PT97295A - Processo para a preparacao de uma calcitonina hibrida - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de OHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, japonesa, industrial e comercial, com sede em Νδ 5-1, 5-cheme, Ukima, Kita-ku, Tokyo, Japão, (inventores: Eigoro Murayama e Thhru Hoshi, residentes no Japão), para «PROCESSO PARA a preparaqXo de uma calciio- NINA HÍBRIDA»»

Descrição

ENQUADRAMENTO DA INVENQlO

Esta invenção refere-se a um processo para a preparação de novos análogos da calcitonina possuindo actividade biológica.

Sabe-se <iue a oaleltonina ocorre naturalmente na enguia, salmão, galinha, perco, homem, boi, ovelha e rato. Seja qual for a sua origem, a calcitonina de ocorrência natural ê constituida por 32 aminoácidos. Por exemf pio, a calcitonina humana tem a seguinte estrutura de pép-tidos: GSP · - 1 -

>«ais^jBEBdB?a8ffl5S22Sa!í4 „(*** H-Gye-Gly-Asn-leu-Ser-íhr-Cys-Met-Iieu-Gly 123456789 10

Ihr-Tyr-Thr~Gln-Aep-Phe-Aen-Iys*»Plie«-HlB 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 fhr-Phe-Pro-Gln-Ihr-Ala-Ile-Gly-V a1-Gly· 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Ala-Pro-NHg 31 32 A caloinonina áe enguia tem a seguin te estrutura àe péptiáosi H-Cy8-Ser-Asn-leu-Ser-Th.r-Cys-Val~Leu-Gly- 1' 2» 3* 4 5 6 7 8 9 10

Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Iys-leu-Gln-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Yal-Gly-Ala-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Thr-Pr©-SH2 31 32 A ealcitonina inerentemente presente em seres humanes e animais é de ora em diante oolectivamente referida oomo Hoaloitonina nativa”, - 2 -

A Descrição Pública da Patente Japonesa Nfis. 277698/1988, 284198/1988, 287800/1988, J. Bio-chem. Vol. 159, p. 125 (1986), Endocrinology, Vol. 117, p. 80 (1987) e J. Biochem. Vol. 162, p. 399 (1987) refere análogos da calcltonina nativa. Os análogos da caleitonina nativa inc luem: análogos possuindo pelo menos um dos resíduos de aminoáoidoa na caloitonina nativa substituídos por outro resíduo de aminoáoido (de tipo substituição)j análogos que possuem pelo menos um dos resíduos de amino-ácidos na oaloitonina eliminado (de tipo eliminação)$ análogos que possuem pelo menos um resíduo de aminoáoido adicionado entre os resíduos de aminoáoido na caloitonina nativa ou no seu terminal (tipo de adição); e análogos que possuem dois ou mais tipos de substituição, eliminação e adição combinados em conjunto. Quando são substituídos, eliminados ou adloionados, dois ou mais resíduos de amine-ácidos, eles podem estar adjacentes ou afastados na estrutura de páptidos, Estes tipos de caloitonina nativa são de agora em diante referidos como ''análogos de caleitonina". A oaloitonina bumana nativa está inerentemente presente nos seres humanos mas as suas ao-tividades biológicas nos seres humanos tem-se revelado baixas. Por outro lado, as calcitoninas nativas derivadas de animais diferentes do homem como por exemplo o salmão, enguia e galinha tem elevado actividade biológica para o homem e parecem ser promissores para a utilização como agentes terapêuticos para a osteoporose, hipercaloemia neoplástioa e a doença de Paget. Além disso, os análogos de oaloitonina de engia tem sido comercialmente produzidos como agentes terapêuticos. Contudo, a caloitonina nativa derivada de animais diferentes de seres humanos e os seus análogos provocam efeitos naturais em seres humanos como por exemplo náuseas severas, desordens na função do sistema digestivo e antigenicidade. A calcltonina humana tem poucos, se alguns, efeitos laterais. - 3 -

As náuseas provocadas pela calcitonina nativa derivada de animais diferentes de seres humanos e seus análogos é descrita nas seguintes referencias: 1) K. fakahashi. e ool., "Gan to Kagaku Ryoho (Câncer and Chomotherapy)", Vol. 12, Nfi 10, 2004-2010 (1985)? 2) J. Sgawa e col·, "Gan no Rinsho (Clinicai Aspeets of Câncer)", Vol. 30, Na 3, 251-258 (1984)? e 3) G.F. Mazzuoli e ool., Calcif. Tissue Int., 38> 3-8 (1986).

Os problemas nas funçêes do sistema digestivo provocadas pela calcitonina nativa derivada de amimais diferentes do homem e seus análogos são descritos nas seguintes referências: 1) K. Jonderko, Gut (England), £0. 430-435 (1989)? 2) K. Jonderko e ool., J. Clin. Gastroenterol., 12, 22-28 (1990)? and 3) J. Hotz e ool., Bigestien, 20, 180-189 (1980). A antigenicidade de calcitonina nativa derivada de animais diferentes do homem,s em análogos é descrita na referencia seguinte: 1) E.R. Singer e ool., J* Clinicai Invest., £1, 2331--2338 (1972)? 2) J.G. Haddad e col., J. Glinical Invest., £1, 5133--3141 (1972): e 3) A. Grauer e col., J. Bone and Mineral Res., jj, 387-391 (1390). - 4 - h Μ ^vrK- ,' - .v-jk1.*.;,; 1 í <." ". '*** ~4 ................ * '“••‘“-«ι

RESUMO DA INVENClO A presente invenção tem oobio objeoto proporcionar um processo para a preparação de noves análogos da oaloitonina que não são até agora conhecidos. Duma forma breve, a presente invenção proporciona uma oalcitenlna que tem aotividade biolegica elevada em seres humanos e que contude tem poucos efeitos laterais nos seres humanes, A oaloitonina da presente invenção é um hibrido de calci-tonina humana e calcitenina derivada de animais diferentes do homem, nomeadamente, uma oalcitonina híbrida constituída por um segmento de peptidos em calcidonina humana e um segmento de peptidos em oaloitonina derivada de animais diferentes do homem.

Os presentes inventores descobriram que a aotividade dos efeitos laterais provocados no homem pela oaloitonina derivada de animais diferentes do homem está localizada predominantemente no terminai amlno, particularmente no s egmento de peptido consistindo de 1 - 16 resíduos de aminoácido terminais, Também foi descoberto que embora todos os 16 resíduos de aminoácidos terminais possam ser substituidos, os efeitos laterais desejáveis podiam ser eliminados por substituição de pelo menos 10 desses resíduos de aminoácidos.

Para as acfeividades biolágioas mais importantes a oalcitonina derivada do homem e de animais diferentes do homem, a sequência de aminoácidos no terminal de ácido carboxilioo é importante como é descrito nas seguintes referencias: 1) Eené Maier e col,, EEBS Betters, 48, 68 (1974)? 2) René Maier e col., Olinioal Endoorinology, £, 3275 (1376): 3) R.M. Epand e ool., Eur, J. Breehom., 159. 125 (1986)? e - 5 -

4) D.M. Binilay e ool., Endocrinolegy, 117« 399 (1987).

Os presentes inventores descobrira» que o segmento de páptide acima especifioad©, nomeadamente, o segmente de páptid® no t erminal de ácido carboxílico que possui as actividades biológicas mais importância, não tinha pontos actives que provocassem efeitos laterais indesejáveis no homem e desenvolvessem uma calcitonina híbrida com base nesta descoberta. Assim, do ponto de vista de uma redução dos efeitos laterais, o segmento do péptido consistindo de resíduos de aminoácidos nas posiçSes 11& e posteriores na direcção do terminal do ácido carboxílico pode compreender calcitonina humana ou calcitonina derivada de animais diferentes do homem.

Por outro lado, do ponto de vista das actividades biolcgicas, é preferível a cilcitonina que possu:. actividades biolcgicas superiores à calcitonina humana.

Assim, o segmento de peptido mais perto do terminal carboxi é preferíyelmente um Begmento de peptido que ê derivado de animais diferentes do homem e que tem propriedades biológicas para e homem do que a calcitonina humana. A este respeito, o segmento de péptido em consideração tem pelo menos 4 resíduos de aminoáeides, e tem preferenclalmente pele menos 10 resíduos de aminoácidos.

Dos pontos de vista acima referidos, a calcitonina hidrida da presente invençãc consiste em dois segmentos de peptidos compreendendo um deles desde o 12 ao 10a resíduo de aminoácidos do terminal amino, que ê um segmento em calcitonina derivada do homem e compreendendo os outros © 292 a 322 resíduos de aminoácidos na direcção do terminal oarboxi, isto á, um segmento em caloitonina derivada de animais diferentes do homem, sendo 0 segmento de peptido intermediário constituído pelos resíduos de aminoáci-do 112 a 282 possuindo a sequência de aminoácidos de qualquer — 6 —

dos tipos de cal elimina. Se desejado# pode existir uma transição entre a sequências de aminoácidos da calcitonina humana em relação à calcitonina não humana em qualquer posição do segmento de péptido entre os resíduos de aminoácidos 112 e 282.

Para conseguir uma maior redução nos efeitos laterais# o segneito péptido no terminal amino é preferivelmente constituido pelo Ia ao 13a resíduos de aminoácidos da calcitonina humana. Para conseguir uma maior potenciação das actividades biológicas, o segmento de péptido nas posiçães 222 e 322 é preferivelmente constituido por um segmento de peptido derivado de animais diferentes do homem,

0 segmento de péptido desde a posição 14a até à posição 21a no terminal amino pode ter a sequência de aminoácidos de qualquer tipo de calcitomina, e pode ser uma transição da sequência de aminoácidos da calcitonina humana em relação â calcitonina não humana em qualquer posição desse segneito intermediário. No caso mals preferido, a calcitonina híbrida da presente invenção é constituída por um segmento de péptido de calcitonina humana nas posiçães Ia a 16a no terminal amino e no segmento de péptido em calcitonina não humana nas posiçães 17a a 32a.

DESCRICÃO DOS DESENHOS a? A Figura 1 é um gráfico que mostra a relação com o tenpo da concentração de cálcio no plasma sanguíneo durante o tratamento com vários tipos de calcitonin A Figura 2 é um gráfico que mostra a variação com o tempo dos valores limites de e stimulação após a administração de vários tipos de calcitonina? A Figura 3 é um gráfico que mostra as alteraçães no peso corporal de ratos administrados com vários tipos de calcitonina? - 7 -

A Figura 4 é um gráfico que postra a absorção de alimentos nos ratos cadministrados com vários tipos de calcitonina; A Figura 5 é um gráfico que mostra a relação entre a concentração de calcitonina de salmão e a ligação de anticorpos? e

As Figuras 6 a 9 são gráficos que mostram a eficiência da ligação de calcitonina de salmão e duas calcitoninas híbridas a soro de calcitonina humana anti-salmãc.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO O termo "calcitonina humana" aqui utilizado significa calcitonina humana nativa e análogos de calcitonina humana não nativa. De modo semelhante, o termo "calcitonina não humana ou calcitonina derivada de animais diferentes do homem" significa calcitonina nativa derivada de animais diferentes do homem e análogos não nativos dessa calcitonina não humana. Os animais diferentes do homem incluem preferivelmente, mas não se limitar á eles, salmão, enguia e galinha. 0 numero de resíduos de aminoácido substituído, eliminados ou adicionados nos dois tipos de análogos de calcitonina não á limitado a qualquer valor particular mas não é preferivelmente superior a 5. Se um segmento de péptido de interesse não contiver mais do que 5 resíduos de aminoácido, o numero de resíduos de aminoácidos substituídos, eliminados ou adicionados é preferivelmente não superior a 1, e se esse segmento de péptido não contiver mais do que 10 resíduos de aminoácidos, o número correspondente de resíduos de aminoácidos substituídos, eliminados ou adicionados é preferivelmente não superior a 3.

No caso do segmento de péptido de calcitonina humana, a sequência dos primeiros 10 resíduos de aminoácido a partir do terminal de amino é preferivelmente - 8 -

igual ao da calcitonina humana nativa, ou pode ser que o segmento de péptido de um análogo de calcitonina humana tenha a mesma sequência de aminoácidos da calcitonina humana nativa com a excepção de o resíduo de metionina na posição 8 ser substituido por um resíduo de valina. Tal como para o segmento de peptido global da calcitonina humana, um análogo preferido é aquele em que não mais do que dois resíduos de aminoácidos são substituídos, eliminados ou adicionados à calcitonina nativa. 0 análogo mais preferido é aquele em que o segmento de peptido tomado globalmente difere do tipo nativo apenas na substituição no resíduo de metionina na posição 8.

No caso do segmento de péptido da calcitonina derivada de animais diferentes do homem, ele e preferivelmente igual ao segmento de péptido da calcitonina correspondente , ou pode ser o segmento de peptido do análogo dê calcitonina não humana que não tenha mais do que 3 resíduos de aminoácidos, substituidos, eliminados ou adicionados ao tipo nativo, Um análogo mais preferido é aquele em que o segmento de péptido, tomado globalmente, tem uma sequência em que apenas um resíduo de aminoácido é substituido ou eliminado do tipo nativo.

Os animais preferidos diferentes do homem são aqueles em que a calcitonina derivada tem actividades biológicas superiores em relação ao homem. Exemplos desses animais incluem peixes, como por exemplo salmão e enguia, como por exemplo ã galinha. 0 salmão e a galinha são os mais preferidos, sendo o salmão particularmente preferido.

Tendo estes factos em consideração, a calcitonina híbrida da presente invenção tem preferivelmente a seguinte sequência de aminoácidos: 9

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met(ou Val)-Leu-Gly-12345678 8 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(ou Glu)-Ehe)ou Leu)~Asn(ou His)-11 12 13 14 15 16 17

Lys-Phe(ou leu ou Des)-His(ou Gin) -Thr-Tyr-Pro-Arg· 18 19 20 21 22 23 24

Thr-Asn(ou Asp)-Thr(ou Val)-Gly-Ser(ou Ala)-Gly-Thr-25 26 27 28 29 30 31 32

Pro-NK^

Na calcitonina hibrida da presente invenção# a parte da estrutura da calcitonina global derivada de animais diferentes do homem como por exemplo salmão# enguia e gaiiinha gue provocam efeitos laterais quando administrados ao homem (por exemplo náuseas# problemas nas fun-çQes do sistema digestivo e antigenicidade) é subsÇÉido pelo segmento correspondente da calcitonina humana que não provoca esses efeitos laterais# sendo os efeitos laterais provocados pela primeira parte reduzidos ou inteiramente eliminados. Isto é equivalente a dizer que a calcitonina híbrida da presente invenção tem o ponto farmacologicamente acti-vo da calcitonina humana substituido pelo segmento correspondente da calcitonina não humana de modo a potenciar as actividades fisiológicas pretendidas da calcitonina humana. A calcitonina híbrida da presente invenção pode ser sintetizada por síntese em fase sólida# utilizando resinas de polímero ou por sintese em fase líquida# que é vulgarmente utilizada nas técnicas de síntese orgânica. A utilização da sintese em fase sólida é preferida 10 -

<!** no caso áa síntese áe uma quantidade oomparativamente pequena áe péptiáos. Per eutre lad©, a utilização da síntese em fase líquida é preferida no caso de uma sintese áe uma grande quantidade de peptides. Nos exemplos que se apresentam a seguir nesta desoriçSe, os péptidos foram sintetizados por síntese de fase sólida. Contudo, se a oaloitonina híbrida da presente invençS© é ou deve ser sintetizada em grande quantidade, a utilização da sintese em fase líquida, que é uma técnica bem conhecida da síntese dos péptidos, é a preferida* 0 procedimento habitual da síntese em fase líquida começa com a síntese de pelo menos dois péptidos parolais, sendo cada um deles constituído por dois ou mais resíduos de aminoácidos, em seguida ligam-se estes péptidos parciais sucessivamente e finalmente obtem--se o péptido pretendido que possui a sequência de amino-écidos acima especificada (no caso da presente inrenção, o péptido pretendido é a oaloitonina híbrida que já foi acima descrita). A síntese em fase líquida é ainda caracte' rizada por se efectuar a reacção de síntese de péptido em meio líquido, partioularmente num meio como por exemplo a dimetilformamida ou · tetrahidrofurano. Um péptido parcial é t ipicamente constituído por 2-20 preferivelmente 3-15, resíduos de aminoácidos* Num caso preferido, ceroa de 2-10 unidades destes péptidos parciais são sintetizados e em seguida ligados sucessivamente para sintetizar o péptido pretendido.

Na síntese do péptido acima descrito, os derivados reactivos de aminoácidos são tipicamente utilizados como materiais áe partida. Se o aminoácido de partida contiver grupos funcionais aotivos diferentes daqueles que formam ligaçSes de péptidos, esses grupos funcionais aotivos são preferivelmente protegidos com grupos protec-tores, que são removidos após o final de síntese de pepti-dos. 0 péptido a ser produzido na presente invenção tem - 11 -

1-7 pontos de dissulfureto que são formadas em qualquer fase pretendida após a sintese de um peptido parcial com uma sequência 1-7. Contudo# esta ligação de dissulfureto tem baixa estabilidade e é preferivelmente formada após o final da síntese de peptido. Estas condições para os procedimentos de protecção e desprotecção e a formação de uma ligação de dissulfureto são também preferivelmente adop-tadas na síntese em fase sólida a ser descrita em seguida. A sintese em fase sólida é um processo de sintese de um peptido que possui a sequência de ami-noácidos pretendida por ligação de resíduos de aminoácidos sucessivamente numa resina veículo. Este processo pQde ser efectuado automaticamente com um sintetizador automático.

As resinas que podem ser utilizadas na síntese em fase sólida incluem resinas de clorometilo# resinas de oximetilo# resinas de 4-(oximetil)fenilacetami-dometilo, resinas de benzideeilamina e resinas de polia-crilamida.

Os aminoácidos utilizados nestas sin-teses são aminoácidos todos opticamente L-isómeros e protegidos, tal como requerido. Exemplos de grupos protectores de α-amino incluem um grupo carbobenzoxi (Z), um grupo t--butil oxicarbonilo <Boc), um grupo 9-fluorofenilmetiloxi-carbonilo (Fmco), um grupo formilo (HOC) e um grupo acetilo (Ac). Grupos protectores de oc-carboxi exemplares incluem um grupo benzilo (Bzl),um grupo butilo terciário (But)#um grupo ne-tilo (Me) e um grupo etilo (Et) e um grupo fenacilo (Pac).Os grupos que podem ser utilizados para proteger os grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácidos incluem: um grupo benzilo (Bzl), e um grupo p-toluenossulfonilo (Tos), um grupo p-nitrofenol (N02)* um grupo benzidrilo (Bzh), um grupo acetamidometilo (Acm), um grupo butilo terciário (But), um grupo butiloxi terciário carbonilo (Boc), um 12 -

grupo oicliehexilo (CHex) e um grupo 4-metoxi-2,3,6--trimetilbenzenossulfonile (Mtr). Pode ser utilizado um ou mais destes grupos protectores dependendo do produto que se pretende obter. A reacçãe de adição sequencial de ami-noácidos pode ser efeotuada por condensação desidratante utilizando carbodiimidas ou oom a a^uda de ésteres acti-vos. As carbodiimidas úteis incluem diciclohexilcarbo-diimiàa e 1-etil 3-(3-dimetilaminopr©pil)carbodiimida, e os ésteres activos úteis incluem um éster de N-hidro-xissuooinimida (-OSu), um éster de pentofluorofenol (-OPfp) e um éster de dihidrexibenzotriazina (-ODhbt).

Os catalizadores da reacção que podem ser utilizados incluem a dimetilformamida (DMF), tetra-hidrofurano (THP), diclorometano, clorofórmio, acetato de etilo, dioxano, sulféxido de dimetilo (DMSO), M-metilpir-rolidina, piridina e égua.

Podem ser utilizados vários grupos des protegidos dependendodo tipo de grupos protectores que se pretendem eleminar e do produto que se pretende obter, e os exemplos úteis incluem: fluorato de hidrogénio, ácido trifluoroacético, ácido trifluorometanossulfdnioo, amoníaoo/metanol, brometo de hidrogénio/áeido aoétioo, hidrogénie/paládio em carbono, acetato de mercúrio, ácido acético/pé de zinco, e uma substância aloalina/água-meta-nol.

Durante ou após a síntese, podem ser utilizados várias técnicas de purificação, como por exemplo a cromatografia de fase inversa, oromatografia de fase normal, cromatografia de permuta iénica, e cromatografia de filtração em gel, e recristalização. As ligaçBes de dia sulfureto podem ser formadas por oxidação com ar atmosférico ou com ferricianeto de potássio. - 13 -

Apresentam-se em seguida exemplos oom o eb^eotive de melhor ilustrar a presente invenção, mas que eles não devem ser tomados como limitativos.

Os exemplos 1 a 6 ilustram a sintese de amostras âe oalcitonina híbrida da presente invenção, e o Exemple 7 mostra o resultado da análise da composição em aminoácidos para as amostras de oalcitonina sintetizada nos Exemplos 1 a 6. Os exemplos 8-10 descrevem as experiências conduzidas para avaliar as actividades principais da caleitonina híbrida da presente invenção. Os exemplos 11 a 14 descrevem as experiências conduzidas para demonstrar a eliminação dos efeitos laterais da caleitonina.

Exemplo 1 Síntese da caleitonina híbrida (146) humana/(17-32) salmãe:

H-Gys-Gly-Asn-I»eu-Ser-íDhr-Oys-Met-Iieu-Gly-123456789 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-lys-leu-Gln-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Ihr-2yr-Pro-Arg-Shr-Asn-Thr-&ly-Ser-Gly 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Thr-Pro-NHg 31 32 A síntese foi efectuada por meio de um processo de sintese em fase sálida utilizando um sinteti-zador automático. - 14 -

(I) Introduzindo prelina em resina de benzidilamina (BHA).

Foram suspensas dez gramas de resina BHÀ (-NH25 0,38 mmol/g) e agitadas em 100 ml de DMF. Após remoça© do sobrenadante, adieionaram-se mais 100 ml de DMF, seguido da adição de BooProOH (15 mmol), DOO (20 mmol) e HOBI (20 mmol). A mistura foi agitada durante a noi te à temperatura ambiente. Após filtração oom filtro de vidro, a resina resultante foi lavada oom cloreto de meti-leno.

Posteriormente, foram adicionados 200 ml de uma solução de olereto de metileno a 105¾ ani- drido acético, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora para bloq.uear os grupos amino residuais. Apds o fim da reaeçâo, a resina foi lavada oom cloreto de metileno e seoa em vazio.

Apds secagem, foram adicionados 50 ml de uma solução de cloreto de metileno contendo 50# v/v de ácido trifluoroaoético e a mistura fei agitada à tempera tura ambiente durante uma hora. Apds filtração com um filtro de vidre, a resina resultante foi lavada sucessivamente cem cloreto de metileno, metanol, cloreto de metileno e trietilamina e seca em vazic. (2) leaeção de adição sequencial de aminodeidos

Introdução de 1 grama da resina obtida em (1) na coluna de um sintetizador automático, e foram adicionados aminoáoidos em sequência nas oondiçSes seguintes. - 15 -

(i) reaoça©: 30 min a T.A. etn solvente de DMF

(ii) lavagem 10 min a T.A. oob DHF (iii) remoçSo de Fmoc: 10 min a T.A. oom 20 v/v$ de

piperidina em solvente de DMP

(iv) lavagem 10 min a T.A. oom DMF

Repetindo as fases (i) - (4)> foram adicionados 31 aminodciáos após o Proo. Os aminoáoidos utilizados são apresentados na Tabela 1 seguinte.

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Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 g Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Arg^Mtr)-OPfp 0.641 ' Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Met-Opfp 0.426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 - 17 -

Apés a reaoção, os grupos protectores e a resina foram removidos do péptido oom o auxílio de fluoreto de hidrogénio, e o péptido foi lavado oom éter. 0 precipitada foi dissolvido numa solução aquosa de 50$ v/v de ácido acético, e as substâncias insolúveis foram separadas por filtração. 0 filtrado foi liofilizado para se obterem ceroa de 600 mg do péptido bruto. (5) Purificação e formação de ligaçães de dissulfureto

Foi dissolvida uma parte (cerca de 50 mg) do péptido bruto em água contendo 0,1$ v/v de ÍDFA e a solução foi submetida a cromatografia líquida de alto rendimento numa coluna de ODS.

Utilizando a solução A (acetonitrilo contendo 0.1$ v/v de !DFA) e a solução B (água contendo 0.1$ v/v de IFA) e a coluna foi eluída com o gradiente gradual (A/B em pero entagem v/v) aume ntando de 20 até 50 a 40$, e as fracçães a 30$ de eluiçSo foram recolhidas e liofiliza-das. 0 péptido liofilizado (46 mg) foi dissolvido em 50 ml de ásido acético a 0.05$ v/v e o pH da solução foi ajustado a 8,5 oom a solução aquosa 3 M de amoníaco. Posteriormente, foram adicionados 1,5 ml de uma solução 0,1 M de Kj3Pe(CN)g e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos para se formarem ligaçães de dissulfureto. Apés se ajustar o pH a 5,0 com ácido acético a 50$, foi adicionada uma resina de permuta iónica (formada Cl”) e a mistura foi agitada durante 20 minutos, seguida de separação por filtração da resina, 0 filtrado foi concentrado e submetido a cromatografia de alto rendimento numa coluna ODS e purifi-. cada de novo pelo mesmo procedimento descrito acima. As * fracçSes a 30$ de eluiçSo foram recolhidos e liofilizados - 18 -

para se obterem 28 g do peptide pretendido.

Exemplo 2

Sintese de oaleitonina híbrida de (1-16) humana/(17-32) enguia H-Gys-Gly-Asn-Leu-Ser-ÍDhr-Cys-Met-Iieu-Gly-123456789 10

Thr-Iyr-Thr-G-ln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 .

Ihr-Pre-NHp 31 32 (1) leacção de adição sequencial de aminoácidos.

Foi introduzido 1 grama de resina BAHA incorporado prolina preparada na fase (1) do Exemplo 1 na coluna do sintetizador automático e foram adicionados nas mesmas condições de reacção utilizadas na fase (2) do Exemplo 1. Os aminoáoides utilizados são os referidos na la-bela 2 seguinte. - 19 -

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 g Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ala-OPfp 0.378 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Val-OPfp 0.400 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0.641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Met-Opfp 0.426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 20 Λ *

Apés a reacçãe, a resina de peptide foi tratada pele mesmo processe descrito na fase (2) de Exemple 1 para se obterem cerca de 510 mg do peptide brute (2)

PurifieaçSe e formação de ligações de dissulfu-rete 3?ei submetida uma parte (ceroa de 450 de páptide bruto a purificação e a formação de liga-çSes de dissulfurete peles mesmos procedimentos utilizados na fase (3) do Exemplo 1, tendo side obtidos 32 mg do peptido purifioado.

Exemple 3

Sintese da calcitonina hibrida de análogo humano (1-16, Met8 —> Val8)/enguia (17-32): H-Oys-Gly-Asn-leu-Ser-Ihr-Gys-Val-leu-Gly-123456789 10

Thr-Tye-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Ibr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly- 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Tbr-Pro-líHg 31 32

(D

Eeaoçãe de adiçãe sequencial de aminoáoidos

Foi introduzido 1 grama de resina BHA incorporando prolina preparada na fase (1) do Exemplo 1 na coluna de um sintetizador automático e foram adicionados aminoáoidos nas mesmas condições da reaoçSo utilizadas na fase (2) do Exemplo l.Os aminoáoidos utilizados sãe os referidos na tabela 3 seguinte. 21 -

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 g Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ala-OPfp 0.378 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Val-OPfp 0.400 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0.641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Gin-OPfp 0.423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Gin-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Val-Opfp 0.400 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 - 22 -

Depois da reacçãe a resina de péptido foi tratada pelo mesmo processo descrito na fase (2) do Exemplo 1 para se ohterem cerca de 580 mg do péptido bruto* (2) Purificação e formaçSo das ligaçSes de dissulfu-reto.

3?©i submetido uma parte (cerca de 500 mg do péptido bruto a purificação e formação de ligaçSes de dissulfureto pelos mesmos procedimentos utilizados em (3) do Exemple 1, tendo sido obtidos 35 mg do péptido purificado.

Exemple 4-

Sintese da caloitonina híbrida humana (1-16)/análogo de enguia (17-31, Des Leu1^): H-Qys-Gly-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-123456789 10

a?hr-$yr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-lys-Gln-Thr-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Pro-NHg 31 (1) EeacçSe de adiçSe sequencial de aminoácidos loi introduzido 1 grama da resina BHA incorporando prelina preparada na fase (1) do Exemplo 1 - 23 - ’ T:raK!5R!K5E3intalnrajJB>sw s& na coluna de um sintetizador automático e foram adicionados aminoáoidos nas mesmas oondiçSes da reacçSo utilizadas na fase (2) do Exemplo 1. Os aminoáoidos utilizados são os referidos na Tabela 4- seguinte: - 24 - *

J

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 s Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ala-OPfp 0.378 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Val-OPfp 0.400 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-ArgfMtr)-OPfp 0.641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Met-Opfp 0.426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 - 25 -

Após e fim da reacçãe, o peptide resina foi tratado pelo mesmo processo descrito na fase (2) do Exemplo 1 para se obterem cerca de 520 mg do pép-tido bruto. (2) Purificação e formação de ligaçSes de dissulfureto

Foi submetida uma parte (cerca de 450 mg) do póptido bruto a purificação e formação de liga-ç*es de dissulfureto pelos mesmos procedimentos utilizados na fase (3) do Exemplo 1 tendo sido obtidos 23 mg do pép-tid· purificado.

Exemple 5

Sintese de calcitonina híbrida humana (1-13) / salmão (14-32): H-Cya-Gly-Asn-Iíeu-Ser-Thr-Cys-Met-Iieu-Gly- 123456789 10

Shr-Eyr-!Dhr-Gln-01u-I)eu-His-Iiys-I»eu-Gln-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-íDhr-Asn-Ihr-Gly-Ser-Gly- 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 IPhr-Pro-NHg 31 32 A síntese foi executada por um processo de sintese em fase sólida utilizando um sintetizador automático. - 26 - ^·!· -ΐίΓΊ^δδΐιΛ'**".’»·. -~- ~ áHwwZrowS^ «xticrwsíí.tfiyíHi**·*·*^ ** ^¾1 (1) Introdução da prolina em resina de benzidrilamina (BHA)

Foram suspensos dez gramas de resina BHA (-R^* 0,38 mrnol/g) e agitados em 100 ml de DMF. Após remoção do sobrenadante, foram adicionados mais 100 ml de DMF, seguido da adição de BocProOH (19 mmol, DCC (19 mmol) e HOBT (19 mmol), A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Após filtração com um filtro de vidro, a resina resultante foi lavada com cloreto de metileno. P0steriormente, foram adicionados 200 ml duma solução de cloreto de metileno contendo 10% v/v de anidrido acético e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear os grupos amino individuais. Após o fim da reacção, a mistura foi lavada com cloreto de metileno e seca em vazio.

Após secagem, foram adicionados 50 ml numa solução de cloreto de metileno contendo 50% v/v de ácido trifluoroacético e a mistura foi agitada â temperatura ambiente durante 1 hora. Após a filtração com um filtro de vidro, a resina resultante foi lavada sucessivamente com cloreto de metileno, metanol, cloreto de metileno e trietila-mina e seca em vazio.

Utaa parte da resina resultante foi analisada com um analisador de aminoácido e verificou-se que tinham sido incorporados 0,31 mmol de prolina por grama de resina. (2) Reacção de adição sequencial de aminoácidos

Foi introduzido 1 grama da resina obtida na fase (i) na coluna de um sintetizador automático e foram adicionados os aminoácidos em sequência nas seguintes condições. 27 -

(l) reacção de adição: 30 min à temperatura ambiente em solvente DMF

(ii) lavagem: 10 min à temperatura ambiente com DMF

(iii) remoção de Fmoc: 10 min à temperatura ambiente com 20 v/v% de piperidina em solvente DMF

(iv) lavagem: 10 min à temperatura ambiente com DMF

Repetindo as fases (i) - (4), foram adicionados 31 aminoácidos a seguir a Pro. Os aminoácidos utilizados são os referidos na Tabela 5 seguinte. 28 -

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 g Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 ‘ Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0.641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Leu-Opfp 0.411 Fmoc-L-Glu(OBut)-OPfp 0.468 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-QPfp 0.411 Fmoc-L-Met-Opfp 0.426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OH 0.464 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OH 0.464 29

Após a reacção, foram removidos, a resina e os grupos protectores do péptido com fluoreto de hidrogénio e o péptido foi lavado com éter. O precipitado foi dissolvido numa solução aquosa a 50 v/v% de ácido acético e matéria insolúvel foi separada por filtração, O filtrado foi liofilizado para se obterem cerca de 720 mg do péptido bruto. (3) Purificação e formação de ligações de dissulfureto

Foi dissolvida uma parte (cerca de 700 mg) do péptido bruto em água contendo 0,1 v/v% de TFA e a solução foi submetida a cromatografia líquida de alto rendimento numa coluna ODS.

Utilizando um sistema de solvente consistindo em água e acetonitrilo contendo 0,1% de TFA, a coluna foi eluida com um gradiente gradual de acetonitrilo aumentando de 20 v/v% até 30 v/v% a 40 v/v%, e as fracções a 30 v/v% foram eluidas e recolhidas e liofilizadas (purificação primária). O péptido liofilizado (cerca de 80 mg) foi dissolvido em 80 ml de áciêo acético a 0,05 v/v% e o pH da solução foi ajustado a'8,5 com amoníaco aquoso 3 M. Pos-teriormente, foram adicionados 1,5 ml de K3Fe(CN)6 0,1 M e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min para se obterem as ligações de dissulfureto. Após se ajustar o valor do pH a 5,0 com ácido acético a 50% v/v 50 v/v% foi adicionada uma resina de permuta aniónica (forma Cl ) e a mistura foi agitada durante 20 min, seguido de separação por filtração da resina. 0 filtrado foi concentrado e submetido de novo a cromatografia líquida de alto rendimento numa solu-na de ODS, que fòi aluída com o mesmo sistema de solventes 30

utilizado na purificação primária em gradientes de densidade gradual de acetonitrilo desde 25, 27 ate 30 a 35 v/v% rificação secundária). As fracções a 30 v/v% de eluição fo ram recolhidas e liofilizadas para se obterem 53 mg do pepti do do título.

Exemplo 6 Síntese da calcitonina híbrida (1-21) humana)/22-32) salmão*

H- Cy s-G ly-Asn- Le u-S er-Th r-Cys~Met-Le u-G ly~ 123456789 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His- 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Fro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Thr-Pro-NH2 31 32

Foi introduzido 1 grama de resina BHA incorporando prolina preparada na fase (1) do Exemplo 5 na coluna de um sintetizador automático e foram adicionados os aminoácidos nas mesmas condiçQes de reacção utilizadas na fase (2) do Exemplo 5. Os aminoácidos utilizados são os referidos na Tabela 6 seguinte. 31 - -n. *»«Mrt3TOfflc,roK. 'i^ ϋ'.; atn, >*«„„„^,3

Tabela 6 ..y

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 g Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-L-Thr (But) -ODhb't 0.430 Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0.641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0.400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0.510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0.503 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-L-Phe-OPfp 0.438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0.457 Fmoc-L-Gln-OPfp 0.423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0.495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Met-Opfp 0.426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0.430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0.419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0.411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0.412 Fmoc-Gly-OPfp 0.367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0.595 32 - ti εΤ'ΓΓτηηΐΛ-τ'ίΡ', %3r^-{^U^M»^»iSrVit^2 WesM^rçrsnan...

Após a reacção, o péptido-resina foi tratado pelo mesmo processo utilizando na fase (2) do Exemplo 5 para se obterem cerca de 860 mg de péptido bruto. (2) Purificação e formação de ligaçSes de dissulfureto

Uftia parte (cerca de 850 mg) de péptido bruto foi submetida a purificação e formação de ligação de dissulfureto pelos mesmos procedimentos utilizados na fase (3) do Exemplo 5. 0 filtrado resultante foi concentrado e submetido de novo a cromatografia de alto rendimento numa coluna 0DS# que foi eluída com o mesmo sistema solvente utili-pado na purificação primária a ingredientes de densidade gradual de acetonitrilo desde 24 a 35 v/v% ate 26, 28 e 30 v/v% (purificação secundária)· As fracções a 28 v/v% de elui-ção foram recolhidas e liofilizadas para se obterem 66 mg de péptido pretendido.

Exemplo 7

Análise da composição de aminoácidos

Cada uma das calcitoninas purificadas nos Exemplos 1 a 6 foi hidrolisada a 150°C durante 1 hora na presença de HC1 6N, e a composição em aminoácidos foi analisada com um analisador de aminoácidos. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 7. 33

Aminoáoido Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3 Exemplo 4 Exemplo 5 Exemplo CS t— CM co o o i—1 *sT CS o r—1 rH 1—1 CS *«_y ____ V_y >_y —y s._y s—y '—-· s— *—y *.—y »—y '—y *·--' T—} i—l o r—1 <“í co CM LO LO σ> »—1 co t- O o CM t—1 O o o co o o • » » o • • * • CM co i—1 co n· t—1 CM τ—1 1—1 o 1—1 co CD r—1 cs Ν' i-H i-l 1—1 !N (N 1—1 i—! r—1 1—1 CN N-X· v-y *wy »._y »-» v_y V-y '—y ·—' •s_y V-- '— •w-* ·«—y «w» t- uo Ν' co CO CD (N o co CO t" co CD CD 03 1—1 CO co CS o cd i—1 Gi o o o o O CD CD co in o CN Ν' o 1—1 o CN IN t—S 1—1 1-1 O 1-1 co CD i—! <N N· rH CS o co CS iH rH T—1 1—1 CS V_> N—y '—' «—y v-y V_y 1—* N—y --- V_y> --- ____ v_y ___ •wy (N •n CS in Ν' CN 1—1 o CS MT CS CS co U3 1—1 Ν' CO co i—I O o 1-1 o o Γ—i o CD CD CO LO o (N Ν' 1-1 CS co CS 1—i *H 1—1 O i—1 CD •H CD CD P C Φ Pi 05

co CD 1-1 CS Ν' 1-1 1-1 i—í co CS 1-1 1—1 1-1 1—1 CS n—y x_y v_y v_y V_y '—' >._y V-' y ___ v_y v_y --- CS CS LO CD o rH t- ca rH co CD CO Ν’ o cs 1—1 co co CS CS o o CD 1—1 o O o O o CD co LO o CS Ν' 1-1 i—1 o CO CM 1—i 1—[ 1—1 I—1 1—1 CD U P C CD O M5 P tn CD y—» y—% y—« y—s y—«v /—S y—>. y—s y—N y—s. y—«s y—^ y—s. y—N. y- co t- cs cs Ν' O O i—1 co CS 1—i r—1 i—1 i—I CS "W '—y n—y v_y v—' V—y v_y v_y ‘—y v—y swy >._y Nwy ^y N* co 03 t- LO CS .cs co t—1 C~ i—l t" CO i—1 O o CD r~1 o o o o o 03 CO CD Ή cs ’Μ4 O co cs t—i t—í T—1 1—1 T—1

X Li u X >> d r—l P D) u O CD CD bO O CD x: 0 f—l P P cd CD CD >> JD -r—1 íh Ih < h 00 o o < > α E- CU < CU CDoo Ό (D P ra CDo I—I <0 > CS Po Ϊ5 34

Exetnolo 8 cas. Determinação das actividades biologi- As seis novas calcitoninas preparadas nos Exemplos 1 a 6 foram dissolvidos numa solução tampão de acetato de sódio 0{1 Μ (pH A, 2) contendo 0,1% de BSA (albumina de soro de bofino) j-e foram injectadas em ratos macho SD (com 4 semanas de idade) em pré-jejum (24 horas) através da veia da cauda. Passada 1 hora, a concentração do cálcio no soro foi medida pelo processo OCPC (Calcium C - Test Wako of Wako Pure (Chemical Industries, Ltd.). A actividade da calcitonina que provoca· va uma queda de 10% na concentração de cálcio no soro foi determinada como sendo 10 mU, e o número de unidades por miligrama de calcitonina foi designado por "actividades específica". Os resultados obtidos são os apresentados na Tabela 8.

Tabela 8 Novas calcitoninas Actividade específica (u/ma) Exemplo 1 2106* 2 2639 3 2262 4 2611 5 2575 6 1792 * Media para duas medidas Exemplo 9 hipercalcernia Processo* Eficiência das calcitoninas contra a 35 - fv .........

Poi administrada vitamina D3 (5 mg Ag) oralmente a ratos machos Sd de 5 semanas de idade durante 4 dias consecutivos para construir modelos experimentais de ratos hipercalcímicos. No dia 5, £oram injectados calcito-nina híbrida (1-16) humana / (17-32) salmão (calcitonina híbri da 1), calcitonina de salmão e calcitonina humana subcutâneamente, cada numa quantidade de 4 UIAg· Foi extraído sangue em intervalos de tempo determinados e foi medida a concentração de cálcio do plasma.

Resultados obtidos e sua discussão:

As curvas em função do tempo das concen-traçSes de cálcio no plasma para as calcitoninas de ensaio são apresentadas na Figura 1. Como se pode ver da Figura 1, toda a calcitonina 1, calcitonina de salmão e calcitonina humana ensaiados provaram uma redução rápida na concentração elevada de cálcio no sangue. É assim óbvio que a calcitonina híbrida da presente invenção e tão eficaz como a calcitonina de salmão e a calcitonina humana contra a hipercal-cemina.

Exemplo 10

Efeito analgésico das calcitoninas

Processo: 1) Animal

Foram utilizados 10 coelhos machos (Kbl:JW) pesando 2,7 a 3,2 kg. (ii) Implantação de uma cânula de guia para a administração intraventricular. 36 ^^»Wrf?eS8i!!i '''-™T7' ......... mumm ml· Γ* WWVfo»-·-*****

Os coelhos foram presos numa dispositivo estereostáxico com anestesia com pentobarbital (30 mg/kg, i.v.). Após o escalpe ter sido incisado, foi inserida uma cânula de guia para administração intraventricular (Piastic Products) no ventriculo lateral esquerdo de cada animal e foi fixada com cimento dental (coordenadas estereotáxicas de bregma: posterior 4,0 mm; lateral, 5,5 mm? ventral, 5,5 mm). Passada uma semana de convalescência, os coelhos foram submetidos às experiências descritas a seguir. Após a experiência, foi injectado azul de metileno para verificar a coloração da cânula. (iii) Ensaio de antinocicepção

Os coelhos foram reunidos com um retentor de coelhos e foi aberto um furo com um diâmetro de 1 mm e uma profundidade de 1 mm em ambas as partes lateriais de um incisor maior superior com uma broca de dentista. Foi montado um eléctrodo estimulante em cada furo e foi aplicada uma estimulação electrica (5 ms, 5 Hz, 3 s de duração) a várias tensões a partir do um estimulador eléctrico (Nihon Kohden Corp) para medir os valores limites da estipulação (d) que induzem respostas de lambimento (lambimento e o movimento dos lábios e da maxila inferior) nos animais. Foram conduzidas as medidas uma hora antes da administração do medicamento e, imediatamente após a administração. Bem como 0,5 h, 1,0 h, 1,5 h, 2,0 h, 3,0 h e 4,0 h após a administração.

Os medicamentos ensaiados foram a calci-tonina híbrida (1-16) humana/(17-32) de salmão (calcitonina híbrida 1) calcitonina de salmão e calcitonina humana, cada uma das quais foi administrada ventricularmente numa quantidade equivalente a 8 ΌΙ/kg. A solução salina fisiológica foi utilizada como controlo.

Resultados e discussão? 1 p-ra^rTSiaíS n , ,1__ WMMO. Λ'."* Víftarj.-dAtó·''

As curvas da dependência do tempo dos valores limites de estimulação para as calcitoninas de ensaio são apresentadas na Figura 2. Como se pode observar na Figura 2, as três calcitoninas provocavam aumentos comparáveis no valor limite qiiie atingia o máximo de 0,5 - 1,5 horas após a administração do medicamento. É portanto estimulado que a calcitonina híbrida da presente invenção é tão eficaz como a calcitonina de salmão e a calcitonina humana na sua acção analgésica.

Exemplo 11

Efeitos das calcitoninas na inibição do ganho de peso corporal e do apetite

Processos

Foram injectadoa intramuscularmente ratos com calcitonina híbrida (1-16) humana/(17-32) de salmão (calcitonina híbrida 1), calcitonina humana e calcitonina de enguia, e foram medidos os seus pesos corporais e consumos de alimentos passados 24 horas.

Resultados obtidos:

As alterações no peso corporal dos ratos administrados com várias calcitoninas são apresentadas na Figura 3, e os seus consumos de alimentos na Figura 4. Cada uma das calcitoninas foi administrada em três doses diferentes: 12,5 UI/kg» 50 UI Ag e 200 UI Ag. Para as alterações do peso corporal, os pesos medidos foram calculados em média para 5 ratos, e para o consumo de alimentos foram adicionados em conjunto os valores medidos para 5 ratos.

Discussão:

Como é óbvio a partir das Figuras 3 e 4, a calcitonina de salmão e a calcitonina de enguia apresentavam - 38 ^ <"' '^-i. -rv·· * '^^V^n^vxnasx^yi^· > efeibos dependentes da dose na inibição do ganho do peso corporal e do apetite/ enquanto que a calcitonina hibriâa de 1 e a calcitonina humana não provocavam alterações no peso corporal e no consuma de alimentos. Pode assim concluir-se que a calcitonina híbrida da presente invenção provoca efeitos tãc pequenos no ganho de peso do corpo e no apetite como a calcitc nina humana*

Exemplo 12

Efeito das calcitoninas no tempo de esvaziamento gástrico

Processo*

Cadelas beagles em jejum desde o dia anterior foram injectadas com calcitonina híbrida (1-16) humana/ (17-3 2) de salmão (calcitonina híbirda 1) calcitonina de salmão, calcitonina humana e solução solina fisiológica através de uma veia encefálica. Passa-se uma 3gora foram admini|s-trados oralmente, comprimidos de aspirina entéricos (contendo 200 mg do ingrediente activo) juntamente com 25 ml de água.

Em seguida/ foram tomadas amostras sanguíneas da outra veia encefálica a determinados intervalos de tempo e no plasma obtido da maneira habitual foi armazenada a -20°C ate às medidas serem efectuadas. Ã medida que passa através da parede intestinal, a maior parte da aspirina ingerida é metaboli-zada e entra no fluxo sanguíneo como ácido salicílico. Assim, o ácido salicilico no plasma foi determinado como marcador para a aspirina. Foi adicionado etanol (200 jil) a 50 ^μΐ de plasma e a mistura foi centrifugada a 10 000 rpm x 1 min, sendo o sobrenadante resultante submetido a HPLC.

Resultados obtidos* - .39 - m A acçâo de retardamento de cada calci-tonina no esvaziamento gástrico é resumida na Tabela 9. A diferença entre o tempo para a administração de solução salina fisiológica em relação à absorção de aspirina foi calculada para cada animal pãra determinar o atraso no tempo de esvaziamento gástrico.

m J - 40 κΓΛ Λ rtJArK-i )

Dose,uq (UI)/kg Tempo de absorção tempo de atraso fl vo co • O H • σ\ • • • * • » • vO O • O co • CM CM 4 9 • <-t •tf • « ♦ CM ro • • • r- <y\ tf • • • yj o • • • • • • • • • Γ0 VO • o co <J\ • CM m H • » CM • » O ω • • CO O tf • • CO <tf • O co • O O <J\ • iH • H Λ

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Notas Tempo de Absorção* é o tempo desde a administração de aspirina até a sua absorção

Tetnpo de atraso* diferença no tempo da absorção de aspirina entre calcitonina e a solução salina fisiológica

Discussão*

Como a Tabela 9 mostra, a calcitonina de salmão tinha uma acção muito forte no atraso do tempo de esvaziamento gástrico enquanto que a calcitonina humana era fraca nessa acção. A calcitonina hábrida 1 era mais parecida com a calcitonina humana do que a calcitonina de salmão no atraso do tempo .rde esvaziamento gástrico. Pode ser assim concluido que a calcitonina híbráda 1 da presente invenção pode ser administrada em doses mais elevadas de, unidades de actividade do que a calcitonina de salmão

Exemplo 13

Efeitos das calcitoninas na motilidade gástrica intestinal no cão consciente.

Processo*

Foi anesteciado um cão beagle saudável pesando cerca de 10 kg com uma injecção i.v. de pentobarbital de sódio e a cavidade abdominal foi aberta em condições assépticas.

Foram suturados transdutores de força extraiuminal na serose do antro gástrico do estômago duodeno e jejum para medir a confiracção muscular circular, tal como referido anterior mente (Itoh e col. Gastroenterol Jpn, 12, 275 1977)). 42 ιί****

Os cabos de ligação destas sondas estavam fora da cavidade abdominal e em seguida foram ligadas atraves de insisão na pele feita entre as escápulas.

Após a cirurgia abdominal, foi feita uma incisão na pele longitudinal de 5 cm no pescoço frontal direito para expor a veia jugular externa.

Foi colocado um tubo Silastico (tamanho francês 8,5 Dow Corning, Midland, MI) na reia cava superior atraves da veia e suturado na pele adjacente como guia para a injecção intravenosa dos medicamentos de ensaio.

Após a operação foi colocada uma camisa protectora no cão para proteger os cabos de ligação e o tubo silastico. O cão foi metido numa caixa individual experimental, e foi-lhe dado alimento comercial para cães às 5,00 da taade e foi dada água à vontade.

Foi registada a actividade motora gastro--intestinal num registador de penas de camisa térmica (WR-3101, Graphtic, Tóquio, JapSo) ligando os cabos de ligação das sondas aos cabos de ligação dos amplificadores (HG-5, Nihon Kohden, Tóquio, Japão).

Cerca de duas semanas após a operação, a actividade contráctil gastro-intestinal podia ser dividida em dois padrães de actividade principais, estado interdigestivo e digestivo.

No estado interdigestivo, observaram-se IMC (complexo motor migrante interdigestivo) que ocorria em intervalos regulares de 100 a 120 min durante no antro gástri-• co, e a que migravam atraves do duodeno e do jejum a uma velo-. cidade constante. - 43 S\ t^n^7S^3!fxsmamaasmaum. **«*»-— '*£ ί·.Λί**·Α; Tiras Mtwrçjrec.· Λ

Em todos os animais, a alimentação fazia parar o padrão de IMC regular. Foram efectuadas experiências durante o estado interdigestivo, 0 medicamento foi dis solvido em solução salina a 0,9% e foi administrado através de um tubo Silástico interior durante cerca de 10 segundos num volume de 0,3 ml/kg. 15 minutos após o fim de IMC no antro gástrico, este foi posteriormente lavado com uma solução salina a 0,9%.

Foi medido o tempo até ao próximo IMC desde a administração do medicamento, e foi utilizado como Índice para a actividade inibidora do medicamento na motilidade gastro-intestinal.

Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 10. 44 - Ο (0 I-J 0) Α φ Β co M ro Η η οί • · Ο Η Η

Cn< Β*

ο CQS Ο W (0 Ρ -> ρ Cn φ§8 ο ο Ο ο m Ο μ . Η ^ Ο Ο Q LO Ο 'δ · ΓΟ 'Χ' Ο ο»< Β* φ Wδ ο W Φ Ρ ,<—<* *ρ ο> <d§ 8 w Η

Resultados •Τ' vV"7:\;ηιΓ-^νΤ^'^'ν^,,,, -·.<.·'.;::ι·ί'* *“®*vrs* _ * Ο Ο ω Ο »Η Η s_^ «Η Ο Ο f-% ο Η Ο rH CVJ Η ΓΟ LO Η s> /-Ν ο ΓΟ • • Ο ω ΓΟ VO Η Η Η ιΗ v** r-l ο ο Η ο ψ • • * OJ Η ΓΟ ιη Η «w* «—1 03 ιη Ο 00 ιη • • • • • Ο Ο Η ρ—1 Ο VD Ο ΓΟ ιη • t % Ο Ο Ο Ο 'w' Ο cn< 9 φ Wδ ο W φ ρ ^ ρ σ> φ W (_| 01 Ο W φ Ρ +J «. 01 Φ Φ X ® \ ϋ ο Ρ S Ρ ^ Η 8 Φ Φ φ Φ β β α α •Η 0 •Η •Η Η α ΪΦ β β G ο ε 0 0 Φ 0 φ -Ρ Η •Ρ φ Ρ Ό Ρ Ό •Η φ Η ΰ •Η Η •Η Η 0 Μ Ο δ Ο Ρ Η Ο Ρ Η γΗ ε ιΗ Α Η Α ítJ φ φ ΰ Φ Μ Φ Ή ο Ό υ α ϋ Μ υ Α - 45 - —*>’WiJ.

Notasí 1. Os índices de "atraso IMC" significam o seguinte. 0... o próximo IMC ocorria 180 min após a administração. 0,5... o próximo IMC ocorria mais de 180 min mas num período de 300 min após a administração. 1.. . 0 próximo IMC ocorria um dia após a administração. 2.. . 0 próximo IMC ocorria dois dias após a administração. 3.. . 0 próximo IMC ocorria três dias após a administração. 2. A calcitonina híbrida era a calcitonina (1-16) humana/ /(17-32) de salmão e a calcitonina híbrida 2 era a calcitonina (1-21) humana/(22-32) de salmão.

Discussão*

Tal como referido na tabela 10, a calcitonina de salmão administrada intravenosamente de forma dependente de dose inibia a ocorrência do próximo IMC num cão consciente.

Para uma dose de 3 ugAçb atravasa a ocorrência de IMC de 3 dias. Por outro lado. a calcitonina humana tinha um efeito muito pequeno no IMC.

Embora as calcitoninas híbridas também inibissem o IMC, estes compostos atrasavam a ocorrência do próximo IMC apenas 1 dia mesmo na maior dose examinada (100 ^g Ag).

Estes resultados demonstram definitivamente que as calcitoninas hibridas tinham um efeito mais fraco na motilidade gastro-intestinal em cães conscientes do que a calcitonina de salmão.

Estes resultados também indicavam que as calcitonlniaas hibridas causarão provavelmente menos efeitos adversos no sistema gastro-intestinal provavelmente menos efeitos adversos no sistema gastro-intestinal do que a calcitonina de salmão. - 46 -

Exemplo 14

Reacção cruzada entre anticorpos de calcitonina humana antisalmão e calcitonina híbrida.

Processo;

Foi sintetizado calcitonina de salmão por um procedimento vulgar de sintese em fase sólida. A calcitonina de salmão marcada com 125 I foi preparada pelo processo de Tejedor (Tejedor, F. e Ballesta, J.P.G.j Analytical Biochemistr$·, 127, 143-149 (1982)).

Verificou-se gue quatro tipos de soro humano continham anticorpos após a administração de calcitonina de salmão gue tinha sido fornecida de Dr. Frederik R. Singer (CEDERS-SINAI MEBICAL CENTER). Os teores de anticorpos destes soros contra a calcitonina de salmSo são os seguintes:

No. 1 1 : 4000 No. 2 1 : 8000

No. 3 1 : 8000 No. 4 1 * 2000 1) Determinação da proporção da difusão do soro

Foi utilizada como tampão de reacção uma solução tampão de borato 0,1 M (pH 8,0) contendo 0,5% de BSA, 0,9% de NaCl, e 0,05% de Tween 20. Este tampão de reacção, soro de calcitonina humana anti-salmão (diluído com o tampão de reacção ate uma diluição final de 100-6 400) e uma solução de calcitonina marcada foram carregados num tubo auxiliar (do tipo Spitz de Saschted Inc. medindo 12 x 75 mm) nos volumes respectivos que se mostram em seguida, bem agitados, e deixados em repouso durante a noite à temperatura ambiente. * 1 * 2 i) ii) Tampão de reacção Soro de calcitonina humana 300 jul 400 μΐ iii) anti-salmão Solução de calcitonina 100 μΐ 0 jal marcada ( ~ 20 000 cprn) 100 Λ* 100 All - 47 k ·' ^EU-^ Λ4*ω,„νί . vjJSjgJjy, :IV* *., :W;tdi*W·* V^ * 1 Ligação total (B) * 2 Ligação específica (NSB) A solução de reacção foi bem misturada com 500 yul de BGG a 0, 2% ( \ -globulina de bovino, Sigma), misturada ainda com 1 ml de PEG /=/6000 a 25%, bem agitada e em seguida deixada em repouso à temperatura ambiente durante 15 min. A solução reaccional foi em seguida centrifugada numa centrifugadora de tipo sucção (05RP-22 da Hitachi) a 3 000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Após se remover o sobrena-dante por aspiração, foi medida a radioactividade com um contador de raios gama. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 5. 2) Reacção de competição entre a calcitonina de salmão marcada com 125le a calcitonina humana ou calcitonina hibrida. o tampão da reacção, vários tipos de calcitonina, soro de calcitonina humana anti-salmão e a solução de calcitonina marcada foram carregados num tubo auxiliar nos volumes respectivos indicados a seguir e tratados póster iormente da mesma forma como na determinação da diluição do soro. i) Tampão de reacção ii) Calcitonina iii) Soro de calcitonina humana anti-salmão iv) Solução de calcitonina marcada ( 2 20.000 cpm) *1 200 μαΐ 100 ;ul

*2 *3 400 ;ul 300 ^1 Ο μ1 O 100 ul O ;il 100 ).1 100 ^jil 100 μΐ (B') (NSB) 100 (BO*)

As duas calcitoninas hibridas utilizadas foram* 1. calcitonina (1-16) humana/)17-32) salmão/ - 48

2. calcitonina (1-21) humana/(22-32) salmão.

Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 6 a 9.

Resultados obtidos e discussãot

Foi feita uma investigação para se saber se a calcitonina de salmão marcada com 125 I competia com a calcitonina de salmão para o soro de calcitonina humana anti-salmão Ns 1 (Figura 5). Foram obtidas curvas semelhantes quando foram utilizados os soros de calcitonina humana anti-salmão NSs. 2 a 4. Estes resultados indicam que a calcitonina de salmão começavam a competir com a calcitonina de salmão marcada para uma dose de pelo menos 1 mg/ml.

As experiências efectuadas com os 4 tipos de soro demonstram que nenhuma das calcitoninas híbridas 1 ou 2 era reconhecida pelo soro de calcitonina humana anti-salmão (Figuras 6 a 9).

Pode assim concluir-se que a calcitonina hibrida da presente invenção pode ser potencialmente utilizada como medicamento eficaz para pacientes que produzem anticorpos de calcitonina anti-salmão. A calcitonina hibrida da presente invenção tem a vantagem especial de apresentar actividades biológicas tão fortes como as da calcitonina de salmão, enguia e galinha embora não causem efeitos laterais incluindo náuseas, problemas nas funçSes do sistema digestivo e antigenicidade. Tem também uma vantagem processual em que as reacçães laterais gue podiam de outra forma ser encontradas durante a sintese podem ser agora evitadas alterando a Met8 em calcitonina humana para Vai8. 49 -

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - 10 - Processo para a preparação de uma cal-citonina híbrida caracterizado por se incorporarem dois segmentos de péptido, sendo um deles um segmento de péptido em calcitonina humana ou um seu análogo que se encontra localizado no lado mais próximo da extremidade do terminal de amino/ e sendo o outro um segmento de péptido em calcitonina derivada de um animal diferente do homem e se que se encontra localizado no lado mais próximo da extremidade do terminal de carboxi. - 2S - Processo dè acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que o segmento de péptido que se encontra na parte loca-1 izada no lado mais próximo da extremidade do terminal de ami no compreende pelo menos 10 resíduos de aminoácidos em calcitonina humana e o segmento de péptido que se wencontra na parte localizada no lado mais próximo da extremidade do terminal de carboxi compreende pelo menos 6 resíduos de aminoácidos em calcitonina derivada de um animal diferente do homem. - 3® - Processo de acordo com a reivindicação 1# caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que a calcitonina humana é calcitonina humana nativa ou um seu análogo e a calcitonina derivada de um animal diferente do homem é calcitonina nativa ou um seu análogo. - 43

   Processo de acordo com a reivindicação 1/ caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que a calcitonila não humana é derivada de enguia, salmão ou galinha. - 53 - Processo para a preparação de uma calcitonina híbrida caracterizado por se incorporar um segmento de péptido em calcitonina humana e um segmento de péptido em calcitonina derivada de um animal diferente do homem, compreendendo o primeiro segmento de péptido resíduos de aminoacidos desde o primeiro até ao de ordem n (n = 10 - 28) a partir do terminal de amino e compreendendo o segundo segmento de péptido os resíduos de aminoacidos subsequentes na direcção do terminal de carboxi. - 6® - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que o primeiro segmento de péptido compreende resíduos de aminoacidos desde o primeiro até ao de ordem n (n * 13 - 2 a partir do terminal de amino e é ou um segmento de péptido em calcitonina humana nativa ou um segmento de péptido num analogo de calcitonina humana possuindo não mais do que dois resíduos de aminoácidos substituidos por, eliminados de ou adicionados ao segmento de péptido em calcitonina humana nativa. 51 -2¾¾¾ - 7a - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que o segmento de péptido num análogo de calcitonina humana possui um resíduo de valina substituido pelo oitavo resíduo de metionina em calcitonina humana nativa. _ 8£ - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que o segundo segmento de péptido compreende os resíduos de aminoácidos de ordem n (n * 14 - 22) e subsequentemente a partir do terminal de amino de calcitonina de enguia, salmão ou galinha e é ou um segmento de péptido em calcitonina nativa de enguia, salmão ou galinha ou um segmento de pép-tido num análogo de calcitonina não possuindo mais do que três resíduos de aminoácidos substituídos por, eliminados de ou adicionados ao segmento de péptido em calcitonina nativa de enguia, salmão ou galinha. _ gs _ Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que o segundo segmento de péptido é um segmento de péptido em calcitonina nativa de enguia ou salmão ou é um segmento de péptido num análogo de calcitonina possuindo um resíduo de aminoácido substituido por ou eliminado do segmento de péptido em calcitonina nativa de enguia ou salmão. 52 -

   - 10* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida em que a sequência dos resíduos de aminoácidos desde o primeiro até ao decimo sexto a partir do terminal de amino é a mesma dos resíduos de aminoácidos desde o primeiro até ao décimo sexto de calcitonina nativa humana, e a sequência dos residuos.de aminoácidos desde o décimo sétimo até ao trigésimo segundo é a mesma dos resíduos de aminoácidos desde o décimo sétimo até ao trigésimo segundo em calcitonina nativa de enguia ou salmão. - ll* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida possuin· do a seguinte fórmula estruturalj - 53 -

   - 12* - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida possuindo a seguinte fórmula estrutural: H-Cys-Gly- Asn- Le u-S er-Thr-Cy s-Met- Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Fhe-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. - 13* - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se obter uma calcitonina híbrida possuindo a seguinte fórmula estruturais H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala- Gly-Thr-Pro-NH2; H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Agp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-KH 2· 54 - /

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly- Thr—Pr o-NH N-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln~Glu-Leu-His-Lys-Leu- Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser- Gly-Thr-Pro-NE^J ® H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe- His-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser- Gly-Thr-Pro-NHg· - 14â - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13 caracberizado por se sintetizar o plptido possuindo uma sequência da referida calcitonina (híbrida) por meio de uma síntese em fase sólida ou uma síntese em fase líquida e se formar a ligação de dissulfureto do referido peptido em qualquer fase desejada da síntese da referida calcitonina (híbrida)· 55 - 15· Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por se sintetizar completamente o péptido possuindo uma sequência da referida calcitonina (híbrida) com a excepção de não se ter formado a ligação de dissulfu-reto e em seguida se formar a ligação de dissulfureto. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos de patente japoneses apresentados em 9 de Abril de 1990 e em 1 de Setembro de 1990, sob os nss. 93656/1990 e 231913/1990, respectivamente. Lisboa, 9 de Abril de 1991 /

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