PT98109A - Processo recombinante para a preparacao duma nova proteina - Google Patents

Description

-φ·

Descrição referente à patente de invenção de HOEGHSI JâPAíí I»I MIíESD, japonesa, industriai e comercial, com sede em 10-16, 8 eborae, Akasáka, Minato-ku, fokyo Japão, (inventores: lamotsu Ha-shiiooto , lenichi liíezuka, Itesayo shi Eumegawa e Sunao lakeshita., residentes no Japão), para >f£RQ-OESSQ PARA â EIPREBSlQ M HIQ- TEÍm os'F-i mmjmà m oêwus HQSBMRAS»*

Descrição Pormenorizada da Inveneao Pampo de Utilização Industrial A presente invenção refere-se a uma. nova proteína que tem actlvidade de desenvolvimento ou de diferenciação de células ósseas e de actlvidade de desenvolvimento e diferenciação de células do cérebro, um 1BI que codifica a referida proteína e a produção da mencionada proteína por processos de tecnologia genética* fécnica Anterior JCadomatsu e col* (1938, Biochem. Biophys. Res* Pom raun. 151« 1312 - 1313) descobriram um novo gene que codifica um polipéptido com 9 971 dalton, designado Ϊ-3Κ1, que é rico em resíduos de lisina básica e- é expressado espeeificamente na M*A,

fase de desenvoIvimento inicial d© teratoeareinona embriónico do rato* Kadomatsu e ool. (1990# J. Oell Biol. 110, 60? * 616) também descobriram que MIEI é um polipéptido segregado e uma hormona para o crescimento de células e para a diferenciação de células semelhantes a uma proteína que pertença à família ... do faetor de crescimento de transformação (263?)-betá*

Entre as proteínas da família fGE-beta, foram descobertas recentemente as proteínas morfogénieas do tecido ósseo (BMP) que se espera serem úteis no tratamento de fraetu-ras ósseas (Wozney e col«# 1988, Science 242» 1528 - 1534}*

Por outro lado, relativamente aos factoree de crescimento derivados de células de cérebro, descobriu-se receatemente o faetor de crescimento dos nervos (ISE), que se espera seja u-tilizado no campo médico.

Entre as doenças que afeetam m pessoas idosas, a osteoporose * a demência têm-se tomado gradualmeate um problema social importante nos países industrialmente avançados* O número de pacientes que sofrem destas doenças espera-se que aumente no futuro. Por conseguinte, um gene espeeifieemente expressado em células de ©steoblastas ou de células de cérebro ou os seus produtos codificado® esperam-se que sejam ú-teis ao diagnóstico e/ou ao tratamento destas doenças.

Esboço da Invenção 1 presente invenção proporciona um clone de q&W especificamente expressado numa Inha de células osteoblasti- •i* cas, HG3$3®1» estabelecida a partir da parte superior do crâ nio' de ratos e também uma nova proteína codificada pelo cABH. A presente invenção também proporciona um clone de cABH que codifica a correspondente proteína humana isolada da biblioteca de cABN construída a partir de células humanas usando u-ma amostra áe eABI que codifica a nova proteína de rato. 2

A presente invenção também proporciona uma proteína que tem 168 resíduos de aminoácidos* A nova proteína perten ce à família ME que é um grupo de proteínas com actividade de diferenciação de células ou de desenvolvimento de células* 0 mME que codifica a proteína é fortemente expressado em HG313S1 e fraeamente expresso em células de cérebro e células IIH323, mas mão no rim* baço, timo, fígado, pulmão ou músculos do esqueleto de ratos*

Rm primeiro lugar, a invenção refere—se a uma proteína que tem a sequência de assino ácidos da seguinte formula (I)

Het-A*l-A*2- Gln-Gln- 2yr-&ln-Gln-(Hn-Arg-Arg-lys-ibe-Ala-Ala-Ala-Phe-Ieu-Ala-A*3-Ile-fhe-Ile-Iieu-Ala-Ala-Yal-àsp-íl2ir-Ala-(Jlu-Ala-Sly-Lys-Ijys-G-lu-Iiys-Pro-Glu-lys—lys-Tal—Iiys-lys-Ser—

Asp-Oys-G-ly-Glu-frp-G-ln-Èrp-Ser-Tal-Cys-Val-PrO-lbr-Ser-G-ly-

Asp— Gys- (yly— I»eu—Grly— ibr—Arg—Glu— Sly—Shr—Arg—$fer—Gly—Ala—Glu— Gys-lys-Gln-fhr-Met-liya-fbr-Glii-Arg-Oys-lys-Ile-iro-Gys-Asa-2rp-lys-I)ys-Gln-fhe-©ly-Ala-&lu-0ye-lys-fyr-eFla-Bie-§ln-Ala-frp-G-ly-&lu-Cys-ilsp-lieu-Asn-2iir-Ala-I*eu~Iiys-íbr-Arg-'Bir-Gly-

Ser—leu—Xiys—Arg—Ala—I»eu—His—Asn—Ala,—A^4—Gys—Gln—lys—Ibr—Vel—

Thr-Ile-Ser-lys-B?o-Gys-&ly-Lye-ieu-$br-iys-Pra-£ys-]?ro-G-ln-

Ala-Glu-3er-lys-lys-lys^lya-%s-Glu-&ly-lys~lys-Gln-Grlu-I>ys-

Ket-leu-Asg rij

Hesta sequência de aminoaciáos, Axl e Ser ou Gin, 1x2 é Ser ou Ala, Ax3 é leu ou fbe e Ax4 é Aep cu Glu*

Um exemplo desejável de proteínas proporcionadas pela presente invenção e uma proteína com uma sequência de a minoácidos descrita na seguinte formula (2*1) de GSf-1 de ra to ou (I-II) de ÔSl-l bumano*

‘ί γ Ρ

í^t-Ber-Ser-ain-&ln«2^&In-(Jln-S3m^S-*irg-I.ys-Phe-Ala-Ala^ ála-Bie^Iíeu-Ala-Iieu^Ile-Bie-Ile-Ijeu-Ala^âla-Va^Asp^Ilir-Ala-

Asp-Gys-Gly-Slu-^p-Sln-Srp-Ser-Tal^Oye-Tal-Pro-Tíiir-Se^&ly-

Isp-OyS-Oay^U^

OyS^IJyS-Gln-3?hr-&l»t^Lye-l1hr-Bln^Arg-Gys-%B“'Ile-I>2’0,'cyí5“rÁen"

Trp-liys-Lys-&ltt-Plie^&ly-Ala-&lu^Cys-Iiye^O}yr*<«Glii^?iie*Glia.*Al&- 2rp»^-ly-G-lU“*0ys-^lsp“Iieu-Asa*ílir-AXa~1jôu--I>ys-Sh3?-Arg~Siia>®ly~

Ser-Ieu-LyS“Arg-Ala-Iieu~Iis-Asa-Ala»Asp*Cys«G'l33.-ly8^ílir^Val-

Slir-Ile-Ser-Lys-Pro-Gy3-GlF-Lys-I^u-$lir-Lys*PrQ-I.y3-l)ro*Glii-

Ala-Glu-Ser-Iiys-Lys-<‘Ly»-Iiy»-'I»ys~Glu-&ly^Sys->Iíya-G’ln^Glu^IyS'r*

W

Ilet-Iieu-Asp ri-a

Ket-&ln-Ala-Gln-&ln-2yp-&la-&ia-*Gla-Arg^g-3iya-a«-Ala«Al^*

Ala-Plia.I«u-Ala-Phe*Ile-Plse-Ile-Iêii-Ãla-ikla-Yal-Asp*$iir-Ala-

GltL-Ala-Gly-I.ys-IJys-Glu-I.yswPro^Gla-liys-I»ys-Yal-I.ye~Lys^S«r-

Asp-Gys-Gly-Gla-Slrp-Glii-Prp-Ser-Yal-Cyís^Yal-P^o-^-Ser-Gly* ásp-ays-Gly-Ieu-Gly-^Shr-Arg^Glu-Gly-Sbr-Arg-iair-Gly-Ala-Glu-

Cys»iys»£ln^lbr»Het~lys-Tbr«&2n^Arg»Oy3~lys^Ile~ir0^Gys^Asn- 2rg-iya-lys«Gln-Pbe~&ly~Ala»&lu-Gys~lys«T;Fr*&ln-Pbe-Gln-Ala- lrjN&ly-Glu~Gys~Aep-I«u-Asa~$br~iUa»I«u-Iys“£br“Arg~íOhr-G-ly·

Ser-leu-Iys~Arg-Ala~Ieu-HiS“âsn“Ala~Glu*0ys-S3n»Iys"*:Kir-*'Val·*' l,hr“-Ile-Ser-Xys-Pro-Cys^Gly-Lys-»I«u-Shr*I«ys-Pro*Iiys-a?o*-&ln- Âla-Glu“Ser~lys-Iys»lys-Iys~Lya~&lu~&ly~bys»lys»Gln-Glii~I»yB’''* êlet-Leu-lsp

fMlJ A iuyemçao também se refere a um AM que codifica a sequência de aminoacidos da formula (X)*

Uma parte dos resíduos de aminoácidos da formula (I) pode ser modificada por supressão f substituição ou adição de resíduos de aminoáeidos na proporção «m que a aetividade * 4 *

cia proteína aão seja reduzida* Alem disso* não só se incluem na presente invenção os ABI que codificam a sequência de aai-noácidos de comprimento completo de fórmula (II) ou as suas sequências parcialmeate modificadas mas também se inclui ima porção do AM» A invenção também se refere a um vector de expres** são que compreende 1) AM quê codifica a proteína a ser produzida; 2) ira promotor apropriado# tal como um promotor precoce de antigene ΐ de vírus ST 40, apropriadamente orientado a montante da sequência de codificação; e 3) os outros fragmentos de AM necessários paa expressar um gene exogénico na célula hospedeira. A invenção também se refere a um inserto para a produção das proteínas com a sequência de aminoácidos de for-* mula (I)* que compreende 1) a transformação de uma sélula hospedeira com © vector de expressão proporcionado pela invenção; 2) a cultura das células transformadas; e em seguida# 3) a produção da citada proteína* A invenção também se refere a uma proteína obtida por cultura das células hospedeiras transformada® pelo vector de expressão proporcionado pela presente invenção; hma ^proteína* significa 1) uma proteína com a sequência de comprimento completo de aminoácidos de fórmula (I); ou 2) uma proteína com as sequências de aminoácidos de comprimento completo mas modificadas por supressão* substituição ou adição de aminoácidos à sequência áe fórmula (i); - 5 -

3) uma parte das sequências de aminoáeidos áe 1) ou 2).

Efeito» da Invenção \_/· 0 ADH que codifica os 168 resíduos de amiuoáoidos proporcionado pela presente invenção pode ser utilizado na produção de urna proteína com a sequência de 168 aminoáeidos de comprimento completo ou seu» fragmentos. 0 referido &M po de ser ligado com qualquer promotor apropriado, tal como promotor precoce de antlgenio T de vírus S740 e inserido num vee tor de expressão. A mencionada proteína pode ser segregada pe la célula hospedeira transformada pelo citado reator de expressão* Como a proteína não sítio de glicosil&ção na sua sequência de aminoáeidos, a proteína pode ser produzida utilizando bactérias tais como E*. coli ou leveduras. à proteína produzida de acordo com & presente invenção possui actividade de diferenciação de células ou de crescimento de células da mesma maneira que as outras proteínas pertencentes à família ME* Portanto, espera-se que a proteína seja util ^‘tratamento e/ou no diagnóstico da osteopcrose e da demência* O referi do lãM pode ser itilizaâo como amostra para s isolamento de contrapartidas humanas da biblioteca de cAM construída a par tir de uma linha de células estabelecida a partir de osteoblas tomas humanos ou a partir de células de neurónios do cérebro ou de células de tumores * pescrição de uma Forma de Realização da Invenção Proteína 031-1 A proteína proporcionada pela invenção foi retirada de uma biblioteca de cABI de células H03f3^1# uma linha de células o steoblésticas estabelecida a partir da parte superior de crânios de ratos, através de uma seleeção áe hibridi-, zaçao diferencial comparada com ΙΙΗ3'Ι3* uma linha de células — 6 — 1

de fibroblastos "bem estabelecida* Então, is ando o qàM que eo difica GS2-1 de rato como amostra, seleeeionou-se um gMM que codifica 082-1 humano a partir da biblioteca áe &âlm humano* Esta sequência de nueleótidos que codifica a mencionada proteína é representada pela fórmula II. axaminou-.se a especificidade dos tecidos de GSE-1 de rato com o método de mancliamea to de Northern entre os diversos tecidos de rato, tais como cérebro, músculos, rim, fígado, baço, timo e pulmão. Gs sinais positivos, o que significa a expressão de máRH que codi-fica a citada proteína, observaram-se apenas ao cerebro»

Sj,/ 0 OSE-1 tem o seguinte perfil de característicae: 1) contém 163 resíduos de aminoócidos que incluem a primeira "metio nina no sítio de partida e é uma proteína forte-mente básica e Mdrofíiica contendo 17 a 13¾ de resíduos áe lisina em relação ao total de resíduos dos aminoãci-dos; 2) não contes sítio de glieosil&ção j 3) contém des resíduos de cisteína, o que sugere a estrutura tridimensional muito complexa do OSIr-1; 4} o perfil de 03Γ-1 mencionado em 1) a 3} sugeriu a elevada homologia entre GSP-1 e HS1, que se refere ao desenvolvimento e à diferenciação de células. Gom base em ca da uma das sequências de aminoácidos, a homologia sequen ciai entre í-lll e 032-1 de rato é calculada como sendo igual a 48,3%* Gs resíduos de acíinoácidds coo homologia ( (designados com asterisco) são indicados no esquema seguinte

- 7 - τ

1 OSF-1 mf&AiiFiãL iiiM&wm bagiesbk 100 $1

t tt t XX **36 363¾ 363¾ 3fc36 um mm^mAOT gbmgsxsgs vjxesjfg&dck WM «*» 1 32

101 150 GSB-lí 'OTOAWSSOB miM2§ SM&âlfíMB OOE372ISKF X * 3E3E 36* 1 Xtt St 36 *36 X 36*

COELTKPKPO *·** ag 4Pm«»V wW Í-2E-1 S YKEESW&AC2) GS$G2£âB0G SCEKKAB.YSAÒ C0ESIRV2KP 33 ctshkskie: 82 151 168 osjwi? Assmms mmua>

1 XX πε-ι í mmmi} .. 83 90 í-íKl e uma proteína segregada (ou um pollpéptido) e JUt 4^ # supoe-se ser um factor de diferenciação de células de earcino ma embriónico controladas pelo ácido retinoico (Fu 2o mo mura e col» , Seikagaku, 1989* 61» 1040). 0 0Si-l é muito semelhau-te a í;ll exeepto em relação à sua especificidade de tecido pa ra o osteoblastoma e cerebro. â proteína proporcionada pela invenção inclui a sequência de aminoacidos de comprimento com pleto de 031·! ou um fragmento de 033-1 com substaneialaente a mesma actiridade que 031-1. A proteína de acordo com a presente invenção pode ser segregada como parte da sequência de aminoacidos de fórmu la (I). Com base na liomologia áa sequência âe aminoácidos da cada proteína, GSE-l e provavelmente clivado no resíduo de Gin na posição 78 e no resíduo de Arg na posição 84 e, em se- «* 3 *»

gizida, I segregado como uma proteína com cerca de 9 000 dal·* toa* Portanto, a proteína de acordo com a presente invenção inclui partes da proteína de fórmula (1) e de mutantes de OSP *1 eom substituição de alguns resíduos de aminoóeidos com sabe taneialmente a mesma actividade que ÔSP-1. AM que Codifica a Proteína 0Sí?-l A expressão ”ASI que codifica a proteína de acordo ooia a presente invenção11 significa 1) um ADI que tem uma sequência de núcleotidos que codifica a sequência de aminoácidos de fórmula (I)$ ou 2) um AM que codifica ou uma parte de OSiWl ou substitutos de resíduos de aminoácidos com substancialmente a mesma actividade de 0S2F-1. lima sequência típica de nueleótidos é representada na seguinte fórmula (II) Α.2(ϊ-Ι2α-1ί(ίΙ*0Α·ϋ*0Αυ*$ΑΧ*αΑ{ϊ-0ΑΘ-0ί1ϋ*0£Κί?»Ζ&Α*ΑΜ-ϊ2Ι*&0Α*αδα!*

a/iU-GGS-GC-^AáG*MA»(}AG*iiAA*GGW*aí\á-iiââ*MIJ*&2G*AAIJ*MÇ*2!C:iW

{Hií3*!ESi£*a&â*aAÁ*fGG*0AG*2GS*â&f*&2G^2&I*a$G*00I-AM«A&I-aGÍJ-lí/iG*'J!a2*GStJ*I28*GS0-AO2*e&G*GáG«-aSG»AO[í>»GG?«ÁC2-G(JZ*dCI*&AG* 2GC-A A1J- 0Atí*AGG* A2G-AAG* AGI*- GAGr-A&iW 2G2-AAGr-Á2C- CCY- 5HxG*» AAC-2GG-AAG*AAG*CAtJ*$22-*GG2-Ges;-§â(3*,MG*MU*'2A0*GAG*220*GAG*GGI* 2CTG*GGá«G-Ax^*TG2*GAG*02Y*MI*AG2*GGG*I2G*AAG*ÁCC*AGA-AC2*GGS* AG-1- 0 2(j*A/lG*GGâ* GO X-G 2S~Q AO-ilal-» GO Y-GA2- 2GX- C AG-AáTJ-AC Ϊ- G-20-AGG-AmG-ÇGC-MG-GGG-SGS-GGCWAiir-GSY-ACC-AAG-CCG-AAtr-GOf-CM-GGU-GAlí-2CIí-AáG-MG-AAG-AM-AAG-G-AA-GGG-AA5-AAA-GAG-GAG-AAG-A2G-G2G-GA2-2AA

C*J

iíesta sequência de nucleótidos, lí é A ou G, Y ó C 9

ou f, lí I G ou 2, 2l âo» C* Tt los G» & M í f ou A. lías seguintes fórmulas (1I-I) e (ΙΖ-ΙΣ), representa ••se respectiyamente exemplos de uma forma de realização de ABF que codifica CSP-1 de rato e OSi-l humano.

Al^íC^SGG-CÂ^GilA-fÂS-O/iG^GAG-CiU-G&i^Á&Â-MiwSTiíWGGA^GGÍV (K3€^ffC^Cfe-GCá«fíÍ^Aff«f$G*Afa*ff^eGA^2^e^Sâfí-AG!&-GC!D«· GAMGC-GG(^AA(^AM~GAí^MA-0Cl^GAA-AÂA-AÁG-Giô-ÂAá-MíG-10A-GAG*Í1Gf-GGA-.GM*~2GG~CáG-i,GG-*áG2-G2G-l1GC-G2d-002-ACC-AGC-GGG~ GAC- 2G£~ GGA-* ££G- GGG~ACC~CGG- GAG~ GGG-AC-T~0GG-AG2- GGC-GGC* GAG-ÍG£^iL4A-0ÂG^AGG«áfG*MG^AGriVGAG*AGA«$Gf-ââG^Aí20*Ge2-»fGe»AÂG-5rGS-MG»AAG-.GA&.fff‘3^GGiWG02*GAG*i!GG»áAG^fAG*Gâ{^$i,G-GáG»GG2^ l1GG-.GGA-&M*2G$-eAG»Cl5G-M2-‘AGG*GGG*22&-MG-AG0»AGA-AC®-GSG« âGG-G5G-AáG-GGA«GG2^C2G-0áG»AA2i**G0$^GA€»2Gf-0áG*âiyWAO2^&2G-AGG-ASG-fGG-áAG^eGG-ACta^CTGC^MG^GfG-ACO^MG-OGG-AAG-eGS^GâA-GGG-GAG-2GA-AAG«AAG»AAG-AAâ-*AâG--GAA«GG0^M&.MÂ-GAG-GAG*AAG-A£G~GfG~GA£~£âA A‘2G-GAC—GG2-CM-GAG-fÁe*.GAG-GáG-eAG-GGíLV0GiWMiWíi!fS^GGA*GG2«» δΟΟ«220-ϊϊ^&ΟΑ«ϊϊβ^Αϊϊ*ϊίί^Α2Α·-02&-δΟΑ*δΟ$*&ϊ6-&Α2»ΑΟΜΟΐν GAA-GGA-GGG-AAG-AAA-GAG~ÁAA-*-CGA-“GM“AAA-Ai\â-G£G-AAG^AAG-2Gi-&AG-2G3GGA-GAA^2GG -CAG-aGGkAGi^GfG-SGa-GfG-GGC-AeG-AGT-GGiW GAÊ^!í)Gf-GGG^G2&-GG0-A0A^GGG^GAG-GGG*A8íweGG-AGMGA^GC2^GAG-SGe-AAG»GAA^A0C«.A'2G*MG*A0G^GA^AGA^2&f*âAS-Afe-CGe*íG0-áAe-2GG»MG-AAG~0M^22f»GGG“GGG-*GàG-2GG«*AM«fâG«GAG>*f2GwGAG»GCG-$GG-GGA-‘GAA-xG2--Gâ{>-Gíi1G--M0^ACâ-*GGC-*G2GwM6*s-AfíG«‘A&á»AG2«GGA-Α&1^α$δ-ΜΟ·Ο®Α^αθΟ-^$δ*βΑ(^Μ!Β«^ΜΑΑ*α^0Αβ*ΑΑ&-ΑΟΜ!εα-AGG^ArfCWfGG-AáG*.GOe-.2Gf£-GGG-MA-CfG^AGC^AAG-.GOe»AM-OC2-CAA^ GGA-0AA-2G2-AiiG^AAG-AAG^AAA“AAG«-GAA-GGO^AAG-AáiWGAG-GAG^AAG-. ASCkOlEG- GA2* 2ΔΑ /*ιι-π_7 - 10 -

cias áe nueleotidos que codificai a sequência de aminoacidos podem ser determinadas usando tabelas de eodões genéticos gje ralsente disponíveis· Portanto, o A3)I que codifica a proteína proporcionada pela invenção é ou o ADI com a sequência de nu-cleótidos de formula (II) ou o seu isêmero por degenerescência* A expressão nisêmere por degenerescência” significa um APS com uma sequência de núcleo tidos que codifica a proteína idêntica a GSÍ?~I mas que utiliza um codao ou codoes equivaleu tes*

Bceoarao&o do APS que Codifica a Proteína OSP-1

Os APS de acordo com a presente invenção podem ser sintetizadas por qualquer processo correntemente usado para a síntese química de oligonucleotidos com base nas sequências de nueleotidos descrita» na presente invenção* 0 AM de acordo com a presente invenção que eodifi ca 0S3F-1 áe rato pode também ser preparado por meio dos seguintes processos típicos áe tecnologia genética, que consistem em *5 + 1) semear 2,2 x 10 células pór placa (placa de cultura de plástico, 10 centímetros áe diâmetro, total de quarenta placas) de uma linba de células ooteoblásticas, MG3S3I1, estabelecida a partir da parte superior do crânio do rato (Eodama e col*, Jpn. J* Gral, Biol, 23* 899 * 901); 2) cultivar as células durante Cerca de nove dias a 37° 0, com opcional mudança do meio j 3) colectar as células quando o numero destas atinge o valor 8 x lô**-; 4) isolar & AM total das células % 5) purificar o miALM; 11

6) preparar uma biblioteca cie câã&Jf e, e© seguida, 7) elonar o sráM pretendido.

Como referências para as operações 4} a 7), indicam -se os manuais publicados tais como Molecular Oloning t A la-boratory Kanusl (1982, editado por $* Maniatis e eol* e publi cada por Cold Spring Harbor laboratory). lambém é possível isolar o cíjuDM áe células de seres humanos ou de espécies diferentes de ratos a partir de uma bi blioteca de cABI da correspondente espécie utilizando eABií de rato como amostra para seleccionar. A proteína OSI-1 pode ser produzida, por qualquer célula hospedeira, como células de 1. eoli. levedura ou animais com o promotor apropriado a cada célula* Os procedimentos pormenorizados podem realizar-se de acordo com os métodos descritos no manual de K&niatis (iMd.}, etc* A presente invenção I explicada utilizando formas de realização preferidas. Os métodos usados nas formas de rea lização preferidas são os seguintes.

Adquiriram-se enzimas de restrição nas firmas lew Eoglead Biolabs (USA) e 'falsara. tShuzo (Japão) e empregaram-se de acordo com as instruções áos fornecedores. Ia firma lakara Shuso, adquiriu-se um estojo de supressão, 14 ligase e fosfatas© alcalina de bactérias. O sistema **de síntese de cáM maijsí foi adquirido em Amerslmm (Inglaterra). A AM? traascriptadas inversa, o estojo de purificação de màBM e o adaptador BeoRI--líotl foram adquiridos em Pharmacia (Suécia). Adquiriu-se o estojo de marcação de ABI escorvado aleatoriamente à firma Boehringer n&nnheim YamaneacM (Japao). O vector de clonação 12 —

lambda gtlG e o estojo de embalagem ia vitro “Sigapatik gold" foram adquiridos em Stratagen© (Sstados Unidos da America}, A transformagao de .13» coii e a ligação de illH realizaram-se como é descrito por Maniatis e eol. (ibid*)»

EIEMPI0S

Sresmlo 1

Breparação de uma Biblioteca de cAIM a Partir de Células M0325E1 de uma linha de Células Osteoblasticas Hurínicas

Sxtraíu-se o ARM total pelo método da guanídina (Planiatis e col», iMd.) de 8 x 10^ células da linha de células osteoblésticas imirínicas, M633?3B1| depois, purificou-se o mAPJI do áSIT total com o “estojo de purificação de mARH* (Phar macia). Sintetizou-se o oABH de fita dupla a partir do raARH pelo "sistema de síntese cAPH mais". Olonou-se o eáM de tira dupla sintetizado no sector de clonação lambda gtlO depois da ligação de um adaptador de ScoHl-Hotl por meio $4 ASH ligase e empacotou-se em partículas lambda com o estojo de empacotamento in vitro "Gigapack gold”* Os fagos empacotados foram guardados em tampão SM (Haniatis e col», (ibid,)* Determinou--se a eficiência desta biblioteca infectando 35, coli 0600 (Ja panese Câncer Research Resources Bank, Instituto Racional de Sauáe éo Japão, H2Q05) com estes fagos, obtendo-se como resul tado 1,4 t. 10^ placas/micrograma de cAM*

Picagem de Olores Específicos de 1-10323131 Seleccionados por i-eio de Seleccão Diferencial contra a Linha de Oelulas fibro-blásticas Murírijcas !!lH3f3 e Reclon&ção no Yector, de Plasmí-dio nUOllS

Sintetizou-se uma amostra de cáDl radioactivo usan . do transeriptase inversa de AM? a partir de mâRH quer de célu 13

las Α03£3ΕΙ quer de células ICIH3'T3 (A200 GH1 1653}# preparadas de acordo com o mesmo método que as células KG5fil3Sl* Selec eionaram-se cerca de 1,5 2 10^ eloaes da biblioteca de cAM de dlulas S0323B1 preparadas ao Exemplo 1 por Mbridizaçao de placas usando uma amostra áe eAM radioaotivo uma a uma e obtiveram-se setenta e oito elones que se Mbràdizam especifi e&mente com uma amostra de cADH de HG323B1» ihctraíu-se o fago de ΑΊΜ de cada clone com fenol# precipitou-se com etanol a 10% (Ilsniatis e col., ibid* ) e purificou-se o inserto de cAM de cada clone depois de fraccio-namento por tamanhos por electroforese con gel de agarose do fago de AM digerido com BcoEI (Maniatis e col*# ibid.)* &?©* psraraswse amostras radio activas de cada clone a partir deles utilizando o estojo de marcação de ΑΊΜ escorvado aleatoriamen te (Boehriager Mancheis Yamarauchi)*

Subasteu-se 0,3 micrograma de mAM preparado a par tir ou âe ΓΙ03Ϊ3.31 ou de HIH523 a eleetrcforese em gel de agarose com desnaturação por formaldeído e 1rans feriu-se paca uma membrana de nylon (B20D31B* pall Bio Support, Estados Unidos da America do Morte} por transferencia capilar (Kaaiatis e col*, ibid).

Cada clone foi ainda seleecionado relativameate ã sua taxa de expressão em células Í1C323S1 e MIH313 pelo método de transferencia de Morthern com uma amostra radioactiva deri vada de cada clone. Então# eseo2heu-ss um clone# designado i-:G031 devido à sua expressão específica em células Í-10323E1* 0 inserto de cAM que se obteve por digestão do fa go clone Í- C031 com IcoRl foi clonado para dentro do vector de elonação pUGUS (íakara Shuso) enquanto se elimina o seu fosfato de extremidade 5* P®r meio áe fosfatase alcalina microbiana (Íakara. Sbuzo)# por meio de 24 APH ligase, para se produzir 0 plasmídio p;iGG3l# cuja estrutura esta representada na - 14

figura 1«

Ssqtieaslamento de ASM do laser to de oêDlí âe Ώι-ιϋΰ31

Xtepois â& digestão de pMG031 com Sphl e 3amSl, eonstrairam-se dez mutsntes de supressão usando o Mestojo de supressão de quilo-*sequênciasn (1‘akara Slraso), X&tes rautantes por supressão foram designados como pM05M., ^10031-2 .·, e pKCQ31~10 (figura 2). A sequência de ABI do inserto de eÂM de pí-lGG31 e os seus mutantes de supressão foram determinados utilizando um sequenciador automático de ÂM (modelo 370Λ, Applied 3io-sysieras) com a orientação do sítio de HindlH para o sítio de EcoRi. Seterminaram-se aprorimaáamente trezentos pares de bases da sequência de nueleotidos de cada clone e compôs-se a sequência completa de eAM combinando os dados de sobreposição das sequências* A sequência completa e a sua sequência de aminoácidos deduzida estão representadas na figura 3 e a proteína codificada por este õâM foi designada como OSP-i àe ra to* ·

Exemplo 4

Expressão Específica âe QSP-I de Rato nos lecidos

Realizou-se a transferência de lortliern para exami nar s expressão específica de OSf-1 de rato nos tecidos*

Preparou-se ΑΪ0.Τ total pelo método da guanidina a partir de timo, baço, cérebro, rim, pulmão, fígado e másculos 3unto ao esqueleto, que foram retirados áe dez ratos com a idade de quatro semanas (05731/61), adquiridos à firma 01EA J1PÁI, Inc*. Submeteram-se 10 microgramas de ÂRÉ preparado a . partir de cada tecido, M03$5E1 ou NIH3S3, a electroforese em - 15 -

gel de agarose de desnaturação com formaldeído e fixaram-se em membranas de nylon*

Digeriu-se pAC03I com 2eoRI e o fragmento do inser to de oADu foi fraccionado por tamanhos por meio de electrofo rese em gel de agarose e purificado. Sintetizou-se uma amostra radioactiva a partir deste fragmento com o "estojo de mar cação de ASB escorvado aleatoriamente*» ilealizou-se a análise da mancha áe transferencia de Ebrtiiern usando estas membranas e amostras e observou-se u ma elevada expressão em í;C3E3Bl e uma relativamente pequena expressão em cérebro e líIR3i'3 (BAgura 4*)*

Exemplo 5

Glonagão áe um cAM que Codifica Q8B»i Humano

Utilizando pACQ31 que contém cADI que codifica OSF-1 como amostra, seleecionaram-se 4 x 10^ clones áe uma bi blioteca de cÁW da parte superior das têmporas cerebrais humanas (Glonetech, Oo., número de código GIHL1094a) por Mbrl-dização em placas e depois retirou-se um clone fago positivo* 0 elone foi designado HBB.1* Então, isolou-se o inserto áe cAPI? em HBE1 por digestão com ScoRI e ligou-se a pUGUS (faka ra Shuso, ΰο·, Japão) para criar pBBR.1 que corresponde a pMG031»

Exemplo 6

Sequenciamento de AM do inserto de cÁM de pHBRl

Depois da digestão de pHBEl com BstI e BamHI, conjr ’ truíram-se dez mutantes de supressão usando o “estoco de supressão de quilo-sequSneias" (fakara Shuzo). Estes mutaates obtidos por supressão foram designados como pHBEl-Ι, pBBEl-2, pHBRl—3 * *·· ô pHBRl—10. 16

As sequências &e àW âo inserto é&M de pHBEl e os seus mutantes obtidos por supressão foram determinados usando um sequeneisdor de AM automático (modelo 370A* Applied (Bio-systems), na orientação do sítio de HindIII* Beterminaram-s e aprosdLaadasente duzentos pares de bases da sequencia de nucleé tidos de cada clone e a sequência completa de cAM foi constituída combinando os dados áe sobreposição das sequências. Â sequência completa e a sua sequência áe aminoaeidos deduzida estão representadas na Figura 6»

Exemplo 7

Gonstrucão de um vector áe Expressão cara 03ff-l e produção de OSB-1 Usando esse Tector s

Eealizou-se a expressão de GSP-l procedendo de a-cordo com o processo descrito no Fedido de Patente Japonesa Publicado para Inspecção Publica Sbo 63-267288 com o título l,Kétod.o para Expressar proteínas em Oelulas Animais Usando G-e nes Amplificados In ¥itro”*

Inseriu-se o cAM para 081-1 no vector de cassete pHS©747 (Japanese Oancer Research iiesources Bank» Instituto ilaoional de Saúde do Japão, ¥1047) entre o promotor precoce de antigene SY4C T e o sinal adicional poli á, como se descre ve mais adiante.

Sm primeiro lugar, removeu-se o sítio de EcoAI a montante do promotor precoce do antigenio S/φ 1' de pMSG747 por x3reenchimento da folga usando fragmento de Klenow ('fakara Sbuso), seguido de religação com ligase. Introduziu-se um úni co novo sítio de EcoHI no único sítio de PstI entre o promotor 8 ¥40 e o sinal poli A inserindo um oligonueleotido liga-dor ScoRI sintético* 0 vector construído como novo, designado por pHS&757* foi utilizado para amplificação do gene in vi tro (figura 5). 17 -

& 0 fragmento de clflf de GSIf-1 foi inserido ao sitio ϋοοΕΙ de pMSQ-757* na orientação correeta para expressão de 0BB-1 e o plasmídio foi designado somo plasmídio pOil. Pode obter-se um fragmento unitário de expressão 'de 08M. de -extre aidades coesivas assimétricas (III) digerindo pGH com BstXI* 5* GiGG . GGAOSSGS 3*

Unidade de Impressão de USP-1

3f OCGOCrACC GG5?G 5* rui 7 ITo entanto, a digestão de pOPl com BstXI origina dois fragmentos de tamanhos mal to próximos e é bastante difícil separar esses dois fragmentos por fraecionamento de tamanhos. Por consequência, o plasmídlo pHSG-11 (Japanese Oaacer Research Resources Bank, Instituto Racional de Saúde do Japão, ΤΠ3049) foi inserido no sítio Ihol a Jusante do sinal poli  de pQPl* 0 plasmídio assim construído foi designado como p02?3* li listurou-se um fragmento de expressão (III) acima mencionado com um fragmento de á® (I?) preparado a partir do veetor eosmídio pHS&293 (Japanese Câncer Research Resources Bank, Instituto Racional de Saúde do Japão, 733046} » ©o» uma proporção molar igual a 20 : 1 e, ea seguida, ligou-se em série por meio de 54 lígase, como se descreve no Pedido de Patente de Invenção Japonesa Publicado para, Inspecção pública Slio63-267288 5» ÚSm GGAG&Gm 3* gene neo * sítio cos 3f CGOCGRGO GSTG 5’ fivj - 18

iânpaeotcm^ô o fragmento de AE? âe cadeia comprida ea £sgo lambda la vltro e amplificou-se em IS. coli 0m2ú6 (depositado ea Jferãentation Researoà Ias ti tate* ágeney of Industrial ucieace and feehnology, ísukuba» como iME p-911ú; ia-keshiia e ool.* 1983, G-ene 71* 9 - 18) e empacotou-se la vi-· vogoa partículas de fago lambda para preparar uma grande quan tidsde de' cosmí&io· EDw. 'jjraasfectou-se ο para células GHO (ovário de criceto chinês) pelo método convencional da copre-oigitagao coa fosfato de cálcio e seleecionaram-se os clones resistentes a «-418. Batão, preparou-se o ARI.' total de cada elouo pelo método da guaniídina e determinou-se o nível de expressão do gene G3B-X por análise· de transferencia de Northern usando. gííM de 03¥-X como amostra e escolheu-se o elone de maior produção,.

Cultivaram-ae as células do elone escolhido em al-fa-MSI contendo 10yõ de soro de feto de vitela, durante vinte e quatro horas e cletectou~se a proteína OBf-1 na cultura sobrenadaste .

Breve descrição dos besenhos

KJ A ilgura 1 representa us mapa do plasmídio priCGGl. A caixa aberta é o cnli! inserido eme codifica G8P-1 de rato. i. seta indica o gene resistente a ampicilina. G círculo fecha do é a origem da replicação do plasmídio. á I?igura 2 representa uma estrutura de segmentos do inserto cA3H de pHC031 e dos seus cies mutantes de supressão. is linhas cheias são cATM inseridos contidos em cada plasmídios. As sotas assinalam regiões erga sequência foi determinada e o sentido do sequenciamento dos núcleotidos. A figura 3 representa a sequência de nueleotidos completa do clDH inserido de pKCG^l e a sequência de aminoáci dos de GSB-i de rato dedusida da sequência de nueleotidos. % - 19

ta sublinhado o segmento ligador JcoEI-Ilotl* Um símbolo oom tris asteriscos,, aasst e o eodao de acabamento da translação« A figura 4 mostra o resultado da analise de transferencia e sanehamento de nortaera para a especificidade do tecido de expressão pelo gene de OSf-l. dada pista indica: 1« timo; 2- baço; 3- cérebro; 4- rim; 5- fígado; 6« pulmão; 7* músculos 3unto ao esqueleto; 8- células MC313E1; e 9- célu las ΙίϊΗ3$3. IBS e 23S indicam as posições de MM ribossémico« A figura 5 representa vm mapa do plasmídio pSSS757* L eaisa aberta é o sinal poli A* A seta aberta é 0 promotor precoce do antigene S 740 i5. A seta © o sentido e a posição a-proximada do gene de resistência a cloranfenieol. 0 círculo fechado é a origem âa replieação do plasmídio. A figura S representa a sequencia completa de nu- cleotidos do cAUI inserido de pHBAl e a seqencia de aminoaci-dos de OSf-1 humano dedusida a partir da sequencia de nucleó-tidos.

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Claims (2)

1. & 35 I 1 1 Η 5) I 0 A Ο ·Α Ο Processo para a expressão da proteína OSB-1 humana em células hospedeiras que possui a seguinte sequencia de aminoácidos de formula (I) ilet-iXl-.lx2-Gln-&ln-I^o?-Gln-&ln-Gln-Arg-iirg-lys-Phe-lla-Ala-Ala-Phe- Ieu~Ala—A*3-Ile—Phe- Ileibeu - Ala-Ala—Yal—Asp— 1’hr-Ala- G-lu-Ala~aly-iys-Xiys-&lU“hys-Pro-aiu-Lys-Lys-¥al-Iiys-lys-Ser-Asp-Cys-Gly-Glu- Irp-Gln- i'rp~Ser“Val-Oys*¥al-Pro- Ihr-Ser-Gly-Asp-Oys-Gly-Iieu-Gly-.Shr-Arg-Glu-Gly-Shr-Arg-íhr-Gly-Ala-Glu-Gys-Lys-G-ln-Ihr-í-let-Lys-Dhr-dln-Arg-Oys-lys-Ile-Pro-Oys-Asn-2rp-Lys~lys-Glh-Phe-&ly~Al£«Glu-0ys-lys-2yr-Gln-Phe-Gln-Ala-Trp- Gly-Glu- Gys- Asp-leu- Asn- 2hr-Ala-leu-lys-Ahr-*Arg-Ehr-Gly- Ser~Ieu~lyS“Arg-Ala-leu-Bis-Asn“Ala-A*4^Cys-Gln-Lys-I%r-?al- fhr-Ile-Ser-Iys-EcQ-Oys-Gly-lys-Iett-Ihr-Iys-PrQ-Xjys-Pro-Gln- Ala-Glu-Ser-iys-iys-lys“Xys-Ays-Glu«Gly-lys-lys-GYn-Glu-I»ys- iíet-Iieu-Asp cu na qual 1*1 I Ser ou Gin» A*2 I Ser ou Ala, 1*3 é leu ou Phe e A*4 e Asp ou Glu» . ou uma sequência de aminoácidos de formula (I) pareialmente modificada ou as suas partes, caracterizado por se cultivar células hospedeiras que foram transformadas por um veetor de expressão de MM que codifica a proteína 0S3?-1 e tipicamente tem a seguinte sequência núcleo tí dica de hases de formula IX AI‘(>I2G--ICI-CAlJ-GAh-Í,ÂI-GAG~CÃG~eAU--GGíO-2GA~AiiA-íi,IP~GCA-GCÍi!-* GG0-ff0»^G-{^A-$2¥-Al2-3í!í!G-Af^I2(^G0á-GG!IÍ-G'IG-GAI--ACI3í-GGfÍÍ- GA$-GC2-GGG-AAG~AAA-GAG-AM-GCW-GM-MA-AAG-G$G-AÂU-iLAG-2CP- GA0-SGT-&GA-GM-2GG-0á(^2GG-ÁGÍ-G2G-TGY-G£G~CGY-ACG-A&Y-GGU- - 21 - GAC-3}a!2-&Q;U-B!G-eaa-AC2-G&a-aâG-»aGG-10-T-C(3-Y-iaf-GG2-e-CI-G-AG- l1&G-MU*OáU-AGG*áTG-MO*'lGI*GA(>-A&A--ÍW^M&-âíSG-*COI-rÍGO-MG~ TGG^AAG-MG-GAU-2i12-Gffi3-&QX~GAG-i^Q~AAU-2A(A-CAG-2ri]C-CAG-&CI- AGG-GGA-GAA-!IlGi2~GAG-G,A?-MT~ÂGg-GGC-B.'S-AAG--ÁCG-ÁGA-AG!B-GG2~ AGI-CAG-MG-GGA~GGA-Cj]G--CAG-AAA--GGI-&A2-.2GI-CAG-AAU--AC!C-GíC- AOG~A2O“riGG-AáG-GGO-2G2-*^GG-AAG-O2T-AO0-AAG-GGG-AAU-OG2-OM- GCU~C{AU-2CVI-AACT-áAG“MG-ÂM«-MGr-GAA«GGu-MG-AAA-CAG“GÂG-MG A2Gr-GTG-GA2-2M na qual U é á ou Cr, I e O ou
2. 2, I e G ou 2, 2ί I A ou G, 7 I G ou G e Vi é ! ou i, ou um seu isomero de degenerescência. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos japoneses apresentados em 29 de Junho de 1990 e em 28 de Setembro de 1990* sob os 3Ps Hei-2-169,824 e Hei-2-256,81Q, res pectivamente. l>isboa, 2? de Junho de 1991 Θ ΑΘΙΗϊΕ OílCIAi ®A $®©ΜΕ5>ΛΒΕ HÍBUSTIIAI.

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