RS20050889A - Pšenične biljke sa povećanom otpornošću prema imidazolinonskim herbicidima - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak je usmeren na pšenične biljke sa povećanom otpornošću na neki imidazolinonski herbicid. Konkretnije, predmetni pronalazak obuhvata pšenične biljke i tritikalne biljke, koje sadrže jednu ili više IMI nukleinskih kiselina iz Triticum turgidum. Predmetni pronalazak takođe obuhvata semenje koje proizvode navedene pšenične i tritikalne biljke, kao i postupke kontrolisanja korova u blizini pšeničnih biljka i tritikalnih biljaka.

Description

Pšenične biljke sa povećanom otpornošću prema

imidazolinonskim herbicidima

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se načelno na biljke koje poseduju povećanu otpornost na imidazolmonske herbicide. Konkretnije, predmetni pronalazak se odnosi na žitarice dobijene mutagenezom, unakrsnim ukrštanjem i transformacijom koje su dovele do povećane otpornosti prema imidazolinonskim herbicidima.

Pozadina pronalaska

Acetohidroksiacidna sintaza (AHAS; EC 4.1.3.18, acetolaktatna sintaza (ALS)), koju kodira Als nukleinska kiselina, prvi je enzim koji katalizuje biohemijsku sintezu amino kiselina razgranatog lanca, valina, leucina i izoleucina (Singh B.K., 1999,Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine,u: Singh B.K. (ur.) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, Nevv York, str. 227-247). AHAS predstavlja i mesto delovanja četin strukturno nesrodne familije herbicida, uključujući sulfonilureje (LaRossa RA i Falco SC, 1984, Trends Biotechnol 2:158-161), imidazolinone (Shaner i sar. 1984, Plant Phvsiol. 76: 545-546), triazolopirimidine (Subramanian i Genvick, 1989,Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidims,u (ur.): VVhitaker JR, Sonnet PE, Biocatalvsis in agricultural biotehnologv. ACS Svmposium Series, American Chemical Societv, Washington, D.C, str. 277-288) i pirimidiloksibenzoate (Subramanian

i sar. 1990, Plant Phvsiol 94:239-244). Herbicidi tipa imidazolinona i sulfonilureje u masovnoj su primeni u savremenoj poljoprivredi, usled toga što su efikasni pri niskom nivou primene i relativno netoksični za životinje. Ove familije herbicida, inhibicijom AHAS aktivnosti, sprečavaju dalji rast i razvoj podložnih biljaka, uključujući i mnoge vrste korova. Među komercijalno dostupnim imidazolinon herbicidima, biće pomenuto nekoliko primera, kao što su PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazakvin) i ARSENAL® (imazapir). Primeri herbicida tipa sulfonilureje su hlorsuifuron, metsulfuron

metil, sulfometuron metil, hlorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nikosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron, imazosulftiron, pirazosulfuron etil i halosulfuron.

Usled visoke efikasnosti i niske toksičnosti, imidazolinonski herbicidi pogodni su za primenu raspršivanjem preko široke oblasti pod vegetacijom. Mogućnost rasprišivanja herbicida preko velike površine pod vegetacijom, smanjuje troškove vezane za uspostavljanje i održavanje plantaža, a smanjuje se i potreba za neposrednom pripremom pre primene ovakvih hemikalija. Raspršivanje preko površine željenih otpornih vrsta takođe omogućava postizanje maksimalnog prinosa željene vrste, zbog odsustva kompetitivnih vrsta. Ipak, mogućnost primene postupka raspršivanja zavisi od prisustva imidazolinon- otpornih vrsta željene u vegetaciji oblasti preko koje se herbicid raspršuje.

Među glavnim poljoprivrednim biljkama, neke leguminozne vrste, kao što je soja, prirodno su otporne na imidazolinonske herbicide, usled sposobnosti da brzo metabolišu herbicidna jedinjenja (Shaner i Robson, 1985, VVeed Sci. 33:469-471). Druge biljke, kao što je kukuruz (Nevvhouse i sar. 1992, Plant Phvsiol. 100:882-886) i pirinač (Barrett i sar., 1989,Crop Safeners for Herbicides,Academic Press, New York, str. 195-220) podložne su delovanju imidazolinonskih herbicida. Diferencijalna osetljivost na imidazolinonske herbicide zavisi od hemijske prirode određenog herbicida i razlika u metabolizmu jedinjenja od toksičnog do netoksičnog oblika u svakoj biljci (Shaner i sar. 1984, Plant Phvsiol. 76:545-546; Brown i sar. 1987, Pestic. Biochem. Phvsiol. 27:24-29). Ostale fiziološke razlike među biljkama, kao što su apsorpcija i translokacija, takođe mogu imati važnu ulogu u osetljivosti (Shaner i Robson, 1985, VVeed Sci. 33:469-471).

Biljne kulture otporne na imidazolinone, sulfonilureje i triazolopirimidine uspešno su proizvedene upotrebom semene, mikrosporne, polenske i kalusne mutageneze kodZea mays, Brassica napus, Glycine maxiNicotiana tabacum(Sebastian i sar. 1989, Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson i sar. 1989, Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Nevvhouse i sar. 1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan i sar. 1991, Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand i sar. 1993, J. Hereditv 84:91-96). U svim navedenim slučajevima otpornost je posredovana pojedinačnim parcijalno dominantnim jedarnim genom. Prethodno su, mutagenezom semenaTriticum aestivumL. Cv Fidel (Nevvhouse isar. 1992,Plant Phvsiol. 100:882-886), takođe izolovane četiri vrste žitarica otpornih na imidazolinon. Studije nasledljivosti potvrdile su da otpornost uslovljava jedan parcijalno dominantan gen. Na osnovu alelskih studija, autori su zaključili da su se mutacije u ove četiri identifikovane linije nalazile na istom lokusu. Jedan od gena otpornosti kod Fidel kultivata nazvan je FS-4 (Nevvhouse i sar. 1992, Plant Phvsiol. 100:882-886).

Kompjutersko modelovanje trodimenzionalne konformacije AHAS inhibitornog kompleksa predviđa nekoliko amino kiselina u predloženom vezivnom džepu na mestima gde će indukovane mutacije verovatno usloviti selektivnu otpornost na imidazolinone (Ott i sar. 1996, J. Mol. Biol. 262:359-368). Biljke duvana proizvedene uz pomoć nekih od racionalno dizajniranih mutacija na predloženim vezujućim mestima AHAS enzima proizvele su zapravo specifičnu otpornost na jednu klasu herbicida (Ott i sar. 1996, J. Mol. Bici. 262:359-368).

Otpornost biljaka na imidazolinonske herbicide navedena je u brojnim patentima. U.S. Patentne publikacije pod brojevima 4,761,373, 5,333,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 i 6,222,100, opisuju primenu promenjene Als nukleinske kiseline kako bi se proizvela otpornost na herbicide kod biljaka, i posebno opisuju izvesne linije kukuruza otporne na imidazolinon. U.S. Patent No. 5,013,659 opisuje biljke koje pokazuju otpornost na herbicide, a koje poseduju mutaciju najmanje jedne amino kiseline u jednom ili više konzerviranih regiona. Mutacije koje su tamo opisane kodiraju ili unakrsnu otpornost na imidazolinone i sulfonilureje ili specifičnu otpornost na sulfonilureje, dok specifična otpornost na imidazolinone nije opisana. Takođe, U.S. Patent No. 5,731,180 i U.S. Patent No. 5,767,361 razmatraju izolovani gen sa pojedinačnom aminokiselinskom suspstitucijom u AHAS aminokiselinskoj sekvenci divljeg varijeteta (vvild type) monokotile, koja dovodi do specifične otpornosti na imidazolinone.

Do danas u stanju tehnike nije opisanaTriticum turgidumžitarica ili neka tritikalna biljka otporna na imidazolinone. Stanje tehnike takođe ne opisuje na imidazolinon otporne biljke koje sadrže najmanje jednu promenjenuTriticum turgidumAls nukleinsku kiselinu. U stanju tehnike takođe nije prethodno opisana na imidazolinone otporna žitarica koja sadrži mutacije na drugim genomima od onog od kojeg je dobijen FS-4 gen. S toga je u stanju tehnike potrebno identifikovanje imidazolinon-otpornih gena u drugim genomima i vrstama. Takođe su u stanju tehnike potrebne žitarice ili tritikalne biljne vrste koje poseduju povećanu otpornost na herbicide, kao što je imidazolinon i koje sadrže najmanje jednu promenjenu Als amino kiselinu. Takođe su potrebni postupci za kontrolisanje rasta korova u blizini ovakvih biljaka ili tritikalnih biljaka. Ove kompozicije i postupci omogućili bi primenu herbicida postupakom raspršivanja preko površina zasejanih žitaricama ili tritikalnim biljkama.

Kratak pregled pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje žitarice koje sadrže EMI nukleinske kiseline, naznačene time što se žitarice odlikuju povećanom otpornošću na imidazolinonske herbicide u poređenju sa divljim varijetetom ovih biljaka. Žitarice mogu sadržati jedan, dva, tri ili više IM I aiela. U jednom obliku izvođenja, žitarica sadrži najmanje jednu IMI nukleinsku kiselinu. U drugom obliku izvođenja, najmanje jedna IMI nukleinska kiselina izabrana je iz grupe koja se sastoji od neke Imi 1 nukleinske kiseline, neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline. U drugom obliku izvođenja, najmanje jedna IMI nukleinska kiselina sadrži IMI nukleinske kiseline Durum podvrste. U još jednom obliku izvođenja, žitarica sadrži multipne IMI nukleinske kiseline locirane na različitim genomima. U narednom obliku izvođenja, multipne IMI nukleinske kiseline obuhvataju Imi 2 nukleinske kiseline Durum podvrste i Imi 3 nukleinske kiseline Durum podvrste. Poželjno je da IMI nukleinske kiseline kodiraju proteine koji sadrže mutaciju u konzerviranoj aminokiselinskoj sekvenci, izabranoj iz grupe koja se sastoji od Domena A, Domena B, Domena C, Domena D i Domena E. Još je poželjnije da je mutacija u konzerviranom Domenu E. Takođe su ovim pronalskom obezbeđeni delovi biljaka i biljna semena dobijena od biljaka koje su ovde opisane.

IMI nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu sadržati nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: nekog polinukleotida od SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23; nekog polinekleotida koji kodira polipeptid od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:24, nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida od bilo kojeg od prethodno pomenutih polinukleotida; i neki polinukleotid kompelmentaran bilo kojem od prethodno pomenutih polinukleotida.

Biljke iz predmetnog pronalaska mogu biti transgene ili ne-transgene biljke. Primeri ne-transgenih žitarica sa povećanom otpornošću na imidazolinonske herbicide obuhvataju žitarice koje poseduju ATCC patentnu depozitnu oznaku broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 i PTA-4960; ili neki mutantni, rekombinatni ili genetički promenjeni derivat biljke sa ATCC patentnom depozitmm oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 i PTA-4960; ili potomstvo biljke sa ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 i PTA-4960; ili biljka koja je potomak bilo koje od navedenih biljaka.

Uz navedene kompozicije, predmetni pronalazak obezbeđuje nekoliko postupaka. Ovde su opisani postupci modifikovanja biljne tolerancije na imidazolinonske herbicide, koji se sastoje od modifikovanja ekspresije neke IMI nukleinske kiseline u biljaka. Takođe su opisani postupci đobijanja transgenih biljaka sa povećanom otpornošću na imidazolinonske herbicide, koji se sastoje od transformisanja biljne ćelije ekspresionim vektorom koji sadrži jednu ili više IMI nukleinskih kiselina i generisanja biljke iz biljne ćelije. Pronalazak dalje obuhvata postupak kontrole korova u blizini biljke, koji se sastoji od primene imidazolinonskih herbicida na korove i na biljku, naznačeno time da biljka pokazuje povećanu otpornost na imidazolinonske herbicide u poređenju sa divljim tipom te biljke, i da sadrži jednu ili više IMI nukleinskih kiselina. U nekim poželjnim oblicima izvođenja ovih postupaka, biljka sadrži multipne IMI nukleinske kiseline koje su locirane na različitim genomima žitarica.

Kratak opisa crteža

Crtež 1 prikazuje poredak DNK sekvence Als 2 gena, umnoženog sa genomske DNK izolovane iz Durum pšenice varijeteta Ciccio (SEQ ID NOl 1), Als 2 gen umnožen sa genomske DNK iz Durum pšenice varijeteta Colosseo (SEQ ID NO: 14), Als 2 gen umnožen sa genomske DNK Durum pšenice varijeteta Utopia (SEQ ID NO: 16) i konsenzus sekvencu Als 2 gena Durum pšenice (SEQ ID NO: 19). Među varijetetima nema polimorfizma.

Crtež 2 prikazuje poredak DNK sekvence Als 3 gena umnoženog iz genomske DNK Durum pšenice varijeteta Ciccio (SEQ ID NO: 13), Als gen umnožen iz genomske DNK Durum pšenice varijeteta Colosseo (SEQ ID NO: 15), Als 3 gen umnožen sa genomske DNK iz Durum pšenice varijeteta Utopia (SEQ ID NO: 17) i konsenzus sekvencu Als 3 gena Durum pšenice (SEQ ID NO:21). Mešu varijetetima nema polimorfizma.

Crtež 3 prikazuje poredak DNK sekvence Als 2 gena umnoženog sa genomske DNK Ciccio varijeteta (SEQ ID NO: 11), Als 2 gen umnožen sa genomske DNK iz imiđazolinon-otporne Cl 19 linije (SEQ ID NO:l), Als 2 gen umnožen sa genomske DNK imidazolinon-otporne UT15 linije (SEQ ID NO:7), Als 2 gen umnožen sa genomske DNK imidazolinon-otpome UT19 linije (SEQ ID NO:9) i konsenzusnu sekvencu Als 2 gena Durum pšenice (SEQ ID NO: 19). Nukleotidni polimorfizam koji posreduje u otpornosti Cl 19 linije na.imidazolinon označen je boldom.

Crtež 4 prikazuje poredak amino-kiselinske sekvence proteina koja je izvedena na osnovu poretka Als 2 gena iz varijeteta Ciccio (SEQ ID NO: 12), amino-kiselinsku sekvencu proteina kodiranog Als 2 genom iz imidazolinon-otporne Cl 19 linije (SEQ ID NO:2), pretpostavljenu amino-kiselinsku sekvencu proteina kodiranog Als 2 genom iz imidazolinon otporne linije UT15 (SEQ ID NO:8), pretpostavljenu amino-kiselinsku sekvencu proteina kodiranog Als 2 genom iz imidazolinon otporne UT19 linije (SEQ ID NO: 10) i konsenzusnu sekvencu Als 2 gena Durum pšenice (SEQ ID NO:20). Polimorfizam koji utiče na otpornost prema imidazolinonu kod Cl 19 linije označen je boldom.

Crtež 5 prikazuje poredak DNK sekvence Als 3 gena umnoženog sa genomske DNK Utopia varijeteta (SEQ ID NO.T7), parcijalnu Als 3 polinukleotidnu sekvencu umnoženu sa genomske DNK iz imidazolinon otporne UT12 linije (SEQ ID NO:3), Als 3 gen umnožen sa genomske DNK imidazolinon otporne UT15 linije (SEQ ID NO:5), Als 3 gen umnožen sa genomske DNK imidazolinon otporne UT19 linije (SEQ ID NO:23) i konsenzusnu sekvencu Als 3 gena Durum pšenice (SEQ ID NO:21). Nukleotidni polimorfizam koji posreduje u otpornosti linija na imidazolinon označen je boldom.

Crtež 6 prikazuje amino-kiselinski poredak pretpostavljene amino-kiselinske sekvence proteina kodiranog Als 3 genom iz varijeteta Utopia (SEQ ID NO: 18), pretpostavljenu amino-kiselinsku sekvencu polipeptida kodiranog parcijalnom Als 3 polinukleotidnom sekvencom iz imidazolinon otporne UT12 linije (SEQ ID NO:4), pretpostavljenu amino-kiselinsku sekvencu proteina kodiranog Als 3 genom iz imidazolinon otporne UT15 linije (SEQ ID NO:6), pretpostavljenu amino-kiselinsku sekvencu proteina kodiranog Als 3 genom iz imidazoiinon otporne linije UT19 (SEQ ID NO:24) i konsenzusnu sekvencu Als 3 gena Durum pšenice (SEQ ED NO:22). Polimorfizam koji utiče na otpornost prema imiđazolmonu kod UT12 linije označen je boldom.

Crtež 7 je shematska prezentacija konzervirane amino-kiselinske sekvence u AHAS genima, koje su uključene u razvijanje otpornosti prema različitim AHAS inhibitorima. Specifično amino-kiselinsko mesto odgovorno za otpornost označeno podvučenim slovima. (Preuzeto uz modifikacije iz: Devine MD i Eberlein CV, 1997,

Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide tolerance based on

altered target sites in Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry and Molecular Biology,

IOS Press Amsterdam, str. 159-185).

Detaljan opis

Predmetni pronalazak odnosi se na žitarice, delove biljaka žitarica i ćelije biljaka žitarica sa povećanom otpornošću prema imdazolinonskim herbicidima. Predmetni pronalazak takođe obuhvata semena proizvedena od strane ovde opisanih biljaka žitarica, kao i postupke za kontrolisanje korova u blizini ovde opisanih žitarica. Naglašava se da zavisno od konteksta u kojem je upotrebljeno u specifikaciji ili zahtevima, »neki« može značiti jedan ili više. Tako, na primer, pozivanje na »neku ćeliju« može značiti da najmanje jedna ćelija može biti upotrebljena.

U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »pšenična biljka« odnosi se na nekog člana rodaTriticum.Pšenične biljke iz predmetnog pronalaska mogu biti članovi rodaTriticum,uključujući bez ograničenja, 7'.aestivum, T. turgidum, T. timopheevii, T.monococcum, T. zhukovskyiT. urar tu,kao i njihove hibride. PrimeriT. aestivumpodvrsta obuhvaćenih predmetnim pronalaskom suaestivum(obična pšenica),compactum(kompakta),macha(macha),vaviilovi(vavilovi),speltaisphaecrococcum.Primeri podrvrsta71 turgidumobuhvaćenih ovim pronalaskom suturgidum, carthlicum, dicocoom, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicumidicoccoides.Primeri podvrstaT. monococcumobuhvaćenih predmetnim pronalaskom su monococcum (einkom) iaegilopoides.U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, pšenična biljka je član vrstaTriticum turgidum;i konkretno, član podvrste Durum, na primer, Ciccio, Colosseo ili Utopia.

Izraz »pšenična biljka« obuhvata pšeničnu biljku na svim nivoima zrelosti ili razvića, kao i sva tkiva ili organe (delove biljke) koji su dobijem ili su nastali od svake takve biljke, ukoliko nije drugačije jasno naglašeno kontekstom. Delovi biljke obuhvataju, bez ograničenja, na primer, drške, korenove, cvetove, ovule, prašnike, listove, embrione, meristemske regione, kalusno tkivo, anterne kulture, gametofite, sporofite, polen, mikrospore, protoplaste i slično. Predmetni pronalazak takođe obuhvata semenje dobijeno od biljaka iz predmetnog pronalaska. U jednom obliku izvođenja, semenje je čista linija povećane otpornosti na imidazolinonske herbicide u poređenju sa semenom pšenične biljke divljeg varijeteta.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata tritikalne biljke, delove tritikalnih biljaka i ćelije tritikalnih biljaka, koje poseduju povećanu otpornost na imidazolinonske herbicide. U značenju kako je ovde primenjeno, »tritikalna biljka« se odnosi na biljka koja je nastala ukrštanjem raži( Secale cereale)sa bilo tetraploidnom biljkom pšenice (na primer,Triticum turgidum)ili sa heksaploidnom biljkom pšenice (na pr.Triticum aestivum).Predmetni pronalazak takođe obuhvata semenje dobijeno od ovde opisanih tritikalnih biljaka i postupke za kontrolisanje korova u blizini ovde opisane tritikalne biljke.

Predmetni pronalazak takođe opisuje pšeničnu biljku koja sadrži najmanje jednu IMI nukleinsku kiselinu, naznačeno time što biljka ima povećanu otpornost prema nekom imidazolinonskom herbicidu, u poređenju sa divljim varijetetom te biljke. Moguće je da pšenične biljke iz predmetnog pronalaska imaju multipne IMI nukleinske kiseline koje potiču iz različitih genoma, budući da ove biljke mogu sadržati više od jednog genoma. Na primer, pšenicaTriticum turgidumsadrži dva genoma, koji se uobičajeno označavaju oznakom genomi A i B. Budući daje AHAS neophodan metabolički enzim, pretpostavlja se da svaki od dva genoma ima najmanje jedan gen koji kodira AHAS enzim (to jest, najmanje jedan Als gen), što je uobičajena situacija sa drugim metaboličkim enzimima kod tetraploidnih pšenica koje su do sada mapirane. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »Als genski lokus« označava poziciju Als gena u nekom genomu, a izrazi »Als gen« i »Als nukleinska kiselina« odnose se na nukleinsku kiselinu koja kodira AHAS enzim. Als nukleinska kiselina jednog genoma razlikuje se po svojoj nukleotidnoj sekvenci od Als nukleinske kiseline drugog genoma. Stručnjak upoznat sa stanjem tehnike može da odredi poreklo genoma iz kojeg potiče svaka Als nukleinska kiselina, putem genetičkog ukrštanja i/ ili postupaka sekvenciomranja ili postupkom egzonukleazne digestije, koji su poznati u stanju tehnike. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »Als 1 nukleinska kiselina«, »Als 2 nukleinska kiselina« i »Als 3 nukleinska kiselina« označava Als nukleinske kiseline locirane na tri različita genoma. Za potrebe ovog pronalaska, Als 3 genski lokus nalazi se u genomu A, a Als 2 genski lokus nalazi se u genomu B. Takođe za potrebe ovog pronalaska, IMI nukleinske kiseline nastale od genoma A ili B su označene kao Imi 3, odnosno, Imi 2 nukleinska kiselina.

U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »IMI nukleinska kiselina« odnosi se na neku Als nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja je mutirana u odnosu na divlji varijetet Als nukleinske kiseline, a koja obezbeđuje povećanu otpornost na imidazolinon onim biljkama koje je eksprimiraju. U značenju kao stoje ovde primenjeno, izrazi »Imi 1 nukleinska kiselina«, »Imi 2 nukleinska kiselina« i »Imi 3 nukleinska kiselina« označavaju IMI nukleinske kiseline koje se odnose na alele Als 1, Als 2 i Als 3 gena otpornosti na imidazolinon. Budući da pšenične biljke sadrže dve kopije svakog genoma, biljka dakle, sadrži dve kopije svake konkretne Als nukleinske kiseline. Na primer,Triticum turgidumbiljka sadrži dve kopije A i B genoma, pa stoga sadrži po dve kopije Als 3 i Als 2 gena. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »IMI alel« odnosi se na jednu kopiju određene IMI nukleinske kiseline. Shodno tome, za potrebe ovog pronalaska, pšenična biljka može imati dva Imi 2 alela, svaki na po jednoj kopiji B genoma.

U narednom obliku izvođenja, pšenična biljka sadrži miltipne IMI nukleinske kiseline. U značenju koje je ovde primenjeno, kada se opisuje biljka koja sadrži »multiple EVII nukleinske kiseline«, izraz »multipne IMI nukleinske kiseline« odnosi se na prisustvo različitih nukleinskih kiselina u biljci, a ne na to da li je biljka homozigotna ili heterozigotna za određeni Als lokus. Na primer, biljka koja sadrži multipne IMI nukleinske kiseline, može sadržati neku Imi 2 i neku Imi 3 nukleinsku kiselinu, umesto da sadrži dve kopije neke Imi 2 nukleinske kiseline.

Imi 2 klasa nukleinskih kiselina obuhvata Imi 2 nukleinske kiseline iz C119, UTOl, UT03, UZ05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17 i UT20 linija, koje su kasnije opisane. Imi 3 klasa nukleinskih kiselina obuhvata Imi 3 nukleinske kiseline iz UT12, UT15 i UTl9 linije koje su kasnije opisane. Svaka Imi klasa može obuhvatati Članove iz druge vrste pšenice. S toga, svaka Imi klasa obuhvata EVU nukleinske kiseline koje se po svojoj nukleotidnoj sekvenci razlikuju, ali koje se pnmenom studija nasledljivosti, koje su poznate stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, mogu označiti da potiču sa ili su lokalizovane na istom genomu pšenice.

Saglasno tome, predmetni pronalazak obuhvata pšenične biljke koje sadrže najmanje jednu IMI nukleinsku kiselinu, naznačena time da biljka poseduje povećanu otpornost prema nekom imidzolinonskom herbicidu u poređenju sa divljim varijetetom te biljke, i naznačena time daje najmanje jedna IMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imi 1 nukleinske kiseline, neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline. U jednom obliku izvođenja, biljka sadrži i neku Imi 2 i neku Imi 3 nukleinsku kiselinu. U poželjnom obliku izvođenja, Imi 2 nukleinska kiselina poseduje polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO.T. U drugom poželjnom obliku izvođenja, Imi 3 nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata neke imidazolinon-otporne tritikalne biljke. U značenju koje je ovde primenjeno »tritikalna biljka« označava neku biljku koja je dobijena ukrštanjem raži (Secale cereale) sa bilo tetraploidnom pšeničnom biljkom (na primer,Triticum turgidum)ili sa nekom heksaploidnom pšeničnom biljkom (na primer,Triticum aestivum).Za potrebe ovog pronalaska, tritikalne biljka otporne na imidazolinon sadrže najmanje jednu IMI nukleinsku kiselinu, naznačeno time da tritikalna biljka ima povećanu otpornost prema imidazolinskim herbicidima u poređenju sa divljim varijetetom te biljke i naznačeno time da je najmanje jedna IMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imi 1 nukleinske kiseline, neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline. U jednom obliku izvođenja, biljka sadrži neku Imi 2 i neku Imi 3 nukleinsku kiselinu. U požljnom obliku izvođenja, Imi 2 nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:l. U drugom poželjnom obliku izvođenja, Imi 3 nukleinska kiselina poseduje polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23.

U značenju koje je ovde primenjeno u vezi sa nukleinskim kiselinama, izraz »iz« odnosi se na nukleinsku kiselinu koja je »locirana na« ili »dobijena iz« određenog genoma. Izraz »locirana na« odnosi se na nukleinsku kiselinu sadržanu unutar nekog genoma. Takođe, u značenju koje je ovde primenjeno u vezi sa genomom, izraz »dobijena od« odnosi se na nukleinsku kiselinu koja je uklonjena ili izolovana iz tog genoma. Termin »izolovan« će kasnije biti definisan.

Predmetni pronalazak obuhvata pšenične biljke koje sadrže jednu, dve, tri ili više IMI nukleinskih kiselina, naznačeno time da biljka poseduje povećanu otpornost na imdazolinonske herbicide u poređenju su divljim varijetetom te biljke. IMI aleli mogu sadržati nukleotiđnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od polinukleotida definisanih za SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5, ili SEQ ID NO:23; neki polinukleotid koji kodira polipeptid definisan za SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:24; neki polinukleotid koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida iz bilo koje prethodno definisane sekvence; i neki polinukleotid komplementaran bilo kojim od prethodno spomenutih polinukleotida. Predmetni pronalazak takođe obuhvata tritikalne biljke koje sadrže jednu, dve, tri ili više IMI alela, naznačeno time da tritikalne biljke imaju povećanu otpornost na imidazolinonske herbicide u poređenju sa duljim varijetetom te biljke. IMI aleli mogu sadržati nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od polinukleotida definisanih u SEQ ID NOT,SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23; nekog polinukleotida koji kodira polipeptid definisan za SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:24; neki polinukleotid koji se sastoji od najmanje 60 uzastopnih nukleotidnih sekvenci bilo kojeg od prethodno definisanih polinukleotida; i neki polinukleotid komplementaran bilo kojem od prethodno pomenutih polinukleotida.

U jednom obliku izvođenja, pšenična biljka ili tritikalna biljka sadrži dve različite IMI nukleinske kiseline, naznačene time da su nukleinske kiseline dobijene ili su locirane na različitim genomima pšenice. Poželjno je da su dve nukleinske kiseline neka Imi 2 nukleinska kiselina i neka Imi 3 nukleinska kiselina. Još je poželjnije da Imi 2 nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 i da Imi 3 nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23. U narednom obliku izvođenja, pšenična biljka ili tritikalna biljka sadrži jednu IMI nukleinsku kiselinu, naznačenu time da nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23. U još jednom obliku izvođenja, pšenična biljka sadrži više od dve IMI nukleinske kiseline, naznačene time daje svaka IMI nukleinska kiselina iz različitog genoma. Poželjno je da najmanje jedna IMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23.

U jednom poželjnom obliku izvođenja pronalaska, izolovana IMI nukleinska kiselina kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži mutaciju u domenu koji je konzerviran kod nekoliko AHAS proteina. Ovi konzervirani domeni su ovde označeni kao Domen A, Domen B, Domen C, Domen D i Domen E. Crtež 7 prikazuje generalni položaj svakog domena unutar AHAS proteina. Domen A sadrži amino-kiselinsku sekvencu AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:25). Domen B sadrži amino-kiselinsku sekvencu QWED (SEQ ID NO:26). Domen C sadrži amino-kiselinsku sekvencu VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:27). Domen D sadrži amino-kiselinsku sekvencu AFQETP (SEQ ID NO:28). Domen E sadrži amino-kiselinsku sekvencu IPSGG (SEQ ID NO:29). Predmetni pronalazak takođe pretpostavlja da mogu postojati male varijacije unutar konzerviranih domena, na primer, kod biljke boca, serinski ostatak u Domenu E zamenjen je alaninom.

Saglasno, predmetni pronalazak obuhvata biljke pšenice koje sadrže IMI nukleinsku kiselinu koja kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži mutaciju ukonzerviranomdomenu izabranom iz grupe koja se sastoji od nekog Domena A, Domena B, Domena C, Domena D i Domena E. U jednom obliku izvođenja, pšenična biljka sadrži neku IMI nukleinsku kiselinu koja kodira neku amino-kiselinsku sekvencu koja posedujei mutaciju u Domenu E. U drugim poželjnim oblicima izvođenja, mutacije u konzerviranom regionu nalaze se na mestima koja su naznačena podvučenim slovima: AITG Q VPRRMIGT (SEQ ID NO:25); QWED (SEQ ID NO:26); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:27); AFQWTP (SEQ ID NO:28) i IPSGG

(SEQ ID NO:29). Jedna poželjna supstitucija je zarriena asparagina serinom u Domenu E.

Imidazolinonski herbicid može biti izabran, bez ograničenja, između PURSUIT®

(imazetapir), CADRE ® (imazapik), RAPTOR® (imazamoks), SCEPTER ®

(imazakvin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), derivat prethodno pomenutih herbicida ili smeše dva ili više prethodno pomenutih herbicida, na primer, imazapir/imazamoks (ODYSSEY®). Konkretnije, imidazolinonski herbicid može, bez ograničenja, biti izabran iz grupe 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil)-4-metil-5-okso-2-imdazolin-2-il)-3-kvinolinkarboksilna kiselina, 5-etil-2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidzolin-2-il)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-metilnikotinska kiselina i smeša metil 6-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-m-toluata i metil 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-p-toluata. Poželjna je primena 5-etil-2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinske kiseline i 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinske kiseline. Naročito je poželjna primena 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-iI)-5-(metoksimetil)-nikotinske kiseline.

Pšenične biljke koje su ovde opisane mogu biti bilo transgene pšenične biljke ili ne-transgene pšenične biljke. Slično, tritikalne biljke koje su ovde opisane mogu biti bilo transgene tritikalne biljke, bilo ne-transgene tritikalne biljke. U značenju kako je ovde primenjeno, izraz »transgena« odnosi se na biljku, biljnu ćeliju, kalus, tkivo biljke ili deo biljke koji sadrži ceo ili deo najmanje jednog rekombinantnog polinukleotida. U mnogim slučajevima, ceo rekombinantni polinukleotid ili njegov deo je stabilno integrisan u hromozom ili je stabilan ekstra-hromozomalni element, tako da se prenosi na sledeće generacije. Za potrebe pronalaska, izraz »rekombinantni polinukleotid« odnosi se na polinukleotid koji je promenjen, rearanžiran ili mođifikovan genetskim inženjeringom. Primeri obuhvataju svaki klonirani polinukleotid ili polinukleotide koji su povezani sa ili vezani za heterologne sekvence. Izraz »rekombinantni« ne odnosi se na promene polinukleotida koje su nastale usled prirodnih događaja, kao što su spontane mutacije ili zbog ne-spontane mutageneze nakon selektivnog ukrštanja. Biljke koje sadrže mutacije koje su nastale usled ne-spontane mutageneze i selektivnog ukrštanja, ovde su označene kao ne-transgene biljke i obuhvaćene su pronalaskom. U oblicima izvođenjima naznačenim time da je pšenična biljka transgena i sadrži multiple IMI nukleinske kiseline, nukleinske kiseline mogu poticati sa različitih genoma ili sa istog genoma. Alternativno, u oblicima izvođenja naznačenim time daje pšenična biljka ne-transgena i sadrži multipne IMI nukleinske kiseline, nukleinske kiseline su locirane na različitim genomima ili na istom genomu.

Primer ne-transgene pšenične linije koja sadrži jednu IMI nukleinsku kiselinu je biljna linija podneta kod ATCC pod patentnom depozitnom oznakon broj PTA-4960, a ovde je označena imenom C119 pšenična linija. C119 pšenična linija sadrži neku Imi 2 nukleinsku kiselinu. Nukleotidna sekvenca koja odgovara Als 2 genskom lokusu kod Cl 19 linije je prikazana u SEQ ID NO:l. Ostali primer ne-transgenih linija pšenice koje sadrže jednu IMI nukleinsku kiselinu su biljne linije podnesene kod ATCC pod Patentnom depoznitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4923 i PTA-4960; a koje ovde označene kao UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17, odnosno UT20 linija. Nukleotidna sekvenca koja odgovara Als 2 genskom lokusu u UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17 i UT20 linijama identična je polinukleotidnoj sekvenci opisanoj u SEQ ID NO:l.

Drugi primer ne-transgenih linija pšenice koje sadrže jednu IMI nukleinsku kiselinu su biljne linije podnešene pod ATCC patentnom depozitnom oznakom broj TA-4916 i koja je ovde označena kao UT12 linija pšenice. UT13 pšenična linija sadrži Imi 3 nukleinsku kiselinu. Nukleotidna sekvenca koja odgovara Als 3 genskom lokusu kod UT12 linije prikazana je u SEQ ID NO:3.

Sledeći primer ne-transgene pšenične linije koja sadrži jednu IMI nukleinsku kiselinu je biljna linija podnesena pod ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4919, a koja je ovde označena kao UT15 linija. UT15 linija pšenice sadrži jednu Imi 3 nukleinsku kiselinu. Nukleotidna sekvenca koja odgovara Als 3 genskom lokusu kod UT15 linije prikazana je u SEQ ID NO:5. Naredni primer ne-transgene pšenične linije koja sadrži jednu IMI nukleinsku kiselinu je biljna linija podnesena pod ATCC patentom depozitnom oznakom broj PTA-4922. Nukleotidna sekvenca koja odgovara Als 3 genskom lokusu kod UT19 linije identična je polinukleotidnoj sekvenci đefinisanoj u SEQ ID NO:23.

Odvojeni podnesci za oko 2500 semena svake imdazolinon-otporne pšenične linije izvršeni su kod American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, na dan 7. januara 2003. i 28. januara 2003. godine. Ovi podnesci načinjeni su u skladu sa uslovima i propisima Budimpeštanskog dogovora koji se odnosi na podneske mikroorganizama. Podnesci su načinjeni na period od najmanje trideset godina i na najmanje pet godina nakon prijema poslednjeg zahteva za deponovani uzorak od strane ATCC. Podnesena semena su označena patentnim depozitnim oznakama broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 i PTA-4960.

Predmetni pronalazak obuhvata pšenične biljke sa patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; mutirani, rekombinantni ili genetički promenjen derivat biljke sa patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; svako potomstvo biljke sa patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; i biljku koja je potomak ovih biljaka. U poželjnom obliku izvođenja, pšenična biljka iz predmetnog pronalaska takođe je otporna na herbicide na način karakterističan za PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920, PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960.

Ovim pronalaskom su takođe obuhvaćeni hibridi pšeničnih biljaka koje su ovde opisane i drugih biljaka pšenice. Ostale pšenične biljke obuhvataju, bez ograničenja,T. aestivumL. cv Fidel i svaku drugu pšeničnu biljku koja sadrži mutiram' gen FS-1, FS-2, FS-3 ili FS-4 (videti, U.S. Patent No. 6,339,184 i U.S. Patentnu prijavu No. 08/474,832). Poželjni hibridi sadrže kombinaciju Imi 1, Imi 2 i/ili Imi 3 nukleinskih kiselina

Termin »kultivat« ili »varijetet« odnosi se na grupu biljaka unutar jedne vrste defnisanu zajedničkom grupom karakteristika ili osobina, prihvaćenih od strane stručnjaka, koje su dovoljne da razlikuju jedan kultivat ili varijetet od drugog kultivata ili varijeteta. Ne postoji implikacija ni u jednom od dva izraza da će sve biljke unutar jednog kultivata ili varijeteta biti genetički identične, bilo na genskom ili na molekularnom nivou, ili da će bilo koja navedena biljka biti homozigotna na svim lokusima. Kultivat ili varijetet se smatra »selektovan« za određenu osobinu onda kada se selektovani kultivat ili varijetet auto-ukršta, sve biljke potomci sadrže navedenu osobinu. Izraz »ukrštena linija« ili linija odnosi se na grupu biljaka unutar kultivata definisanu istim setom karakteristika ili osobina od strane stručnjaka u stanju tehnike, dovoljnim da razlikuju jednu ukrštenu liniju ili liniju od druge čiste linije ili linije. Nema implikacija ni u jednom od termina da su sve biljke jedne ukršttene linije ili linije genetički identične na bilo genskom ili molekulskom nivou, niti da će bilo koja navedena biljka biti homozigotna na svim lokusima. Ukrštena linija ili linija smatra se »čistom linijom« za određenu osobinu ukoliko, kada se čista linija ili linija samo-ukršta, sve biljke potomci sadrže datu osobinu. U predmetnom pronalasku, osobina nastaje usled mutacije na Als genu pšenične ili tritikalne biljke ili semena.

Naglašava se da pšenična ili tritikalna biljka iz predmetnog pronalaska može, uz neku IMI nukleinsku kiselinu, sadržati i divlji tip Als nukleinske kiseline. Pretpostavlja se da imidazolinon-otporne linije mogu sadržati neku mutaciju u samo jednom od većeg broja AHAS izoenzima. S toga, predmetni pronalazak obuhvata pšenične i tritikalne biljke koje sadrže jednu ili više IMI nukleinskih kiselina, uz jednu ili više Als nukleinskih kiselina divljeg tipa.

Osim pšeničnih i tritikalnih biljaka, predmetni pronalazak obuhvata izolovane IMI proteine i nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline sadrže neki polinukleotid izabran iz grupe koja se sastoji od polinukleotida SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, ili SEQ ID NO: 23; neki polinukleotid koji kodira polipeptid definisan u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6; ili SEQ ID NO:24.; neki polinukleotid koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od prethodno pomenutih polinukleotida; i neki polinukleotid komplementaran bilo kojem od prethodno pomenutih polinukleotida. U poželjnom obliku izvođenja, IMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:l. U drugom poželjnom obliku izvođenja, IMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu opisanu u SEQ ID NO:3. U još jednom poželjnom obliku izvođenja, IMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ED NO:5.

Izrazi »AHAS protein« ili »AHAS polipeptid« odnose se na divlji varijetet proteina acetohidroksiacid sintaze, a izraz »IMI protein« odnosi se na svaki AHAS protein koji je nastao mutacijom divljeg varijeteta AHAS proteina i koji uzrokuje povećanu otpornost na imidazolinon kod biljke, biljne ćelije, dela biljke, biljnog semena ili biljnog tkiva, kada je u njima eksprimiran. U poželjnom obliku izvođenja, IMI protein sadrži polipeptid kodiran od strane polinukleotidne sekvence obuhvaćene SEQ ID NO:l. U narednom poželjnom obliku izvođenja, IMI protein sadrži polipeptid kodiran polinukleotidnom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:3. U još jednom poželjnom obliku izvođenja, IMI protein sadrži polipeptid kodiran polinukleotidnom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23. U značenju kao što je ovde primenjeno, izraz »nukleinska kiselina« i »polinukleotid« odnosi se na RNK ili DNK koja je linearna ili razgranata, jednolančana ili dvolančana ili na njihov hibrid. Izraz takođe obuhvata RNK/DNK hibride. Ovi izrazi takođe obuhvataju netranslirane sekvence lokalizovane i na 3' i na 5' kraju kodirajućig regiona gena; najmanje oko 1000 nukleotida sekvence uzvodno od 5' kraja kodirajućeg regiona i najmanje oko 200 nukleotida sekvence nizvodno od 3' kraja kodirajućeg regiona gena. Manje uobičajene baze, kao što su inozin, 5-metilcitozin, 6-metiladenin, hipoksantin i druge mogu biti korišćene za antisens, dsRNK i ribozomalno sparivanje. Na primer, pokazano je da polinukleotidi koji sadrži C-5 propin analoge uri dina i citidina, vezuju RNK sa visokim afinitetom i da su potentni antisens inhibitori ekspresije gena. Moguće je izvršiti i druge modifikacije, kao što su modifikacije fosfodiestarskih veza ili 2'-hidroksi u molekulima šećera riboze u molekulu RNK. Antisens polinukleotidi i ribozomi mogu se u potpunosti sastojati od ribonukleotida ili mogu sadržati mešane ribonukleotide i dezoksiribonukleotide. Polinukleotidi iz predmetnog pronalaska mogu se proizvesti svim sredstvima, uključujući genomske preparacije, cDNK preparate,in vitrosintezu, RT-PCR iin vitroiin vivotranskripciju.

»Izolovani« molekul nukleinske kiseline je onaj koji je suštinski izdvojen od drugih molekula nukleinskih kiselina, koji se prisutni u prirodnom izvoru nukleinskih kiselina (to jest, od sekvenci koje kodiraju druge polipeptide). Poželjno je da je »izolovana« nukleinska kiselina razdvojena od nekih sekvenci koje prirodno okružuju tu nukleinsku kiselinu (to jest, od sekvenci koje se nalaze na 5' i 3' krajevima nukleinske kiseline) u prirodno postojećem replikonu. Na primer, klonirana nukleinska kiselina se smatra izolovanom. U različitim oblicima izvođenja, izolovani molekul IMI nukleinske kiseline može sadržati manje od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb nukleotidne sekvence koja se prirodno naslanja na molekul nukleinske kiseline u genomskoj DNK ćelije iz koje je nukleinska kiselina potekla (na primer, ćelijaTriticum turgidum).Neka nukleinska kiselina se takođe smatra izolovanom ukoliko je izmenjena ljudskom intervencijom ili je postavljena na lokus ili na mesto koje nije njeno prirodno mesto, ili ukoliko je uvedena u ćeliju agroinfekcijom, biolistikom ili nekim drugim postupkom transformacije biljaka. Staviše, »izolovani« molekul nukleinske kiseline, kao što je cDNK molekul može biti oslobođen od ostalog ćelijskog materijala sa kojim je prirodno povezan ili od medij uma za kulturu, kada se proizvodi rekombinantnim pristupima ili od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, kada je sintetisan hemijskim putem.

Definicijom »izolovane nukleinske kisline naročito nisu obuhvaćeni: prirodno postojeći hromozomi (kao što su razmazi hromozoma), veštačke hromozomalne biblioteke, genomske biblioteke i cDNK biblioteke koje postoje kako u oblikuin vitropreparata nukleinskih kiselina ili u obliku transfektovanih/transformisanih preparata ćelije domaćina, naznačeno time da su ćelije domaćinain vitroheterogeni preparati ili su kultivisane u kulturi kao heterogene populacije pojedinačnih kolonija. Takođe, definicijom nisu obuhvaćene pomenute biblioteke, naznačene time da specifična nukleinska kiselina Čini manje od 5% broja umetnutih nukleinskih kiselina u vektorske molekule. Dalje nisu obuhvaćene genomske DNK celih ćelija ili ukupni preparati ćelijske RNK (uključujući i preparate celih ćelija koje su mehanički podeljene ili enzimatski razgrađene). Takođe, nisu obuhvaćeni preparati celih ćelija koji su biloin vitropreparati ili su heterogene smeše razdvojene elektroforezom, naznačeno time da nukleinska kiselina iz predmetnog pronalaska nije dodatno razdvojena od heterolognih nukleinskih kiselina u elektroforetskom međijumu (na primer, daljim razdvajanjem, isecanjem jedne trake od heterogenih traka u agaroznom gelu ili na najlonskoj membrani).

Molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska, na primer, molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu SEQ ED NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ TD NO:5 ili SEQ ID NO:23 ili neki njihov deo, može se izolovati primenom standardnih molekularno bioloških pristupa i na osnovu informacija o sekvencama koje su ovde dostavljene. Na primer, IMI cDNKT. turgidummože se izolovati izT. turgidumbiblioteke primenom cele sekvence ili dela sekvence SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23. Štaviše, molekul nukleinske kiseline koji obuhvata celu sekvencu ili deo sekvence SEQ ED NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23, može se izolovati polimeraznom lančanom reakcijom, primenom oligonukleotidnih prajmera načinjenih na osnovu ove sekvence. Na primer, iRNK se može izolovati iz biljnih ćelija (na primer, guanidijum-tiocijanatnim ekstrakcionim postupkom opisanim kod Chirgvvin i sar. 1979, Biochemistrv 18:5294-5299;, a cDNK se može pripremiti primenom reverzne transkriptaze (na primer, Molonev MLV reverzna transkriptaza, dostupna kod Gibco/BRL, Bethesda, MD; ili AMV reverzna transkriptaza, dostupna kod Seikagaku America, Inc. St Petersburg, F). Sintetski oligonukleotidni prajmeri za reakciju umnožavanja polimeraznom lančanom reakcijom, mogu se dizajnirati na osnovu nukleotidne sekvence prikazane u SEQ ID NO:l, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ED NO:23, Molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska može se umnožiti primenom cDNK ili genomske DNK, kao matrice i odgovarajućih oligonukleotidnih prajmera, saglasno standardnom PCR postupku. Molekul nukleinske kiseline koji je tako umnožen, može se klonirati u odgovarajući vektor i okarakterisati primenom postupka cDNK sekvencijalne analize. Dalje, oligonukleotidi koji odgovaraju nekoj JMI nukleotidnoj sekvenci mogu se dobiti standardnim sintetskim postupcima, na primer, primenom automatizovanog sintetizera DNK.

IMI nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu sadržati sekvence koje kodiraju IMI protein (to jest, kodirajući region), kao i 5' ne-translirajuće sekvence i 3' ne-translirajuće sekvence. S druge strane, molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu sadržati samo jedan kodirajući region nekog IMI gena, ili mogu sadržati ceo genomski fragment izolovan iz genomske DNK. Kodirajući region ovih sekvenci označen je kao »ORF položaj«. Štaviše, molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska može sadržati deo kodirajućeg regiona nekog IMI gena, na primer, fragment koji se može koristiti kao proba ili kao prajmer. Nukleotidna sekvenca određena kloniranjem IMI gena izT. turgidumdozvoljava dobijanje proba i prajmera namenjenih upotrebi za identifikovanje i/ili kloniranje IMJ homologa u drugim tipovima ćelija i organizama, kao i IMI homologa iz ostalih pšeničnih biljaka i srodnih vrsta. Deo kodirajućeg regiona može takođe kodirati biološki aktivan fragment nekog IMI proteina.

U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »biološki aktivan deo« nekog IMI proteina treba da obuhvati deo, na primer neki domen/motiv, nekog IMI proteina koji, kada se proizvede kod biljke, povećava otpornost biljke na imidazolinonske herbicide u poređenju sa divljim varijetetom te iste biljke. Postupci za kvantifikovanje povećanja otpornosti na imidazolinonske herbicide opisani su u kasnijim Primerima. Biološki aktivan deo nekog IMI proteina obuhvata peptide nastale od SEQ ED NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:24, koji se sastoje od manjeg broja amino kiselina od IMI proteina pune dužine i uslovljavaju povećanu otpornost na imidazolinonske herbicide kada se eksprimiraju u biljkama. Biološki aktivni delovi (na primer, peptidi koji su na primer, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ili više amino kiselina dužine), tipično sadrže domen ili motiv sa najmanje jednom aktivnošću nekog EMI proteina. Štaviše, biološki aktivni delovi u kojima su ostali regioni polipeptida uklonjeni, mogu se dobiti rekombinantnim postupcima i okarakterisati za jednu iii više aktivnosti, kako je ovde opisano. Poželjno je da biološki aktivni delovi nekog EMI proteina obuhvate jedan ili više konzerviranih domena, izabranih iz grupe koja se sastoji od nekog Domena A, nekog Domena B, nekog Domena C, nekog Domena D i nekog Domena E, naznačeno time da konzervirani domeni sadrže mutaciju.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje IMI himere ili fuzione polipeptide. U značenju koje je ovde primenjeno, neki IMI »himerni polipeptid« ili »fuzioni polipeptid« obuhvata neki IMI polipeptid operativno vezan za neki ne-IMI polipeptid. Neki »ne-IMI polipeptid« odnosi se na neki polipeptid koji poseduje amino kiselinsku sekvencu koja suštinski nije identična sekv enci IMI polipeptida, na primer, to je neki polipeptid koji nije IMI izoenzim i taj polipeptid obavlja različitu funkciju od LM I polipeptida. U značenju koje je ovde primenjeno u vezi sa fuzionim polipeptidom, izraz »operativno vezan« treba da ukaže da su EMI polipeptid i ne-IMI polipeptid vezani jedan za drugog, tako da obe sekvence obavljaju uloge koje takve sekvence obavljaju. Ne-IMI polipeptid može biti vezan za N-kraj ili C-kraj EMI polipeptida. Na primer, u jednom obliku izvođenja, fuzioni polipeptid je GST-IMI fuzioni polipeptid, u kojem je EMI sekvenca vezana za C-kraj GST sekvence. Ovakvi fuzioni polipeptidi mogu olakšati prečišćavanje rekombinantnog EMI polipeptida. U drugom obliku izvođenja, fuzioni polipeptid je neki IMI polipeptid koji sadrži heterolognu signalnu sekvencu na svom N-kraju. Kod nekih ćelija domaćina (na primer, sisarske ćelije domaćina), ekspresija i/ili sekrecija IMI polipeptida može se povećati putem primene neke heterologne signalne sekvence.

Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira neki EMI polinukleotid čija je sekvenca identična polipeptidu koga kodira polinukleotidna sekvenca SEQ ED NO:l, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23, može se kreirati uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili dclecija u nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23, tako da su ta jedna ili više supstitucija, adicija ili delecija uvedene u kodirani polipeptid. Mutacije se mogu uvesti u sekvencu SEQ ID NO:l, SEQ ED NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ED NO:23, primenom standarnih postupaka, kao što je usmerena mutageneza ili PCR-posredovana mutageneza. Poželjno je da se konzervativne amino kiselinske supstitucije se čine na jednom ili više predviđenih ne-esecijalnih amino kiselinskih ostataka.

»Konzervativna amino kiselinska supstitucija« je ona supstitucija kojom se jedan amino kiselinski ostatak zamenjuje amino kiselinskim ostatkom sa sličnim bočnim lancem. Familije amino kiselina sa sličnim bočnim lancem su definisane u nauci. Ove familije obuhvataju amino kiseline baznog lanca (na primer, lizin, arginin, histidin), kiselog lanca (na primer, aspartatna kiselina, glutamatna kiselina), nenaelektrisanog polarnog bočnog lanca (na primer, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnog bočnog lanca (na primer. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatog bočnog lanca (na primer, treonin, valin, izoleucin) i aromatičnog bočnog lanca (tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). S toga, prethodno određena ne-esencijalna amino kiselina u IMI polipeptidu poželjno se zamenjuje drugom amino kiselinom iz familije istog bočnog lanca. Alternatvno, u jednom obliku izvođenja, mutacije se mogu uvoditi nasumice duž svih delova IMI kodirajuće sekvence, primenom saturacione mutageneze, a tako nastali mutanti mogu se ispitati na EMI aktivnost kao što je ovde opisano, kako bi se identifikovali oni mutanti koji su zadržali EMI aktivnost. Nakon mutageneze sekvence SEQ ED NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO;23, kodirani polipeptid se može rekombinantno eksprimirati, dok se aktivnost polipeptida može odrediti analizom otpornosti na imidazolinon kod biljaka koje eksprimiraju polipeptid, kao Što će kasnije biti opisano u Primerima.

U cilju određivanja procenta identičnosti dve amino kiselinske sekvence, sekvence se postavljaju tako da se postigne optimalno poređenje (na primer, moguće je u sekvencu jednog polipeptida uvesti prazna mesta kako bi se dobio optimalan poredak sa drugim polipeptidom). Amino kiselinski ostaci na odgovarajućim amino kiselinskim pozicijama se zatim porede. Kada je u jednoj sekvenci jedna pozicija okupirana istom amino kiselinom kao na istom mestu u drugoj sekvenci, onda su dva molekula identična na toj poziciji. Isti tip poređenja može se načiniti između dve nukleinske kiseline. Procentualna identičnost sekvenci između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija u obe sekvence (to jest, procentualna identičnost sekvence = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100). Za potrebe ovog pronalaska, procentualna identičnost sekvenci između dve nukleinske kiseline ili polipeptida, određena je primenom Vector NTI 6.0 (PC) softverskog paketa (InforMax, 7600 Wisconsin Ave. Bethesda, MD 20814). Ograničenje dužine praznine (engl.gap openingpenal' ty)od 15 i ekstenzije praznih pozicija (engl.gap extension penaltv)od 6.66 primenjeni su za određivanje procenta identičnosti dve nukleinske kiseline. Ograničenje dužine praznine od 10 i ekstenzije praznih pozicija od 0.1 su primenjene za određivanje identičnosti dva polipeptida. Svi ostali parametri su ostavljeni na automatskom podešavanju.

Za potrebe predmetnog pronalaska u određivanju identiteta sekvence tokom poređenja DNK i RNK sekvence, smatra se da je timidinski nukleotid ekvivalentan uracilskom nukleotidu. Poželjno, izolovani IMI polipeptidi obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su najmanje 50-60%, poželjno najmanje 60-70% i još poželjnije najmanje 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% ili 90-95% i još poželjnije, oko 96%, 97%, 98%, 99% ili više identični ukupnoj amino kiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ED NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ED NO:6 ili SEQ ID NO:24. U narednom obliku izvođenja, izolovani EMI polipeptidi obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su najmanje 50-60%, poželjno, najmanje 60-70% i još poželjnije najmanje 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% ili 90-95% i najpoželjnije najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili više, identični sa celokupnom amino kiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ED NO:2, SEQ ED NO:4, SEQ ED NO:6 ili SEQ ED NO:24 . Takođe, moguće je proizvesti optimizovane EMI nukleinske kiseline. Poželjno je da optimizovana IMI nukleinska kiselina kodira EMI polipeptid koji moduliše otpornost biljke na imidazolinonske herbicide i još je poželjnije da povećava otpornost biljke na imidazolinonske herbicide nakon masovne ekspresije u biljci. U značenju koje je ovde primenjeno, »optimizovan« se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je genetički izmenjena kako bi se povećala njena ekspresija kod određene biljke ili životinje. U cilju dobijanja optimizovanih IMI nukleinskih kiselina, DNK sekvenca gena može se modifikovati tako da 1) obuhvati kodone potrebne za visoku ekspresiju biljnih gena; 2) obuhvati neki A+T sadržaj u nukelotidnom baznom sastavu do nivoa koji se nalazi kod biljaka; 3) formira inicijacionu sekvencu biljke; 4) eliminiše sekvence koje uzrokuju destabilizaciju, neodgovarajuću poliadenilaciju, degradaciju i terminaciju RNK ili tako da formira sekundarnu strukturu ukosnice ili mesta za isecanje na RNK. Povećana ekspresija EMI nukleinskih kiselina kod biljaka može se postići primenom distribucione frekvencije korišćenja kodona kod biljaka uopšte ili kod određene biljke. Postupci optimizacije ekspresije nukleinskih kiselina u biljkama mogu se naći u EPA 0359472; EPA 0385962; PCT Aplikacija No. WO 91/16432; U.S. Patent No. 5,380,831; U.S. Patent No. 5,436,391; Perlack i sar. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; i Murray i sar. 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.

U značenju koje je ovde primenjeno, »frekvencija koričenja poželjnih kodona« odnosi se na preferencu koju iskazuju pojedinačne ćelije domaćina u korišćenju nukleotidnih kodona u određivanju neke amino kiselina. U cilju određivanja frekvencije korišćenja određenog kodona u genu, broj pojavljivanja tog kodona u genu deli se sa ukupnim brojem pojavljivanja svih kodona koji određuju poziciju te amino kiseline u genu. Slično tome, frekvencija korišćenja poželjnih kodona koju pokazuje određena ćelija može se izračunati određivanjem prosečne frekvencije korišćenja poželjnog kodona u velikom broju gena koji se eksprimiraju u ćeliji domaćinu. Poželjno je da se ova analiza ograniči na gene koji se visoko eksprimiraju od strane ćelije domaćina. Procenat odstupanja frekvencije korišćenja poželjnog kodona za sintetske gene od onog koji koristi sama ćelija, izračunava se najpre određivanjem procenta odstupanja frekvencije korišćenja jednog kodona od ukupne frekvencije kod te ćelije, a zatim dobijanjem prosečnog odstupanja svih kodona. U značenju koje je ovde primenjeno, ovo izračunacanje obuhvata unikalne kodone (na primer, ATG i TGG). Uopšteno, ukupno prosečno odstupanje korišćenja kodona nekog optimizovanog gena od frekvence korišćenja kod cele ćelije domaćina, izračunava se primenom jednačine 1A= n = IZ Xn - YnXn puta 100 Z, gde je Xn = frekvencija korišćenja kodona n u ćeliji domaćinu; Yn = frekvencija korišćenja za kodon n u sintetskom genu; n predstavlja neki individualni kodon koji određuje neku amino kiselinu; i ukupan broj kodona je Z. Ukupno odstupanje frekvencije korišćenja kodona, A, za sve amino kiseline trebalo bi poželjno da bude manje od 25% i još poželjnije, manje od 10%.

Dakle, neka IMI nukleinska kiselina može biti optimizovana tako da njena distribuciona frekvencija korišćenja kodona odstupa poželjno, ne više od 25% od one kod visoko eksprimiranih biljnih gena i još poželjnije, ne više od 10%. Uz to, u razmatranje je uzet i procentualni sadržaj G+C degenerisane treće baze (monokotiledoni favorizuju G+C na ovoj poziciji, dok dikotiledoni ne). Takođe je uočeno daje XCG (gde X predstavlja A, T, C ili G) nukleotid najmanje poželjan kodon kod dikotila, dok se XTA kodon izbegava kako kod monokotila, tako i kod dikotila. Optimizovane IMI nukleinske kiseline iz ovog pronalaska takođe poželjno imaju CG i TA parove indeksa izbegavanja bliske onima kod izabranih biljaka domaćina (to jest,Tnticim turgidum).Poželjnije je da odstupanje ovih indeksa od vrednosti kod biljaka domaćina nije veće od 10-15%.

Pored molekula nukleinskih kiselina koje kodiraju EMI polipeptide koji su napred opisani, sledeći aspekt pronalaska tiče se izolovanih molekula nukleinskih kiselina koje su antisens prethodnih molekula. Antisens polinukleotidi trebalo bi da inhibiraju ekspresiju gena ciljnog polinukleotida, specifičnim vezivanjem ciljnog polinukleotida i uticajem na transkripciju, isecanje, transport, translaciju i/ili stabilnost ciljnog polinukleotida. Postupci za usmeravanje antisens polinukleotida prema hromozomalnoj DNK, prema primarnom RNK transkriptu ili prema obrađenoj iRNK opisani su u prethodnom stanju tehnike.

Izraz »antisens«, za potrebe ovog pronalaska, odnosi se na nukleinsku kiselinu koje sadrži neki polinukleotid koji je u dovoljnoj meri komplementaran ćelom genu ili jednom delu gena, primarnog transkripta ili obrađenoj RNK, tako da utiče na ekspresiju tog endogenog gena. »Komplementarni« polinukleotidi su oni koji su sposobni za bazno sparivanje po standardnim Watson-Crickovim pravilima komplementarnosti. Konkretno, purini će se bazno sparivati sa pirimidinima i formirati kombinaciju sparenih guanina za citozin (G:C), odnosno adenina sparenog za timin (A.T) u slučaju DNK, ili adenina sparenog za uracil (A:U) u slučaju RNK. Treba naglasiti da se dva polinukleotida mogu međusobno hibridizovati čak i ako nisu potpuno komplementarni jedan drugom, ukoliko poseduju makar jedan region koji je suštinski komplementaran. Izraz »antisens nukleinska kiselina« obuhvata jednolančanu RNK, ili neke dvolančane DNK ekspresione kasete koje se mogu transkribovati i formirati antisens RNK. »Aktivne« antisens nukleinske kiseline su molekuli antisens RNK sposobni za selektivnu hibridizaciju sa primarnim transkriptom ili sa iRNK koja kodira polipeptid sa najmanje 80% identičnosti sekvence sa polipeptidnom sekvencom SEQ LD NO:2, SEQ ED NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:24.

Uz IME nukleinske kiseline i polipeptide koji su prethodno opisani, predmetni pronalazak obuhvata ove nukleinske kiseline i polipeptide prikačene za neki drugu strukturu ili molekul. Ti drugi molekuli obuhvataju bez ograničenja, detekcione molekule, hibridizacione molekule, purifikacione molekule, molekule za isporuku, reakcione molekule, vezujuće molekule i slično. Tipična grupa nukleiskih kiselina koje ima neki prikačenu strukturu, jesu probe i prajmeri. Probe i prajmeri tipično sadrže suštinski izolovani oligonukleotid. Oligonukleotidi tipično sadrže region nukleotidne sekvence koji se hibridizuje pod strogim uslovima za najmanje 12, poželjno oko 25, još poželjnije za oko 40, 50 ili 75 uzastopnih nukleotida sens lanca sekvence predstavljene u SEQ ID NO:l, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23, neku antisens sekvencu koja je predstavljena u SEQ ED NO:l, SEQ ED NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23 ili za njihove prirodno postojeće mutante. Prajmeri bazirani na nekoj od nukleotidnih sekvenci SEQ ED NO.T, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23 mogu se koristiti u PCR reakcijama u cilju kloniranja IME homologa. Probe zasnovane na EMI nukleotidnim sekvencama mogu se koristiti za detekciju transkripata ili genomskih sekvenci koje kodiraju iste ili homologe polipeptide. U poželjnim oblicima izvođenja, probe dalje sadrže neku signalnu grupu koja je za njih prikačena, na primer, signalna grupa može biti neki radioizotop, fluorescentno jedinjenje, neki enzim ili neki kofaktor enzima. Ovakve probe mogu se primeniti kao deo genomskog markera test kompleta za identifikovanje ćelija koje eksprimiraju EMI polipeptide, kao što je merenje nivoa EMI-kodirane nukleinske kiseline u uzorcima ćelija, na primer, đetektovanje nivoa IME iRNK ili određivanje da lije genomski EMI gen mutiran ili uklonjen.

Pronalazak dalje obezbeđuje neki izolovani rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži neku EMI nukleinsku kiselinu koja je prethodno opisana, naznačen time da je ekspresija vektora u ćeliji domaćinu dovodi do povećane otpornosti na imidazolinonske herbicide u poređenju sa divljim varijetetom ćelije domaćina. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »vektor« odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu koja je za njega prikačena. Jedan tip vektora je »plazmid«, Što se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju su mogu ugraditi drugi segmenti DNK. Drugi tip vektora je viralni vektor, naznačen time da se dodatni segmenti DNK mogu vezati u viralni genom. Neki vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (na primer, bakterijski vektori koji sadrže bakterijski oridžin replikacije i epizomalni sisarski vektori). Ostali vektori (na primer, ne-epizomalni sisarski vektori) su integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u tu ćeliju, pa se stoga replikuju zajedno sa genomom ćelije domaćina. Štaviše, izvesni vektori su sposobni da usmere ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Ovakvi vektori su ovde označeni izrazom »ekspresioni vektori«. Uopšteno, ekspresioni vektori koji se koriste u tehnikama rekombinantne DNK najčešće su u formi plazmida. U ovoj specifikaciji, izrazi »plazmid« i »vektor« mogu se koristiti kao sinonimi, budući da je »plazmid« najčešća forma vektora. Ipak, pronalazak treba da obuhvati druge forme ekspresionih vektora, kao što su viralni vektori (na pnmer, replikativno oštećeni retrovirusi, adenovirusi i adeno-asocirani virusi), koji obavljaju ekvivalentne funkcije.

Rekombinantni ekspresioni vektori iz predmetnog pronalaska sadrže neku nukleinsku kiselinu iz predmetnog pronalaska u formi koja je pogodna za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, što znači da rekombinantni ekspresioni vektori obuhvataju jednu ili više regulatornih sekvenci, izabranih na osnovu toga koja će se ćelija primeniti kao ćelija domaćin, a koje su operativno vezane za sekvencu nukleinske kiseline koja treba da se eksprimira. U odnosu na rekombinantni ekspresioni vektor, »operativno vezan« treba da znači da je nukleotidna sekvenca od interesa vezana regulatomu(e) sekvencu(e), na način koji dozvoljava ekspresiju te nukleotidne sekvence (na primer, u nekomin vitrotranskripcionom/translacionom sistemu ili u ćeliji domaćinu, kada je vektor unesen u ćeliju domaćina). Izraz »regulatorna sekvenca« treba da obuhvati promotore, pojačivače i druge elemente koji kontrolišu ekspresiju (na primer, poliademlacioni signali). Ovakve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990) i Gruber i Crosbv, u:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,ur. Glick i Thompson, Poglavlje 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida i reference koju su tu citirane). Regulatorne sekvence obuhvataju one sekvence koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim tipovima ćelija domaćina i one koje usmeravaju ekspresiju nukelotidne sekvence samo u nekim ćelijama domaćina pod izvesnim uslovima. Stručnjaci upoznati sa stanjem tehnike podrazumevaju da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije koju treba transformisati, nivoa ekspresije željenih polinukleotida, i td. Ekspresioni vektori iz predmetnog pronalaska mogu se uvesti u ćeliju domaćina kako bi se proizveli polipeptidi ili peptidi, uključujući fuzione polipeptide ili peptide, kodirane ovde opisanim nukleinskim kiselinama (na primer, IMI polipeptidi, fuzioni polipeptidi, i td).

U poželjnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, IMI polipeptidi se eksprimiraju u biljkama i u biljnim ćelijama, kao što su jednoćelijske biljne ćelije (na primer alge) (videti Falciatore i sar. 1999, Marine Biotechnologv 1(3):239-251 i reference ovde obuhvaćene), zatim u biljnim ćelijama viših biljaka (na primer, spermatofite, kao što su žitarice). Neki IMI polinukleotidi mogu se »uvesti« u biljnu ćeliju na bilo koji način, uključujući transfekciju, trasformaciju ili transdukciju, elektroporaciju, bombardovanje partikula, agroinfekciju, biolistiku i slično.

Pogodni postupci za transformaciju ili transfekciju ćelija domaćina, kao i biljnih ćelija mogu se naći u Sambrook i sar.{ Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2.izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) i u drugim laboratorijskim priručnicima, kao što jeMethods in Molecular Biology,1995, Vol 44,Agrobacterium protocols,ur. Gartland i Davey, Humana Press, Totovva, Nevv Jersev. Budući da je povećana otpornost na imidazolinonske herbicide poželjna osobina koja treba da se nasledi kod mnogih biljaka, kao što je kukuruz, pšenica, raž, zob, tritikala, pirinač, ječam, soja, kikiriki, pamuk, repa i kanola, tapioka, paprika, suncokret i kalendula, solanace biljke, kao što je krompir, duvan, plavi patlidžan i paradajz, vrste Vicia, grašak, detelina, žbunaste biljke (kafa, kakao, čaj), Salix vrste, drveća (palmino ulje, kokos), višegodišnje trave, stočne biljke, ove biljke su takođe poželjne ciljne biljke za genetički inženjering, kao u jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska. Stočne kulture obuhvataju, bez ograničenja, pšeničnu travu, kanarinsku travu, zobiku, divlju raž, plavu travu, pasju travu, detelinu, salfoin, smiljkitu, švedsku detelinu, crvenu detelinu i slatku detelinu.

U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, transfekcija nekog IMI polinukleotida u biljku, postiže seAgrobacteriumposredovanim transferom. Jedan postupak transformacije poznat u stanju tehnike je uranjanje cvetajuće biljke u rastvorAgrobacteriuma,naznačen time štoAgrobacteriasadrži neku IMI nukleinsku kiselinu, nakon čega sledi ukrštanje transformisanih gameta.Agrobacteriumomposredovana transformcija biljke može se izvesti primenom na primer, GV3101 (pMP90) (Koncz i Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) ili LBA4404 (Clonetech)Agrobacterium tumefacienssoj. Transformacija se može sprovesti postupkom standardne transformacije i postupka regeneracije (Deblaere i sar. 1994, Nucl. Acid. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. I Schilperoot, Robert A.,Plant Molecular Biologv Manual,2. izdanje - Dordrecht: Kluvver Academic Publ., 1995. - u: Sect. Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. I Thompson, John E„ Methods in:Plant Molecular Biology and Biotechnology,Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Na primer, repa se može transformisati kotiledonskom ili hipokotilskom transfrmacijom (Moloney i sar. 1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Block i sar. 1989, Plant Physiol. 91:694-701). Primena antibiotika zaAgrobacteriumposredovanu i biljnu selekciju, zavisi od binarnog vektora iAgrobacteriumsoja koji se koriste u transformaciji. Selekcija repe se normalno izvodi primenom kanamicina kao selektivnog biljnog markera.Agrobacterium-<p>osTedovmgenski transfer u lan može se izvesti primenom, na primer, postupka opisanog od strane Mlvnarova i sar., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Takođe, transformacija soje može se izvesti primenom postupka opisanog u European Patent No. 0424 047, U.S. Patent No. 5,322,783, European Patent No. 0397 687, U.S. Patent No. 5,376,543 ili U.S. patent No. 5,196,770. Transformacija kukuruza može se postići bombardovanjem partikula, polietilen glikol posredovanim DNK preuzimanjem, ili posredstvom postupaka silikon karbidnih vlakana (videti, na primer, Freeling i Walbot,The Maize Handbook,Springer VVerlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Specifičan primer transformacije kukuruza nalazi se u U.S. Patent No. 5,990,387, dok se specifičan primer transformacije pšenice nalazi u PCT aplikaciji No. WO 93/07256.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, IMI nukleinske kiseline mogu biti stabilno uvedene u biljnu ćeliju ukoliko se ugrade u ne-hromozomalne autonomne replikone ili ako se integrišu u biljne hromozome. Alternativno, uvedeni EMI polinukleotidi mogu biti prisutni na ekstra-hromozomalnom ne-replikujućem vektoru i mogu biti prolazno eksprimirane ili prolazno aktivne. U jednom obliku izvođenja, moguće je kreirati homologni rekombinantni mikroorganizam, naznačen time što je EMI polinukleotid integrisan u hromozom, zatim je proizvoden vektor koji sadrži najmanje deo nekog AHAS gena u koji je uvedena neka delecija, adicija ili supstiticija čime se menja, na primer funkcionalno oštećuje endogeni AHAS gen. i na taj način kreira IMI gen. U cilju dobijanja tačkaste mutacije putem homologne rekombinacije. mogu se primeniti DNK-RNK hibridi u postupku poznatom kao ciljana genska korekcija (himeraplast) (Cole-Strauss i sar. 1999, Nucleic Acid Research 27(5): 1323-1330 i Kmiec, 1999, Gene Therapv American Scientist 87(3):240-247). Ostali postupci homolognih rekombinacija uTriticumvrstama poznati su u stanju tehnike i njihova primena se ovde pretpostavlja.

U homolognom rekombinantnom vektoru, EME gen je ograničen sa 5' i 3' kraja dodatnim molekulom nukleinske kiseline AHAS gena, kako bi se omogućila homologna rekombinacija između egzogenog EMI gena kojeg nosi vektor i endogenog AHAS gena u mikroorganizmu ili biljci. Dodatni bočni molekuli AHAS nukleinske kiseline su dovoljne dužine za uspešnu homolognu rekombinaciju sa endogenim genom. Tipično se u vektor uključuje nekoliko stotina baznih parova do nekoliko kilobaza bočne DNK (sa oba, 5' i 3' kraja) (za opis homolognih rekombinantnih vektora viđeti na primer, Thomas, K.R. i Capacchi, M.R., 1987, Cell 51:503 ili Strepp i sar. 1998, PNAS, 95(8):4368-4373, za cDNK vezanu rekombinaciju u Phvscomitrella patentima). Ipak, budući da se EMI gen normalno razlikuje od AHAS gena za samo nekoliko arriino kiselina, bočna sekvenca nije uvek neophodna. Homologni rekombinantni vektor se uvodi u mikroorganizam ili biljnu ćeliju (na primer, putem polietilen glikol posredovane DNK), a ćelije u koje je IMI gen uveden homolognom rekombinacijom sa endogenim AHAS genom se selektuju primenom postupaka poznatih u stanju tehnike.

U narednom obliku izvođenja, mogu se proizvesti rekombinantni mikroorganizmi koji sadrže selekcionisane sisteme koji omogućavaju ekspresiju uvedenog gena. Na primer, uvođenje IMI gena u vektor na mesto koje je pod kontrolom lac operona omogućava ekspresiju IMI gena samo u prisustvu IPGT. Ovakvi regulatorni sistemi su poznati u stanju tehnike.

Bez obzira da li se nalazi u ekstra-hromozomalnom ne-replikujućem vektoru ili u vektoru koji je integrisan u hromozom, poželjno je da se IMI polinukleotid nalazi u ekspresionoj kaseti biljke. Poželjno je da ekspresiona kaseta biljke sadrži regulatorne sekvence, sposobne da kontrolišu ekspresiju gena u biljnoj ćeliji, pri čemu su one operativno povezane, tako da svaka sekvenca može da ispuni svoju ulogu, na primer završetak transkripcije uz pomoć poliadenilacionih signala. Poželjni poliadenilacioni signali su oni koji potičuod Agrobacterium tumefacienst-DNK, kao što je gen 3, poznat pod imenom oktopin sintaza Ti-plazmida pTiACH5 (Gielen i sar. 1984, EMBO J. 3:835) ili njegovi funkcionalni ekvivalenti, ali su pogodne i druge terminatorne sekvence koje se funkcionalno aktivne kod biljaka. Budući da veoma često ekspresija biljnih gena nije limitirana na transkripcionim nivoima, biljna poželjno je da ekspresiona kaseta sadrži druge operativno vezane sekvence, poput pojačivača translacije, kao što je upravljačka sekvenca koja sadrži 5'-netranslirajuću leder sekvencu iz mozaičnog virusa duvana, koja poboljšava odnos polipeptida prema RNK (Gallie i sar. 1987, Nucl. Acid Research 15:8693-8711). Primeri biljnih ekspresionih vektora obuhvataju one koji su detaljno opisani u: Becker, D. i sar. 1992, New plant binarv vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W. 1984, Binarv Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid Res. 12:8711-8721; iVectors for Gene Transfer in Higher Plants,u: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, urednici: Kung i R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Biljna genska ekspresija trebalo bi da je operativno vezana za odgovarajući promoter koji kontroliše gensku ekspresiju na vremenski-zavisan, ćelijsku-zavisan ili tkivno-zavisan način. Promotori koji se mogu primeniti u ekspresionim kasetama iz predmetnog pronalaska obuhvataju one promotore koji su sposobni da iniciraju transkripciju u biljnoj ćeliji. Ovakvi promotori obuhvataju bez ograničenja, one promotore koji se mogu dobiti iz biljaka, biljnih virusa i bakterija koje sadrže gene koji se eksprimiraju u biljkama, kao što suAgrobacterium i Rhizobium.

Promotor može biti konstitutivan, inducibilan, razvoj no-zavisan, ćelijski-specifičan, tkivno-specifičan ili organ-specifičan. Konstitutivni promotori su aktivni pod gotovo svim uslovima. Primeri konstitutivnih promotora obuhvataju CaMV 19S i 35S promotore (Odell i sar. 1985, Nature, 313:810-812), sX CaMV 35S promotor (Kay i sar. 1987, Science 236:1299-1302) Sep 1 promotor, akrinski promotor u pirinču (McElroy i sar. 1990, Plant Cell 2:163-171), aktinski promotorArabidopsisa,ubikvitinski promotor (Christensen i sar. 1989, Plant Molec, Biol. 18:675-689): pEmu (Last i sar. 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), 35S promotor mozaičnog virusa skrofule, Smas promotor (Velten i sar. 1984, EMBO J. 3:2733-2730), GRP1-8 promotor, promotor cimetne alkoholne dehiđrogenaze (U.S. patent 5,693,439). promoton sa T-DNKAgrobacteriuma,kao što je manopin sintaza, nopalin sintaza i oktopin sintaza, mala subjedinica ribulozo bifosfat karboksilaze (ssu-RUBISCO) promotor i slično.

Inducibilni promotori su aktivni pod određenim spoljašnjim uslovima, na primer, u prisustvu ili odsustvu neke hranljive materije ili metabolita, hladnoće ili toplote, svetla, napada patogenih organizama, u anaerobnim uslovima i slično. Na primer, hsp80 promotor kodBrassicaindukuje je toplotnim šokom; PPDK promotor indukuje se svetlošču; PR-1 promotor iz duvana,Arabidopsisai kukuruza se indukuje infekcijom nekim patogenom; i Adhl promotor se indukuje hipoksijom i stresom hladnoće. Ekspresija biljnih gena može se olakšati putem inducibilnog promotora (za pregled pogledati, Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Hemijski inducibilni promotori su naročito pogodni ukoliko je potrebna vremenski zavisna ekspresija. Primeri ovih promotora su promotor inducibilan salicilnom kiselinom (PCT Application No. WO 95/19443), promotor inducibilan tetraciklinom (Gatz i sar. 1992, Plant J. 2:397-404) i promotor inducibilan etanolom (PCT Application No. WO

93/21334).

Razvojno-zavisni promotori se preferencijalno eksprimiraju na određenim stupnjevima razvića. Tkivno- i organ-specifični promotori obuhvataju one koji se preferencijalno eksprimiraju u određenim tkivima ili organima, kao što su listovi, korenovi, semena ili ksilem. Primeri tkivno-specifičnih i organ-specifičnih promotora obuhvataju, bez ograničenja, promotore koji se prevashodno eksprimiraju u plodu, ovulama, muškim organima, semenu, integumentu, krtoli, dršci, perikarpu, listovima, stigmi, polenu, prašnicima, laticama, čašicama, drškama, mahunama, stablima, korenovima i slično. Promotori specifični za semena, prevashodno se eksprimiraju tokom razvića semena i/ili germinacije. Na primer, promotori specifični za semena mogu biti i embrion-specifični, endosperm-specifični i specifični za omotač semena. Videti, Thompson i sar. 1989, BioEssavs 10:108. Primeri promotora koji se prevashodno eksprimiraju u semenima obuhvataju bez ograničenja celuloznu sintazu (celA), Cimi, gamma-zein, globulin-1, kukuruzni 19 kD zein (cZ19Bl ) i slične.

Ostali pogodni tkivno-specifični ili organ-specifični promotori obuhvataju promotor napin gena iz repe (U.S. Patent No. 5,608,152), USP-promotor izVicia faba(Baemlein i sar. 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), oleozinski promotor izArabidopsisa(PCT Aplikacija No. WO 98/45461), fazeolinski promotor izPhaseolus vulgaris(U.S. patent No. 5,504,200), Bce-4 promotor izBrassica(PCT Aplikacija No. WO 91/13980), ili legumin B4 promotor (leB4; Naemlein i sar. 1992, Plant Journal 2(2):223-9), kao i promotore koji kotrolišu specifičnu ekspresiju u semenu monokotiledonih biljaka, kao što su kukuruz, ječam, pšenica, raž, pirinač, i slično. Pogodni promotori koje treba pomenuti su lpt2 ili lptl-genski promotor iz ječma (PCT Aplikacija No. WO 95/15389 i PCT Aplikacija No. WO 95/23230) ili oni koji su opisani u PCT Aplikaciji No. WO 99/16890 (promotori iz ječmenog hordein-gena, pirinčani gen za glutelin, pirinčani gen za orizin, pirinčani gen za prolamin, pšenični gen za gliadin, pšenični gen za glutelin, zobeni gen za glutelin, Sorghum gen za kasirin i ražani gen za sekalin).

Ostali promotori koji se mogu primeniti u ekspresionim kasetama iz pronalaska obuhvataju, bez ograničenja, promotor glavnog vezujućeg proteina hlorofila a/b, histonski promotor, Ap3 promotor, p-konglicinski promotor, napinski promotor, sojin lektinski promotor, kukuruzni 15 kD zeinski promotor, 22kD zeinski promotor, 27 kD zeinski promotor, g-zeinski promotor, veksi, shrunkenl, shrunken2 i bronz promotori, Zml3 promotor (U.S. Patent No. 5,086,169), kukuruzni poligalakturonazni promotori (PG) (U.S. Patent Nos. 5,412,085 i 5,545,546) i SGB6 promotor (U.S. Patent No. 5,470,359), kao i sintetski ili drugi prirodni promotori.

Dodatna fleskibilnost u pogledu kontrole heterologne genske ekspresijekodbiljaka može se postići primenom DNK vezujućih domena i »respons« elemenata iz heterolognih izvora (to jest, DNK vezujući domeni iz ne-biljnih izvora). Primer ovakvog heterolognog DNK vezujućeg domena je LexA DNK vezujući domen (Brent i Ptashne, 1985, Cell 43:729-736).

Drugi aspekt pronalaska tiče se ćelije domaćina u koju se uvodi rekombinantni ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska. Izrazi »ćelija domaćin« i »rekombinantna ćelija domaćin« konste se naizmenično sa istim značenjem. Smatraće se da se ovi izrazi odnose ne samo na određenu ćeliju, već se mogu primeniti na njihovo potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Budući da se neke modifikacije mogu odigrati u sukcesivnim generacijama usled mutacija ili spoljašnjih uticaja, to potomstvo ne mora biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je ipak obuhvaćeno izrazom, u značenju koje se ovde primenjuje. Ćelija domaćin može biti neka prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, neki IMI polinukleotid može biti eksprimiran u bakterijskoj ćeliji, kao što suC. glutamicum,u ćelijama insekata, fungalnim ćelijama ili sisarskim ćelijama (kao što su ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) ili COS ćelijama), algama, cilijatima, biljnim ćelijama, gljivama ili drugim mikroorganizmima, kao što je C.glutamicum.Ostale pogodne ćelije domaćina su poznate stručnjacima u toj oblasti tehnike.

Ćelija domaćin iz predmetnog pronalaska, kao što je neka prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin u kulturi, može se primeniti za proizvodnju (to jest ekspresiju) nekog IMI polinukleotida. Saglasno tome, pronalazak dalje obezbeđuje postupke za proizvodnju EMI polipeptida, primenom ćelija domaćina iz pronalaska. U jednom obliku izvođenja postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina iz pronalaska (u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira neki EMI polipeptid, ili u čiji je genom uveden gen koji kodira divlji tip ili IMI polipeptid), u pogodnom medij umu tokom proizvodnje EMI polipeptida. U drugom obliku izvođenja postupak obuhvata izolovanje EMI polipeptida iz medijuma ili iz ćelije domaćina. Drugi aspekt predmetnog pronalaska tiče se izolovanih IMI polipeptida i njihovih biološki aktivnih delova. »Izolovani« ili »prečišćeni« polipeptid ili njegov biološki aktivan deo oslobođenje od drugog ćelijskog materijala kada se proizvodi postupcima rekombinantne DNK, ili od hemijskih

prekursora ili drugih hemikalija, kada se hemijski sintetiše. Izraz »suštinski oslobođen od ćelijskog materijala« obuhvata preparate IMI polipeptida u kojima je polipeptid razdvojen od nekih ćelijskih komponenti sa kojima se prirodno nalazi u vezi ili se sa njima rekombinantno proizvodi. U jednom obliku izvođenja, izraz »suštinski oslobođen od ćelijskog materijala« obuhvata preparate nekog IMI polipeptida koji sadrže manje od oko 30% (suve težine) ne-IMI materijala (koji se ovde takođe nazivaju kontaminirajući polipeptidi) Još poželjnije manje od oko 20% ne-IMI materijala, još poželjnije manje od oko 10% ne-IMI materijala i najpoželjnije, manje od oko 5% ne-IMI materijala.

Kada se neki IMI polipeptid ili neki njegov biološki aktivan deo proizvodi rekombinantno, poželjno je daje on suštinski oslobođen od medijuma za kultivisanje, to jest, da medijum za kultivisanje čini manje od oko 20% poželjnije, manje od 10% i još poželjnije, manje od 5% zapremine polipeptidnog preparata. Izraz »suštinski slobodan od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija« obuhvata preparate IMI polipeptida u kojima je polipeptid odvojen od hemijskog prekursora ili drugih hemikalija koje su bile uključene u sintezu tog polipeptida. U jednom obliku izvođenja, izraz »suštinski oslobođen od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija« obuhvata preparate nekog IMI polipeptida koji sadrže manje od oko 30% (iskazano prema suvoj težini) hemijskih prekursora ili ne-IMI hemikalija, još poželjnije, manje od oke 20% hemijskih prekursora ili ne-IMI materijala, još poželjnije, manje od 10% hemijskih prekursora ili ne-IMI materijala i najpoželjnije, manje od 5% hemijskih prekursora ili ne-IMI materijala. U poželjnom obliku izvođenja, izolovani polipeptid ili njegov biološki aktivan deo, ne sadrži kontaminirajuće polipeptide iz istog organizma iz kojeg je IMI derivat dobijen. Tipično, ovi polipeptidi se proizvode rekombinantnom ekspresijom, na primer,Triticum turgidumIMI polipeptida u biljkama različitim odTriticum turgidum,ili u mikroorganizmima, kao što suC. glutamicum,cilijate, alge ili gljive.

IMI polinukleotidne i polipeptidne sekvence iz predmetnog pronalaska imaju različite primene. Sekvence nukleinskih kiselina i amino kiselinske sekvence iz predmetnog pronalaska mogu se primeniti za transformaciju biljaka, čime se moduliše otpornost biljke na imidazolinonske herbicide. Saglasno, pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju transgenih biljaka sa povećanom otpornošću na imidazolinonske herbicide, koje se sastoje od a) transformacije biljne ćelije jednim ili sa više ekspresionih vektora koji sadrže jednu ili više EMI nukleinskih kiselina i b) generisanja iz biljne ćelije, transgene biljke sa povećanom otpornošću na imidazolinonske herbicide u poređenju sa divljim varijetetom te biljke. U jednom obliku izvođenja, multipne EME nukleinske kiseline dobijaju se iz različitih genoma. Ovim pronalaskom su takođe obuhvaćeni postupci za proizvodnju transgenih biljaka sa povećanom otpornošću prema imidazolinonskim herbicidima, koji se sastoje od a) transformacije biljne ćelije nekim ekspresionim vektorom koji sadrži EME nukleinsku kiselinu, naznačeno time da je nukleinska kiselina neka ne-Imil nukleinska kiselina i od b) generisanja, od biljne ćelije, transgene biljke sa povećanom otpornošću prema imidazolinonskim herbicidima u poređenju sa divljim varijetetom te biljke.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupke za modifikovanje otpornosti biljke na imidazolinonske herbicide, koji se sastoji od modifikovanja ekspresije jednog ili više IMI nukleinskih kiselina. Poželjno je da je nukleinska kiselina locirana na ili da je nastala iz različitih genoma. Otpornost biljke prema imidazolinonskim herbicidima može se povećati ili smanjiti, što se postiže povećanjem, odnosno, smanjenjem ekspresije IMI polinukleotida. Poželjno je da se otpornost biljke na imidazolinonske herbicide poveća, povećanjem ekspresije nekog IMI polinukelotida. Ekspresija nekog IMI polinukelotida može se modifikovati nekim postupkom poznatim u stanju tehnike. Mogu se primeniti postupci za povećanje ekspresije EME polinukleotida, pri čemi je biljka transgena ili ne-transgena biljka. U slučajevima u kojima je biljka transgena, biljka se može transformisati vektorom koji sadrži bilo koju od prethodno opisanih EMI nukleinskih kiselina ili se, na primer, biljka može transformisati nekim promotorom koji usmerava ekspresiju endogenih EMI polinukleotida u biljci. Pronalazak opisuje da taj promotor može biti tkivno- ili razvojno- regulisan. Alternativno, kod ne-transgenih biljaka može se modifikovati ekspresija endogenih IMI polipeptida, uz pomoć inducibilnog nativnog promotora. Ekspresija polinukleotida koji sadrže polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ED NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23 u ciljnim biljkama može se postići, bez ograničenja, jednim od sledećih primera: a) konstitutivnim promotorom, b) hemijski-inducibilnim promotorom i c) genetički promenjenom preteranom ekspresijom putem promotora, na primer, cinkanih prstenova transkripcionih faktora (Greisman i Pabo, 1997, Science 275:657).

U poželjnom obliku izvođenja, transkripcija IMI polinukleotida se moduliše primenom transkripcionih faktora sa cinkanim prstenovima (ZFPs), kao što je opisano u Greisman i Pabo, 1997, Science 275:657) i koji se proizvode od strane Sangamo Biosciences Inc. Ovi ZFPs sadrže DNK domen za prepoznavanje i funkcionalni domen koji uzrokuje aktivaciju ili represiju ciljne nukleinske kiseline, kao stoje IMI nukleinska kiselina. Stoga se mogu kreirati aktivirajući i represivni ZFP, koji specifično prepoznaju IMI polinukleotidne promotore koji su ovde opisani i primenjeni za povećanje ili smanjenje ekspresije IMI polinukleotida kod biljaka, čime se moduliše otpornost biljke na herbicide.

Kao što je prethodno detaljno opisano, biljke proizvedene postupcima iz predmetnog pronalaska, mogu biti monokotile ili dikotile. Biljke mogu biti izabrane između kukuruza, pšenice, raži, zobi , tritikala, pirinča, ječma, soje, kikirikija, pamuka, repe, kanole, tapioke, paprike, suncokreta, kalendule, solanaceosnih biljaka, krompira, duvana, plavog patlidžana, paradajza, Vicia vrsta, graška, deteline, kafe, kakaoa, čaja, Salix vrsta, uljane palme, kokosa, ozimih trava i stočnih biljaka, na primer. Stočne biljke obuhvataju, bez ograničenja, pšeničnu travu, kanarinska travu, zobiku, divlju raž, plavu travu, pasju trava, detelinu, salfoin, smiljkitu, švedsku detelinu, crvenu detelinu i slatku detelinu. U poželjnom obliku izvođenja, biljka je pšenična biljka. U svim postupcima koji su prethodno opisani, biljna ćelija obuhvata bez ograničenja, protoplast, ćelije koje proizvode gamete i ćelije koje se regenerišu u celu biljku. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz »transgeni« odnosi se na svaku biljku, biljnu ćeliju, kalus, biljno tkivo ili deo biljke, koji sadrži ceo molekul ili deo molekula rekombinantnog polinukleotida. U mnogim slučajevima, ceo molekul ili deo rekombinantnog polinukleotida je stabilno integrisan u hromozom ili je stabilan ekstrahromozomalni element, pa se zato prenosi na sledeće generacije.

Kao što je prethodno opisano, predmetni pronalazak opisuje kompozicije i postupke za povećanje otpornosti na imidazolinon kod pšeničnih biljaka ili semena u poređenju sa divljim varijetetom te biljke ili semena. U poželjnom obliku izvođenja, otpornost na imidazolinon pšenične biljke ili semena se povećava tako da biljka ili seme mogu da istrpe primenu imidazolinonskog herbicida od poželjno oko 10-400 g ai ha"<1>, poželjnije 20-160 g ai ha"<1>, i najpoželjnije 40-80 g ai ha"<1.>U značenju koje je ovde primenjeno, aplikacija imdazolinonskog herbicida znači da biljka nije uništena ili oštećena ovim tretmanom.

Pronalaskom je takođe obezbeđen postupak za kontrolu korova u blizini pšenične ili tritikalne biljke, koji se sastoji od primene imidazolinonskog herbicida na korovske i na pšenične ili tritikalne biljke, pri čemu pšenične i tritikalne biljke poseduju povećanu otpornost prema imidazolinonskm herbicidima u poređenju sa divljim varijetetom pšenične ili tritikalne biljke i naznačeno time što pšenična ili tritikalna biljka sadrže jedan ili više IMI nukleinskih kiselina. U jednom obliku izvođenja, pšenična ili tritikalna biljka sadrže multipne IMI nukleinske kiseline locirane na ili nastale sa različitih genoma, pri čemu je IMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imil nukleinske kiseline, neke Imi2 nukleinske kiseline i neke Imi3 nukleinske kiseline. U drugom obliku izvođenja, biljka sadrži neku Imi 2 nukleinsku kiselinu i neku Imi 3 nukleinsku kiselinu. Imajući u vidu povećanu otpornost pšeničnih ili tritikalnih biljaka na imidazolinon, moguće je primeniti veliki broj različitih formulacija za zaštitu pšenične ili tritikalne biljke od korova, u cilju povećanja rasta biljke i smanjenja kompeticije za hranljive materije. Imidazolinonski herbicid može se primeniti za kontrolu korova pre ili nakon rasta korova i pre sađenja ili tokom sađenja biljke, u oblastima koje okružuju pšeničnu biljku ili se može upotrebiti formulacija imidazolinonskog herbicida koji već sadrži druge aditive. Imidazolinonski herbicid može se koristiti u tretmanu semena. Aditivi koji se nalaze u formulaciji imidazolinonskog herbicida, obuhvataju druge herbicide, deterdžente, adjuvante, agense za širenje, agensi za zgušnjavanje, stabilizatori, i slično. Formulacija imidazolinonskog herbicida može biti vlažan ili suv preparat i može da obuhvati bez ograničenja, tečljive praškove, emulzifikatorske koncentrate, i tečne koncentrate. Imidazolinonski herbicid i formulacije herbicida mogu se primeniti u skladu sa konvencionalnim metodama, na primer, raspršivanjem, irigacijom, oprašivanjem i slično.

Tokom ove aplikacije citirane su različite reference. Obelodanjivanje svih navedenih publikacija i referenci citiranih unutar ovih publikacija u njihovoj celini je obuhvaćeno ovom patentnom prijavom, sa ciljem da se bolje opiše stanje tehnike na koje se oslanja ovaj patent.

Takođe se smatra da se ono što sledi odnosi se na poželjne oblike izvođenja predmetnog pronalaska i daje moguće uvesti brojne promene bez udaljavanja od domena ovog pronalaska. Pronalazak je ilustrovan primerima, koji ni na koji način ne ograničavaju domen pronalaska. Naprotiv, treba jasno naglasiti da je moguće uvesti različite oblike izvođenja, modifikacije i njihove ekvivalente, koje nakon čitanja ovog opisa mogu biti predložene od strana stručnjaka upoznatih sa stanjem tehnike, bez napuštanja duha predmetnog pronalaska i/ili domena patentnih zahteva.

PRIMERI

Primer 1

Mutageneza i selekcija otpornih pšeničnih durum linija

Pšenične linije otporne na imidazolinon dobijene su mutacijama, i uz pomoć konvencionalnih postupaka selekcije. Inicijalna mutageneza semena izvedena je tretiranjem semena pšenice varijeteta Durum sa 3 ili 3.5 ml EMS (etilmetan sulfonat) po litru tokom 2 sata, nakon tretmana natapanja česmenskom vodom tokom 5.5 hr, a zatim ispiranja destilovanom vodom. Tokom EMS tretmana, semena su mešana svakih 10-15 minuta. Nakon 2 sata od početka EMS tretmana, mutagen je ispran i zamenjen fosfatnim puferom (0.001 M, pH 3.5). Semenje je zatim tretirano natrijum azidom (2 ml/litru IM štok rastvora), tokom čega je snažno mešano tokom l sata. Tečnost je odlivena, a semenje je isprano dva puta destilovanom vodom, osušeno i ostavljeno na tacnama, u staklenoj bašti tokom 24-36 h, da se osuši, pre nego što sue poseje u vlažnu zemlju.

Ml generacija biljaka koja je izrasla iz tretiranog semenja je požnjevena i nastala M2 generacija semenja je posejana. M2 biljke su, na stupnju od tri lista, tretirane sa lOoz/ac Raptor herbicida (88.6 g imazamoks/ha). Biljke koje su preživele primenu herbicida su prenesene u staklenu baštu za produkciju M3 generacije.

M2:3 linije su ispitane u staklenoj bašti primenom 10 oz/jutar (88.6 g imazamoks/ha) ili 12 (oz/jutar) (106.3 g imazamoksa/ha) Raptor® herbicida. Herbicid je primenjen na stupnju tri lista. M3:4 semena su dobijena od najotpornijih M3 biljaka.

PRIMER 2

Otpornost Durum pšeničnih Unija na imidazolinonske herbicide

Probe na otvorenom ( 1)

Devet M4:6 linija dobijenih od četiri M2 biljke (C119, C132, C137, C012) je procenjeno u ponovljenim probama na jednoj lokaciji za uzgajanje Duruma u Italiji. 75g/ha imazamoksaje primenjeno na BBCH stupnju rasta 21-25 biljaka. Nivo od 35 g/ha bi tipično doveo do praktično 100% smrtnosti podložnih pšeničnih biljaka. Dvadesetjedan dan nakon tretmana (DAT), procentualni odgovor zasada (ukupno oštećenje) varirao je od 0 do 13% i od 0 do 17%, 43 DAT. Prinos, kao procenat netretirane iste linije varirao je od 85 do 102%.

Probe na otvorenom ( 2)

Stodeset M3:4 linija dobijenih od šesnaest M2 biljaka ispitano je delovanje imazamoksa, i to u prisustvu 71 g/ha i 160 g/ha. Broj od 44 linije po M2 biljci varirao je od jedan do dvadeset. Otpornost M3:4 linija je upoređena sa netretiranim stabljikama iste linije, kao i sa tretiranim biljkama divljeg tipa od koje su neke od njih nastale. Tabela sumarno prikazuje rezultate.

Sve testirane linije preživele su oba nivoa herbicidnog tretmana, pri čemu su sve biljke divljeg tipa uginule pri oba nivoa koncentracije herbicida. Na osnovu poređenja sa linijama divljeg varijeteta, sve testirane linije su pokazale značajno povećanu otpornost na primenjene doze, naročito ako se posmatra redukcija visine u odnosu na netretirane biljke. Nivo od 35 g/ha imazamoksa je dovoljan da izazove uginuće podložnih durum pšeničnih biljaka. Stoga je procenjeno da su linije otporne na nivo od skoro 3 puta do preko 4 puta tog nivoa.

Probe u staklenoj bašti:

Petnaest Durum linija, svaka dobijena od različite M2 biljke i dva divlja tipa durum linija, procenjeno je na otpornost na imidazolinonski herbicid imazamoks, pri nivoima od 100 i 160 g/ha, u probama u staklenoj bašti. Procene otpornosti izvršene su 14. i 21. dana nakon tretmana. Oštećenje je ocenjeno na skali 0-9, gde 0 predstavlja odsustvo oštećenja, a 9 smrt biljke. Tabela 2 sumarno prikazuje rezultate.

Sve linije su pokazale veću otpornost od linija divljeg varijeteta, u tome što su sve biljke divljeg tipa uginule nakon 21-dnevnog tretmana, odnosno, tokom vremena pri kojem su čak i linije sa značajnim oštećenjem nakon 14. dana počele da se oporavljaju. Nivo od 35 g/ha imazamoksa je dovoljan da izazove uginuće podložnih Durum biljaka pšenice. Stoga, svih petnaest linija dobijenih mutagenezom, pokazale su izuzetnu otpornost na imazamoks.

PRIMER 3

Biokemijska osnova otpornosti

Enzim ugrožen delovanjem imidazolinonskog herbicida je acetohidroksiacil sintaza (AHAS), prvi katalitički enzim u biohemijskoj sintezi amino kiselina razgranatog lanca - val ina, leucina i izoleucina. Smatra se da se herbicid vezuje za mesta unutar džepa enzima, ali da se ne vezuje za aktivno mesto.

In vitroaktivnost AHAS enzima ekstrahovanog iz biljke može se biohemijski meriti. Efekat na aktivnost nakon dodavanja različitih koncentracija nekog imidazolinonskog herbicida, kao što je imazamoks na AHAS protein ekstrahovan iz divljeg tipa durum pšenice (linija UT) može se videti u Tabeli 3. Čak i pri relativno niskim koncentracijama, AHAS aktivnost rapidno pada.

Tabela 3 takođe sadrži podatke o AHAS aktivnosti kod nekoliko linija nastalih od M2 linija otpornih na imidazolinonske herbicide. Inhibicija aktivnosti je značajno manja pri nižim koncentracijama imazamoksa, pa čaki i pri višim koncentracijama, aktivnost je uopšteno jednu trećinu do jedne polovine u odnosu na kontrolu. Ovi podaci, zajedno sa podacima na otpornost u staklenoj bašti i na otvorenom, izgleda da podupiru tezu o mutagenezom-nastalim promenama u najmanje jednom AHAS genu u Durum genomu, koji dovodi do toga da AHAS protein manje inhibiran od strane imazamoksa.

PRIMER 4

Molekulama osnova otpornosti

Molekularna karakterizacija imidazolinon otpornih linija potvrdila je prisustvo specifičnih mutacija u genima koji kodiraju AHAS enzim (Als 2 i Als 3). Imidazolinon otporna C119 linija sadržala je guanin-adenin baznu supstituciju u Als 2 genu, koja je dovela do amino kiselinske supstitucije serina u asparagin u Donjenu E, kod AHAS enzima. Cl 19 linija nije sadržala mutacije u Als 3 genu. Slično ovome, imidazolinon otporne linije UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13,17114, UT16, UT17, UT20 sadržale su divlji tip sekvence Als 3 gena i guanin-adenin baznu supstituciju u Als 2 genu.

Imidazolinon otporna UT12 linija sadržala je guanin - adenin baznu supstituciju u Als 3 genu, koja je dovela do amino kiselinske zamene serina asparaginom u Domenu E AHAS enzima. UT12 linija nije sadržavala nikakvu mutaciju u Als 2 genu.

Imidazolinon otporne linije Utopia UT15 i UT19, sadržale su novu mutaciju u Als 3 genu, guanin - adenin baznu zamenu, koja je dovela do amino kiselinske zamene serina treoninom u amino-terminalnom delu AHAS enzima. Imdazolinon otporna linija Utopia UT15 takođe je sadržavala timin - citozin baznu zamenu u Als 2 genu, koja nije dovela do amino kiselinske supstitucije.

PRIMER 5

Inženjering pšeničnih biljaka otpornih na imidazolinon

Pšenične biljke otporne na imidazolinon dobijene su postupkom opisanim od strane Ishida i sar. (1996, Nature Biotech. 14:745-750). Nezreli embrioni veličine 1-2 mm izolovani su 10-15 dana nakon polinacije, a zatim se sterilisani etanolom i 30% rastvorom hloroksa. Nezreli embrioni su inficiraniAgrobacteriumćelijama koje su nosile konstrukciju od interesa u vektoru japanskom duvana, na LS-infekcionom medijumu, a zatim su ko-kultivisani na LS-ko-kultivacionom medijumu tokom 3 do 7 dana (svi medijumi su dobijeni od japanskog duvana saglasno Ishida i sar. (1996, Nature Biotech, 14:745-750). Eksplanti su zatim preneseni u LS medijum koji je sadržao 0.05 do 1.0 uM PURSUIT® i kultivisani su pod slabim svetlom tokom 2 do 3 nedelje. Nakon 3. selekcije, kalusi su prenešeni u regeneracioni medijum, obogaćen sa 0.25 do 0.75 uM imazetapira (PURSUIT®) tokom tri nedelje. Izdanci su zatim prenešeniu ViLS medijum za okorenjavanje i kultivisani su tri nedelje pre nego što su transplantirani u zemlju i negovani u staklenoj bašti. Pretpostavljeno transgene biljke su popsrkane sa 25 do 50 g/ha imazamoksa (RAPTOR®) kako bi se eliminisale one koje to nisu.

Claims (67)

1. Pšenična biljka koja sadrži najmanje jednuTriticum turgidumEMI nukleinsku kiselinu, naznačena time daTriticum turgidumnukleinska kiselina uslovljava povećanu otpornost te biljke na neki imidazolinonski herbicid u poređenju sa divljim varijetetom te biljke.

2. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline.

3. Pšenična biljka iz Zahteva 2, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina neka Imi 2 nukleinska kiselina.

4. Pšenična biljka iz zahteva 2, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina neka Imi 3 nukleinska kiselina.

5. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što jeTriticum turgidumEME nukleinska kiselina neka EMI nukleinska kiselina iz Durum podrvsta.

6. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina kodira neki EMI polipeptid koji sadrži mutaciju u konzerviranoj amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od nekog Domena A, Domena B, Domena C, Domena D i nekog Domena E.

7. Pšenična biljka iz Zahteva 6, naznačena time što je konzervirana amino kiselinska sekvenca neki Domen E.

8. Pšenična biljka iz Zahteva 7, naznačena time što mutacija dovodi do supstitucije serina asparaginom u EMI proteinu u odnosu na divlji varijetet AHAS proteina.

9. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida opisanog u SEQ ID NO.i, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQEDNO:23; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid opisan u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotidu navedenom pod a) do c).

10. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ED NO:l.

11. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQEDNO:3.

12. Pšenična biljka iz Zahteva i, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ID NO:5 ili SEQ ED NO:23.

13. Pšenična biljka iz Zahteva 1, koja sadrži dveTriticum turgidumIMI nukleinske kiseline.

14. Pšenična biljka iz Zahteva 13, koja sadrži nekuTriticum turgidumImi 2 nukleinsku kiselinu i neku Emi 3 nukleinsku kiselinu.

15. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što biljka nije transgena biljka.

16. Pšenična biljka iz Zahteva 15, naznačena time što biljka poseduje ATCC patentnu depozitnu oznaku broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; ili je rekombinantni ili genetički inženjerovan derivat biljka sa ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; ili je potomak biljke sa ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960; ili je biljka koja je potomak bilo koje od prethodno navedenih biljaka.

17. Triticum turgidumpšenična biljka iz Zahteva 15, naznačena time što biljka poseduje ATCC patentnu depozitnu oznaku broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960, ili je potomstvo biljke sa ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960.

18. Pšenična biljka iz Zahteva 15, naznačena time što biljka ispoljava otpornost na herbicide koja je karakteristična za biljke sa ATCC patentnom depozitnom oznakom broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960.

19. Pšenična biljka iz Zahteva 15, naznačena time što pšenična biljka ima neku ATCC patentnu depozitnu oznaku broj PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, PTA-4916, PTA-4917, PTA-4918, PTA-4919, PTA-4920 PTA-4921, PTA-4922, PTA-4923 ili PTA-4960.

20. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što je imidazolinonski herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-yl)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil)-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-3-kvinolinkarboksilna kiselina, 5-etil-2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinska kiselina, 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-metilnikotinska kiselina i smeša metil 6-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-rn-toluata i metil 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2- il)-p-toluata.

21. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što je imidazolinonski herbicid 5-etil-2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinska kiselina.

22. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što je imidazolinonski herbicid 2-(4-izopropil-4-metiI-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinska kiselina.

23. Neki biljni deo pšenične biljke iz Zahteva 1.

24. Neka biljna ćelija pšenične biljke iz Zahteva 1.

25. Seme proizvedeno od pšenične biljke iz Zahteva 1.

26. Seme iz Zahteva 25, naznačeno time što je seme čista linija za povećanu otpornost na neki imidazolinonski herbicid u poređenju sa semenom divljeg varijeteta pšenične biljke.

27. Pšenična biljka iz Zahteva 1, naznačena time što je biljka transgena biljka.

28. Transgena pšenična biljka iz Zahteva 27, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline.

29. Transgena pšenična biljka iz zahteva 28, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina neka Imi 2 nukleinska kiselina.

30. Transgena pšenična biljka iz Zahteva 28, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina neka Imi 3 nukleinska kiselina.

31. Transgena pšenična biljka iz Zahteva 27, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida opisanog u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid opisan u SEQ ED NO:2, SEQ ED NO:4, SEQ ED NO:6 ili SEQ ED N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotidu navedenom pod a) do c).

32. Trangena pšenična biljka iz Zahteva 27, naznačena time što najmanje jedna IMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ID NO:l.

33. Pšenična biljka iz Zahteva 27, naznačena time što najmanje jedna IMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ID NO:3.

34. Pšenična biljka iz Zahteva 27, naznačena time što najmanje jedna IMI nukleinska kiselina sadrži neku polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ED NO: 5 ili SEQ ID NO:23.

35. Neka tritikalna biljka koja sadrži najmanje jednuTriticum turgidumEMI nukleinsku kiselinu, naznačena time štoTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina uslovljava povećanu otpornost biljke na neki imidazolinonski herbicid u poređenju sa divljim varijetetom te biljke.

36. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina izabrana, iz grupe koja se sastoji od neke Imi 2 nukleinske kiseline i neke Imi 3 nukleinske kiseline.

37. Tritikalna biljka iz Zahteva 36, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina neka Imi 2 nukleinska kiselina.

38. Tritikalna biljka iz Zahteva 36, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina neka Imi3 nukleinska kiselina.

39. Tritikalna biljka iz Zahteva 36, naznačena time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina neka IMI nukleinska kiselina Durum podvrsta.

40. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina kodira neki EMI polipeptid koji sadrži mutaciju u konzerviranoj amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od nekog Domena A, Domena B, Domena C, Domena D i nekog Domena E.

41. Tritikalna biljka iz Zahteva 40, naznačena time što je konzervirana amino kiselinska sekvenca neki Domen E.

42. Tritikalna biljka iz Zahteva 41, naznačena time što mutacija dovodi do supstitucije serina asparaginom u IMI proteinu u odnosu na AHAS protein divljeg varijeteta.

43. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida opisanog u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid opisan u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotidu navedenom pod a) do c).

44. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ID NO: 1.

45. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQIDNO:3.

46. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu kao što je opisana u SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:23.

47. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, koja sadrži dveTriticum turgidumIMI nukleinske kiseline.

48. Tritikalna biljka iz Zahteva 47, koja sadrži nekuTriticum turgidumImi2 nukleinsku kiselinu i nekuTriticum turgidumImi3 nukleinsku kiselinu.

49. Neki biljni deo tritikalne biljke iz Zahteva 35.

50. Neka biljna ćelija tritikalne biljke iz Zahteva 35.

51. Seme proizvedeno u tritikalnoj biljci iz Zahteva 35.

52. Seme iz Zahteva 51, naznačeno time što je seme čista linija za povećanu otpornost na imidazolinonski herbicid u poređenju sa semenom divljeg varijeteta tritikalne biljke.

53. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što je biljka transgena.

54. Tritikalna biljka iz Zahteva 35, naznačena time što biljka nije transgena.

55. Neka izolovana EMI nukleinska kiselina, naznačena time što EMI nukleinska kiselina sadrži neki polinukleotid izabran iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida sekvence SEQ ED NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ED NO:5 ili SEQ ED NO:23; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid koji sadrži SEQ ED NO:2, SEQ ED NO:4, SEQ ED NO:6 ili SEQ ID N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotiđu navedenom pod a) do c).

56. Izolovana EMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid SEQ ED NO: 1.

57. Izolovana EMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid SEQ ED NO:3.

58. Izolovana EMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid SEQ ED NO:5 ili SEQ ID NO:23.

59. Izolovana IMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži SEQ ED NO:2.

60. Izolovana IMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži SEQ DD NO:4.

61. Izolovana EMI nukleinska kiselina iz Zahteva 55, naznačena time što nukleinska kiselina sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži SEQ ID NO:6. ili SEQ ID NO:24.

62. Postupak kontrolisanja korova u blizini neke biljke, koji se sastoji od primene nekog imidazolinonskog herbicida na korov i biljku, naznačen time da biljka poseduje povećanu otpornost na imidazolinonski herbicid u poredjenju sa divljim varijetetom te biljke i naznačen time da biljka sadrži najmanje jednuTriticum turgidumIMI nukleinsku kiselinu.

63. Postupak iz Zahteva 62, naznačen time što je najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od neke Imi2 nukleinske kiseline i neke Imi3 nukleinske kiseline.

64. Postupak iz Zahteva 62, naznačen time što najmanje jednaTriticum turgidumEMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida opisanog u SEQ ID NO: 1, SEQ ED NO:3, SEQ ED NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ED NO:24; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid opisan u SEQ ED NO:2, SEQ ED NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ED N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotiđu navedenom pod a) do c).

65. Postupak iz Zahteva 62, naznačen time što pšenična biljka sadrži nekuTriticum turgidumImi2 nukleinsku kiselinu i neku Imi3 nukleinsku kiselinu.

66. Postupak dobijanja transgenih biljaka sa povećanom otpornošću na neki imidazolinonski herbicid, koji se sastoji od: a) transformisanja biljne ćelije jednim ili sa više ekspresionih vektora koji sadrže najmanje jednuTriticum turgidumIMI nukleinsku kiselinu; i b) generisanja, iz biljne ćelije, transgene biljke sa povećanom otpornošću na neki imidazolinonski herbicid, u poređenju sa divljim varijetetom te biljke.

67. Postupak iz Zahteva 66, naznačen time što najmanje jednaTriticum turgidumIMI nukleinska kiselina sadrži polinukleotid izabran iz grupe koja se sastoji od: a) nekog polinukleotida opisanog u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, ili SEQ ID NO:23; b) nekog polinukleotida koji kodira polipeptid opisan u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID N024; c) nekog polinukleotida koji sadrži najmanje 60 uzastopnih nukleotida bilo koje od sekvenci navedenih pod a) ili b); i d) nekog polinukleotida koji je komplementaran bilo kojem polinukleotiđu navedenom pod a) do c).