PT92920B

PT92920B - Metodo para a producao de uma molecula soluvel relacionada mas distinta de icam-1

Info

Publication number: PT92920B
Application number: PT92920A
Authority: PT
Inventors: Alan Mcclelland; Jeffrey Greve
Original assignee: Molecular Therapeutics Inc
Priority date: 1989-01-24
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1995-12-29
Also published as: NZ232203A; FI900331A0; KR900011895A; IL93119A; IE900257L; KR100202435B1; AU4876790A; NO900155D0; IE74144B1; DK0379904T3; PT92920A; EP0379904A1; GR3020481T3; NO900155L; DE69026844D1; ATE137799T1; EP0379904B1; DE69026844T2; JP3080631B2; ES2087091T3

Description

FUNPAMENTO DO INVENTO

O presente Invento estâ relacionado com uma forma solúvel da molécula de adesão intercelular (sICAM-1) assim como com a sequência de DNA codificadora de sICAM-1. sICAM-1 e ICAM-1 são substancialmente semelhantes por partilharem os primeiros 442 aminoácidos NF^-terminais do domínio extracelular. No entanto, sICAM-1 difere de ICAM-1 no extremo C e estas alterações conferem solubilidade a sICAM-1. Sabe-se que ICAM-1 medeia a adesão de muitos tipos celulares, incluindo células endoteliais, a linfôcitos que expressam o antigénio-1 associado à função dos linfócitos (LFA-1). ICAM-1 tem a propriedade de se ligar directamente a LFA-1. Existe também evidência de que LFA-1 medeia adesão que não é via ICAM-1. Em adição, ICAM-1 tem capacidade para se ligar a LFA-1 e a rinovírus humano. Ele possui a propriedade de inibir a infecção dos vírus rinovírus e Coxsackie A. Ela pode ser usada para antagonizar a adesão de células mediada por ligação a ICAM-1 incluindo ligação ICAM-l/LFA-1 e torna-se assim útil no tratamento de inflamação, rejeição de enxertos, tumores que expressam LFA-1 e outros processos envolvendo a desão de células. Com base na semelhança substancial dos domínios extraceiu1 ares de ICAM-1 e sICAM-1, sICAM-1 tem propriedades identificadas para ICAM-1.

principal receptor de Rinovírus HUmano (HRR) foi transfectado, identificado, purificado e reconstituído como descrito nos Pedidos de Patentes U.S. copendentes No.262570 e 262428 entregues em 25 de Outubro de 1988. Demonstrou-se que este receptor é Idêntico a uma proteina da superfície celular prêviamente descrita, ICAM-1. 0 Pedido de Patente Europeia 0 289 949 descreve uma molécula de adesão celular associada a membranas (ICAM-1) que medeia a adesão de muitos tipos celulares incluindo células endoteliais a linfôcitos que contêm LFA-1. Este pedido de patente

-4proporciona uma discussão da presente investigação no campo das moléculas de adesão intercelulares. E iiportante notar que os inventores procuraram especificamente um mRNA com splicing alternativo para ICAM-1 e não identificaram um. ICAM-1 foi originalmente identificado com base no seu papel na adesão de leucócitos a células T (Roth 1 ei n , R. et a 1. ,

J. Immunol. 137:1270-1274( 1986 ) )a qual se demonstrou ser mediado pela ligação heterotípica de ICAM-1 a LFA-1 (Marlin et a I. , Ce 11 5J_:813-819 (1987)). A estrutura primária cfe ICAM-1 revelou que ela é homóloga das moléculas de adesão celular. Neural Cell Adhesion Molecule(molêcula de adesão de células neurais) (NCAM) e Myelein-Associated Glycoprotein (g1icoproteina associada a míelina) (MAG) e levou à hipótese de ser um membro da família de supergenes das imunoglobul inas (Simmons et al.,Nature 331:624-627(1988); Staunton et a 1., Cel 1 52: 925-933( 1988). A sequência de DNA dos clones de cDNA está descrita nos artigos atrás referenciados por Simmons et a 1. , e Staunton et a 1 . ,supra, a partir da qual pode ser deduzida a sequência de aminoácidos de ICAM-1. A molécula ICAM-1 tem uma região lidrofóbica típica que atravessa membranas contendo 24 aminoácidos e uma cauda citop1asmática curta contendo 28 aminoácidos. A ICAM-1 dos trabalhos anteriores é uma molécula insolúvel que é solubilizada a partir das membranas celulares por lise das células num detergente não iónico. A mistura de ICAM-1 solubilizada em detergente é então passada através do material da matrix de uma coluna e depois através de uma matrix de coluna consistindo em anticorpos monoclonais.

SUMARIO DO INVENTO

O presente invento proporciona uma espécie molecular de ICAM-1 endógena spliced de modo alter.

nativo designada sICAM-1 que apresenta uma sequência de mRNA alternativa e queé solúvel sem a adição de um detergente .

presente invento proporciona uma molécula de adesão interce1u1 ar,so1úve1 ,humana (sICAM-1) ou um seu derivado funcional, essencialmente livre de contaminantes naturais. sICAM-1 pode ser obtido a partir de células HeLa, HEI e suas células transfectantes primárias caracterizada por ser solúvel na ausência de detergentes não iónicos e por ser o produto de tradução definido por uma nova sequência de mRNA. Este produto natural de células humanas tem a vantagem de ser secretado a partir de células numa forma solúvel e por não ser imunogénico. 0 produto solúvel natural difere do produto insolúvel natural por o produto solúvel possuir uma nova sequência de 11 resíduos de aminoácidos no extremo C e não possuir os domínios que atravessam a membrana e citoplásmico presente na forma insolúvel.

presente invento proporciona uma sequência de DNA isolada e purificada codificadora de sEAM-1 assim como uma célula hospedeira codificadora da referida sequênc i a.

presente invento proporciona um método de recuperação da molécula de adesão intercelular solúvel na forma súbstancialmente pura compreendendo os passos de:

(a) remoção do sobrenadante de células não lisadas (b) introdução do sobrenadante numa matrix de afinidade contendo anticorpo imobilizado capaz de se ligar a

SICAM-1 , (c) ligação do referido sICAM-1 ao referido anticor) po da referida matrix, (d) lavagem da referida matrix para remover os contaminantes não ligados e (e) recuperação da referida sCIAM-1 numa forma substancialmente pura por eluição da referida sICAM-1 a partir da referida matrix.

Posterior purificação poderá ser feita utilizando uma coluna de lectina de aglutinina de gérmen de trigo antes ou depois do passo da matrix de anticorpo. Outros passos de purificação poderão incluir cromatografia de fraccio namento por tamanho, cromatografia iónica e electroforese em gel. Pode ser ainda usada purificação por sedimentação através de gradientes de sacarose. 0 anticorpo capaz de se ligar a sICAM-1 poderá incluir anticorpos contra ICAM-i ou HRR.

presente invento inclui anticorpos policlonais contra sICAM-1.

presente invento inclui ainda um anticorpo especifico para síCAM-1, capaz de se ligar â molécula de sICAM-1 e que não é capaz de se ligar a ICAM-l.Para um método para a produção de um anti-soro contra peptideos ver Green et a 1. ,Cel 1 28: 477-487 ( 1982 ).

invento também inclui uma linha celular de hibridoma capaz de produzir tal anticorpo.

Este invento ainda inclui o uso terapêutico de anticorpos especificamente dirigidos contra sICAM-1, pEra aumentar a adesão de células mediada por ICAM-1 e LFA-1.

invento ainda inclui um método para a produção de um anticorpo que é capaz de se ligar a sICAM-1 e não a ICAM-1 caracter izendo-se pelos passos de (a) preparação de um conjugado peptideo-proteína, o referido conjugado peptideo-proteína esDecifico para pelo menos uma porção da sequência única de 11 aminoácidos presente em sICAM-1, (b) imunização de um animal com o referido conjugado peptideo-proteína, (c) administração de injecções de reforço e (d) obtenção de anti-soros.

Os anticorpos seriam capazes de se ligarem a sICAH-1 e incapazes de se ligarem a ICAM-1. 0 invento inclui a linha celular de hibridoma que produz um anticorpo da mesma especificidade, o anticorpo produzido pela linha celular de hibridoma e o método de produção.

invento ainda inclui um método de inibição da interação do antigénio associado â função de linfôcitos (LFA-1) e da molécula de adesão interce1u1 ar-1 (ICAM-1) compreendendo o passo de contacto das células contendo LFA-1 com sICAM-1 ou um seu derivado funcional. Este método de inibição da adesão de ICAM-1 tem aplicação em estados de doença tais como inflamação, rejeição de enxertos e para células tumorais expressando LFA-1.

-8Este invento ainda inclui um método de diagnóstico da presença e localização de uma célula tumoral que expresse LFA-1.

Este invento ainda inclui um método para reduzir substancialmente a infecção de rinovírus humanos do principal grupo de recptores compreendendo o passo do contacto do vírus com sICAM-1 ou um seu derivado funciona 1.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos e de aminoácidos de sICAM-1.

A Figura 2 é uma comparação das regiões C-terminais de sICAM-1 e ICAM-1. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos de ICAM-1 e sICAM-1 estão apresentadas começando no residuo de aminoácido 435. Os traços na sequência de sICAM-1 indicou nucleotídeos que faltam. As posições dos codões de paragem em ambas as proteínas estão indicadas por um asterisco.

A Figura 3 é uma comparação da estrutura de-sICAM-1 e ICAM-1. A região de ICAM-1 que atravessa a membrana está indicada pelo rectangulo a ponteado e o domínio citop1asmático pelo rectangulo a tracejado. 0 novo extremo C de s ICAM-1 está indicado pelo ractangulo a cheio.

Os cinco domínios previstos tendo homologia com imunoglobulina estão numerados I a V.

A Figura 4 mostra o gene ICAM-1 e a sua expressão em transfectantes HRR. A: transferência

Southern de DNA de HeLa (Faixa 1), LTK (Faixa 2) e HEl(Faixa3

-9cortado com EcoRI e despistado com o oligonucleotídeo ICAM-1 B: transferência Northern de RNA poli A+ de HeLa(Faixa 1), LKT“(Faixa 2) e HEI (Faixa 3) despistado com o oligonucleotideo ICAM-1; C: amnlificação PCR de cDNA preparado a partir de RNA poli A+ de HeLa (Faixa 1), LTK“ (Faixa 2) e HEI (Faixa 3). Os iniciadores usados foram das regiões codificadoras N-terminal e C-terminal de ICAM-1 tendo a sequência gga a11cATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC e ggaattcTCAGGGAGGCGTGG CTTGTGTGTT. No primeiro caso temos sequência de ICAM-1,no segundo caso adaptadores em sitios de restrição. Faixa 1 e 2 72 h de exposição, Faixa 3, 90 minutos de exposição.

A Figura 5 é um gel mostrando a detecção dos mRNAs de ICAM-1 e de sICAM-1 em células HeLa e HEI. A amplificação de PCR foi efectuada em 100 ng de cDNA de cadeia simples usando os iniciadores PCR 5-4. (CTTGAGGGC ACCTACCTCTGTCGG) e PCR 3.4 (AGTGATGATGACAATCTCATACCG). As extensões foram efectuadas a 72°C durante 25 ciclos e um décimo do produto foi analisado num gel de 1% de agarose/3% gel NuSieve. Faixa 1, cDNA de HeLa; faixa 2, cDNA de HEI; faixa 3, cDNA de LTK^-; faixa 4, testemunha fago com ICAM-1; faixa 5, testemunha fago com sICAM-1; faixa 6, testemunha fagos com ICAM-1 + sICAM-1. Os produtos de amplificação específicos de 105 pb e 86pb estão indicados pelas setas.

A Figura 5 é uma transferência Western mostrando a síntese de uma forma solúvel da proteina ICAM-1 por células HeLa e HEI. Este demonstra a existência de uma proteina no sobrenadante de cultura de células HeLa e HEI relacionada com ICAM-1 . Amostras equivalentes de lisados celulares e sobrenadantes de cultura foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulos e despistadas com um anti-soro policlonal de coelho contra ICAM-1

125 seguido de proteina A marcada com I; nos sobrenadantes de cultura de HeLa e HEI observa-se uma espécie proteica

-lO-

que migra perto da posição de ICAM-1 ligada a membranas.

A Figura 7 é uma representação gráfica dos plasmídeos de sICAM-1 e ICAM-1 clonados.

7A. pHRR3 é um cDNA de tamanho completo codificador de sICAM-1 obtido por PCR. Os clones

19.1-3 e 4.5 são clones de cDNA parciais codificadores de sICAM-1 obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de HEI em lambda GT11. Por baixo dos clones está um esquema da molécula de sICAM-1. S indica o peptídeo sinal e I a V os domínios homólogos de IgG. Os rectangulos a cheio indicam o extremo C único de 11 aminoácidos.

7B. pHRRl e pHRR2 são clones de cDNA de ICAM-1 com tamanho completo obtidos por PCR. Os restantes clones de ICAM-1 foram obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA de HEI em lambda GT11. Por baixo dos clones está um esquema da molécula de ICAM-1, mostrando o peptídeo sinal (S), os cinco domínios homólogos de IgG (I a V), a região transmembranar (TM) e o domínio citop1 asmático (C).

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES REFERIDAS

Um aspecto do presente invento relaciona-se com a descoberta de um ligando natural solúvel para o sítio de ligação ao receptor de Rinovirus Humano (HRV) e que também se liga LFA-1. Esta molécula natural solúvel está relacionada, sendo no entanto distinta, com a molécula designada Molécula de Adesão Intercelular-1 ou ICAM-1 que é insolúvel, ligada à membrana celular e possui uma região hidro fóbica tipíca que atravessa a membrana e uma cauda citoplásmica curta. A nova proteina do presente invento tem uma se-11-

quência de DNA que inclui uma diferença significativa da sequência de DNA publicada para ICA-1, sICAM-1 contem a maior parte do domínio extracelular de ICAM-1, que inclui os domínios funcionais para funções múltiplas incluindo ligação a HRV e LFA-1, mas não possui o domínio que atravessa a membrana e o domínio citoplásmico.sICAM-1 retem a capacidade de ligação a HRV e LFA-1 e é secretada numa forma solúvel. A sequência de DNA para sICAM-1 contem uma deleção de 19 pares de bases do nucleotideo 1465 a 1483 de acordo com a numeração de Staunton et a 1, supra ( 1988 ). 0 restante do clone sICAM-1 estã de acordo com a sequencia de ICAM-1 com excepção de uma substituição de um G por A na posição de nucleotideo 1462 que muda Glu 442 para Lis, como se mostra na Figura 1. A sequencia de resíduos de aminoácidos num peptideo é designada de acordo com a nomenclatura convencional como seja a do Lehninger's Biochemistry, Worth Publishers, New York, NY( 1970). sICAM-1 é um produto natural de células HeLa e HEI e de outras células humanas que tenham a propriedade de ligação nos vírus, rinovírus humano e Coxsackie A e inibição da infecção. Também possui a propriedade de ligação a LFA-1 e pode ser usada para antagonizar a adesão das células mediada pela ligação ICAM-l/LFA-1 e portanto ser útil como agente terapêutico no tratamento de inflamação, rejeição de enxertos,supressão de células tumorais que expressem LFA-1 e outros processos envolvendo adesão celular. A proteína sICAM-1 isolada e purificada como agente terapêutico não possuiria os problemas imunogénicos associados, às proteínas estranhas.

A secreção de uma proteína natural solúvel elimina os problemas associados à produção e purificação de uma proteína insolúvel ligada à membrana celular, uma vez que não é necessária a lise celular e portanto pode ser empregue cultura contínua assim como processos simplificados para a purificação e isolamento de sICAM-1.

As linhas de células de mamíferos não humanos que expressam o gene do principal receptor do rinovírus humano foram anteriormente identificadas e são tema do Pedido de Patente copendente U.S. No. 262570 e 262428 entregues em 25 de Outubro de 1988 e incluem referências aos depósitos ATCC das linhas celulares. 0 principal receptor de rinovírus humano foi identificado com anticorpos monoclonais que inibem a infecção por rinovírus. Estes anticorpos monoclonais reconhecem uma glicoproteina da superfície celular de 95Kd em células humanas e nos transfectantes de ratinho expressando um fenótipo de ligação a rinovírus. A proteina de 95 Kd purificada liga-se ao rinovírus in vitro.

A sequência proteica da proteina de 95 Kd mostrou uma identidade com a de ICAM-1; um clone de cDNA obtido a partir de transfectantes de ratinho expressando o receptor de rinovírus tinha a mesma sequência publicada para ICAM-1, excepto no que respeita à alteração de G para A préviamente descrita. Assim foi determinado que o principal receptor de rinovírus humano e ICAM-I eram a mesma proteina. Foí isolada uma linha de células L de ratinho transfectadas designada HEI que continha e expressava o gene HRR ou o gene ICAM-1. A terminologia ICAM-1 foi usada se bem que seja agora reconhecido que HRR e ICAM-1 são permutáveis.

Preparou-se uma biblioteca de cDNA iniciada ao acaso de RNA poli A+ de HEI em lambda GT11.

A biblioteca foi despistada em duplicado usando dois nucleotideos derivados da sequência publicada de ICAM-1. 0 oligonucleotídeo ICAM-1 tem a sequência GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTT GGGGCCGCAGGTCCAGTTC e o o 1igonuc1eotideo ICAM-3 tem a sequência CGTTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT.

Obtiveram-se oito clones positivos com um despiste e três foram seleccionados para posteriores estudos. A sequenciação de DNA de dois dos clones mostrou identidade com a sequencia publicada de ICAM-1. A sequência

do terceiro clone, lambda 19.1-3 era significativamente diferente dos outros dois clones por haver uma delecção de 19 pb do nucleotideo 1465 a 1483 de acordo com a numeração de Staunton et a 1., supra. A delecção de 19 pb estava presente num segundo cDNA, lambda HE1-4.5 e foi independentemente confirmado usando cDNA gerado por reacção de cadeias com polimerase (PCR). A análise da sequencia de DNA previu a existência de uma forma secretada de ICAM-1 que ê gerada por um mecanismo de splicing alternativo. A identificação de sICAM-1 em transferências Western de sobrenadantes de cultura das linhas celulares HEI e HeLa confirma que a sequência de mRNA de sICAM-1 codifica uma forma solúvel de ICAM-1 que não se associa com a superficie celular mas antes ê libertado para o meio de cultura. Um mRNA spliced de modo alternativo gerador de uma forma secretada de uma outra molécula de adesão (NCAM) foi identificado (Glower et a 1., Cell 55:955-964 (1988), no entanto em NCAM foi incorporado um exão no mRNA enquanto que no presente invento foi eliminado um exão do mRNA. Nenhuma sequência de mRNA alternativa para ICAM-1 foi anteriormente ident if icada ( Staunton et a 1).

Clones de cDNA de sICAM-1

Uma biblioteca de cDNA iniciado ao acaso foi construida em lambda GT11 a partir de políA+ de HEI pelo Clontech Laboratories, Paio Alto, CA. A biblioteca foi despistada com duas sondas oligonucleotidicas de 47 meros derivadas do meio da sequência codificadora de ICAM-1. Isolou-se um clone positivo designado 19.1-3 que tinha uma inserção de 1,5Kb, isolou-se um segundo clone de cDNA designado 4.5 que possui uma inserção de 1,25 Kb;e obteve-se mais um clone de cDNA pH RR-3 por subclonagem dos produtos de amplificação por PCR, em Bluescript utilizando o Sistema de Amplificação de DNA Perkin Elmer/Cetus,Perkin

Elmer, Wellesley MA., como se mostra na figura 4C, faixa 3. Estes clones apresentaram uma diferença significativa relativamente à sequencia ICAM-1 publicada. Todos eles possuem uma delecção de 19 pares de bases desde o nucleotideo 1465 atê 1485 de acordo com a numeração de Staunton et a 1, supra. Para demonstrar directamente que o mRNA de sICAM está presente em células HEI e células HeLa, efectuou-se uma experiência PCR usando iniciadores que lacbiam a região de 19 pb ausente no mRNA de sICAM (Figura 8). Usando estes iniciadores o produto do mRNA de sICAM-é 105 pb enquanto o produto sICAM-Ι tem menos 19 pb i.e. 86 pb. Esta experiência mostra que as células HEI e as células HeLa contêm ambas as formas de mRNA de ICAM-1 enquanto as células L testemunhas não contêm. Um oligonucleotideo sintético designado PCR3.2 tendo a seguinte sequência:

ggaattcTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT foi usado para distinguir os clones de cDNA contendo a delecção de 19 pb de entre os clones não contendo a delecção de 19 pb. 0 oligonucleotideo sintético não se liga a clones de cONA que contêm a delecção de 19 pb. Em adição, a sequência parcial do cDNA 19.1-3 e PHRR-3 confirmaram a delecção de 19 pb. Estes resultados indicam que existe pelo menos duas espécies diferentes e distintas de ICAM-1 nas células HEI, a ICAM-1 insolúvel de trabalhos anteriores e a nova forma solúvel como descrito no presente Invento.

As sequências das formas com delecção (sICAM-Ι) e sem delecção (ICAM-1) do mRNA da Molécula de Adesão Intercelular-1 representados pelos clones de cDNA estão apresentadas na Figura 2. A sequência no ponto de delecção é AGGT consistente com uma junção de splicing de RNA. A remoção de 19 oases do mRNA desloca a grelha de leitura e faz com que as sequências dos dois pol ipeptideos divirjam no residuo de aminoácido 443. A forma com delecção (sICAM-Ι) contem mais 11 resíduos de aminoácidos seguido de um codão de terminação na mesma grelha de leitura, Esta molé-15-

cula consiste assim em 453 aminoácidos comparado com os 505 aminoácidos da forma sem deleção. Começando com o extremo N de ICAM-1, sICAM-1 tem 442 aminoácidos em comum com ICAM-1. A forma com deleção (sICAM-1) contem um extremo C único de 11 aminoácidos mas não possui o domínio que atravessa a membrana (24 aminoácidos) e o dominio da cauda citoplasmática (28 aminoácidos )de ICAM-1, como se mostra na Figura 3.

Clones de cDNA de ICAM-I

Para cionar genes pode-se usar uma pluralidade de métodos. Um método consiste em usar duas sondas ol igonucleotidicas de 47 meros parciaimente sobreponlveis. Estas duas sondas designadas oligonucleotideo ICAM-1 e oligonucleotideo ICAM-3 foram sintetizadas a partir da sequência publicada para ICAM-1. 0 oligonucleotideo ICAM-1 foi marcado com actividade altamente especifica e hibridado com uma transferência Southern em condições muito estritas. Como se mostra na figura 4A, detectou-se uma única banda de

4,4 Kb em HeLa, HEI e duas linhas celulares transfectantes primários HRR contendo o gene humano ICAM-1. 0 tamanho do fragmento está de acordo com Simmons et a 1. ,mas difere de Staunton et a I. , provávelmente reflectindo um polimorfismo de sitios de restrição.

ol igonucleotideo ICAM-1 foi usado no despiste de uma transferência Northerç de RNA poli A+ das mesmas linhas celulares. Como se mostra na figura 4B, um mRNA de 3,3 Kb foi detectado em HeLa, HEI e linhas celulares transfectantes primários mas não em células LTK. 0 sinal nas células HEI era muitas vezes mais forte do que nas outras linhas celulares indicando um nível muito mais elevado de mRNA em células HEI. Isto está de acordo com o nível elevado da expressão de HRR (ICAM-1). em células

HEl.Um segundo RNA de 2,4Kb foi também detectado em células HEI. Estes resultados confirmam que o mRNA de ICAM-1 humano ê expresso em transfectantes HRR. Ver Figura 43.

gene ICAM-1 humano foi isolado a partir de transfectante HEI usando amplificação por reacção de cadeias com polimerase (PCR) utilizando o Sistema de Amplificação de DNA, Perkin-Elmer/Seats, Perkin Elmer, Wellesley MA. A amplificação por PCR foi efectuada em cDNA de cadeia simples feito a partir de RNA de HeLa, Ltd“ e HEI. Os iniciadores foram feitos a partir das regiões codificadoras 5' e 3' da sequência ICAM-1 publicada. Os produtos específicos da amplificação de ICAM-1 foram detectados por hibridação de uma transferência Southern das reacções PCR usando o oligonucleotideo ICAM-1. Como se mostra na figura 4C, uma única banda de aproximadamente 1600 pb que condiz com o tamanho previsto foi amplificado a partir de células HeLa e de células HEI mas estava ausente nas células LTK. 0 produto de amplificação foi clonado em Bluescript (Stratagene,

San Diego, CA) e obtiveram-se dois clones independentes desi£ nados PHRR1 e PHRR2. A sequência completa de PHRR2 mostrou 100X de identidade com a sequencia codificadora de ICAM-1 com excepção de uma única alteração de 3 para A préviamente descri ta.

Uma biblioteca em lambda GT11 feita a partir de cDNA de HEI iniciado ao acaso foi despistada com as sondas ICAM-1 e ICAM-3 e isolaram-se oito clones positivos. Como se mostra na figura 7 seleccionaram-se seis clones ao acaso para estudos posteriores e foram analisados por sequenciaçao parcial do DNA. Um total de aproximadamente 1000 nucleotideos da sequência derivada destes clones apresentou identidade de com a sequência de ICAM-1.

Purificação e isolamento de proteína solúvel

As células HeLa e HEI foram cultivadas em condições convencionais em DMEM (Meio Essencial Modificação de Dulbeco) com 10% de Soro Fetal Bovino. 0 meio condicionado destas células foi colhido e centrifugado ou filtrado para remover células ou detritos celulares. A ICAM-1 ligada a membranas não está presente no sobrenadante. Este meio foi então adsorvido a uma resina de anticorpo monoclona1-sefarose (sendo um exemplo o anticorpo monoclonal (78.4A) em que o anticorpo monoclonal é dirigido contra ICAM-1 ou sICAM-1 e as proteinas não adsorvidas são removidas da resina por lavagem com um tampão fisiológico salino, como seja tampão de fosfatos salino. A síCAM-1 ligada foi então eluida em condições que prescrevam a conformação nativa da proteína, como descrito no pedido copendente No. de Série 262428 entregue em 25 de Outubro de 1988. A sICAM-1 pede ser ainda purificada por cromatografia de afinidade com lectinas, cromatografia de permuta iónica ou filtração em gel.

mRNA transcrito in vitro a partir de cDNA codificador de sICAM no vector Bluescript (Stratagene) foi traduzido in vitro. Na ausência de membranas microssomais obteve-se uma proteína não glicosi lada com um PM aparente de 52 000 daltons; ra presença de membranas microssomais obteve-se uma espécie glicosilada de 72 000 daltons que estava sequestrada dentro da membrana microssonai indicando que o polipeptideo sICAM é correctamente translocado, processado e glicosilado pelas membranas microssomais.

cDNA codificador de tmICAM e sICAM no vector CDM8 (Ver, 3. e Aruffo, A. PNAS 84:3365(1987)foi transfectauú para células COS e células L de ratinho usando a técnica de DEAE-dextran. As 72 h as células foram anali-18-

sadas por dois métodos: (1) análise FACS com um Mab anti-ICAM (C78.4) para a expressão em membranas celulares de espécies de ICAM e (2) marcação metabólica seguido de imunoadsorção com Mab anti-ICAM de sobrenadantes celulares e 1 isados celulares. Os resultados da marcação metabólica indicaram acumulação intracelular de uma espécie de 63 000 daltons nas células transfectadas com sICAM mas não secreção detectável de sICAM no sobrenadante. Estes dados são consistentes com sICAM sendo secretada através da via secretora Regulada (R.B. Kelly, Science 230:25 (1985)).

Prepararam-se sondas de anticorpos específicos para sICAM e para ICAM-1. Cfe peptideos sintéticos

S-PEP,

PPGMRLSSSLW(C) derivado de uma sequência única de 11 aminoácidos no extremo C de sICAM e P002, derivado do extremo C de ICAM-1.

GTPMKPNTQATPP (C) foram feitos e purificados; os resíduos C do extremo C entre parêntesis foram adicionados para facilitar o acoplamento dos peptideos a veículos proteicos. Os peptideos sintéticos (foram acoplados a KLH (Hemocianina de lapa) por processos convencionais e o conjugado infectado em coelhos para produzir anti-soro anti-peptideo e observou-se ligarem especificamente aos respectivos imuncgénios peptídicos.

Em ligação com o presente pedido de patente, foram depositados os seguintes microorganismos da

American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Orive,

Rockville, MD 20852, USA:

Uma linha celular de Mamífero, HEI tendo a designação ATCC CRL 9592,

Uma linha celular de Mamífero,HRVRI (HRRI) tendo a designação ATCC CKL 9593 e

Uma linha celular de hibridoma,CI II 92.1 A tendo a designação ATCC HB 9594.

Claims

REIVINDICAÇÃO

I^a. - Método para a recuperação da molécula de adesão intercelular-1, (sICAM-1), na forma substancialmente pura, caracterizado pelos passos de:

(A) remoção do sobrenadante das células não lisadas, (B) introdução do sobrenadante numa matriz de afinidade contendo anticorpo imobilizado capaz de se ligar a SICAM-1, de preferencia anticorpos contra ICAM-1 e sICAM-1 ou seus derivados , (C) permitir que a referida sICAM-1 se ligue ao referido anticorpo da referida matriz.

(D) lavagem da referida matriz de afinidade para remover os contaminantes não ligados e (E) recuperação da referida sICAM-1 na forma substancialmente pura através da eluição da referida sICAM-1 da referida matriz.
2^a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda pela introdução do sobrenadante numa coluna de lectina ou de gérmen de trigo antes ou depois do sobrenadante ser introduzido na referida coluna de anticorpo.
3^a. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado por se obter uma molécula de adesão intercelular-1 solúvel humana, isolada e purificada ou um seu derivado funcional.
4^J. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se obter uma molécula de adesão intercelular obtida a partir de HeLa, Hei e seus transfectantes primários que apresenta as seguintes caracteristica s :

(A) solúvel na ausência de detergente e (B) ser o produto da tradução das sequências de mRNA apresentadas na Figura 1:

-2250 ATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCTGCCCGCACTCCTGGTCCTGCTCGGGGCTCTG 117

MAPSSPRPALPALLVLLGAL

118 TTCCCAGGACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTCATCCTGCCCCGG 177 FPGPGNAQ TSVSPSKVILPR 13

178 GGAGGCTCCGTGCTGGTGACATGCAGCACCTCCTGTGACCAGCCCAAGTTGTTGGGCATA 237 GGSVLVTCSTSCDQPKLLGI 33

238 GAGACCCCGTTGCCTAAAAAGGAGTTGCTCCTGCCTGGGAACAACCGGAAGGTGTATGAA 297 ETPLPKKELLLPGNNRKVYE 53

298 CTGAGCAATGTGCAAGAAGATAGCCAACCAATGTGCTATTCAAACTGCCCTGATGGGCAG 357 LSNVQEDSQPMCYSNCPDGQ 73

358 TCAACAGCTAAAACCTTCCTCACCGTGTACTGGACTCCAGAACGGGTGGAACTGGCACCC 417 STAKTFLTVYWTPERVELAP 93

418 CTCCCCTCTTGGCAGCCAGTGGGCAAGAACCTTACCCTACGCTGCCAGGTGGAGGGTGGG 477 LPSWQPVCKNLTLRCQVEGG 113

478 GCACCCCGGGCCAACCTCACCGTGGTGCTGCTCCGTGGGGAGAAGGAGCTGAAACGGGAG 537 APRANLTVVLLRGEKELKRE 133

538 CCAGCTGTGGGGGAGCCCGCTGAGGTCACGACCACGGTGCTGGTGAGGAGAGATCACCAT 597 PAVGEPAEVTTTVLVRRDHH 153

598 GGAGCCAATTTCTCGTGCCGCACTGAACTGGACCTGCGGCCCCAAGGGCTGGAGCTGTTT 657 GANFSCRTELDLRPQGLELF 173

65 8 GAGAACACCTCGGCCCCCTACCAGCTCCAGACCTTTGTCCTGCCAGCGACTCCCCCACAA 717 ENTSAPYQLQTFVLPATPPQ 193

718 CTTGTCAGCCCCCGGGTCCTAGAGGTGGACACGCAGGGGACCGTGGTCTGTTCCCTGGAC 777 LVSPRVLEVDTQGTVVCSLD 213

7 7 Θ GGGCTGTTCCCAGTCTCGGAGGCCCAGGTCCACCTGGCACTGGGGGACCAGAGGTTGAAC 8 37 GLFPVSEAQVHLALGDQRLH 233

FIG.Iq

8 38 CCCACAGTCACCTATGGCAACGACTCCTTCTCGGCCAAGGCCTCAGTCAGTGTGACCGCA 8 97

PTVTYCNDSFSAKASVSVTA 253

8 98 gagGACGAGGGCACCCAGCGGCTGACGTGTGCAGTAATACTGGGGAACCAGAGCCAGGAG 957 jtqEGTQRIíTCA· V IBCNOSOE 2*73

958 ACACTGCAGACACTGACCATCTACAGCTTTCCGGCGCCCAACGTGATTCTGACGAAGCCA 1017 TLQTVTI YSFPAPNVI L Τ K P 293

1018 GAGGTCTCAGAAGGGACCGAGGTGACAGTGAAGTCTGAGGCCCACCCTAGAGCCAAGCTG 1077 EVSEGTEVTVKCEAHPRAKV 313

1078 ACGCTGAATGGGGTTCCAGCCGAGCCACTGGGCCCGAGGGCCCAGCTCCTGCTGAAGGCC 1137 TLNGVPAQPLGPRAQLLLKA 333

1138 ACCCCAGAGGACAACGGGCGCAGCTTCTCCTGCTCTGCAACCCTGGAGGTGGCCGGCCAG 1197 TPEDNGRSFSCSATLEVAGQ 353

1198 CTTATACACAAGAACCAGACCCGGGAGCTTCGTGTCCTGTATGGCCCCCGACTGGACGAG 1257 LIHKNQTRELRVLYGPRLDE 373

1258 AGGGATTCTCCGGGAAACTGGACGTGGCCAGAAAATTCCCAGCAGACTCCAATGTGCCAG 1317 RDCPGNWTWPENSQQTPMCQ 393

1318 GCTTGGGGGAACCCATTGCCCGAGCTCAAGTGTCTAAAGGATGGCACTTTCCCACTGCCC 1377 AWCNPLPELKCLKDGTFPLP 413

1378 ATCGGGGAATCAGTGACTGTCACTCGAGATCTTGAGGGCACCTACCTCTGTCGGGCCAGG 1437 IGESVTVTRDLEGTYLCRAR 433

1438 AGCACTCAAGGGGAGGTCACCCGCAAGCCCCCCGGTATGAGATTGTCATCATCACTGTGG 1497 STQGEVTRKPPGMRLSSS L W 453

1490 TAG 1500

FIC.Ib
5^a. - Método para a obtenção de uma sequência de DNA isolada e purificada, caracterizado por se incorporar na referida sequência a sequência de DNA que codifj. ca a molécula de adesão intercelular-1 solúvel e hurana, de preferência como descrito na Figura 1, anteriormente referida .
6*. - Célula hospedeira, caracterizada por conter a sequência de DNA da reivindicação 3.
7^a. - Anticorpo de preferência monoclo nal caracterizado por ser capaz de se ligar a sICAM-1 e incapaz de se ligar a ICAM-1 insolúvel, de preferencia capaz de se ligar â sequência de 11 aminoácidos do extremo C como se mostra na Figuranl, anteriormente referida.
8«. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para redução da infecção por rinovírus humane, caracterizado por se incluir na referida composição a proteina das reivindicações 3 ou 4.
9^a. - Processo para a preparação ώ uma composição farmacêutica para reverter o mau funcionamento do sistema imune causada por excesso de sICAM-1,caracterizado por se incluir na referida composição anticorpos monoclonais contra sICAM-1 e/ou ICAM-1 e/ou suas misturas.
10^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para reverter o mau funciona-25- mento do sistema imune causado por excesso de sICAM-i, caracterizado por se incluir na referida composição LFA-1, purificado ou seus derivados funcionais.