PT99068B

PT99068B - Processo para a preparacao de agentes antitromboticos tripeptidicos

Info

Publication number: PT99068B
Application number: PT99068A
Authority: PT
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1999-02-26
Also published as: EP0479489A3; CS291391A3; ATE234857T1; EP0685489B1; DK0685489T3; PT99068A; HUT59162A; DE69132884D1; DE69133217D1; KR100219993B1; NO913773L; NO309984B1; IE913423A1; EP0684258A3; AU645347B2; NZ239907A; MX9101280A; HU217441B; EP0837071A1; DE69132884T2

Description

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de inibidores da trombina representados pela fórmula:

A R»eRS tal como é proporcionada em que A(C=O)- é, inter alia, fenilglicilo, ciclo-hexilglicilo, ciclo-hexenilglicilo, tienilglicilo ou naftilglicilo, em que o grupo α-amino é de preferência

substituido por alquilo por exemplo metilo ou por um grupo alcoxicarbonilo, cicloalcoxicarbonilo ou arilcoxicarbonilo por exemplo t-butiloxicarbonilo. A(C=O)- também representa um grupo acetilo substituido em a tal como α-metoxifenilacetilo; ou um grupo biciclico tal como um grupo tetra-hidroisoquinolin-l-oilo; ou um grupo 1-amino ou (amino substituído)-cicloalquilcarbonilo tal como 1-aminociclo-hexilcarbonilo. É também proporcionado um método para a inibição da formação de coágulos de sangue em seres humanos e nos animais por administração de um inibidor da trombina da fórmula anterior e formulações farmacêuticas úteis no método.

referido processo consiste, por exemplo, na remoção de um grupo bloqueador de um composto de fórmula 1, em que P representa um grupo protector de amino.

Este invento relaciona-se com inibidores da trombina que são anticoagulantes úteis em seres humano e animais. Relaciona-se em particular com derivados do dipeptídeo L-Prolina-L-Arginina-aldeldo apresentando actividade antitrombótica.

A inibição da trombina ê correntemente conseguida pela administração de heparinas e de cumarinas. O mecanismo pelo qual estes agentes actuam foi muito estudado. As heparinas só se podem administrar parentericamente e os níveis devem ser monitorizados com muito cuidado. As cumarinas actuam por bloqueamento ou inibição da formação de trombina e requerem algum tempo para se conseguir uma eficácia máxima.

Embora tanto as heparinas como as cumarinas sejam anticoagulantes eficazes existe uma necessidade relativamente a agentes antitrombina que actuem rapidamente para evitar a formação de coágulos e que não interfiram com a acção do plasma na dissolução de coágulos existentes.

Os compostos que inibem a trombina proporcionados por este invento são representados pela fórmula 1 que se segue.

em que A é

1) um grupo da fórmula

R -C—

I

B em que R é um grupo fenilo da fórmula

em que a e a' são independentemente hidrogénio, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, trifluorometilo, hidroxi, hidroximetilo, amino, ou aminometilo; ou R é tienilo, furilo, naftilo, ou naftilo mono- ou di-substituído por alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, amino, ou mono- ou di-(alquil inferior)amino, ou hidroxi; ou R é ciclo-hexadienilo, ciclo-hexenilo, ciclo-hexilo ou ciclopentilo;

R^ é hidrogénio, metilo ou etilo;

B é alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, ou um grupo amino da fórmula

-N(R₂> (r₃)

em que R₂ e são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior, ou R₂ é hidrogénio e R₃ é acetilo, haloacetilo ou um grupo oxicarbonilo da fórmula

R₄-OC(O)em que R₄ é C^-Cg alquilo, C₂~C₆ alquenilo, C₃-C_? cicloalquilo, benzilo, nitrobenzilo, difenilmetilo, ou um grupo fenilo tal como foi definido anteriormente: contanto ainda que quando é metilo ou etilo, então B é diferente de metilo ou etilo ou A é

2) l-aminociclohexilo ou 1-aminociclopentilo em que o grupo amino é um grupo -N(R₂) (R₃) tal como foi definido anteriormente; ou A é

3) um grupo bicíclico da fórmula 2

em que Q é um radical com um carbono representado por

H \ I

C = O, -CH₂, e -C-;

ou um radical com dois carbonos representado por

H

I

-ch₂-ch₂-, -ch₂c=o ou -ch₂-c-;

Y é um radical carbono representado por -CH ,

H

I

-C-;

ou um radical de dois carbonos representado por

H

I ' -^CH2-?-contanto que um, mas não ambos, de entre Q e Y é

H

I

-cOU

-^ch2-ç-;

e, contanto ainda que, apenas um de entre Q e Y seja um radical carbono;

Rg é hidrogénio ou um grupo oxicarbonilo tal como foi definido anteriormente; e

R_g é hidrogénio, halogénio, hidroxi, alquilo inferior ou alcoxi inferior; e o círculo tracejado no interior do anel com 6 membros do grupo bicíclico indica um anel aromático ou um anel per-hidro; e seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

Os peptídeos representados pela fórmula 1 são agentes antitrombóticos úteis e podem ser utilizados com adjuvantes da terapêutica com activador do plasminogénio de tecido (tPA), estreptoquinase ou uroquinase.

Os compostos são preparados por métodos de acoplamento convencionais. Por exemplo, Boc-D-PHg é acoplado com um éster de L-prolina para formar éster de Boc-D-Phg-Pro. 0 grupo éster é removido e o Boc-D-Phg-Pro é acoplado com a forma lactama da L-arginina para proporcionar a lactama de Boc-D-Phg-Pro-Arg sob uma forma amino-protegida. 0 anel lactama de Arg é aberto por redução e o grupo amino-protector da arginina é removido para proporcionar Boc-D-Phg-Pro-Arg-aldeído. Os peptídeos são convertidos em formas salinas apropriadas tais como acetatos e sulfatos.

O invento também proporciona um método para evitar a formação de coágulos no homem e nos animais e formulações farmacêuticas úteis no método.

Os compostos do invento representados pela fórmula 1 são tripeptídeos quando A é um resíduo de amino-ácido tal como fenilglicilo (Phg), e quando A é diferente de um resíduo de amino ácido, por exemplo quando B é um grupo diferente de um grupo amino ou alquilamino, os compostos são derivados N-acilo do dipeptídeo prolina e arginina-aldeido (Pro-Arg-H). Tal como é indicado na fórmula 1, o centro assimétrico da porção A (C=0) é R ou RS enquanto que o das porções prolina e arginina-aldeido é L.

Os termos usados na fórmula 1 são aqui definidas como se segue:

Alquilo inferior refere-se a grupos ^C]_^-C4 alquilo de cadeia linear ou ramificada tais como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, etc.

Alcoxi inferior refere-se a um grupo C^-C^ alcoxi tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi, etc.

Halogénio refere-se a fluoro, cloro, bromo ou iodo.

Mono- ou di-(alquil inferior)amino refere-se a grupos tais como metilamino, etilamino, dimetilamino, metiletilamino, dietilamino, n-butilamino, n-propilamino, etc.

O termo C^-C_g alquilo’· refere-se aos grupos alquilo lineares ou ramificados tais como os grupos C₁~C₄ alquilo definidos anteriormente, para além de n-pentilo, isopentilo, n-hexilo, os grupos hexilo isoméricos, etc. C₂-C₆ alquenilo refere-se aos grupo olefínicos tais como vinilo, alilo, butenilo, pentenilo isomérico e grupos hexenilo. C₃-C₇ Cicloalquilo refere-se a hidrocarbonetos cíclicos tendo de três a 7 átomos de carbono no anel tais como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e ciclo-heptilo.

Tal como foi definido na fórmula 1, quando A ê o grupo (R) (R^) (B)C-, R pode ser um grupo fenilo que pode ser mono- ou di-substituído. Exemplos desses grupos fenilo são fenilo (a e a'=

Η), 4-metilfenilo, 3-etilfenilo, 4-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 3-etoxifenilo, 2-metoxifenilo, 3-isopropoxifenilo, 4-hidroxifenilo, 4-clorofenilo, 3-clorofenilo, 2-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 3-bromofenilo, 4-fluorofenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-trifluorometilfenilo, 4-hidroximetilfenilo, 2-hidroximetilfenilo, 3-aminofenilo, 4-aminofenilo, 3-amino-4-clorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 3-hidroxi-4-fluorofenilo, 3-hidroxi-4-metilfenilo,

3- metoxi-4-hidroxifenilo, 3-cloro-4-etoxifenilo, e grupos fenilo mono- e di-substituídos afins.

Exemplos de grupos R quando R é naftilo ou um grupo naftilo mono- ou di-substítuido são grupos 1-naftilo, 2-naftilo,

6-metoxi-2-naftilo, 8-hidroxi-l-naftilo, 8-amino-2-naftilo,

4- metil-l-naftilo, 6-cloro-2-naftilo, 4-hidroxi-6-etoxi-2-naftilo, · 8-metilamino-4-cloro-2-naftilo, 6,8-dimetoxi-2-naftilo,

6-etil-l-naftilo, 4-hidroxi-l-naftilo, 3-metoxi-l-naftilo, e grupos naftilo afins.

Exemplos de grupos representados na fórmula 1 guando B é um grupo amino -N(R₂) (R₃) são amino (R₂ = R₃ = Η), metilamino, etilamino, isopropilamino, dimetilamino, e grupos amino afins; e quando R₂ é hidrogénio ^{e R}3 é um grupo carbonilo R^-O-C(O)-, exemplos desses grupos, são os grupos C^-C^ alcoxicarbonilamino tais como metoxicarbonilamino, etoxicarbonilamino, t-butoxicarbonilamino, isoamiloxicarbonilamino, etc.; os grupos C -C_ alqueniloxicarbonilamino tais como viniloxicarbonilamino, aliloxicarbonilamino, 2-buteniloxicarbonilamino, etc.; grupos C₃~C₇ cicloalcoxicarbonilamino tais como ciclopropiloxicarbonilamino, ciclopentiloxicarbonilamino, ciclo-hexiloxicarbonilamino, etc. Grupos oxicarboxilamino representados pelo termo B incluem ainda por exemplo, benziloxicarbonilamino, 4-nitrobenziloxicarbonilamino, difenilmetoxicarbonilamino, feniloxicarbonilamino, ou um grupo feniloxicarbonilamino em que a porção fenilo substituída é tal como foi aqui definida anteriormente, etc.

Exemplos dos grupos A(C=O) da fórmula 1 guando A é um radical do grupo 1 da fórmula (R) (R^J (B)C- são fenilglicilo, 3-metoxifenilglicilo, 4-metoxifenilglicilo, 4-clorofenilglicilo, 3,4-diclorofenilglicilo, 3-trifluorometilfenilglicilo, N-(t-butiloxicarbonil)fenilglicilo, N-(t-butiloxicarbonil-N-metil) fenilglicilo, α-metilfenilacetilo, a-etilfenilacetilo, α-metoxifenilacetilo,, α-isopropoxifenilacetilo, 1-naftilglicilo, 2-naftilglicilo, N-(t-butiloxicarbonil)-2-naftilglicilo, 2-tienilglicilo, 3-tienilglicilo, N-(ciclopentiloxicarbonil)-2-tienilglicilo, 2furilglicilo, N-etil-2-furilglicilo, mandeloilo, 4- cloromandeloilo, 3-metoximandeloilo, a-hidroxi-α-(2-naftil)acetilo, a-hidroxi-a-(2-tienil)acetilo, 1,4-ciclo-exadienilglicilo, 1-ciclo-hexenilglicilo, N-(t-butiloxicarbonil)-1,4-ciclo-hexadienilglicilo, ciclo-hexilglicilo, e grupos A(CO) afins.

Os compostos peptídeos representados pela fórmula 1 em que A é um grupo aquiral 1-aminociclopentilo ou 1-aminociclo-hexilo são representados pela fórmula estrutural que se segue.

C(O)-Pro-Arg-H em que p é uma ligação carbono-carbono ou -CH₂-; e R₂ e R₃ têm os mesmos significados que foram aqui anteriormente referidos. Exemplos desses tripeptídeos são N-(l-aminociclo-hexanoil)-Pro-Arg-H, N-(1-aminociclopentanoil)-Pro-Arg-H;

Ν-(1-metilaminociclo-hexanoil)-Pro-Arg-H, N-(1-t-butiloxicarbonilaminociclo-hexanoil)-Pro-Arg-H, etc.

Exemplos de peptídeos representados pela fórmula 1 em gue A é um grupo bicíclico representado pela fórmula 2 anterior são os derivados N-acilo D-l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-ilcarbonilo e D-l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-3-ilcarbonilo de Pro-Arg-H representados a seguir

os derivados de di-hidroisoindole-l-ilcarbonilo representados a seguir;

c (0) -L-Pro-L-Arg-H os derivados de oxo representados pela fórmulas >

» e os seus derivados per-hidro. Os termos R_g e Rg têm os significados que os aqui anteriormente definidos. Rg é de rência hidrogénio, e R, é de preferência hidrogénio, etoxi, cloro, ou metilo.

mesmos prefemetoxi,

Sais farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos do invento incluem os sais de adição de ácidos formados com ácidos inorgânicos e ácidos carboxilicos. Exemplos de ácido inorgânicos formadores de sais são os ácidos halídricos, clorídrico e bromídrico; o ácido fosfórico e o ácido sulfúrico. Sais de ácido carboxílico são formados com ácidos tais como ácido acético, propiónico, malónico, maleico, cítrico, succínico, málico, benzoico, fumãrico, e ácidos carboxilicos afins. Os sais de adição de ácidos são preparados de um modo convencional por exemplo por neutralização da forma base livre do composto 1 com o ácido. Sais de adição de ácidos preferidos são sais sulfato e hidrocloreto.

Apresentações preferidas do invento são compostos representados pela fórmula 1 em que A é

B onde R é um grupo fenilo

ou um grupo naftilo ou naftilo substituído, R₁ é hidrogénio e B é um grupo amino -N(R₂)(R₃). Compostos ainda preferidos são representados por aqueles em que R₂ é hidrogénio e R^ é um grupo oxicarbonilo R₄O-C(O)-.

Uma outra apresentação preferida do invento compreende compostos da fórmula 1 em que A é um grupo bicíclico (2). Compostos preferidos nesta apresentação são representados pela fórmula 1 quando A(C=O) é o 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-ilcarbonilo (fórmula 2, Q = Y =

-CHe, Rg=Rg=) e l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-3-ilcarbonilo) (fórmula 2, Q =

H

I

-CH -Ce Y = -CH₂-).

Os compostos representados pela fórmula 1 são preparados por métodos conhecidos de acoplamento de peptídeos. De acordo com um desses métodos o ácido A-COOH, em que A tem os mesmos significados que foram definidos para a fórmula 1, é acoplado com uma prolina carboxi-protegida para formar o dipeptídeo (quando A é um amino ácido) ou um éster de N-acilprolina (quando A é diferente de um amino-ácido). 0 grupo éster protector de carboxi da porção prolina do produto é removido e a forma ácido livre do dipeptídeo é acoplada com a forma lactama da arginina. A sequência da reacção anterior é ilustrada pelo esquema que se segue

ACOOH tésterde prolina(a) desesterificar

A- (C=O)-Pro-OH (b) (a)

A- (C=O)-Pro-Arg(P)lactama (c) em que P representa um grupo protector de amino.

O produto lactama de Arg(P) (c) acoplado é reduzido com hidreto de alumínio e lítio num solvente inerte para clivar o anel lactama e proporcionar o tripeptídeo na forma arginina-aldeido representada pela fórmula

A(C=O)-Pro-Arg(Ρ)-H em que Arg(P)-H representa arginina amino-protegido-aldeido.

A forma lactama da arginina é obtida por acoplamento intramolecular de arginina amino-protegida [Arg-OH]. Por exemplo, BOc-Arg(Cbz)OH representado pela fórmula

Boc-NH-CH-(CH_)-NH-C(=NH)-NHCbZ

I ^{2 3}

COOH é convertido primeiramente numa forma éster activo, tal como nm anidrido mixto activo, com um éster cloroformato, por exemplo cloroformato de etilo para dar origem a cloroformato de isobutilo. A formação de éster é realizada na presença de amina terciária tal como N-metilporfolina. A adição de uma base amina terciária mais forte tal como trietilamina efectua a acilação interna para proporcionar a forma lactama da arginina di-amino-protegida como é indicado mais abaixo.

Boc NH

c =NH I

NH-Cbz

Antes da utilização no acoplamento com o A(C=O)-Pro-OH tal como é indicado no esquema anterior, o grupo protector Boc é removido selectivamente com ácido trifluoroacético para proporcionar o grupo amino livre requerido.

O acoplamento de um composto ACOOH com um éster de prolina, guando A é um resíduo de amino-ácido, ê realizado protegendo em primeiro lugar o grupo amino do amino-ácido. São utilizados grupos protectores de amino convencionais habitualmente usados para protecção ou bloqueamento temporário do grupo amino. Exemplos desses grupos protectores incluem os grupos alcoxi, alqueniloxi, cicloalcoxi e ariloxicarbonilo tais como etoxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, tricloroetoxicarbonilo, benz iloxicarbonilo, difenilmetoxicarbonilo, e grupos afins. 0 grupo éster utilizado para proteger o grupo carboxi da prolina durante a reacção de acoplamento pode ser gualguer um dos grupos éster facilmente removíveis habitualmente usados tais como ésteres de t-butilo, benzilo, p-nitrobenzilo, p-metoxibenzilo, difenilmetilo, tricloroetilo, fenacilo, ou trialguilsililo. Ao realizar a reacção de acoplamento utiliza-se um grupo éster para a prolina gue é removível em condições sob as guais o grupo de protecção de amino permanece intacto. 0 grupo de protecção de amino do ácido de acilação ACOOH permanece assim no seu lugar para protecção do grupo amino durante o subseguente acoplamento com o composto lactam da arginina para formar c.

Os compostos representados pela fórmula 1 em que A é o grupo (R) (R_x) (B)C- e B é um grupo amino -N (Rg) (Rg) em gue Rg é hidrogénio e Rg é alguilo inferior são preparados com o composto correspondente em gue B é amino usando métodos de alguilação conhecidos. Por exemplo, o N-metil-D-fenilglicil-L-propil-L-arginina-aldeído é preparado por alguilação redutora como se segue. Difenilglicina protegida com Cbz é acoplada em DMF com éster de T-butilo de L-prolina usando diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) e hidroxibenzotriazole (HOBt) para formar o éster de t-butilo do dipeptideo Cbz-D-fenilglicil-L-prolina. O peptídeo é hidrogenado em álcool etílico sobre catalisador de paládio sobre carbono a fim de remover o grupo de protecção Cbz, adiciona-se formaldeído à mistura de redução e a hidrogenação é mantida para formar éster de t-butilo de N-metil-D-fenilglicil-L-prolina. 0 grupo amino secundário N-metilo da porção fenilglicilo é protegido com o grupo Cbz por reacção do éster de t-butilo de dipeptideo com cloroformato de benzilo em THF contendo N-metilmorfolina para formar éster de t-butilo de N-Cbz-N-metil-D-fenilglicil-L-prolina. 0 grupo éster de t-butilo é removido à temperatura ambiente em ácido trifluoroacético contendo anisole para proporcionar N-Cbz-N-metilD-fenilglicil-L-prolina. Este último dipeptídeo é então acoplado com o lactama de Arg protegida com Cbz e o anel lactama é aberto redutoramente para dar origem à Arg-aldeido tal como foi descrito anteriormente. Ambos os grupos protectores Cbz do tripeptídeo são removidos por hidrogenação sobre catalisador Pd/C para proporcionar N-metil-D-fenilglicil-L-propil-L-arginina-aldeido.

Compostos representados pela fórmula 1 em que A é (R) (Rp (B)C-, e R é ciclo-hexadienilo ou ciclo-hexenilo e B é um grupo alquilamino, -N(R₂) (R^), podem ser preparados por redução da imina formada com um aldeído de alquilo inferior com cianoboro-hidreto de sódio. De um modo semelhante essas alquilações em N podem ser realizadas com um iodeto de alquilo inferior e hidreto de sódio.

Os compostos da fórmula 1 em que A é um grupo biciclo (2) são preparados pelos mesmos métodos de acoplamento que foram referidos anteriormente. Por exemplo o peptídeo da fórmula 1 em que A representa o grupo 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolil-l-ilo é obtido por acilação de um éster de prolina, tal como éster de benzilo, com um derivado activo de 1,2,3,4-tetra-hidro-l-carboxi-isoquinolina. Os derivados activos que podem ser usados incluem os haletos de ácido tais como o cloreto ou brometo, o azeto de ácido, assim como ésteres e anidridos activos tais como os formados com os cloroformatos tal como foi descrito anteriormente. 0 azoto do anel da tetra-hidroisoquinolina (fórmula 2, R₅=H) é protegido ou alquilado durante o acoplamento acilador. Por exemplo um éster activo de N-Boc-l,2,3,4-tetra-hidro-l-carboxi-isoquinolina formado com cloroformato de iso-butilo é usado na acilação de éster de prolina. 0 produto peptídico éster de N-Boc-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-ilcarbonilprolina é desesterifiçado, o ácido livre é convertido num éster activo e este último é acoplado com a forma lactama da arginina. 0 produto lactama é então convertido na forma aldeído tal como foi descrito anteriormente para proporcionar o composto da fórmula 1 nomeadamente, Boc-l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-ilcarbonil-Pro-Arg-H.

grupo biciclo per-hidro representado pela fórmula 2 é preparado por hidrogenação de qualquer um dos ácidos parcialmente reduzidos ou insaturados por processos convencionais. Por· exemplo, ãcido 1,2,3,4-tetra-hidroisoguinolino-l-carboxílico é hidrogenado sobre óxido de platina num solvente tal como etanol ou ácido acético para proporcionar o ácido per-hidro(deca-hidro)isoquinolino-l-carboxílico. Os ácidos per-hidro são então usados tal como foi anteriormente descrito na acilação do éster de prolina. Exemplos desses derivados perhidro representados pela fórmula 1 são N-(D-decahidroisoquinolin-l-oil)-L-propil-L-arginina-aldeido N-(D-decahidroisoguinolin-3-oil)-L-prolil-L-arginina-aldeido.

As reacções de acoplamento descritas anteriormente são realizadas no frio de preferência a uma temperatura variando entre cerca de -20°C e cerca de 15°C. As reacções de acoplamento são realizadas num solvente orgânico inerte tal como dimetilformamida, dimetilacetamida, tetra-hidrofurano, cloreto de metileno, clorofórmio, e solventes comuns afins. São geralmente usadas condições anidras quando, na reacção de acoplamento, é usado um éster activo do ácido de acilação.

Os compostos do invento são melhor isolados sob a forma de sais de adição de ácidos. Sais dos compostos da fórmula 1 formados com ácidos, tais como os aqui anteriormente mencionados, são úteis como sais farmaceuticamente aceitáveis para administração dos agentes antitrombóticos e para preparação de formulações destes agentes. Outros sais de adição de ácidos podem ser preparados e usados no isolamento e purificação dos peptídeos. Por exemplo, os sais formados com os ácidos sulfónicos tais como ácido metano-sulfónico, ácido n-butano-sulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico e ácido naftaleno-sulfónico podem ser assim usados.

acídico é ajustado sendo o pH exacto

O método preferido para o isolamento e purificação dos compostos representados pela fórmula 1 preparando-se entretanto ao mesmo tempo uma forma desejada de sal estável é o descrito pelo pedido de patente copendente apresentado No. de Série

--------------. De acordo com o método, sais estáveis de ácidos inorgânicos tais como sais sulfato e hidrocloreto são proporcionados por purificação preparativa por cromatografia de fase reversa A fase aquosa compreende ácido sulfúrico ou ácido clorídrico numa concentração variando entre cerca de 0,01% e cerca de 0,05% e acetonitrilo, THF, metanol ou outros solventes apropriados servem como componente orgânico. O pH do eluente para entre cerca de pH 4 e cerca de pH 6, uma função do peptídeo particular, com uma resina básica, por exemplo resina Bio-Rad AG-1X8 na forma hidroxilo. Após ajustamento do pH, a solução do sal do tripeptídeo, por exemplo sulfato ou hidrocloreto, é liofilizada para proporcionar a forma salina purificada em pó seco. Num exemplo do processo, o sulfato bruto de D-Phg-L-Pro-L-Arg-H, contaminado com sulfato epimérico D-Arg-H é dissolvido em cerca de 0,01% de ácido sulfúrico sendo então a solução carregada numa coluna Vydac C.-RP-HPLC. Um gradiente de 2-10% de acetonitrilo em 0,01% de H₂SO₄ foi utilizado para eluir a coluna durante 10 horas. São recolhidas fracções múltiplas e as que contêm o produto desejado tal como foi determinado por RP-HPLC analítico são reunidas. 0 pH das fracções reunidas é ajustado para pH de cerca de 4,0 a cerca de 4,5 com a resina Bio-Rad Ag-lW8 no ciclo hidroxilo. Depois de filtração a solução é liofilizada para proporcionar sulfato puro de D-Phg-L-Pro-L-Arg-H.

Qs compostos proporcionados pelo invento (fórmula 1) inibem a acção da trombina em seres humanos e nos animais. A inibição da trombina é demonstrada por inibição in vivo da actividade amidase da trombina. 0 Quadro 1 que se segue indica a constante de equilíbrio aparente (Kass) para interacção entre o composto do teste (inibidor) e trombina. Os dados no quadro foram obtidos num ensaio em que a trombina hidrolisa o substrato cromogénico, N-benzoil-D-fenilalanil-L-valil-L-arginil-p-nitroanilida.

O ensaio foi realizado em 50 μΐ de tampão (Tris 0,03M, NaCl o,l5M, pH 7,4) com 25 μΐ de solução de trombina (0,21 mg/ml de pó trombostato em Tris 0,06, NaCl 0,3M, pH 7,4) e 150 μΐ de uma solução aquosa do substrato cromogénico a uma concentração de 0,25 mg/ml. Foram adicionadas soluções do composto do teste (25 μΐ) com várias concentrações. As taxas de hidrólise do substrato foram medidas por monitorozação das reacções a 405 nm para a libertação de p-nitroanilina. Curvas padronizadas foram realizadas registando-se a concentração de trombina livre em relação à taxa de hidrólise. As taxas de hidrólise observadas com os compostos do teste são então convertidas nos valores da trombina livre nos respectivos ensaios por utilização de curvas padronizadas. A trombina ligada (ligada ao composto do teste) foi calculada subtraindo a quantidade de trombina livre observada em cada ensaio da quantidade inicial conhecida de trombina usada no ensaio. A quantidade de inibidor livre em cada ensaio foi calculada por subtracção do número de moles de trombina ligada do número de moles de inibidor adicionado (composto do teste).

valor Kass é a constante de equilíbrio hipotética para a reacção entre trombina e o composto do teste (I).

Trombina + I--> Trombina - I <[Trombina I]

Kass= [(Trombina)χ(I)]

Kass foi calculado para uma gama de concentrações dos compostos do teste e o valor médio é referido em unidades de litro por mole.

QUADRO 1

Inibição da Actividade Amidase da Trombína

Amidase de Trombina 6

Inibidor de teste A(C=O)D-Fenilglicilo

N-Boc-D-fenilglicilo

N-Boc-D-fenilglicilo (sal sulfato)

N-Boc-D-(4-hidroxi)fenilglicilo

N-Boc-D-(4-metoxi)fenilglicilo

N-Boc-DL-(3,4-dicloro)fenilglicilo

N-Acetil-D-(4-metoxi)fenilglicilo

N-Boc-D-1-naftilglicilo

N-Boc-D-2-naftilglicilo

N-Boc-DL-1-naftilglicilo

N-Boc-D-(6-metoxi)-2-naftilglicilo

N-Boc-D-2-tienilglicilo

N-Boc-D-ciclo-hexilglicilo

N-Metil-D-fenilglicilo

N-Boc-N-metil-D-fenilglicilo (R)-α-Metilfenilacetilo (R)-α-Etilfenilacetilo (R) -α-Metoxifenilacetilo (S) -α-Metilfenilacetilo

N-Boc-DL-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin1-ilcarbonilo

DL-1,2,3,4-Tetra-hidroisoquinolin-lilcarbonilo

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5.2 11,0

7.5

4.2 0,2

3,8 (1/mole)

87,7

1/

A(C=O)- refere-se à fórmula 1. A não ser que indicado de outro modo os inibidores do teste apresentavam-se sob a forma de sais acetato.

A actividade anticoagulante dos compostos do invento foi determinada em testes padronizados. 0 Quadro 2 que se segue apresenta os dados obtidos com compostos representativos do invento em testes usados para determinar o tempo de protrombina, o tempo da trombina e o tempo da tromboplastina parcial activada (APTT). Os valores numéricos no quadro são as concentrações dos compostos do teste (ng/ml) requeridas para prolongar 2 vezes a coagulação nos três testes. A avaliação do tempo de trombina foi realizada no plasma e determinada separadamente num sistema tampão com um pH 7,5.

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Tempo de Protrombina:

Tempo de Trombina:

Os dados apresentados no Quadro 2 foram obtidos usando um instrumento CoaScreener de Tecan, Inc. nos protocolos de ensaio indicados a seguir.

μΐ plasma 50 μΐ solução salina 7 μΐ solução do teste 50 μΐ tromboplastina (Dade) μΐ plasma 50 μΐ solução salina 7 μΐ composto teste μΐ trombina bovina (2 unidade NIH/ml)

Mo Tempo de Trombina determinado em tampão pH 7,4 foi usado fibrinogénio em vez de plasma.

APTT: 50 μΐ plasma μΐ Actina (DAde) μΐ solução teste 50 μΐ CaCl₂ (0,01M).

A actividade antitrombótica de compostos representativos do invento foi determinada em testes in vivo realizados em ratazanas. O teste utilizado induziu trombose arterial na artéria carótida do rato e mediu a dose de infusão do composto do teste requerida para manter o fluxo sanguíneo durante cinquenta minutos a seguir ao tempo da oclusão. O teste foi realizado como se segue.

A trombose arterial foi induzida em ratazanas por lesão da artéria carótida. A aplicação tópica de uma solução de cloreto férrico foi usada para lesionar o vaso. Ratazanas Sprague-Dawley machos (375-450 g) foram anestesiados com xilazina (20 mg/kg,

s.c.) seguindo-se cetamina HCl (100 mg/kg, s.c.). Os animais foram colocados numa cobertura de água em que a água circulante foi mantida a 37°C. A artéria carótida foi alcançada por meio de uma incisão, cervical na linha média. Foi usada dissecação cuidadosa com uma agulha romba para expor e isolar o vaso da bainha carótida. Foi passado um fio de seda por baixo da artéria para levantar o vaso para proporcionar uma folga a fim de inserir por baixo dele um par termoeléctrico. As alterações na temperatura do vaso foram monitorizadas num registador de gráfico de faixa que tinha um temporizador de tinta de escrever. Foram usados fórceps pequenos para mergulhar discos ( 3 mm dia) de papel de filtro Whatman No. 1 numa solução FeCl₃ (35%). Os discos foram cortados com tamanhos iguais usando tubos de aço inoxidável aguçados (3 mm i.d.) mandrilados num engenho de furar. Um disco saturado foi colocado em cada artéria carótida acima do par termoeléctrico. 0 tempo entre a aplicação de FeCL₃ e o tempo ao qual a temperatura diminuiu abruptamente foi registado como o tempo para a aclusão (TTO) do vaso. O tempo médio requerido para ambos os vasos ocluirem foi usado para representar TTO para cada animal. Os compostos do teste foram dissolvidos em solução salina isotónica. Um êmbolo de seringa foi usado para fazer a infusão das soluções da droga começando 15 minutos antes da aplicação de FeCl₃ ^econtinuando durante 60 minutos após a aplicação de FeCIg. As curvas de dose-resposta foram registadas para determinar a relação entre ο log_1Q úas doses infundidas e o TTO das artérias lesadas. Um índice comparativo da actividade antitrombótica foi determinado a partir das curvas calculando a dose de infusão requerida para manter o fluxo sanguíneo durante 50 minutos (ED 50 min) .

A associação entre a oclusão do vaso e a diminuição abrupta da temperatura foi estabelecida por registo simultâneo da temperatura e do fluxo sanguíneo no mesmo registador. Uma sonda do fluxo pulsátil de Doppler foi colocada em redor- da porção da artéria carótida proximal em relação ao par termoeléctrico. A sonda registou alterações na velocidade do fluxo; assim, a sonda foi colocada num ponto em que não ocorreu trombose e em que o diâmetro interno do vaso permaneceu constante devido à distensão pelo fluxo de sangue. A temperatura de base e a velocidade do fluxo (determinados com um Directional Pulsed Doppler Flowmeter, Model 545-C, University of Iowa Bioengineering) foram registadas antes da aplicação de cloreto férrico a 35%. Os resultados foram registados como alteração percentual a partir dos valores de base (6 minutos antes da oclusão). 0 tempo ao qual a temperatura do vaso diminuiu rápidamente foi estabelecido arbitrariamente como zero é temperatura de pré- e pós-oclusão e os valores do fluxo foram referenciados a partir desse ponto.

O Quadro 3 que se segue contem os resultados obtidos com os compostos no teste de trombos induzidos quimicamente descrito anteriormente em ratazanas.

Quadro 3

Actividade Antitrombótica vs. Trombose Arterial no Rato

ED__A

Composto de Teste A(C=O) - da Fórmula 1 (mq/kq/h)

N-Boc-D-fenilglicilo	2,9
N-Boc-D-ciclohexilglicilo	11,3
N-Boc-D-1-naftilglicilo	6,4
N-Boc-DL-1-naftilglicilo	5,5
N-Boc-D-2-naftilglicilo	NA²

^ED50 ® ^a ã°se de infusão requerida para manter o fluxo de sangue durante 50 minutos.

/ ' Não activo a 4 mg/kg/h ou a 7 mg/kg/h, as doses mais elevadas testadas.

Os compostos do invento inibem a formação de coágulo sem interferência apreciável com a capacidade de lise do coágulo natural dos organismos por exemplo compostos que têm um baixo efeito inibidor sobre a fibrinólise.

O invento num dos seus aspectos proporciona um método para inibir a formação de coágulos sanguíneos no ser humano e nos animais que compreende a administração ao referido ser humano ou animal de uma dose não tóxica inibidora do coágulo eficaz de um composto representado pela fórmula 1. O composto anti-coagulante é administrado oralmente, parentericamente por exemplo por infusão intravenosa (iv), injecção intramuscular (im) ou subcutânea (sc). De preferência a administração é realizada por infusão iv.

Uma dose inibidora do coágulo eficaz varia entre cerca de 5 mg e cerca de 1.000 mg. O regime de dosagem pode variar, por exemplo para utilização profilática pode ser administrada uma dose diária única ou podem ser administradas múltiplas doses tal como 3 ou 5 vezes por dia. Em situações criticas de tratamento um composto do invento é administrado por infusão iv a uma taxa variando entre cerca de 1 mg/kg/hora e cerca de 50 mg/kg/hora e de preferência entre cerca de 2,5 mg/kg/hora e cerca de 25 mg/kg/hora.

método deste invento também é praticado em conjunção com um agente de lise do coágulo por exemplo activador do plasminogénio de tecido (tPA), tPA modificado, estreptoquinase ou uroguinase. Nos casos em que tenha ocorrido a formação de coágulo e em que uma artéria ou uma veia tenha sido bloqueada, quer parcialmente quer totalmente, utiliza-se habitualmente um agente de lise do coágulo. Um composto do invento pode ser administrado juntamente com o agente de lise ou subsequentemente à sua utilização para evitar a reocorrência da formação de coágulo.

Ao realizar o método é desejável a utilização de um composto do invento preferido. Por exemplo utiliza-se um composto preferido tal como é aqui anteriormente descrito. Peptideos preferidos são N-Boc-D-fenilglicil-L-propil-L-arginina-aldeido e aldeído N-metil-D-fenilglicil-L-propil-L-arginina que se apresentam sob forma salina por exemplo como sulfatos ou hidrocloretos. Um composto especialmente preferido do invento para utilização no método é sulfato de N-(D-l,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-l-oil)-2-prolil-2-arginina-aldeído.

O invento também proporciona formulações farmacêuticas para utilização no método terapêutico descrito anteriormente.

Formulações farmacêuticas do invento compreendem uma quantidade inibidora do coágulo eficaz de um composto representado pela fórmula 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para administração oral o composto antitrombótico é formulado em cápsulas ou comprimidos de gelatina que podem conter excipientes tais como agentes de ligação, lubrificantes, agentes de desintegração, etc. Para administração parentérica o antitrombótico é formulado num diluente farmaceuticamente aceitável por exemplo solução salina fisiológica (0,9%), de dextrose a 5%, solução de Ringer, etc.

composto antitrombótico do invento pode ser formulado em formulações de unidade de dosagem compreendendo uma dose entre cerca de 1 mg e cerca de 1.000 mg. De preferência o composto apresenta-se sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável tal como por exemplo sal sulfato, sal acetato ou um sal fosfato. Um exemplo de uma formulação de unidade de dosagem compreende 5 mg de sal sulfato de N-Boc-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginina-aldeído sal sulfato numa ampola de vidro estéril de 10 ml. Um outro exemplo de uma formulação de unidade de dosagem compreende cerca de 10 mg de sulfato N-metil-D-fenilglicil-L-propil-L-arginina-aldeído em 20 ml de solução salina isotónica contida numa ampola estéril.

Uma formulação preferida é uma forma de unidade de dosagem compreendendo entre 5 mg e 50 mg de sulfato N-(D-l,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-l-oil) -L-propil-L-arginina-aldeído em ampolas estéreis.

Os Exemplos que se seguem são proporcionados para descrever com maior detalhe o invento e não são elaborados de modo a serem limitativos do seu âmbito.

Os valores R_f nos exemplos que se seguem foram determinados por cromatografia de camada fina sobre gel de sílica usando Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) nos sistemas solventes que se seguem:

(A) clorofórmio-metanol-ácido acético, 135:15:1, v:v:v (B) acetato de etilo-ácido acético-etanol absoluto,

90:10:10, v:v:v (C) clorofórmio-metanol-ãcido acético, 90:30:5, v:v:v

Os métodos de HPLC analítica usados nos exemplos foram os seguintes:

Método 1. Waters 600E usando uma coluna de fase reversa C_lg Vydac de 0,46 cm x 10 cm. O cromatograma foi monitorizado em LDC a 220 nM usando um gradiente de A = acetato de amónio 0,01 M e B = acetonitrilo.

Método 2. Pharmacia FPLC usando um PepRPC medindo 0,5 cm x 5,0 cm. A monitorização foi feita em Pharmacia UV-M a 214 nM usando um gradiente de ou A = 0,01M de acetato de amónio ou B = acetonitrilo.

As abreviaturas usadas nos exemplos têm os significados que se seguem.

Amino-ácidos: Arg = arginina, Pro = prolina, Phg = fenilglicina

Boc = t-butiloxicarbonilo

Bzl = benzilo

Cbz = benziloxicarbonilo

DCC = diciclo-hexilcarbodi-imida

DMF = dimetilformamida

DMSO = dimetilsulfóxido

FAB-MS = espectro de massa por bombardeamento atómico rápido

FD-MS = espectro de massa de desabsorção de campo.

THF = tetra-hidrofurano

TLC = cromatografia de camada fina

Exemplo 1

Hemi-sulfato de N-Boc-D-Fenilglicil-L-propil-L-Arginina-aldeído (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)

1) Boc-D-Phg-Pro-OBZL

Uma solução de Boc-D-fenilglicina (15,0 g, 59,7 mmole) e hidrocloreto de éster de benzilo da prolina (14,43 g, 59,7 mmole) em 60 ml de DMF foi arrefecida até 0°C e adicionou-se N,N-di-isopropiletilamina (10,3 ml, 59,7 mmole) seguindo-se hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (8,1 g, 59,7 mmole) e DCC (12,3 g, 59,7 mmole). A mistura da reacção foi agitada durante 3 dias â temperatura ambiente e em seguida foi filtrada e o filtrado foi evaporado até se obter um óleo sob vácuo. O óleo foi dissolvido em 200 ml de acetato de etilo e 150 ml de ãgua e após agitação a camada orgânica foi separada, lavada três vezes com porções de 100 ml de HC1 0,lN, uma vez com 150 ml de água, três vezes com uma porção de 100 ml de bicarbonato de sódio a 5% e de novo com 150 ml de água. A solução orgânica lavada foi seca sobre MgSC>₄sendo então evaporada sob vácuo para proporcionar 24,8 g de Boc-D-Phg-Pro-OBzl sob a forma de um sólido (95% da teoria): TLC R_f (A) 0,75; FAB-MS 439 (M+).

2) Boc-D-Phg-Pro-OH produto Boc-D-Phg-Pro-OBzl obtido tal como foi descrito anteriormente (24,5 g, 55,7 mmole) foi dissolvido em 40ml de DMF e foram adicionados à solução 225 ml de álcool isopropílico e 1,0 g de 5% de catalisador Pd sobre carbono. Fez-se borbulhar azoto na mistura da reacção por meio de um tubo de dispersão de gãs e em seguida fez-se borbulhar hidrogénio durante 16 horas seguindo-se uma purga com azoto durante 5 minutos. 0 catalisador foi filtrado através de uma almofada de filtração hyflo e o filtrado foi evaporado ate â secura sob vácuo para proporcionar um resíduo sólido. 0 resíduo foi cristalizado a partir de éter dietílico contendo uma pequena porção de acetato de etilo. Foram obtidos 10,35 g do produto de esterificado. Boc-D-Phg-Pro (2), rendimento 53%: TLC R_f (A) 0,32; FAB-MS 349 (MH+); ¹H RMN (DMSO-dg), í 1,35 (s, 9H), 1,71-2,10 (m, 4H), 3,10 (m, 1H) , 3,74 (Μ, 1H) , 4,20 (m, 1H) , 5,45 (d, 1H) , 7,09 (d, 1H) , 7,25-7,40 (m, 5H), 12,50 (sl, 1H).

3) Boc-L-Arg (cbz)-OH

Hidrocloreto de N-Boc-arginina (Boc-Arg-OH-HCl). (82,1 g, 250 mmole) foi dissolvido em 240 ml de NaOH 5N num balão de fundo redondo de 3 tubuladuras. A solução foi arrefecida até -5°C e adicionou-se cloroformato de benzilo (143 ml, 1,0 mole, 4 eq.) gota a gota durante 55 minutos enquanto o pH da mistura era mantido a 13,2-13,5 com NaOH 5N (250 ml). A mistura da reacção foi agitada durante uma hora a -5°C após a adição de cloroformato ficar completa. A mistura da reacção foi diluída com 100 ml de agua e 500 ml de éter dietílico e a camada aquosa foi separada e extraída duas vezes com porções de 40 ml de éter dietílico. A camada aquosa foi acidificada até pH 3,0 com H₂SO₄ 3N (560 ml) e extraída com 550 ml de acetato de etilo. A camada aquosa separada foi extraída uma vez com acetato de etilo e o extracto foi combinado com extracto de acetato de etilo anterior. Os extractos combinados foram lavados com água, secos sobre MgSO₄ e evaporados até à secura sob vácuo. O resíduo foi triturado com éter e o produto precipitado foi filtrado e seco. Foram obtidos 66,1 g de (3) Boc-Arg(Cbz)-OH (65% da teoria): TLC R_f (C) 0,43;FD-MS (M+).

¹H-RMN (CDC1₃), δ 1,42 (s, 9H), 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H), 7,30-7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H) ,

4) Boc-Arg (Cbz)-Lactam

Uma solução de Boc-Arg(Cbz)-OH (3) preparada tal como foi descrito anteriormente (6,60 g, 0,162 mole) em 230 ml de THF seco foi arrefecida até -10° num banho de gelo-acetona. À solução fria foi adicionada N-metilmorfolina (18,7 ml, 1,05 eq) seguindo-se cloroformato de isobutilo (22,5 ml, 1,05 eq) e a mistura foi agitada durante 5 minutos a -10°C. Em seguida, adicionou-se trietilamina (23,5 ml, 1,05 eq) e a mistura foi agitada durante 1 hora a -10^eC e à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura da reacção foi vertida num litro de uma mistura de gelo-água e o produto (4) precipitou. O precipitado foi filtrado, lavado com água fria, seco sob vácuo, e foi cristalizado a partir de acetato de etilo. Foram obtidos 38,05 g (60% da teoria) de produto 4, Boc-Arg(Cbz)-lactam: TLC R_f (A) 0,77; FD-MS 391 (MH+).

¹H RMN (CDC1₃) δ 1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H).

5) Sal Trifluoroacetato de Arg(Cbz)-Lactama

Boc-Arg(Cbz)-lactama (4) (38,0 g, 0,097 mole) foi misturada com 200 ml de ácido trifluoroacético contendo 20 ml de anisole e a mistura foi agitada a 0°C durante uma hora. A mistura da reacção foi evaporada sob vácuo sem aquecimento e foram adicionados 400 ml de éter dietílico ao resíduo. O sólido resultante foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo. Foram obtidos 40,5 g do sal trifluoroacetato produto (5): TLC R^ (C) 0,29; FD-MS 291 (MH+).

6) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-Lactama

A uma solução de Boc-D-Phg-Pro (14,5 g, 41,6 mmole), preparada tal como foi descrito na parte 2, atrãs referida, em 80 ml de DMF arrefecida até -15°C foram adicionados 4,6 ml de N-metilmorfolina seguindo-se 5,4 ml de cloroformato de isobutilo e a mistura da reacção foi agitada a -15°C durante dois minutos.

Num frasco separado TFA · Arg (Cbz)-lactama (15,3 g,

37,8 mmole, preparado tal como foi atrás descrito na parte 5), foi dissolvido em 30 ml de DMF, a solução foi arrefecida até 0°C e foram adicionados 4,6 ml de N-metilmorfolina. Depois da solução ter sido agitada a 0°C durante dois minutos foi vertida para solução de Boc-D-Phg-Pro preparada tal como foi atrás descrito. A mistura da reacção obtida foi agitada durante 4 horas a -15°C sendo então deixada aquecer até â temperatura ambiente durante a noite. Uma solução a 5% de NaHCC>₃ (5 ml) foi adicionada à mistura da reacção que foi então evaporada sob vácuo para proporcionar um óleo. O óleo foi dissolvido em 175 ml de acetato de etilo e foram adicionados 150 ml de água. Após agitação, a camada orgânica foi separada, lavada com NaHCO₃ a 5% e água, seca sobre MgSO^ e evaporada até à secura sob vácuo para proporcionar 23,0 g de Boc-D-Phg-Pro-Arg(CBz)-lactama (6) sob a forma de um sólido amorfo (98%) de rendimento). TLC R^ (A) 0,72. FAB-MS 621 (MH+).

7) Boc-D-Phg-Pro-Arg(cbz)-H

O lactama (6) (23,0 g, 37 mmole), obtido tal como foi descrito na parte 6 anteriormente referida foi dissolvido em 200 ml de THF seco e a solução foi arrefecida até -15°C sob uma atmosfera de azoto. À solução fria adicionou-se gota a gota durante 10 minutos uma solução 1M de hidreto de alumínio e litio em THF (37 ml, 37 mmole) e depois da adição ficar completa a mistura da reacção foi aquecida até 0°C e agitada durante 1 hora. Uma solução de 12 ml de THF e 12 ml de H₂SO₄ θ,5Ν foi adicionada lentamente gota a gota à mistura durante 10 minutos. A mistura da reacção foi diluida com 200 ml de acetato de etilo e 200 ml de água e depois de agitação, a camada orgânica foi separada. A camada orgânica foi lavada três vezes com porções de 150 ml de água, seca sobre MgSO₄ e evaporada até à secura sob vácuo para proporcionar 19,2 g (83% de rendimento) de BOc-D-Phg-ProArg(Cbz)-H. FAB-MS 623 (MH+).

[a] = -66,1°, C = 0,5, CHClg.

8) Hemi-sulfato de Boc-D-Phg-Pro-Arg-H

Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H (7) (18,2 g, 29,2 mmole) foi dissolvido em 100 ml de THF e 100 ml de água e 29,2 ml de ^H2^SO4 IN e 2 g de 10% de Pd/C foram adicionados â solução. Fez-se borbulhar azoto na suspensão durante 5 minutos por meio de um tubo de dispersão de gás seguindo-se hidrogénio durante 4 horas. Depois da redução ficar completa fez-se borbulhar azoto de novo durante 5 minutos. A mistura da reacção foi filtrada através de uma almofada de hyflo a fim de remover o catalisador e o filtrado foi concentrado até um volume de 100 ml por evaporação sob vácuo. Ao concentrado aquoso foram adicionados 200 ml de n-butanol e a camada orgânica foi separada da camada aquosa. A camada aquosa foi extraida três vezes com porções de 100 ml de n-butanol e os extractos foram combinados e adicionados â camada orgânica. A camada orgânica foi evaporada até à secura sob vácuo, o resíduo foi triturado com éter dietílico/éter di-isopropílico, 1:1, v:v, e o sólido foi seco sob vácuo para proporcionar 10,26 g do produto bruto (8). 0 material bruto foi dissolvido em 10% de acetonitrilo-água e a solução foi aplicada a uma coluna de 7,5 cm x 53 cm de resina HP-20 equilibrada préviamente em acetonitrilo a 10%-água. O produto foi eluido a partir das colunas por eluição feita por vãrios passos com concentrações crescentes de acetonitrilo em água (10% a 12% a 15%). As múltiplas fracções foram recolhidas e ensaiadas em relação ao produto por meio de HPLC de fase reversa. As fracções contendo o produto foram reunidas e evaporadas até à secura para proporcionar 5,42 g de produto puro, hemi-sulfato de Boc-D-Phg-Pro-Arg-H, (53% de rendimento): [a]^ = -125,6°, C = 0,5 CHC1₃; FAB-MS 489 (MH+); Tempo de Retenção em RP-HPLC (Método 2, 10-50% B durante 45 min., tempo = 32,3 min.

Exemplo 2

Sal de acetato N-(t-Butiloxicarbonil)-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginina-aldeído (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)

A uma solução de Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H, preparado tal como foi descrito na parte 7 do Exemplo 1, (38,9 g, 61 mmole) em 500 ml de ãlcool isopropílico contendo 7,1 ml, (2 eq.) de ácido acético foram adicionados 2,0 g de catalisador Pd a 10% sobre carbono. A mistura foi purificada com azoto por meio de um tubo de dispersão de gás durante 5 min fazendo-se então passar hidrogénio através da mistura durante 24 horas. Depois da redução ficar completa fez-se passar azoto através da mistura de novo durante 5 min. A mistura da reacção foi filtrada através de uma almofada de hyflo a fim de remover o catalisador e o filtrado foi evaporado até à secura proporcionando 33,6 g do produto bruto sob a forma de um sólido amorfo. 0 produto foi purificado em lotes de 5 g sobre uma coluna com 5 cm x 25 cm de Vydac C_lg. 0 produto tripeptidico foi eluido durante 8 h com um gradiente de acetonitrilo a 10-30% /acetato de amónio 0,01M. Foram recolhidas múltiplas fracções e essas fracções contendo o produto tal como foi evidenciado por HPLC de fase reversa foram reunidas e secas por congelação. Foram obtidos 11,7 g (35% de rendimento) do tripeptídeo do título tendo as características que se seguem:

FAB-MS 489 (MH+)

Análise de amino-ãcidos: Phg = 1,07; Pro = 0,94 [aJ_D = -108,9° (C = 0,5, CHClg)

Análise Elementar calculada para ^C28^H44^N6°9^!

Teorias C, 55,25; H, 7,29; N, 13,81

Encontrado! c, 55,52; H, 7,40; N, 13,93

Tempo de Retenção = 31,9 min pelo Método HPLC 2;

a 50% B durante 45 minutos.

Os compostos caracterizados nos Exemplos que se seguem 3-4 foram obtidos seguindo os processos descritos pelo Exemplo 1 sendo .a fenilglicina do Exemplo 1 substituída pelas naftilglicina e p-hidroxifenilglicina indicadas.

Exemplo 3

Diacetato de N-Boc-D-l-naftilglicil-Pro-Arg-H [a]_D = + 18,87°, C'= 0,5, 50% ácido acético FAB-MS (MH+) 539

B

Método HPLC 1, gradiente: 20% a 60% durante 60 mm.

Tempo de retenção = 42,0 min.

Exemplo 4

Diacetato de N-Boc-D-2-naftilglicil-Pro-Arg-H

Método HPLC 2, gradiente 30% a 60% B durante 60 min. Tempo de retenção = 18,0 min.

Análise elementar calculada para ^C32^H46^N6°9^ÍTeoria: C, 58,35; H, 7,04; N, 12,76

Encontrado: C, 58,59; H, 6,83; N, 13,03

Exemplo 5

Diacetato de N-Boc-D-(4-hidroxifenilglicil)-Pro-Arg-H

Método HPLC 2, gradiente 10% a 40% B durante 40 minutos.

Tempo de retenção = 26,5 min.

Análise de amino-ãcidos: 4-hidroxifenilglicina = 0,99, prolina = 1,01.

Exemplos 6-23

Os compostos indicados no Quadro 4 que se segue foram preparados pelos métodos de acoplamento descritos pelo Exemplo 1 quando a D-fenilglicina usada no Exemplo 1 foi substituída pelo amino ácido ou ácido acético substituído [A(C=O)] indicados.

Todos os compostos no Quadro 4 são formas de sal acetato.

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Exemplo 27 sulfato de D-l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-oil-L-prolilL-arginina-aldeído

A uma solução de ácido isoquinolino-l-carboxílico (12,5 g, 0,072 mole) em 185 ml de ácido acético glacial foram adicionados 2 g de óxido de platina e a suspensão foi hidrogenada à temperatura ambiente sob uma pressão de hidrogénio de 60 psi num aparelho de hidrogenação de Parr durante 24 horas. A mistura da reacção foi filtrada através de uma almodada de filtração (celite) para remover o catalisador e o filtrado foi evaporado até â secura in vacuo. 0 resíduo sólido foi triturado com água, filtrado e seco para proporcionar 8 g (rendimento 63£%) de ácido DL-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolino-l-carboxílico. Espectro de Massa-FD 178 (MH⁺); '’ή RMN (DMSO-d_g) : 5 2,80-3,00 (m, 3H) , 3,15 (m, 1H), 3,30-3,40 (m, 2H), 7,05-7,25 (m, 4H), 7,70 (m, 1H).

O produto (7,08 g, 0,04 mole) foi dissolvido em NaOH 2N (40 ml, 0,08 mole) e 40 ml de álcool t-butílico e 10,5 g (0,048 mole) de dicarbonato de di-terc-butilo foram adicionados à solução. Após agitação durante 24 horas à temperatura ambiente a massa de álcool t-butílico foi evaporada a partir da mistura da reacção. A solução aquosa resultante foi extraída com éter dietílico, a camada aquosa foi separada e acidificada com HC1 2N até pH 2,0. A fase aquosa acidificada foi extraida com acetato de etilo, o extracto foi seco sobre MgSO^ e evaporado até à secura in vacuo. 0 óleo residual foi dissolvido em éter dietílico e 7,9 ml (0,04 mole) de diciclo-hexilamina foram adicionados à solução. Após repouso a 4°C durante 4 h o precipitado de sal diciclo-hexilamina de ácido N-Boc-DL-l,2,3,4-tetra-hidro-isoquinolin-l-carboxílico foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco in vacuo.

Obtiveram-se 15,7 g (rendimento de 86%) do sal puro. Espectro de massa 459 (MH⁺).

Análise elementar calculada para ^C27^H42^N2°4^:

Teoria: C, 70,71; H, 9,23; N, 6,11

Encontrado: c, 71,07; H, 9,37; N, 5,87

O derivado protegido BoC (73,4 g, 160 mmole) foi suspenso em 200 ml de acetato de etilo e a suspensão foi lavada com ãcido cítrico 1,5 N e ãgua, foi seca sobre MgSO₄ e evaporada até à secura sob vácuo. O óleo residual foi dissolvido em acetato de etilo, a solução foi arrefecida até 0°C e adicionou-se 2,4,5-triclorofenol (31,6 g, 160 mmole) à solução seguindo-se DCC (33 g, 160 mmole). A mistura da reacção foi agitada durante uma hora a o°c.e à temperatura ambiente durante 1,5 horas. A mistura da reacção foi arrefecida até 0°C o precipitado foi filtrado e o filtrado foi evaporado até à secura sob vácuo. O óleo residual foi dissolvido em 100 ml de piridina e prolina (18,42 g, 160 mmole) e trietilamina (22,3 ml, 160 mmole) foram adicionadas à solução. Após agitação à temperatura ambiente durante 24 horas a mistura da reacção foi evaporada até à secura sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, adicionou-se ãgua e o pH foi ajustado para 9,5 com NaOH 2N. A camada aquosa foi separada, acidificada até pH 2,0 com HCl 2N, e extraída com acetato de etilo. O extracto foi seco sobre MgSO₄, filtrado e evaporado até à secura sob vacuo. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em cloreto de metileno e acetato de etilo. Após repouso a 4°C durante 4 horas formou-se um precipitado na solução, o qual foi filtrado, lavado com acetato de etilo e recristalizado a partir de cloreto de metileno/acetato de etilo. 0 produto sólido, Boc-D-l,2,3,4-tetra-hidroisoquinolin-l-oil-L-prolina (Boc-D-l-Tiq-Pro-OH), foi seco sob vácuo para dar origem a 19,6 g, rendimento de 33% do produto puro, TLC R_f (A) 0,44; FAB-MS, 375 (MH⁺);

Análise elementar calculada para C__nH_oz_N 0_;

2o 2 5

Teorias C, 64,15; H, 7,00; N, 7,48

Encontrados C, 63,26; H, 6,98; N, 7,52 [α]_β = +43,14°, C = 0,5, metanol.

Num primeiro balão, Boc-D-l-Tiq-Pro (17,8 g, 47,5 mmole) foi dissolvido em 100 ml de DMF, a solução foi arrefecida até -15 °c e foram adicionados 5,3 ml (52,3 mmole) de N-metilmorfolino e 6,2 ml (47,5 mmole) de cloroformato de isobutilo. A mistura foi agitada a -15°C durante dois min.

Num segundo balão, a lactama arginina protegida com Cbz sob a forma de sal trifluoroacético [arg(Z)-Lactama*TFA], (19,2 g, 47,5 mmole) foi dissolvido, em 40 ml de DMF, a solução foi arrefecida até 0°C, e foram adicionados 5,3 ml (52,3 mmole) de N-metilmorfolina. A mistura foi agitada durante 2 minutos a 0°C antes de ser adicionada ao primeiro balão. A mistura da reacção foi agitada durante 4 h a -15°C, sendo então aquecida lentamente até à temperatura ambiente durante a noite e foram adicionados 5 ml de NaHC0₃ a 5%. A mistura da reacção foi evaporada sob vácuo para proporcionar um óleo. 0 óleo foi dissolvido em 175 ml de acetato de etilo e 150 ml de água foram adicionados à solução. A camada orgânica foi separada, lavada com 5% de NaHCO₃, água, HCl O,1N e de novo com água antes de secagem sobre MgSO^. A solução lavada e seca foi evaporada sob vácuo até à secura para proporcionar 24,3 g (rendimento de 79%) do produto. Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-lactama, sob a forma de um sólido amorfo.

TLC R_f (A) 0,71

FAB-MS 647 (MH⁺) [a]_D ⁼ -32,8°ç C = 0,5 clorofórmio

O produto lactama de Arg(Z) obtido anteriormente (23,4 g, 36,2 mmole) foi dissolvido em 300 ml de THF seco e a solução oi colocada sob Ν₂· A solução foi arrefecida até -20°C e adicionaram-se gota a gota 37 ml de hidreto de alumínio e lítio 1M em THF (37 mmole) à solução fria durante 30 minutos. Depois da adição ficar completa a mistura foi agitada a -20°C durante 30 minutos, e adicionou-se gota a gota durante 10 minutos uma solução de 20 ml de THF e 20 ml de H₂SO₄ 0,5N. A mistura da reacção foi diluida com 400 ml de acetato de etilo e foram adicionados 400 ml de água. A camada orgânica foi separada, lavada duas vezes com porções de 150 ml de água e seca sobre MgSO₄· A camada orgânica lavada e seca foi evaporada sob vácuo para proporcionar 21 g (89% de rendimento) do produto, Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-H sob a forma de um sólido amorfo.

TLC R_f(A) 0,28.

produto Arg(Z)-H obtido tal como foi descrito anteriormente foi hidrogenado como se segue a fim de remover o grupo protector Cbz. O produto (18,1 g, 27,9 mmole) foi dissolvido em 200 ml de THF e foram adicionados 80 ml de água e 28 ml de H₂ ^S04 IN e 3,0 g de Pd a 5% sobre carbono. Fez-se borbulhar azoto através da suspensão por meio de um tubo de dispersão durante 5 minutos seguindo-se hidrogénio durante 5 horas e em seguida azoto durante 5 minutos. 0 catalisador foi filtrado e o filtrado foi concentrado até um volume de 100 ml. 0 concentrado foi diluido com 200 ml de n-butanol e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída três vezes com porções de 100 ml de n-butanol e os extractos foram combinados com a camada orgânica. A camada orgânica foi evaporada sob vácuo, e o resíduo do produto da reacção foi triturado com éter dietílico:éter di-isopropílico, 1:1, v:v, o sólido foi filtrado e seco sob vácuo para dar origem a 11,08 g de produto crú.

produto foi purificado e obtido sob a forma de sal sulfato como se segue. O produto bruto obtido tal como foi descrito anteriormente foi dissolvido em 20 ml de água e 20 ml de ₂SO₄ ΙΟΝ. A solução foi aquecida até 50°C durante 25 min, arrefecida até â temperatura ambiente e o pH da solução foi ajustado para 4,0 com resina Bio-Rad AG1-X8 (forma hidróxido). A resina foi separada da solução por filtração e a solução foi liofilizada para proporcionar 8,44 g do produto sobre sob a forma de sal sulfato, D-1-Tiq-Pro-Arg-H*H₂S0₄.

O sal sulfato (4,2 g) foi dissolvido em 0,01% de ^H2^S04 e a solução foi aplicada a duas colunas de fase reversa para HPLC com 5 cm x 25 cm (resina Vydac C₁₈) em séries. Um gradiente de concentrações crescentes de acetonitrilo (2% a 10%) foi usado para a eluição do produto salino. As fracções foram recolhidas e reunidas tendo como base o perfil analítico RP-HPLC. 0 pH das fracções combinadas foi ajustado para 4,0 usando resina AG1-X8 (resina de permuta aniónica analítica Bio-Rad com malha 50-100) em ciclo hidroxi. A solução foi filtrada a fim de remover a resina e o filtrado foi liofilizado. Foram obtidos 2,4 g (57% da teoria) de produto purificado

FAB-MS 415 (MH⁺) [a]D ⁼ ⁷⁶'¹²°' ^c = 0,5/H₂SO₄ Ο,ΟΙΝ

Análise amino ácidos: Pro, 0,92; Tiq, 1,00

Análise elementar calculada para C_.H_„N^O„S:

32 6 7

Teoria: C, 49,21; H, 6,29; N, 16,29; S, 6,26

Encontrado: C, 51,20; H, 6,17; N, 16,88; S, 5,37.

ia - Processo para a preparação de um composto da fórmula

Claims

em que A ê

1) um grupo da fórmula

R-CI

B

B em que R é um grupo fenilo da fórmula em que a e a' são independentemente hidrogénio, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, trifluorometilo, hidroxi, hidroximetilo, amino, ou aminometilo; ou R é tienilo, furilo, naftilo, ou naftilo mono- ou di-substituido por alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, amino, ou mono- ou di-(alquil inferior)amino, ou hidroxi; ou R é ciclo-hexadienilo, ciclo-hexenilo, ciclo-hexilo ou ciclopentilo; R^ é hidrogénio, metilo ou etilo;

P é hidrogénio;

B é alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, ou um grupo amino da fórmula

-N(R₂) (r₃) em que R₂ e Rg são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior, ou R₂ é hidrogénio e Rg é acetilo, haloacetilo ou um grupo oxicarbonilo da fórmula

R₄-OC(O)em que R₄ é C^-Cg alquilo, C₂-Cg alquenilo, Cg-C? cicloalquilo, benzilo, nitrobenzilo, difenilmetilo, ou um grupo fenilo tal como foi definido anteriormente: contanto ainda que quando R é metilo ou etilo, então B é diferente de metilo ou etilo:ou A é
2) 1-aminociclo-hexilo ou 1-aminociclopentilo em que o grupo amino é um grupo -N(R₂) (Rp tal como foi definido anteriormente; ou A é
3) um grupo bicíclico da fórmula 2 em que Q é um radical com um carbono representado por

C-0, -CH₂-, e -C-H;

ou um radical com dois carbonos representado por

-ch₂-ch₂-, -ch₂, C = 0 ou -ch₂-c-h,

Y é um radical carbono representado por -CH₂

Η

I

-C- ;

I ou um radical de dois carbonos representado por

H

-^ch2-ç- ;

contanto que um, mas não ambos, de entre Q e Y é

H

I

-Cou

-^ch2-ç-;

e, contanto ainda que, apenas um de entre Q e Y ser um radical com dois carbonos;

R₅ é hidrogénio ou um grupo oxicarbonilo tal como foi definido anteriormente; e

R_g é hidrogénio, halogénio, hidroxi, alquilo inferior ou alcoxi inferior; e o círculo tracejado no interior do anel com 6 membros do grupo bicíclico indica um anel aromático ou um anel per-hidro; e dos seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis;

caracterizado por compreender a remoção de um grupo bloqueador de um composto de fórmula 1, em que P representa um grupo protector de amino.

2â.

- Processo para a preparação de um composto da fórmula

0 H L Η NH )—C—Ν —CH-(CH₂)₃-N-C— NH—Ρ

Ν I

C=O

I

A R RS

C—O i

H em que A é

1) um grupo da fórmula

T¹

R-CI

B em que R é um grupo fenilo da fórmula a

a' em que a e a' são independentemente hidrogénio, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, trifluorometilo, hidroxi, hidroximetilo, amino, ou aminometilo; ou R é tienilo, furilo, naftilo, ou naftilo mono- ou di-substituido por alquilo inferior, alcoxi inferior, halogénio, amino, ou mono- ou di-(alquile/inferior)amino, ou hidroxi; ou R é ciclo-hexadienilo, ciclo-hexenilo, ciclo-hexilo ou ciclopentilo;

R^ é hidrogénio, metilo ou etilo;

P é hidrogénio;

B é alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, ou um grupo amino da fórmula

-N(R₂) (r₃) em què R₂ e R₃ são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior, ou R₂ é hidrogénio ou alquilo inferior e R₃ é acetilo, haloacetilo ou um grupo oxicarbonilo da fórmula

R₄-OC(O)em que R₄ é C^-C^ alquilo, ^C2^C6 alquenilo, C₃~C₇ cicloalquilo, benzilo, nitrobenzilo, difenilmetilo, ou um grupo fenilo tal como foi definido anteriormente;

2) 1-aminociclo-hexilo ou 1-aminociclopentilo em que o grupo amino é um grupo -N(R₂) (R₃) tal como foi definido anteriormente;

3) um grupo bicíclico da fórmula em que q é uma ligação carbono-carbono ou -CH₂-; Y é uma ligação carbono-azoto ou -CH(R_g)-, e R_? e R_g são hidrogénio ou >C=0, contanto que quando R_? é >C=0 Y é uma ligação carbono a azoto, -CH(R_g) e R_g é hidrogénio, e q é -CH₂~; R^ é hidrogénio, alquilo inferior, benzilo ou grupo oxicarbonilo tal como foi definido anteriormente; e R_g é hidrogénio, halogénio, hidroxi, alquilo inferior ou alcoxi inferior; e dos seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis; contanto ainda que quando R₁ é metilo ou etilo então B é diferente de metilo ou etilo;

caracterizado por compreender o desbloqueamento de um composto da fórmula 1 em que P é um grupo bloqueador de amino.

3^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se preparar um composto em que A é um grupo da fórmula

T¹

R-Ccarac4a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, terizado por se preparar um composto em que B é um grupo amino da fórmula -N(R₂)(R₃).

5a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar o N-Boc-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginal e os seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

6®. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar o N-metil-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginal e os seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

7â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que A é um grupo bicíclico da., fórmula e seus sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

82. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar o sulfato de DL-1,2, 3,4-tetra-hidroisoquinolino-l-oil-L-prolil-L-arginina-aldeído.

9^a . - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por se preparar o sulfato de D-l,2,3,4-tetra-hidro isoquinolino-l-oil-L-prolil-L-arginina-aldeído.