou formaldeído). A vacina é então ajustada para a quantidade de antigénio desejada e após possível mistura de adjuvantes ou após possível formulação da vacina, dispensada, por exemplo, como lipossomas, microesferas ou formulações de "libertação lenta".

Numa outra modalidade preferida, as vacinas podem finalmente ser vacina de subunidade, i.e. podem conter constituintes de vírus definidos, isolados, preferivelmente 11 proteínas isoladas de vírus influenza. Estes constituintes podem ser isolados a partir de vírus influenza através de métodos conhecidos pelos especialistas na arte.

Além disso, os vírus influenza obtidos pelo processo de acordo com a invenção podem ser usados com o objectivo de diagnóstico. Assim, a presente revelação também se relaciona com composições de diagnóstico que contêm vírus influenza de acordo com a invenção ou constituintes de tais vírus, se apropriado, em combinação com aditivos usuais neste campo e agentes de detecção adequados.

Os exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1

Preparação de linhas celulares que estão adaptadas para crescimento em suspensão e podem ser infectadas por vírus influenza

Uma linha celular que está adaptada para crescimento em cultura de suspensão e pode ser infectada por vírus influenza é seleccionada começando a partir de células MDCK (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2), que têm sido proliferadas por meio de apenas poucas passagens ou durante vários meses em laboratório. Esta selecção foi realizada através da proliferação de células em garrafas rotativas que estiveram a rodar a 16 rpm (em vez de cerca de 3 rpm como é normal para as garrafas rotativas com crescimento aderente de células) . Após várias passagens das células presentes em suspensão no meio, foram obtidas as estirpes de células que cresceram em suspensão. Estas estirpes de células foram infectadas com vírus influenza e foram seleccionadas as estirpes que produziram maiores rendimentos de vírus. Um aumento na taxa de crescimento celular em suspensão durante a primeira passagem a 16 rpm é conseguido durante 1 a 3 passagens pela adição de sistemas de selecção conhecidos pelos especialistas na arte, tais como hipoxantina, 12 aminopterina e timidina, ou alanosina e adenina, individualmente ou em combinação. A selecção de crescimento celular em suspensão também é possível em outros sistemas de cultura celular com agitação conhecidos pelos especialistas na arte, tais como frascos de agitação.

Alternativamente, podem ser estabelecidos clones celulares de elevada replicação de vírus antes da selecção como suspensão de células por clonagem de células em placas de microtitulação. Neste processo, as células de arranque de crescimento aderente (após a tripsinização) são diluídas para uma concentração de cerca de 25 células/ml com meio com soro e são adicionados 100 μΐ desta suspensão de células a cada poço duma placa de microtitulação. Se 100 μΐ de meio estéril filtrado de uma cultura celular (homóloga) de 2 a 4 dias de idade ("meio condicionado") forem adicionados a cada poço, a probabilidade de crescimento das células inoculadas numa muito baixa densidade celular aumenta. Através de verificação por microscópio óptico, os poços são seleccionados em que apenas uma célula está contida; o tapete celular daí resultante é então passado para frascos de cultura celular maiores. A adição de meio de selecção (por exemplo, hipoxantina, aminopterina e timidina ou alanosina e adenina, individualmente ou em combinação) após esta passagem de células origina através de 1 a 3 passagens uma maior capacidade de distinguir os clones das células Os clones celulares que resultam deste modo foram seleccionados com respeito à sua replicação de vírus específica e depois seleccionados como células de suspensão. A selecção de células que estão adaptadas para crescimento em meio sem soro também pode ser realizada através de métodos conhecidos pelos especialistas na arte.

Os exemplos de células que estão adaptadas para crescimento em suspensão em meio sem soro e podem ser 13 infectadas por vírus influenza são as linhas celulares MDCK 33016 (DSM ACC2219) e MDCK 13016, cujas propriedades estão descritas nos exemplos seguintes.

Exemplo 2

Replicação de vírus influenza na linha celular MDCK 33016 A linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219; obtido a partir de uma cultura celular MDCK por pressão de selecção) foi proliferada a 37°C em meio de Iscove com uma taxa de separação de 1:8 a 1:12 duas vezes por semana numa garrafa rotativa que foi posta a rodar a 16 rpm. Quatro dias após a transferência, foi conseguida uma contagem de células de aproximadamente 7.0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Simultaneamente à infecção da cultura celular agora com 4 dias de idade com a estirpe de vírus influenza A/PR/8/34 (m.o.i. =0.1), a cultura celular foi tratada com tripsina (concentração final de 25 μρ/ιηΐ) e posta em cultura novamente a 37°C, e a replicação de vírus foi determinada durante 3 dias (Tabela I).

Tabela I

Replicação de influenza A/PR/8/34 em garrafas rotativas (linha celular MDCK 33016) após infecção duma cultura celular sem variação do meio, medido como conteúdo de antigénio (unidades de HA)

Conteúdo em HA dias após infecção (dpi) 1 dpi 2 dpi 3 dpi Experiência 1 1:64 1:512 1:1024 Experiência 2 1:4 1:128 1:1024 Experiência 3 1:8 1:32 1:512 14

As razões indicadas significam que uma diluição 1:X dos virus recolhidos continuam a ter propriedades de hemaglutinação. As propriedades de hemaglutinação podem ser determinadas, por exemplo, como descrito em Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden, (Virological Working Methods), Volume 1 (1974), pages 260-261 or in Grist, Diagnostic Methods in Clinicai Virology, pages 72 to 75.

Exemplo 3

Replicação de vírus influenza na linha celular MDCK 13016 em garrafas de agitação A linha celular MDCK 13016 foi replicada a 37°C em meio de Iscove com uma taxa de separação de 1:6 a 1:10 duas vezes por semana numa garrafa agitação (50 rpm). Quatro dias depois da transferência, foi conseguida uma contagem de células de aproximadamente 8.0 x 105 células/ml. Simultaneamente à infecção da cultura celular, agora com 4 dias de idade, com a estirpe de virus influenza A/PR/8/34 (m.o.i. = 0.1), a cultura celular foi tratada com tripsina (concentração final de 25 μρ/ιηΐ) e novamente incubadas a 33°C, e a replicação dos virus foi determinada durante 6 dias (Tabela II).

Tabela II

Replicação de influenza A/PR/8/34 em garrafas giratórias (linha celular MDCK 13016) após infecção de uma cultura celular sem variação do meio, medido como conteúdo em antigénio (unidades de HA)

Conteúdo em HA após dias da infecção (dpi) 1 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi Experiência 1 1:2 1:128 1:1024 1:1024 1:2048 Experiência 2 1:4 1:512 1:2048 1:2048 1:1024 15

Exemplo 4

Replicação de várias estirpes de influenza na linha celular MDCK 33016 em garrafas rotativas A linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) foi replicada a 37°C em meio de Iscove com uma taxa de separação de 1:8 a 1:12 duas vezes por semana numa garrafa rotativa com uma rotação de 16 rpm. Quatro dias depois da transferência, foi conseguida uma contagem de células de aproximadamente 7.0 χ 105 a 10 x 105 células/ml. Simultaneamente à infecção da cultura celular, agora com 4 dias de idade, com várias estirpes de virus influenza (m.o.i. =¾ 0.1), a cultura celular foi tratada com tripsina (concentração final de 25 μρ/πιΐ) e novamente incubadas a 33°C, e a replicação dos virus foi determinada no 5o dia após a infecção (Tabela III).

Tabela III

Replicação de estirpes de influenza em garrafas rotativas (linha celular MDCK 33016) após infecção duma cultura celular sem variação do meio, medido como conteúdo em antigénio (unidades de HA)

Conteúdo em HA 5 dias após infecção

Estirpe de Influenza A/Singapore/6/86

Conteúdo em HÁ 1:1024 1:256 1:256 1:128 A/Sichuan/2/87 A/Shanghai/11/87 A/Guizhou/54/89 A/Beij ing/353/89 A/Singapore/6/86 B/Beijing/1/87 1:512 1:1024 1:256 16 (Continuação) B/Yamagata/16/88 1:512 A/PR/8/34 1:1024 A/Equi 1/Prague 1:512 A/Equi 2/Miami 1:256 A/Equi 2 1:128 Fontainebleau A/Swine/Ghent 1:512 A/Swine/Iowa 1:1024 A/Swine/Arnsberg 1:512

Exemplo 5

Replicação de várias estirpes de influenza em células MDCK 33016 no fermentador A linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) foi inoculada em meio de Iscove com um inoculado de celular de 1 x 105 células/ml num fermentador com vaso com agitação (volume de trabalho de 8 L) . A uma temperatura de incubação de 37°C, uma PO2 de 50 ± 10% (regulado) e um pH de 7.11 ± 0.2 (regulado), as células proliferaram em 4 dias para uma densidade celular de 7 x 105 células/ml. Foram adicionados 8 ml da solução de stock de virus (quer A/PR/8/34 ou A/Singapore/6/86 ou A/Shanghai/11/87 ou A/Beijing/1/87 ou B/Massachusetts/71 ou B/Yamagata/16/88 ou B/Panama/45/90) e, simultaneamente, 16 ml de uma solução tripsina com uma força de 1.25% a estas células e a cultura celular inoculada foi incubada novamente a 33°C. A replicação dos virus foi determinada durante 6 dias (Tabela IV) . 17

Tabela IV

Replicação de estirpes de vírus influenza no fermentador (linha celular MDCK 33016) após infecção duma cultura celular sem variação do meio, medido como conteúdo em antigénio (unidades de HA)

Conteúdo em HA após dias de infecção (dpi) 1 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi A/PR/8/34 1:64 1:512 1:1024 1:2048 1:2048 A/Singapore 1:32 1:512 1:2048 1:2048 1:1024 A/Shanghai 1:8 1:128 1:256 1:256 1:512 A/Beij ing 1:16 1:256 1:1024 1:1024 n.d. B/Yamagata 1:8 1:128 1:512 1:512 n.d. B/Massachusetts 1:4 1:128 1:256 1:512 n.d. B/Panama n. d. 1:128 1:256 n.d. 1:1024

Exemplo 6 influência da dose de infecção (m.o.i.) na replicação dos vírus A linha celular MDCK 13016 (obtida a partir de uma cultura celular MDCK por pressão de selecção) foi proliferada a 37°C em meio CHO ultra com uma taxa de separação de 1:8 a 1:12 duas vezes por semana numa garrafa rotativa com uma rotação de 16 rpm. Quatro dias depois da transferência, foi conseguida uma contagem de células de aproximadamente 7.0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Foi investigada a influência da dose infecciosa (m.o.i.) sobre o rendimento do antigénio e a infecciosidade. Simultaneamente à infecção da cultura celular, agora com 4 dias de idade, com várias estirpes de vírus influenza A/PR/8/34 (m.o.i. = 0.5 e m.o.i. = 0.005), a cultura celular foi tratada com tripsina (concentração final de 25 μρ/ιηΐ) e 18 novamente incubadas a 37°C, e a replicação dos vírus foi determinada durante 3 dias (Tabela V).

Tabela V

Replicação da estirpe de vírus influenza PR/8/34 na linha celular MDCK 13016 em garrafas rotativas após a infecção com uma m.o.i. de 0.5 ou 0.005. A avaliação da replicação dos vírus foi realizada por detecção de antigénio (ha) e título de infecciosidade (CCID50 - cell culture infective dose 50% - dose infecciosa de 50% em logi0 sobre a cultura celular)

Dias após infecção 2 3 4 5 HA CCID50 HA CCID50 HA CCID50 HA CCID50 PP./8/34 m.o.i.=0.5 128 5.1 256 5.7 512 5.3 1024 5.4 m.o.i.=0.005 64 4.9 512 8.0 512 8.3 1024 8.3 A determinação da CCID50 pode, neste caso, ser realizada, por exemplo, de acordo com o método que está descrito em Paul, Zell- und Gewebekultur [Célula and tissue culture] (1980) , p. 395.

Exemplo 7

Influência da substituição do meio na replicação dos vírus A linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) foi proliferada a 37°C em meio de Iscove com uma taxa de separação de 1:8 a 1:12 duas vezes por semana numa garrafa rotativa com uma rotação de 16 rpm. Quatro dias depois da transferência, foi conseguida uma contagem de células aproximadamente de 7.0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Foi investigada a influência da dose infecciosa (m.o.i.) sobre o rendimento do antigénio e a infecciosidade. A cultura celular, agora com 4 dias de idade, foi infectada com a estirpe de vírus influenza A/PR/8/34 (m.o.i. = 0.05), sendo 19 realizada a adição de tripsina (concentração final de 20 μς/ιηΐ na garrafa rotativa) por mistura do inoculo de vírus com a solução stock de tripsina. A cultura celular foi tratada com adições de meio e novamente incubada a 33°C, e a replicação de vírus foi determinada durante 5 dias (Tabela VI).

Tabela VI

Replicação de influenza A/PR/8/34 em garrafas rotativas (linha celular MDCK 33016); adição de 5% (concentração final) de um meio de Iscove triplamente concentrado, de glucose (concentração final 3%) ou glucose e hidrolisado de caseína (concentração final de 3% ou 0.1%) medido como conteúdo em antigénio (unidades HA)

Conteúdo em HA dias após infecç ?ão (dpi) Adição 1 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi — 1:16 1:256 1:1024 1:1024 (controlo) 3x Iscove 1:8 1:128 1:1024 1:2048 Glucose 1:32 1:512 1:2048 1:2048 Glucose/hidrolisado de caseína 1:8 1:128 1:512 1:1024

Exemplo 8

Replicação de vírus influenza em células MDCK 33016 no fermentador e obtenção do vírus A linha celular MDCK 33016 (ACC2219) foi inoculada em meio de Iscove com um inoculado celular de 0.5 χ 105 células/ml num fermentador com agitação (volume de trabalho de 10 L) . A uma temperatura de incubação de 37°C, uma p02 de 55 ± 10% (regulado) e um pH de 7.1 ± 0.2 (regulado), as células proliferaram em 4 dias para uma densidade celular de 7 χ 105 células/ml. Foram 20 adicionados 0.1 ml da solução de stock de virus (A/Singapore/6/86; m.o.i. cerca de 0.0015) e, simultaneamente, 16 ml de uma solução tripsina com uma força de 1.25% a estas células e a cultura celular inoculada foi incubada novamente a 33°C. A replicação dos virus foi determinada após 5 dias e os virus foram recolhidos. As células e os residuos celulares foram removidos por filtração de fluxo tangencial (Sarcoton Mini-Microsart Module com tamanho de poro de 0.4 5 μπι; procedimento de filtração de acordo com as instruções do fabricante), não foi detectado no filtrado perda de antigénio (medido como HA). O material de virus foi concentrado desde 9.5 L a 600 ml por filtração de fluxo tangencial fresca (Sartocon Mini-Ultrasart Module com 100,000 NMWS (limite de separação de peso molecular nominal); procedimento de filtração de acordo com as instruções do fabricante) . A quantidade de antigénio no concentrado foi 5120 unidades HA (inicio com 256 unidades de HA; factor de concentração 201, enquanto que a infecciosidade no concentrado foi 9.2 logio CCID50 (inicio com 8.9 logio CCID50; factor de concentração 16); a perda de antigénio e de infecciosidade foi inferior a 1%, medido no filtrado após a filtração a 100000 NMWS.

Exemplo 9

Replicação de vírus influenza em células MDCK 33016 no fermentador de perfusão

Foram suspendidas 1.6 x 108 células da linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) em meio UltraCHO (0.8 x 105 células/ml) no vaso do reactor Biostat MD (Braun Biotech Int., Melsungen, Germany) com um volume efectivo de 2000 ml e proliferadas a 37°C numa operação de perfusão com uma taxa de fluxo crescente (entrada de oxigénio por tubo de arejamento (regulação de oxigénio 40 ± 10% pCb) ; regulação de pH < 7.2; retenção celular por filtro de spin > 95%). A contagem de células vivas 21 aumentou em 11 dias em 200 vezes para 175 x 105 células/ml (Tabela VlIIa). Foram transferidos 1990 ml desta cultura celular para um segundo fermentador de perfusão (volume de trabalho 5 L), enquanto as células remanescentes foram colocadas novamente em 2000 ml de meio e a proliferação de células foi realizada novamente numa operação perfusão. No segundo fermentador de perfusão (infecção pelos virus), as células foram infectadas com a estirpe de virus influenza A/PR/8/34 (m.o.i. = 0.01) com adição simultânea de tripsina (concentração final 10 μρ/ιηΐ) e incubado durante 1 h. O fermentador foi então incubado numa outra operação perfusão (regulação de pCb: 40 ± 10% e pH: < 7.2). No primeiro dia após a infecção, a incubação foi realizada a 37°C e o virus recolhido do sobrenadante da cultura celular perfusada foi descartado. A partir do segundo dia após a infecção, a replicação do virus foi realizada a 33°C e a taxa de perfusão de 2 volumes de fermentador/dia foi reduzida para 0 em 7 dias. A tripsina necessária para a replicação de virus estava presente no meio UltraCHO que foi usado para a perfusão numa concentração de 10 μς/ιηΐ. Os virus colhidos (= sobrenadante da cultura celular perfusada) foram recolhidos a 4°C e a replicação dos virus durante 7 dias foi determinada como a quantidade de antigénio (Tabela VlIIb).

Tabela VlIIa

Replicação de células MDCK 33016 no fermentador de perfusão

Dia Contagem de células vivas Contagem de células Totais Perfusão [x lOVml] [x 10" /ml] [ 1/dia] 0 0.6 0.6 0 3 8.0 8.3 0 22 (continuação) 4 14.6 17.5 1.1 5 33.3 34.7 1.1 6 49.8 53.6 2.1 7 84.5 85.6 3.9 8 82.6 84.9 4.0 9 100.8 104.8 4.1 10 148.5 151.0 4.0 11 175.8 179.6 3.9

Tabela VHIb

Replicação de influenza A/PR/8/34 no fermentador de perfusão (linha celular MDCK 33016), medido como conteúdo em antigénio (unidades HA) no sobrenadante da cultura celular perfusadas acumuladas

Dia após a infecção Conteúdo em HA na recolha de vírus Adição de Meio (perfusão) Quantidade total de recolha de Vírus 1 <4 4 1 0 1 2 8 4 1 4 1 3 64 3 1 7 1 4 256 2 1 9 1 5 2048 2 1 11 1 6 4096 2 1 12 1 7 4096 0 1 12 1 23

Exemplo 10

Preparação duma vacina de influenza experimental

Foi preparada uma vacina experimental a partir de virus influenza A/PR/8/34 do Exemplo 2 - A/PR/8 replicados a 37°C -(Experiência 2; vacina A) e Exemplo 4 - A/PR/8 replicado a 33°C - (vacina B). Os virus influenza no meio da cultura celular foram separados das células e os fragmentos celulares por centrifugação de baixa velocidade (2000 g, 20 min, 4°C) e purificados por uma centrifugação de gradiente sacarose (10 a 50% (m/m) de gradiente de sacarose linear, 30000 g, 2 h, 4°C) . Foi obtida a banda que contém os virus influenza, diluida 1:10 com PBS pH 7.2, e sedimentada a 20000 rpm, e o pellet foi recuperado em PBS (50% do volume original do meio cultura celular). Os virus influenza foram inactivados com formaldeido (adição por duas vezes de 0.025% duma solução formaldeido de 35% de força com um intervalo de 24 h, incubação a 20°C com agitação). Cada um dos 10 ratinhos NMRI, com 18 a 20 g de peso, foi inoculado com 0.3 ml de cada uma destas vacinas experimentais inactivadas no dia 0 e no dia 28 por injecção subcutânea. 2 e 4 semanas após a inoculação e também 1 a 2 semanas após a revacinação, foi colhido o sangue dos animais para determinar o título de anticorpos de neutralização contra A/PR/8/34. Para determinar a taxa de protecção, os ratinhos foram expostos 2 semanas após a revacinação (6 semanas após o início da experiência) através da administração intranasal de 1000 LD5o (50% da dose letal) . Os resultados da experiência estão compilados na Tabela IX. 24

Tabela IX

Eficácia de vacinas experimentais: para a vacina A os virus influenza A/PR/8/34 foram replicados a 37°C e para a vacina B a 33°C. 0 titulo de anticorpos de neutralização contra A/PR/8 e também a taxa de protecção após a exposição dos ratinhos foram investigados

Titulo de anticorpos de neutralização/ml* Número de vivos da Taxa de protecção/Total 2 s pvac 4 s pvac 1 s prevac 2 s prevac Vacina A <28 56 676 1, 620 1/10 Vacina B 112 1,549 44,670 112,200 9/10 * Semanas após a vacinação (s pvac) e semanas após a revacinação (s prevac)

As experiências confirmam que os virus influenza que foram replicados a 37°C na cultura celular com um elevado rendimento de antigénio (titulo HA) apenas induzem um baixo titulo de anticorpo de neutralização no ratinho e fornece uma protecção escassa, enquanto os virus influenza que foram replicados a 33°C na cultura celular também com um elevado rendimento de antigénio (titulo HA) induzem um elevado titulo de anticorpo de neutralização no ratinho e fornece uma boa protecção.

Lisboa, 21 de Dezembro de 2010 25

Claims

REIVINDICAÇÕES 1- A linha celular MDCK 33016, DSM ACC2219.
2- Um processo para a produção de uma vacina de vírus influenza, que compreende: (i) a proliferação das células num meio livre de soro em suspensão; (ii) a infecção das células com vírus influenza; (iii) pouco tempo antes da infecção, simultaneamente com a infecção ou pouco tempo após a infecção, a adição à suspensão de células de uma protease para clivar a proteína precursora da hemaglutinina [HAD]; (iv) após uma outra fase de cultura, o isolamento dos vírus influenza replicados nas células; e (v) a formulação de vírus influenza isolados para dar uma vacina para administração a seres humanos ou animais; Caracterizado por as células poderem ser infectadas por virus influenza e terem sido seleccionadas partindo de células MDCK que estão adaptadas para crescimento em suspensão em meio livre de soro.
3- O processo, de acordo a reivindicação N°.2, caracterizado por a cultura das células ter lugar num sistema de perfusão ou num processo descontínuo (batch).
4- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 ou N°.3, caracterizado por o pH do meio de cultura no passo (i) estar no intervalo de 6.6 a 7.8.
5- O processo, de acordo com a reivindicação N°.4, caracterizado por o pH do meio de cultura estar no intervalo de 6.8 a 7.3.
6- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.5, caracterizado por a infecção com vírus influenza ser realizada quando a cultura celular tiver alcançado uma densidade celular de cerca de 8 a 25 x 105 1 células/ml (processo em batch) ou cerca de 5 a 20 x 106 células/ml (processo de perfusão).
7- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.6, caracterizado por a infecção das células com virus influenza ser realizada a uma m.o.i. (multiplicidade de infecção) de cerca de 0.001 a 10.
8- O processo, de acordo com a reivindicação N°.7, caracterizado por a infecção ser realizada a uma m.o.i. de cerca de 0.002 a 0.5.
9- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.8, caracterizado por a protease ser uma protease de serina.
10- O processo, de acordo com a reivindicação N°.9, caracterizado por a protease de serina ser tripsina.
11- O processo, de acordo com a reivindicação N°.10, caracterizado por a tripsina ser adicionada numa concentração final no meio de cultura entre 1 e 200 μς/ιηΐ.
12- O processo, de acordo com a reivindicação N°.ll, caracterizado por a concentração final de tripsina no meio de cultura estar no intervalo de 5 a 50 μς/ιηΐ.
13- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.12, caracterizado por as células infectadas estarem em cultura durante 2 a 10 dias.
14- O processo, de acordo com a reivindicação N°.13, caracterizado por as células infectadas estarem em cultura durante 3 a 7 dias.
15- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.14, caracterizado por as células infectadas estarem em cultura entre 30°C e 36°C.
16- O processo, de acordo com a reivindicação N°.15, caracterizado por as células infectadas estarem em cultura entre 32°C e 34°C. 2 17- 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.16, caracterizado por a recolha e isolamento dos vírus replicados ser realizado 2 a 10 dias após a infecção.
18- O processo, de acordo com a reivindicação N°.17, caracterizado por a recolha e isolamento dos vírus replicados ser realizado 3 a 7 dias após a infecção.
19- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.18, caracterizado por as células serem da linha celular MDCK 33016, DSM ACC2219.
20- O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.2 a N°.19, caracterizado por a vacina conter um adjuvante.
21- O processo, de acordo com a reivindicação N°.20, caracterizado por a vacina conter partículas de vírus intactas, vírus inactivados, ou proteínas isoladas dos vírus. Lisboa, 21 de Dezembro de 2010 3