PT95478B

PT95478B - Processo para a solucao de peptidos e processo para a sinteswe de peptidos

Info

Publication number: PT95478B
Application number: PT95478A
Authority: PT
Inventors: Jean-Marie Bernard; Kamel Bouzid; Christian Gervais
Original assignee: Rhone Poulenc Chim Base
Priority date: 1989-10-02
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 1997-07-31
Also published as: JPH08311095A; DD299189A5; IE903511A1; JP2579699B2; US5712367A; ES2071058T3; CA2026655C; EP0421848A1; DK0421848T3; ATE118219T1; EP0421848B1; JPH03204894A; PT95478A; DE69016732T2; DE69016732D1; FR2652581A1; FR2652581B1; IE67453B1; GR3015802T3; CA2026655A1

Description

RHÔNE-POULENC CHIMIE

PROCESSO PARA Ã SOLUBILIZAÇÃO DE PÉPTIDOS E PROCESSO

PARA A SÍNTESE DE PÉPTIDOS

A presente invenção diz respeito a um processo para a solubilização de péptidos. Diz igualmente respeito a um processo para a síntese de péptidos em fase líquida.

Existe um grande número de métodos de síntese de péptidos descritos na literatura. Todos têm pontos comuns de base que consistem:

- em proteger a função da cadeia lateral de um aminoãcido por um grupo protector clivãvel no fim da síntese do péptido,

- em proteger a função amida (N^) do dito aminoácido com um grupo protector clivãvel depois da condensação do aminoácido,

- em activar a função ácido carboxílico do dito aminoácido protegido e em condensar depois com um aminoácido ou um péptido cuja função C terminal está protegida e cuja função amina está livre,

- em se obter o péptido mediante desprotecção total dos grupos protectores depois da condensação de todos os aminoácidos.

t?

-2-Os diversos métodos de síntese distinguem-se pelo estado físico da fase onde teve lugar a síntese: fase líquida ou fase sólida.

Os métodos de síntese ditos em fase líquida consistem em realizar todas as reacções em fase homogénea.

No método descrito por Bodansky e du Vigneaud em Journal of American Chemical Society 81, 5688-5691 (1959) protege-se o aminoácido com um grupo metílico e condensam-se os aminoácidos sucessivos passo a passo após protecção da sua função amina com um grupo benzil-oxicarbonilo e activação da sua função carboxílica com um éster nitrofenílico. Os intermediários sucessivos são purificados mediante precipitação ou lavagens. Esta técnica requer um elevado número de etapas de síntese delicadas ou longas que levam inevitavelmente a uma importante perda de compostos; é assim que Schwyzer e Sieber (Helvetica Chemica Acta, 49, 134-158, 1966) obtêm por esta técnica um rendimento para o ACTH de somente 6,85%.

A síntese descrita por Beyermann e Colab. (Rec. Trav. Chim. Pays Bas, 92, 481, 1973) consiste em aplicar o método de_s crito anteriormente, a partir de um aminoácido ou de um péptido cujo grupo carboxílico está protegido por um grupo benzílico e em realizar as ligações na presença de um excesso de anidrido do aminoácido protegido, de modo a aumentar os rendimentos. 0 número de operações é tão elevado como no processo anterior e o péptido formado perde frequentemente a sua solubilidade em meio orgânico desde que o número de aminoácidos ultrapasse quatro ou

3cinco.

Certos métodos de síntese em fase líquida utilizam agen tes protectores solubilizantes do aminoácido ou do péptido inicial mais sofisticados; assim a patente de invenção europeia ns 0 017 536 menciona como grupo protector o grupo fenilazobenzil-sulfoniletiloxi (OPSE). Este grupo permite a solubilização dos péptidos formados no seio da dimetilformamida e a sua insolubil_i zação, quer em água quer em outros dissolventes orgânicos. A sín tese faz-se sempre passo a passo com precipitação de cada intermediário péptidico formado antes da adição de um novo amino ácido, o que põe problemas ao nível da filtração dos compostos sólidos. Este processo, como o conjunto dos processos anteriormente descritos, não permite manter em solução péptidos com um grande número de aminoãcidos.

Entre os processos em fase líquida, pode-se citar ainda os processos em que o aminoácido é mantido em solução mediante utilização de um polímero linear não reticulado, tal como o polietilenoglicol [Mutter e Bayer, Nature 237, 512 (1972)], sen do os sub-produtos eliminados mediante ultracentrifugação ou me diante precipitação.

Entre os métodos de síntese ditos em fase sólida, pode-se citar a técnica descrita por Merrifield em 1963 em Journal of American Chemical Society 85, 2149-2154, que consiste em fixar a função carboxílica C-terminal do primeiro aminoácido ou do primeiro grupo peptídico sobre um suporte insolúvel. As liga ções e as lavagens podem ser padronizadas de modo a tornar o pro ·»» cesso automatizável. Esta técnica permanece até hoje muito dispendiosa, visto que é necessário utilizar reagentes em grande excesso de modo a conter todas as cadeias peptídicas durante a síntese em um tempo razoável. A pureza e a homogeneidade dos pejo tidos formados está ainda longe de ser a ideal, devendo os subprodutos formados por cadeias peptídicas incompletas ser elimina dos uma vez terminada a reacção. Com efeito, a purificação no estádio intermediário é impossível, enquanto no estádio final ê difícil, visto que necessita de uma aparelhagem complicada e de uma técnica sofisticada, por conseguinte dispendiosa tal como a cromatografia líquida de alta pressão preparativa.

A exploração desta tecnologia no estádio industrial conti nua um problema não resolvido até hoje, em virtude das dificuldades de utilização de grandes quantidades de resinas, quer em reac tor agitado, quer em leito fixo.

A presente invenção permitiu resolver uma grande parte dos problemas deixados em suspenso na técnica anterior.

Descobriu-se agora um processo de solubilização de pépti. dos que pode permitir a sua síntese em fase líquida não aquosa e a sua purificação.

processo de solubilização de péptidos eventualmente pro tegidos ou salificados, no seio de um dissolvente orgânico não mi_s cível com a água, é caracterizado pelo facto de se ligar o grupo C. terminal do dito péptido por intermédio de uma ligação amida

-5ou éster a um grupo lipófilo, obtendo-se quando se liga este úl timo à L-serina uma molécula cuja solubilidade em água a 25°C é inferior a 30g/litro, sendo este grupo lipófilo quimicamente definido e não polimérico.

grupo lipófilo, que vai permitir a síntese peptídica em fase líquida orgânica não miscível com a ãgua, é de preferência constituído por duas entidades A e L ligadas entre si por uma ligação covalente e ligadas ao péptido de modo covalente por intermédio da entidade A:

Péptido-CO-A-L

A entidade -A- representa um braço de ligação bifuncional entre o péptido em curso de síntese e grupo L.

grupo L representa a parte lipófila da entidade A-L. Es_ te grupo L ê não em caso algum polimérico. É de preferência um grupo hidrocarbonado comportando eventualmente halogéneos; corres ponde à fórmula geral:

-C, .N_ZJ,S, , Si.-,Χ, .

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) na qual:

- a representa um número inteiro compreendido entre 1 e 50, b representa um número inteiro compreendido entre 3 e 101,

-6ί Λ

- c representa um número inteiro compreendido entre 0 e 6,

- d representa um número inteiro compreendido entre 0 e

2z

- e representa um número inteiro compreendido entre 0 e

2,

- f representa um número inteiro compreendido entré 0 e 2,

- g representa um número inteiro compreendido entre 0 e

20,

- X representa um átomo de halogéneo escolhido entre o flúor, o cloro e o bromo.

Entre o conjunto dos compostos que podem representar o gru po L preferem-se aqueles em que o símbolo a representa um número inteiro superior a 6 e mais preferencialmente superior a 12, assim como aqueles èm que o símbolo g representa um número inteiro superior a 2.

grupo A que, como definido anteriormente, representa o braço de ligação bifuncional, comporta em uma das suas extremida des pelo menos uma função álcool ou amina (B) e na outra extremi dade uma função carbonilo ou uma função éter. Pode ser represen tado pela seguinte fórmula geral:

na qual:

- B representa um grupo hidroxi ou amino,

- Ar representa um radical aromático mono ou policíclico,

- R^ representa uma ligação covalente, um radical alquiLe no comportando 1 a 4 átomos de carbono eventualmente subs tituído por um radical fenilo, um grupo alquilenocarboni. lo,

- R2 representa uma ligação covalente, um radical alquileno comportando 1 a 4 átomos de carbono eventualmente subs. tituído, oxialquileno comportando 1 a 4 átomos de carbono na cadeia alquileno, um átomo de oxigénio,

- K, m,e n representam números inteiros iguais a 0 ou 1,

- p representa um número inteiro igual a 1 ou 2.

É evidente da leitura da presente descrição que as duas entidades A e L podem formar um só grupo respondendo às fórmulas gerais:

B-R^Ar' ou

B-CH (3-q)

-Ar (q)

em que:

- B e R^ têm os significados definidos antes,

- Ar' representa um radical aromático policíclico,

- Ar representa um radical benzénico e q representa um número inteiro igual a 2 ou 3.

Entre os grupos A, podem-se citar, os seguintes grupos de fórmulas:

-ho-ch₂- — o-ch₉-co-

HO-CH„ -(O

o-ch₂-coHO-CH,

CH₂-CH₂-COHO-CH

HO-CH,

CH₂-COΎ i

’ν

HO-CH₂-CO-O-

na qual:

- e D₂ representam, cada um, um grupo igual ou diferente escolhido entre os radicais ou átomos 0 ; CO ; CH₂O ; CH₂CO ; OCO ou D₂ representa um ãtomo-de hidrogénio;

-10,χ

na qual e têm os signi ficados definidos antes;

na qual e têm os signjL ficados definidos antes;

✓

Pode-se citar entre os grupos lipofilos - L os grupos de fórmulas seguintes:

co-0-ch₂

O-D

D3OCO Y coo-d₃ em que representa um radical alquilo comportando 1 a átomos de carbono;

CO-O-D₄ na qual representa um grupo arilo ou aralquilo;

-ι>

O-CH₂ —7 \

Q--co—(o

V

14Os dissolventes em que os péptidos são solubilizados gra ças a sua ligação ao grupo lipófilo são dissolventes orgânicos não miscíveis com a agua, tais como os derivados alifãtcos halo genados, em particular o cloreto de metileno, os derivados aromáticos tais como o anisol ou o clorobenzeno, os ésteres tais co mo o acetato de etilo.

processo de solubilização permite aumentar notavelmente a solubilidade dos péptidos em fase orgânica.' Permite, por exemplo, obter soluções homogéneas de concentração superior ou igual a 50g/litro.

Uma outra vantagem do presente processo provém do facto de os péptidos ligados aos grupos A-L anteriormente definidos , terem um elevado coeficiente de divisão em favor da fase orgânica quando da decantação na presença de água.

Esta propriedade pode utilizar-se, com vantagem, para pu rificar os péptidos mediante lavagens aquosas.

A presente invenção diz igualmente respeito a um processo de síntese de péptidos eventualmente protegidos, em meio líqui. do, caracterizado pelo facto de se partir de um aminoácido ou de um péptido solubilizado em meio orgânico por um grupo A-L, tal co mo definido anteriormente, ligado ã função carboxílica do aminoãcido ou do péptido inicial e de se adicionar os aminoácidos ou péptidos a condensar activados sobre a sua função ácido e protegidos sobre a sua função amina e, eventualmente, sobre a sua cadeia lateral.

yl5A protecção da função amina dos aminoácidos pode efectuar-se mediante substituição de um átomo de hidrogénio desta função por um grupo tal como o butiloxi terc.-carbonilo ou pela formação de sais de DANE, por exemplo mediante reacção da função amina com um composto beta-dicarbonilado.

A activação do péptido ou do aminoácido N-protegido realiza-se mediante formação, quer de um anidrido misto com um cloreto de ácido, quer de um anidrido misto com um cloroformato de alquilo, quer de um anidrido simétrico com uma carbodiimida, quer de um éster activado de acordo cora uma técnica clássica de síntese, quer mediante qualquer outra técnica de activação de um amino ácido N-protegido.

Uma vantagem do processo de acordo com a presente invenção reside no facto de ela permitir uma síntese produtiva e repe titiva, em meio orgânico, onde o péptido ligado à molécula lipófila A-L, definida anteriormente, se mantém sempre em solução . Cada intermediário péptido-A-L, N-protegido ou não, é mantido so lúvel no meio orgânico.

Uma outra vantagem importante do processo de acordo com a presente invenção, é que ele permite eliminar da fase orgânica os reagentes em excesso e os co-produtos da síntese, mediante simples lavagem com água:

- depois da etapa de condensação, os compostos tais como o excesso de. aminoácidos activadós; ou de· pé.ptidos-acti vados, os ácidos ou álcoois ou qualquer outro sub-pro16duto da reacção que não esteja ligado ã cadeia peptídi ca sintetizada;

- depois da etapa de desprotecção, os agentes de desbloqueio das funções pretendidas e os co-produtos da reac ção de corte do grupo N-protector.

Este processo evita assim todas as etapas de purificação mediante precipitação, necessárias na técnica anterior.

seguimento da pureza do péptido durante a síntese é pos. sível a qualquer momento, mediante simples colheita e análise por qualquer técnica tal como a cromatografia líquida de alta resolução, a ressonância magnética nuclear do protão ou do carbono, a potenciometria, a espectrometria de massa, etc.

Devido ã semelhança das etapas de condensação e de despro tecção, quando da adição de cada um dos aminoãcidos, o processo de acordo com a presente invenção permite a síntese dos péptidos de acordo com um modo operatório repetitivo.

Devido â repetitividade da síntese, o processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado com vantagem sob uma forma automatizada.

Por fim, uma vez terminada a síntese da sequência inicial do péptido, liberta-se o péptido dos seus grupos protectores e do grupo solubilizante A-L mediante hidrólise, hidrogenólise ou mediante qualquer outro método de desprotecção utilizado em síntese

peptídica.

Este processo ê particularmente interessante? para a síntese de péptidos hidrófilos ou portadores de grupos hidrófilos, co mo por exemplo os que comportam na sua cadeia os seguintes amino ácidos: a arginina, a glutamina, a asparagina, a serina, a treonina, a glicina.

Os péptidos resultantes da síntese são eventualmente utilizados para a preparação de medicamentos, vacinas, produtos agro-alimentares ou fitossanitãrios.

A presente invenção será mais completamente descrita com a ajuda dos exemplos seguintes que não devem ser considerados como li. mitativos da mesma.

I- SÍNTESE DOS REAGENTES QUE PERMITEM OBTER OS GRUPOS SOLUBILIZANTES A-L

EXEMPLO 1: Preparação do 3-clorometil-benzoato de 4-fenil-benzilo

Em um balão de três tubuladuras de 500 ml, introduzem-se sucessivamente:

- 40 g (0,217 mole) de bifenilmetanol

150 ml de tolueno

-18- 42,9 g (0,227 mole) de cloreto de 3-clorometil-benzoí^ lo.

Agita-se e aquece-se a mistura reaccional a 40°C.

Adicionam-se então no decurso de 10 minutos 25 ml (0,277 mole) de N-metilmorfolina.

A temperatura do meio reaccional eleva-se espontaneamente para 60°C e aquece-se depois até 80°C durante 2 horas e 30' minutos.

Despeja-se a mistura reaccional final em uma ampola de de cantação, dilui-se até 1 litro mediante adição de acetato de etilo, lava-se depois sucessivamente com 450 ml de ãcido clorídrico normal 400 ml de uma solução aquosa normal de hidrogenocarbonato de sódio e, depois, com ãgua até à neutralidade.

A destilação dos dissolventes conduz a um resíduo sólido que se cristaliza de quente a frio em 1,6 litros de metanol.

O 3-clorometil-benzoato de 4-fenil-benzilo obtém-se deste modo com um rendimento de 81% (59,5 g), sob a forma de um composto sólido branco com um ponto de fusão de 102°C.

A sua estrutura foi estabelecida mediante espectrometria de massa e de RMN do protão (360 MHz).

< -19-

A análise mediante cromatografia em camada fina (CCM) sobre placa de sílica Merck 60F 254 revela uma única mancha em cada um dos dois sistemas de eluentes ensaiados:

acetato de etilo/ciclo-hexano (2/5) Rf=0,7 hexano/acetona (4/1) Rf= 0,6

EXEMPLOS 2 a 14

Procedendo de acordo com o processo descrito no exemplo 1, preparam-se os seguintes compostos.

Exemplo 2

3-clorometil-benzoato de 3-fenoxi-benzilo

Aspecto: óleo

Rendimento: 9 4 %

Exemplo 3:

3-clorometil-benzoato de 9-metileno-antracilo.

Aspecto: sólido com um ponto de fusão de 148°C (recristalização em metanol).

Rendimento: 82% /20 i.

Exemplo 4

Exemplo

3-bromometil-benzoato de 4-fenil-benzilo

Aspecto: sólido com um ponto de fusão de 63-65°C.

Rendimento: 2 6 %

3-clorometil-benzoato de 4-butil-terc.-benzilo

Aspecto: óleo

Rendimento: 47%

3-clorometil-benzoato de 2,4-dicloro-benzilo

Aspecto: sólido com um ponto de fusão de 75°C (recristalização em acetona + água)

Rendimento: 7 5 %

3-clorometil-benzoato de colesterilo

- ** o

Aspecto: solido com um ponto, de fusão de 122 C. (recrijs talização em diclorometano + metanol)

Rendimento: 78%

Exemplo 8

3-clorometil-benzoato de fitilo • Aspecto: óleo

Rendimento: 53%

Exemplo 9

3-clorometil-benzoato de 2,2,3,3,4,4,4-heptafluorobutilo.

Aspecto: óleo

Rendimento: 79%

Exemplo 1Q

3-clorometil-benzoato de 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-pentadecafluoro-octilo.

Aspecto: óleo

Rendimento: 81%

Exemplo 11

Cloroacetato de colesterilo

Aspecto: cristais

Rendimento: 72%

-22Exemplo 12

Cloroacetato de 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-butilo.

Aspecto: liquido de ponto de ebulição 80°C (sob 2660 Pa)

Rendimento: 20%

Exemplo 13

Cloroacetato de 2,2,3,3,474,5,5,6,6,7,7,8,8,8-pentádecafluoro-octilo

Aspecto: óleo

Rendimento: 7 2 %

Exemplo 14

Cloroacetato de 4-(3’,5¹-dicloro-fenoxi)-benzilo.

Aspecto: óleo

Rendimento: 97% ¹¹ SÍNTESE DE DIFERENTES AMINOACIL-A-L OU PÉPTIDQ-A-L N-PROTEGIDOS

Exemplo 15

Síntese do éster de (3-metil-benzoato de 4-hidroximetil

-bifenilo) da N-butiloxiterc.-carbonil-L-leucima

Em um balão de três tubuladuras de 500 ml, introduzem-se sucessivamente:

- 15 g do sal de potássio da N-butiloxi-terc.-carbonil-L-leucina (ou seja 0,056 mole),

- 180 ml de DMF anidra,

- 14,905 g (ou seja 0,044 mole) de 3-clorometil-bénzoato de 4-hidroximetil-bifenilo em solução em 100 ml de DMF anidra e

- 1,5 g de iodeto de sódio.

Leva-se a mistura reaccional, sob agitação, a 75°C.

Após duas horas de reacção, adicionam-se 490 ml de acetato de etilo.

Lava-se a solução orgânica sucessivamente com duas vezes 100 ml de água, 200 ml de uma solução diluída de KHCO^ (pH 8,5), 200 ml de agua, 200 ml de uma solução de KHSO^ (pH2) e 200 ml de água.

Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, filtra-se depois e evapora-se para se obter um óleo com um rendimento igual a 100%.

-34A estrutura do composto foi confirmada mediante espectro metria de massa e mediante RMN do protão (360 MHz).

A análise mediante cromatografia em camada fina sobre pia ca de sílica revela uma única mancha no seguinte sistema de eluição;

- acetato de etilo/hexano (2/5) Rf: 0,66

EXEMPLOS 16 a 22

Procedendo-se de acordo com o processo descrito no exemplo 15, prepara-se os seguintes compostos;

Exemplo 16

Aspecto; óleo

Rendimento; 98%

-^25//

Exemplo 17

Aspecto: óleo Rendimento: 95%

Exemplo 18

Aspecto: óleo Rendimento: 100%

Exemplo 19

CO-O~CH₂-(CF₂)g-CF₃

Aspecto: pó branco

Rendimento: 100%

Exemplo 20 (CH₃)₃-C-O-CO- [NH-CH₂-CO] 5“°^CH2“ \ Ο / Ç¹ cd.-o-ch₂ 707 Cl

Aspecto: pó branco Rendimento: 77,5%

Exemplo 21 (ch₃)₃-c-o-co-[nh-ch₂-co] ₂-o-ch

Aspecto: óleo Rendimento: 10 0 %

Exemplo 22 (ch₃)₃-c-o-co-[nh-ch₂-co] -O-CH.

CO-O-CH₂-(CF₂)2”^CF3

Aspecto: pó

Rendimento: 70%

Exemplo 23 (ch₃)₃-c-o-co-[nh-ch₂-co] ₅-o-ch₂

Aspecto: pó branco Ponto de fusão: 215°C

Exemplo 24 (ch₃)₃-c-o-co-[nh-ch₂-co]₅-o-ch₂ Ύθ co-o-ch₂~(cf₂)₇-cf₃

Aspecto: pó branco Ponto de fusão: 240°C

Exemplo 25 <ch₃)₃-c-o-co-[nh-ch₂-co] ₄-o-ch₂ -V Q

CO-O-CH₂-(CF₂)_?-f

Aspecto: pó branco

-28III- SÍNTESE DE DIFERENTES AMINOACIL-A-L

Exemplo 26

Síntese do cloridrato do éster de (3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo) da L-leucina.

Em um balão de três tubuladuras de 250 ml, introduzem-se sucessivamente:

- 24,6 g (ou seja 0,044 mole) do éster de 3-metil-benzoa to de 4-hidroximetil-bifenilo da N-butiloxiterc.-carbo nil-L-leucina,

- 100 g de diclorometano.

Faz-se depois borbotar uma corrente de ácido clorídrico anidro na mistura reaccional agitada durante 1 hora e 30 minutos à temperatura ambiente.

Desgaseifica-se em seguida a solução sob uma corrente de azoto durante 20 minutos.

Evapora-se em seguida a mistura reaccional até um volume de 50 ml e precipita-se depois mediante adição de 200 ml de éter etílico.

composto obtido após filtração pesa 13,9 g (0,0413 mole) (rendimento 94%) . É um pó branco com um ponto de fusão de 121°c-122°C.

429ζ\

A estrutura do composto é confirmada mediante espectrometria de massa e mediante RMN do protão (360 MHz).

A análise mediante cromatografia em camada fina sobre pia ca de sílica revela uma única mancha no seguinte sistema de eluen tes:

diclorometano/metanol/ácido acético (90/10/5) Rf=0,55

EXEMPLOS 27 a 29

Procedendo de acordo com o processo descrito no exemplo

26, prepara-se os seguintes compostos.

-30Exemplo 27

Aspecto: óleo Rendimento: 98%

Exemplo 28

Aspecto: pó branco Rendimento: 9 8 %

Aspecto: pó branco

Rendimento: 80%

-31-.IV - DETERMINAÇÃO D&S SOLUBILIDADES DAS MOLÉCULAS DE FORMULA (L)-SERIL-A-L EM ÃGUA

Exemplo 30;

Quando os grupos lipófilos A-L estão ligados à L-serina proporcionam uma molécula cuja solubilidade em água é inferior a 30 g/litro à temperatura ambiente.

Síntese das moléculas de fórmula (L)-seril-A-L

Dissolvem-se os cloridratos de fórmula HC1, (L)-seril-A-L, obtidos de acordo com o processo descrito nos exemplos 26 a 29, em diclorometano. Faz-se passar amoníaco gasoso através de_s ta solução ã temperatura ambiente. Filtra-se rapidamente o cloreto de amónio obtido. Concentra-se em seguida o filtrado sob pressão muito reduzida. Tritura-se imediatamente, o composto ob tido após concentração, em água durante 15 minutos ã temperatura ambiente, e filtra-se depois.

A solubilidade do composto de fórmula (L)-seril-A-L ê de terminada sobre o filtrado.

Solubilidade das moléculas de fórmula (L)-seril-A-L . Éster de 3-hidroximetil-benzoato de 4-hidroximetil-b_i fenilo da L-serina:

solubilidade em água a 25°_c. ₀ g/ntro (insolúvel)

Éster de 3-hidroximetil-benzoato de benzilo da L-se rina

Solubilidade em ãgua a 25°C: 0,2 g/litro

Éster de 3-hidroximetil-benzoato de 3-fenilbenzilo da L-serina;

solubilidade em água a 25°C: 0,75 g/litro.

A título de comparação;

. Éster metílico da L-serina:

Solubilidade em água a 25°C: ^100 g/litro

Éster benzílico da L-serina:

Solubilidade em água a 25°C: >100 g /litro.

V - EFEITOS SOLUBILIZANTES NOS DISSOLVENTES ORGÂNICOS DO GRUPO

LIPÕFILO PROTECTOR DA FUNgÃO CARBOXÍLICA DOS PÉPTIDOS

O efeito solubilizante do grupo lipõfilo é demonstrado pela determinação da solubilidade descrita antes, onde o pépti do modelo é um pêptido particularmente hidrófilo: a N-butiloxiterc.-carbonilpentaglicina.

(CH₃)₃-C-O-CO-4NH-CH₂-CO)₅-or •Λ

R	Solubilidade em g/100 ml	Coeficiente de partilha entre CH₂CL₂ e H₂O
anisol	ch₂ci₂	h₂o
R1	5	> 10	0,0016	>1.000
R2	5	>10	0,0008	>2.000
Λ -^CH3	insolúvel	0,33	0,50	0,66
benzilo *	insolúvel	0,070	0,017	4,1

-34VI

- SÍNTESE PEPTÍDICA EM MEIO ORGÂNICO CONCENTRADO POR MEIO DE

GRUPOS LIPÔFILOS A-L

Sintetiza-se o pentapeptido leucina encefalina L-tirosil -glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina:

com como grupo lipófilo A-L o éster de 3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bi£enilo;

com como grupo protector da função amina dos aminoãci. dos constitutivos o grupo butiloxi terc.-carbonilo.

Exemplo 31

Exemplo 31a: Síntese do éster do 3-hidroximetil-benzoato de 4-tiidroximetil-bifenilo da N-butiloxi terc.-carbonil-L-fenilalanil-L-leucina

Em um reactor de três tubuladuras de 500 ml, introduzem·

-se sucessivamente:

- 10,33 g (0,039 mole) de N-butiloxi terc.-carbonil-L-fenilalanina, ml de diclorometano.

Após dissolução, baixa-se a temperatura do meio reaccional para -5°C e adicionam-se sucessivamente, sob agitação, 4,29 ml (0,039 mole) de N-metilmorfolina e 4,46 ml (0,036 mole) de cloreto de pivaloílo.

Decorridas 4 horas de reacção, adicionam-se 14,018 g (0,030 mole) de cloridrato do éster de 3-hidroximetil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo da L-leucina e depois 3,3 ml (0,030 mole) de N-metilmorfolina.

Após 2 horas de reacção, lava-se a mistura reaccional sucessivamente com:

x 25 ml de água (pH 5,8 - 6,44), x 30 ml de KHCO₃ diluído (pH 8,2 - 8,3), x 30 ml de ãgua (pH 7,3 - 7,2), x 30 ml de H₂SO₄ (pH 3,89 - 3,35), x 30 ml de NaCl diluído (pH 6,7 - 6,5).

O rendimento em composto doseado em relação a um produto ê de 100%.

acetato de etilo/hexano (2/5) Rf = 0,38.

A estrutura do composto foi verificada mediante espectrometria de massa e mediante RMN do protão (360 MHz) e a sua pureza foi confirmada mediante análise por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).

Exemplo 31b: Síntese do cloridrato do éster de 3-hidroximetil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo da L-fenilalanil-L-leucina.

' Seca-se a solução obtida após extracção no exemplo 31a, mediante destilação sob vazio do diclorometano. Leva-se o volume final até a 150 ml.

Ã temperatura ambiente, faz-se borbulhar na solução uma corrente de ácido clorídrico seco durante 1 hora e 45 minutos. Desgaseifica-se em seguida a mistura reaccional mediante passagem de azoto seco durante 1 hora na solução.

Concentra-se a mistura reaccional sob vazio até um volume de 75 ml.

Uma cromatografia em camada fina sobre placa de sílica confirma a pureza do composto: Rf = 0,8 no sistema de eluentes diclorometano/metanol (90/10) .

Uma análise mediante HPLC confirma que o corte do grupo N-butiloxi terc.-carbonilo é quantitativo (100%) .

Uma amostra do composto precipitado no sistema acetato de etilo/éter etílico apresenta um ponto de fusão de 167/169°C.

-37Exemplo 31c: Síntese do éster de 3-hidroximetil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo da N-butiloxi terc.-carbonil-glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina.

Em um reactor de três tubuladuras de 500 ml, introduzem-se sucessivamente:

5,1 g (0,022 mole) de N-butiloxi terc.-carbonil-glicil -glicina, ml de diclorometano.

Após dissolução, baixa-se a temperatura do meio reaccional para -5 C e adicxonam-se sucessivamente, sob agitaçao, 2,4 ml (0,022 mole) de N-metilmorfina e 2,7 ml (0,0176 mole) de cloreto de pivaloílo.

Após 2 horas de reacção, sob agitação a -5°C, adiciona-se metade da solução obtida no exemplo 31b de cloridrato do éster de 3-hidroximetil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo da L-fenilalanil-L-leucina (0,0147 mole em 40 ml de diclorometano) e depois 1,62 ml (0,0147 mole) de N-metilmorfolina.

Após 2 horas e 30 minutos de reacção, sob agitação, lava-se a mistura reaccional sucessivamente com:

ml de í^SO^ diluído (pH 3,5), x 30 ml de ãgua (pH 4,5 - 3,6), x 30 ml de NaOH diluído (pH 8,6 - 7,3), χ 30 ml de ãgua (pH 6,8 - 6,1)

A análise mediante cromatografia em camada fina sobre a placa de sílica revela um único composto no seguinte sistema de eluentes:

diclorometano/metanol (90/10) Rf: 0,6.

A estrutura do composto foi verificada mediante espectro metria de massa e mediante RMN do protão (360 MHz) e a sua pureza foi confirmada mediante análise por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).

Exemplo 31d; Síntese do cloridrato do éster de 3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo da glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina.

Seca-se a solução obtida após extracção no exemplo 31c me diante destilação sob vazio do diclorometano. Leva-se o volume f_i nal a 75 ml.

Ã temperatura ambiente faz-se borbotar na solução uma cor rente de ãcido clorídrico seco durante 1 hora e 30 minutos. Desga seifica-se em seguida a mistura reaccional mediante passagem de azoto seco durante 1 hora na solução.

O rendimento em composto doseado da solução assim obtida é de 100%.

Verifica-se a pureza mediante cromatografia em camada fina sobre placa de sílica e mediante HPLC.

Exemplo 31e; Síntese do éster de (3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenilo) da N-butiloxi terc.-carbonil-L-tirosil-glicil-glicil-L-fenila3ani.l-L-leucina.

Em um reactor de três tubuladuras de 250 ml, introduzem

-se sucessivamente:

- 5,26 g de N-butiloxi terc.-carbonil-L-tirosina, ml de diclorometano.

Após dissolução, baixa-se a temperatura do meio reaccional para -15°C e adicionam-se sucessivamente, sob agitação, 2,23 ml (0,02 mole) de N-metilmorfolina e 2,5 ml (0,019 mole) de cloro formato de isobutilo.

Decorridos 10 minutos de reacção, adiciona-se esta solução à solução obtida no exemplo 31d de cloridrato do éster de 3-metil-benzoato de 4^-hidroximetil-bifenilo da glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina (0,0135 mole em 40 ml de diclorometano), sob agitação a -15°C; adicionam-se. ~ depois 1,5 ml (0,0135 mole) de N-metilmorfolina.

Após 4 horas de reacção, sob agitação, lava-se a mistura reaccional sucessivamente com:

-40ζ ml de H^SO^ diluído (pH 6,6), ml de H₂SO₄ diluído (pH 2,2), x 40 ml de água (pH 4,3 - 3,8), ml de KHCO^ diluído (pH 8,1), x 40 ml de água (pH 7,9 - 6,9).

Seca-se a fase orgânica mediante evaporação até ã secura para se obter 14,4 g de um composto sólido branco de aspecto merengado.

A análise mediante cromatografia sobre camada fina sobre placa de sílica revela um único composto.

Exemplo 31f; Síntese da N-butiloxi terc.-carbonil-L-tirosil-glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina.

Em um balão de três tubuladuras de 100 ml, suspendem-se 5 g do éster de 3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenil da N-butiloxi terc.-carbonil-L-tirosil-glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina em 15 ml de metanol.

Adicionam-se 15,7 ml de hidróxido de sódio N e 15 ml de acetonitrilo.

-41Depois de 4 horas de reacção, adicionam-se 20 ml de éter etílico.

Decanta-se a fase aquosa, lava-se com 2 x 20 ml de éter etílico e acidifica-se depois até pH 3 com uma solução de KHSO^ a 5%.

Extrai-se o N-butiloxi terc.-carbonilpentapeptido com uma mistura de acetato de etilo/éter etílico a 75/5.

Lava-se a fase orgânica (-75 ml) com 2 x 30 ml de água (pH 4,0 - 5,0) .

Dilui-se a fase orgânica final com 100 ml em frasco aferido para doseamento mediante HPLC em relação a um padrão de referência puro.

rendimento doseado, após extracção e saponificação, é de 94,5% eia relação ao cloridrato do éster de 3-metil-benzoato de 4-hidroximetil-bifenil de L-leucina, o que significa que se tem um rendimento superior a 99% para cada etapa.

Após doseamento, concentra-se e seca-se a solução orgânica sob pressão muito reduzida. Dissolve-se o resíduo obtido (3,5 g, ou seja um rendimento de 100%) êm álcool isopropílico e precipita -se depois mediante adição de éter isopropílico.

Repete-se esta operação uma segunda vez para se obter finalmente 2,42 g de um pó, ou seja um rendimento em produto iso lado puro de 71%.

A pureza do composto foi verificada por análise mediante HPLC, por espectrometria RMN do protão (360 MHz) e por espectrometria de massa.

Exemplo 31g: Preparação do trifluoroacetato da L-tirosil-glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina.

Em um balão de três tubuladuras de.50 ml, dissolvem-se à temperatura ambiente 2,12 g (2,78 mmoles) de. N-butiloxi terc.-car bonil-L-tirosil-glicil-glicil-L-fenilalanil-L-leucina preparada no exemplo 31f, em 10 ml de uma. mistura a 50/50 em volume de diclo rometano/anisol e.5 ml de ácido trifluoroacético.

Depois de 1 hora de reacção sob agitação, concentra-se a solução sob pressão reduzida.

O composto é doseado em relação a um padrão de referência puro a 100%.

O rendimento após corte é de 100% (2,78 mmoles em compos_ to doseado).

Liofiliza-se, em seguida, a solução doseada para se obter 1,72 g de um pó branco: rendimento final em composto recuperado 92,5% em relação à N-butiloxi terc.-carbonil-L-tirosil-glicil-gli cil-L-fenilalanil-L-leucina.

-4Χ

Verifica-se a pureza do composto mediante análise por HPLC, por espectrometria RMN do protão (360 MHz) e por espectro metria de massa.

A análise elementar do composto final dã:

C: 53,1%

H: 5,7%

N: 9,9%

F: 8,1% para uma fórmula bruta:

^C28H37^O7N5, CF₃COOH, 2H₂O.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a solubilização de peptidos eventualmente protegidos ou salifiçados, no seio de um dissolvente orgânico. não miscível com- a agua, caracterizado pelo facto de se ligar o grupo C-terminal do dito péptido por intermédio de uma ligação amida ou éster· a um grupo .lipõfilo, dando este ultimo origem, quando estã ligado à L-serina, a uma molécula cuja solubilidade em ãgua a 25°C é inferior a 30 g/litro, sendo este grupo lipõfilo.quimicamente definido e não polimérico.
2, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o grupo lipõfilo ser constituído por duas en tidades químicas A e L ligadas entre si por uma ligação covalen

45te, em que:

- A representa um braço de ligação entre o péptido e o grupo re presentado pelo símbolo L;

- L representa um grupo hidrocarbonado lipôfilo.
3,- Processo de acordo com a reivindicação 2, caraterizado .pelo facto de o grupo representado pelo símbolo A representar um braço de ligação bifuncional, comportando pelo menos uma fun ção (B) álcool ou amina e na outra extremidade uma. função carbo nilo ou éter e representado pela formula geral:

B -Rj.-Ar _(k) -Z R₂-C _(n) -0 J- _p na qual:

- B representa um grupo hidroxi ou amino;

- Ar representa um radical aromático·mono- ou policíclico;

- R^ representa uma ligação covalente, um radical alqui, leno contendo 1 a 4 ãtomos de carbono eventualmente substituído por um radical fenilo ou um grupo alquile nocarbonilo;

- R₂ representa um átomo de oxigénio, uma ligação covalente ou um grupo alquileno comportando 1 a 4 ãtomos de carbono eventualmente substituído ou um grupo oxialquileno comportando 1 a 4 ãtomos de carbono na cadeia alquileno;

-46ou

- K, m e n representam, cada um, um número inteiro igual a 0 ou 1;

- p representa um número inteiro igual a 1 ou 2.
4.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza. do pelo facto de o grupo lipõfilo representado pelo símbolo L corresponder à fórmula geral:

^C(a) ^H(b) °(c) ^N(d) ^S(e) ^Si(f) ^X(g) na qual:

- X representa um átomo de halogéneo escolhido entre o flúor, o cloro e o bromo;

- a representa um número inteiro compreendido entre 1 e 50;

- b representa um número inteiro compreendido entre 3 e 101;

- c representa.um número inteiro compreendido entre 0 e 6;

- d representa um número inteiro compreendido entre 0 e 2;

- e representa um número inteiro compreendido entre 0 e 2;

- f representa um número inteiro compreendido entre 0 e

2;

- g representa um número inteiro compreendido entre 0 e

20.

tf

475. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do pelo facto de as duas entidades representadas pelos símbolos A e L poderem formar um único grupo correspondendo a uma das .fórmulas gerais:

B-E^Ar· ou B-CH₍₃._q)-Ar»_(g) em que:

- B representa um grupo hidroxi ou amino;

- representa uma ligação covalente, úm radical alquileno...comportando 1 a 4 átomos de carbono, eventual mente substituído .por um radical fenilo,· ou um grupo alquilenocarbonilo;

— Ar* representa um radical aromático policíclico;

- Ar representa um radical benzénico;

e q representa, um número inteiro igual a 2 ou 3.
6. - Processo para a. síntese de péptidos eventualmente pro tegidos em meio líquido, caracterizado pelo facto de se partir de um péptido ou de um aminoãcido inicial solubilizado de açorado com uma. qualquer das reivindicações 1 a. 5 e de. se adicionar sucessivamente, um a um,, os. aminoãcidos activados na função ãci do e protegidos na função amina.
7. - Processo para a síntese de péptidos eventualmente pro tegidos em meio líquido, caracterizado pelo facto de se partir de um aminoãcido ou de um péptido solubilizado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5 e de se condensar um outro pêptido tendo a sua função acido C-terminal activada e a sua função amina N-terminal protegida.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo facto de o meio líquido ser constitua! cLo por um dissolvente escolhido entre os derivados alifãticos halogenados, os derivados aromáticos e os ésteres.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo facto de se proteger a função amina N-terminal com um grupo butiloxiterc.-carbonilo (Boc) ou mediante reacção com um composto betadicarbonilado.
10. - Processo de.acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo facto, de se activar a função acido com um cloreto de ácido, com um cloroformato de alquilo, com uma car bidiimida ou com um éster activado.
11.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo facto, de se introduzir o péptido C-ter minai inicial no meio reaccional, de se adicionar depois o aminoãcido ou.o péptido activado. na sua função ácida e protegido na sua função amina, de se eliminarem depois da fase orgânica, após reacção, os co-produtos e os excessos de reagentes mediante lavagem com soluções aquosas neutras, ácidas ou alcalinas, de se li-49- bertar depois a-função amina e, finalmente, de se introduzir um novo aminoãcido ou um novo pêptido activado na sua função ãcido e protegido na sua .função amina.