RS50238B - Postupak i uređaj za koncentrisanje i stabilisanje konjugovanog estrogena iz kobiljeg urina - Google Patents

Abstract

Postupak prilagođen praksi za decentralizovano koncentrovanje i stabilizovanje mešavina konjugovanih estrogena (CE) iz urina ždrebnih kobila (PMU), naznačen time, što se u urinu ždrebnih kobila (PMU) sadržana prirodna mešavina konjugovanih estrogena (CE) koncentruje i stabilizuje na jednom čvrstom nosaču (adsorbentu), tako što se jedna unapred određena maksimalna ukupna količina sakupljenog, eventualno prethodno prečišćenog tečnog urina iz jednog rezervoara kontinualno, ili u pojedinačnim manjim količinama sa unapred određenom brzinom proticanja pumpa kroz jedan vertikalan metalan cevast rezervoar (11) a istekla urinska tečnost se odbacuje, pri čemu taj cevast rezervoar (11) ima ispunu od adsorbenta, stalno obloženu tečnošću, pogodnu za adsorpciju jedne unapred određene količine smeše konjugovanih estrogena (CE) koja se nalazi u urinskoj tečnosti, i pri čemu je kao krajnja kontrola punjenja adsorbenta unapred određena, maksimalna ukupna količina urinske tečnosti upumpane kroz pomenuti cevasti rezervoar (11) podešenaje na maksimalni kapacitet adsorbenta za konjugovane estrogene (CE) sadržane u urinskoj tečnosti. Prijava sadrži još 22 patentna zahteva.

Description

Ovaj se pronalazak odnosi na jedan postupak i na jedan uređaj za koncentrovanje i stabilisanje konjugovanog estrogena iz mokraće ždrebnih kobila na čvrstim nosačima, kako bi se dobio pogodan polazni materijal za izradu farmaceutskih preparata koji sadrže prirodnu mešavinu ovih konjugovanih estrogena kao aktivnu komponentu.

Estrogen se u medicini koristi za hormonsku supstitucionu terapiju.

Estrogenske se mešavine naročito koriste za lečenje i profilaksu kod žena koje pate od teškoća prelaznih godina posle prirodne ili veštačke menopauze. Tu su se prirodne smeše konjugovanih estrogena, koje se nalaze u urinu ždrebnih kobila, pokazle kao izuzetno delotvorne i dobro podošljive.

Rastvoren sadržaj čvrstih materija u urinu ždrebnih kobila (= pregnant mares' urine, u daljem tekstu skraćeno u "PMU") može se, prirodno, kretati u

širokim okvirima i nalazi se u celini u opsegu od 40 - 90 g suve supstance po litru. Pored urina i ostalih uobičajenih sastojaka urina, u sadržaju čvrstih materija PMU nalaze se fenolski sastojci u količini od oko 3-5 mas.% u odnosu na suvu supstancu. Pod tim fenolskim sastocima nalaze se krezol i kao HPMF poznat dihidro-3,4-bis [(3-hidroksi£enil)metil]-2(3H)-furanon. Oni mogu biti u slobo-dnom ili konjugovanom obliku. PMU sadrži jednu prirodnu mešavinu estrogena koja se najvećim delom nalazi u konjugovanom obliku, na primer kao natrijumova so poliestra sumporne kiseline (u daljem tekstu skraćeno kao "sulfatna so"). Sadržaj konjugovanog estrogena (= conjugated estrogen, nadalje skraćeno kao "CE") može se računati kao so estrogensulfata u iznosu između 0,3 i 1 mas.% u odnosu na suvu supstancu.

Za neposrednu pripremu i dobijanje konjugovanog estrogena koji se nalazi u PMU, u poznatom su stanju tehnike opisani razni postupci. Obično se ekstrakti koji sadrže konjugovane estrogene dobijaju iz PMU ekstrahovanjem jednim polarnim organskim rastvaračem, koji se ne meša sa vodom ili se mesa samo malo, kao što je, na primer, etilestar sirćetne kiseline, n-butanol ili cikloheksanol. Kod ovakvih ekstrakcija tečnost-tečnost javlja se veći broj proble-ma, kao što je jako obrazovanje pene, obrazovanje sedimenata, obrazovanje emulzija i loše razdvajanje faza. Ovo je u celini zapaženo u brojim stepenim ekstrahovanja, što dovodi do gubitaka i do samo delimičnog dobijanja sadržaja estrogena. Da bi se izbegli ovi nedostaci, u poznatom je stanju tehnike do sada predložen niz postupaka za ekstrahovanje čvrste faze.

Za pripremanje malih količna tečnog urina i tečne plazme za analitičko određivanje estrogena pomoću gasne hromatografjje, opisuju Heikkinnen i dr.

(Clin.Chem.27/ 7,(1981), 1186 - 1189) i Shackleton i dr, (Clinica Chimic Acta 107 (1980) 231 - 243) jednu ekstrakciju čvrste faze estrogena pomoću jedne kapsule sa silanizovanim silika gelom koji sadrži oktadecilsilan radikale (Sec-Pak<R>C<18->cartridge, proizvođač Waters Ass. Ine, Milford, MA, USA). Ovde se estrogen ispira metanolom iz kapsule.

1968 predložio je H. L. Bradlovv (videti Sterids U (1968) 265-272) da se za ekstrahovanje konjugiranog estrogena iz urinskog amberlita XAD-2 koristi jedna nepolarizovana hidrofobna polistirenska smola firme Rohm und Haas. Dobijeni je kapacitet adsorpcije mali. Prema Bradlow-u će se evenualno razblažen urin propuštati malom brzinom proricanja kroz jednu kolonu koja sadrži smolu. Estrogeni se ispiraju metanolom ili etanolom.

Novije patentne prijave opisuju postupak za dobijanje jednog ekstrata koji sadrži prirodne mešavine konjugovanog estrogena iz kobiljeg urina pomoću ekstrakcije čvrste faze konjugovanog urina ždrebnih kobila, na primer na RP-silikagelu (WO 98/08525) ih" na nejonskoj polupolarnoj polimernoj adsoberskoj smoli (WO 98/08526).

Pored napred opisanog optimizovanja neposredne, potpune prerade urina ždrebnih kobila (PMU) radi dobijanja prirodne mešavine konjugovanih estrogena (CE), takođe su stepeni koji prethode preradi, kao što je, naprimer, obezbeđenje skladištenja kojim se štiti estrogen i rukovanje sakupljenim urinom na sabirnom centru, od izuzetnog značaja za prinos i kvalitet sirovine koja sadrži estrogen i prirodne mešavine konjugovanih estrogena koja se otud izdvaja. S tim u vezi, teži se i optimizovanju transporta sakupljenog sirovog materijala koji sadrži estrogen od sabirnog mesta do mesta krajnje obrade i izdvajanja konjugovanih estrogena.

Potpuna prerada PMU ekstrahovanjem čvrste faze zahteva hemijsko-farmaceutski kvalifikovan stručan personal, da bi se pod dobro regulisanim uslovima mogli održati veliki zahtevi u pogledu čistoće i kvaliteta jedne supstance koja treba da se koristi kao farmaceutska aktivna materija, ili jedne mešavine supstanci. Sakupljanje urina (PMU) obično se vrši u normalnoj životnoj sredini ždrebnih kobila, tj, u ergelama, u seoskoj okolnoj sredini i često na udaljenijim mestima. Po pravilu tu postoji samo jedna jednostavna infrastruktura a sakupljanje urina (PMU) i njegovo rukovanje obično vrši jednostavno, priučeno ljudstvo, pred koje se u pogledu rukovanja prikupljenim urinom ne mogu postavljati suviše veliki zahtevi.

Konjugovani estrogeni (CN), sastava koji se izdvaja iz urina ždrebnih kobila, predstavljaju, međutim, jednu kompleksnu mešavinu, koja posebno sadrži natrijumestronsulfat, natrijumekvilinsulfat kao i druge CE. Za izdvajanje CE veoma je važno da se PMU što je brže moguće obradi u svežem stanju. Kod dužeg uskladištenja počinje urin naglo da se razlaže. Urin počinje da tamni, dobija zadah amonijaka a sadržaj CE vrlo naglo opada. Brzina razlaganja zavisi od uslova skladištenja i od kriterijuma čistoće. Ukupno prikupljen urin (PMU), pri čemu se radi o velikim količinama tečnosti, mora se zbog toga čak dnevno transportovari od sabirnog centra do nekog centralnog mesta za obradu, kako bi se obezbedila što je moguće brža obrada.

Zbog toga postoji hitna potreba za odgovarajućim postupkom i uređajem za što je moguće bolju zaštitu proizvoda i jednostavnije rukovanje koncentrovanjem i stabilizovanjem konjugovanog estrogena koji se nalazi u urinu ždrebnih

kobila (CE) neposredno u sabirnom centru za urin (PMU), kao i za što je mogu-

će efikasnijim transportom od sabirnog centra do mesta prerade i izdvajanja.

Zbog toga je zadatak ovog pronalaska da se uklanjanjem napred opisanih

nedostataka razvije pogodan tehnički postupak za dobijanje prirodne mešavine

konjugovanih estrogena i pogodan uređaj za koncentrovanje i stabilizovanje

konjugovanih estrogena (CE) od sakupljenog urina ždrebnih kobila (PMU).

Posebno treba da postupak i uređaj omoguće jednostavno rukovanje, koje će

štititi proizvod, koncentrovanjem i stabilisanjem konjugovanih estrogena od

PMU u sabirnom centru za urin kao i što je moguće efikasniji transport tako

pripremljenog sirovog materijala koji sadrži estrogen od sabirnog centra do

mesta završne obrade i i izdvajanja prirodne mešavine konjugovanih estrogena.

Neočekivano je utvrđeno da su konjugovani estrogeni (CE) vezani na

čvrstim nosačima (adsorbentima) veoma stabilni i da se mogu držati duže

vremena bez ikakve pojave razlaganja.

Ovaj pronalazak se odnosi na jedan postupak prilagođen praksi za,

decentralizovano, tj. naročito u blizini štala i/ili pašnjaka, koncentrovanje i

stabilizovanje mešavina konjugovanih estrogena (CE) iz urina ždrebnih kobila

(PMU), koji je karakterističan po tome

-što se u urinu ždrebnih kobila (PMU) sadržana prirodna mešavina

konjugovanih estrogena (CE) koncentruje i stabilizuje na jednom čvrstom nosaču

(adorbentu), tako

-što se jedna unapred određena maksimalna ukupna kolicima

sakupljenog, eventualno prethodno proceđenog tečnog urina iz jednog

rezervoara kontinualno, ili u pojedinačnim manjim količinama sa unapred

određenom brzinom proricanja pumpa kroz jedan vertikalan metalan cevast

rezervoar a istekla urinska tečnost se odbacuje, pri čemu

-taj cevast rezervoar ima ispunu od adsorbenta, stalno obloženu tečnošću,

pogodnu za adsorpciju jedne unapred određene količine smeše konjugovanih

estrogena (CE) koja se nalazi u urinskoj tečnosti, i pri čemu je

-kao krajnja kontrola punjenja adsorbenta unapred određena,

maksimalna ukupna količina urinske tečnosti upumpane kroz pomenuti cevast

rezervoar podešena je na maksimalni kapacitet adsorbenta za konjugovane

estrogene (CE) sadržane u urinskoj tečnosti.

Izraz "prilagođen praksi" ovde znači da je postupak prilagođen lokalnim

uslovima praktičnog sakupljanja, što znači da ga priučeno osoblje može

jednostavno i bezbedno primenjivati, tj. da nije komplikovan i da se može izvesti

uz najveće moguće isključenje pogrešnog opsluživanja.

Izraz "decentralizovan" ovde označava da se postupak može izvesti na bilo

kom mestu pogona za sakupljanje urina bez specijalnih hemijsko-farmaceutskih

uređaja, tj. naročito u blizini štala i/ili pašnjaka. Pod izrazom "cevasti rezervoar"

podrazumeva se ovde bilo koja vrsta zatvorene kolone, ili stuba, sa dotokom i

oticanjem koji se mogu zatvoriti, kao i sa elementima za zatvaranje, na primer sa

brzorastavnim spojnicama. Na taj način izraz "cevasti rezervoar" obuhvata u

okviru ovog pronalaka i kolone koje se obično koriste u laboratorijama,

tehnikumima, odnosno u hemijskim pogonima, a koje se, kako je napred rečeno,

mogu koristiti za primenu u ovom pronalasku.

Postupkom prema pronalasku biče pripremljen sirov, odnosno polazni materijal koji služi za izradu farmaceutskih preparata koji sadrže kao aktivne komponente prirodnu mešavinu konjugovanih estrogena iz PMU, u. kome je sadržaj prirodne estrogenske smeše PMU praktično potpuno koncentrovan na adsorbentu (nosaču) i može se duže vreme stabilizovati pod normalim uslovima sabirnog centra. Posle potpunog (maksimalnog) punjenja može se cevasti rezervoar lako isključiti i zameniti cevastim rezervoarom sa nenapunjenim adsorbentom. Cevasti rezervoari sa napunjenim adsorbentima mogu biti dugo vremena uskladišteni na temperaturi okolne sredine, ili, po želji, mogu se ohladiti na oko 4°C, a pod određenim uslovima mogu se duboko ohladiti do oko -20°C, na primer dotle dok se ne sakupi jedan određen broj cevastih rezervoara pogodan za skupni transport do centralnog pogona za preradu. Transport se može izvesti na temperaturi okolne sredine ili, kako je napred opisano za skladištenje, uz hlađenje odnosno duboko hlađenje. Konačna obrada i izdvajanje prirodnih mešavina konjugovanog estrogena (CE) može se u centralnom pogonu za preradu izvesti na način uobičajen za svaki od adsorbenata, na primer pranjem i ispiranjem CE iz adsorbenta i daljom obradom ekstrakta iz adsorbenta na željeni način. Tako se, na primer, ekstrakt iz adsorbenta može na poznat način dalje koncentrovati, kako bi se dobio koncentrat u najvećoj meri, ili potpuno oslobođen od organskih rastvarača, pogodan za dalju galensku preradu. Po želji se može drugim postupcima sušenja, na primer sušenjem raspršivanjem, sušenjem preko vibracionog sloja, sušenjem pomoćr zamrzavanja ili vakuumskim sušenjem, proizvesti mešavina čvrstih materija bez sredstava za ispiranje. Bilo ekstrakt koji sadrži estrogensku smešu, bilo neki od njega načinjen koncentrat ili sušenjem raspršivanjem načinjen čvrst proizvod mogu se na poznat način preraditi u čvrste ili tečne galenske preparate kao što su tablete, dražeje, kapsule ili emulzije.

Pored opisanog postupka, pronalazak se odnosi na jedan uređaj koji se može koristiti u tom postupku, koji na najpogodniji način vodi računa o minimalnim uslovima na mestu primene i obezbeđuje sigurno, za proizvod najpogodnije izvođenje postupka. Ovaj uređaj prema pronalasku pogodan je za praktično usmereno, decentralizovsano, tj. blisko štali ili pašnjaku koncentrovanje i stabilizovanje. U daljem tekstu biće u celini objašnjenji neki parametri postupka bitni za izvođenje postupka. S obzirom na specijalna konstruktivna, odnosno na raznim aparatima zasnovana izvođenja uređaja, koji su pogodni za izvođenje postupka prema pronalasku, biće detaljan opis uređaja prema pronalasku kasnije prikazan, a koji će se eventualno dodatno pozivati na sledeći opšti opis izvođenja postupka.

Za postupak prema pronalasku može se sakupljen PMU kao takav koristiti pa će se dnevno sakupljena količina PMU zbog toga prethodno držati u jednom spremniku. Eventualno se preporučuje prethodno izdvajanje grubih mehaničkih nečistoća kao što su slama, seno ili slično, na primer pomoću jednog običnog grubog sita kod punjenja rezervoara sveže sakupljenim PMU. Po želji se mogu, radi smanjenja broja klica i virusa, u urin sakupljen u rezervoaru dodati konzervansi, germicidi, baktericidi i/ili sredstva protiv crevnih glista.

Iz rezervoara će se PMU redovno u zavisnosti od postojeće količine urina, na primer jednom do dva puta dnevno upumpavati, na primer jednom pumpomsa gipkim crevom, u cevasti rezervoar koji sadrži adsorbent. Ovaj cevasti

rezervoar obično ima dimenzije i masu koje omogućuju osobama normalne

snage ručno manipulisanje. S obzirom na postupak, preporučuje se da se cevasti

rezervoar za prihvatni adsorbentski sloj tako dimenzioniše, da može primiti oko

30 do 50 1 adsorbensa a da PMU mora od ulaza do izlaza da pređe putanju od 80

do 120 cm. Prema pronalasku adsorpcija konjugovanog estrogena vrši se na

adsorbentu dovođenjem PMU u dodir sa adsorbentom, pri čemu se tečan urin

uvodi u vertikalno postavljen cevast rezervoar bilo sa gornjeg, bilo sa donjeg

kraja, pa se tokom proricanja održava u dodiru sa adsorbentom dovoljno dugo

vremena za adsorpciju sadržaja estrogena, sve dok preostao urin najzad sa

suprotnog kraja ne izađe iz cevastog rezervoara. Pri tome će PMU biti u cevasti

rezervoar tako uvođen, bilo sa gornjeg, bilo sa donjeg kraja, da će adsorbent biti

stalno obložen tečnošću kako bi se što je više moguće isključio suv rad cevastog

rezervoara.

Vreme dodira odnosno brzina proricanja prilagođena je svakom

pojedinačnom adosorbentu i treba za adsorbente pogodne za postupak (brzina

punjenja) da bude u opsegu od 3 do 10 zapremina sloja adsorbenta/h, najbolje 4

do 6 zapremina sloja adsorbenta/h. Tako su, na primer, pogodne brzine punjenja

4,4 do 5,5 zapremina sloja adsorbera /h.

Specijalna su vremena trajanja dodira i brzine proricanja za posebno

pogodne adsorbente detaljnije navedena kod opisa tih adsorbenata.

Maksimalna ukupna količina tečnog urina koja se provodi kroz cevasti

rezervoar može zavisiti od kapaciteta adsorpcije svakog od adsorbenata i treba

da se za adsorbente pogodne za ovaj postupak kreće u opsegu od 20 do 60

zaoremina sloja adsorbenta, najpogodnije od 30 do 40 zapremina sloja

adsorbenta. Obično može maksimalna ukupna količina tečnog urina koja treba

da prođe kroz cevasti rezervoar radi njegovog punjenja, da iznosi, u zavisnosti od

adsorbenta i veličine rezervoara u opsegu od 900 do 2 000 1. Krajnja vrednost

veličine protoka daje se personalu za opsluživanje u sabirnom centru tačno

unapred određena za svaki tip cevastog rezervoara. Za merenje kroz cevasti

rezervoar napumpanog tečnog urina može se koristiti neki jednostavan

protokomer, najbolje, na primer, jedan vodomer. Po dostizanju maksimalnog

punjenja može se preključiti na jedan paralelan drugi cevasti rezervoar i nastaviti

proces adorpcije.

Kada se za cevasti rezervoar dostigne unapred data krajnja vrednost

cevasti će se rezervoar sa adsorbovanim CE po želji naknadno oprati, na primer

vodom i/ili nekim drugim pogodnim vodenim rastvorom za ispiranje, pre no što

se prekine dovod tečnosti. Potom se zatvore izlaz i ulaz tečnosti, pa se veza za

dovod tečnosti, na primer jedna jednostavna brzorastavna spojnica, do cevastog

rezervoara prekine. Pun cevasti rezervoar se može potom odneti i uskladištiti na

neko pogodno mesto do transporta do cetralnog pogona za preradu, a priključuje

se nov, nepunjen cevasti rezervoar na dovod tečnosti.

Cevasti se rezervoar može posle punjenja sa, na primer pre zamene

cevastog rezervoara potpuno napunjenjog sa PMU, ili pre dostizanja ukupnog

kapaciteta punjenja posle ma kog broja delimičnih stepena punjenja, isprati, po

želji, vodom i/ili drugim pogodnim vodenim rastvorom za pranje, na primer

jednim baznim vodenim rastvorom kao što je razblažena vodena natrijumova

lužina (na primer vodeni 0,5-2 N NaOH), da bi se iz cevastog rezervoara uklonio ostatak urinarne tečnosti. Količina rastvora za ispiranje nije kritična i bira se, da je dovoljna da iz cevastog rezervoara ukloni zaostao urin a da pri tome ne bude isprana neka iole veća količina konjugovanog estrogena. Pogodna je primena 1 - 3, najbolje oko 2 zapremine sloja tečnosti na zapreminu sloja adsorbenta. Pri tome će se voda za pranje ili rastvor za pranje propuštati kroz cevasti rezervoar sa adsorbentom sa brzinom proticanja od 3 do 10, najbolje 5 do 7, zapreminskih delova vode za pranje na 1 zapreminski deo adsorbenta na čas. Adsorbent u cevastom rezervoaru napunjen sa CE može poslužiti kao sirov, odnosno polazan material za izdvajanje čistog CE za izradu lekova koji sadrže prirodnu mešavinu konjugovanih estrogena

TJ jednoj varijanti pronalaska može se cevasti rezervoar posle pranja vodomi/ilivodenim rastvorom, a u cilju stabilizovanja CE potom isprati sa jednim konzervansnim rastvorom, na primer nekim rastvorom koji sadrži neki konzervans, sa nekim vodenim rastvorom podešenog pH i/ili nekim slanim vodenim rastvorom, pre no što se cevasti rezervoar odvoji od uređaja i zameni sledećim novim. Radi sprečavanja zagađivanja kolone (odnosno cevastog rezervoara) klicama, naročito kod skladištenjailitransporta bez hlađenja, mogu se dodati uobičajeni konzervansi i, na primer, germicidi. baktericidii/ilisredstva protiv crevnih glista. Podešavanje pH vrednosti vode za pranje vršiće se prema svakom od korišćenih adsorbenata. Kao slani rastvori mogu se koristiti različiti koncentrovani vodeni rastvori neorganskih soli, čiji su primeri dati u TabeliIII.l.Primena slanih rastvora posebno se preporučuje onda kada cevasti rezervoari punjeni sa CE treba da se skladište rashlađeni ili duboko rashlađeni. Najpogodniji su rastvori kuhinjske soli sa koncentracijom soli od oko 10 do 35 mas.%, najbolje 25 do 33 mas.%.

Kod jednog preporučljivog izvođenja postupka prema pronalasku sakupljen se urin, pre prepumpavanja iz sabirnog rezervoara u cevasti rezervoar, oslobađa od sluziifinoisitnjenih čvrstih materija. Zbog toga je svrsishodno da se tečan urin iz sabirnog rezervoara prvo propusti kroz jedan ili više filtara za grubo prečišćavanje, pre no što se tečan urin pumpa kroz cevasti rezervoar. Tako se, na primer, PMU može prevesti kroz najmanje jedan od poznatih uređaja za razdvajanje, na primer preko jednog postrojenja za filtriranje sa najmanje jednim dubinskim filtromilisa taložnim filtrom. Kao uređaj za razdvajanje može poslužiti jedan dubinski filtar sa slojem peska ili jedan kupovni filtarski umetak, ili se može koristiti kupovni taložni filtar, ili pločasti filtar, filtar sa svećom, filtarska torba ih filtarska cev. Filtri se mogu koristiti pojedinačno ili više njih u ma kojoj međusobnoj kombinaciji, na primer uključeni u nizu jedan iza drugog i/ili paralelno. Po želji se može tečnom urinu (PMU) pre filtriranja dodati i pomoćno sredstvo za filtriranje. Pogodna sredstva za filtriranje su ona koja vezuju kalcijumkarbonat i/ili sluz i time poboljšavaju filtriranje urina. Eventualno se može na filtar priključiti jedan izdvajač čestica, na primer u slučaju sloja peska kao filtra jedan naknadno priključen izdvajač peska.

Stručnjaku su principi, odnosno izvođenje filtriranja potpuno poznati. U vezi sa zadatkom koji se rešava pronalaskom u obzir za primenu prema pronalasku dolaze uobičajeni principi bistrog filtriranja. Bistro filtriranje teži čišćenju tečne faze, tako da je čistoća filtrata bitna ocena za postizanje ciljeva postupka. Proces razdvajanja se u osnovi ostvaruje međusobnim delovanjem sredstva za filtriranje i suspenzije. To se mora uzeti u obzir kako kod izbora sredstva za filtriranje, modeliranja procesa, tako i kod tehničkog rasporeda filtarskih uređaja. U većini slučajeva izdvojen čvrst materijal bitno utiče na odvijanje procesa. Tako kod dostignutog udela čvrstih materija i pri njegovoj sposobnosti obrazovanja premošćenja (delići se oslanjaju preko sredine filtra a da ga ne zapuše) preuzima obrazovana filtarska pogača, koja se sve više širi, funkciju sredstva za filtriranje. U ovom slučaju taložnog filtriranja, filtriranja sa pogačom, struktura filtarske pogače određuje tok procesa, dok samo filtarsko sredstvo posle jedne početne faze ima samo funkciju podupiranja. Mesto izdvajanja čvrste materije je sledeće bitno svojstvo za raspoznavanje procesa filtriranja. Kod površinskog filtriranja vrši se izdvajanje čvrstih materija na površini filtarskog sredsva sejanjem, tj. na osnovu odnosa veličina između čestica Čvrstih materija i pora filtarskog sredstva. Nasuprot tome, kod dubinskog filtriranja prodiru čestice čvrstih materija u sredstvo za filtriranje i slažu se u njegovoj unutrašnjosti.

Adsorbenti koji se nalaze u cevastim rezervoarima mogu biti svi neorgansld ili organski adsorbenti koji imaju dovoljan kapacitet za u PMU sadržane prirodne mešavine konjugovanih estrogena. Kao adsorbenti za postupak prema pronalasku pogodne su polimerne adsorberske smole, silikagel, RP-silikagel ili polupolarne polimerne adsorberske smole za primenu u cevastim rezervoarima.

Hidrofobizovani silikagelovi koji se mogu koristiti kao adsorbenti u cevastim rezervoarima jesu, na primer, poznati obrnuto-fazni silikagelovi (Reverse-Phase-silikagelovi, skraćeno RP-silika gelovi), koji su hemijski modifi-kovani silikagelovi, koji nose hidrofobne funkcionalne grupe, odnosno ligante. Tako su, na primer, pogodni silanizovani RP-silikagelovi koji kao hidrofobne funkcionalne grupe sadrže n-oktadecildimetilsilil, n-oktildimeitlsililoksi ili dimetilhidroksisililoksi radikale. Pogodni su, na primer, silanizovani silikagelovi sa srednjom veličinom čestica od 15 do 500fim.Kao posebno pogodan pokazao se silikagel koji sadrži dimetilhidroksilsililoksi radikale sa srednjom veličinom čestica u opsegu od 0,05 - 0,3 mm, na primer "Kieselgel 60/Dymethylsilanderivat" firme Merck. Tečan se urin može kroz cevasti rezervoar koji sadrži silikagel propuštati brzinom proticanja koja će omogućiti da trajanje dodira za adsorbovanje sadržaja estrogena bude dovoljno. Pogodne su, na primer brzine proticanja koje odgovaraju protoku od 5 do 20 zapreminskih delova PMU na 1 zapreminski deo silikagela na čas. Najbolje je da se adsorpcija vrši na sobnoj temperaturi. Brzina proticanja tečnog urina kroz reaktor može se u toku rada regulisati malim natpritiskom (regulisanim kapacitetom pumpe). Količina primenjenog hidrofobizovanog silikagela može se menjati u zavisnosti od vrste primenjenog silikagela i količine sadržaja čvrstih materija u sakupljenom tečnom urinu. Kada se koristi pretfiltriran PMU, tj. oslobođen sluzi i čvrstih materija, može se, na primer, jedan zapreminski deo hidrofobizovanog silikagela opteretiti sa do 80 zapreminskih delova prethodno obrađenog PMU, a da u ispuštenoj urinskoj tečnosti ne bude iole primetnijih količina estrogena.

Polupolarne polimerne adsorberske smole, koje se mogu koristiti u cevastim rezervoarima kao adsorbenti, jesu porozni nejonski polimeri koji, nasuprotnepolarnim hidrofobnim polimernim adsorberskim smolama, imaju jednu među-

polarnost (na primer dipolni moment aktivne površine smole u opsegu od 1,0 do

3,0, posebno 1,5 do 2,0, Debye) i jednu pomalo hidrofilnu strukturu, na primer

smole estara polikarbonskih kiselina. Posebno se koriste makroporozne polupolarne smolesamakromrežastom strukturom isaprosečnim prečnikom pora uopsegu od 50 do 150, najbolje 70 do 100 Angstrema i jednom specifičnom

površinom u opsegu od 300 do 900, najbolje 400 do 500, m<2>/g. Kao posebno

dobre pokazale su se makroporozne poprečno umrežene alifatične smole estara

polikarbonskih kiselina, naročito poprečno umrežene smole poliakrilestara, kao

što je, na primer Amberlite XAD-7<R>firme Rohm und Haas. Tečan se urin može

kroz cevasti rezervoar koji sadrži adsorbersku smolu propuštati bzinom proticanja koja će omogućiti da trajanje dodira za adsorbovanje sadržaja estrogena

bude dovoljno. Pogodne su, na primer brzine proticanja koje odgovaraju protoku

od 3 do 10, najbolje 5-7, zapreminskih delova PMU na 1 zapreminski deo

adsorberske smole na čas. Najbolje je da se adsorpcija vrši na sobnoj

temperaturi. Brzina proticanja tečnog urina kroz reaktor može se u toku rada

regulisati malim natpritiskom (regulisanim kapacitetom pumpe). Količina

primenjene polupolarne adsorberske smole može se menjati u zavisnosti od vrste

primenjene adsorberske smole i količine sadržaja čvrstih materija u sakupljenom

tečnom urinu. Kada se koristi PMU, može se, na primer, jedan zapreminski deo

adsorbentske smole, na primer poprečno umrežene alifatične adsorberske smole

estara polikarbonskih kiselina, opteretiti sa do 80 zapreminskih delova prethodno obrađenog PMU, a da u ispuštenoj urinskoj tečnosti ne bude iole primetnijih

količina estrogena.

Pored napred navedenih adsorbenata mogu se koristiti i druge adsorbentske smole ili vrste silikagela. Kao adsorbenske smole pogodne su kako

nepolarne, polupolarne, tako i polarne adsorbenske smole. Količina urina koja

se može pumpati preko adsorbera se pri tome mora prethodno odrediti prema

kapacitetu svakog od adsorbera. Primeri upotrebljivih adsorberskih smola su

komercijalne vrste kao što su polimerni Amberlite adsorbendisaosnovnom

rešetkom od stirendivinilbenzola (na primer tipa XAD-1180, XAD~2, XAD-4,

XAD-16), sa osnovnom rešetkom od akrilestra (na primer YAD-7) ili one sa

visoko polarnim rešetkama koje sadrže azot i kiseonik (na primer XAD-12).

Drugi su adsorbenti Dowex-smole (kopolimeri stirena i divinilbenzola), kao na

primer Dowex 112, Dowex Optipore, Dowex Optipore V 493, Lewatite

(umreženi polistiren), na primer Lewatit OC 1046, Levvatit OC 1066, ili Lewatit

OC 1163, poliaminjonoizmenjivaćke smole, na primer Dowex-smole. Pogodne su

su adsorbentske smole posebno XAD-7, XAD-16 (tip HP), XAD 118 i Dowex

Optipore, najbolje kao Dowex Optipore V 493, kao i Lewatite OC 1064, OC

1063 i OC 1163.

Pored napred opisanog postupka, pronalazak se takođe odnosi i na jedan

uređaj koji se koristi u tom postupku, koji vodi računa o jednostavnim uslovima

na mestu korišćenja i omogućuje sigurno, za proizvod pogodno, izvođenje

postupka.

Uređaj prema pronalasku karakterističan je po svojoj sposobnosti za

praksi prilagođeno, decentralisano, tj. naročito po štalama ili pašnjacima,

koncentrovanje i stabilisanje na čvrstom nosaču (adsorbentu) mešavine

konjugovanih estrogena (CE) koji se nalaze u urinu ždrebnih kobila (PMU), pri čemu ovaj uređaj obuhvata: - jedan vertikalno postavljen cevast rezervoar, koji je ispunjen jednim adsorbensom koji je (stalno) obložen tečnošću, a koji je pogodan za adsorpciju jedne unapred određene količine mešavine konjugovanih estrogena (CE) koji se nalaze u tečnom urinu ždrebnih kobila, pri čemu ceevast rezervoar ima bilo a) na donjem kraju postavljen ulazni otvor za tečnost a na gornjem kraju postavljen izlazni otvor za tečnost, bilo b) na gornjem kraju postavljen ulazni otvor za tečnost i na donjem kraju postavljen izlazni otvor za tečnost, - kao i ispred cevastog cilindra po određenom rasporedu poredane i provodnim crevima povezane

- pumpu, merač strujanja i protokomer.

Uređaj prema pronalasku podešen je za izvođenje napred opisanog postupka za praksi prilagođeno, decentralizovano koncentrovanje i stabilisanje u PMU sadržanih konjugovanih estrogena (CE). Po želji može uređaj da obuhvati dva paralelno priključena cevasta rezervoara koji se mogu jedan posle drugog, odnosno naizmenično koristiti.

Cevasti rezervoari koji se koriste u uređaju prema pronalasku, mogu se, što se tiče visine i prečnika, dimezionisati u širokom opsegu. Da se rukovanje u praksi ne bi otežalo, treba da cevasti rezervoar u pogledu veličine i mase budu

tako dimenzionisani da jedna osoba normalne snage, na primer kod zamene

punog cevastog rezervoara novim, praznim rezervoarom, može njima ručno dobro manipulisati i nositi ih. Tako, na primer, cevasti rezervoar treba da bude tako dimenzionosan, da ima unutrašnje dimenzije za adsorbentski sloj takve da omogućuju prihvatanje 30 do 50 1 adsorbenta, pri čemu unutrašnja visina treba je u opsegu od 80 do 120 cm. Unutrašnji prečnik cevastog rezervoara treba

uglavnom da bude od 10 do 25 cm. Stručnjak će biti u stanju da izvrši tačno

dimenzionisanje cevastog rezervoara kako bi obezbedio optimalne odnose

strujanja u toku pogona.

Dalje se cevasti rezervoar, primenjen u uređaju prema pronalasku, sastoji od jakih materijala, otpornih na velika opterećenja i otpornih na hemikalije, koji se obično koriste za izradu pribora za hemijsku industriju, na primer

laboratorijskog stakla otpornog na udar, plastične mase i/ili metala kao što je, na

primer, Čelični lim.

U uređaju prema pronalasku mogu se koristiti bilo koje jednostavne i robusno izrađene pumpe kao, na primer, tzv. monopumpe, pumpe sa crevom ili membranske pumpe. Kao pogodna pumpa za uređaj prema pronalasku pokazala se jedna pumpa sa crevom.

Kod uređaja prema pronalasku može se koristiti bilo koji jednostavan i

robusno izrađen uređaj za merenje strujanja, kao, na primer, neki rotametar

(merač strujanja promenljive površine), trokrilni merač strujanja ili indukcioni merač strujanja. Tako se, na primer, kao merač strujanja za uređaj prema pronalasku dobro pokazao rotametar sa plovkom.

U uređaju prema pronalasku može se za merenje količine tečnog urina

pumpanog kroz cevasti rezervoar koristiti bilo koji, jednostavan i robusno izrađen protokomer, na primetr vodomer ili indukcioni protokomer. Kao pogodan protokomer za uređaj prema pronalasku pokazao se vodomer.

Kod jedne pogodne varijante uređaja prema pronalasku između pumpe i merača strujanja dodatno se ugrađuje najmanje jedan ili više pretfiltara, na primer dubinski filtri ili taložni filtri. Kod filtara se može, na primer, raditi o dubin-skom filtru sa slojem peska, ili nekom komercijalnom fltarskom ulošku, ili komercijalnom taložnom filtru, ili pločasstom filtru, filtru sa uloškom, filtarskoj kesi ili filtarskoj cevi. Iza pretfiltra može se, eventualno, postaviti još jedan odva-jač čestica, na primer u slučaju jednog sloja peska kao pretfiltra iza njega se mo-že postaviti jedan odvajač peska. Filtri se mogu varijantama pronalaska priklju-čivati pojedinačno ili više njih u bilo kojoj međusobnoj kombinaciji, na primer u nizu jedan iza drugog i/ili paralelno. Jedno pogodno izvođenje ovih varijanti ističe se po tome što je pretfjltar jedan modul od dva paralelno uključena pretfiltra, koji rade naizmenično jedan po jedan pa se i u toku rada uređaja svaki može zameniti novim filtrom. Sledeće pogodno izvođenje ovih varijanti ističe se po tome, što se filtarsko postrojenje sastoji od jednog modula od serijski priklju-čene pretfiltarske jedinice od pretfiltra (na primer filtarske kese) i jednog ili dva dubinska filtra na koje se nastavljaju dva paralelno priključena apsolutna filtra (na primer membranski filtri), pri čemu apsolutni filtri u pogonu rade pojedi-načno na smenu, pa se i u toku rada uređaja mogu zameniti novim filtrom. Dalje je pogodno da se uređaju prema pronalasku radi kontrole redosleda funkcio-nisanja pretfiltara ugradi po jedan manometar između pumpe i pretfiltra kao i jedan manometar u području iza pretfiltra, najbolje tek iza merača toka.

Za dalje objašnjenje uređaja prema pronalasku u jednom preporučljivom izvođenju služi slika 1 koja prikazuje šematski jedan uređaj za stabilisanje i koncentrovanje CE iz PMU. Sematski prikaz procesa jedne varijante filtriranja sirovog urina dat je na slici 2.

Proces i uređaj prema pronalasku imaju niz prednosti, od kojih će u sledećem tekstu najvažnije biti ukratko pomenute. Koncentrovanje CE, tj, punjenje adsorpcionih kolona može se izvesti neposredno na mestu prikupljanja. Time otpada dnevni transport velikih količina tečnog urina do centralnog pogona za obradu. Punjenje se može duže vremena, do više nedelja kontinualno vršiti sve dok adsorberska kolona ne bude zasićena; tako, na primer kod adsorbenske smole XAD-7 iznosi količina adsorbiranog urina oko 35 zapremina sloja. Preostao urin, iz koga je izvučen CE, ostaje na licu mesta gde ionako postoje odgova-rajući uređaji za njegovo uklanjanje. Transportovaće se napunjene kolone, tj. samo oko 1/35 deo početne mase tečnog urina. Transport se može obavljati u većim vremenskim intervalima. Transport isto tako može zahtevati duže vreme, na primer do nekoliko nedelja. Zbog dobre stabilnosti CE na adsorbenskoj koloni ne očekuje se nikakvo razlaganje. Otpada obrada velikih količina urina u separatorima i postrojenjima za ultrafiltriranje, pošto je izvršeno izdvajanje sluzi i taloga koji su se eventualno nalazili u početnom urinu pomoću robusnih taložnih ili dubinskih filtara koji ne zahtevaju održavanje (na primer, peščani filtar, filtarski uložak, taložni filtar, pločasti filtar, filtar sa uloškom, filtarska torba ili cev za filtriranje), a koji se po potrebi mogu lako zameniti.

Sledeće slike i primeri treba da pronalazak detaljnije objasne ali da mu pri tome ne ograniče opseg.

Slike

Slika 1

Šematski prikazan uređaj za stabilisanje i koncentrovanje CE iz PMU;

elementi uređaja imaju sledeće značenje: (1)=dovod tečnog urina iz sabirnog

rezervoara; (2)=pumpa, na primer pumpa sa crevom; (3)=spojni vodovi; (4)= manometar; (5) = trograni priključak; (6) = brzorastavna spojnica; (7) =

ventil za zatvaranje; (8)=filtar; (9) merač toka sa plovkom (rotametar); (10)=

protokomer, na primer vodomer; (11)=cevasti rezervoar, kolona; (12)=sloj adsorbenta; (13)=odvod.

Slika 2

Šematski prikaz jednog procesa za filtriranje sirovog urina, kod koga se

postrojenje za filtriranje sastoji od jednog modula koga čini serijski priključena

pretfiltarska jedinica od pretfiltra (na primer filtarske kese) i jednog ili dva filtra

sa dubokim slojem i za tim paralelno priključena dva apsolutna filtra (na primer

membranski filtri).

Primeri

Primer 1

Opšte uputstvo za rad za koncentrovanje i stabilisanje konjugovanih estrogena

(ĆE), koji se sadrže u urinu ždrebnih kobila (PMU), neposredno u sabirnom

centru za PMU adsorbovanjem na adsorbensu koji se nalazi u jednom cevastom

<*>rezervoaru.

Sakupljeni će se urin preko jednog levka sa ugrađenim sitom sipati u

jedan sabirni rezervoar. Sito ima gruba okca i služi samo za uklanjanje grubih

mehaničkih nečistoća kao što su slama, seno itd,

Postupak će biti u daljem tekstu objašnjen u vidu primera sa primenom

jedne adsorbentske kolone (kao cilidričnog rezervoara) sa jednom polupolarnom

adsorberskom smolom. Ako se koriste cevasti rezervoari sa drugim adsorbentima, podesiće se eventualno rukovanje a naročito obrada napunjenog cevastog

rezervoara prema vrsti svakog od adsorbenata. Proces punjenjaipotonje pranje

cevastog rezervoara u sabirnom centru za urin vršiće se, u suštini, kako je

opisano pod A) i B), ili eventualno samo neznatno prilagoditi nekim posebnim

mesnim uslovima ili pojedinim adsorbenrima.

A)Adsorbovanie sadržaja estrogena iz PMU na jednom adsorbentu

Adsorbovanje sadržaja CE iz PMU vrši se u jednom postrojenju za

adsorpciju kao što je, u vidu primera, skicirano na slici 1. Jedna ukupna količina

PMU, unapred određena u odnosu na kapacitet cevastog rezervoara, odnosno

adsorbentske kolone pumpa se na temperaturi okolne sredine, eventualno posle

prethodnog prosejavanja i eventualnog filtriranja, odjednom ili po delovima,

kroz jednim adsorbentom ispunjenu kolonu ili cevasti rezervoar. Kao adsorbent

može se koristiti, na primer, jedna u vodi nabubrela polupolarna poliakril-

estarska adsorberska smola(=Amberlite XAD-7, proizvodnja Rohm und Haas,

veličina čestica 0,3 do 1,2 mm, dipolni moment 1,8 Debye, prosečan prečnik pora

80 angstrema, specifična površina oko 450 m<2>/g suvog) ili drugi pogodni

adsorbenti. Po dostizanju prethodno određene maksimalne količine punjenja sa

PMU prekinuće se dovod PMU u kolonu, odnosno ccevast rezervoar, a po želji

će se nastaviti sa pumpanjem od napunjene kolone odnosno cevastog rezervora u

jednu paralelno priključenu praznu kolonu ili cevasti rezervoar. Sadržaj estrogena iz PMU potpuno je adsorbovan na ovako napunjenoj adsorberskoj koloni.

B) Pranje napunjene adsorberske kolone

Napunjena adsorberska kolona, odnosno cevasti rezervoar, posle završetka procesa adsorbovanja može se po želji oprati vodom ili nekim drugim vodenim rastvorom za pranje, na primer nekim baznim rastvorom za pranje kao što je razblažena natrijumska lužina ( na primer 0,5-2 N NaOH). Voda za pranje ili rastvor za pranje će se pumpati na temperaturi okolne sredine sa jednom unapred određenom brzinom protoka, na primer oko 5,5 zapremina sloja na čas, kroz kolonu odnosno cevasti rezervoar. Istekla tečnost za pranje se baca.

C) Skladištenje i transport

Radi odnošenja odnosno privremenog skladištenja napunjenih adsorberskih kolona, odnosno cevastih rezervosra, oni se po završetku procesa adsorbovanja, odnosno posle neobaveznog pranja (na primer vodom ili nekim drugim, eventualnom baznim rastvorom za pranje, kao što je posebno razblažena natronska lužina, na primer 0,5-2 N NaOH) zatvaraju sa oba kraja, odvoje se od uređaja za punjenje i uskladište na nekom pogodnom mestu. Skladištiti se može na temperauri okolne sredine, na primer 15 do 30°c u normalnom magacinu ili u nekoj hladnjači na do oko 4°C. Ako je tečnost u adsorberskoj koloni zaštićena od zabrzavanja, može se i na nižim temperaturama, na primer do oko -20°C duboko ohladiti. Napunjene kolone, odnosno cevasti rezervoari će se u redovnim intervalima od nekoliko dana do par nedelja transporovati od sabirnog centra i lokalnog skladišta do jednog centralnog pogona za obradu, gde je obezbeđena stručna hemijska obrada i izdvajanje konjugovanih estrogena.

D) Desorbovanje konjugovanih estrogena iz adsorberske kolone odnosno cevastog rezervoara

Obrada punih kolona, odnosno cevastih rezervoara vrši se na za svaki od adsorbenata uobičajen način radi odvajanja primesa i izdvajanja CE. Kod primene jedne polupolarne adsorberske smole tipa Amberlite, na primer XAD 7, može se obrada izvesti kao u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 98/08526. Prema istoj će se tečnost za ispiranje pogodnom brzinom tečenja puštati kroz kolonu, odnosno cevasti rezervoar, prethodno zagrejanu na 45°C. Istekli eluat će se hvatati po frakcijama. Prva frakcija (= oko 1 zapremine sloja), ostale frakcije iznose svaka po oko 0,75 zapremine sloja. Pojedinačne frakcije se ispituju pomoću HPLC na sadržaj soli estrosulfata, krezola i HPMF. Prva se frakcija sakuplja sve dok eluat ima bledožutu boju. Ova frakcija po pravilu sadrži so estrogensulfata samo u tragovima.

Pošto istekne prva zapremina sloja eluata, dolazi do promene boje eluata u intenzivno tamnomrk ton boje. U sledeće 2 do 4 frakcije po pravilu se nalazi oko 80 do 98 % ukupne na koloni adsorbovane količine konjugovanog estrogena. To se da jasno sagledati preko smanjenja intenziteta boje. Eventualno se mogu preostale frakcije posle uklanjanja razređivača destilisanjen dalje obraćivati da bi se izdvojilo još CE.

Kako svaka od glavnih frakcija koje sadrže konjugovani estrogen ima velik sadržaj suve supstance (određen pomoću HPLC) u vidu soli estronsulfata, a

u najvećoj su meri očišćene od krezola i HPMF, te frakcije već predstavljaju

pogodne ekstrakte za dalju galensku obradu.

E) Regenerisanie kolona sa adsorberskom smolom

Regenerisanje punih kolona odnosno cevastih rezervoara vrši se na uobičajeni način za svaki od pojedinačnih adsorbenata. Kada se koristi jedna polupolarna adsorbenska smola tipa Amberlite, na primer XAD 7, može se regenerisanje vršiti kao u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 98/08526. U cilju regenerisanja, kolona, odnosno cevasti rezervoar se prvo ispere jednom mešavinom, podešenom na pH 12, etanola i vode, koja sadrži 50 mas.% etanola, potom 10% vodenim rastvorom natrijumcitrata, pa još jednom sa mešavinom etanola i vode, i na kraju sa destilisanom vodom. Celokupna se regeneracija za, na primer, navedenu adosrbesku smolu odvija na temperaturi od 45°C, pri čemu se rastvori za regenerisanje i za pranje mogu uvoditi u kolonu odnosno u cevasti rezervoar bilo sa donjeg, bilo sa gornjeg kraja. Kolona, odnosno cevasti rezervoar, može se više puta, na primer do 40 puta, puniti i opet regenerisati.

Primer 2:

Ispitivanje sa punim adsorberskim kolonama radi određivanja CE sadržaja koji se može desorbovati

Za istraživanje stabilnosti kolona, tj. stabilnosti adsorbovanog CE (konjugovanog estrogena), vršeno je ispitivanje stabilnosti sa adsorberskim kolonama napunjenim početnim urinom. Adsorberske kolone su na uobičajen način punjene, potom je adsorberska smola izvađena iz kolone i na dve

temperature je skladištena tokom različitih vremenskih intervala. Posle isteka

vremena skladištenja adsorbat je ispran i ispitan je njegov sadržaj CE i primesa.

Dobijeni su rezultati poređeni sa rezultatima ispiranja kontrolnih uzoraka, tj. uzoraka koji nisu držani na skladištu.

A) Izvođenje istraživanja

Adsorpcija je izvedena na poznat način ispunjenom kolonom, zapremine 3 1, sa polupolarnom adsorberskom smolom tipa XAD-7 (polupolarna poliakril-estarska adsorberska smola, tj. Amberlit XAD-7, fabrike Rohm und Haas, veličine čestica 0,3 do 1,2 mm, dipolnog momenta od 1,8 Debye, prosečnog prečnika pora 80 angstrema, specifične površine oko 450 m<2>/g suvog). Potom je u kolonu sipana količina od 90 1 (= 30 zapremina sloja) prethodno ultraffltriranog kobiljeg urina (poreklom iz Poljske) na sobnoj temperaturi, protočnom brzinom od 5 zapremina sloja na čas. Sadržaj estrogena u PMU biće potpuno adsorbovan na ovako napunjenoj koloni sa polupolarnom adsorberskom smolom. Po završetku punjenja, kolona sa kobiljim urinom bila je naknadno isprana sa 3 1 vode a napunjena smola izvađena iz kolone i podeljena na 10 uzoraka od po 300

ml a oni su bili preneti u manje kolone. Jedan je uzorak odbačen.

Potom je dalje postupano na sleđeći način:

1. Neposredno ispiranje kontrolnog uzorka, tj. bez skladištenja.

2. Skladištenje svakog od uzoraka na 4°C ili na 25°C

3. Ispiranje uzorka 1 (4°C) i 2 (25°C) posle nedelju dana skladištenja.

4. Ispiranje uzorka 3 (4°C) i 4 (25°C) posle dve nedelje skladištenja.

5. Ispiranje uzorka 5 (4°C) i 6 (25°C) posle pet nedelja skladištenja.

6. Ispiranje uzorka 7 (4°C) i 8 (25°C) posle osam nedelja skladištenja.

Ispiranje je vršeno na uobičajen način, tako što je napunjenja adsorberska smola prvo isprana jednim vodenim rastvorom natrijumhidroksida. Posle svakog stepena pranja svaka je tečnost za pranje ispitana pomoću HPLC na njen sadržaj estrona (kao soli sulfata), ekvilina, krezola i HPMF.

Kao tečnost za ispiranje korišćena je mešavina vođe i etanola dobijena dodavanjem alkalnog natrijumhidroksida (30 mas. %, pH 12) a ispiranje je smole vršeno na temperaturi ispiranja od 45°C. Ekstrakt je sakupljen po frakcijama koje su ponovo ispitane pomoću HPLC na njihov sadržaj estrona, krezola i HPMF. Prva je frakcija sakupljana sve dok je ekstrakt (eluat) bio bezbojan ili bledožute boje. Ova je frakcija sadržala Estron (so estrogensulfata) samo u tragovima. Nakon što je istekla prva zapremina sloja ekstrakta (eluata) došlo je do promene boje ekstrakta u intenzivno tamnomrk ton boje. U sledeće 2 do 4 frakcije sadržano je oko 80 do 98 % ukupne količine konjugovanih estrogena adsorbovanih u koloni. Ostale frakcije za renerisanje smole (na 45°C po unaprd datom redosledu sa 50 % eatnolom pri pH 12. 10% natrijumcitratom sa vodom) sadrže samo male količine soli estrogensulfata. To se jasno može videti po smanjenju intenziteta boje.

B) Rezultati

Rezultati ipitivanja stabilnosti kolona dobijeni za pojedinačne uzorke prikazani su u tabelama 1.0 do 1.9, odnosno sažeti u tabeli 1.10, i treba da u daljem tekstu budu detaljnije objašnjeni.

Punjenje kolone, odnosno cevastog rezervoara urinom, videti tabelu 1.0. kao i ispiranje kontrolne kolone, tabela 1.1, pokazale su normalan tok adsorbovanja i desorbovanja, Utvrđene su povišene vrednosti za krezol i HPMF u ekstraktu (eluatu) koje se u velikoj meri može pripisati nepotpuno laminarnom strujanju u koloni odnosno koje može dovesti do povraćaja izlaznog urina sa vrlo velikim vrednostima krezola od skoro 1000 mg/l.

Tabele 1.2 do 1.9 daju rezultate za ispiranje posle skladištenja od jedne, dve, pet i osam nedelja. Bitno je da je utvrđeno da se adsorbovani hormoni (CE) po pravilu kvantitativno desorbuju. Posle samo jednonedeljnog uskladištenja na 25°C utvrđena je kvantitativna đesorpcija tek kod 50% etanolske regeneracije, pri čemu se ipak radi o desorpcijii zaostalih količina CE, s tim da je najveći deo mogao biti izdvojen u stvarnoj desorpciji. Zavisnost desorpcije od trajanja skladištenja i temperature se ne primećuje, ili se samo uslovno pominje, na primer zbog toga što neoptimalni uslovi strujanja u malim kolonama mogu imati veći uticaj. Ekstrakt (eluat) je u svim slučajevima u najvećoj mogućoj meri bez krezola HPMF. Za postizanje optimalnih rezultata treba nezavisno od vremena provedenog na skladištu voditi računa o optimalnom proricanju kroz kolonu. Kolone, odnosno cevasti rezervoari treba zbog toga da su stalno puni tečnosti, tj. izbegavati suvi rad.

Rezultati petonedeljnog skladištenja, tabele 1.6 i 1.7, pokazuju za temperaturu od 4°C dobar tok ispiranja; za T = 25°C svakako se nalaze delovi hormona u regeneratu. U oba slučaja je sadržaj HPMF i krezola u ekstraktu (eluatu) vrlo mali.

Neočekivano su za vrlo dugotrajno skladištenje postignuti veoma dobri rezultati, kao što su oni za osmonedeljno skladištenje sa izvanrednim rezultatima prikazani u tabelama 1.8 i 1.9. Maksimumi ispiranja su za estron i ekvilin vrlo strmi, odnosno oštri, tj. CE-eluat je mali. Vrednosti krezola i HPMF približavaju se nuli.

Tabela 1.10 prikazuje sve rezultate u jednom preglednom izvodu. Zbir sadržaja estrogena u eluatima (ekstraktima) i u regeneratima u svim se slučajevima nalazi ispod oko 1055 mg ± 4% i odgovara očekivanom bilansu.

Ukratko se može zaključitu da jednonedeljno do osmonedeljnog skladi-štenja punjene XAD-7 smole na temperaturama od 4°C i 25°C pokazuje razlike u postupku ispiranja, visini i širini hormonskih maksimuma, ali ne i zbiru ukupno ispranih hormona, koji svi do jednoga u odnosu na sadržaj estrona spadaju u opseg od 1055 mg ± 4%. Iz toga se može izvesti da se zapažene kvalitativne razlike u najvećoj meri zasnivaju na nehomogenim uslovima strujanja u primenjenim relativno malim kolonoma, i da bi se primenom prema uslovima u praksi dimenzionisanih kolona, odnosno cevastih rezervoara, mogle lako izbeći.

Tabela 1. 0:

Ispitivanje kolona u pogledu stabilnosti materijala kolona

Punjenje kolona sa prirodnim urinom iz Poljske, ultrafiltriranim

Adsorber XAD 7, zapremina = 3 1

Prema zadatku je sa kolone skinuta smola i isprana sa 3 1 vode. Smola je, podeljena na jednake delove od po 300 ml, podvrgnuta ispitivanju stabilnosti kolone. Jedan je paket smole odmah ispran, dok su ostali uskladišteni na sobnoj temperaturi i u hladnjaku.

Primer 3

Ispitivanja stabilnostisapunim adsorberskim kolonama radi određivanja broja

klica

Mikrobiološki kvalitet i poverenje u prirodne polazne materijale za izradu farmaceutskih preparata, a koji su ranije dobijeni, dobija sve veći značaj. Zbog toga su vršene analize za određivanje broja klica u uzorcima posle petonedeljnog i osmonedeljnog skladištenja kolona koristeći uobičajenu metodologiju (Farmakopeja ).

Rezultati određivanja broja klica prikazani su u tabeli II. Ukupni brojevi klica za temperaturu skladištenja od 4°C označeni su kao mali. Za temperaturu skladištenja od 25°C voda za pranje kolone ima 1,2 do 4,6 . IO<6>klica, dok je u ekstraktu (eluatu) nađeno 80 do 170 klica. Ovde treba napomenuti da skladištem adsorbenti u kolonama nisu bili ni isprani ni konzervisani, dakle od pre je posto-jala povećana opasnost od klica. Kod skladištenja bez hlađenja preporučuje se pranje punih kolona bar vodom, ali ipak bolje dodatno sa rastvorima za pranje koji vrše stabilisanje odnosno konzerviranje, na primer slanim rastvorom.

Primer 4

Ispitivanja stabilnostisadubokohlađenim punim adsorberskim kolonama

Utoku godišnjih doba i/ili u regionalnim uslovima mogusekod skladi-štenja ilikodtransporta punekolone,odnosno cevasti rezervoari, sresti sa temperaturamaispod tačkesmrzavanja, saneželjenimposledicama da se vodeni sadržajkolona, odnosnocevastih rezervoara,zamrzne. Odgovarajućaistraživanja su dovela dozaključkada se proces zamrzavanja negativno odražava na ispiranjeotopljenih kolonaodnosno cevastih rezervoara.Kako je temperiranjekolona neizvodljivo,ili ukoliko dođe do skladištenjananiskim temperaturama,predlaže sedaseradisprečavanja zabrzavanjaposlednje pranje izvršiumcsto vodomnekim pogodnimmešavinamaprotivzamrzavanja.

A)Izvođenjeispitivanja

Od velikog broja mogućih mešavina protivzamrzavanja,od kojih je radiobjašnjenja nekoliko navedeno uvidu primera u tabeli III.l,za dalja ispitivanjajekaoprimer izabran jedan slani rastvor. Kod sipanja23 g NaClu 100g vode tačka zamrzavanjajena -21°C.

Punjenje kolone izvedeno je na uobičajen način. Po završetku punjenja urinom vršeno je ispiranje sa 3 zapremine sloja vode, zatim sa 2 zapremine sloja jednog 33% NaCl rastvora. Potom je kolona uskladištena tokom 9 dana na -19°C

u jednom zamrzivaču.

B) Rezultati

Posle 9 dana skladištenja na -19°C sadržaj kolone ostao je tečan i bez ikakvog znaka zaleđivanja. Obrada kolone, tj. bazno pranje, ispiranje i regenerisanje, protekla je normalno. Ukupan sadržaj hormona po TS iznosio je oko 22 mas. %. Rezultati su prikazani u Tabeli in.2.

Negativno delovanje velikog sadržaja NaCl na sadržaj CE i na izdvajanje krezola i HPMF nije zapaženo, kao zaključak se može smatrati da je stabilisanje kolona, odnosno cevastih rezervoara punjenih urinom sa jednim vodenim slanim rastvorom, i skladiwtenje uz hlađenje, na primer do oko -20°C, u trajanju od 1,5 do 2 nedelje povoljno delovalo. Sadržaj kolona, odnosno cevastih rezervoara ostao je tečan, obrada kolona, odnosno cevastih rezervoara radi izdvajanja CE pranjem, ispiranjem i regenerisanjem protekla je normalno. Nisu potvrđeni negativni nalazi ni kod velikih sadržaja NaCl.

Primer5:

Praktična ispitivanja kondenzovanjaistabilizovanja urina

A) Opšte

Kod jednog praktičnog ispitivanja treba da se pokaže da se kod dovoljnog

sadržaja hormonauurinu postižu ne samo u laboratoriji već i u proizvodnim

uslovima dobri rezultati. Vršeno je istraživanje kako se to može izvesti u

sakupljačkim kampanjama na bilo kojim mestima.

B) Izvođenje istraživanja

Svež urin zadovoljavajućeg kvaliteta sakupljan je u jednoj ergeli. Sa tri

konja i 15 do 20 1 urina na dan dobijeno je za 10 dana oko 150 do 200 1. Za

adsorbovanje je izabrana jedna adsorberska kolona kapaciteta5I. Dnevno

punjenje urinom, osim u dane vikenda, tokom istraživanja vršeno je prema

sleđećem planu:

Početak sakupljanja urina od vikenda

Ponedeljak:punjenje urina od subote, nedelje i ponedeljka

Utorak do petka:punjenje urina od svakog tekućeg dana

Ponedeljak:punjenje urina od subote, nedelje i ponedeljka

Utorak:ispiranje (eluiranje)

Punjenje urinom brzinom punjenja od oko 4,5 zapremine sloja/h vršeno je

neposredno u kolonu, pri čemu je samo jedan pamučni fUtarski uložak sa grani-

com odvajanja od 20/xm služiio kao pretfiltar. Između pojedinačnih punjenja

radi otežavanja uslova nije vršeno ispiranje vodom. U prethodnim istraživanjima

moglo se preko jednog pamučnog filtarskog uloška propustiti do 450 1 urina bez

gubitka pritiska. Kod ovog praktičnog ispitivanja pokazalo se filtriranje zbog

neočekivano velikog sadržaja taloga kalcijumkarbona i/ili sluzi u celini kao teško.

Posle svakih 40 do 50 litara dolazilo je do začepljenja sa porastom pritiska

do oko 4 bar, što je zahtevalo zamemi filtra. Zbog sadržaja kalcijumkarbonata

i/ili sluzi savetuje se eventualno dodavanje pomoćnih sredstava za filtriranje.

Kako filtarski uložak propušta čestice taloga > 20/xm, nije dolazilo do

začepljavanja adsorberske kolone.

C)Rezultati

Sadržaj hormona

Rezultati ovih praktičnih ispitivanja prikazani su u tabeli IV.

Sadržaji estrona i ekvilina u sirovom urinu bili su sa 123 mg/l, odnosno 74

mg/l zadovoljavajaće veliki i odgovaraju urinu srednjeg do dobrog kvaliteta. Ipak

je bila neočekivana vrednost krezola od 531 mg/l u svežem urinu, koja do tada

nije zapažena. Ovde se postavlja pitanje ishrane i zahteva posebnu pažnju. Ako

bi u suštini prevladao povećan sadržaj krezola to biunekim slučajevima moglo

dovesti do teškoća. Zbog toga može biti potrebno da se alkalni proces pranja kod

obrade produži da bi se sadržaj krezola u etanolskom eluatu (ekstraktu) sveo na

minimum. Inače su adsorpcija i desorpcija protekle kao i obično. U eluatu je

ostvaren dobro zapažen tok estrona i ekvilina. U eluatima 2 i 3 našlo se više od

95% estrona/ekvilina. U odnosu na sadržaj suve materije, ukupni sadržaj hormona iznosio je oko 30 mas.%. Time su ispunjena očekivanja postavljena u istraži-

vanju i pod teškim uslovima istraživanja postignuto je odlično koncentrovanje:

sadržaj hormona/suva materija < 15 mas.%.

Broj klica

Dodatno je kod adsorpcije urina istraživano moguće oblaganje kolone

klicama bakterija. Pri sledećim uslovima:

1. Punjenje kontaminiranog sirovog urina (filtriranjem pamučnim filtarskim

uloškom nisu izdvojene klice)

2. Bez pranja posle dnevnog punjenja

3. Izvođenje istraživanja na sobnoj temperaturi

4. Trajanje istraživanja 10 dana

Nije bilo isključeno sejanje klica u kolonu i potonje oblaganje kolone

klicama. Određivanje ukupnog broja klica kod raznih stepena adsorbovanja dalo

je sledeće rezultate:

D) Pregled rezultata

Tokom 10 dana istraživanja dolivan je svakodnevno svež urin u

adsorbersku kolonu zapremine 5 I. Ukupna zapremina urina iznosila je 140 1 sa

srednjim sadržajem estrona, odnosno ekvilina od 123 mg/l, odnosno 74 mg/l.

Ispiranje kolone vodom posle dnevne adsorpcije urina namerno je

izostavljeno. U oba vrlo značajna dobijena glavna eluata nađeno je oko 93%

estrona odnosno ekvilina. Ukupan sadržaj hormona u eluatu u odnosu na suvu

materiju iznosi oko 30 mas.%. Sledeći neočekivani rezultat odnosi se na jedno

moguće zagađivanje kolone. Uprkos dodavanju klicama veoma zagađenog urina,

ni posle 10 dana nije zapaženo taloženje klica u koloni. Dobijem je eluat sa 1,5

klica/ml praktično bez klica. Pod teškim uslovima se pokazalo u velikim

razmerama da se kod dovoljnog sadržaja hormona u sirovom urinu može u

adsorberskoj koloni ostvariti dobar kvalitet stabilizovanja i koncentrovanja kod

sadržaja hormona u odnosu na suvu materiju većeg od 15%.

Primer 6

Istraživanja sa filtrima sa uloškom

U jednom slcdećm kraktičnim ispituvanju vršeno je istraživanje sa filtrima

sa uloškom, čiji se rezultati mogu prikazati na sledeći način:

Upotrebljen materijal: svež urin (poreklom iz jedne nemačke ergele).

Delimično zamućen, u buradima sakupljen urin ždrebnih kobila prepum-

pan je u jednu posudu pomoće pumpe sa crevom i kroz5/ j,kesu (pretfiltar). U

posudi je ostao talog od oko 0,5 mas.%. Šematski prikaz postupka filtriranja

sirovog urina dat je na slici 2.

Za svako je ispitivanje uzet jedan uzorak posle apsolutnog filtra (membranski filtar). Posle svakih 1001 uzet je uzorak iz otoka iza kolone.

Ukupno punjenje kolone: 3971 filtrata

Sadržaj suve materije posle obrade (TS) iznosio je 5,9 mas.%.

Claims (23)

1. Postupak prilagođen praksi za decentralizovano koncentrovanje i stabilizovanje mešavina konjugovanih estrogena (CE) iz urina ždrebnih kobila (PMU), naznačen time, - što se u urinu ždrebnih kobila (PMU) sadržana prirodna mešavina konjugovanih estrogena (CE) koncentruje i stabilizuje najednom čvrstom nosaču (adsorbentu), tako - što se jedna unapred određena maksimalna ukupna količina sakupljenog, eventualno prethodno prečišćenog tečnog urina iz jednog rezervoara kontinualno, ili u pojedinačnim manjim količinama sa unapred određenom brzinom proticanja pumpa kroz jedan vertikalan metalan cevast rezervoar (11) a istekla urinska tečnost se odbacuje, pri čemu - taj cevast rezervoar (11) ima ispunu od adsorbenta, stalno obloženu tečnošću, pogodnu za adsorpciju jedne unapred određene količine smeše konjugovanih estrogena (CE) koja se nalazi u urinskoj tečnosti, i pri čemu je - kao krajnja kontrola punjenja adsorbenta unapred određena, maksimalna ukupna količina urinske tečnosti upumpane kroz pomenuti cevasti rezervoar (11) podešena je na maksimalni kapacitet adsorbenta za konjugovane estrogene (CE) sadržane u urinskoj tečnosti.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što su unutrašnje dimenzije cevastog rezervoara (11) za sloj adsorbenta (12) tako odmerene, da cevasti rezervoar (11) može primiti 30 dO 50 1 adsorbenta i obrazovati za PMU jednu putanju od ulaza do izlaza dužine od 80 do 120 cm koju mora preći.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je cevast rezervoar (11) koji se koristi u ovom postupku načinjen od laboratorijskog stakla otpornog na udar, plastične mase i/ili metala.

4. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se kao pumpa (2) koristi jedna monopumpa, pumpa sa crevom ili membranska pumpa.

5. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se kao merač (9) koristi jedan rotametar sa plovkom, jedan trokraki merač toka ili jedan indukcioni merač toka.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se za merenje kroz cevasti rezervoar (11) pumpane količine tečnog urina koristi jedan protokomer (10), najbolje jedan vodomer ili jedan indukcioni protokomer.

7. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je brzina toka (brzina punjenja) u opsegu od 3 do 10 zapremina adsorberskog sloja /h, najbolje 4 do 6 zapremina adsorberskog slojaIh.

8. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se kao adsorbenti koriste polimerne adsorberske soli, silikagel ili RP-silikagel, najbolje polupolarne polimerne adsorberske soli.

9. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što maksimalna ukupna količina tečnog urina iznosi 20 do 60 zapremina adsorberskog sloja, najbolje 30 do 40 zapremina adsorberskog sloja.

10. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se cevasti rezervoar (II), posle punjenja adsorbenta količinom PMU koja približno odgovara ukupnom kapacitetu adsorbenta, ili posle postizanja ukupnog kapaciteta punjenja sa bilo koliko pojedinačnih delimičnih stepena punjenja, ispira vodom i/ili nekim drugim pogodnim vodenim rastvorom za pranje.

11. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se cevasti rezervoar (11), posle punjenja adsorbenta po želji prvo ispira vodom i/ili nekim drugim pogodnim vodenim rastvorom za pranje a potom, radi daljeg stabilizovanja i koncentrovanja, jednim rastvorom za konzerviranje, na primer nekim rastvorom koji sadrži neki konzervans, nekim vodenim rastvorom sa podešenim pH i/ili nekim vodenim slanim rastvorom.

12. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što se tečan urin iz sabirnog rezervoara pumpa prvo kroz jedan ili nekoliko pretfiltara (8), pogodno kroz jedan dubinski ili jedan taložni filtar, pre nego što se tečan urin propusti kroz cevasti rezervoar (11).

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time, što je pretfiltar (8) jedan dubinski filtar sa peščanim slojem ili filtarskim uloškom, pločast filtar, filtar sa uloškom, filtarska torba ili filtraciona cev.

14. Postupak prema zahtevu 12 ili 13, naznačen time, što se tečnom urinu pre filtriranja dodaje pomoćno sredstvo za filtriranje.

15. Uređaj za praksi prilagođeno decentralisano koncentrovanje i stabilisanje mešavine konjugovanih estrogena (CE) koji se nalaze u urinu ždrebnih kobila (PMU) na čvrstom nosaču (adsorbentu), naznačen time, što obuhvata: -jedan vertikalno postavljen cevast rezervoar (11), koji je ispunjen jednim adsorbentom koji je (stalno) obložen tečnošću, a koji je pogodan za adsorpciju jedne unapred određene količine mešavine konjugovanih estrogena (CE) koji se nalaze u tečnom urinu ždrebnih kobila, pri čemu cevasti rezervoar (11) ima bilo a) na donjem kraju postavljen ulazni otvor za tečnost a na gornjem kraju postavljen izlazni otvor za tečnost, bilo b) na gornjem kraju postavljen ulazni otvor za tečnost i na donjem kraju postavljen izlazni otvor za tečnost, - kao i ispred cevastog rezervoara (11) po određenom rasporedu poredane i provodnim crevima (3) povezane - pumpu (2), merač (9) strujanja i protokomer (10).

16. Uređaj prema zahtevu 15, naznačen time, što je između pumpe (2) i merača (9) strujanja dodatno ugrađen najmanje jedan pretfiltar (8), najbolje jedan dubinski filtar ili jedan taložni filtar.

17. Uređaj prema zahtevu 16, naznačen time, što je pretfiltar (8) jedan modul od dva paralelno priključena pretfiltra, koji naizmenično pojedinačno rade pa se i u toku rada uređaja mogu zameniti.

18. Uređaj prema zahtevu 16 ili 17, naznačen time, što je radi kontrole redoslednih funkcija pretfiltra (8) ugrađen jedan manometar (4) između pumpe (2) i pretfiltra (8), kao i jedan manometar (4) u području iza pretfiltra (8), najbolje pogodno iza merača (9) strujanja.

19. Uređaj prema zahtevu 1, naznačen time, što su unutrašnje dimenzije cevastog rezervoara (11) za sloj adsorbenta (12) izvedene sa unutrašnjom visinom u opsegu od 80 do 120 cm i sa unutrašnjim prečnikom u opsegu od 10 do 25 cm

20. Uređaj prema zahtevu 15, naznačen time, što je cevast rezervoar (11) koji se koristi u ovom uređaju načinjen od laboratorijskog stakla otpornog na udar, plastične mase i/ili metala.

21. Uređaj prema zahtevu 15, naznačen time, što je pumpa (2) obuhvaćena uređajem jedna monopumpa, pumpa sa crevom ili membranska pumpa.

22. Uređaj prema zahtevu 15, naznačen time, što je kao merač (9) toka uređajem obuhvaćen jedan rotametar sa plovkom, jedan trokraki merač toka ili jedan indukcioni mjerač toka.

23. Uređaj prema zahtevu 15, naznačen time, što je uređajem obuhvaćen, za merenje kroz cevasti rezervoar (11) pumpane količine tečnog urina korišćen protokomer (10), jedan vodomer ili jedan indukcioni protokomer.