PT91294B

PT91294B - Processo para a preparacao de construtos de antigenes a partir de antigenes da classe i de "complexo de histocompatibilidade principal" com moleculas de suporte especificas e de composicoes farmaceuticas que os comtem

Info

Publication number: PT91294B
Application number: PT91294A
Authority: PT
Inventors: Klaus Bosslet; Gerhard Seemann; Hans Harald Sedlacek
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1988-07-28
Filing date: 1989-07-27
Publication date: 1995-03-01
Also published as: JP2812726B2; FI893575L; EP0352761B1; AU625065B2; DK371089A; ES2080055T3; FI893575A0; FI100973B; DE58909458D1; EP0352761A3; KR910003098A; DE3825615A1; PT91294A; EP0352761A2; US6548067B1; GR3017915T3; ATE128732T1; AU3900589A; US20040091488A1; KR970010760B1

Description

Descrição /

A presente invenção refere-se a construtos de antigenes que resultam do acoplamento de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) da classe I com moléculas de suporte específicas.

As reacçOes de rejeição dos tecidos são as reacçOes imunes provocadas por células T mais fortes que são conhecidas. Em indivíduos da mesma espécie, elas são provocadas por diferenças alogénicas dos antigenes MHC da classe I e da classe II.

Nas transplantações de órgãos, por exemplo os determinantes alogénicos eventualmente existentes dos antigenes MHC do tecido dador são reconhecidos pelas células T

I

BAD ORIGINAL alo-específicas do receptor como estranhas, é provocada uma resposta imune por células T e obtém-se a reacção de rejeição desde que não se utilize uma terapia imuno-supressora ou esta não seja suficiente.

Sabe-se ainda que os antigenes da classe I de ÍiHC são glicoproteínas que se manifestam na superfície de todas as células que contêm núcleo. Elas consistem numa cadeia pesada que é codificada pelos genes da classe I de KHC e por uma cadeia leve, a B^-niicroglobulina que está associada não covalentemente com a cadeia pesada.

A parte extracelular das cadeias pesadas está dobrada em três domínios, dos quais os dois primeiros domínios (alfa-^ e alfa2) em comparação com as sequências de aminoácidos até agora conhecidas os antigenes de KHC da cias se I de diferentes indivíduos apresentam um polimorfismo marcado. Eles servem para a apresentação dos antigenes e pos suem os determinantes alogénicos. 0 terceiro domínio extracelular possui uma -sequência conservante. A associação com microglohulina essencial para uma correcta dobragem da cadeia pesada e para o transporte da molécula para a superfí cie das células.

isolamento e a caracterização de antigenes da classe I de KHC mutados mostrou que, para a provocação de uma reacção de rejeição, já bastam pequenas diferenças de aminoácidos nos domínios de alfa^ e alfa2 entre o doa dor e o receptor (Nathenson e col., Ann. Rev. Immunol.,

1986, 4, 471 - 502).

Kesmo em seres humanos, verificou-se que pequenas diferenças entre o doador e o receptor originam a rejeição de um transplante (J, Dausset, E. T. Rapaport, 1. legrand, J. Colombani e A. Marcelli-Barge: Skin allograft

survival in 238 human subjects: Role of specific relationshi ps at the four gene sites of the first and the second HL-A loci, Histocompatibility Testing (1970), páginas 381 - 397, Terasaki Ρ. I. (ed.). Do que se disse anteriormente, chega-se à conclusão de que, para utilizar a indutibilidade específica e a intensidade da resposta imune das células na reac ção de transplantação de tecidos é possível para perturbar ou destruir as células pretendidas.

A Requerente descobriu que se podem acoplar suportes específicos das células pretendidas, por exemplo de preferência, anticorpos monoclonais (mAK), mas também anticorpos policlonais ou em moléculas que se ligam a receptores existentes nas células na extremidade terminal N ou C de uma mlécula da classe I de MHC alogénico sem que se alterem prejudicialmente os determinantes alogénicos.

Com o auxílio deste suporte específico da célula pretendida, a molécula da classe I de MHC é trazida especificamente para as células pretendidas, o que irigina a activação de células T alo-específicas e, por consequência, há a destruição daé células pretendidas por células T citotóxicas alo-específicas.

Um esclarecimento para a razão do acoplamento de um suporte específico da célula pretendida na extre midade terminal N ou C de uma molécula da classe I de MHC com obtenção dos determinantes alogénicos baseia-se no facto de que a extremidade terminal N da molécula da classe I da MHC fique no lado pretendido para a célula dos domínios alfa 1 ^e alfa₂, enquanto os determinantes alogénicos se encontram sobre o lado voltado para a célula dos domínios alfa^ e alfa₂ (Figura 1, Figura 34).

Por causa do grande polimorfismo dos antigenes na classe I de MHC existente na população humana, con- 3 -

segue-se provocar uma reacção de rejeição com o auxílio de apenas duas moléculas da classe 1 de MHC diferentes escolhidas, por exemplo, HLA B27w e HLA B27k, em cerca de 100% da população. HLA B27w e HLA B27k são dois subtipos definidos por T-linfócitos citotóxicos da especificidade serológica definida HLA B27. Na população caucasóide, cerca de 7% dos indivíduos possuem HLA B27w e cerca de 1% possui HLA B27k.

Bela utilização, por exemplo, dos dois subtipos de HLA B27 para a alogeneização correspondente à presente invenção, pode tratar-se quase 100% da população caucasóide. Ho entanto, de acordo com a presente invenção, pode acoplar-se cada um dos antigenes da classe I de MHC ao suporte específico pretendido se o acima mencionado antigene do doador que interessa não origine a activação de células T alo-específicas e o subsequente prejuízo, por exemplo, a des truição das células pretendidas.

Como células alvo no organismo, pode não só tratar-se de células não pretendidas e/ou de células que provocam doenças, como, por exemplo, células de tumores. Os 1 construtos de antigenes de acordo com a presente invenção são, por consequência, apropriados para a terapia de tumores Lio entanto, também outras doenças, que são provocadas por células ou pelos seus produtos e são influenciadas favoravel mente por eliminação destas células, podem ser submetidas a terapia com os construtos de antigenes da classe I de MHC de acordo com a presente invenção.

A maneira de actuação das moléculas híbridas descritas nos grupos de exemplos I e II baseia-se no facto de estas poderem ligar-se a um antigene que existe nas células por causa da espeficididade do componente dos anticorpos. Devido a parte de HLA B27 da molécula de fusão, a superfície das células pretendidas é mascarada com uma molécula alogénica da classe I de MHC. Estas moléculas alogéni4

cas da classe I podem então ser reconhecidas por células T citotóxicas alo-específicas, o que origina a destruição dás células pretendidas pelas células T citotoxidas alo-especificas.

A presente invenção refere-se, por consequência a

a) antigenes da classe I de MHC que são acoplados no ter minai Ti ou C com suportes específicos, em que o acoplamento, de preferência, se realiza covalentemente, mas também não covalentemente, por exemplo, por ponte s de biotina-avidina e em que suportes específicos se ligam selectivamente ãs células alvo, elas constituem de preferência, não só anticorpos monoclonais mas tam bém policlonais, no entanto, são moléculas completamente gerais que ligam o receptor que ligam aos respectivos receptores da célula;

b) processo para a preparação dos construtos de antigenes da classe I de MHC e ♦

c) utilização dos construtos de antigenes da classe I de MHC mencionados em a) e em bj para a destruição ou eliminação de células pretendidas.

A invenção é ainda descrita nos seguintes

Exemplos e nas reivindicações da patente, mas em que não se limita a esses exemplos.

Os Exemplos 1-17 que se descrevem seguidamente referem-se a um construto de acordo com a presente invenção obtido a partir de wA2£ B/l—8 Vjj—Gen (1) de rato específico ao nitrofenol (NP), a um IgG C-P (ab’)₂ Gen (2) humano e a um gene H1A B27w (3). (1) e (2) são, por exemplo, previstos para a parte do suporte específica - neste caso,

- 5 mAK contra NP - enquanto (3) é antigene da classe I ELA.

construto acima mencionado é expresso depois da correspondente transformação de tais células de mieloma e seu seccionamento, os quais contém uma microglobulina Humana e uma cadeia leve de uma imunoglobulina, cujo gene V forma com B/l-8 um sítio de ligação NP, como, por exemplo, as células de mieloma de rato J 558 1 (V. T.

Oi, S. L. Morrison, L. A. Herzenberg e P. Berg : Immunoglobulin gene expression in transformed lymphoid cells, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 825, 1983). Por troca do gene da cadeia pesada e utilização de uma correspondente cadeia leve, pode dotar-se o produto de fusão mAK/HLA B27w com qual, quer especificidade pretendida, para um mAE específico ou selectivo.

EXEMPLOS

I Os Exemplos 1 a 13 referem-se à construção de um gene de fusão HUy B27/MAK com o componente HLA B27 na extremidade 3' do anticorpo monoclonal.

A) Preparação do componente mAK C-Gen (IgG^ C-Gen).

Exemplo 1

Isolou-se um IgG^ C-gen humano de um banco de genes humanos em fagos EMBL3 (A.-H. Frischauf, H. Lehrach, A. Proustka, N. Murray : Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol. 170, 827 - 842 (1983) e G. Η. A. Seemann, R. S. Rein, C. S. Brown, H. L. Ploegh : Gene conversion-like mechanisms may generate polymorphism in human class I genes. The EKBO Journal 5, 547 -

552 (1986)) e são subclobados no vector de plasmídio pUC19 como fragmento de HindIII/Sphl com 3,1 kb de tamanho (Clone 54.1.24) (Figura 2).

Todas as técnicas utilizadas neste Exemple e nos Exemplos seguintes, quando não se indica outra coisa, são retiradas de T. Maniatis, E. F. Fritsch, H. Lehrach e A.-M. Frischauf, Laboratory Manual EMBL (1982), Heidelberg; J. Sambrook : Molecular Cloning : A laboratory manual (1982) Cold Spring Harbour Laboratory.

Exemplo 2 clone 54.1.24 foi submetido a uma diges tão de restrição completa com HindIII e parcial com PstI.

Assim, obtêm-se, entre outros fragmentos de restrição, o exão Cu. e um, dois-ou três exOes hinge. Estes fragmentos riJ_ foram separados com gel de agarose e clonados num vector pUC19 cortado com HindIII e PstI (Figura 3).

k) clone do plasmídio com o C_H1 e três exbes de articulação (F(ab’)2 3H) foi em seguida separado com BamHI e Asp718, os sítios de corte foram preenchidos e religados com ligase (Figura 4). Assim, o poligador pUC19 é suprimido entre os pontos de corte de Xbal e SstI.

I B) Preparação do Gene HLA B27

Exemplo 3

Isolou-se um gene HLA B27w de um banco de genes genómico clonado em bacteriofagos EMBL3 (A.-M. Frischauf, a. a. 0. e G. H. A. Seemann, a. a. 0) e caracterizou-se por formação do mapa de restrição e por análise da se- 7 -

quência de nuleótidos (A. Maxan, V/. Gilbert ; Sequencing and labeled DNA with base specific Chemical cleavage. Meth. Enzymol: 6 5, 499 - 560 (1986) e F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson : DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5465 - 5467i (1977)) (Figura 5).

gene HLA B27w foi em seguida digerido com as enzimas de restrição SstI e Bglll e subclonado nos sítios de corte SstI e BamHI de pUC19. Isolaram-se clones de plasmídio com os subfragmentos A, B, C (Figura 5).

Exemplo 4

Separou-se completamente o plasmídio com o subfragmento A com SstI e parcialmente com Smal e, depois da separação num gel de agarose, clonou-se o fragmento A' (Figura 6) num plasmídio pUC19 separado cd>m HindII e SstI.

I

Exemplo 5 7

Digeriu-se o plasmídio com o subfragmento B com xbal e clonou-se o inserto xbal assim (B¹) num plasmídio pUC19 cortado com xbal (Figura 7)Exemplo 6 plasmídio com o subfragmento C foi cortado completamente com HindIII e parcialmente com SstI e isolou-se o fragmento que se segue ao fragmento A no gene HDA B27w (C') depois da separação com gel de agarose e clonou-se no vector de plasmídio KS+ com o Bluescripto separade com HindIII e SstI (Stratagene, Dajolla, CA, Estados Unidos da América) (Figura 8)

t

Exemplo 7

Preparam-se fagos de cadeia única de KS + vector plasmídio 0' por infecção com fagos auxiliares VCS-K13 (Stratagene, Número de Catálogo 200251) e purificou-se (Stratagene : Bluescript Exo/nung DNA sistema de sequenciamento : Manual de InstruçOes). Com estas cadeias individuais hibrizou-se um oligonucleótido sintético (I = 5'CCTTACCTCATCTCAGG3') e sintetizou-se a parte restante da segunda cadeis com o auxílio de polimerase de Klenow. Depois da transformação do plasmídio de cadeia dupla produzido desta maneira na bactérias XL-Blue, produziram-se pelos clones de plasmídios assim obtidos de novo por infecção com fagos de cadeia única auxiliares e determinoQ-se com o auxílio de um primário de oligonucleótido II (5'TGAGGGCTCCTGCTT3') a sequência de nucleótidos (E; Sanger e col., a. a. 0.). Eez-se a mutação de um clone em que o codão TGG (aminoácido 274) na extremidade 3' do exão alfa^ foi mudado no codão de interrupção (TGA), foi identificado (Ç^h) (Figura 9).

Exemplo 8

Partiu-se 0 plasmídio com 0 fragmento A¹com SstI e ligou-se 0 fragmento C isolado depois da separação sobre um gel de agarose e produzido com ele por meio de uma eliminação completa com HindIII e parcial com SstI do clone de plasmídio 0. Depois da ligação durante trinta minu tos a 14° C, preencheram-se as extremidades não ligadas com T4 polimerase e, em seguida, ligou-se mais uma vez. Por restabelecimento do mapa de restrição, identificou-se 0 plasmídio D (Figura 10), no qual o fragmento A' está ligado com o fragmento C através do sítio de corte SstI no exão alfa₂·

BAD ORIGINAL

Exemplo 9

Eoi separado com xbal o plasmídio com o fragmento B’ que foi cortado com xbal a partir do plasmídio B' e purificou-se depois da separação num gel de agarose (Eigura 11). Com o auxílio da análise de sequência de nucleó tidos (17), identificou-se um plasmídio (E) , no qual o fragmento B' está ligado na orientação 5' - 3' correcta no fragmento D.

C) Fusão do Gene HLA B27w Modificado com o Fragmento do

Gene IgG3 C F (ab')₂ 3H

Exemplo 10 fragmento E foi cortado por uma eliminação com EcoRI e HindIII a partir do plasmídio E, as extremidades foram preenchidas com polimerase e depois da separação purificou-se^ com um gel de agarose. Este fragmento E assim purificado foi depois ligado com o plasmídio que contém o fragmento IgG3 F(ab')₂ 3H, depois do que se separa este com xbal e as extremidades xbal foram preenchidas com polimerase (Figura 12). For estabelecimento do mapa por restrição, foi identificado o clone que continha o plasmídio F, no qual o gene HLA B27w modificado está fusionado com o gene F(ab')₂ 3H na orientação 5' - 3’ correcta.

Exemplo 11

Cortou-se o fragmento F com HindIII e EcoRI para se colocar um poliligador antes da extremidade 5' do . fragmento F. As extremidades HindIII e xbal foram preenchi10

das com polimerase e cloradas num pUC19, separadas com SstI e as suas extremidades SstI foram preenchidas com 1^ polimerase. Por análise de restrição, identificou-se o clone com o plasmídio G que possui na extremidade 5' do fragmento P o poliligador pUC19 (figura 13).

Exemplo 12

Separou-se o plasmídio G com HindIII e ScorI, isolou-se o inserto com o gene de fusão IgG Fíab’^ HLA B27w e clonou-se num Bluescripto separado com HindIII e EcoRI vector do plasmídio KS+ (Stratagene : Bluescript Exo/ Nung DBA sequencing system : Instruction Manuel) (Figura 14),

Ex enrolo 15

G plasmídio H cus resulta desta clonação foi em seguida separado com BamHI e clonou-se o inserto no vector de expressão eucariótico cortado com BamHI pBV^ (T. Simon, K. Raj evskv / Nucl. Acids Res. 16 , 354 (.1988)), o qual continha as sequências promotoras/reforçadoras IgG H e o gene VH que deriva de mAK B/l-3 de rato específica a NP (Figura 15) (N. N. Neuberger : EMBO Journal 2., 1375 - 1378 (.1983)

Por análise de restrição, identificou-se o plasmídio I, em que o gene de fusão IgG 3 F(ab')_? H1A B27w está clonado com orientação 5' - 3' correcta oor detrás do gene Vrr.

JlÍ gene de fusão mAK/HLA B27w possui agora as extremidades 5' e 3' intactas com todos os sinais necessá rios para a expressão em células eucarióticas. 0 construto é. como se disse já atrás, expresso em cada célula de mieloma e cortado, que contém uma I^-microglobulina humana e uma cadei a leve de uma imunoglobulina, cujo gene V com V_H 3/1-8 forma um sítio de ligação NP, por exemplo, a célula de mieloma de BAD ORIGINAL^

rato J 558L (V. T. Oi, S. 1. Morrison, L. A. Herzenberg, P. Berg, Proc. Bati. Acad. bei. USA 80, 825 (1985)).

II Os Exemplos 14 a 17 referem-se à construção de um gene de fusão HLA B27/KAK com o componente HLA B27 na extremidade 5' do anticorpo monoclonal.

A) Preparação do Gene HLA B27

Ex em.pl o 14

Isoluo-se um gene HLA B27w de um oanco de genes genómicos clonado em bacteriófagos col., a. a. 0. e g. Η. A. Seemann, a. a. -se por formação do mapa de restrição e quência de nucleótidos (Kaxam e col., a. col., a. a. 0.) (Figura 5).

EK BL 5 (Eri s ch au f e 0.) e caracterisoupor análise de sea. 0.) e (Sanger e gene HLA B27w foi digerido em seguida com as enzimas de ^restrição SstI e BglII e subclonou-se nos sítios de corte SstI e BamHI de pUCl9. Isoloram-se os clones de plasmídio com os subfragmentos A, B e C (Figura 5).

plasmídio com o subclone C, HLA B27, foi separado parcialmente com PstI. Com polimerase, foram eliminados os sítios de corte PstI que se suspendiam da extremidade 5' com adição de dGTP e religaram-se com T^ ligase. Por análise de restrição, identificou-se o clone de plasmídio CL, que não contém sítios de corte PstI no intrão entre o exão alfa₂ e alfa^ (Figura 16J.

clone de plasmídio CL foi parcialmente separado com SstI e completamente com Hindlll, isolou-se o fragmento Cl' e clonou-se num vector Ml5 mpl8 de cadeia dur

BAD ORIGINAL

- 12 - ittA)».'»—,'.· ... -y- - J pia separado com SstI e HindIII. 0 clone Ml 3 Cl' com o fragmento Cl' foi identificado por determinação da sequência dos ácidos nucleicos do inserto (Figura 17).

Do fago Cl' Ml3 mpl8 isolaram-se os fagos de cadeia única da estirpe de bactérias CJ236 de acordo com o protocolo do estojo de mutagénese Bio-Rad Muta-Gene M13, que continham uracilos. Nestes fagos de cadeia única, hibrizou-se um oligonucleótido (oligonucleótido III) com a sequência 5'GCGCGCTGGAGCGTCTC3' e, com a adição de polimerase, dNTP e ligase, sintetizou-se a segunda cadeia.

Depois da infecção da estirpe de bactérias MV1190, identificou-se 0 clone C2 mudado por análise de restrição dos ADN de dupla cadeia M13 mpl8 e trataram-se por análise de sequência de ácido nucleico (Figura 18). Pela mutagénese, destruiram-se os sítios de restrição de corte com PstI no exão alfa2 sem alterar o rasto de leitura ou a sequência de aminoàcidos codificada.

Pelo clone C2 M13, foram produzidos de novo fagos de cadeia ú^ica da estirpe de bactérias CJ236 e hibridizou-se com 0 oligonucleótido IV (oligonucleótido IV =

5'GGGGACGGTGGAATTCGAAGACGGCTC3')· Em seguida, sintetizou-se a segunda cadeia com polimerase, ligase e dNTP. Depois da transformação em bactérias MV1190, identificou-se o clone C2’ Ml3 mpl8 por análise de restrição e verificou-se que se tratava da mutação correcta por análise das sequências de nucleótidos (Figura 19). Por meio desta mutagénese, introduzui-se no exão TM do gene H1A B27 um sítio de corte com EcoRI e com AsuII e modificou-se 0 aminoàcido 279 de glutamina para asparagina (Figura 20).

Exemplo 15

Sí ssa

Digeriu-se o clone do plasmídio com o subfragmento B com Xbal e clonou-se o inserto de Xbal (B¹) assim obtido num plasmídio pUCl9 separado com Xbal (Figura 7).

clone de plasmídio com o fragmento A foi completamente separado com HindII e parcialmente com Smal e religou-se. Por análise de restrição, identificou-se o clone A', no qual uma parte do poliligador de puC19 é apagada (.Figura 21).

U clone do plasmídio A' foi parcialmente separado com sstl e ligado com um fragmento C2 produzido poi separação com Sstl do clone do plasmídio G2 e isolado depois da separação num gel de agarose. Por caracterização de restrição, identificou-se o plasmídio (Figura 22), no cual o fragmento a está ligado com o fragmento C2 por intermédio do local de corte Sstl no exão alfa2. A extremidade 5' do gene HLA B27vr é, por consequência, completa.

Construção do Bigador f

Sintetizaram-se dois oligonucleótidos :

oligonucleótido Va :

5’ TCGAATTCCG GCGAGGCAGC TCCCGGCAGCT GCáCCCGCAG CAGCCGCAGC AGGCGGl-CAG GTCCAACTGC AGGA 7' oligonucleótido Vb :

5' TCCTGCAGTT GGACCTGCCC GCCTGCTGCG GCTGCTGCGC GTGCAGCTGC GGGAGCTC-CC TCGCCGGAAT TCGA 3'.

Os dois oligonucleótidos são hibrizados um com o outro. Obtêm-se dessa forma fragmentos de ABN de cadei

BAD ORIGINAL

a dupla coe ua sítio de corte de restrição com EcoRI numa das extremidades e com um sítio de corte de restrição com Pstl na outra extremidade. Estes fragmentos foram separados com EcoRI e Pstl e clonados num vector de plasmídio pUC19 separado com EcoRI e Pstl (Figura 23)· 0 clone de plasmídio

I foi identificado por análise de restrição e verificado por análise de sequência de nucleótidos.

gene de imunoglobulina V foi sintetizado por Ρ. T. Jones e col. (Ρ. T. Jones, ?.· H. Pear, J. Foote,

M. S. Neuberger, G. Winter - Nature 321 : 522 (1986)) com o auxílio de oligonucleótidos. Obtém-se um sítio de restrição com Pstl na zona 5' do clone e é clonado como o fragmento Hindi ΙΙ/BamHI num vector ΙΊ13 mpS, cujos pontos de corte com Pstl foram destruídos por separação, eliminação das extremidades salientes e religação (Pigura 24).

II 3) Preparação da Parte do Gene mAN C

Exemolo 16 i' /

Isolou-se um gene C de IgG3 a partir de um banco de genes humano em fagos EK313 (Frischauf e col., a. a 0. e oeemann e col., a. a. 0.) e subclonou-se como fragmento com o tamanho de 3,1 Kb de HindIII/Sphl no vector de plasmídio pUC19 (clone 54.1.24) (Figura 2).

clone do plasmídio 54.1.24 foi separado com HindII e AispVlS, eliminaram-se as extremidades salientes do ponto de corte de Asp713 com polimerase e religaram-se com ligase. Por análise de restrição e determinação da sequência de ácidos nucleicos, identificou-se 0 clone 54.1.24 Delta Pol, que, além de Sphl, Pstl, Sstl e EcoRI, não con tém nenhuma sítios de cortrè de restrição 3' do gene C de IgC-3 humano (Figura 25).

BAD ORIGINAL ;

Cl·

clone de plasmídio 54.1.24 Delta Pol foi digerido com Bgl2 e Sphl. As extremidades salientes foram eliminadas com polimerase e religadas com ligase. Por análise de restrição e determinação da sequência dos ácidos nucleicos, identificou-se o clone I, que contém ainda o exão do gene C IgG 3 humano (Figura 26;.

clone de plasmídio I foi separado com Psti e as extremidades salientes eliminadas com polímeras Nas extremidades lisas assim obtidas, ligou-se o inserto Β’, cortado com Xbal e preenchido com polimerase, com obtenção de extremidades lisas. Por análise de restrição e determinação da sequência de ácidos nucleicos, identificou-se o clone K (Figura 27) que contém um exão humano IgG3 Cg-, e uma extremidade 3' de um gene da classe I de H1A.

clone de plasmídio K foi separado com HindIII e EcoRI, as extremidades salientes eliminadas e ligou-se o inserto no plasmídio puC19 cortado com Sstl, cujas extremidades foram tornadas igualmente lisas. Identificou-se o clone L, que contém o poliligador do vector 5' de pUC19 do exão Cgl (Figura 28;

clone de plasmídio 1 foi separado com BcoRI e HindIII, o inserto purificado e ligado no vector Kfí' cortado com HindIII e EcoRI (Stratagene : Bluescript Exo/I-iung DNA Sequencing System;, cujos sítios de corte com Psti foram previamente destruídos por eliminação com Psti, tratamento com I’ polimerase e religação. Identificou-se o clone M a partir do qual se pode cortar o exão humano CL·-, com as extremidades 3' da classe I HLA por eliminação com BamHI (Figura 29;.

Exemplo 17

RAD ORiGíNAL

A partir do clone V M13 mp8, preparou-se ADN de cadeia dupla e separou-se com EamHI. Separou-se o clone M K3 ⁺ com BamHI e purificou-se o inserto K. Ligou-se o fragmento I-I no clone V separado com BamHI e identificou-se o clone N com auxílio da determinação da sequência dos ácidos nucleicos de M13, θ qual contém um gene de IgG3 intacto (Figura 30)·

A partir do clone K13, preparou-se ADN de cadeia dupla, separou-se com ScoRI e reuniu-se o inserto. 0 clone de plasmídio D-^ foi separado com EcoRI e ligado com o fragmento N. Isolou-se o clone fago 0, no qual o fragmento N está clonado no clone D^ na orientação correcta (Figura 31) · clone de plasmídio 0 foi submetido a uma eliminação completa com PstI e com eliminação parni a1 com EcoRI e ligou-se com o fragmento do ligador cortado do vector de plasmídio L com EcoRI e PstI. 0 clone de plasmídio P contém o gene da fusão completo HLA B27w m.AK (Figura 32, Figura 33). Este gene de fusão pode ser expresso em células humanas sozinho, oíi células de rato em conjunto com o gene de microglobulina beta₂ e seccionado, se também existir uma cadeia pequena de imunoglobulina nas células de expressão.

Legenda da Figura 1

Alfal, alfa2 e alfa3 significam os domínios da cadeia de antigenes de MHC da classe I. As setas mostram, nas hélices alfa, as que possuem alo-determinantes. CM deve significar a membrana da célula, C a célula.

Legenda da Figura 2 e Seguintes

EcoRI, etc, significa a separação com a

- 17 respectiva endonuclease de restrição ou o correspondente sí tio de corte. BamHI/Asp7l8 significa um sítio de restrição destruído por religação depois do enchimento.

TK significa região de trans-membrana.

5'NT significa 5'-não transladado.

IgH p/E significa cadeia comprida de imunoglobulina-promotor/reforçador.

x significa digestão incompleta.

DS-DNA significa : ADN de cadeia dupla.

SS-DNA significa : ADN de cadeia simples.

legenda da Figura 54

s. CTL significa ; linfócito T citotóxico singenético.

TcR significa : receptor de célula T.

a.MHC classe I significa ; antigene da classe I de MHC alogénico.

t. a.a. significa : antigene associado com um tumor.

s.t.c. significa ; célula de tumor singénica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

ÍB

Processo para a preparação de construção de antigenes a partir de antigenes da Classe I de Complexo de Histocompatibilidade Principal (Major Histoconipatibility Complex = MHC) e moléculas de suporte específicas, caracterizado pelo facto de se fusionarem as partes dos genes necessárias sob a forma do seu DNA, se dotarem com as sequên cias de regulação apropriadas e se exprimirem em sistemas de expressão apropriados.

- 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se ligarem as partes dos genes necessárias na extremidade 3' do gene da Classe I de MHC.

- 3® Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se ligarem as partes dos genes necessárias na extremidade 5' do gene da Classe I de MHC.

_ 4ê processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se acoplar respectivamente um antigene da Classe I de MHC com uma molécula de suporte específica.

- 5§ Processo para a preparação de construtos de antigenes a partir de antigenes da Classe I de MHC e de moléculas de suporte específicas, caracterizado pelo facto de os componentes dos construtos serem acoplados por meio de ligações não covalentes.

_ 6® Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o acoplamento se realizar por intermédio de uma ponte de avidina-biotina.

- Ί* Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo facto de, como moléculas de suporte específicas, se empregarem domínios CB4.

- 86 Processo'de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo facto de, como moléculas de suporte específicas, se empregarem anticorpos monoclonais .

_ Qa _

Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de se empregar o gene ou a molécula HLA B27w ou HLA B27k.

- 10ô Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de os anticorpos monoclonais empregados serem encurtados na parte constante da cadeia pesada.

f - 11ê Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar pelo menos um construto de antigene, quando preparado de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 com as substâncias veiculares correntes.