JPH08501687A

JPH08501687A - 新規な天然物質シクラメノールおよび化学誘導体

Info

Publication number: JPH08501687A
Application number: JP6507782A
Authority: JP
Inventors: ミユラー，ハルトビヒ; ビシヨフ，エルビン; フイードラー，フオルカー−ベルント; ベバー，カールハインツ; フクマン，ブルクハルト; ローゼン，ブルノ
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-13
Publication date: 1996-02-27
Also published as: DE59307796D1; EP0660825A1; CA2144747A1; DE4231289A1; ATE160772T1; DK0660825T3; WO1994006774A1; EP0660825B1; US5565561A; GR3025682T3; ES2109512T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、式

Description

【発明の詳細な説明】新規な天然物質シクラメノールおよび化学誘導体本発明は、新規な天然物質シクラメノール（ｃｙｃｌａｍｅｎｏｌ）、放線菌目の微生物、特にストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株ＭＨＷ８４６からのその調製方法、化学誘導体、ならびに医薬、特にヒトの急性および慢性炎症性障害の医薬および動物薬としてのそれらの使用に関する。例えば、ヒタチマイシン（ｈｉｔａｃｈｉｍｙｃｉｎ）、バージニアマイシン（ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ）またはミクソビレシン（ｍｙｘｏｖｉｒｅｓｃｉｎ）のような多くの微生物により生産されるマクロ環状ラクタムが、抗菌もしくは抗腫瘍作用をもつことは、既に知られている［参照、例えばJ. Antibiotics 34，261（1981）；37，13（1984）；Biochim. Biophys. Acta 577，324（1975 ）］。本発明は、一般式（Ｉ）［式中、各場合、Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｕ，Ｖ，ＷおよびＸは、＞ＣＨ₂基を表し、そしてＲ¹およびＲ²が、水素を表すかまたはＲ¹が、水素を表し、Ｒ²が、ヒドロキシルを表すか、またはＲ¹およびＲ²が、一緒になって＝Ｏ基を形成するか、あるいは、各場合、ＡおよびＢ，ＤおよびＥ、ＧおよびＬ、ＭおよびＱ，ＲおよびＴ，ＵおよびＶ、そしてＷおよびＸは、−ＣＨ＝ＣＨ−基を表し、Ｒ¹が、水素を表し、Ｒ²が、ヒドロキシル（シクラメノール）を表すかまたは式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ₃もしくは−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ₃）₃を表す］の化合物に関する。驚くべきことに、新規な天然物質シクラメノールおよびその化学誘導体の両方は、急性および慢性の炎症過程における中心的反応に、強い阻害作用をもつのが特色である。その上、本発明による一般式（Ｉ）の化合物の調製方法が、見いだされて、式（Ｉａ）の天然物質シクラメノールの生産が、最初に記述される。一般式（Ｉａ）の化合物は、菌株ストレプトミセス種ＭＨＷ８４６を、栄養培地で培養し、次いで、それを、培養液から単離することによって生産される。本発明による一般式（Ｉａ）の化合物は、適切な栄養培地において、適切な生理的条件下で、ストレプトミセス菌株を培養することによって生産される。それは、培養液から、抽出もしくは吸着によって分別され、さらに適切な方法によって濃縮される。その上、本発明は、炭素および窒素源、そしてまた金属塩類を含有する栄養培地における培養の間に、下記（１）〜（６）の物質特性において示される性質およびパラメーターを有する化合物を生産する、ストレプトミセス科の微生物に関する。放線菌目、ストレプトミセス科、ストレプトミセス属からの菌株ストレプトミセスＨＭＷ８４６種またはそれに由来する変種および変異株が、特に、本調製方法のために重要である。その菌株は、日本の宮城県わふや（Ｗａｈｕｙａ）の土壌サンプルから単離された。この菌株の培養物は、８８年１２月１４日に、受託番号ＤＳＭ４９５０としてGerman Collection of Microorganisms in Brunswick chweigに寄託された。本菌株は、C.S. Cummins and H. Harris，J. Gen. Microbiol. 15，9-10，195 6によるＤＬ−ＤＡＰに関する、またR.M. Kroppenstedt in Chemical Methods S ystematics（eds. Goodfellow，M.；Minnikin，O.E.）によるイソ／アンチイソ脂肪酸パターンに関する化学分類学的研究を基礎に、ストレプトミセス属に帰属された。気菌糸の色は、明確に確認されないので、E.B. Shirling and D. Gottl ieb，Int. Jounal Syst.Bact. 16，313-340，1966による培地において、気菌糸を殆ど形成しないストレプトミセスである。ストレプトミセス種ＭＨＷ８４６は、ペプトン−鉄寒天培地およびトリプシン寒天培地でメラノイド色素を形成する。供給されるＣ源については、Ｄ−グルコースのみが明瞭に資化される（表１）。本菌株は、＋２０℃〜＋３５℃の温度範囲で生育する。＋５℃と＋４５℃では、生育は観察されない。該菌株の濃縮および単離は、ペトリ皿に土壌サンプル懸濁液を塗布し、４〜６週間培養し、個々のコロニーの継代培養を繰り返すという放線菌単離の常法によって行われた［Williams，S.T. and Cross，T．（1971），Actinomycetes，in： Methods in Microbiology 4，295-334，Booth，C.（editor），London-New York ：Academic press］。その上さらに、本発明による化合物（Ｉａ）は、ストレプトミセス科の好適な微生物が、同化できる炭素、窒素源および無機塩類を含む栄養培地で好気的条件下で培養され、本化合物が、常法によって単離される場合に、得られることを発見した。本発明による化合物（Ｉａ）の調製方法については、慣用の炭素、窒素源および必須塩類を含む栄養培地が使用される。使用できる炭素源は、炭水化物、特に、例えば澱粉のような多糖類、例えばグルコースのような単糖類である。例えば麦芽エキスのような天然に存在する混合物、同じく前記成分の混合物が、さらに使用される。使用できるＮ源は、慣用の窒素含有の栄養培地構成分、すなわち、例えばアミノ酸、タンパク質、タンパク質加水分解物、アンモニウム塩、大豆粉、粉乳、および適切なそれらの混合物のような天然に存在する複合物である。栄養培地に必要な添加物は、無機塩類、例えばカリウム、ナトリウム、カルシウム、またはマグネシウム、鉄、亜鉛およびマンガンの燐酸塩、硫酸塩もしくは塩化物である。これらの物質の濃度は、広い範囲内に変化でき、ある場合には、無機塩類の必須濃度は、上記の炭素もしくは窒素源中に、または使用される水中に不純物として含有される。例えばポリオールもしくはシリコンのようなあらゆる種類の消泡剤が、場合により、さらに添加物として使用される。本発明による化合物（Ｉａ）の調製方法は、慣用の固形、半固形もしくは液体栄養培地を用いて実施することができる。水性液体栄養培地が、より好ましい。栄養培地への接種は、一般に常法によって、例えば試験管スラントもしくはフラスコ培養物によって、ここでは実施される。培養は、好気的条件下で行われ、振盪培養、例えば振盪フラスコ、通気混合培養もしくは液内培養を用いるような一般的慣用法により実施してもよい。より好ましくは、培養は、通気発酵槽、例えば通常の液内発酵タンクでの好気的液内法において実施される。培養を連続法もしくはバッチ法で実施することも可能である。好ましくは、バッチ法で実施される。調製方法は、好気的条件下で実施され；培養は、常法、すなわち、例えば振盪培養もしくは通気発酵槽培養を用いて実施することができる。栄養溶液構成分の百分比は、広い範囲内で変えられ、一般に、炭素源は、０．５〜８％、好ましくは０．６〜６％、窒素源は、０．１〜５％、好ましくは０．５〜２％の組成であり、塩類は、常用濃度、好ましくは０．００１〜０．５重量％の範囲で存在する。消泡剤は、０．５％以上の濃度で存在する。殺菌に使用される温度は、＋１００〜＋１４０℃、好ましくは＋１２０〜＋１３０℃である。増殖培養のｐＨは、好ましくは、約６〜約８．５、特に、６．５〜８．０に維持されるべきである。酸性側においてｐＨ低下が大きすぎる場合には、有機もしくは無機塩基、好ましくはＣａＣＯ₃の添加によって避けることができる。発酵技術において慣例のように、自動的ｐＨ調節が、また実施されるが、その場合には、滅菌有機もしくは無機酸、例えばＨ₂ＳＯ₄、あるいは滅菌アルカリ、例えばＮａＯＨが、一定間隔で培養液中に注入される。好適には、微生物が、酸素および栄養物と十分に接触するよう、確実にすることである。このことは、振盪および撹拌のような一般的慣用法によって実施することができる。培養温度は、約＋１６〜＋４２℃、好ましくは＋２４℃〜＋３２℃であり、特に好ましくは約＋２８℃付近である。培養時間は、大きく変わり得るものであり、例えば、栄養培地の組成および培養温度が重要である。特定の最適条件は、いかなる微生物分野の当業者によっても容易に決定することができる。培養ブロス中に蓄積する本発明の化合物の量は、一般に、培養開始後約１〜７、好ましくは１〜４日に最高値に達する。微生物学的方法において一般的であるように、培地の交差感染は避けねばならない。このために、栄養培地、培養容器およびまた通気に必要な空気の滅菌のような通常の注意が払われる。装置を滅菌するために、例えば、蒸気もしくは乾熱殺菌が使用される。培養中に、望ましくない量の泡が形成される場合には、通常の化学的消泡剤、例えば液状脂肪および油、油／水エマルジョン、パラフィン、オクタデカノールのような高級アルコール、シリコン油、およびポリオキシエチレンもしくはポリオキシプロピレン化合物を、添加することができる。泡は、また、通常の機械的装置（例えば遠心力を用いる）の力で押さえ、または消すことができる。新規化合物（Ｉａ）は、培養上澄液および菌体中に見いだされ、慣用の抽出および／またはクロマトグラフィー法を用いて発酵混合液から単離でき、任意に精製される。クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーの形で実施できる。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、好適に使用される。使用できる吸着剤は、例えばシリカゲル、ケイ酸マグネシウム、活性炭素、セルロース、セルロース誘導体、ポリアミド、例えばアセチル化ポリアミドのような合成樹脂、デキストランゲルもしくは修飾デキストランゲル、のような通常の無機もしくは有機吸着剤である。使用される溶離液は、本発明の化合物が溶解するどんな種類の溶媒もしくは溶媒混合液でもよい。酢酸エチル、クロロホルムおよびメタノール、またはそれらの混合液（例えば、クロロホルムとメタノール、または酢酸エチルとクロロホルムの混合液）が、好適に使用される。好ましくは、クロマトグラフィー法、例えば、シリカゲルのような吸着剤への非特異的吸着またはゲル拡散クロマトグラフィーが、本発明による化合物（Ｉａ）の単離のために使用される。これらは、水に難溶の天然物質の精製において既知の方法である。本発明による化合物（Ｉａ）は、その溶液から、常法、例えば溶媒の蒸発、凍結乾燥、等によって得ることができる。好適な実施態様においては、菌体は、培養ブロスから、好ましくは遠心によって分別され、低極性溶媒を用いて、数回、好ましくは２回抽出される。使用される溶媒は、Ｃ₁−Ｃ₄−アルコール、Ｃ₁−Ｃ₄−ケトン、もしくはハロゲン化炭化水素でもよい。水性有機溶液は、真空中で、例えば培養ブロスの約１／２０容まで濃縮され、さらに次の操作を受ける。培養ブロスは、菌体分離後、水に非混和性の溶媒、好ましくは酢酸エチルを用いて数回抽出され、濃縮後、始発容量の約１／１０までさらに処理される。本発明による化合物（Ｉａ）は、これらの２種類の粗抽出物から、通常のクロマトグラフィー法、好ましくはシリカゲルでのクロマトグラフィーによって単離することができる。場合により、それは、ポリスチレン（例えば、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ、 Roem and Haas製またはＬｅｗａｐｏｌＣＡ９２２１、Bayer製）に基づく非特異的吸着樹脂に結合させることができる。脱着は、水と前記有機溶媒、特に、水／メタノールの混合液によって、分画的に実施される。試験によって確認された活性画分は、＋３０℃〜＋３５℃、減圧下で、有機溶媒が完全に除去されるまで濃縮され、凍結乾燥される。凍結乾燥物は、再び水に懸濁され、好ましくは、酢酸エチルまたは他の水に非混和性溶媒を用いて抽出される。本発明による化合物は、通常のクロマトグラフィー法、好ましくはシリカゲルでのクロマトグラフィーによって、その抽出物から回収される。本発明による化合物（Ｉａ）は、次の性質によって特徴づけられる：１）本天然物質は、無色ないし淡黄色固体である。それは、熱により焼結し、１５０℃以上で分解する。溶解直後の旋光度は、［α］²⁰ ₅₈₉＝＋３８４０゜（ＤＭＳ中、ｃ＝０．５％）である。Ｒ_f＝０．４５（溶媒系クロロホルム：メタノール（９：１）、シリカゲル６０既製プレートＦ₂₅₄（Merck）、ＴＤＭ試薬により緑色、ヨウ素により灰褐色）。２）ＵＶスペクトル（図１、別添）メタノール中に溶解する（ＣＨ₃ＯＨ１ｍｌ中、ｃ＝０．１ｍｇ）。酸性もしくはアルカリ性ｐＨは、溶液ｍｌ当たり１ＮＨＣｌまたは１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０μｌ添加により確立する。３）化合物（Ｉａ）のＩＲ吸収スペクトルは、図２に再現される（横座標：波数ｃｍ^-1；縦座標：吸収）。その物質が、ＫＢｒディスクに圧縮される場合には、次の波数（ｃｍ^-1）における吸収バンドを示す：相対強度：ｖｓ＝非常に強いｓ＝強いｍ＝中間ｗ＝弱いｓｈ＝肩４）¹Ｈ核磁気共鳴スペクトルは、図３のようなシグナル位置（ppm）および秒当たり振動を示す。それは、本化合物のジメチルスルホキシド−ｄ₆溶液中で、B ruker製核磁気共鳴分光計を使用し、標準（内部）としてＴＭＳを用いて、２５０ＭＨｚの磁場強度において記録された。ＨＩＣヘテロ原子相関分光法によって、炭素原子に対して、それに結合された水素原子を、帰属させることが可能であった： δ＝５．０ｐｐｍにおけるＯＨ基およびδ＝７．５ｐｐｍにおけるＮＨ基は、Ｈ／Ｄ交換によって同定された。Ｃ原子交互の結合、したがってその分子の基本構造は、二次元¹Ｈ，¹Ｈ−ＣＯＳＹＮＭＲスペクトルにおいて、Ｃ原子に結合された対応する水素原子の結合の測定によって確認できる。このようにして、各Ｈ原子の化学シフトが、２Ｄプロットにおいて決定される（表４、参照）。結合成分は、相関図において確認される。例としては、δ＝４．１ｐｐｍにおけるＨ原子の結合成分は、図３において同定される：５．０ｐｐｍにおけるＯＨ基、５．２ｐｐｍにおけるオレフィンＨおよびδ＝１．９５および２．６５ｐｐｍにおける２個のジアステレオマーのプロトン。５．１および６．１ｐｐｍ間に、ある場合には、複雑な形で互いに結合している１２個のプロトンがある。全てのシグナルは、相関図（表５）に整理することができる：６００ＭＨｚスペクトル（Bruker，Karlsruhe）によって、全てのシフトを指定することができた。したがって、１４．５Ｈｚおよび１５．５Ｈｚ間のプロトンのＪ³結合定数をもつ３個の二重結合は、トランスの立体配置をもち、１１．５Ｈｚの結合定数をもつ１個は、シス−の立体配置をもつ。６）化合物（Ｉａ）は、ＤＣＩ条件下での質量分光法において、ｍ／ｅ＝３１１に分子ピークを示す。ＥＩモードにおける質量スペクトルは、分子ピークについて３１１．１８９５の高分解能を与える（Ｃ₂₀Ｈ₂₅ＮＯ₂についての計算値＝３１１．１８８５）。一般式（Ｉ）に含まれる本発明による他の化合物は、一般式（Ｉａ）の天然物質シクラメノールの化学的誘導によって調製され、次いで、これらは、順次その化学構造が確定される。この方法において、式（Ｉａ）の天然物質は、［Ａ］Ｒ²（一般式Ｉ）が、アセチルを表す場合には、保護気体下で４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ピリジン存在下、無水酢酸と室温で反応され、［Ｂ］Ｒ²（一般式Ｉ）が、トリメチルシリル基を表す場合には、保護気体下で同様にピリジンおよびトリメチルクロロシランの存在下、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドと室温で反応され、そして［Ｃ］（Ｒ¹＝Ｈ／Ｒ²＝Ｈ）、Ｒ¹＝Ｈ，Ｒ²＝ＯＨ）、（Ｒ¹＋Ｒ²＝＝Ｏ）そして各場合Ａ−Ｘが、−ＣＨ₂ −基（一般式Ｉ）を表す場合には、メタノール中、活性炭素上のパラジウムの存在下で、０℃において水素により水素化される。本発明による一般式（Ｉ）および（Ｉａ）の化合物は、急性および慢性の炎症過程ならびに白血球が関与する他の病状に対する薬物において、有効な化合物として使用することができる。それらの作用は、酸素ラジカルの遊離、例えばβ− グルクロニダーゼおよびエラスターゼのような加水分解活性をもつ酵素、ならびにヒトの多形核好中球由来の酸化的ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を強力に阻害することにある。かくして、好ましくは、それらは、アレルギー／ゼンソクのような気道の急性および慢性炎症、気管支炎、リウマチ、動脈硬化症、関節症、胃腸管の炎症、心筋炎および心臓梗塞の治療および予防に好適である。使用実施例：１．ミエロペルオキシダーゼの単離：ヒト多形核好中球からのミエロペルオキシダーゼが、測定のために使用された。その好中球は、D. English and B.R. Andersen，Journal of Immunological M ethods 5，（1974）249-252の方法により、新鮮な静脈全血から単離された。１０⁷細胞が、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．０中０．５％臭化セチルトリメチルアンモニウム１ｍｌを用いて０℃で１０分間溶解され、凍結され、そして直接、再融解された。この工程を２回繰り返した。次いで、その懸濁液を４０，０００ｇで１０分間遠心した。その上澄液を、そのミエロペルオキシダーゼ活性にしたがって、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．０で希釈し、試験に使用した。２．試験：試験を実施するために、試験サンプル１０μｌを、平滑な底をもつミクロタイタープレート（Greiner）中に、上記のように調製されたミエロペルオキシダーゼ溶液（１〜２．５μｇタンパク質）３０μｌとともに、ジメチルスルホキシド含有溶液（ｍａｘ．ｖ／ｖ３０％）に添加する。その反応は、ジメチルスルホキシド中、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．０２５０μｌ、０．５ｘ１０^-3ｍｍｏｌ／ｌのＨ₂ Ｏ₂ １０μｌおよび２．５ｘ１０^-2ｍｏｌ／ｌのオルト−ジアニシジン１０ μｌからなる試験混合液の添加により開始される。吸光度の増加は、Ｅｌｉｓａリーダーにおいて３０℃で４９０ｎｍにおいて測定される。６回の測定が２分間隔で実施され、分当たりの吸光度増加が計算される。試験サンプルの代わりに、ジメチルスルホキシドの相当量のみを含む対照は、１００％値として作製され、次いでサンプルによる阻害が計算される。全ての測定を、３並列の測定で実施する。実施例１の本発明による化合物（Ｉａ）は、上記試験においてミエロペルオキシダーゼの活性を、表６に示すように阻害する：３．小細静脈における白血球付着が、ハムスター頬嚢（Duling，MVR 5，423-4 29，1973により調製）において研究された。付着の増大は、頬嚢の予備的調製物により引き起こされる。本物質は、０．１ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．から白血球付着を著しく低下する。さらなる実験において、頬嚢は、ＬＴＢ₄により１０分間、過融解された。好中球白血球の集積を直接測定するためのミエロペルオキシダーゼ活性の測定は、対照に比較して約８０〜１００％の増大を示す。１ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．において、新規な天然物質（ｌａ／実施例１）は、ＭＰＯ活性における上昇を妨げる。４．実施例１（一般式Ｉａ）の生体内の作用ラットの梗塞モデルにおける梗塞サイズの減退方法：実施例１からの化合物の生体内の作用を測定するために、心臓の梗塞を、麻酔（トラパナル（ｔｒａｐａｎａｌ）ｉ．ｐ．）されたＷｉｓｔａｒラットにおいて、左冠動脈の結紮によって実験的に誘導した。５分の術後回復期の後、１００％ＤＭＳＯまたは溶媒に溶解した実施例１の化合物の１ｍｇ／ｋｇ投与量を、換気されているラットのカテーテル挿入された頚静脈中に、６分間、注入し、そして冠動脈を３０分間閉鎖した。閉鎖２５分時点で、実施例１の化合物または溶媒の第２回投与を、上記条件下で実施する。注入と閉鎖期の終了後、結紮を開き、心臓を３０分間再潅流した。梗塞サイズの測定：梗塞された心臓組織の組織学的染色のために、心臓を、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー中塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ，１．５％）により１５分間、そして０．９％ＮａＣｌにより１０分間、３７℃で、潅流圧１００ｍｇＨｇにおいて、体外で（ｅｘｖｉｖｏ）逆行して潅流した。梗塞サイズは、非梗塞組織に対する梗塞組織の重量％で計算され、実施例１の化合物で処置された１１ラットと溶媒で処置された１１匹の、平均値の％および標準偏差で示された。結果：閉鎖前および再潅流前に実施例１の化合物、各１ｍｇ／ｋｇの投与により、梗塞サイズを１９．０±６．０％および１２．２±４．８％減退した。本発明は、また、不活性な、無毒な、薬物学的に適切な補助剤および添加剤を付加して、一般式（Ｉ）／（Ｉａ）の１種以上の化合物を含むか、または式（Ｉ）／（Ｉａ）の１種以上の活性化合物からなる医薬製剤、ならびにこれらの製剤の生産方法を包含する。式（Ｉ）／（Ｉａ）の活性化合物は、これらの製剤中、全混合物に対して０．１〜９９．５重量％、好ましくは、０．５〜９５重量％の濃度で存在すべきである。式（Ｉ）／（Ｉａ）の活性化合物に加えて、その医薬製剤は、また、他の薬物学的活性化合物を含むこともできる。前述の医薬製剤は、常法、例えば、添加剤もしくは補助剤とともに、既知の方法で調製することができる。一般に、式（Ｉ）／（Ｉａ）の活性化合物を、全量約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重において、２４時間毎に、好ましければ数回の分割投与の形で、投与するのが、望ましい結果を達成するのに好都合であることが分かった。しかしながら、ある場合には、上記量を変えること、すなわち、処置される患者の型および体重に因り、薬物に対する個体の反応、疾病の性質および重篤度、製剤および投与の種類、そして投与の行われる時間もしくは間隔に因り変えることも好都合である。（実施例１）シクラメノール（Ｉａ）実施例Ｉ前培養用の種菌の調製１リットルエルレンマイヤーフラスコ中の、次の組成：グルコース４ｇ麦芽エキス１０ｇ酵母エキス４ｇを水道水で１０００ｍｌ、ｐＨ７．３とした殺菌栄養溶液１５０ｍｌに、ストレプトミセスＭＨＷ８４６株の菌糸を接種し、＋２８℃で、２４０ｒｐｍのロータリーシェーカーで３日間発酵させる。その洗浄培養物を、その後の発酵混合液の種菌として用いる。実施例ＩＩタンク発酵用の前培養液の調製実施例Ｉ記載の組成の栄養溶液２０ｌおよび消泡剤（ＳＡＧ５６９３，Unio n Carbide）２０ｍｌを、撹拌、通気および温度調節装置のついた３０ｌ容器中に注入し、＋１２１℃で５０分間殺菌する。その栄養溶液を＋２８℃まで冷却後、それに、実施例Ｉ記載のように得たストレプトミセスＭＨＷ８４６株の振盪培養液３００ｍｌを接種し、分当たり３００回転の撹拌（ブレード撹拌機）で、無菌エアー分当たり１０ｌ（０．５ｖｖｍ）を通気し、温度＋２８℃、０．５ｂａｒの陽圧において発酵させる。２日間の発酵後、その培養液を１バッチ６００ｌ容器の種菌として使用する。実施例ＩＩＩ６００ｌ容器における発酵次の組成：グルコース５g デキストリン４０g 酵母自己消化物１．５g 粉乳１０g を水道水で１０００ｍｌとする栄養溶液４００ｌを、ｐＨ７．０に調節して、６００ｌ容器中で＋１２１℃６０分間殺菌し、＋２８℃に冷却し、実施例ＩＩにより得た種菌２０ｌを接種する。ＭＨＷ８４６株の発酵を、＋２８℃、無菌エアー分当たり２００ｌ（０．５ｖｖｍ）の通気、分当たり１５０回転の撹拌（ブレード撹拌機）とともに１ｂａｒの陽圧において実施する。３〜６日の発酵後、本発明の化合物（１）が生成された時、その培養物を収穫する。生成した生産物：１〜２ｍｇ／ｌ。実施例ＩＶ実施例ＩＩＩにより得た４００ｌ発酵の培養ブロスを、ｐＨ６．５〜７．０で２００〜２５０ｌ／ｈで、ウェストファリア分離機において分離する。その菌体を、等量のメタノールを用いて処理し、１０分間撹拌する。次いで、酢酸エチル３０ｌを添加し、その混合液を、さらに６０分間撹拌する。相分離のために、水１０〜１５ｌを添加し、その有機相を分離する。有機相を、約５ｌまで濃縮し、さらに、クロマトグラフィー法により直接精製する。菌体の分別後、上澄液４００ｌを、塩化ナトリウム２５ｇで処理し、酢酸エチル１３０ｌおよび３０ｌを用いて連続して抽出する。合わせた抽出液を、約５ｌまで減圧濃縮する。実施例Ｖメディウムプレッシャー（ｍｅｄｉｕｍｕｐｒｅｓｓｕｒｅ）クロマトグラフィーによるさらなる濃縮カラム：ガラスカラム１０ｘ１８ｃｍ流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ検出：２８０ｎｍ固定相：シリカゲルＳｉ６０、７０〜２３０メッシュ溶離液：酢酸エチルｐ．ａ．実施例ＩＶからの粗抽出液を、さらに、活性化合物含量約１ｍｇ／ｋｇ（分析用ＨＰＬＣによる）まで濃縮する。カラム溶出液を、分画して収集し、次のパラメーターにより分析用高圧液体クロマトグラフィーにかける：溶媒：４５％水性メタノールＬｉＣｈｒｏＳｏｌｖ流速：１ｍｌ／ｍｉｎ検出：２８５ｎｍおよび２２０ｎｍ固定相：Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ３ｘ１０ＯＤＳ２活性化合物を含む画分を合わせ、活性化合物を、石油エーテルを用いて、濃縮液から大体６０〜８０％濃度の調製物として沈殿させ、真空乾燥する。実施例ＶＩ純物質の単離：純物質を、ＨＰＬＣ法によって実施例ＩＶの濃縮産物から単離する。カラム：Ｌａｔｅｋ５ｘ２５ｃｍＯＤＳ２５μ 溶媒：５５％水性メタノール流速：３０ｍｌ／ｍｉｎ検出：２８５ｎｍ（実施例２、３および４）実施例１からの化合物４５ｍｇを、メタノール１０ｍｌ中に、０℃で溶解し、活性炭素上１０％濃度のパラジウムの１スパーテル分を添加後、撹拌しつつ水素を用いて水素化する。水素化を２０分後に中断し、その混合物を濾過し、濾液を蒸発し、シリカゲル６０によるクロマトグラフィーによって精製する。ＨＰＬＣおよび¹Ｈ−ＮＭＲにより均一である実施例２の化合物の生成物２０ｍｇを得る；Ｒ_f（シリカゲル、ＣＨＣｌ₃／メタノール９：１）０．４７、ＴＤＭ試薬により草緑色（紫になる）、ＵＶ不活性、無色結晶、ｍ．ｐ．８４℃。実施例２からの化合物の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、二重結合系の完全な水素化を示す。高分解能ＥＩ−ＭＳは、ｍ／ｅ＝３２５．２９９６における分子ピークを示す（Ｃ₂₀Ｈ₃₉ＮＯ₂：３２５．２９８１を算出）。元素分析は、次の結果である：ＣＨＮ計算値：（％）７３．８１２．１４．３実測値：（％）７３．９１０．７４．３さらに、別添の図６は、実施例２の化合物のＩＲおよび¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。実施例２の化合物に加えて、少量の実施例（３）の化合物の脱酸素生成物および実施例（４）の化合物のケトンが、付加的に生じる。（実施例５）実施例１からの化合物９０ｍｇを、アルゴン下でピリジン約２ｍｌに溶解する。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）の２結晶粒および無水酢酸４０滴を添加し、その混合液を、１時間、ＲＴにおいて撹拌する。水２２０ｍｌを添加し、その混合液を、酢酸エチルを用いて５回抽出する。有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製する。ＨＰＬＣおよび¹Ｈ−ＮＭＲにより均一である生成物モノ酢酸シクラメノール４０ｍｇを得る；Ｒ_f（シリカゲル、クロロホルム／メタノール９：１）０．８４；ＴＤＭ試薬により緑色、ＵＶ活性（２５４ｎｍ）、無色結晶（針状）、ｍ．ｐ．２６０℃、ＦＴ−ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：（実施例６）実施例１からの化合物１４０ｍｇを、無水アセトニトリル５ｍｌに溶解する。少量のアセトニトリル、乾燥ピリジン０．３ｍｌおよびトリメチルクロロシラン１０滴中、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド５００ｍｇ溶液を撹拌しつつＲＴで添加する（アルゴン）。３０分後、その混合液を、ＲＴにおいて蒸発させ、０．１ｍｍＨｇで乾燥する。その残渣を、ジクロロメタン／メタノール９：１を用いるシリカゲルの調製用薄層クロマトグラフィーにより精製し、無色の非結晶性固体シクラメノール（モノ）トリメチルシリルエーテル４０ｍｇを得る；Ｒ_f（シリカゲル、ＣＨＣｌ₃／メタノール９：１）０．８１、ＴＤＭ試薬により緑色、ＵＶ活性、ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベバー，カールハインツドイツ連邦共和国42115ブツペルタール・アウフデムシヤイト17 (72)発明者フクマン，ブルクハルトドイツ連邦共和国40878ラテインゲン・ゲルハルトシユトラーセ47 (72)発明者ローゼン，ブルノドイツ連邦共和国42489ブユルフラート・マリエンブルガーシユトラーセ65

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式（Ｉ）の化合物。［式中、各場合、Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｕ，Ｖ，ＷおよびＸは、＞ＣＨ₂基を表し、そしてＲ¹およびＲ²が、水素を表すか、またはＲ¹が、水素を表し、Ｒ²が、ヒドロキシルを表すか、またはＲ¹およびＲ²が、一緒になって＝Ｏ基を形成するか、あるいは、各場合、ＡおよびＢ，ＤおよびＥ、ＧおよびＬ、ＭおよびＱ，ＲおよびＴ，ＵおよびＶ、そしてＷおよびＸは、−ＣＨ＝ＣＨ−基を表し、Ｒ¹が、水素を表し、Ｒ²が、ヒドロキシル（シクラメノール）を表すか、または式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ₃もしくは−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ₃）₃を表す］２．１種ないし複数の請求の範囲１の化合物を含む医薬。３．急性または慢性炎症の治療のための請求の範囲２記載の医薬。４．医薬製造のための請求の範囲１の化合物の使用。５．ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＭＨＷ８４６、またはその変異株もしくは変種の１株を培養し、シクラメノール（ｃｙｃｌａｍｅｎｏｌ）をその培養物から回収し、そして任意に、誘導体にすることを特徴とする、請求の範囲１記載の化合物の調製方法。