RS50738B - Mutanti hemokina u lečenju multiple skleroze - Google Patents

Abstract

Upotreba CC hemokinskog mutanta, koji sadrži najmanje dve mutacije u katjonskom mestu 40's-petlje, i koji, u odnosu na molekul divljeg tipa, ima smanjenu aktivnost vezivanja za GAG, za pripremu farmaceutskog preparata za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelinizirajučih bolesti, naznačen time da je CC hemokin odabran iz RANTES, MI1 alfa, MI1 beta, MI3, MI4, HCC1, I309, I35612 i MC2. Prijava sadrži još 6 nezavisnih i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na mutante CC hemokina, koji sadrže najmanje dve mutacije na 40's-petlji i koji, u odnosu na molekul divljeg tipa, imaju smanjenu mogućnost vezivanja GAG: utvrđeno je da su takvi mutirani hemokini efikasni za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelinizirajućih bolesti.

STANJE TEHNIKE

Hemokini predstavljaju porodicu malih pro-inflamatornih citokina sa leukocitnim hemotaktičkim i aktivirajućim svojstvima. Zavisno od položaja prvih konzerviranih cisteina, porodica hemokina može da se podeli u C-C, C-X-C i C-X3-C hemokine (Baggiolini M. i sar., Adv Immunol. 1994, 55:97-179; Baggiolini M. i sar.., Annu Rev Immunol. 1997,15:675-705; Taub D. i sar., Cvtokine Growth Factor Rev. 1996,7(4):355-76).

Mnogi C-X-C hemokini kao što je interleukin-8 (IL-8) su hemotaktični za neutrophile, dok su C-C hemokini aktivni na nizu leukocita uključujući monocite, limfocite, eosinofile, bazofile, NK ćelije i dendritske ćelije.

NH2-terminalni domen hemokina je uključen u vezivanje za receptore pa NH2-terminalno procesiranje može ili da aktivira hemokine ili da hemokine učini potpuno inaktivnima.

N-terminalne varijante sintetičkih C-C hemokina su testirane na njihovu aktivnost kao inhibitora ili antagonista oblika koji nastaju prirodno. MCP-1, MCP-3 i RANTES koji nemaju 8 do 9 NH2-terminalnih amino kiselina su neaktivni na monocitima i korisni su kao receptorski antagonisti (Gong JH i sar., J Exp Med. 1995,181 (2):631-40 i Gong JH i sar., J Biol Chem. 1996, 271(18):10521-7).

Ekstenzija RANTES sa jednim metioninom dovodi do skoro potpune inaktivacije ovog molekula a Met-RANTES se ponaša kao antagonista za jedan autentični (Proudfoot AE i sar., J Biol Chem. 1996 Feb 2;271(5):2599-603).

WO 99/16877 se odnosi na amino-terminalno razgranati RANTES, koji nema NH2-terminalne amino kiseline što odgovara amino kiselinskim ostacima 1, 1-2, 1-3 ili 1-4 prirodno nastajućeg RANTES i pošto ima hemokinsku antagonističku aktivnost, kao i cDNA sekvence koje ih enkodiraju, njihovu upotrebu u terapiji i/ili dijagnozi bolesti, u kojima je potrebna aktagonistička aktivnost dejstva hemokina. RANTES (3-68) je preporučeni razgranati antagonist hemokina. lako su hemoatraktantna aktivnost RANTES i CC hemokina globalno bili ispitivani uglavnom u vezi sa specifičnim ćelijskim membranskim receptorima, RANTES može da ulazi u reakciju i sa glikozaminoglikanima (GAGs), visoko promenljivim, razgranatim grupama šećera koji se post-translaciono dodaju na nekoliko proteina, koji se generički nazivaju proteoglikanima (PG). Ovakvi proteini postoje na ćelijskoj membrani, u vanćelijskoj matrici i u krvotoku, gde izolovani GAGs takođe mogu da budu prisutni.

Interakcija sa GAG je jedna osobina koja je zajednička mnogim rastvorljivim molekulima za ćelijsku signalizaciju (interleukini, faktori rasta). PG, ili izolovani GAGs, mogu da stvaraju komplekse sa rastvorljivim molekulima, verovatno na nivou zaštite ovog molekula od proteolize u vanćelijskom okruženju. Jedna od hipoteza je bila i da GAG mogu da pomognu u korigovanju prezentacije molekula za ćelijsku signalizaciju na njihovim specifičnim receptorima i, eventualno, modulaciji aktivacije ciljnih ćelija.

U slučaju hemokina, koncentracija u imobilizovane gradijente na mestu zapaljenja i, posledično, interakcija sa ćelijskim receptorima i njihovo stanje aktivacije su izgleda modulirani različitim oblicima GAG (Hoogevverf AJ i sar., Biochemistrv 1997, 36(44): 13570-8). Prema tome, smatra se da modulacija takvih interakcija može da predstavlja terapijski pristup kod zapaljenskih bolesti (Schvvarz MK i VVells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 3(4):407-17) kao i kod HIV infekcije (Burns JM i sar., Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(25): 14499-504).

Strukturni zahtevi i funkcionalna dejstva GAG-RANTES interakcije ispitivani su na mnogim modelima. RANTES vezuje GAG na endotelijskim ćelijama umbilikalne vene čoveka (HUVEC) u mikromolarnim koncentracijama i sa afinitetom i specifičnošću većim nego drugi hemokini, kao MCP-1, IL-8, ili MIP-1alfa. Izgleda da ovakva interakcija nije samo elektrostatička, već zavisi i od drugih parametara kao što su dužina i N- i O-sulfacija GAG (Kuschert GS i sar., Biochemistrv 1999, 38(39): 12959-68). GAG-defektne ćelijske linije i dalje mogu da vezuju hemokine, ali prisustvo GAG na ćelijskoj površini u mnogome pojačava njihovu aktivnost na receptorima kada su u niskim koncentracijama (Ali S i sar., J Biol Chem 2000, 275(16):11721-7). Drugi eksperimenti su pokazali da GAG, pre svega heparin sulfat, olakšavaju interakciju RANTES sa ćelijskom površinom makrofaga i posledičnu inhibiciju HIV infekcije, što je rezultat dosledan sa dobro poznatom rezistencijom ovih ćelija, koje loše eksprimiraju heparin sulfat, na antivirusno dejstvo RANTES (Oravecz T, i sar., J Immunol. 1997,159(9):4587-92).

Solubilni GAG su u kompeticiji sa GAG na ćelijskoj membrani, i mogu da deluju kao specifični inhibitori RANTES-indukovane aktivacione površine (Appay V, i sar.; Int Immunol 2000, 12(8): 1173-82), ili kao supresori HIV infekcije (Burns JM, i sar.; Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(25): 14499-504).

Neke strukturno-funkcionalna studije su pokušale da identifikuju RANTES domen odgovoran za interakciju sa GAG, jer je tradicionalna konsenzus sekvenca (BBXB, gde je B osnovni ostatak, a X može biti bilo koji ostatak) previše generička. Izvršeno je jedno ispitivanje mapiranja epitopa korišćenjem monoklonskog antitela, izdvojenog protiv rekombinantnog humanog RANTESa,

koje je u stanju da blokira i antivirusno dejstvo i mobilizaciju intraćelijskog kalcijuma posredovanog RANTESom (Burns JM i sar., J. Exp. Med. 1998, 188(10):1917-27). Ovaj pristup je dozvolio da se definišu ostaci 55-66 kao neophodni i za takve aktivnosti i za interakciju GAG, gde se tvrdi da interakcija GAG može da bude komplementarna ili specifična funkcija sa jednog od posredovanih kanonskim, receptorima kao što se sugeriše i ispitivanjem na RANTES varijantama koje imaju izmenjena agregaciona svojstva (Appay V i sar., J Biol Chem 1999, 274(39):27505-12).

Region 55-66, koji predstavlja C-terminalni alfa-helikalni segment, je homologni za GAG-vezujući domen drugih hemokina, kao IL-8 (VVitt DP i Lander AD, Curr. Biol. 1994, 4(5):394^00), i sadrži katjonsko mesto koje sadrži lizin i arginin (KKVVVR). Ovakav region vezivanja se razlikuje od mesta vezivanja za ćelijske receptore, koje je locirano na N-završetku (Pakianathan DR i sar., Biochemistrv 1997, 36(32):9642-8), i sadrži neke ostatke koji su uključeni u agregaciju RANTES monomera, iako izgleda da takve dizagregacijske mutacije ne utiču na interakcije sa GAG (Czaplevvski LG i sar., J. Biol. Chem. 1999, 274(23): 16077-84; WO 98/13495).

RANTES sadrži drugo katjonsko mesto (RKNR) na ostacima 44-47 koje se čuva u GAG vezujućem domenu drugih hemokina, kao MIP-1a (Koopmann W i Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997, 272(15): 10103-9) i MIP-ip (Koopmann W i sar., J Immunol. 1999, 163(4):2120-7).

Humane RANTES varijante koje sadrže samo po jednu mutaciju u ovim katjonskim mestima dislocirane su jer RANTES antagonisti imaju potencijalne terapijske primene u lečenju HIV infekcije i zapaljenskih ili alergijskih bolesti (WO 99/33989).

U ovom pronalasku se još otkriva da je samo trostruki mutant RANTESa, u kome su tri ostatka na pozicijama 44, 45 i 47 supstituisana Alaninom, izgubio sposobnost vezivanja GAG (A. Proudfoot i sar., Gordon konferencija o hemokinima, Prvo zasedanje, 24. jula 2000, lično saopštenje).

OPIS PRONALASKA

Sada je utvrđeno da su CC hemokini, koji sadrže najmanje dve mutacije na katjonskom mestu takozvane "40's-petlje" delotvorni za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelinizujućih bolesti. Ovo mesto predstavlja jedan očuvani motiv vezivanja GAG u CC hemokinima (kao RANTES, MIP-1alfa i MIP-1beta, MIP-3, MIP-4, HCC1, I309, MCP-2). Svi ovi mutanti hemokina imaju smanjenu aktivnost vezivanja GAG, kada se porede sa odgovarajućim molekulima divljeg tipa.

Region u kome treba da su prisutne najmanje dve mutacije treba da bude prisutan, u skladu sa ovim pronalaskom, takozvana "40's-petlja" indikovana je za broj CC hemokina na Slici 1. Pre svega, pokazano je da je RANTES trostruki mutant, u kome su tri osnovna ostatka na pozicijama 44, 45 i 47 zamenjena Alaninom, aktivan u životinjskom modelu za lečenje multiple skleroze. Ovaj trostruki mutant RANTESa pokazao je dozno zavisno dejstvo na mišjem modelu EAE i uporedivu efikasnost sa referentnim lečenjem rekombinantnim IFN-beta. Analogni rezultati su nađeni i sa razgranatim RANTES trostrukim mutantom, u kome su tri ostatka na pozicijama 44, 45 i 47 supstituisana Alaninom i kojima nedostaju prve 2 N-terminalne amino kiseline. Ovaj razgranati RANTES mutant (koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2) je novi i predstavlja još jedan cilj ovog pronalaska.

Slični eksperimentalni dokazi su generisani i u vezi sa trostrukim mutantima MIP-1alfa i MIP-1beta, koji su već poznati i koji su ovde identifikovani kao MIP-1a trostruki mutant R18A-R46A-R48A (Koopmann VV i Krangel MS., J Biol Chem. 1997, 272(15): 10103-9) i MIP-1 (3 trostruki 40-49 mutant K45A-R46A-K48A (Laurence JS, Biochemistrv 2001, 40:4990-4999).

Izraz "smanjena aktivnost vezivanja GAG" znači da mutanti iz ovog pronalaska imaju manju sposobnost da se vezuju za GAG (kao heparin sulfat) u odnosu na odgovarajuće molekule divljeg tipa.

Još je bolje ako su mutanti humanog RANTESa, u kome su tri osnovne amino kiseline na položajima 44, 45 i 47 molekula divljeg tipa supstituisane drugim amino kiselinama. Ovakvi ostaci se mogu supstituisati malim, alifatičnim, ne-polarnim ili blago polarnim ostacima, kao što su na primer Ala, Ser, Thr, Pro, i Gly. Alaninu se daje prednost.

Pokazano je da su posebno efikasni u lečenju MS oni RANTES mutanti koji imaju amino kiselinske sekvence kao što je zabeleženo u SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3.

Drugi cilj ovog pronalaska jeste upotreba mutanta hemokina kako su gore definisani za proizvodnju farmaceutskog sastava za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelizacionih bolesti.

Multipla skleroza (MS) je oboljenje CNS koje sporo napreduje i koje se odlikuje diseminovanim poljima demijelinizacije u mozgu i kičmenoj moždini, što dovodi do multiplih i raznolikih neuroloških simptoma i znakova, obično sa remisijama i egzacerbacijama (vidi The Merck Manual{ Merikov priručnik),šesnaesto izdanje).

Uzročnik nije poznat, ali se sumnja na imunološku abnormalnost, gde trenutno nekoliko indikacija ukazuje na specifični mehanizam. U postulirane slučajeve spadaju infekcija sporim ili latentnim virusom, i mijelinoliza enzimima. Vrednost IgG je obično povišena u likvoru, a povišeni titri su često povezani sa nizom virusa, uključujući i male boginje. Značaj ovih nalaza i pretpostavljene veze sa HLA alotipovima iizmenjenim brojem T ćelija nisu jasni, jer su dokazi u nekoliko suprotstavljeni. Povišena porodična učestalost ukazuje na genetsku prijemčivost žena koje su nešto češće pogođene od muškaraca. Izgleda da postoje i faktori životne sredine, lako bolest najčešće nastaje u starosnoj grupi između 20 i 40 godina, MS je povezana i sa geografskom oblašću u kojoj pacijenti provedu prvih 15 godina života. Preseljenje posle prvih 15 godina ne utiče na izraženost rizika.

Plakovi ili ostrvca demijelinizacije sa uništavanjem oligodendroglije i perivaskularno zapaljenje su diseminovani po ćelom CNS, pre svega u beloj masi, sa predilekcijom za lateralne i posteriorne kolumne (posebno u cervikalnim i dorzalnim regionima), optičke nerve, i periventrikulane oblasti. Putevi u srednjem mozgu, ponsu i cerebelumu takođe bivaju zahvaćeni, a može biti zahvaćena i siva masa u cerebrumu i moždini.

Ćelijska tela i aksoni su obično očuvani, posebno kod ranih lezija. Kasnije, aksoni mogu biti uništeni, posebno u dugim putevima, a fibrozna glioza putevima daje njihov "sklerotični" izgled. Istovremeno se mogu naći i rane i pozne lezije. Hemijske promene u sadržaju lipidnih i proteinskih sastojaka mijelina pokazane su i u samim plakovima i oko njih.

Ova bolest se odlikuje različitim tegobama i nalazima disfunkcije CNS, sa remisijama i stalno ponovnim egzacerbacijama.

Nuklearna magnetska rezonanca (MRI) je najosetljivija metoda dijagnostičke vizualizacije; ona može da pokaže brojne plakove. Lezije mogu da se vide i kontrastom pojačanim CT snimcima.

Terapijska dostignuća na polju lečenja multiple skleroze (MS) sporo su se javljala, delimično zbog nepotpunog razumevanja patogeneze samog poremećaja. Za empirijski bazirani tretman najveća prepreka napredovanju je visoko promenljivi tok MS, dugotrajna priroda najvećeg broja mera ishoda, kao i odsustvo objektivnih markera tretmana, posebno kratkoročno.

lako patogeneza MS ostaje neizvesna, prirodna istorija ove bolesti se i dalje izučava. Razvijene su objektivne mere ishoda koje se zasnivaju na snimcima nuklearnom magnetskom rezonancom (MRI) a mnogi od nedostataka kliničkih ispitivanja su sada otkriveni, što je dovelo do poboljšanja metoda ovih ispitivanja i boljeg tumačenja rezultata.

Prema tome, još jedan od ciljeva ovog pronalaska jeste metoda za lečenje MS davanjem efikasne količine mutanta hemokina, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom.

Pod "efikasnom količinom" podrazumeva se količina aktivnog sastojka koja je dovoljna da utiče na tok i ozbiljnost bolesti, što dovodi do redukcije ili remisije takve patologije. Efikasna količina će zavisiti od načina primene i stanja bolesnika.

Dodatni cilj ovog pronalaska jesu farmaceutski sastavi koji sadrže mutante hemokina iz ovog pronalaska, u prisustvu jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, za lečenje MS i/ili drugih demijelinizacionih bolesti.

Pod "farmaceutski prihvatljivim" se podrazumeva svaki nosač koji ne utiče na efikasnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu primenu, gore navedeni sastojci se mogu formulisati u jedinici doziranja za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor. Uz farmaceutski prihvatljivi nosač, sastav ovog pronalaska može da obuhvati i manje količine aditiva, kao što su stabilizatori, ekscipijenti, puferi i konzervansi.

Davanje ovakvog aktivnog sastojska može biti intravensko, intramuskularno ili supkutano. I drugi načini davanja, kojima se mogu postići željeni nivoi u krvi, takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom.

Optimalna doza aktivnog sastojka može da se odgovarajuće odabere u skladu sa načinom davanja, stanjem bolesnika i njegovim osobinama (pol, godine starosti, telesna težina, zdravlje, veličina), obimom simptoma, pratećim terapijama, učestalošću lečenja i željenim dejstvom. Podešavanja i manipulacije utvrđenih raspona doziranja su potpuno u okviru znanja stručnjaka za ovu oblast.

Uobičajena dnevna doza aktivnog sastojka može da bude oko 0,01 do 100 miligrama na kilogram telesne težine. Uobičajeno se 1 do 40 miligrama na kilogram dnevno daje u podeljenim dozama ili u oblicima sa kontrolisanim oslobađanjem i to je efikasno za postizanje željenih rezultata. Drugo ili naredno davanje se može obaviti u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja se daje individualnom pacijentu.

Ovaj pronalazak se opisuje s pozivom na specifične oblike, ali sadržaj pronalaska obuhvata sve modifikacije i supstitucije, koje može da obezbedi stručnjak za ovu oblast, a da se ne udalji od značenja i svrhe sadržanih zahteva.

Pronalazak ćemo sada opisati uz pomoć sledećih Primera, koje ne treba tumačiti nikako kao ograničavanje celokupnog pronalaska. Ovi Primeri će se odnositi na Slike koje su dole označene.

OPIS SLIKA

Slika 1: Predstavlja redosled nekih egzemplarnih CC Hemokina, poredanih na nivou 40's-petlje. Ovaj proteinski segment i katjonsko mesto koje odgovara motivu vezivanja GAG-nalaze se u kućicama.

Slika 2: Pokazuje mapu plazmida koji se koristi za kloniranje divljeg tipa RANTES i njegovih mutanata u skladu sa Primerima.

Slika 3: Pokazuje rezultate eseja kompetitivnog vezivanja [<125>I]-RANTES i mutanata heparinom u eseju heparinske perle.

Slika 4: Pokazuje eseje vezivanja na bazi ekvilibrijumske kompeticije za RANTES i trostruki RANTES mutant 40-49.

Slika 5: Pokazuje indukciju monocita i hemotaksu T ćelija uz pomoć RANTES i trostrukih RANTES mutanta 40-49 i 50-59.

Slika 6: Pokazuje inhibiciju regrutacije peritonealnih ćelija trostrukim mutantom RANTES 40-49.

Slika 7: Pokazuje inhibiciju RANTES-indukovanog regrutovanja peritonealnih ćelija razgranatim trostrukim mutantom RANTES 40-49 (3-68) proizvedenim uPichia pastoris.

Slika 8: Pokazuje inhibiciju MIP-1P -indukovanog regrutovanja peritonealnih ćelija trostrukim 40-49 mutantom MIP-ip (K45AR46AK48A).

Slika 9: Pokazuje inhibiciju MIP-1a -indukovanog regrutovanja peritonealnih ćelija trostrukim 40-49 mutantom MIP-1a (R18A-R46A-R48A1

Slika 10: Pokazuje inhibiciju tioglikolatom indukovanog regrutovanja ćelija trostrukim mutantom 40^9 RANTES.

Slika 11: Pokazuje inhibiciju početka eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa RANTES trostrukim mutantom iz ovog pronalaska.

PRIMERI

1. Materijali i metode

a) Generisanie RANTES mutanta koji ne vezuju heparin

Mutageneza RANTES postignuta je tehnikom inverzne reakcije lanca polimeraze. Tačke mutacije

su uvedene u jedan od dva prajmera koji se koriste za rehibridizaciju sekvence kodiranja humanog RANTES (GenBank acc. No. NMJD02985) u suprotnom pravcu. Da bi se poboljšala efikasnost anilirajućih prajmera (posebno kada su u prajmere uvedene multiple mutacije) DNK je alkalno denaturisana. Ova denaturisana DNK je razblažena do koncentracije od oko 10 pg/reakciji dnevno da se izbegne inkorporisanje nemutirane DNK u reakciju transformacije.

Navedene amino kiseline koje su date u Primerima i u Opisu uzimaju u obzir zreli protein, t.j. koji počinje sa Ser, u kome se ova amino kiselina nalazi na poziciji 24 u skladu sa listom sekvenci. Prema tome, imamo savršenu korespodenciju između amino kiselina navedenih u listi sekvenci i onih datih u Primerima, gde 23 treba dodati ovim brojevima koji se pojavljuju u Primerima i u Opisu.

Ovde su prikazane sekvence korišćenih mutagenih prajmera a mutagene osnove su<p>odvučene: R44A (sens)

Amplifikacija je obavljena u termičkom cikleru za DNK (Perkin-EImer-Cetus 480) za 35 ciklusa korišćenjempfuturbo®DNK polimeraze (Stratagene). DNK je ligirana i transformisana u Top 10 F' kompetentneE. colićelije (Invitrogen). Sekvenca ovih mutanta potvrđena je sekvenciranjem

DNK.

b) Ekspresija i purifikaciia divljeg tipa ( WT) RANTES i RANTES mutanta uE . coli .

Fragmenti DNK koji se dobijaju tehnikom PCR kao što je gore opisano i koji su klonirani u

plazmid pET24d (Slika 2), generisali su seriju vektora. WT ili mutirana RANTES kodirajuća sekvenca se klonira na 3' u pT7 promoter, između lokacijaXba\iNhe\ IXho\.Ovaj plazmid sadrži dva markerska gena (Km i lacl) i jednu aktivnu replikaciju porekla (Ori fl).

Dobijeni vektori su korišćeni da se retransformiše soj BL21(DE3)E. coli,koji omogućava snažnu ekspresiju proteina korišćenjem sistema pT7 / Lacl. Ekspresija proteina je indukovana dodavanjem 1 mM izopropil-p-D-tiogalaktopiranozida (IPTG) u kulturu. Ćelije su obrane (prikupljene) i ponovo suspendovane u puferu za liziranje (50 mM Tris-HCI pH 8, 10 mM MgCI2, 5 mM Benzamidin/HCI, 1 mM DTT, 0.1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), DNase 20 mg/L).

Ćelije su razbijene sa tri prolaza kroz French Pressure Cell unit. Ova suspenzija je onda centrifugirana na 10,000 x g tokom 30 min na 4°C. Talog sa inkluzionim telom sa sadržajem VVT RANTES ili jednog od mutanta RANTES rastvoren je u 0.1 M Tris/HCI, pH 8,0, sa sadržajem 6M Guanidin/HCI, i 1 mM DTT i mešan 30 min na 60 °C. Ovaj rastvor je dijaliziran sa tri promene 1 % sirćetne kiseline. Nerastvorljivi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 10,000 x g tokom 30 min. Supematant sa sadržajem WT RANTES ili jednog od mutanta RANTES je liofilizovan.

Ovaj liofilizovani prah je rastvoren u 0.1 M Tris/HCI, pH 8,0, sa sadržajem 6M Guanidin/HCI, i 1 mM DTT da bi se dobila koncentracija od oko 1 mg/ml. Ovi proteini su renaturisani razblaženjem, kap po kap, do zapremine koja je 10 x veća od rastvora guanidine od 20 mM Tris/HCI, pH 8.0 sa sadržajem 0.01 mM oksidizovanog glutationa i 0.1 mM redukovanog glutationa. Ovaj rastvor je mešan preko noći na 4 °C. Nerstvorljivi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 10,000 x g tokom 30 min. pH je podešen na 4,5 sirćetnom kiselinom, a provodljivost je podešena na 20 mS razblaženjem sa vodom. Ovaj rastvor je nanet na HiLoad S 26/10 colonu koja je prethodno ekvilibrisana u 20 mM natrijum acetata, pH 4,5, a protein je razblažen lineranim 0-2 M NaCI gradijentom u istom puferu. Frakcije sa sadržajem WT RANTES ili jednog od muntantih proteina RANTES su sjedinjene, pa dijalizirane sa tri promene sirćetne kiseline i liofilizovane.

Ovi liofilizovani proteini su rastvoreni u 50 mM Tris/HCI puferu, pH 8,0. Vodeća sekvenca MKKKVVPR dobijena postupkom kloniranja je pocepana od WT RANTES ili jednog od RANTES mutantnih proteina inkubacijom sa endoproteinazom Arg-C (1:600 enzim: supstrat, težinski) preko noći na 37°C. Pocepani proteini su odvojeni od nepocepanih hromatografijom katjonske izmene na HiLoad S 26/10 koloni koja je prethodno ekvilibrisana u 20 mM natrijum acetata, pH 4.5, sa sadržajem 6 M ureje, a proteini su razblaženi linearnim 0-2M NaCI gradijentom u istom puferu. Pocepane frakcije su objedinjene i dijalizirane sa dve promene 1 % sirćetne kiseline, i konačno sa 0,1% trifluorosirćetne kisline, a onda su liofilizovane (Edgerton MD i sar., str. 33-40, i Proudfoot AE i sar., str. 75-87, u knjizi "Hemokini Protocols" (Protokoli za hemokine), Methods in Molecular Biologv 2000, vol. 138, Humana Press).

Autentičnost VVT i RANTES mutantnih proteina potvrđena je masenom spektrometrijom. Analognom procedurom proizvedeen je još jedan mutant koji je sadržao jednu Met, kao NH2-terminalnu ekspresiju, kao i jednostruke ili trostruke RANTES mutante na 40's-petlji i jednostruke ili trostruke mutante na 50's-petlji.

c) Ekspresija i purifikaciia divljeg tipa ( VVT) RANTES i RANTES mutanta uPichia

pastoris

Zreli trostruki RANTES mutanti na 40s'-petlji (R44A-K45A-R47A) dobijeni su korišćenjem megaprajmera na bazi PCR mutageneze (Datta AK, Nucleic Acid Research 1995 , 23(21 ):4530-31). On je kloniran u ekspresioni vektorPichia pastoris,pPIC9K, u ramu sa S.cerevisiaeMat alfa pre-pro signal peptida.

Po potvrdi sekvenciranja, ovaj plazmid je prenesen uPichia pastorisdomaćina, soj GS115(/?/s4) elektroporacijom. His<+>klonovi su pregledani da se utvrdi prisustvo ekspresije RANTES mutanta. Obavljene su manje studije ekspresije korišćenjem standardnih procedura kako je opisano u Pichia Expression Kitu koji proizvodi Invitrogen (Life Technologies). Ukratko, kultura je ekspandirana u obogaćenoj podlozi gde je korišćen glicerol kao izvor ugljenika, posle čega je taložen i ponovo suspendovan u podlozi sa sadržajem metanola da bi se indukovala ekspresija RANTES mutantnog proteina. Sekrecija RANTES mutanta u ovoj podlozi otkriva se na SDS-PAGE prebojavanjem Kumazi plavim.

Klon koji sekretuje visoke nivoe RANTES mutanta (približno 500-750 mg/l) korišćenjem za dobijanje većih količina u velikim bocama za mešanje. Ova fermentirana čorba je centrifugirana na 5.000 obrtaja u minuti, a supernatant je korišćen za prečišćavanje.

Ovaj protein je prečišćen iz supernatanta samo jednim hromatografskim korakom na koloni Heparin Sefaroza, ekvilibrisanoj sa 0.1 M Tris-HCI, a zatim razblaženoj lineranim gradijentom 0-2 M NaCI u istom puferu korišćenjem zapremine 20 kolona. Autentičnost ovog proteina potvrđena je masenom spektrometrijom, i otkriveno je da se u takvim sistemima proizvodi RANTES mutant (R44A-K45A-R47A) koji je i razgranat na N-završetku u odnosu na divlji tip molekula, t.j. nedostaju mu prve dve amino kiseline. Prema tome, mutant koji je dobijen na ovaj način identifikovan je kao trostruki RANTES mutant na 40's-petlji (3-68) (R44A, K45A, R47A) a sekvenca njegovih amino kislina je kao SEQ ID NO: 3.

d) Esej za vezivanje heparina

Heparin sefarozna hromatografija je obavljana korišćenjem 50 ng WT ili mutiranih RANTES

proteina koji su punjeni u Heparin Sefaroznu kolonu ekvilibrisanu u 25 mM Tris/HCI, pH 8,0 i 50 mM NaCI a zatim razblaženi linearnim gradjentom 0-2 M NaCI u 25 mM Tris/HCI, pH 8,0. Heparin sefarozna hromatografija je obavljana korišćenjem 50 u.g WT ili mutiranih RANTES proteina koji su punjeni u kolonu za MonoS katjonsku izmenu ekvilibrisanu u 50mM natrijum acetata, pH 4.5. Protein je razblažen gradijentom 0-2 M NaCI.

Esej kompetitivnog vezivanja je obavljen korišćenjem VVT RANTES, trostrukih mutanta RANTES na 50's-petlji, i trostrukih mutanta RANTES na 40's-petlji (SEQ ID NO: 2 - koji se identifikuju i kao "R44A-K45A-R47ARANTES") koji su radioaktivno obeleženi jodom (<125>l ) koji proizvodi Amersham do specfične aktivnosti od 2200 mCi/mole. Filterske ploče sa 96 udubljenja MgCI2, 0,15 M NaCI i 0,5% BSA). Serijska razblaženje heparina u puferu za vezivanje obavljena su da se pokrije raspon koncentracija od 20 mg/ml do 1 u,g/ml. Ovaj esej je obavljen u ukupnoj zapremini od 100 uJ dodavanjem 25 uJ razblaženja heparina, 25 jal 0,4 nM [<125>l]-hemokina, 25 |al heparinskih peril (0.2 ug/ml u vodi) i 25 uJ pufera za vezivanje u svako udubljenje. Ovi eseji su rađeni u triplikatu. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi sa agitacijom tokom 4 sata. Filterske ploče su ispirane tri puta sa 200 jal puferom za ispiranje korišćenjem vakuumske pumpe da se uklone nevezani-obeleženi hemokini. Zatim je dodato 50] x\scintilanta u svako udubljenje, pa je brojana radioaktivnost (1 min/udubljenju). Podaci su analizirani kroišćenjem programa GraFit Softvvare.

e) Eseji vezivanja za receptore sa na bazi ekvilibriiumske kompeticije

Ovi eseji su obavljani na membranama od CHO transfektanata koji eksprimiraju CCR1 ili CCR5

korišćenjem eseja scintilacijske blizine (SPA) korišćenjem [<125>l]-MIP-1a kao trejsera. Kompetitori su pripremani serijskim razblaženjima neobeleženih hemokina u puferu za vezivanje da se pokrije raspon od lO^-IO"<12>M. Korišćen je sledeći puffer za vezivanje: 50 mM HEPES, pH 7,2 sa sadržajem 1 mM CaCI2, 5 mM MgCI2, 0,15 M NaCI i 0,5% BSA. SPA Perle žitnih klica (Amersham) su razblažene u PBS do 50 mg/ml, i razblažene u puferu za vezivanje do 10 mg/ml, pa je finalna koncentracija u eseju bila 0,25 mg/udubljenju. Membrane pripremljene od CHO ćelija sa ekspresijom CCR1 ili CCR5 čuvane su na -80°C i razblažene u puferu za vezivanje na 80ng/ml. Jednake zapremine količina membrane i perli su mešane pre obavljanja ovog eseja da se smanji pozadina. Konačna koncentracija membrane iznosila je 2 u.g/ml dok je [<125>l]-MIP-1a bila 0.1 nM. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi sa agitacijom tokom 4 sata. Radioaktivnost je merena, a podaci su analizirani kako je opisano za esej vbezivanja heparina.

f) Esej hemotakse

Hemotaksa monocita je obavljana korišćenjem eseja u micro-Boyden komori. Monociti su

purifikovani iz «kolačića» (leukocitne frakcije) korišćenjem sledeće procedure izolacije: 100 ml rastvora «kolačića» razblaženo je sa 100 ml PBS, naneto na Ficoll i centrifugirano na 600 x g tokom 20 min na sobnoj temperaturi. Prikupljene su ćelije koja prave interfejs, isprane su dva puta sa PBS, i ponovo suspendovane u koncentraciji od 40-100 x 10<6>/ml u RPMI 1640 podlozi sa sadržaejm 5% inaktiviranog seruma fetusa krave (FCS), 2 mM glutamina i 25 mM HEPES, pH 7.2. Dalje su prečišćene iz limfocitne frakcije dodavanjem 10<6>erritrocita ovce/ml, formiraju rozete preko noći na 4° C, a onda su separirane drugim centrifugiranjem Ficoll gradijentom na 900 x g tokom 20 min na sobnoj temperaturi.

Utvrđeno je da monociti postoje na interfejsu između Ficoll i pufera, a T ćelije su bile u talogu (peletu). Monociti su isprani sa PBS i ponovo suspendovani na 2.5 x 10<6>/ml u RPM11640 podlozi. Čistoća je merena rasipanjem unapred i bočno, FACS analizom i utvrđeno je da iznosi 40-80% zavisno od donatora. Hemokini su razblaženi do finalne zapremine od 30 jal, pokrivajući raspon koncentracija od 10"<6->10"<12>M u RPMI podlozi koja je stavljena na donja udubljenja. Filter veličine pore 5 jam (Neuroprobe) za monocite i 8 jam za T ćelije stavljen je na donja udubljenja da se obezbedi da nema mehurića vazduha, pa je sistem zatvoren. Pedeset mikrolitara ćelijske suspenzije (2,5 x 10<6>ćelija/ml) u RPMI podlozi stavljeno je u gornja udubljenja. Komora je inkubirana 30 minuta za monocite i 1,5 sati za T ćelije na 37 °C pod 02. Ćelije su onda odbačene, gornja površina membrane je očišćena od ćelija, a membrana je oprana PBS-om. Membrana je fiksirana uranjanjem u MeOH u trajanju od 1 minuta, osušena vazduhom i prebojena rastvorima za Polje A i B. Migrirane ćelije su brojane odabirom nasumičnih za svako udubljenje sa objektivom 20x standardnim mikroskopom na koji se prikopčava IBAS softver za analizu slike. Podaci su obrađeni korišćenjem GraFit softvera.

g) Esej za regrutovanje peritonealnih ćelija

U prvom eseju, regrutovanje ćelija indukovano je intraperitonealnom injekcijom 10 jag hemokina

razblaženih u 0.2-ml sterilnog fiziološkog rastvora (NaCI bez LPS) u ženke miševa BALB/c starosti 8 do 12 nedelja. Mutanti hemokina (10 jag hemokina razblaženih u 0,2 ml sterilnog fiziološkog rastvora) dati su 30 min pre davanja agonista. Šesnaest sati kasnije, miševi su žrtvovani aerosolom C02. Peritonealna lavaža je obavljena sa tri ispitanja sa po 5 ml PBS, pa su ispirci spojeni. Ćelije su centrifugirane na 600 xgtokom 10 min, ponovo suspendovane u finalnoj zapremini od 1 ml, pa je ukupni broj dobijenih leukocita brojan na hemacitometru.

U drugom eseju, regrutacija ćelija indukovana je intraperitonealnom injekcijom 200 ul 3% rastvora tioglikolata u destilovanoj vodi u ženke miša BALB/c stare 8 do 12 Nedelja (Dan 1). Mutant hemokina (10 jag hemokina razblaženo u 0.2 ml sterilnog fiziološkog rastvora) dat je 30 min pre davanja tioglikolata. Mutant hemokina je davan svakodnevno tokom 3 dana (Dani 2, 3 i 4). Miševi su žrtvovani petog dana aerosolom C02. Peritonealna lavaža mje obavljena sa 3 ispiranja sa po 5 ml PBS, pa su ispirci spojeni. Ćelije su centrifugirane na 600 x g tokom 10 min, ponovo suspendovane u finalnoj zapremini od 1 ml, pa je ukupni broj dobijenih leukocita brojan na hemacitometru.

h) Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis ( EAE)

Postupak imunizacije

Ženke miša C57 BL/6NCrlBR starosti 8 nedelja i težine 18-22 grama imunizovane su (dan=0) supkutanom injekcijom u zadnji deo vrata 0,1 ml emulzije sa sadržajem 200 (ag MOG35.55 peptida (Neosvstem, Strasbourg, France) u potpunom Freundovom adjuvantu (CFA saMycobacterium butyricum,Difco, Detroit, U.S.A.) sa sadržajem 0.25 mgMycobacterium tuberculosis.Pre ove supkutane injekcije, primili su po jednu 200 ul i.v. injekciju 300 ng pertussis toksina (List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A.) razblaženog u PBS u repnu venu. Drugog dana, životinjama je data druga supkutana injekcijoa 300 ng pertussis toksina.

Rezultati ove procedure, koja počinje otprilike između dana 8 i 10 jesu u pojavi progresivne paralize, koja nastaje od repa i progresivno ide naviše do prednjih udova.

Dizajn studije

U ovu studiju uključeno je 10 životinja po grupi. Sve grupe su imunizovane MOG35.55peptidom u CFA i pertussis toksinom, u skladu sa protokolom imunizacije.

Grupa 1: pozitivna kontrolna Grupa koja je dobila samo nosač (PBS) i.p. putem.

Grupa 2: pozitivna kontrolna Grupa koja je dobila samo nosač (PBS) s.c. putem.

Grupa 3: primila je 10 jag/mišu i.p. trostrukog RANTES mutanta na 40's-petlji.

Grupa 4: primila je 1 ug/ mišu i.p. trostrukog RANTES mutanta na 40's-petlji.

Grupa 5: primila je 10u,g/mišu i.p. trostrukog Met-RANTES mutanta na 40's-petlji

Grupa 6: primila je 1 u,g/ mišu i.p. trostrukog Met-RANTES mutanta na 40's-petlji.

Grupa 7 : primila je 10,000 U/ mišu s.c. mišjeg rekombinantnog interferona beta

( m-IFN-p)

Grupa 8 : dobila je 20,000 U/mišu s.c. m-IFN-p

Nosač

PBS je iskorišćen za razblaženje RANTES svih trostrukih mutanta na 40's-petlji , Met-RANTES svih trostrukih mutanta na 40's-petlji i mIFN-p u odgovarajućoj koncentraciji.

Način davanja

RANTES trostruki mutanti na 40's-petlji, Met-RANTES trostruki mutanti na petlji i m-IFN-p davani su svakodnevno i.p. načinom u zapremini davanja od 200 ul/mišu. Grupe 1, 2 su dozirane i.p. sa 200 jal/mišu PBS.

Traianie tretmana

Tretman je započinjao za svaku životinju eksperimentalnog dana 4 (oko 3-5 dana pre uobičajene pojave bolesti), a zatim je nastavljeno 14 uzastopnih dana (žrtvovanje eksperimentalnog dana 18).

Klinička opažanja

Od dana 5 životinje su individualno pregledane gde su traženi znaci paralize i mereni kliničkim skorom na sledeći način:

0 = nema znakova bolesti

0.5 = delimična paraliza repa

1 = paraliza repa

1.5 = paraliza repa + delimična unilateralna paraliza zadnjih udova

2 = paraliza repa + slabost zadnjih udova ili delimična paraliza zadnjih udova 2.5 = paraliza repa + delimična paraliza zadnjih udova (sniženi pelvi)

3 = paraliza repa + potpuna paraliza zadnjih udova

3.5 = paraliza repa + potpuna paraliza zadnjih udova

• inkontinencija

4 = paraliza repa + paraliza zadnjih udova + slabost ili delimična paraliza zadnjih udova

5 = moribund ili umrla.

2. REZULTATI

a) Esej vezivanja heparina

Prečišćeni RANTES proteini mutirani na jednom ili tri položaja analizovani su heparinskom

hromatografijom, a potrebna koncentracija NaCI za razblaživanje upoređena je sa elucionim

profilom VVT RANTES. Budući da je interakcija s heparinom elektrostatska, mutanti su podvrgnuti hromatografiji katjonske izmene na koloni MonoS. Ovo dovodi do pada koncentracjie NaCI koja je potrebna da se razblaže jer je mutageneza uklonila osnovni rezduum. Razlika koncentracija NaCI dobijenih hromatografijom odbija se od one koja se dobija heparinskom hromatografijom. Ako je ova vrednost pozitivna, identifikuje se specifična interakcija s heparinom. (Tabela 1)

Direktno merenje vezivanja za heparin obavljeno je sa trostrukim RANTES mutantima na petljama 40's i 50's u eseju kompetitivnog vezivanja. VVT RANTES mutanti su jodirani Ameršamom i imali su istu specifičnu radioaktivnost u iznosu od 2.200 mCi/mol. Međutim, samo oko 20% trostrukog mutanta na 40's-petlji vezalo se za heparinske perle, s maksimalnim brojem cpm od 4.000 u poređenju sa 22.000 cpm za VVT RANTES i mutant na 50's-petlji (Slika 3). Ovo pokazuje da ti reziduumi na 40's-petlji, koji su mutirani, doprinose većem delu kapaciteta RANTES da se vezuje za heparin. S druge strane, ovo pokazuje da putativni motiv vezivanja za GAGna 50's-petlji nije "pravo" GAG- mesto vezivanja.

b) Eseji vezivanja za receptore sa na bazi ekvilibrijumske kompeticije

Sposobnost trostrukih RANTES mutanta na petljama 40's i 50's da uđu u kompeticiju za [<125>l]

MIP-1a za vezivanje za rekombinantni CCR1 i CCR5 u membranama pripremljenim iz CHO stabilnih transfektanata. Nije bilo signifikantne razlike ni u jednoj od pojedinačnih mutacija na oba receptora (rezultati nisu prikazani). Nijedan od trostrukih mutanata nije pokazao razliku u vezivanju za CCR5 u poređenju sa VVT RANTES proteinom. Međutim, na CCR1, trostruki mutant na 40's-petlji pokazao je 100-struko smanjenje afiniteta, dok je trostruki mutant na 50's-petlji pokazao samo manji (trostruki) gubitak afiniteta (Slika 4).

c) Esej hemotakse

Trostruki mutanti na petljama 40's i 50's uspevali su da indukuju hemotaksu monocita aktivnošću

sličnom kao VVT RANTES, s izuzetkom trostrukog mutanta na 40's-petlji koji je mogao da indukuje signifikantnu hemotaksu na 1 \ xM. Međutim trostruki mutanti na petljama 40's i 50's imali su jednaku snagu i sposobnost da indukuju hemotaksu T ćelija (Slika 5). Rezultati dobijeni sa esejem hemotakse monocita dobro odgovaraju onima dobijenim u esejima za vezivanje za receptore.

Rezultati dobijeni u eseju za hemotaksu monocita odgovaraju onima koji su dobijeni u esejima za vezivanje za receptore. Gubitak aktivnosti trostrukog RANTES mutanta na 40's-petlji na hemotaksu monocita odgovara gubitku afiniteta za CCR1.

d) Esej regrutovanja peritonealnih ćelija

Trostruki RANTES mutant na 40's-petlji nije mogao da indukuje regrutovanje ćelija u peritoneum

u dozi (10 (ag/mišu) pri kojoj RANTES uzrokuje značajnu regrutaciju (Slika 6).

Štaviše, ako se 10 \ xg mutanta daje 30 minuta pre davanja RANTES, inhibira se ćelijska regrutacija koju indukuje RANTES. Prema tome, GAG-vezivanje je proizvelo jedan inhibitor regrutacije ćelija izazvane hemokinom invivo.

Analogni rezultati su prikazani na Slici 7 sa razgranatim RANTES (3-68) trostrukim mutantom na 40's-petlji (proizvedenim uPichia pastoris),na Slici 8 pomoću MIP-ip trostrukog mutanta na 40's-petlji (K45A-R46A-K48A) i na Slici 9 pomoću MIP-1 trostrukog mutanta na 40's-petlji (R18A-R46A-R48A). Regrutovanje ćelija stimulisano tioglikolatom bilo je inhibirano i RANTES (3-68) trostrukim mutantom na 40's-petlji kao što je prikazano na Slici 10.

e) Eksperimentalni Autoimuni Encefalomijelitis ( EAE)

RANTES trostruki mutant na 40's-petlji pokazao je dozno zavisno dejstvo na mišjem modelu

EAE. Ovaj protein u koncentracijama od 1\ xgi 10 jag/mišu koji je davan svakodnevno i.p počevši od dana 10 posle primame imunizcije sa MOG, pokazao je uporedivu efikasnost sa referentnim tretmanom, rekombinantim m-IFN-p (Slika 11). Početak bolesti je signifikantno usporen, a težina bolesti (procenjeno površinom ispod krive) takođe je značajno smanjena. Štaviše, srednja vrednost maksimalnog kliničkog skora koja se dostiže tokom ovog eksperimenta takođe je smanjena. Drugi mutant (Met-RANTES trostruki mutant na 40's-petlji ) nije pokazao nikakvo korisno dejstvo u istom eksperimentu..

Naši rezultati pokazuju jasno korisno dejstvo tretmanom RANTES trostrukim mutantom na 40's-petlji, čime se smanjuju klinički znaci hroničnog EAE kod miša po imunizaciji sa MOG. Prema tome, RANTES trostruki mutant na 40's-petlji ima blagotvorno terapijsko dejstvo i može da se koristi za lečenje hroničnih demijelinizirajućih bolesti, kao što je MS.

Sledeća Tabela 2 će razjasniti identitet sekvenci zabeleženih u listi sekvenci i u ćelom tekstu reported in the Sequence Listing and throughout the text.

Claims (14)

1. Upotreba CC hemokinskog mutanta, koji sadrži najmanje dve mutacije u katjonskom mestu 40's-petlje,i koji, u odnosu na molekul divljeg tipa, ima smanjenu aktivnost vezivanja za GAG, za pripremu farmaceutskog preparata za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelinizirajućih bolesti, naznačen time da je CC hemokin odabran iz RANTES, MIP-1alfa, MIP-1 beta, MIP-3, MIP-4, HCC1,1309, 135612 i MCP-2.

2. Upotreba iz zahteva 1 , u kojoj je hemokinski mutant RANTES mutant.

3. Upotreba iz zahteva 2, naznačena time da je hemokinski mutant RANTES trostruki mutant u kome su tri osnovne amino kiseline u katjonskom mestu 40's-petlje zamenjene drugim amino kiselinama.

4. Upotreba iz zahteva 3, naznačena time da su amino kiseline u katjonskom mestu 40's-petlje zamenjene Alaninom, Serinom, Treoninom, Prolinom ili Glicinom.

5. Upotreba iz zahteva 1, naznačena time da su mutant hemokina razgranati i mutirani RANTES iz SEQ ID NO. 3.

6. Upotreba iz zahteva 1, naznačena time da je mutant hemokina RANTES mutant SEQ ID NO: 2.

7. Upotreba iz zahteva 1, naznačena time da je mutant hemokina MIP-1-alfa mutant SEQ ID NO: 4.

8. Upotreba iz zahteva 1, naznačena time da je mutant hemokina MIP-1-beta mutant SEQ ID NO. 5.

9. Farmaceutska kompozicija za lečenje multiple skleroze i/ili drugih demijelinizirajućih bolesti koji obuhvata kao aktivni sastojak mutant hemokina kako je definisan u zahtevima od 1 do 8 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom.

10. Skraćeni i mutirani humani RANTES koji ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO.2.

11. DNK molekul koji obuhvata sekvence DNK koje kodiraju za skraćeni i mutirani RANTES iz zahteva 10.

12. Ekspresioni vektor koji obuhvata DNK molekul iz zahteva 10.

13. Ćelija domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor iz zahteva 12.

14. Proces rekombinacije za pripremu polipeptida iz zahteva 1, kojio obuhvata gajenje u odgovarajućoj podlozi za kulturu ćelije iz zahteva 13.