PT95164B - Processo para a preparacao de uma vacina contendo complexos possuindo actividade adjuvante - Google Patents
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Description
! DESCRIÇÃO .1 A presente invenção refere-se a compleΊ ii xos que possuem actividade adjuvante, compreendendo os compleii ‘ xos um lipido e pelo menos um glicosido, e a novos glicosidos para incorporação nos referidos complexos.
ι
A imunização profilática de animais contra micróbios compreende a administraçao de um antigenio derivado de micróbios em ligaçao com um material que aumenta a resposta imune de anticorpos e/ou mediada por células, do antigenio do animal, este material e conhecido como um adjuvante. Os únicos adjuvantes actualmente autorizados para utilizaH çao em seres humanos ou em suínos em muitos países sao o hidróJ xido de alumínio e o fosfato de alumínio. Embora estes adjuh vantes sejam suficientes para muitas vacinas, alguns estudos i mostraram que o adjuvante completo de Freund (FCA) ou Quil ! A (também conhecido como saponina) são muitas vezes mais eficai zes no aumento da resposta de anticorpos e da imunidade mediada por células mas infelizmente estes adjuvantes podem provocar • i uma reacçao adversa dos animais à vacinaçao.
ΓΓΤΠ
Γ
As Patentes EP-A-0 109 942 e EP-A-0
180 564 descrevem complexos imunogénicos formados entre glicosidos, tais como as saponinas triterpenoides (particularmente o Quil A), e antigénios que contêm uma região hidrofóbica. Estes complexos imuno-estimulantes foram designados como iscons. A quantidade de Quil A num iscom pode ser de cerca de 10 a 100 vezes inferior à que se utilize quando se mistura | o Quil A com o antigénio para se obter o mesmo efeito antiginé·' nico. Os iscons nao criam as reacções adversas associadas J com o Quil A.
ί A patente EP-A-231 039 indica que a 1 presença de antigénio nao é necessária para a formaçao da li estrutura de base do iscom, de agora em diante referido como ! matriz de iscom, sendo possível obter a matriz a partir de um esterol, como por exemplo colesterol, um fosfolípido, ' como por exemplo a fosfatidil-etanolamina, e um glicósido, tal como o Quil A. Contudo, nao existem referências de que essas matrizes fossem úteis como adjuvantes; elas foram referidas apenas de passagem para mostrar que as estruturas do tipo
I iscom podem ser obtidas sem a presença de um antigénio. Desco! briu-se agora que essas matrizes vazias podem ser utilizadas para proporcionarem uma função adjuvante por adiçao a antigénios de bactérias e micoplasmas que nao fazem parte da matriz ! de iscom.
Η - Além disso, em todos os três documentos íl da técnica anterior acima citados, quando se utilizava um ! antigénio insolúvel em égua, este era solubilizado com um i detergente e em seguida, após se misturar com o glicósido etc, o detergente era removido, por exemplo por diálise, para i provocar a formaçao dos iscons. descobriu-se agora que os ' iscons se formam na presença do detergente e esta fase de remoção e desnecessária. As matrizes de iscom podem ser obtidas de forma semelhante.
Um aspecto da invenção proporciona uma vacina para utilização humana ou animal compreendendo
J (1) um antigénio associado com uma bactéria ou micoplasma
I
.1 e (2) uma matriz de iscom, nao sendo o referido antigénio ί incorporado no iscom.
I A invenção também engloba um processo
I para preparar uma vacina para utilização humana ou animal, i „ ' compreendendo (1) formar-se um complexo de um glicosido, um esterol e, opcionalmente, um fosfolípido, e (2) misturar-se o referido complexo com um antigénio associado com uma bactéria i
; ou micoplasma.
animal pretende-se significar de preferência um mamifero como por exemplo uma vaca, suíno, ovelha, cabra, cavalo, cao ou gato.
um vertebrado
Por nao-humano,
A vacina pode compreender um ou mais μ diluentes e veículos de natureza convencional. Estes serão ? normalmente adicionados durante ou após a fase (2) do processo.
i I
I!
ll Por antigénio associado com uma bactei!
, ria ou micoplasma pretende-se significar qualquer entidade ! susceptível de produzir uma resposta imunológica, mediada por anticorpos ou células, protectora contra a bactéria ou micoplasma num vertebrado exposto a antigénio. 0 antigénio pode ser toda ou parte de uma proteína, glicoproteina, glicolí1 pido, polissacarido ou lipo-polissacárido, que está associado ! com a bactéria ou micoplasma, ou pode ser um polipéptido ou H outra entidade que mimifica toda ou parte dessa proteína, glicoproteina, glicolípido, polissacarido ou lipo-polissacári1 do. Dado que o antigénio nao é incorporado na matriz de iscom durante a formaçao deste último, nao é necessário que ele tenha uma região hidrofóbica ou que esteja ligado a um grupo j; hidrofobico, como nos procedimentos da técnica anterior. A i própria bactéria ou micoplasma nao necessita de estar presente í
| na vacina mas pode ela reduzir o custo da vacina se se utilizaj rem células integrais, por exemplo de Haemophilus pleuropneumoij niae, em vez dos extractos.
i Por micoplasma, incluem-se os organisi : mos muito parecidos conhecidos tal como ureiaplasmas e acole! plasmas.
r
As doenças de bactérias incluem as causadas por Micobactérias (por exemplo M.tuberculosis & M.bovis) , Clostrídiom (por exemplo C.welchii), Rickettsia, Espiroquetas (por exemplo Treponema pallidum ou Leptospira pomona), Escherichia (por exemplo E, coli), Estafilococos (por exemplo
S.aureus), Haemophilus (por exemplo H. influenzae e H. pleuropneumoniae), Bordetella, (por exemplo B.pertussis), Vibrio (por exemplo V cholerae), Salonela (por exemplo S. typhi e S. paratyphi), Estreptococos (por exemplo S. agalactiae), Neisseria (por exemplo N. gonorrhoea), Pasteurela (por exemplo P. multocida), Legionela (por exemplo L. pneumoniae), Clamedia (por exemplo C. psittaci), Pseudomonas (por exemplo P. malliae) Actinobacilus (por exemplo A. pleuropneumoniae), Campilobacteria (por exemplo C. jejuni), Listeria (por exemplo L. monocytogenes), Brucela (por exemplo B. abortus), Corinobacteria (por exemplo C. diptheriae), Yersinia (por exemplo Y pseudotuberculosis), Pneumococos (por exemplo Streptoccus pneumoniae), Bacilo (por exemplo B. anthracis), Klebsiela (por exemplo K. pneumoniae), Shigela (por exemplo S. dysenteriae) e Actinomicetas (por exemplo Nocardia asteroides).
De preferência a bactéria e ums Micobactéria (por exemplo M. tuberculosis), Clostrídiom (por exemplo C. welchii), Rickettsia, Espiroquetas (por exemplo Treponema pallidum), Escherichia (por exemplo E. coli ) , Estafilococus (por exemplo S.aureus), Haemophilus (por exemplo H. influenzae e H. pleuropneumoniae) , Bordetela, (por exemplo B. pertussis), Vibrio (por exemplo V. cholerae), Salmonela (por exemplo S,typhi e S. paratyphi), Estreptococus (por exemplo S. agalactiae), Neisseria (por exemplo N. gonorrhoea), Pasteurela (por exemplo P. multocida), Legionela (por exemplo L. pneumoniae), Pseudomonas (por exemplo P, malliae), Actinobacilos (por exemplo A. pleuropneumoniae), Campilobactéria (por exemplo C. jeiuni), Listeria (por exemplo L. monocytogenes). Os antigenios particulares incluem o factor de aderência em Coli, por exemplo pili K 88, proteína de porina em, por exemplo, Salmonela e outras proteínas de membrana de B. pertussis e Meisseria meningitidis.
De preferência, antigenio aquele _ /.
que nao forma um iscom convecional, como é descrito nas Patentes EP-A-1O9 942 e EP-A-180 564.
A vacinaçao dos suínos contra H. pleuropneumoniae e particularmente preferida.
Os micoplasmas com interesse veterinário ou medico incluem:
Micoplasma bovis,
M.
gallisepticum,
M. agalactiae, M. hyopneumoniae, M. pneumoniae, M. synoviae,
M. arthritidis, M. capricolium, M. dispar, M. hominis,
M. mycoides subs. capri, M. orale, M.oripneumoniae,
M. pulmonis, M. cynos, M. hyorhinis, M. mycoides,
M. salvarium e M. fermentans.
Embora o anti.genio nao seja incorporado na matriz de iscom do modo anteriormente descrito, nomeadamente como parte da própria estrutura do iscom, ele pode contudo estar presente no exterior da matriz de iscom ou ele pode ser posteriormente integrado na matriz de iscom. Alternativamen. te, ele pode estar presente totalmente separado em solução ou dispersão.
A matriz de iscom pode ser preparada da forma referida na patente EP-A-0 231 039, nomeadamente misturando em conjunto o esterol, glicósido, e (opcionalmente) fosfolipido solubilizados e em seguida removendo o agente solubilizante. Alternativamente, pode omitir-se a remoção do agente solubilizante. Apresenta-se na Figura 1 da Patente EP-A-0 231 039 (ampliaçao 116 000 x) uma micrografia electrónica de iscons obtidos de Quil A, colesterol e fosfatidiletanolamina. Se nao se utilizarem fosfolipidos, formam-se duas estruturas dimensionais. Um exemplo dessas estruturas é referido na Figura 2 da Patente EP-A-0 231 039. esta figura e uma micrografia electrónica (ampliaçao 146 000 x) de estruturas obtidas de Quil A e colesterol. 0 termo matriz de iscom é utilizado para referir as estruturas tridimensionais e bidimensionais.
Os glicosidos a utilizar no processo de acordo com a invenção podem ser os mesmos dos mencionados
nas Patentes EP-A-0 109942 e EP-A-0 231 039. Geralmente os glicósidos sao glicósidos que apresentam propriedades antifaticas e compreendem regiões hidrofóbicas e hidrofílicas na molécula. Utilizam-se de preferência saponinas, especialmente o extracto de saponina obtido de Quillaja saponária Molina em primeiro lugar no extracto de DQ preparado de acordo com K. Dalsgaard: Saponin Adjuvants. Buli. Off. Int.. Epiz. 77 & 7-B) 1289-1295 (1972) e Quil A, também preparado de acordo com K. Dalsgaard: Saponin Adjuvants III Archiv Fur die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974). Outras saponinas preferidas sao a ascina obtida a partir de Aesculus hippocastanum (T Patt e W Winkler: Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskaatanie (Aesculus hippocastanum) Arzneimittelf orschung 10 (4) 273-275 (1960) e sapoalbina de Gypsophilla struthium (R Vochten. P. Joos e R Ruyssen: Physicochemical properties of sapoalbin and their relateion to the foam stability, J. Pharm. Belg. 42 213-226 (1968). A utilização de Quil A é especialmente preferida.
No processo de acordo com a invenção os glicósidos sao utilizados pelo menos na concentração crítica que forma micelas. No caso de Quil A esta concentração é de cerca de 0,03% em peso.
Geralmente, a proporção molar de glicósido (especialmente quando ele é o Quil A) em relaçao a esterol (especialmente quando ele é o colesterol) e ao fosfolípido e de 1:1:0-1, + 20% (preferivelmente nao mais do que + 10%) para cada número. Este valor é equivalente a uma proporção em peso de carca de 5:1 para o Quil A: colesterol.
Os esteróis utilizados no processo de acordo com a invenção podem ser esteróis conhecidos de origem animal ou vegetal, como por exemplo colesterol, lanosterol, lumisterol, estigmasterol e sitosterol. De preferência o colesterol é o esterol utilizado no processo de acordo com a invenção.
Ê preferível utilizar um fosfolípido, de modo a se formarem iscons tridimensionais. Os fosfolípidos
adequados incluem fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.
Um segundo aspecto da invenção proporciona um processo para a preparaçao de um complexo imunogénico incorporando um antigénio insolúvel em água, compreendendo o processo solubilizar-se o antigénio com um agente solubili' zante, misturar-se o antigénio, um glicósido, um esterol e,
-opcionalmente, um fosfolípido solubilizados e obter-se um iscom essencialmente sem a remoção do agente solubilizante.
Assim, nao existe necessidade de remover
I 1 o agente solubilizante por ultrafiltraçao, diálise, ultracenI trifugaçao ou processos cromatográficos de modo a se obterem
I
I os iscons.
j
J 0 antigénio é como acima definido, , com a excepção de ele poder estar associado com fungos, parasiI tas por exemplo protozoários e nelmintas ou vírus em vez de , apenas micoplasmas ou bactérias.
ί Os fungos associados com doenças incluem:
Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Microsporum spp., Trichophyton spp. Epidermophyton spp. e Dermatophilus
I spp .
Os parsitas associados com doenças incluem os referidos na Patente EP-A-109 942.
Os vírus associados com doenças incluem li os referidos na Patente EP-A 109-942. Muitos deles têm envelo1 pes a partir dos quais se podem extrair os antigenios adequa’ dos. Os vírus particulares incluem o vírus da gripe, o vírus ! de herpes de equinos, vírus da diarreia virai de bovinos, i coronavirus, parvovirus, virus da leucemia de felinos, virus da imunodeficiência de felinos e virus da artrite virai de equinos.
agente solubilizante pode ser qualquer dos mencionados nas Patentes EP-A-0 109-942 e EP-A-0 321 039, por exemplo um detergente, ureia ou guanidina.
Geralmente, pode utilizar-se para este . fim um detergente nao-iónico, iónico ou zuiteriónico ou um detergente com base em ácido eólico, como por exemplo o desoxicolato de sódio. De preferência, o detergente utilizado e o glicósido de octilo, nonil N-metil glucamida ou decanoil N-metil glucamida mas sao também adequados os éteres de alquilfenil polioxietileno, especialmente o éter t-isooctilfenílico de polietileno glicol possuindo 9 a 10 grupos de oxietileno e que é comercializado segundo a marca comercial de Triton X-100R.
processo de acordo com a invenção pode ser utilizado para a preparaçao de complexos imunogenicos a partir de proteínas antigénicas ou de péptidos que apresentem propriedades anfipáticas, por exemplo os descrito na patente EP-A- 109 942.
Os processos adequados para isolamento de antigénios e ligaçao a grupos hidrofóbicos sao descritos na patente EP-A-109 942.
No processo de acordo com o segundo aspecto da invenção o antigénio dissolvido ou solubilizado ê geralmente feito contactar com uma solução contendo o glicósido pelo menos na concentração critica de formaçao de micelas, um esterol, e opcionalmente um fosfolípido.
Se desejado, a solução obtida dos compostos imunogênicos pode ser liofilizada. As composiçoes liofilizadas podem em seguida ser reconstituídas antes da utilização por adiçao de água.
j Um terceiro aspecto da invenção propro; ciona um processo para a preparaçao de uma matriz de iscom j que compreende solubilizar-se um esterol, e opcionalmente um fosfolípido, com um agente solubilizante e misturar-se com uma solução do glicosido, sem a remoção do agente solubilizante .
agente solubilizante, esterol, fosfolípido e glicósido sao como atrás definidos.
! Alem disso, a invenção refere-se à í
. ; preparaçao de uma composição farmacêutica contendo complexos • I • ί i
R imunogénicos preparados por meio do primeiro ou do segundo aspecto da invenção. Estas propriedades podem ser obtidas preparando os complexos imunogénicos numa forma adequada para administração parentêrica, preferivelmente para administraçao injectável e, em particular, para injecção por via subcutânea ou intra-muscular. Geralmente, as composiçoes farmacêuticas contêm os complexos imunogénicos num meio aquoso, fisiologicamente aceitável, que, se desejado, contêm um tampao e/ou um sal como por exemplo o cloreto de sódio para adaptaçao da pressão osmética. Estes procedimentos sao bem conhecidos.
Os seguintes exemplos nao limitativos ilustram vários aspectos preferidos da invenção.
EXEMPLOS 1-6: Preparaçao da Matriz fr Iscom Vazia
Reagentes Necessários
Solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco A, Oxoid)
Mistura de lípidos (ver a seguir)
Solução a 10% p/v de Quil A (Superfos) em ãgua destilada e esterilizada.
Preparaçao da Mistura de Lipidos (10 ml)
Materiais: Clorofórmio (analar), Colesterol (Qualidade I, de figado de suinos, Sigma), LBfosfatiditil colina (Sigma), Mega 9 ou 10 (Sigma) ou Triton (Mega 9 é o nonil N-metil glucamida, enquanto que Mega 10 é a decanoil N-metil glucamida) e água destilada esterilizada)
Processo (a) Prepara-se uma solução a 20% p/v de Mega 10 em água destilada e esterilizada; isto e pesam-se 2 g de Mega 10 e desissolvem-se em 2 ml de água, (b) Pesam-se 50 mg de Colesterol e adicionam-se a 50 mg de fosfotidil colina, (c) Quando o colesterol se dissolveu na fosfotidil colina sao adicionados 2 ml de clorofórmio, (d) Sao adicionados os 10 ml da solução a 20% p/v de Mega 10. A mistura terá um
^^SEsaaatttfe®^SS»·.
aspecto branco leitoso. Ocorrerá um aumento de volume para 12 ml. Contudo, o clorofórmio será evaporado por agitaçao e será obtido o volume final de 10 ml. (e) Coloca-se num agitador magnético na câmara aquecida (37°C), com a tampa do recipiente removido. Após agitaçao continuada, a mistura tornar; -se-á mais fluida e transparente, (f) Guarda-se a temperatura ambiente.
EXEMPLO 1 |i !| Procedimento: Sao colocados 20 ml de íl PBSA num frasco universal esterilizado. Sao adicionados 100 l| pl de uma solução a 10% de Quil A. Sao adicionados 400 pl da mistura de lipidos. Agita-se a mistura a velocidade máxima lí durante 10 segundos. Faz-se a esterilização da mistura fazendoi' -se passar através de um filtro de 0,2 um (Millipore). Decantai| ί· se um pequeno volume para estudos de microscopia electronica. Guarda-se a +4°C.
EXEMPLO 2
Foi seguido o processo referido no
| Exemplo | 1, | mas | com as | variações | seguintes. Sao colocados 20 |
| ml de PBSA | num | frasco | universal | esterilizado. Sao adicionados | |
| 200 pl | de | uma | solução | a 10% de | Quil A. Sao adicionados 800 |
μΐ da mistura de lipidos. Agita-se bem a solução à velocidade í máxima durante 10 segundos. Esteriliza-se através de um filtro de 0,2 pm. Decanta-se um pequeno volume para estudos de microsí copia electronica. Guarda-se a +4°C.
j EXEMPLO 3
Sao adicionados 20 ml de PBSA a uma I célula agitada de Amicon com uma membrana de corte de 30 K |; de peso molecular. A esta membrana foram adicionados 800 pl de mistura de lipidos e 200 pl de Quil A (solução a 10%). A solução foi concentrada para 5 ml e foram adicionados 100 ml de PBSA. Repetiu-se o procedimento anterior por duas vezes. Filtraram-se os 20 ml do frasco através de um filtro de 0,2 pl marcou-se e guardou-se a +4°C.
EXEMPLO 4
Foram adicionados 20 ml de PBSA a uma célula agitada de Amicon com uma membrana com o peso molecular de 30 K de corte em posição. Foram adicionados 400 pl da mistura de lípidos e 100 pl de uma solução a 10% de Quil A. Concentrou-se a solução acima referida para 5 ml e ressuspendeu-se para 100 ml com PBSA. Repetiu-se o procedimento anterior por duas vezes. 0 conteúdo final de 20 ml da célula foi em seguida esterilizado por filtraçao através de um filtro de 0,2 pm marcou-se e guardou-se a +4°C.
EXEMPLO 5
Foram adicionados 20 ml de PBSA a uma célula agitada de Amicon, com uma membrana de corte de 30 K de peso molecular em posição. Foram adicionados 200 pl da mistura de lípidos e 50 pl de uma solução a 10% de Quil A. A solução acima referida foi concentrada para 5 ml e ressuspendida em 100 ml de PBSA. Repetiu-se a fase anterior por duas vezes. Es seguida filtraram-se os 20 ml da preparaçao da célula através de um filtro de 0,2 pm, marcou-se e guardou-se a +4°C.
EXEMPLO 6
Adicionaram-se 20 ml de PBSA a uma célula agitada de Amicom (membrana de corte de 30K de peso molecular). Foram adicionados 100 pl da mistura de lípidos e 25 pl de uma solução a 10% de Quil A. Concentrou-se a solução acima referida para 5 ml e ressuspendeu-se com 100 ml de PBSA. Repetiu-se a fase anterior por duas vezes. 0 conteúdo final de 20 ml das células foi esterilizado por filtraçao através de um filtro de 0,2 pm, marcou-se e guardou-se a +4°C.
; Nos' estudos de microscopia electrónica, j
| estas matrizes de iscom pareciam ser menos numerosas do que nos outros exemplos.
EXEMPLO 7
Estudos em ratos: Eficiência
Foram utilizados ratazanas fémeas de uma estirpe criada (Balb/C) e da mesma idade (6-8 semanas). Os ratos foram obtidos da unidade mantida em barreira (SPF) de Harlan-Olac (Bicester). A estirpe da National Cell Type ι Collection de Mycoplasma hyopneumonlae foi utilizada neste j) estudo. 0 organismo foi cultivado numa modificação no meio 1 de Friis. As culturas de armazém foram mantidas a -70°C. Cada , suspensão para incorporação em vacina foi preparada por inocuj laçao de 40 ml de caldo com 4 ml de cultura de armazém a um j Q jl valor de pH de 7,4 e em seguida foram incubadas a 37 C durante Íj 3 dias ou até que o valor do PH descesse para 6,8. Nessa altura 4 o organismo tinha atingido a fase logaritmica de crescimento.
íi As culturas foram desactivadas utilizando uma etileno imina il | binaria, concentradas utilizando ultrafiltraçao de caudal j tangencial, e lavadas com solução salina tamponada com fosfato ϋ (PBSA) . A concentração do antigénio foi ajustada de forma a que todas as vacinas contivessem 10 jrg de proteína total por 0,1 ml de dose de rato da vacina.
I As preparações de iscom dos :! 3 a 6 foram utilizadas da forma seguinte.
I
Foram imunizados oito grupos ratos em duas ocasioes, recebendo cada rato 0,1 ml das i tes preparações:
Exemplos de seis seguinGrupo Vacina
A 10pg M, hyopneumoniae apenas
B 10jig M. hyopneumoniae adjuvantada com meio completo de Freund
C 10pg M. hyopneumoniae com matriz de iscom contendo 10pg QA/de dose de rato
D 10pg M. hyopneumoniae com matriz de iscom contendo 5jig QA/de dose de rato
E 10ug M. hyopneumoniae commatriz
de iscom contendo 2,5)ig QA/de dose de rato
F lOug M, hyopneumoniae com matriz de iscom contendo l,25^ig QA/ de dose de rato
G 0 u g M. hyopneumoniae com matriz de iscom contendo 5pg QA/de dose de rato
Η 10 u g M. hyopneumoniae + 10 c £ u de H. pleuropneumoniae com matriz de iscom contendo 5pg QA/de dose de rato
QA = Quil A
Fez-se uma pré-sangria de grupos de ratos através da vela da cauda antes da imunização primária e em seguida 14 dias depois, passados vinte e oito dias após a imunização primária os animais receberam uma outra vacinaçao e foram sangrados sete dias depois e finalmente vinte e oito dias após a secundária. Separou-se o soro do sangue no dia da recolha e armazenou-se a -70°C para análise por ELISA. Observaram-se os ratos após vacinaçao para a determinação de quaisquer reacções locais adversas e sistémicas.
RESULTADOS
I Os resultados das experiências efectuai
I das para avaliar o feito adjuvante de Quil A numa preparaçao j de iscom em que o antigénio e exterior a preparaçao sao aprei ] sentados em seguida nas Tabela 1 e 2.
ί ! Os resultados demonstram claramente j que a preparaçao de ISCOM com o mais alto valor de proporção | de proteína: Quil A de 10 pg: 10 pg/dose de rato produz a I maior resposta à vacina, dando uma resposta tao boa se nao melhor do que a vacina com o adjuvante de Freund.
Os grupos de ratos que receberam vacinas ·! de iscom contendo menos do 10 pg de Quil A por dose de rato
Q
nao se comportaram melhor, ao produzirem uma resposta ao antigenio, do que o antigénio isolado ---Nao foram notadas reacçoes a vacina quer locais quer sistémicas em qualquer rato que recebesse j a vacina de iscom ou com apenas antigénio. Nos ratos imunizados j com a vacina de Freund, foram notados pequenos granulomas i com aproximadamente 3 mm no ponto de imunização menor mas η nos outros ratos nao foram notados sintomas de perturbações sistémicas.
I Tabela 1 - Respostas anti-M. hyopneumoij niae em ratos medidas pelo ensaio de ELISA INDIRECTO,
H
| Grupos | Pre | 28DP2 |
| Tempo i — | Vacinaçao | |
| i A | 0.023 | 0.184 |
| B | 0.019 | 0.126 |
| C | 0.019 | 0.203 |
| D | 0.019 | 0.043 |
| E | 0.019 | 0.083 |
| F | 0.032 | 0.029 |
| G | 0.042 | 0.052 |
| 1 : H | 0.040 | 0.150 |
1 Omitiram-se os desvios padrao
I DP2°- dias após a vacinaçao secundária i
' EXEMPLO 8: Estudos em ratos: avaliaçao • da matriz de iscom vazia como adjuvante para a vacina de Haemophilus pleuropneumoniae em ratos
Foram imunizados ratos com vacina coni tendo bactérias de H.pleuropneumomiae totalmente desactivadas e matriz de iscom formuladas com vários teores de Quil A. Os ratos imunizados por duas vezes com uma vacina contendo ! 10 jig de Quil A/rato deram uma maior resposta de anticorpos í
do que os ratos imunizados com números equivalentes de bactéri' as no adjuvante de Freund. Doses inferiores de Quil A tinham um efeito aparente pequeno de adjuante. Nao foram observados efeitos locais ou sistémicos adversos após administraçao de qualquer vacina contendo a matriz de iscom.
> A estirpe de referência NCTC de H.
pleuropneumoniae do serotipo 3 (Estirpe 1421) foi cultivada até uma fase de crescimento logarítmico num extracto de fungo , suplementado com B NAD. A cultura foi desactivada com formalina i a 0,2% e lavada por três vezes com solução salina tamponada | com fosfato (PBS) para se obter uma preparaçao de antigénio ' de células integrais desactivadas. 0 antigénio foi normalizado ji por enumeração das bactérias utilizando uma câmara de Neubaumer ! comregras modificadas de Thoma e foi armazenada em PBS a 4°C até à sua utilização.
ίί Foram imunizados grupos de ratos, seis h
ί' em cada grupo, com H. pleuropneumoniae apenas, H. pleuropneumoniae juntamente com a matriz de iscom contendo teores diferentes de Quil A, como a seguir pormenorizado. Um grupo final recebeu antigénios de H. pleuropneumoniae e de M. hyopneumoniae ’ juntamente com a matriz de iscom para investigar a possivel interacção entre os dois antigénios. Os ratos receberam duas injecçoes subcutâneas de 0,1 ml da vacina adequada em duas ocasioes com um intervalo de 3 semanas entre as imunizações.
ι Imunização de ratos ί
Grupo Vacinaçao i 1 Nenhuma 1 2 Hpl apenas j 3 Hpl em FIA
Hpl com matriz de iscom contendo 10pg QA/por dose de rato de vacina
Hpl com matriz de iscom contendo 5jjg QA/por dose de rato de vacina ί 6 Hpl com matriz de iscom contendo 2.5pg QA/por dose de rato de vacina
I *
tf#*'
| 7 | Hpl com matriz de iscom de rato de vacina | contendo | 1.2pg QA por dose |
| 8 | Hpl com matriz de iscom | contendo | 5pg QA/por dose d'e |
| rato de vacina | |||
| e 10pg/por dose de rato | de antigénico de Mycoplasma |
, hyopneumoniae.
Η
Após a vacinaçao primaria houve uma fraca resposta de anticorpos em cada grupo. Apos a vacinaçao secundária, houve um aumento rápido e pronunciado nos teores ; de anticorpos em 2 de cada 8 grupos imunizados. Foi observada a maior resposta em ratos imunizados com bactérias juntamente 1 I ΐ com a matriz de iscom contendo 10 ug de Quil A por rato que ι tinha um valor de 0D de pico medio de 1,24 (+ 0,17) unidades J de Densidade Óptica (UOD) quando medida uma semana após a l· imunização secundária. Os ratos imunizados com bactérias e com FIA tinham uma resposta de anticorpos semelhante mas ligei' i
J ramente inferior com um valor de OD de pico médio de 1,11 ι (j+ 0,08) UOD na mesma ocasiao. Os ratos imunizados com apenas j bactérias, bactérias com doses inferiores de Quil A, ou bactérias juntamente com antigénio de M. hyopneumoniae tinham todos respostas de anticorpos semelhantes, e inferiores com valores í de pico entre 0,43 e 0,63 UOD quando medidos um mês depois da imunização secundária.
: Tabela 2
Resposta Anti-H.pleuropneumoniae medida pelo ensaio de ELISA indirecto
Pré-vacinaçao 28 DP2°
| A | 0.87 | 0.189 |
| B | 0.170 | 0 428 |
| C | 0.185 | 1.002 |
| D | 0.135 | 1.161 |
| E | 0.131 | 0.626 |
| F | 0.164 | 0.645 |
| G | 0.119 | 0.620 |
| H | 0.227 | 0.480 |
23¾¾.
EXEMPLO 9: Estudos em Suínos
Foram obtidos 30 porquinhos cruzados Landrace com três semanas de idade a partir de uma criaçao conhecida como sendo isenta de toda a evidência clínica serolé1 gica de infecção com H. pleuropneumoniae e M.hyopneumoniae. ί Os porquinhos foram mantidos em isolamento de todos os outros e foram alimentados a vontade com uma dieta de manutençao/cres! cimento convencional.
;í Foi cultivado um isolado de baixa passa' gem (menos de 10) de campo (SVA3) de M.hyopneumoniae até ao crescimento de fase logarítmica em meio de Friis.
A 20 ml de PBSA esterilizado foram j adicionados 400 ul de uma solução a 10% de Quil A e 1600 ul
J de mistura de lípidos. A mistura foi em seguida bem agitada, ί i
H durante 20 segundos a velocidade máxima seguido de filtraçao | através de um filtro de 0,45 pm. A 10 ml desta mistura de ι ISCOM foram adicionados 10 ml de 4 mg/ml de antigénio de M.hyopneumoniae para se obter uma mistura de ISCOM contendo 2 mg/ml j de antigénio e 1 mg/ml de Quil A.
il j Foi imunizado um grupo de 5 porquinhos com 1 ml de matriz de ISCOM contendo 3 mg/ml de antigénio de células integrais de M. hyopneumoniae. Um outro quinto ' grupo recebeu 1 ml de 2 mg/ml de M, hyopneumoniae adjuvantado i com uma vacina de Freund. Os outros 5 porquinhos receberam apenas PBSA.
Os porquinhos receberam a sua primeira vacinaçao com 3 semanas de idade por injecção intramuscular profunda de 1 ml da vacina adequada nos músculos profundos i do lado esquerdo do pescoço. Foi dada uma segunda injecção semelhante 6 semanas depois no lado direito do pescoço. Após duas semanas da segunda imunização, quando tinham 11 semanas ! de idade, os porquinhos foram ensaiados esperimentalmente.
| Os porquinhos foram sacrificados passadas aproximadamente 2 semanas apos o ensaio para exame post-mórtem para patologia do pulmão.
• i <a>7
a) Reacçoes Clínicas á Vacinaçao
Nao foram observados sinais clínicos adversos em qualquer dos porquinhos após a vacinaçao primária ou secundária. Nao ocorreram em qualquer dos grupos aumentos significativos na temperatura após as imunizações primária ou secundária. 0 maior aumento na temperatura, de 1,1 + 0,23°C, foi observado nos porquinhos imunizados com antigénio de Μ,hyopneumoniae em adjuvante incompleto de Freund após a imunização secundaria. Em geral, as temperaturas médias do grupo aumentaram de aproximadamente 0,3°C o que foi insuficiente para provocar sinais clínicos de pirexia. As vacinas que continham M.hyopneumoniae nao foram notavelmente mais pirogénicas do que as que nao o continham.
Nao eram visiveis os sensíveis reacçoes locais nos locais de injecção de qualquer vacina em qualquer das ocasioes examinadas.
Nao foram observadas diferenças entre o ganho do peso dos porquinhos.
b) Reacçoes Clínicas á Injecção
Nao eram aparentes reacçoes clinicas após infecção. 0 ataque experimental nao provoca pirexia. Os porquinhos permaneciam clinicamente normais durante as duas semanas após o ataque. Os aumentos de peso neste periodo e as ingestões de alimentos nao apresentaram diferenças significativas entre os grupos.
c) Medição dos Anticorpos do Soro
Após a vacinaçao primária apenas o grupo que recebeu M. hyopneumoniae adjuvantada com o meio de Freund demonstrava uma resposta de anticorpos. Contudo, apos uma segunda imunização houve um aumento pronunciado nos teores de anticorpos em todos os animais que receberam M. hyopneumoniae. As respostas de anticorpos de M.hyopneumoniae medidas pelo ensaio de Elisa OD ((a. 492 nm) antes do ataque foram as seguintes:
Para animais que receberam a vacina de ISCOM 0,6 + 0,156
Para animais que receberam a vacina ! adjuvantada de Freund 1,7 + 0,089
Foi também observada uma resposta de anticorpos anti M. hyopneumoniae (0D 492 nm = 0,6 + 0,156) em animais que receberam vacinas de matriz de ISCOM.
Nao houve outro aumento significativo : nos teores de anticorpos em qualquer dos grupos após infecçao.
I ! d) Reacções Locais à Vacinaçao ι
í As reacções mais severas foram observa! das nos porquinhos que foram imunizados com antigénios de ' M. hyopneumoniae no adjuvante de Freund. As reacções consistiam em granulomatos casuais múltiplos e dispersos e eram caracteristicos das reacções ao adjuvante de Freund no porco. Nao foram observadas lesões em porcos que receberam vacinas de ISCOM.
Exemplo 10: Estudos em Ovelhas
Foram adquiridas ovelhas BlacKface x Swaledale de uma fazenda que se sabia estar isenta de OEA durante pelo menos 4 anos. Os animais com 5-6 anos de idade foram pré-escrutinados antes da utilização para anti-corpos 1 a Chlamydia psittaci e Toxoplasma gondii. As ovelhas foram mantidas em isolamento do outro gado e foram alimentados com cevada concentrada a valores adequados para o seu estado fisiológico e nutricial. j 1. Vacinas
I
I Cultivaram-se estirões OEA de A22 e
S26/3 de Chlamydia psittaci que foram posteriormente semi-purifiçadas. 0 volume inicial da cultura de cada estirpe de 10 1 foi concentrado para 1 1 neste processo para se obter o Antigénio 10X ’ Foi preparada uma vacina de ISCOM (IV) : da forma seguinte: (a) 50 ml de antigénio 10X foram tratados ' ?· -S J~—'f-ti^tsaíKUeaasr com 100 ul de glutaraldeido de armazém (50%) durante 15 min a 4°C. (d) Foram adicionados 50 ml de glicina 0,15 M esterilizada com filtros em PBS e a suspensão foi incubada durante 5 min a 4P°C. (c) A suspensão foi centrifugada a 17000 g duranHte 45 min a 4°C, e em seguida a pastilha doi lavada duas vezes |!com PBS esterilizado a pH 7,2. (d) A pastilha foi ressuspendida jem 50 ml de PBS. (e) Foi adicionado Tiomersal (1%, esterilizado Hpor filtraçao), 0,5 ml, para se obter uma concentração final 'ide 0,01%.
A 100 ml de PBSA esterilizado foram
| (: adicionados | 50 | pl de uma solução a 10% | de Quil | A e | 2 ml de |
| uma mistura | de | lipidos. A mistura foi | agitada a | uma | pressão |
| de 62 KN.m-2 li | e | concentrada para um volume | de 20 ml. | Foi | adicio- |
| iinado PBSA esterilizado para perfazer o | volume a | 200 | ml e o |
volume em seguida foi reduzido para 20 ml. Repetiu-se este procedimento por duas vezes. 0 volume final foi filtrado através de um filtro de 0,45 um.
A preparaçao de antigénio foi adicionada à mistura de Iscom para se obter uma concentração de antigénio ide antigénio 0,25X/ml.
Prepararam-se uma vacina com base em óleo (OBV) e uma de Alhidrogel absorvida em agua (AAV) como (controlo para se obter antigénio ΙΧ/ml e antigénio 0,25X/ml ί
(respectivamente.
! A experiência compreendia 5 grupos num total de 106 ovelhas. Os grupos 1, 2 e 3 foram vacinados (com OBV, AAV e IV respectivamente. Os grupos 4 e 5 constituíam ί — — los controlos, sendo infectados/nao vacinados e nao infectados/ !nao vacinados respectivamente.
í ( A vacina OBV foi administrada apenas iuma vez como dose de 1 ml dada 9 semanas antes das ovelhas serem fecundadas. As outras duas vacinas foram administradas por duas vezes, 9 semanas e 3 semanas antes da fecundação das ovelhas, compreendendo cada injecção uma dose de 2 ml (todas as vacinas forneciam uma carga de 4 fig de proteina ! Chlamydial).
?n
taneamente pescoço.
um
Todas as vacinas foram injectadas subcusitio pequeno tosquiado no lado direito do
As ovelhas dos grupos 1, 2, 3 e 4 foram atacadas com chlamydia viva a 85-90 d. g. 0 grupo 5 nao foi tratado.
No nascimento de cordeiros ou aborto, as placentas, se disponíveis, foram retiradas para amostragem. Foi registada a condição do cordeiro nesta altura (vivo, moribundo ou morto). Nao foi feita tentativa para manter vivos os cordeiros doentes, à parte a administraçao de colostro. A presença ou formaçao de lesões de OEA em placentas foi registada e feita uma estimativa da sua dimensão. Foram examinadas placentas (ou tecidos vaginais) para determinação de corpos de Chlamydia por revelaçao pelo método modificado de Ziehl-Neelsen, e foram cultivadas em células BHK21 tratadas com 5-iododesoxiridina.
Resultados obtidos
Os resultados obtidos mostraram que a vacina de ISCOM proporcionava uma protecção contra a infecção por Chlamydia que era pelo menos tao boa como a proporcionada pelas vacinas convencionais utilizadas na experiência.
EXEMPLO 11: Preparaçao de Iscom do Virus da gripo de equinos
Procedimento: Colocam-se 20 ml de PBSA num frasco universal esterilizado. Adicionam-se 100 μΐ de uma solução a 10% de Quil A. Adicionam-se 400 pl da mistura de lípidos. Adiciona-se um componente de antigénio da gripe de equinos ERIK-14 até uma concentração final de 5 gg/ml. Misturam-se bem a uma velocidade maxima durante 20 segundos. Esteriliza-se a solução fazendo-a passar através de um filtro de 0,2 um (millipore). Decanta-se um pequeno volume para estudos de microscopia electrónica (observação de estruturas de iscom) e observa-se a contaminaçao com bactérias. Armazena-se a + 4°C.
Claims (1)
- Processo para a preparaçao de uma vacina para utilização no homem ou em animais, caracterizado por I (1) preparar-se uma matriz de glicosido e um esterol e (2) !, misturar-se a referida matriz com um antigénio associado com ί uma bactéria ou micoplasma.I • _ 2a i ι ;í jj Processo de acordo com a reivindicação1 1, caracterizado por se incluir adicionalmente um fosfolípido ií na fase (1).N- 3a ||ί. Processo de acordo com a reivindicação ' 2, caracterizado por o fosfolípido ser a fosfatidilcolina.ι _ _Processo de acordo com qualquer das ; reivindicações 1 a 3, caracterizado por o glicosido ser oQuil A.' - 5a Processo de acordo com qualquer das ireivindicações 1 a 4, caracterizado por o esterol ser o colesterol .- 6a íH Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o antigénio ser assoei1 ί ; ado com qualquer uma das seguintes espécies, géneros ou classes de organismos: Mycobacterium, Ciostridium, Rickettsia, Spirochaetes, Escherichia, Staphylococci, Haemophilus, Bordetella,Vibrio, Salmonella, Streptococci, Pasteurella, Legionella, • ι iChlamydia, Pseudomonas, Actinobacillus, Campylobacter, histeria, Mycoplasma bovis, M. gallisepticum, M. agalactiae, M. hyopneumoniae, M. pneumoniae, M. synoviae, M. arthritidis, M. capricolium, M. dispar, M. hominis, M. mycoides subs. capri, M. orale, M. oripneumoniae, M. pulmonis, M. cynos, M. hyorhinis, M. mycoides, M. salvarium e M. fermentans, ou o antigénio compreender o factor de aderência em proteína Coli, de porina
ou outras proteínas de membrana de B. pertussis ou Neisseria meningitidis. - 7a - Processo de acordo com qualquer das 'i reivindicações anteriores, caracterizado por a face (1) compreender preparar-se uma matriz a partir de um glicósido, um esterol, um fosfolipido e um agente solubilizante.| - 8a i Processo de acordo com qualquer das ί reivindicações anteriores, caracterizado por a fase (1) comprei ender obter-se uma matriz a partir de um glicósido, um esterol íi1 e um agente solubilizante escolhido de entre actilglicósido, nonil N-metil glucamida, ureia e guanidina.- 9â Processo de acordo com qualquer das jreivindicações anteriores, caracterizado por o esterol utilizando na fase (1) nao ser o colesterol.j - 10a i l Processo de acordo com a reivindicação9, caracterizado por o esterol ser o lanosterol, lumisterol, | estigmasterol ou sitosterol.- 11a Processo de acordo com as reivindicações ,8, 9 ou 10, caracterizado por a fase (1) compreender prepararΊ-se uma matriz a partir de um glicósido, um esterol e um fosfolipido.- 12ã Processo de acordo com reivindicações anteriores, caracterizado por o associado com Mycoplasma hyopneumoniae.- 13a qualquer das antigenio serProcesso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar um agente solubilizante na fase (1) e ele nao ser removido antes da formaçao da matriz de iscom.- 14â Processo para a preparaçao de um complexo imunogenico compreendendo um antigenio insolúvel em água, caracterizado por se solubilizar o antigenio com um agente solubilizante, misturar-se o antigenio solubilizado, um glicósido e um esterol e obter-se um iscom essencialmente sem a remoção do agente solubilizante.- 15a I Processo de acordo com a reivindicação17, caracterizado por se utilizar adicionalmente um dosfolípido na referida fase da mistura.- 16a P Processo de acordo com a reivindicação1' 15, caracterizado por os iscons serem obtidos em alturas diferentes da ultrafiltração, diálise, ultracentrifugaçao ou métodos cromato gráficos.- 17a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 16, caracterizado por o agente solubilizan24 ί »« _ te ser o desoxicolato de sodio, octilglicósido, nonil N-metil glucamida, N-metil glucamida ou um éter de propileno glicol p-isooctil fenílico com 9 a 10 grupos oxietileno.! - 183 i í! Processo para a preparaçao de uma matriz . de iscom, caracterizado por se misturar um glicósido, um estei rol e um agente solubilizante e obter-se uma matriz de iscomI essencialmente sem a remoção do agente solubilizante.' A requerente reivindica a prioridadeI· do pedido do Reino Unido apresentado em 1 de Setembro de 1989,Íj sob o Ne . 8919819.6.
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