UA77950C2 - Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis - Google Patents
Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis Download PDFInfo
- Publication number
- UA77950C2 UA77950C2 UA2003044038A UA2003044038A UA77950C2 UA 77950 C2 UA77950 C2 UA 77950C2 UA 2003044038 A UA2003044038 A UA 2003044038A UA 2003044038 A UA2003044038 A UA 2003044038A UA 77950 C2 UA77950 C2 UA 77950C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mutant
- chemokine
- amino acids
- mir
- kamte5
- Prior art date
Links
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 claims description 2
- 108091084679 miR-3 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 108091033354 miR-3-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 108091058771 miR-3-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 108091047102 miR-4 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 108091049748 miR-4-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 108091058497 miR-4-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 16
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108091028606 miR-1 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 3
- 101100061516 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) csk1 gene Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- -1 1309 Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101000920778 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150094382 NSS gene Proteins 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 101800001775 Nuclear inclusion protein A Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009809 T cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000007396 fibrous gliosis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091052785 miR-1b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002975 pon Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000007715 potassium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до мутантів СС-хемокінів, які включають, щонайменше, дві мутації в петлі 40-их 2 положень амінокислот і які в порівнянні з молекулою дикого типу володіють зниженою сСАс-зв'язуючою активністю: було встановлено, що такі мутантні хемокіни ефективні при лікуванні розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань.
Хемокіни складають сімейство невеликих цитокінів прозапалення з хемотаксичними і активуючими для лейкоцитів властивостями. У залежності від положення перших консервативних цистеїнів сімейство хемокінів 70 поділяється на С-, С-Х-С- і 0-Х 35-С-хемокіни І|Ваддіоїїпі М. еї аїЇ., Адм. Іттипої. 1994, 55:97-179; Ваоддіоїїпі
М. ега|., Аппи. Кем. Іттипо)ї. 1997, 15:675-705; Таць 0. еї аіІ., СуюКкіпе Сгоумй Расіог Кем. 1996, 7 (4): 355-761).
Багато які С-Х-С-хемокіни такі, як інтерлейкін-8 (1-8), є хемотаксичними для нейрофілів, в той час як
СС-хемокіни активні відносно різних лейкоцитів, включаючи моноцити, лімфоцити, еозинофіли, базофіли,
МК-клітини (природні кілери) і дендритні клітини. 12 МН»-кінцевий домен хемокінів бере участь в зв'язуванні з рецептором, і МН о-кінцевий процесінг може або активувати хемокіни, або перетворювати хемокіни в повністю неактивні.
М-кінцеві варіанти синтетичних С-С-хемокінів тестували на їх активність в якості інгібіторів або антагоністів природних, форм. МОСР-1, МСР-З і КАМТЕЗ, що втратили 8-9 НМе»е-кінцевих амінокислот, є неактивними на моноцитах і придатні як антагоністи рецепторів (Сопд .).Н. еї аї., У. Ехр. Мед. 1995, 181 (2): в31-40ї бопа .Н. еї а1., 9. Віої. Снет., 1996, 271 (18): 10521-7).
Збільшення КАМТЕЗ на один метіонін приводить до майже повної інактивації молекули, і Ме-КАМТЕ5 поводиться, як антагоніст у відношенні аутентичного КАМТЕЗ |Ргоцтоої А.Е. еї аї., У. Віої. Спет, 1996, Рерб. 2; 271 (5): 2599-6031).
МО 99/16877 відноситься до усіченого з аміно-кінця КАМТЕ5, у якого відсутні МН »-кінцеві амінокислоти, с 29 відповідні амінокислотним залишкам 1, 1-2, 1-3 або 1-4 природного КАМТЕ5, і що володіє Ге) хемокін-антагоністичною активністю, а також до послідовностей ДНК, що кодують їх, їх застосуванню для терапії і/або діагностики захворювань, при яких необхідна антагоністична активність для дії хемокінів. КАМТЕЗ (3-68) являє собою переважний усічений антагоніст хемокінів.
Незважаючи на те, що в цілому хемоатрактантна активність КАМТЕЗ і СС-хемокінів вивчалася в основному в о зв'язку зі специфічними мембранними рецепторами клітин, КАМТЕБ може також взаємодіяти з ю глікозаміногліканами (САС), що широко розрізнюються, розгалуженими групами цукрів, що додаються до деяких білків після трансляції, які звичайно називаються протеогліканами (РО). Такі білки знаходяться на клітинних о мембранах, у позаклітинному матриксі і кровотоці, де можуть також бути присутніми вільні САС. ча
Взаємодія з САС є властивістю, притаманною багатьом розчинним молекулам, що передають сигнал клітині 3о (інтерлейкінам, факторам росту). РО або вільні ЗАС можуть утворити комплекс з розчинними молекулами, в можливо з метою захистити дану молекулу від протеолізу у позаклітинному середовищі. Було висловлене також припущення, що ЗАС можуть допомоги в правильній презентації молекул, що передають сигнал клітині, їх специфічному рецептору і, в певних випадках, також модулювати активацію клітин-мішеней. «
У випадку хемокінів, концентрування в постійних градієнтах в місці запалення і, отже, взаємодія з 50 рецепторами клітин і їх активація, ймовірно, модулюється різними формами БАС |ІНоодемжегп А). еї аї., З с Віоспетівігу 1997, 36 (44):13570-8Ї. Отже, було висловлене припущення, що модуляція таких взаємодій може
І» представляти терапевтичний підхід при запальних захворюваннях |Зспу/аг2 М.К. апа УМеїІз Т.М., Сигт. Оріп. Спет.
Віо!., 1999 3(4):407-17| і ВІЛ-інфекції (Вигпз .М. еї а!., Ргос. Май. Асад. сі. ОА, 1999, 96 (25): 14499-504).
Структурні вимоги і функціональні ефекти взаємодії ЗОЗАС-КАМТЕЗ вивчали на різних моделях. КАМТЕ5 зв'язується з СОДО на людських ендотеліальних клітинах пупкової вени (НОМЕСз) в мікромолярних концентраціях з і афінністю і специфічністю вище, ніж інші хемокіни, такі, як МСОСР-1, І/-8 або МІР-1 альфа. Мабуть, така -І взаємодія є не просто електростатичною, але також залежить від інших параметрів, таких, як довжина і М- і
О-сульфатування САС |Кивзспегпі 0.5. еї а!., Віоспетівігу, 1999 38(39): 12959-68). Клітинні лінії з дефіцитом о САС також можуть зв'язуватися з хемокінами, але присутність поверхневих САС на клітині значно посилює їх сл 20 активність по відношенню до рецепторів, коли вони знаходяться в низьких концентраціях (АН 5. еї аї., 9. Віо!.
Спет., 2000, 275 (16): 11721-7). В інших дослідах було показано, що САС, зокрема, гепаринсульфат, сприяють с взаємодії КАМТЕЗ з клітинною поверхнею макрофагів і подальшому придушенню ВІЛ-інфекції, результат, що кореспондується з добре відомою резистентністю цих клітин зі слабою експресією гепаринсульфату, до противірусної дії КАМТЕЗ (Огамесая Т. еї аї., 9. Іттипої., 1997, 159(9):4587-921. 29 Розчинні САС конкурують з клітинними мембранними САС і можуть діяти як специфічні інгібітори індукованої
ГФ) КАМТЕ5 активації поверхні (Аррау М. еї аї., Іййї Іттипої., 2000, 12(8): 1173-82| або в якості супресору
ВІЛ-інфекції (Вигпз .М. еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 1999, 96 (25): 14499-504). о У деяких дослідах по вивченню залежності структури-функції була зроблена спроба ідентифікувати домен
КАМТЕ5, відповідальний за взаємодію з САС, оскільки традиційна консенсусна послідовність (ВВХВ, де В 60 представляє основний залишок, і Х може бути будь-яким залишком) є дуже загальною. Провели картирування епітопу з використанням моноклонального антитіла, отриманого проти рекомбінантного людського КАМТЕ5, здатного блокувати як противірусну дію, так мобілізацію позаклітинного кальцію, що опосередковуються КАМТЕ5
ІВигпов У.М. еї аї., У. Ехр. Меа., 1998, 188 (10): 1917-27). Даний підхід дозволив визначити залишки 55-66, як необхідні як для вияву подібної активності, так і для взаємодії з ЗАС, доводячи, що взаємодія з САС може мати бо додаткову або відмінну функцію від такої, що опосередковується відповідними рецепторами, як було також передбачено при дослідженні варіантів КАМТЕ5, що володіють зміненими агрегаційними властивостями (Аррау У. ега!., 9. Віої. Спет., 1999, 274 (39): 27505-121.
Область 55-66, яка представляє 3-кінцевий альфа-спіральний сегмент, є гомологічною до ЗАс-зв'язуючого домену інших хемокінів таких, як //-8 ГММЩ О.Р. апа Іапаег А.О., Си. Віоі., 1994, 4 (5): 394-400), і містить катіонний сайт, що містить лізин і аргінін (ККУУМК). Така зв'язуюча область відрізняється від зв'язуючого сайту для клітинних рецепторів, що знаходиться в М-кінці (РаКіапаїйнап О.К. еї аї., Віоспетівігу, 1997, 36 (32): 9642-81 і включає деякі залишки, що беруть участь в агрегації мономерів КАМТЕ5З, навіть незважаючи на те, що дезагрегуючі мутації, мабуть, не 7/0 Впливають на взаємодію з САС |Сгаріемузкі І... еї а!., 9. ВіоЇ. Снет., 1999, 274 (23): 16077-84; МО 98/13495).
КАМТЕ5З включає інший катіонний сайт (ККМК) в положеннях залишків 44-47, який зберігається в
САс-зв'язуючому сайті інших хемокінів, таких, як МІР-ІА (Коортапп МУ. апа Кгапде! М.5., 9. Вісі. Спет., 1997, 212(15): 10103-9) ії МІР-Ір (Коортапп МУ. еї аї., 9. Ігатипої, 1999, 163 (4): 2120-7).
Варіанти людського КАМТЕ5, що містять одиничні мутації в даних катіонних сайтах, розкриті як антагоністи 7/5 РАМТЕЗБ, що володіють потенційними терапевтичними застосуваннями при лікуванні ВІЛ-інфекції і запальних або алергічних захворювань (МО 99/33989).
Було також розкрито, що тільки потрійний мутант КАМТЕ5, в якому три залишки в положеннях 44, 45 і 47 заміщені аланіном, втратив здатність зв'язуватися з САС А. Ргоцаїоої еї аіЇ., СпетокКіпе Согдоп Сопіегепсе,
Зезвіоп І, Ошу 24, 2000, персональне повідомлення).
У цей час встановлено, що СС-хемокіни, що містять, щонайменше дві мутації в катіонному сайті так званої петлі 40-их положень амінокислот, є ефективними при лікуванні розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань. Даний сайт представляє консервативний САсС-зв'язуючий мотив в СС-хемокінах (таких, як КАМТЕ5,
МІР-1 альфа і МІР-1 бета, МІР-3, МІР-4, НСС, 1309, МСР-2). Всі ці мутанти хемокінів володіють зниженою здатністю зв'язуватися з САС в порівнянні з відповідними молекулами дикого типу. Га
Область, в якій повинні бути присутніми, щонайменше, дві мутації згідно з даним винаходом, так звана петля 40-их положень амінокислот, вказана для ряду СС-хемокінів на фігурі 1. Зокрема, було встановлено, що і9) потрійний мутант КАМТЕЗ5, в якому три основних залишки в положеннях 44, 45 і 47 заміщені аланіном, активні на моделях тварин для лікування розсіяного склерозу. Було показано, що даний потрійний мутант КАМТЕ5 має дозозалежний ефект на мишачій моделі ЕАЕ і порівнянну ефективність зі стандартним лікуванням ав! рекомбінантним ІЕМ-бета. Аналогічні результати були отримані з усіченим потрійним мутантом КАМТЕЗ, в якому три залишки в положеннях 44, 45 і 47 заміщені аланіном і в яких відсутні 2М-кінцеві амінокислоти. Даний о усічений мутант КАМТЕ5 (що володіє амінокислотною послідовністю ЗЕС ІО Мо: 3) є новим і представляєіїнший Ф) об'єкт даного винаходу.
Аналогічні експериментальні докази були також отримані відносно потрійних мутантів МІР-1 альфа і МІР-1 - бета, які вже відомі і які тут названі, як потрійний мутант МІР-Іа, К18А-К46А-КІА8А |(Коортапп МУ. апа Кгаподе! -
М.5., У. Віої. Спет., 1997, 272 (153: 10103-9| і потрійний мутант по 40-му положенні амінокислот МІР-1В
КАБА-К4АбА-КАВА ЦІ ашгепсе .5., Віоспетізвігу, 2001, 40:4990-4999).
Вираз "знижена САс-зв'язуюча активність" означає, що мутанти згідно з даним винаходом володіють низькою здатністю зв'язуватися з (ЗАС, тобто низький процент кожного з даних мутантів зв'язується з (ЗАС (такими, як « гепаринсульфат) в порівнянні з відповідною молекулою дикого типу. ше с Більш переважними є мутанти людського КАМТЕЗ5, в якому три основні амінокислоти в положеннях 44, 45 і 47 молекули дикого типу заміщені іншими амінокислотами. Такі залишки можуть бути заміщені невеликими )» аліфатичними неполярними або злегка полярними залишками, такими, як Аа, Зег, Тиг, Рго і Су. Аланін є переважним.
Було встановлено, що мутантами КАМТЕЗ, особливо ефективними при лікуванні М5, є такі, що мають -І амінокислотні послідовності, представлені відповідно ЗЕО ІЮО Мо: 2 і ЗЕО ІЮО Мо: 3.
Іншим об'єктом даного винаходу є застосування мутантів хемокінів, визначених вище, для отримання 7 фармацевтичної композиції для лікування розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань. (Се) Розсіяний склероз (М5) представляє повільно прогресуюче захворювання ЦНС, що характеризується розсіяними бляшками демієлінізації в головному мозку і спинному мозку, що приводить до множинних і різних і-й неврологічних симптомів і ознак, звичайно з ремісіями і загостренням (дивись Мегск Мапиаї, 16-е видання). о Причина захворювання невідома, але в якості такої передбачається імунологічне порушення, при наявності в цей час деякої інформації, що вказує на специфічний механізм. Причини, що висловлюються включають зараження вірусом, що повільно розвивається або латентним вірусом і мієліноліз під дією ферментів. Рівень ІД
Звичайно підвищений в СМЖ, і збільшені титри зв'язували з різними вірусами, включаючи кір. Значення даних фактів і повідомлень про взаємозв'язок з НІ А-алотипами і зміненою кількістю Т-клітин неясно, оскільки докази о є до деякої міри суперечливими. Підвищена частота захворювання в сім'ях передбачає наявність генетичної ко схильності: жінки частіше захворюють, ніж чоловіки. Мабуть, є чинники навколишнього середовища. Незважаючи на те, що початок захворювання звичайно доводиться на вік між 20-40 роками, М5 пов'язаний з географічною бо областю, де пацієнт проводить перші 15 років життя. Переміщення після 15-літнього віку не змінює ризик виникнення захворювання.
Бляшки або острівці демієлінізації з руйнуванням олігодендроглії і навколосудинним запаленням розсіяні по
ЦНС, в основному в білій речовині з нахилом до латеральних і задніх стовпів (особливо в шийній і дорсальній областях), зорових нервах і перивентрикулярних областях. Уражаються також шляхи в середньому мозку, мості і 65 мозочку, може бути також уражена сіра речовина, як в мозочку, так і спинному мозку.
Звичайно зберігаються тіла клітин і аксони, особливо на ранніх стадіях поразки. Пізніше, аксони можуть руйнуватися, особливо на довгих шляхах, і фіброзний гліоз надає шляхам їх "склеротичний" вигляд. Одночасно можна виявити дільниці поразки на ранніх і пізніх стадіях. Були показані хімічні зміни в ліпідних і білкових складових мієліну в бляшках і навколо них.
Захворювання характеризується різними скаргами і ознаками дисфункції ЦНС з ремісіями і постійно виникаючими загостреннями.
Ядерно-магнітний резонанс (МКУ) є найбільш чутливим методом діагностики; він може показати багато бляшок. Дільниці поразки також можуть бути видимими при контрастній комп'ютерній томографії.
Досягнення в лікуванні розсіяного склерозу (Мб) з'являються повільно, частково внаслідок неповного 7/0 розуміння патогенезу захворювання. Для емпіричного лікування основні перешкоди для розвитку включають в сильній мірі різну течію М5, тривалу природу найбільш важливих результативних заходів і відсутність об'єктивних маркерів ефекту лікування, особливо в короткий термін.
Незважаючи на те, що патогенез М5 залишається невизначеним, природна історія продовжує вивчатися. Були розроблені об'єктивні результативні заходи, засновані на даних ядерно-магнітного резонансу, і в цей час 7/5 Відомі багато які помилки при клінічних випробуваннях, які привели до поліпшених методів випробувань і кращої інтерпретації результатів.
Іншим об'єктом даного винаходу є, отже, спосіб лікування М5 введенням ефективної кількості мутантів хемокінів згідно з даним винаходом разом з фармацевтично прийнятним наповнювачем. "Ефективна кількість" відноситься до кількості активних інгредієнтів, яка достатня для впливу на течію і 2о тяжкість захворювання, що приводить до зменшення або ремісії такої патології. Ефективна кількість буде залежати від шляху введення і стану пацієнта.
Додатковим об'єктом даного винаходу є фармацевтичні композиції, що включають мутанти хемокінів згідно з даним винаходом, в присутності одного або більше фармацевтично прийнятних наповнювачів, для лікування М5 і/або інших демієлінізуючих захворювань. сч "Фармацевтично прийнятний" означає включення будь-якого носія, який не знижує ефективність біологічної активності активного інгредієнта і який не є токсичним для хазяїна, якому його вводять. Наприклад, для іо) парентерального введення вищезгадані активні інгредієнти можна включити в разову лікарську форму для ін'єкцій в розчинниках таких, як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін і розчин Рінгера.
Крім фармацевтично прийнятного носія, композиції згідно з даним винаходом можуть також включати невеликі о зо кількості добавок, таких, як стабілізатори, наповнювачі, буфери і консерванти.
Введення такого активного інгредієнта може бути внутрішньовенним, внутрішньом'язовим або підшкірним о шляхом. У даний винахід входять інші шляхи введення, при яких можуть бути отримані бажані концентрації Ге! відповідних інгредієнтів в крові.
Оптимальна доза активного інгредієнта може бути відповідно вибрана, виходячи з шляху введення, стану і - зв характеристик пацієнта (статі, віку, маси тіла, стану здоров'я, маси), ступеня вираженості симптомів, іншого ї- одночасного лікування, частоти лікування і бажаного ефекту. Коректування і маніпуляції з встановленими дозами знаходяться в компетенції фахівців в даній області.
Звичайно добова доза активного інгредієнта може складати приблизно від 0,01 до 100мг на кг маси тіла.
Звичайно 1-4Омг на кг на день, введені в роздільних дозах або в формі пролонгованого вивільнення, ефективні « для досягнення бажаних результатів. Друге або подальше введення можна провести в дозі, яка є такою ж, менше 7-3 с або вище, ніж первинна або попередня доза, що вводиться індивідууму.
Даний винахід описаний при зверненні до конкретних втілень, але зміст опису включає всі модифікації і )» заміни, які може провести фахівець в даній області, не відступаючи від значення і мети формули винаходу.
Зараз винахід буде описаний за допомогою наступних прикладів, які жодним чином не треба розглядати як ті,
ЩО обмежують даний винахід. У прикладах будуть посилання на фігури, представлені тут нижче. -І Фігура 1: представлено вирівнювання деяких зразкових СС-хемокінів, вирівняних на рівні петлі 40-х положень амінокислот. Даний сегмент білка і катіонний сайт, який відповідає ЗАС-зв'язуючому мотиву, вміщені в ш- рамки.
Ге) Фігура 2: представлена карта плазміди, використаної для клонування КАМТЕ5З дикого типу і його мутантів
Згідно з прикладами. і-й Фігура 3: представлені результати аналізу конкурентного зв'язування | 12211-ВАМТЕЗ і мутантів гепарином в о аналізі з гранулами, навантаженими гепарином.
Фігура 4: приведені дані аналізів конкурентного рівноважного зв'язування КАМТЕЗ і потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5.
Фігура 5: показана індукція хемотаксису моноцитів і Т-клітин під впливом КАМТЕЗ5 і потрійних мутантів по 40-их і 50-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ. о Фігура 6: показане інгібування рекрутменту перитонеальних клітин під впливом мутанта по 40-их положеннях ко амінокислот КАМТЕ5.
Фігура 7: показане інгібування індукованого КАМТЕ5 рекрутменту перитонеальних клітин під впливом бо усіченого потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ (3-68), отриманого в Ріснпіа равіогів.
Фігура 8: показане інгібування індукованого МІР-ІВ рекрутменту перитонеальних клітин під впливом потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот МІР-ІВ (КАБАКАбАКАЯ8А).
Фігура 9: показане інгібування індукованого МІР-ІА рекрутменту перитонеальних клітин під впливом потрійного мутанта по 40-их положеннях 65 амінокислот МІР-ІА (К18А-К4АбА-КА8А).
Фігура 10: показане інгібування індукованого тіогліколятом рекрутменту клітин під впливом потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ5.
Фігура 11: показано придушення початку розвитку експериментального аутоїмунного енцефаломієліту під впливом всіх потрійних мутантів по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ згідно з даним винаходом.
ПРИКЛАДИ
1. Матеріали і методи а) Отримання незв'язуючих гепарин мутантів КАМТЕЗ
Мутагенез КАМТЕ5 досягали зворотною полімеразною ланцюговою реакцією. Крапкові мутації вводили в один з двох праймерів, використаних для гібридизації з людською кодуючою послідовністю КАМТЕ5 (СепВапк номер 7/0 доступу ММ-002985) в зворотній орієнтації. Для того щоб підвищити ефективність відпалу праймерів (особливо, коли в праймери вводили численні мутації), ДНК денатурували лугом. Денатуровану ДНК розбавляли до концентрації приблизно 10 пг/реакція для уникнення включення немутантної ДНК в реакцію трансформації.
Нумерація амінокислот, представлена в прикладах і описі, стосується зрілого білка, тобто починаючи з 5ег, який є амінокислотою в положенні 24 у відповідності до списку послідовностей. Отже, для того, щоб мати 7/5 правильну відповідність між числом амінокислот в списку послідовностей і таким в прикладах, 23 потрібно додати до чисел в прикладах або описі.
Послідовності використаних мутагенних праймерів є наступними, і мутантні основи підкреслені: "ПАйд(сннстрквк, вето ТОАС ОВ Ва АНЯ р 70 ррддутеклютяня їй оАСОАстестозаттва пе задо ТЯ а:
Ге вирстьн ее же жест вигсе кі етя трів, й фс с вет г. сі
КИБЕачтюжиені) т. о
ВИТ Кісьтксійту
ВОВКА АК САКОПОТОТОЮЬЯ хо о рат аятноаякровкі) ою вепиатеАр оо а олАГОСОСАЧВТОТВ ТОВ ОДА: в; Кк
ВААКИВАНАТА, потрійний хоутант ці Я0-их потнлкениео ав нки сиве); т тре іо ТКА Тео св ва во ОСОАКСОСАВЛВ ВО ААКТОВС ТОВКИ Ен ч о ЖАБА котел 2 ї» У АЛЕБОДОВО КВК ТОК ТОЙ РИ. 75 В ОАрАСАСТ ТО тота Р - 5 АОКАА ТЕСТ АС АТСА АС Рі с Ге ср нс Кі що слободі тн
ШЕ сс ВО ра й
Ампліфікацію проводили в термоблоці для ДНК (Регкіп-ЕІтег-Сейиз 480) протягом 35 циклів з використанням іФ, ДНЕК-полімерази рішигроб. ДНК лігу вали і трансформували в Тор 10 ЕР" компетентні клітини Е.соїї (Іпмйгодеп). ка Послідовність мутантів перевіряли секвенуванням ДНК.
Б) Експресія і очищення КАМТЕЗ5 дикого типу і мутантів КАМТЕЗ в Е.соїї во Отримані з допомогою ПЛР фрагменти ДНК, як пояснено вище, клонували в плазміду рЕТ24а (фігура 2) з отриманням ряду векторів. Кодуючу послідовність КАМТЕ5 дикого типу або мутантного КАМТЕЗ клонували в 3-положенні від промотору рТ7 між Хбваї- і Мпе/Хпо!І-сайтами. Плазміда містить два маркерних гени (Кт і Іасі) і активний початок реплікації (Огі Я).
Отримані вектори використали для повторної трансформації штаму Е.соїї ВІ 21(ОЕЗ), в якому досягається б5 висока експресія білка з використанням системи рт7/ асі. Експресію білка індукували доданням до культури 1ММ ізопропіл-Д-О-тіогалактопіранозиду (ІРТО). Клітини збирали і ресуспендували в буфері для лізісу (560ММ
Трис-НСІ, рН8, 10ММ Маосі», 5мММ бензамідину/НСІ, їмМ ОТТ, 0.1мММ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ),
ОМази 2Омг/л). Клітини руйнували трьома пропусканнями через французький апарат для продавлювання клітин під тиском. Потім суспензію центрифугували при 10000худ протягом ЗОхв. при 4290. Осадок тіл включення, утримуючий КАМТЕЗ дикого типу або один з мутантів КАМТЕ5, солюбілізували в 0,1М Тріс/НСІ, рНе,О, що містить 6М гуанідину/НСІ і їмМ ОТ, і перемішували протягом ЗОхв. при 602С. Розчин діалізували проти З змін 190 оцтової кислоти. Нерозчинні речовини видаляли центрифугуванням при 10000хд9 протягом ЗОхв. Супернатант, що містить КАМТЕ5 дикого типу або один з мутантів КАМТЕЗ5, ліофілізували.
Ліофілізований порошок розчиняли в 0,1М Тріс/НСІ, рНав,О, що містить ЄМ гуанідину/НСІ і їТмМ ОТ. для 70 отримання концентрації, рівної приблизно 1 мг/мл. Білки ренатурували доданням по краплях в 10х об'ємі розчину гуанідину розчину 20мМ Тріс/НСІ, рНВ,О, що містить 0,01мММ окисленого глутатіону і 0,1мММ відновленого глутатіону. Розчин перемішували протягом ночі при 42С. Нерозчинні речовини видаляли центрифугуванням при 10000х9 протягом ЗОхв. Значення рН доводили до 4,5 оцтовою кислотою, і електропровідність доводили до 20т5 розбавленням водою. Розчин наносили на колонку НіЇ ода 5 26/10, заздалегідь урівноважену 20ММ ацетатом 75 натрію, рНа4,5 і білок елюювали лінійним градієнтом 0-2М Масі в тому ж буфері. Фракції, що містять КАМТЕЗ дикого типу або один з мутантних білків КАМТЕ5, збирали, діалізували проти З змін оцтової кислоти і ліофілізували.
Ліофілізовані білки розчиняли в 50мММ Тріс/НсСІ буфері, рНа,0. Лідерну послідовність МКККМУРК, отриману в результаті клонування, відщепляли від КАМТЕ5 дикого типу або одного з мутантних білків КАМТЕ5 інкубуванням з ендопротеїназою Аго-С (фермент:субстрат 1:600, мас/мас.) протягом ночі при 372С. Відщеплені білки відділяли від невідщепленого білка катіонобмінною хроматографією на колонці НіїЇ ода 5 26/10, заздалегідь урівноваженій 20ММ ацетатом натрію, рНЯА,5, що містить 6М сечовини, і білки елюювали лінійним градієнтом 0-2М Масі в тому ж буфері. Збирали відщеплені фракції і діалізували проти двох змін 195 оцтової кислоти і, нарешті, проти 0,190 трифтороцтової кислоти і потім ліофілізували (Еддепоп М.О. еї аЇ., рда. 33-40 апа Ргоцатюої А.Е. ек аЇ, руд. СМ 75-81, іп "Спетокіпе Ргоїосоїв", Мейїйодз іп Моіесшаг Віоіоду, 2000, мої. 138, Нитапа Ргез5). о
Автентичність білків дикого типу їі мутантного КАМТЕЗ перевіряли мас-спектрометрією. З використанням аналогічної методики отримували інший мутант, який містив Меї як подовження МН »-кінця, а також одиничний або потрійний мутанти по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ і одиничний або потрійний мутанти по 50-их положеннях амінокислот. о с) Експресія і очищення КАМТЕЗ дикого типу і мутантів КАМТЕЗ в Ріснпіа равіогів ю
Отримували зрілий потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5 (К44А-КА5А-К47А) з використанням мегапраймера на основі ПЛР-мутагенезу (бана А.К., Мисівеіїс Асід. Кезеагсі, 1995, 23 (21): б» 4530-31). Його клонували в експресуючий вектор Ріспіа равзіогії, рРІСОК, в рамці прочитування з чн препросигнальним пептидом Маї альфа 5. сегемівіае. 3 Після підтвердження послідовності плазміду переносили в штам-хазяїн Ріспіа равіогів (35115(Ппів4) в. електропорацією. Нів'-клони піддавали скринінгу на експресію мутанта ВАМТЕ5. Проводили досліди по експресії в невеликому об'ємі з використанням стандартних методів, як описано в наборі для експресії в Ріспіа від
Іпмйгодеп (І Ме Тесппоіодіев). Стисло, культуру розмножати в збагаченому середовищі, що містить гліцерин як « джерело вуглецю, після чого її осаджували і ресуспендували в середовищі, що містить метанол для індукції експресії мутантного білка ВТАМТЕЗ8. Секрецію мутантного ВАМТЕЗ в середовищі детектували при фарбуванні З с Кумасі синім після проведення електрофорезу в 5ЗО5-ПААГ.
І» Клон, що секретує мутантний КАМТЕ5З у високій концентрації (приблизно 500-75Омг/л), використали для розмноження у великих колбах, що струшуються. Бульйон після ферментації центрифугували при 5000об./хв. і супернатант використали для виділення.
Білок виділяли з супернатанту хроматографією в одну стадію на колонці з гепарин-сефарозою, урівноваженою - 0, 1М Тріс/НСІ, і елюювали лінійним градієнтом 0-2М Масі в тому ж буфері з використанням 20 об'ємів колонки. -і Автентичність білка перевіряли мас-спектрометрією, і було встановлено, що продукований в такій системі мутант
КАМТЕЗ (К44А-КА5А-КА7А), також є усіченим в М-кінці в порівнянні з молекулою дикого типу, тобто він втрачає 2 і, перших амінокислоти. Отже, отриманим таким чином мутант ідентифікували як потрійний мутант по 40-их «сл 20 положеннях амінокислот ВАМТЕ5 (3-68)(К44А, Ка5БА, КА7А), і його амінокислотною послідовністю є 5ЕО ІО Мо: 3. 4) Аналіз зв'язування гепарину о Проводили хроматографію на гепарин-сефарозі з використанням Б5Омкг білків дикого типу або мутантного
ЕАМТЕЗ, які навантажували на колонку з гепарином-сефарозою, урівноважену 25мМ Тріс/НсІі, рне,о ії 5О0мМ Мас, і елюювали лінійним градієнтом 0-2М Масі в 25мМ Тріс/НСІ, рна,0.
Хроматографію на гепарин-сефарозі проводили з використанням Б5Омкг білків дикого типу або мутантного
ГФ) КАМТЕЗ5, які наносили на катіонообмінну колонку Мопоз, урівноважену 5ОММ ацетатом натрію, рН4,5. Білок елюювали градієнтом 0-2М Масі. ді Аналіз конкурентного зв'язування проводили з використанням КАМТЕ5 дикого типу, потрійного мутанта по 50-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ і потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5 60 (послідовність 5ЕСО 0 Мо: 2 також позначений тут, як "К44А-К45А-К47АКАМТЕЗ"), які були помічені 125І(Атегепат) з питомою активністю 2200мкюрі/моль. 96-ямкові планшети з фільтром просочували буфером для зв'язування (5ХОММ НЕРЕЗ5, рН7,2, що містить ММ
Сас1», 5мММ Масі», 0,15М Масі і 0,595 В5А). Проводили серійне розведення гепарину в буфері для зв'язування в межах концентрацій 20мг/мл-Тмкг/мл. Аналіз проводили в загальному об'ємі 100мкл з доданням в кожну ямку 65 25мкл розведень гепарину, 25мкл 0,4 нМ (|722І|-хемокіну, 25мкл гранул, навантажених гепарином (0,2мкг/мл р Дд рину, , У, ранул, р , У воді) і 25мкл буферу для зв'язування. Аналізи проводили в трьох паралелях. Планшети інкубували при кімнатній температурі при струшуванні протягом 4год. Планшети з фільтром промивали З рази 200мкл буфера для промивання з використанням вакуумного насоса для видалення незв'язаного-міченого хемокіну. Потім в кожну ямку додавали 50 мкл сцинтиляційної рідини і визначали радіоактивність (1хв./ямка). Дані аналізували з використанням програми сгагії Зоїмаге. є) Аналізи рівноважного конкурентного зв'язування з рецептором
Аналізи проводили на мембранах від трансфектантів СНО, що експресують ССК1 або ССК5, з використанням сцинтиляційного аналізу просторової близькості (ЗРА), застосовуючи як індикатор | 29Ц-МІР-1у. Конкуренти 70. готували серійним розведенням немічених хемокінів в буфері для зв'язування в межах концентрацій 1075-10712М.
Використаним буфером для зв'язування був 5ХОММ НЕРЕЗ, рН7,2, що містить 1ММ Састі 5, 5мМ Маосі», 0,15М масі і 0,595 ВЗА. Гранули УУпеаідепт ЗРА (Атегзпат) солюбілізували в РВ5 до концентрації 5Омг/мл і розбавляли в буфері для зв'язування до концентрації 1Омг/мл, і кінцева концентрація при аналізі становила 0,25мг/ямка.
Мембрани, отримані з клітин СНО, що експресують ССКІ1 або ССК5, зберігали при -802С і розбавляли в буфері 75 для зв'язування до концентрації 8Омкг/мл. Перед постановкою аналізу для зменшення фону змішували рівні об'єми початкових розчинів мембран і гранул. Кінцева концентрація мембран становила 2мкг/мл, і концентрація для 1125Ц-МІР-1 у, дорівнювала 0,1нМ. Планшети інкубували при кімнатній температурі при струшуванні протягом 4год. Визначали радісактивність і дані аналізували, як описано для аналізу зв'язування гепарину. 7) Аналізи хемотаксису
Хемотаксис моноцитів проводили за допомогою аналізу з використанням камери мікро-Воудеп. Моноцити виділяли з світлого шару кров'яного згустку з використанням наступної методики виділення: 100мл розчину світлого шару кров'яного згустку розбавляли 100 мл РВ5, вміщували на Фіколл і центрифугували при бО00ха протягом 20 хв. при кімнатній температурі. Клітини, утворюючі поверхню розділу, збирали, двічі промивали РВ5 ря і ресуспендували при концентрації 40-100х10'б/мл в середовищі ВРМІ 1640, що містить 595 інактивованої с фетальної телячої сироватки (ЕС5), 2мМ глутаміну і 25мММ НЕРЕЗБ, рН?7,2. Потім їх виділяли з фракції лімфоцитів (о) доданням 105 овечих еритроцитів/мл, проводили реакцію розеткоутворення протягом ночі при 42С і відділяли другим центрифугуванням в градієнті Фікола при 900хд протягом 20хв. при кімнатній температурі. Моноцити виявляли на поверхні розділу між Фіколом і буфером, а Т-клітини знаходилися в осаді. Моноцити промивали РВ5 і о зо ресуспендували при концентрації 2,5х10б/мл в середовищі ЕРМІ 1640. Чистоту визначали прямим і бічним розсіюванням збудженої флуоресценції сортованих клітин, і вона була встановлена на рівні 40-8095 в залежності що від донора. Хемокіни розбавляли до кінцевого об'єму ЗОмкл, в межах концентрацій 1079-10712М в середовищі ВРМІ /Ф вносили в нижню ямку. Над нижньою ямкою вміщували фільтр з розміром пір 5мкм (Мешйгоргоре) для моноцитів і м
Змкм для Т-клітин для гарантії відсутності пухирців повітря і систему скріпляли. 5Омкл клітинної суспензії (2,5х109 клітин/мл) в середовищі ЕРМІ вміщували у верхню ямку. Камеру інкубували протягом ЗОхв. для ї- моноцитів і 1,5год. - для Т-клітин при 372С в атмосфері О»5. Потім клітини видаляли, верхню поверхню мембрани очищали від клітин і потім мембрану промивали РВ5. Мембрану фіксували зануренням в МеонН на Іхв., висушували повітрям і забарвлювали розчинами Ріеїдз А і В. Підраховували число клітин, що мігрували при « довільному виборі полів зору для кожної ямки з об'єктивом 20х на звичайному мікроскопі, забезпеченому шо 70 програмою ІВАЗ. Дані обробляли програмою сгарії. с 49) Аналізи по рекрутменту перитонеальних клітин 1» В першому аналізі рекрутмент клітин індукували внутрішньочеревним введенням 1Омкг хемокіну, розведеного в
О,2мл стерильного фізіологічного розчину (Масі, що не містить І Р5), мишам самицям ВАЇ В/с у віці 8-12 тижнів.
Мутанти хемокінів (1Омкг хемокіну, розбавленого в 0,2мл стерильного фізіологічного розчину) вводили за ЗОохв. 75 до введення агоністу. Через 1бгод. мишей вбивали СО» в аерозолі. Лаваж черевної порожнини проводили З промиваннями по 5мл РВ5 і промивні фракції збирали. Клітини центрифугували при б00хд протягом 1ОХхв., -І ресуспендували в кінцевому об'ємі мл і з допомогою гемоцитометру підраховували загальне число витягнутих лейкоцитів. се) У в . : : о другому аналізі рекрутмент клітин індукували внутрішньочеревним введенням 2О0Омкл 3905 розчину с 50 тіогліколяту в дистильованій воді мишам самицям ВАЇ В/с у віці 8-12 тижнів (день 1). Мутант хемокіну (1Омкг хемокіну, розведеного в 0,2мл стерильного фізіологічного розчину) вводили за ЗОхв. до введення тіогліколяту. с Мутант хемокіну потім вводили щодня протягом З днів (день 2, З і 4). На день 5 мишей вбивали СО» в аерозолі.
Лаваж черевної порожнини проводили З промиваннями по бмл РВ5 і промивні фракції збирали. Клітини центрифугували при 600хд протягом 10хв., ресуспендували в кінцевому об'ємі 1мл і з допомогою гемоцитометру 59 підраховували загальне число витягнутих лейкоцитів. гФ) НІ) Експериментальний аутоїмунний енцефаломієліт (ЕАЕ) т Процедура імунізації
Мишей самиць С57 ВІ /6ЄМСТІВК у віці 8 тижнів з масою тіла 18-22 імунізували (день-0) підшкірним введенням в задню область шиї 0,1 мл емульсії, що містить 200мкг пептиду МОСзв 55 (Меозувіет, 5ігазрошго, Франція) в 60 повному ад'юванті Фройнда (СЕРА з Мусобрасієегішт ршіугісит, Ойсо, Оейгої, США), що містить 0,25Ммг
Мусобрасіегішт (шрегсціовіз. Перед підшкірним введенням вони отримували 200мкл внутрішньовенно ЗООнг коклюшного токсину (Гіві Віоіодіса! Іар., Сатрбреїї, СА, США), розчиненого в РВ5 в хвостову вену. На день 2 твариною робили другу в/ч ін'єкцію ЗООнг коклюшного токсину.
Внаслідок даної процедури, починаючи приблизно з дня 8-10, з'являвся прогресуючий параліч, починаючи від 65 хвоста прогресивно висхідний до передніх кінцівок.
Схема досліду
У дослід входили групи по 10 тварин в кожній. Всі групи імунізували пептидом МОС35-55 8 СЕРА і коклюшним токсином по протоколу імунізації:
Група 1: позитивна контрольна група з введенням одного розчинника (РВ5) в/ч.
Група 2: позитивна контрольна група з введенням одного розчинника (РВ5) п/ш.
Група 3: з введенням потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ в дозі 1Омкг/миша в/ч.
Група 4: з введенням потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ в дозі ТІмкг/миша в/ч.
Група 5: з введенням потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот МеЇ-КАМТЕЗ в дозі 10мкг/миша в/ч. 70 Група 6: з введенням потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот МеЇ-КАМТЕЗ в дозі ТІмкг/миша в/ч.
Група 7: з введенням мишачого рекомбінантного інтерферона бета (пт-ІЕМ-В) в дозі 10000Е/миша п/ш.
Група 8: з введенням Ітп-ІЕМ-В в дозі 20000Е/миша п/ш.
Розчинник
РВ5 використали для розведення потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5, потрійного 75 Ммутанта по 40-их положеннях амінокислот МеЇ-КАМТЕЗ і т-ІЕМ-В до відповідної концентрації.
Шлях введення
Потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5, потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот МеЇКАМТЕЗ і т-ІЕМ-В вводили щодня в/ч в об'ємі 200мкл/миша. Групам 1, 2 в/ч вводили РВ5 з розрахунку 200мкл/миша.
Тривалість лікування
Лікування кожної тварини починали від дня 4 досліду (приблизно за 3-5 днів до звичайного вияву захворювання) і потім продовжували протягом 14 подальших днів (тварин вбивали на день 18 досліду).
Клінічні спостереження
Починаючи з дня 5, тварин індивідуально обстежували на наявність паралічу в балах по клініці таким чином: Га
О - відсутність ознак захворювання 0,5 - частковий параліч хвоста 1 є параліч хвоста і9) 1,5 - параліч хвоста я частковий односторонній параліч задніх кінцівок 2 Е параліч хвоста «т слабість задніх кінцівок або частковий параліч задніх кінцівок 2,5 Е параліч хвоста - частковий параліч задніх кінцівок (опущений таз) ав!
З є параліч хвоста я повний параліч задніх кінцівок 3,5 - параліч хвоста я повний параліч задніх кінцівок - нетримання сечі о 4 - параліч хвоста «т параліч задніх кінцівок ї слабість або частковий параліч передніх кінцівок Ге»! 5 х агонія або смерть 2. РЕЗУЛЬТАТИ - а) Аналізи зв'язування з гепарином -
Очищені білки КАМТЕЗ, мутантні по одному або трьом положенням, аналізували хроматографією з гепарином і концентрацію Масі, необхідну для їх елюювання, порівнювали з профілем елюювання КАМТЕ5 дикого типу.
Оскільки взаємодія з гепарином є електростатичною, мутанти також піддавали катіонобмінній хроматографії на колонці Мопоб5. Це приводило до зниження концентрації Масі, необхідної для їх елюювання, оскільки в результаті « мутагенезу видаляються основні залишки. Різницю в концентрації Масі, отриману при проведенні катіонобмінної (223 с хроматографії, віднімали з такої, отриманої при проведенні хроматографії з гепарином. Якщо це значення є позитивним, то це вказує на специфічну взаємодію з гепарином (таблиця 1). )» Пряме визначення зв'язування з гепарином проводили з потрійними мутантами по 40-их і 50-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ в аналізі конкурентного зв'язування. КАМТЕ5З дикого типу і мутанти йодували (Атегзпат), і всі вони мали однакову питому радіоактивність, рівну 2200мкюрі/моль. Однак тільки приблизно 2095 потрійних -І мутантів по 40-их положеннях амінокислот зв'язувалося з гранулами, навантаженими гепарином, з максимальним числом імпульсів на хвилину, рівним 4000, в порівнянні з 22000 імпульсами на хвилину для КАМТЕ5 дикого типу і 7 мутантом по 50-их положеннях амінокислот (фігура 3). Це показує, що дані залишки в петлі 40-их положень (Се) амінокислот, які піддавали мутагенезу, значною мірою визначають здатність КАМТЕЗ зв'язуватися з гепарином. З іншого боку, це також показує, що передбачуваний САс-зв'язуючий мотив в петлі 50-х положень амінокислот не є іні "дійсним" сайтом САс-зв'язування. о р) Аналізи рівновагового конкурентного зв'язування з рецептором Оцінювали здатність потрійних мутантів по 40-их і 50-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ конкурувати з (2211-МІР-1 о, за зв'язування з рекомбінантними ССКІ і ССК5 в мембранах, отриманих з стабільних трансфектантів СНО. Достовірна
Ге) відмінність була відсутня при будь-якій з одиничних мутацій на обох рецепторах (результати не представлені).
Жоден з потрійних мутантів не показував відмінності в зв'язуванні з ССК5 в порівнянні з білююм КАМТЕЗ дикого іме) типу. Однак на ССК1 потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот мав 100-кратне зниження афінності, в той час, як потрійний мутант по 50-их положеннях амінокислот показував тільки невелику (3-кратну) втрату 60 афінності (фігура 4). с) Аналізи хемотаксису
Всі потрійні мутанти по 40-их і 50-их положеннях амінокислот були здатні індукувати хемотаксис моноцитів з активністю, порівнянною з КАМТЕЗ дикого типу, за винятком потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот, який був здатний індукувати істотний хемотаксис тільки в концентрації їмкМ. Однак потрійні 65 мутанти по 40-их і 50-их положенням амінокислот були рівні по їх здатності індукувати хемотаксис Т-клітин (фігура 5).
Результати, отримані в аналізах хемотаксису моноцитів, добре співпадають з отриманими в аналізах зв'язування з рецептором. Втрата активності потрійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕ5З у відношенні хемотаксису моноцитів відповідають втраті афінності для ССК1. 4) Аналізи рекрутменту перитонеальних клітин
Потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ не був здатний індукувати рекрутмент клітин в черевну порожнину в дозі (1Омкг/миша), в той час як КАМТЕ5З викликає істотний рекрутмент (фігура 6).
Більш того якщо мутант в дозі ТОмкг вводили за ЗОхв. до введення КАМТЕ5, рекрутмент клітин, що індукується КАМТЕ5, придушувався. Отже, втрата зАс-зв'язування давала інгібітор індукованого хемокінами /о рекрутменту клітин іп мімо.
Аналогічні результати представлені на фігурі 7 з усіченим (3-68) потрійним мутантом по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ (отриманим в Ріснпіа разіогіз), на фігурі 8 з потрійним мутантом по 40-их положеннях амінокислот МІР-1-В8. (КА5А-К4АбА-КАІ8А) і на фігурі 9 з потрійним мутантом по 40-их положеннях амінокислот
МІР-Іа (КІ8ВА-КАбА-К48А). Рекрутмент клітин, стимульований тіогліколятом, також інгібувався потрійним мутантом 7/5 по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕФ5, як представлено на фігурі 10. є) Експериментальний аутоіїмунний еицефаломієліт (ЕАЕ) Потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот
КАМТЕЗ показував дозозалежний ефект на моделі мишачого ЕАЕ. Було показано, що білок в дозах Тмкг/миша і 1Омкг/миша, що вводиться щодня в/ч, починаючи з 10-го дня після первинної імунізації МОЄ, виявляв порівнянну ефективність зі стандартним лікуванням рекомбінантним т-ІЕМ-В (фігура 11). Початок захворювання істотно сповільнювався, і тяжкість захворювання (що оцінювали по площі під кривою) також значно знижувався. Крім того, середнє значення максимальної кількості балів по клініці, отримане під час досліду, також знижувалося.
Інший мутант (потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот МеЇї-КАМТЕЗ) був не здатний виявити позитивний вплив в тому ж досліді.
Результати заявників показують чіткий позитивний вплив при лікуванні всіма потрійними мутантами по 40-их сч об положеннях амінокислот КАМТЕЗ, які зменшують вираженість клінічних ознак хронічного ЕАЕ у мишей після імунізації МО. Отже, потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот КАМТЕЗ має позитивний терапевтичний о); ефект, і може застосовуватися як лікування при хронічних демієлінізуючих захворюваннях таких, як М5. о зо о
Мутація відсутя дитяти 0800911 Ф ямА 7777711 1овіова) оме | 009 мо т зв м кА 711овообеє! бо | 007 от « явА 00111000 079 ояв обі 0006005.
КББАЖБЕАНЕЯА 00 оо 075 оо омб | 006 З - У подальшій таблиці 2 показана ідентичність послідовностей, представлених в переліку послідовностей і в )» тексті.
Таблиця 2 - в
Ф п о 6 петрійниймутантто вик положеннях амінокислот НАМТЕЄ во Мантваяамв 0000000 ов в МуанкавяАюТЕВ 00000000 щи ю во 65 19 Праймер Рб о і
Claims (14)
1. Застосування мутанта СС-хемокіну, який містить щонайменше дві мутації в катіонному сайті петлі 40-х положень амінокислот, як представлено на фігурі 1, і який в порівнянні з молекулою дикого типу має знижену і9) САс-зв'язуючу активність, для отримання фармацевтичної композиції для лікування розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань, в якому хемокін вибраний з КАМТЕ5, МІР-1-альфа, МІР-1-бета, МІР-3, МІР-4, НССТ, 1309, ІЗ35612 і МСР-2. ав!
2. Застосування за п. 1, в якому мутант хемокіну представляє мутант КАМТЕЗ5.
3. Застосування за п. 2, в якому мутант хемокіну представляє потрійний мутант КАМТЕЗ, в якому три основні о амінокислоти в катіонному сайті петлі 40-х положень амінокислот заміщені іншими амінокислотами. Ге»!
4. Застосування за п. З, в якому три основні амінокислоти в катіонному сайті петлі 40-х положень амінокислот заміщені аланіном, серином, треоніном, проліном або гліцином. -
5. Застосування за п. 1, в якому мутант хемокіну представляє мутантний КАМТЕЗ з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо: -
З.
6. Застосування за п. 1, в якому мутант хемокіну представляє мутантний КАМТЕЗ з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо:
2.
7. Застосування за п. 1, в якому мутант хемокіну представляє мутант МІР-1-альфа з послідовністю 5ЕО ІЮ « Мо: 4. ш с
8. Застосування за п. 1, в якому мутант хемокіну представляє мутант МІР-1-бета з послідовністю ЗЕО ІЮО Мо: 5.
9. Фармацевтична композиція для лікування розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань, що )» включає як активний інгредієнт мутант хемокіну, визначений в пп. 1-8, разом з фармацевтично прийнятним наповнювачем.
10. Усічений і мутантний КАМТЕ5 людини, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 2. -І
11. Молекула ДНК, що включає послідовність ДНК, що кодує усічений і мутантний КАМТЕЗ за п. 10.
12. Експресуючий вектор, який включає молекулу ДНК за п. 11. 7
13. Клітина-хазяїн, що включає експресуючий вектор за п. 12. (Се)
14. Рекомбінантний спосіб отримання поліпептиду за п. 17, що включає культивування у відповідному сл 50 Культуральному середовищі клітин за п. 13. (42) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00121665 | 2000-10-04 | ||
| PCT/EP2001/011428 WO2002028419A2 (en) | 2000-10-04 | 2001-10-03 | Chemokine mutants in the treatment of multiple sclerosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA77950C2 true UA77950C2 (en) | 2007-02-15 |
Family
ID=8170011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2003044038A UA77950C2 (en) | 2000-10-04 | 2001-03-10 | Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7402303B2 (uk) |
| EP (1) | EP1326628B1 (uk) |
| JP (1) | JP3908165B2 (uk) |
| KR (1) | KR100837898B1 (uk) |
| CN (1) | CN1285381C (uk) |
| AR (1) | AR030854A1 (uk) |
| AT (1) | ATE265222T1 (uk) |
| AU (2) | AU2002215919B2 (uk) |
| BG (1) | BG66137B1 (uk) |
| BR (1) | BR0114407A (uk) |
| CA (1) | CA2423616C (uk) |
| CZ (1) | CZ303409B6 (uk) |
| DE (1) | DE60103078T2 (uk) |
| DK (1) | DK1326628T3 (uk) |
| EA (1) | EA006137B1 (uk) |
| EE (1) | EE05174B1 (uk) |
| ES (1) | ES2217199T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20030215B1 (uk) |
| HU (1) | HUP0302194A3 (uk) |
| IL (2) | IL155178A0 (uk) |
| MX (1) | MXPA03003008A (uk) |
| NO (1) | NO330278B1 (uk) |
| PL (1) | PL204231B1 (uk) |
| PT (1) | PT1326628E (uk) |
| RS (1) | RS50738B (uk) |
| SI (1) | SI1326628T1 (uk) |
| SK (1) | SK287523B6 (uk) |
| UA (1) | UA77950C2 (uk) |
| WO (1) | WO2002028419A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA200302315B (uk) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7553483B2 (en) | 2001-12-17 | 2009-06-30 | Merck Serono Sa | Chemokine mutants acting as chemokine antagonists |
| EP1494703B1 (en) | 2002-04-04 | 2006-03-08 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Chemokines mutants having improved oral bioavailability |
| ES2305573T3 (es) * | 2002-12-23 | 2008-11-01 | Laboratoires Serono Sa | Uso de metantes de quimiocinas cc ccl5/rantes contra transtornos del higado. |
| WO2005040210A2 (en) * | 2003-10-22 | 2005-05-06 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Novel cxcl8 antagonists |
| AT412785B (de) * | 2003-12-04 | 2005-07-25 | Kungl Andreas J Dr | Gag-bindungsproteine |
| ATE322506T1 (de) * | 2004-01-19 | 2006-04-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur reinigung von in bakterien exprimierten proteinen |
| GB0412400D0 (en) * | 2004-06-03 | 2004-07-07 | Univ Newcastle | Treatment of inflammatory conditions |
| EP2218748B1 (en) * | 2005-09-03 | 2012-10-10 | Samsung SDI Co., Ltd. | Polybenzoxazine-based compound, electrolyte membrane including the same, and fuel cell employing the electrolyte membrane |
| GB0614755D0 (en) | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Univ Geneve | Cytokine derivatives |
| US8012474B2 (en) | 2007-08-02 | 2011-09-06 | Nov Immune S.A. | Anti-RANTES antibodies |
| CA2788902C (en) * | 2010-02-08 | 2019-09-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding rantes, and compositions comprising and methods of using the same |
| CN112469430B (zh) | 2018-05-28 | 2024-12-24 | 日内瓦大学 | 抑制大脑炎症的方法 |
| US20250186520A1 (en) * | 2020-10-26 | 2025-06-12 | City Of Hope | Oncolytic virus compositions and methods for the treatment of cancer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5739103A (en) | 1993-11-12 | 1998-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute | Chemokine N-terminal deletion mutations |
| WO1998006751A1 (en) | 1996-08-16 | 1998-02-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Mcp-3, rantes and mip-1alpha receptor antagonists |
| EP0906954A1 (en) * | 1997-09-29 | 1999-04-07 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist |
| DK1431391T3 (da) * | 1997-12-23 | 2005-12-19 | San Raffaele Centro Fond | RANTES-mutanter og terapeutiske anvendelser heraf |
| AU2740900A (en) * | 1999-01-29 | 2000-08-18 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating demyelinating inflammatory disease using ccr1 antagonists |
-
2001
- 2001-03-10 UA UA2003044038A patent/UA77950C2/uk unknown
- 2001-10-03 AU AU2002215919A patent/AU2002215919B2/en not_active Ceased
- 2001-10-03 DE DE60103078T patent/DE60103078T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 HR HR20030215A patent/HRP20030215B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 ZA ZA200302315A patent/ZA200302315B/en unknown
- 2001-10-03 KR KR1020037004599A patent/KR100837898B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 IL IL15517801A patent/IL155178A0/xx unknown
- 2001-10-03 CA CA2423616A patent/CA2423616C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 AT AT01986265T patent/ATE265222T1/de active
- 2001-10-03 EP EP01986265A patent/EP1326628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 MX MXPA03003008A patent/MXPA03003008A/es active IP Right Grant
- 2001-10-03 RS YUP-257/03A patent/RS50738B/sr unknown
- 2001-10-03 ES ES01986265T patent/ES2217199T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 CN CNB018199178A patent/CN1285381C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 PT PT01986265T patent/PT1326628E/pt unknown
- 2001-10-03 EE EEP200300139A patent/EE05174B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 SK SK406-2003A patent/SK287523B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 BR BR0114407-3A patent/BR0114407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 WO PCT/EP2001/011428 patent/WO2002028419A2/en not_active Ceased
- 2001-10-03 EA EA200300439A patent/EA006137B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 US US10/398,457 patent/US7402303B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 PL PL362350A patent/PL204231B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 AU AU1591902A patent/AU1591902A/xx active Pending
- 2001-10-03 DK DK01986265T patent/DK1326628T3/da active
- 2001-10-03 JP JP2002532243A patent/JP3908165B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-03 SI SI200130130T patent/SI1326628T1/xx unknown
- 2001-10-03 HU HU0302194A patent/HUP0302194A3/hu unknown
- 2001-10-03 CZ CZ20030947A patent/CZ303409B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-10-04 AR ARP010104684A patent/AR030854A1/es unknown
-
2003
- 2003-03-28 BG BG107685A patent/BG66137B1/bg unknown
- 2003-04-01 IL IL155178A patent/IL155178A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-04-03 NO NO20031525A patent/NO330278B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2411042C2 (ru) | Композиции и способы для лечения острого респираторного синдрома (sars) | |
| US8022176B2 (en) | FAS peptide mimetics and uses thereof | |
| JP4173633B2 (ja) | 長いペントラキシンｐｔｘ３を含む医薬組成物 | |
| UA77950C2 (en) | Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis | |
| CN110092837B (zh) | Uti融合蛋白 | |
| JP2007510403A (ja) | ケモカイン変異体の治療への使用 | |
| CA3091139A1 (en) | Dosing for treatment with il-22 fc fusion proteins | |
| EP2358738A2 (en) | Modulators of the cx3cr1 receptor and therapeutic uses thereof | |
| AU2002215919A1 (en) | Chemokine mutants in the treatment of multiple sclerosis | |
| KR100870296B1 (ko) | 융합 단백질 | |
| JP2020108383A (ja) | 組織メタロプロテイナーゼ阻害物質３型（ｔｉｍｐ−３）の変異体、組成物、及び方法 | |
| CA2688543C (en) | Vegf-d mutants and their use | |
| US20230303646A1 (en) | Analogs of human fibroblast growth factors | |
| US20070161550A1 (en) | Antiviral compositions which inhibit paramyxovirus infection | |
| ES2355260T3 (es) | Antagonistas de cadherina r selectivos y procedimientos. | |
| WO2005118637A1 (en) | Treatment of inflammatory conditions |