PL168316B1

PL168316B1 - Sposób wytwarzania kompleksu immunostymulacyjnego PL

Info

Publication number: PL168316B1
Application number: PL90308524A
Authority: PL
Inventors: Neill M Mackenzie; Angela M O'sullivan
Original assignee: Mallinckrodt Veterinary Ltd
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1990-08-31
Publication date: 1996-02-29
Also published as: LV10394A; IE903161A1; AU637405B2; EP0415794A1; LV10394B; PL286711A1; CA2064911A1; PT95164A; GB8919819D0; DD297331A5; HU9200666D0; HU214110B; WO1991003256A1; NZ235119A; AU6335590A; YU166790A; HUT61205A; ZA906977B; JPH05500056A; PT95164B

Abstract

1. Sposób wytwarzania kompleksu immunostymulacyjnego (iscom), stosowanego zwlaszcza u swin lub owiec i zawierajacego nierozpuszczalny w wodzie antygen, to jest substancje zdolna do wytwarzania ochronnych przeciwcial lub immunologicznej odpowie- dzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten an- tygen kregowców, polegajacy na (1) przeprowadzeniu antygenu w roztwór za pomoca srodka ulatwiajacego rozpuszczanie, (2) zmieszaniu rozpuszczonego antygenu, glikozydu i sterolu i (3) utworzeniu matrycy iscom, znamienny tym, ze srodek ulatwiajacy rozpusz- czanie pozostawia sie w srodowisku podczas etapów (2) i (3). PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksu immunostymulującego iscom, zawierającego nierozpuszczalny w wodzie antygen do stosowania u ludzi lub zwierząt, zwłaszcza u świń lub owiec.

Profilaktyczne uodpornianie zwierząt przeciwko drobnoustrojom polega na podawaniu antygenu związanego z drobnoustrojem, w połączeniu z materiałem, który zwiększa powstawanie przeciwciał i/lub komórkową odpowiedź immunologiczną antygenu u zwierzęcia. Materiał taki zwany jest adiuwantem. Jedynymi adiuwantami dopuszczonymi obecnie do stosowania u ludzi i świń w wielu krajach są wodorotlenek glinu i fosforan glinu. Jakkolwiek te adiuwanty są dla wielu szczepionek wystarczające, badania wykazały, że pełny adiuwant Freunda (FCA) lub Quil A (znany również jako saponina) są często skuteczniejsze w wywoływaniu odpowiedzi z wytworzeniem przeciwciał (to znaczy odpowiedzi typu humoralnego) oraz odporności komórkowej, ale niestety adiuwanty te mogą wywołać u zwierząt niepożądane reakcje po szczepieniu

W europejskich opisach patentowych EP-A-0 109 942 i EP-A-0 180 564 opisano uodporniające kompleksy utworzone między glikozydami takimi jak triterpenoidowe sapomny (zwłaszcza Quil A) a zawierającymi część hydrofobową antygenami. Te immunostymulujące kompleksy nazwano iscom. Dla wywołania tego samego efektu antygenowego ilość Quil A w iscom może być około 10 do 100 razy mniejsza niż kiedy Quil A jest z antygenem zmieszany. Iscomy nie wywołują niepożądanych reakcji, które występują przy Quil A.

W europejskim opisie patentowym EP-A-231 039 wykazano, że obecność antygenu nie jest konieczna dla wytworzenia podstawowej struktury iscom, zwanej dalej matrycą iscom i że możliwe jest utworzenie matrycy ze sterolu, takiego jak cholesterol, fosfolipidu takiego jak fosfatydyloetanoloamina i glikozydu takiego jak Quil A. Jednakże nie zastrzeżono, że takie matryce są użyteczne jak adiuwanty; wspomniano o nich jedynie mimochodem w celu wykazania, ze struktury typu iscom mogą powstawać bez obecności antygenu.

Nieoczekiwanie okazało się, ze takie puste matryce można stosować w celu uzyskania działania adiuwantu przez dodanie ich do antygenów bakterii i mykoplazm, które nie stają się częścią matrycy iscom.

168 316

Ponadto we wszystkich cytowanych w stanie techniki opisach w przypadku stosowania nierozpuszczalnego w wodzie antygenu przeprowadza się go w roztwór za pomocą detergentu i następnie po zmieszaniu z glikozydem i tak dalej, w celu wytworzenia matrycy iscom, detergent usuwano na przykład przez dializę. Nieoczekiwanie okazało się, że iscom tworzący się w obecności detergentu jest niezbędny. W ten sam sposób tworzy się matryca iscom.

Sposób według wynalazku dotyczy wytwarzania kompleksu immunostymulacyjnego (iscom), stosowanego zwłaszcza u świń lub owiec, zawierającego nierozpuszczalny w wodzie antygen, polega na (1) przeprowadzeniu antygenu w roztwór za pomocą środka ułatwiającego rozpuszczanie, (2) zmieszaniu rozpuszczonego antygenu, glikozydu i sterolu i (3) utworzeniu matrycy iscom, przy czym nowość polega na tym, że środek ułatwiający rozpuszczanie pozostawia się w środowisku podczas etapów (2) i (3).

W sposobie tym, korzystnie, w stadium zmieszania wprowadza się dodatkowo fosfolipid.

Korzystnie, kompleksy iscom tworzy się na innej drodze niż przez ultrafiltrację, dializę, ultrawirowanie lub metodami chromatograficznymi.

Jako środek ułatwiający rozpuszczenie korzystnie stosuje się dezoksycholan sodowy, oktyloglukozyd, nonylo-N-metyloglukamid, dekanoilo-N-metyloglukamid lub eter p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego zawierający 9 do 10 grup oksyetylenowych.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się antygen związany z Mycoplasma hyopneumoniae.

Ewentualnie wytworzone roztwory kompleksów immunogennych liofilizuje się. Preparaty liofilizowane przed użyciem odtwarza się przez dodanie wody.

Z kompleksów immunogennych wytworzonych według drugiego wariantu wynalazku można wytwarzać kompozycje farmaceutyczne. W tym celu kompleksy immunogenne wytwarza się w postaci odpowiedniej do podawania pozajelitowego, korzystnie do iniekcji i szczególnie korzystnie do iniekcji podskórnych lub domięśniowych.

Na ogół w kompozycjach farmaceutycznych immunogenne kompleksy znajdują się w wodnym, fizjologicznie zgodnym środowisku, które ewentualnie zawiera bufor i/lub sól taką jak chlorek sodowy dla uzyskania odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Sposoby te są specjalistom dobrze znane.

Pod pojęciem zwierzę rozumie się kręgowca z wyłączeniem człowieka, korzystnie ssaka takiego jak krowa, Świma, owca, koza, koń, pies lub kot.

Pod pojęciem antygen rozumie się substancję zdolną do wytwarzania ochronnych przeciwciał lub immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten antygen kręgowców'. Antygen jest w całości lub częściowo białkiem, glikoproteidem, glikolipidem, polisacharydem lub lipolisacharydem, który jest związany z bakterią lub mykoplazmą lub jest ewentualnie polipeptydem lub inną substancją, która naśladuje całość lub część takiego białka, glikoproteidu, glikolipidu, polisacharydu lub lipopolisacharydu. Ponieważ antygen nie jest wbudowywany w matrycę iscom w czasie jej tworzenia, nie jest konieczne, aby zawierał on fragment hydrofobowy lub żeby był połączony z grupą hydrofobową, jak to ma miejsce w sposobach cytowanych w stanie techniki. Bakteria lub mykoplazma jako takie nie muszą być obecne w szczepionce, ale mogą obniżyć koszt szczepionki jeśli stosuje się całe komórki, na przykład Haemophilus pleuropneumoniae, zamiast ekstraktów'.

Do pojęcia mykoplazma włączono również blisko spokrewnione organizmy znane jako ureaplazmy i acholeplazmy.

Choroby bakteryjne obejmują choroby wywołane przez Mycobacterium ( na przykład M. tuberculosis i M. bovis), Clostridium (na przykład C. welchii), Rickettsia, Spirochaetes (na przykład Treponema pallidum lub Leptospira pomona), Escherichia (na przykład E. coli), Staphylococci (na przykład S. aureus), Haemophilus (na przykład H. influenzae i H. pleuropneumoniae), Bordetella (na przykład B. petrussis), Vibrio (na przykład V cholerae), Salmonella (na przykład S. typhi i S. paratypN), Streptococci (na przykład S. agalactiae), Neisseria (na przykład N. gonoirhea), Pasteurella (na przykład P. multocido), Legionell (na przykład L pneumoniae), Chlamydia (na przykład C. psittaci), Pseudomonas (na przykład P. malkac),

168 316

Actinobacillus (na przykład A. pleuropneumoniae), Campylobacter (na przykład C. jejuni) i Listeria (na przykład L. monocytogenes), Brucella (na przykład B. abortus), Corynebacterium (na przykład C. diptheriae), Yersinia (na przykład Y. pseudotuberculosis), Pneumococci (na przykład Streptococcus pneumoniae), Bacillus (na przykład B. anthracis), Klebsiella (na przykład K. pneumoniae), Shigella (na przykład S. dysenteriae) i Actinomycetes (na przykład Nocardia asteroides).

Korzystnie bakteria oznacza Mycobacterium (na przykład M. tuberculosis), Clostridium (na przykład C. welchii), Rickettsia, Spirochaetes (na przykład Treponema pallidum), Escherichia (na przykład E. coli), Staphylococci (na przykład S. aureus), Haemophilus (na przykład H. influenzae i H. pleuropneumoniae), Bordetella (na przykład B. petrusis), Vibrio (na przykład V. cholerae), Salmonella (na przykład S. typhi i S. paratyphi), Streptococci (na przykład S. agalactiae), Neisseria (na przykład N. gonorrhoea), Plasteurella (na przykład P. multocida), Legionella (na przykład L. pneumoniae), Pseudomonas (na przykład A. pleuropneumoniae), Campylobacter (na przykład C. jejuni), Listeria (na przykład L. monocytogenes). Niektóre antygeny zawierają czynnik adherencyjny (adherence factor) w Coli, na przykład fimbrie K 88 (pili K 88), białko porin (porin protein), w, na przykład Salmonella oraz białka zewnętrznej błony z B. pertussis i Neisseria meningitidis.

Korzystnie stosuje się taki antygen, który nie będzie tworzył tradycyjnego iscom, na przykład taki jak opisano w europejskich opisach patentowych EP-A-109942 i EP-A-180-564.

Szczególnie korzystne jest szczepienie świń.

Jako mykoplazmy mające zastosowanie w weterynarii stosuje się Mycoplasma bowis, M. gallisepticum, M. agalacitiae, M. hyopneumoniae, M. pneumoniae, M. synoviae, M. arthritidis, M. capricolium, M. dispar, M. hominis, M. mycoides subs, capri, M. orale, M. orinpneumoniae, M. pulmonis, M. cynos, M. hyorhinis, M. mycoides, M. salvarium i M. fermentans.

Matrycę iscom wytwarza się sposobem ujawnionym w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231 039, to znaczy przez zmieszanie razem przeprowadzonego, przy użyciu substancji ułatwiających rozpuszczanie, w roztwór sterolu, glikozydu i (ewentualnie) fosfolipidu. Środka ułatwiającego rozpuszczanie nie usuwa się przed następnym etapem sposobu. W europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231 039 na fig. 1 przedstawiono obraz iscom otrzymanego z Quil A, cholesterolu i fosfatydyloetanoloaminy uzyskany w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 116 000 razy. Jeśli nie używa się fosfolipidów tworzą się struktury dwuwymiarowe. Przykład takiej struktury znajduje się na fig. 2 w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231 039. Przedstawiono tam uzyskany w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 146 000 razy obraz struktury otrzymanej z Quil A i cholesterolu.

Termin matryca iscom używany jest zarówno w odniesieniu do struktur trójwymiarowych jak i dwuwymiarowych.

W sposobie według wynalazku stosuje się ewentualnie takie same glikozydy jak wymienione w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 109 942 i w europejskim opisie patentowym nr EP-A-0 231 039. Na ogół stosuje się glikozydy wykazujące własności amfipatyczne i zawierające w cząsteczce obszary hydrofobowe i hydrofilowe. Korzystnie stosuje się saponiny, zwłaszcza ekstrakt saponin z Quillaja saponaria Molma przede wszystkim DQ-ekstrakt wytworzony według K. Dalsgard: Saponin Adjuvants. Bull. Off In., Epiz. 77 7-8, 1289-1295 (1972) i Quil A, również wytworzony według K. Dalsgard: Saponin Adjuvants III Archiv fur die gesamte Virusforschung 44, 243-1254 (1974). Innymi korzystnymi saponinami są aescine Aesculus hippocastanum (T. Patt i W. Winkler. Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskoatanie/Aesculus hippocastanum) Arzneimittelforschung 10 (4) 273-275 (1960) i sapoalbin z Gypsophilla struthium (R. Vochten, P. Joos i R. Ruyssen: Physicochemical Properties of sapoalbin and their relation to the foam stability. J. Pharm. Belg. 42 213-226 (1968). Szczególnie korzystne jest stosowanie Quil A.

W sposobie według wynalazku stosuje się glikozydy co najmniej w stężeniu krytycznym dla tworzenia micelli W przypadku Quil A stężenie to wynosi około 0,03% wagowo. Na ogół, stosunek molowy glikozydu (zwłaszcza w przypadku Quil A) do sterolu (zwłaszcza w przy168 316 padku cholesterolu) do fosfolipidu wynosi 1:1:0-, ±20% (korzystnie nie więcej niż 10%) dla każdego układu. Odpowiada to stosunkowi wagowemu Quil A do cholesterolu około 5:1.

W sposobie według wynalazku stosuje się znane sterole pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego, takie jak cholesterol, lanosterol, lumisterol, stigmasterol i sitosterol. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się jako sterol cholesterol.

Korzystne jest użycie fosfolipidu, ponieważ tworzą się w tym przypadku trójwymiarowe struktury iscom. Zwłaszcza jako fosfolipidy stosuje się fosfatydylocholinę i fosfatydyloetanoloaminę.

Według wynalazku stosuje się określony wyżej antygen, z tym, że może on być związany z grzybem, pasożytem takim jak pierwotniaki i robaki lub wirusem zamiast właściwej mykoplazmy lub bacterii.

Jako grzyby chorobotwórcze stosuje się Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp. i Dermatophilus spp.

Jako pasożyty chorobotwórcze stosuje sie pasożyty wymienione w europejskim opisie patentowym nr EP-A-109942.

Jako wirusy chorobotwórcze stosuje się wirusy wymienione w europejskim opisie patentowym nr EP-A-109942. Wiele z nich ma osłony, z których ekstrahuje się odpowiednie antygeny. Zwłaszcza stosuje się wirusy takie jak wirus grypy koni, wirus opryszczki koni, wirus wirusowej biegunki bydła, coronawirus, parvowirus, wirus białaczki kotów, wirus niedoboru odpornościowego kotów i wirus wirusowego zapalenia tętnic.

Jako środki ułatwiające rozpuszczanie stosuje sie takie, jak wymieniono w europejskim opisie patentowym nr EP-A-109942 lub EP-A-0 231 039, na przykład detergent, mocznik lub guanidynę.

Na ogół używa sie w tym celu niejonowe, jonowe lub obojnacze detergenty lub detergenty oparte na kwasie cholowym, takie jak dezoksycholan sodowy. Korzystnie, jako detergent stosuje się oktyloglukozyd, nonylo-N-metyloglukamid lub dekanoilo-N-metyloglukamid, ale alkilofenylopolioksyetylenowe etery mogą również być stosowane, zwłaszcza p-izooktylofenylowy eter polietylenoglikolu mający 9 do 10 grup oksyetylenowych, dostępny w handlu pod handlową nazwą Triton X-100R.

Poniższe przykłady bliżej ilustrują wynalazek nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I ilustruje sposób według wynalazku, mianowicie solubilizuje się antygen (za pomocą środków ułatwiających rozpuszczanie z mieszaniny lipidowej), a następnie miesza się go z glikozydem (Quil A) i sterolem (cholesterol w mieszaninie lipidowej), w wyniku czego tworzy się kompleks iscom (nie sama matryca) bez usuwania środka ułatwiającego rozpuszczanie. Przykład II również ilustruje sposób według wynalazku. Skrót PBSA użyty w przykładach oznacza solankę buforowaną fosforanem (produkcji Dulbecco A).

Przykład I.

Wytwarzanie kompleksu immunostymulacyjnego (iscom) z wirusa końskiej grypy.

W wysterylizowanej uniwersalnej kolbie umieszcza się 20 ml PBSA. Dodaje się 100 (tl 10%o roztworu Quil A i 400 gl mieszaniny lipidowej, opisanej szczegółowo w przykładzie II. Następnie dodaje się składnik antygenu końskiej grypy ERIK-14 do końcowego stężenia 5 tg/ml. Miesza się wirowo z pełną szybkością w ciągu 20 sekund. Sterylizuje się roztwór przez przepuszczenie przez fil^tr 0,2 gm (Millipore). Dekantuje się małą ilość do badań pod mikroskopem elektronowym (obserwacja struktur iscom) i sprawdzenia zanieczyszczenia bakteryjnego. Przechowuje się w temperaturze +4°C

Przykład II.

Sposób wytwarzania kompleksu immunostymulacyjnego (iscom), zawierającego nierozpuszczalny w wodzie antygen.

Materiały stosowane w przykładzie:

Wyjałowiona, buforowana fosforanem solanka A (PBSA) produkcji Oxoid

Quil A (patrz niżej)

Mieszanina lipidów (patrz niżej).

1. Sporządzanie Quil A.

168 316

Sporządza się zapasowy 10% roztwór Quil A. 1 g Quil A (produkcji Superfos, Dania) dodaje się do 10 ml wyjałowionej wody destylowanej i dokładnie miesza się. Taki zapasowy roztwór można przechowywać w temperaturze 4°C.

2.1. Materiały:

1) Chloroform (produkcji Analar)

2) Cholesterol (Gatunek I z wątroby wieprzowej, produkcji Sigma)

3) α-fosfatydylocholina (produkcji Sigma)

4) Mega 10 (produkcji Sigma) -(dekanoilo-N-metyloglukamid)

5) Wyjałowiona woda destylowana.

2.2. Sposób:

a) Sporządza się 20% wag./obj. roztwór Mega 10 w wyjałowionej, destylowanej wodzie, to jest odważa się 2 g Mega 10 i rozpuszcza się w 10 ml wody,

b) Odważa się 50 mg cholesterolu i dodaje do 50 mg fosfatydylocholiny,

c) Dodaje się 2 ml chloroformu do powyższego roztworu,

d) Dodaje się 10 ml 20% wag./obj. roztworu Mega 10,

e) Pozostawia się całość z mieszadłem magnetycznym i odkrytą pokrywką naczynia na 2 godziny w komorze cieplnej w temperaturze 37°C,

f) Przenosi się całość na noc do urządzenia szafkowego z przepływem laminamym, kontynuując mieszanie,

g) Następnego dnia mieszaninę umieszcza się w komorze cieplnej, z mieszadłem, aż do uzyskania przezroczystego roztworu,

h) Przechowuje się w temperaturze pokojowej.

Sposób wytwarzania matrycy iscom.

Do 20 ml PBS-A w uniwersalnej, wyjałowionej butelce z tworzywa, dodano 100 pl 10% roztworu Quil A, następnie 400 pl mieszaniny lipidów (dla Iscom 47) lub 200 (tl 10% roztworu Quil A i 800 (tl mieszaniny lipidów (dla Iscom 48). Mieszaninę następnie poddano mieszaniu przy pełnych obrotach w urządzeniu Whirlymixer w ciągu 10 sek. Następnie roztwór przepuszczono przez filtr 0,2 pm (Millipore) dla zapewnienia sterylności.

Kontrola jakości.

Otrzymane preparaty Iscom oglądano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM) po negatywnym barwieniu octanem uranylu.

Wyniki.

Preparaty Iscom 47 i Iscom 48, wytwarzane powyższym sposobem, zawierały dobre matryce iscom, nie różniące się przy oglądaniu pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM) a sposób widoczny w strukturze od iscom wytwarzanych metodami standardowymi, które wymagają etapu dializy lub difiltracji.

168 316

Fig. 2

ISCOM 48 ;y;r?

C · ·''·'·.··-· ' ' A, r ·-<.·

S',,\ . ‘ -.· 1 '

Γ- · ,·' - ; ·· ;

\ -^v · £ ·,'/<,Έ, -i« ·; Ά'.

i-·⁵-λ- · - »U,·' f,· -! ' ’ -,’A ' (A. L._.. W ? * » .-•••Λ.- .

. ·. Ϊ 1 fi-· .·* · γλ ' .? <>:, , « Ί ί & ·*·» • > *·»£'.

·**.

. . ł· «**«*·.

Α’ΐ-νν· .

Cn*<-- ź\Ł,· .·' u ‘ ,

-'Hi i⁴ z *'* >. ·} : -·/· ?>.’:· -...- u* ’

... i ·.

'Λ ó '·· * .

·- . ⁴ ''irtrZiAł·.. ’ ·- xw. S - f ·

o *.« * **« ¹ .· z -J.

·= 'u/

¹ ' *Λ .:·* ‘ j. V, - — 4. r<Łr.

Ή.·. - iyyai· • · L 3'

-2-./·

- '••'''••frereY'·'· .-2-4.7)4-¾%

168 316

Fg.1

ISCOM 47

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kompleksu immunostymulacyjnego (iscom), stosowanego zwłaszcza u świń lub owiec i zawierającego nierozpuszczalny w wodzie antygen, to jest substancję zdolną do wytwarzania ochronnych przeciwciał lub immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego przeciwko bakteriom lub mykoplazmie u eksponowanych na ten antygen kręgowców, polegający na (1) przeprowadzeniu antygenu w roztwór za pomocą środka ułatwiającego rozpuszczanie, (2) zmieszaniu rozpuszczonego antygenu, glikozydu i sterolu i (3) utworzeniu matrycy iscom, znamienny tym, ze środek ułatwiający rozpuszczanie pozostawia się w środowisku podczas etapów (2) i (3).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w stadium zmieszania wprowadza się dodatkowo fosfolipid.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako środek ułatwiający rozpuszczenie stosuje się dezoksycholan sodowy, oktyloglukozyd, nonylo-N-metyloglukamid, dekanoilo-N-metyloglukamid lub eter p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego zawierający 9 do 10 grup oksyetylenowych.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się antygen związany z Mycoplasmahyopneumoniae.