RS50911B - Estri l-karnitina ili alkanoil l-karnitina korisni kao katjonski lipidi za unutarćelijsko oslobađanje farmakološki aktivnih jedinjenja - Google Patents

Abstract

Jedinjenje formule (I)naznačeno time, što su n je ceo broj od 1 do 3,R je vodonik ili prav ili račvast alkanoil, sa 2-6 atoma ugljenika;R1 i R2 koji mogu biti isti ili različiti, predstavljaju zasićen ili nezasićen acil lanac,sa 3-20 atoma ugljenika; i X" je anjon farmakološki prihvatljive kiseline.Prijava sadrži još 27 patentnih zahteva.

Description

Pronalazak koji je ovde opisan odnosi se na upotrebu estara L-karnitina i acil L-karnitina kao katjonskih lipida podesnih kao pomoć za intracelularne distribucije farmakološki aktivnih jedinjenja, omogućavanje njihivog transmembranoskog transporta ili pomaganjem njihove interakcije sa specifičnim mestima na ćelijskoj membrani (receptori).

Ono što se ovde podrazumeva pod terminom "intracelularno oslobađanje" je ćelijska transfekcija sa polinukleotidima ili plazmidima, prirodnog porekla ili modifikovani, koji su terapeutski aktivni (distribucija gena), ili unošenja lekova ili imunogenih peptida u ćelije.

Mnoge farmakološki aktivne supstance, kao na primer, polipeptidi i proteini, ili lekovi, generalno moraju da prodru u ćelije, izvode svoje efekte utičući na ćelijske funkcije na subćelijskom ili molekularnom nivou. Za ove molekule ćelijska membrana predstavlja selektivno nepropustljivu barijeru. U stvari, ćelijska membrana obavlja zaštitnu funkciju, sprečavajući ulazak potencijalno toksičnih supstanci, ali takođe i prolazak jedinjenja koja su terapeutski aktivna. Kompleksni

cactou <SolijcUo mombrono obuhvata foofolipido, cjlikolipido i protoino, a i ijd la

funkcija je pod uticajem citoplazmatičnih komponenata, kao što su Ca<++>i drugi joni, ATP, mikrofilamenti, mikrotubule, enzimi i proteini koji vezuju Ca<++.>Interakcija između strukturnih i citoplazmatičnih komponenti ćelija i odgovor na spoljašnje signale su odgovorni za selektivnost koja se pokazuje među mnogobrojnim različitim ćelijskim vrstama. Barijerni efekat membrana se može prevazići kombinovanjem supstanci u kompleksima sa lipidnim formulacijama koje reprodukuju sastav prirodnih membranskih lipida. Ovi lipidi su u stanju da se fuzionišu sa membranama i oslobađaju supstance koje su sa njima

kombinovane u ćelije. Kompleksi lipida su u stanju ne samo da olakšaju intracelularni transfer fuzionisanjem sa membranama, već takođe mogu i da umanje odbijanje naelektrisanja između membrane i molekula koji treba da penetrira u ćeliju. Amfipatički lipidi, kao što su membranski fosfolipidi, formiraju lipidne vezikule ili lipozome u vodenim sistemima.

Lipozomi su vezikule u kojima je vodena zapremina potpuno okružena jednom ili više membrana koje su sastavljene od molekula lipida, obično fosfolipida. Posfolipidi, koji se sastoje od hidrofilne glave i para lanaca ugljenika (hidrofobni rep), glavne su komponente bioloških membrana. U vodenom rastvoru hidrofobni repovi se auto-asociraju da bi se odstanila voda, dok hidrofilne glave stupaju u interakciju sa ovim medijumom, spontano formirajući veziukule različitih prečnika. Lipidi su obično cviterjonski, neutralni ili anjonski. Ove vezikule mehurići se mogu koristiti kao nosači lekova, malih molekula, proteina, nukleotida i plazmida.

Tokom proteklih godina, iz sintetičkih lipida dobijeni su katjonski lipozomi, klasa pozitivno naelektrisanih vezikula, i široko korišćeni za transfer genetskog materijala u ćelije. Nagativno naelektrisanje DNK može da stupi u interakciju sa pozitivnim naelektrisanjem katjonskih lipida, formirajući stabilan kompleks DNK-lipozom. Jednostavnost i široka upotrebljivost ove tehnologije učinila je vezikule lipozoma značajnim vehikulomom za distribuciju gena u genskoj terapiji humanih subjekata. Nedavno, većina vektora koji se koriste u genskoj terapiji, odobrenih od strane NIH Recombinant Advisorv Committee, su virusni i sintetski sistemi.

Virusne infekcije obuhvataju serije kompleksnih mehanizama da bi bile u stanju da napadnu specifičnu ćeliju i unesu DNK u jezgro (nukleus). Princip upotrebe virusnih vektora u genskoj terapiji je zasnovan na mogućnosti zamene viralnih gena, genima koji kodiraju terapeutsku funkciju, bez eliminisanja sposoblnosti viralne čestice (partikule) da inficira ćelije. Ograničenja virusne terapije se odnose na one virusne elemente koji mogu da budu imunogeni, citopatični i rekombinogeni.

Velike nade polažu se u korišćenje katjonskih lipida u genskoj terapiji. Ovi vektori poseduju veliki potencijal, u poređenju sa onima koji su biološkog porekla, pošto su mnogo bezbedniji, manje toksični, a takođe mogu da inkoproriraju (ugrađuju) velike gene. Međutim, u poređenju sa vektorima bološkog tipa, oni imaju nizak prinos intracelularne transkripcije gena. Ipak, treba imati na umu da je upotreba takvog sistema transfekcije u početnoj fazi ispitivanja. Katjonski lipidi igraju veoma važnu ulogu pri stvaranju kompleksa DNK-lipid, u interakciji ćelija-kompleks, u fuzionisanju sa membranom, u oslobađanju DNK unutar ćelije i u transkripciji.

Postoje značajni primeriin vivoprimena katjonskih lipozoma. Prvo kliničko ispitivanjegenske terapije izvedeno je uvođenjem vektora ekspresije koji sadrži humani HLA-B7 gen komleksiran sa lipozomom, za tretiranje melanoma. Sledeća značajna primena se odnosi na tretman pulmonarne cistične fibroze, administracijom pulmonarnim putem ili kao sprej za nos, vektora ekspresije SV-40C-FTR kompleksiranog sa lipozomom. Ostala klinička ispitivanja, koja uključuju upotrebu lipozoma u genskoj terapiji kancera, su trenutno u toku.

U strukturi katjonskih lipida obično se identifikuju četiri konstitutivna elementa: pozitivno naelektrisana katjonska glava, distancer{ engl. spacer),"sidro"( anchor)lipid i linkerska veza( liker bond).

Katjonska glava je odgovorna za interakcije između katjonskih lipozoma i DNK, između kompleksa DNK-lipozom i ćelijske membrane i drugih komponenata ćelije. Sastoji se od mono- ili polikatjonskih grupa (zavisno od broja i naelektrisanja) koje mogu promenljivo da se supstituišu.

Distancer je deo molekula koji razdvaja katjonsku glavu od hidrofobnog repa, i obezbeđuje optimalan kontakt između katjonske glave i negativnih naelektrisanja fosfata u DNK.

„Sidro" lipid je nepolarni, ugljovodonični deo molekula i određuje fizička svojstva dvostrukog lipidnog sloja, kao što su njegova čvrstina i brzina izmene sa membranskim lipidima.

Ono što se podrazumeva pod "linkerska veza" je veza između ugljovodoničnih lanaca i ostatka molekula. Ova veza određuje hemijsku stabilnost i biorazgradivost katjonskih lipida.

Ova veza određuje hemijsku stabilnost i biorazgradivost katjonskih lipida.

Poslednjih godina upotreba lipozoma je u stalnom porastu u sektoru kozmetike. Uspeh lipozoma na ovom polju se zahvaljuje činjenici da koža vrlo dobro toleriše ova jedinjenja. Oni se koriste i kao tečni nosači aktivnih sastojaka i kao jedinjenja koja potpomažu absorpciju ovih poslednjih.

Naučna i patentna literatura je bogata referencama o dobijanju i upotrebi lipozoma; međutim, postoji vrlo malo referenci koje opisuju upotrebu karnitinskih derivata korisnih za distribuciju gena, dok za distribuciju leka nema raspoloživih dokumenata koji se bave poznatim tehnikama dobijanja jedinjenja, koja bi bar izdaleka potsećala na ona koja su opisana u ovom pronalasku.

Patent application EP 0 279 887 opisuje upotrebu jednog derivata karnitina, tj. fosfatidil karnitina, opciono u smeši sa drugim fosfolipidima i lipidima (holesterol, fosfatidilholin, fosfatidilserin), za dobijanje lipozoma.

U primeru koji se daje za dobijanje lipozoma, proizvode se lipozomi fosfatidil karnitina koji ugrađuju propranolol, lek za koji se zna da je aktivan kao antihipertenziv, agens protiv angine pektoris i protiv aritmije. Ovde se derivat karnitina upotrebljava na osnovu izraženog tropizma miokarda na karnitin. Ovaj tropizam omogućava izbegavanje metabolisanja lipozoma u jetri, umesto da stignu na željeno mesto targeta.

Prisustvo fosfatidil karnitina omogućava takođe da se lipozomi administriraju oralno, pošto su oni otporni na intestinalne lipaze.

UJ. Med. Chem.1998, od 18. juna, 41(13), 2207-15, opisani su brojni estri L-karnitina korisni za distribuciju gena, ali nisu opisani niti predloženi kao korisni agensi za distribuciju leka.

EP 559 625 B1 opisuje brojne estre L-karnitina i acil L-karnitina koji poseduju selektivnu aktivnost za mišićnu relaksaciju gastrointestinalnog trakta.

Poslednih godina molekularni biolozi su identifikovali brojne defekte na nivou hromozoma koji izazivaju nasledne bolesti kod humanih bića.

Važna oblast moderne medicine se bavi tretmanom ovih hereditarnih, genetski zasnovanih bolesti, koristeći protokole genske terapije.

Kao što je već pomenuto, katjonski lipozomi se široko koriste za intracelularnu distribuciju farmakološki aktivnih jedinjenja, olakšavanjem transporta kroz membranu ili unapređenjem njihove interakcije sa specifičnim mestima ćelijske membrane (receptori).

Ovi vektori imaju veliki potencijal, u poređenju sa onima koji imaju biološko poreklo, pošto su mnogo sigurniji, manje toksični, a u stanju su takođe da ugrađuju gene velikih dimenzija. Ipak, u poređenju sa vektorima biološkog tipa, oni imaju nizak prinos intracelularne transkripcije gena.

Pored toga, za transfer gena posredovan katjonskim lipidima, plazmid DNK i katjonski lipidi se čuvaju odvojeno, a njihovo mešanje se izvodi neposredno pred transfer gena.

Pokušaji stabilizacije ovih polinukleotidnih kompleksa do sada nisu uspeli da daju ohrabrujuće rezultate; ustvari, oni ostaju stabilni samo kratko vreme.

Stoga, na polju genetske terapije ili oslobađanja gena i oslobađanja leka, postoji veoma zapažena potreba za sistemima koji su stabilni, reproduktivni, specifični u pogledu mesta, a koji su takođe aktivni i nakon podesnog perioda vremena.

Sada je pronađeno da klasu katjonskih lipida, snažno aktivnih u unapređenju intracelularnog oslobađanja farmakološki aktivnih jedinjenja, predstavljaju novi estri L-karnitina i acil L-karnitina.

Ova nova jedinjenja su stabilna i visoko selektivna, zato što su specifična u pogledu mesta prispeća u targetirani organ.

Ova karakteristika ih čini naročito korisnim za transport aktivnih jedinjenja na mesto gde ona mogu da ispolje njihovu farmakološku aktivnost.

Jedinjenja koja se ovde opisuju u skladu sa ovim pronalaskom, su jedinjenja opšte formule (I):

gde su

n je ceo broj od 1 do 3;

R je vodonik ili alkanoil, ravan ili račvast, sa 2-6 atoma ugljenika;

Rii R2koji mogu biti isti ili različiti, predstavljaju zasićen ili nezasićen ravan acil

lanac, sa 3-20 atoma ugljenika; i

X" je anjon farmakološki prihvatljive kiseline.

Primeri za R su acetil, propionil, butiril, valeril i izovaleril.

Primeri za Rii R2su heksanoil, undekanoil, miristoil, palmitoil ili oleoil.

Poželjni primeri jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom su:

estar L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom

(ST 770);

estar acetil L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom

(ST 771);

estar propionil L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom

(ST 772);

estar izobutiril L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom

(ST 773);

estar izovaleril L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom

(ST 774);

estar L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksicetil-glicerolom

(ST 810);

estar acetil L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetil-glicerolom

(ST 809);

estar propionil L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetil-glicerolom

(ST 808).

Ono što se podrazumeva pod anjonom farmakološki prihvatljive kiseline je bilo koji anjon koji ne izaziva neželjene toksične ili sporedne efekte.

Ove kiseline su dobro poznate farmakolozima i ekspertima u farmaceutskoj tehnologiji.

Primeri ovih anjona, mada oni koji su navedeni nisu izuzetni, su: hlorid, bromid, jodid, aspartat, kiseli aspartat, citrat, kiseli citrat, tartarat, kiseli tartarat, fosfat, kiseli fosfat, fumarat, kiseli fumarat, glicerofosfat, glukozafosfat, laktat, maleat, kiseli maleat, mukat, orotat, oksalat, kiseli oksalat, sulfat, kiseli sulfat, trihloroacetat, trifluoroacetat, metansulfonat, pamoat i kiseli pamoat.

Jedinjenja formule (I) u obliku lipozoma su agensi koji su korisni za oslobađanje prirodnih ili modifikovanih plazmida ili nukleotida, koji se upotrebljavaju u genskoj terapiji, ili koji kodiraju peptid ili protein korisan kao vakcina, ali uopšte i za distribuciju lekova, kao što su na primer, lekovi protiv kancera, agensi protiv virusa, antibakterijski agensi, antifungali, antiprotozoani, lekovi koji se koriste u terapiji kardiovaskularnih sistemskih bolesti, ili imunogeni peptidi i drugi lekovi korisni u terapiji.

Lipozomi koji koriste jedinjenja formule (I) dobijaju se konvencionalnim tehnikama, dobro poznatim osobi koja je uobičajeno verzirana u stanju tehnike; videti na primer, Allen T.M., Drugs, 1998, 56, 747-56. Lipozomi u skladu sa ovim pronalaskom se mogu dobiti korišćenjem drugih komponenti takođe poznatih u praksi tehnologije lipozoma. U jednoj realizaciji ovog pronalska, lipozomi mogu da sadrže helper lipide, termin koji se dobro razume u stanju tehnike. Primeri helper lipida su holesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin, ili dioleil fosfatidilholin.

Lipozomi u skladu sa ovim pronalskom se podesno prezentiraju kao preparati. U realizaciji koja se odnosi na distribuciju farmakološki aktivnih jedinjenja, ovi preparati se podrazumevaju kao farmaceutski, i opciono sadrže farmaceutski prihvatljive nosače i/ili dodatke.

Jedinjenja formule (I) u obliku lipozoma, mogu takođe biti korisna za pripremanje kozmetičkih preparata, i kada sadrže sam lipozom kao kozmetički aktivni agens, ili za distribuciju supstanci sa kozmetičkom aktivnošću, kao što su na primer, hidrantni agensi, nutrijenti, supstance za čišćenje lica, sredstva proitv stvaranja bora, sredstva protiv celulita i sredstva za zatezanje.

Lipozomi koji sadrže jedinjenja formule (I) mogu se administrirati oralno ili parenteralno, intravenozno, intramuskularno, subkutano, transdermalno ili u obliku nazalnih ili za usta sprejova.

Ovde opisani pronalazak se odnosi takođe na druge katjonske lipide, opšte formule (II), koji su već poznati za razne upotrebe (EP 559 625, pomenut gore).

U skladu sa ovim pronalskom, jedinjenja formule (II) su estri L-karnitina, korisni za dobijanje lipozoma, koji poseduju snažnu aktvnost pri oslobađanju leka i poseduju karakteristike stabilnosti i selektivnosti u stizanju na targetirani organ, uporedne sa jedinjenjima formule (I) koja su opisana gore. Ista povoljna svojstva su primenjiva i u slučaju kozmetike.

Ova jedinjenja imaju opštu formulu (II):

gde su

R3je zasićeni ili nezasićeni acil, ravnog ili račvastog lanca, sa 4-26 atoma

ugljenika;

R4je zasićeni ili nezasićeni alkil, ravnog ili račvastog lanca, sa 4-26 atoma

ugljenika; i

X" je anjon farmakološki prihvatljive kiseline.

Poželjni primeri R3su nonanoil, dodekanoil, miristoil, palmitoil, stearoil ili oleoil.

Poželjni primeri R4su nonil, undecil, tetradecil, heksadecil ili oleil.

Primeri specifičnih jedinjenja formule (II), opisanih u ovom pronalasku, su: palmitoil L-karnitinhlorid undecilestar (ST 983);

stearoil L-karnitinhlorid undecilestar (ST 1055);

stearoil L-karnitinhlorid tetradecilestar (ST 1351);

palmitoil L-karnitinhlorid tetradecilestar (ST 1379);

miristoil L-karnitinhlorid tetradecilestar (ST 1380);

palmitoil L-karnitinbromid heksadecilestar (ST 1390);

oleoil L-kamitinhlorid oleilestar (ST 1392).

Brojna jedinjenja formule (II), naime ST 1380, ST 1390 i ST 1392, su poznata i opisana u gore-citiranomJ. Med. Chem.1998, 18. jun, 41(13), 2207-15, kao korisni agensi za dobijanje lipozoma za ćelijske transfekcije namenjene terapeutskoj aktivnosti, ali nikada nisu opisani kao korisni agensi za dobijanje lipozoma za distribuciju leka.

Verzirana osoba sa prosečnim iskustvom u oblasti farmaceutskih formulacija je sasvim svesna teškoća na koje se nailazi prilikom pripremanja kompleksa lipozom-lek; ustvari nemoguće jea prioriutvrditi da li se jedan lipozom, koji je korisan u oslobađanju gena, može koristiti i za distribuciju leka, zahvaljujući brojnim problemima koji se moraju savladati da bi se dobio lipozom koji je u stanju da komleksira lek i koji će ga osloboditi prvenstveno u organu gde on treba da ispolji njegovu kurativnu aktivnost.

Jedinjenja formule (II) u obliku lipozoma su korisni agensi za distribuciju lekova, kao što su na primer, antikancerni, antiangiogeni, antivirusni, antibakterisjki, antifungalni, antiprotozoalni agensi, ili lekovi koji su korisni u terapiji kardiovaskularnih bolesti, ili imunogeni peptidi i drugi lekovi korisni u terapiji. Jedinjenja formule (II) u obliku lipozoma, korisna su takođe za dobijanje kozmetičkih preparata, kao kozmetički agensi, ili za distribuciju supstanci sa kozmetičkom aktivnošću, kao što su na primer, hidrantni agensi, nutrijenti, agensi za čišćenje lica i agensi protiv stvaranja bora, protiv celulita i za zatezanje.

Pomenuti lipozomi mogu opciono da sadrže helper lipide, kao i u slučaju lipozoma koji sadrže jedinjenja formule (II).

Lipozomi koji sadrže jedinjenja formule (II) mogu se administrirati oralno ili parenteralno, intravenozno, intramuskularno, subkutano, transdermalno, ili u obliku nazalnih i za usta sprejova.

Ovde opisani pronalazak takođe se odnosi i na druge katjonske lipide opšte formule (III), koji su već poznati za različite upotrebe (EP 559 625, pomenut gore). U skladu sa ovim pronalaskom, jedinjenja formule (III) su estri L-karnitina, korisni za dobijanje lipozoma, koji poseduju snažnu aktivnost u poboljšanju oslobađanja leka i poseduju karakteristike stabilnosti i selektivnosti stizanja do targetiranog organa, uporedne sa istima jedinjenja formule (I), koja su opisana gore.

Ova jedinjenja imaju opštu formulu (III):

gde su

R5je zasićeni li nezasićeni acil, ravnog ili račvastog lanca, sa 4-26 atoma ugljenika;

R6je zasićeni li nezasićeni alkil, ravnog ili račvastog lanca, sa 4-26 atoma

ugljenika; i

X" anjon farmakološki prihvatljive kiseline,

pod uslovom da:

ukoliko je R5stearoil, da R6nije stearil,

ukoliko je R5oleoil, da R6nije stearil,

ukoliko je R5palmitoil, da R6nije palmitil,

ukoliko je R5miristoil, da R6nije miristil,

ukoliko je R5lauroil, da R6nije lauril,

ukoliko je R5oleoil, da R6nije oleil.

Ova isključena jedinjenja su opisana u obliku lipozoma uJ. Med. Chem.1988, 41, 2207-2215, isključivo za distribuciju gena.

Poželjni primeri R5su nonanoil, dodekanoil, miristoil, palmitoil, stearoil ili oleoil.

Poželjni primeri R6su nonil, undecil, tetradecil, heksadecil ili oleil.

Poželjni primeri jedinjenja formule (III), opisani u ovom pronalasku su:

palmitoil L-karnitinhlorid undecilestar (ST 983);

stearoil L-karnitinhlorid undecilestar (ST 1055);

stearoil L-karnitinhlorid tetradecilestar (ST 1351);

palmitoil L-karnitinhlorid tetradecilestar (ST 1379).

Jedinjenja formule (III) su korisni agensi za distribuciju prirodnih ili modifikovanih plazmida ili nukleotida korisnih u genskoj terapiji ili koji kodiraju peptid ili protein koristan kao vakcina.

Jedinjenja formule (III) mogu se administrirati oralno ili parenteralno, intravenozno, intramuskularno, subkutano , transdermalno, ili u obliku nazalnih i za usta sprejova.

Procedura za dobijanje jedinjenja formule (I), u skladu sa ovim pronalaskom, predstavljena je reakcionim dijagramom koji sledi, sa namerom da se taj dijagram primenjuje na celokupnu opštu formulu (I). Verzirana osoba može lako da dobije sve grupe koje označavaju R, Rii R2, zato što su svi neophodni reagensi pristupačni ili opisani u literaturi, a uslovi reakcije su opšte primenljivi na čitav obim ovog pronalaska, tako da se bilo koja modifikacija, ukoliko je neophodna, normalno postiže unutar okvira opštih znanja.

Pozivajući se na gornji reakcioni dijagram 1, dobijanje jedinjenja formule (I), u skladu sa ovim pronalaskom, je ilustrovano niže.

Primer 1

Pobijanje estra propionil L- karnitinbromida sa 2- hidroksiacetil- 1, 3- dipalmitoil

glicerinom ( ST 772)

a) Pobijanje 1, 3- dihidroksipropan- 2- on 1, 3- dipalmitata ( 1)

Rastvori se dihidroksiaceton (7 g, 0,078 mol) u 300 mL bezvodnog hloroforma,

na 0°C (spoljašnja temperatura), u struji bezvonog azota. Ovako dobijenom rastvoru u kapima se dodaju palmitoilhlorid (44 g, 0,16 mol) i bezvodni piridin (15 mL). Dobijena smeša, čija temperatura se dovede do temperature okoline, meša se 24 h.

Ova smeša se ekstrahuje sledećim redom: sa 300 mL vodenog rastvora 0,5% hlorovodonične kiseline, 300 mL vodenog rastvora 5% natrijum-bikarbonata i konačno, sa 300 mL vode. Odvojena organska faza se osuši sa bezvodnim natrijum-sulfatom, filtrira kroz celulozni filter i koncentriše do suva, dajući sirovi proizvod (1). Čist proizvod se dobija kristalizacijom iz 500 mL etilalkohola.

Pobije se 30,4 g proizvoda (1). Prinos 73%. Temp. toplj. 80.81°C.

<1>H-NMR (CDCI3): 0,9 (6H, t, CjHaCHr); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m;

-OCOCH2CH2-); 2,4 (4H, t, -OCOCH2-); 4,7 (4H, s, -OCCHz-l

b) Pobijanje 1, 2, 3- trihidroksipropan- 1, 3- dipalmitata ( 2)

Uz mešanje, lagano se dodaje voda (7,5 mL) proizvodu (1) (5 g, 9 mmol)

rastvorenom u tetrahidrofuranu (125 mL) i toluenu (25 mL). Temperatura dobijene mlečno bele suspenzije se dovede na 5°C (spoljašnja temperatura), pa se u malim porcijama dodaje natrijum-borohidrid (500 mg, 13 mmol). Ova suspenzija se 30 min meša na 5°C. Zatim se lagano dodaje glacijalna sirćetna kiselina, sve dok ne prestane da se izdvaja gas, usled razgradnje viška natrijum-borohidrida, tako da se na kraju dobije rastvor.

Ovom rastvoru se doda hloroform (100 mL), tako da se stvori dvofazni sistem. Odvoji se donja, organska faza koja sadrži CHCI3, pa se ekstrahuje sledećim redom: vodom (25 mL), natrijum-bikarbonatom (25 mL, 10% vodeni rastvor) i vodom (25 mL).

Organski rastvor, koji sadrži (2), se osuši natrijum-sulfatom, filtrira i koncentriše do suva, dajući proizvod nalik vosku. Proizvod (2) se dobija kristalizacijom iz acetona ovog proizvoda nalik vosku.

Dobije se 4,8 g proizvoda (2). Prinos 94%. Temp. Toplj. 71-72°C.

<1>H NMR (CDCI3): 0,9 (6H, t, CH3CH2-); 1,3 (48H, m, (VH2)n=24); 1,55 (4H, m,

-OCOVH ?CH2-): 2,4 (4H, t, -OCOCH?-): 4,2 (5H, m, - CHCH?Q-).

c) Pobijanje 1, 3- dipalmitoil- 2- bromoacetil glicerola ( 3)

Uz mešanje na 0°C (spoljašnja temperatura), rastvori se proizvod (2) (2,5 g, 4,4

mmol) u bezvodnom hloroformu (50 mL). Ovom rastvoru se lagano dodaje piridin (0,42 mL), pa u kapima rastvor bromoacetilhlorida (0,43 mL, 5,2 mmol) u 3 mL hloroforma. Reakciona smeša se 30 min drži na 0°C (spoljašnja temperatura), pa 30 min na temperaturi okoline.

Reakciona smeša se zatim tretira sledećim redom: sa vodenim rastvorom 1% hlorovodonične kiseline (pribl. 50 mL), vodenim rastvorom 5% natrijum-bikarbonata (pribl. 50 mL) i vodom.

Proizvod (3) se prečisti kristalizacijom iz acetona, a zatim se reakciona smeša osuši (natrijum-sulfat) i koncentriše do suva.

Pobije se 2,5 g proizvoda (3). Prinos 89%. Temp. Toplj. 46-47°C.

<1>H NMR (CDCI3): 0,9 (6H, t, CH3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCH9CH7-); 2,4 (4H, t, -OCOCHU-); 3,9 (2H, s, -OCHzCOO-); 4,2-4,4 (5H, m,

-CH2CH2O-); 5,25 (1H, m, CHCH2O-).

d) Pobijanje estra L- propionil karnitinbromida sa 2- hidroksiacetil- 1, 3-dipalmitoilglicerolom ( 4)

Unutrašnja so L-propionil karnitina (0,95 g, 4,4 mmol), ranije osušena pod vakuumom na 40°C, suspenduje se u bezvodnom dimetilformamidu (pribl. 20 mL). Ovoj suspenziji se dodaje u malim porcijama proizvod (3) (3 g, 4,7 mmol). Suspenzija se lagano zagreva do 38°C i drži pod tim uslovima sve dok se ne dobije rastvor.

Posle 10 min ovaj rastvor se dovede na 0°C i drži 30 min. Dobije se talog koji se filtrira i opere etiletrom, pa rastvori u hloroformu (100 mL). Dobijeni opalescentni rastvor (30 mL) se filtira kroz Celite, pa se koncentriše. Ovom poslednjem rastvoru se doda heksan (100 mL), a istaloženi dobijeni proizvod (4) se filtrira i suši pod vakuumom na 35°C.

Dobije se 3,19 g tritisanog jedinjenja. Prinos 80%. Temp. toplj. = 127-128°C.

[a]<25>D= - 3,9 (C=1% hloroform). Elementarna analiza ca C47H88BrNOio:

<1>H NMR (CDCI3): 0,9-0,95 (6H, t, CH3CH2CH2-); 1,1-1,2 (3H, t, CHsCHsCO); 1,2-1,4 (14H, m, (CH2)n=24); 1,5-1,6 (4H, m, -OCCH 7CH2-1; 2,3-2,4 (4H, t, -OCCH2CH2-); 2,4-2,45 (4H, dd, CHCJH2O-); 2,95 (2H, d, -CHzQCOCH?-); 3,5 (9H, s, N(CH3)3); 4,2 (4H, m, -CHpOCOCH?-): 4,35 (2H, m, -CH2N-); 4,65 (2H, dd, -OCH2CO-); 5,25 (1H, m, -OCH?CH2CH70-); 5,75 (1H, m, -CH2-CH?N-).

Primeri 2- 7

Sledeća jedinjenja su dobijena na isti način kao u prethodnom primeru: estar L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmatoilglicerolom

(ST 770);

estar acetil L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmatoilglicerolom

(ST 771);

estar izobutiril L-kamitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmatoilglicerolom

(ST 773);

estar izovaleril L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmatoilglicerolom

(ST 774);

estar L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetilglicerolom

(ST 810);

estar acetil L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetilglicerolom

(ST 809);

propionil L-karnitinbromidni estar sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetilglicerolom

(ST 808).

Jedna poželjna realizacija pronalaska koji je ovde opisan, sastoji se u dobijanju lipozoma sa antikancernim lekovima i naročito lipozoma koji deluju kao nosači za kamptotecine, na primer one koji su opisani u WO 97/31003. U poželjnijoj realizaciji, ovde opisan pronalazak daje lipozome za oslobađanje kamptotecina opšte formule (IV):

gde su:

R7je -C(R11)=N-0(r1)Rio grupa, u kojoj je

Riovodonik ili CrCsalkil ili CrC5alkenil ravna ili račvasta grupa, ili C3-Ciocikloalkil grupa, ili ravna ili račvasta (C3-Ci0)cikloalkil(CrC5)alkil grupa, ili C6-Ci4aril, ili ravna ili račvasta (C6-Ci4)aril(Ci-Cs)alkil grupa, ili heterociklična grupa, ili ravna ili račvasta heterociklična-(C-i-C5)alkil grupa, gde pomenuta heterociklična grupa sadrži najmanje jedan heteroatom koji se bira između atoma azota, opciono supstituisanog sa (Ci-C5)alkil grupom, i/ili atoma kiseonika i/ili atoma simpora; a pomenute alkil, alkenil, cikloalkil, aril, aril-alkil, heterociklil ili heterociklil-alkil grupe su opciono supstituisane sa drugim grupama koje se biraju između: halogen, hidroksi, Ci-C5alkil, CrCsalkoksi, fenil, cijano, nitro, -NRi2R-i3, gde su R-i2 i R13, koji mogu biti isti ili različiti, vodonik, ravan ili račvast (CrC5)alkil, -COOH grupa ili jedan od njenih farmaceutski prihvatljivih estara; ili -CONR14Ri5grupa, gde su R14i R15, koji mogu biti isti ili različiti, vodonik, ravan ili račvast (Ci-C5)alkil; ili

R10je C6-Cioaroil ostatak, opciono supstituisan sa jednom ili više grupa koje se biraju između: halogen, hidroksi, ravan ili račvast d-Csalkil, ravan ili račvast C-i-Csalkoksi, fenil, cijano, nitro, -NR-|6Ri7, gde su R^ i R17. koji mogu biti isti ili različiti, vodonik, ravan ili račvast C1-C5alkil; ili

R10je poliaminoalkil ostatak; ili

R10je glikozil ostatak;

n je broj 0 ili 1;

R-11 je vodonik, ravan ili račvast C-i-Csalkil, ravan ili račvast d-Csalkenil, C3-Ci0cikloalkil, ravan ili račvast (C3-Cio)cikloalkil-(CrC5)alkil, C6-Ci4aril,

ravan ili račvast (C6-Cio)aril-(CrC5)alkil;

Rai R9koji mogu biti isti ili različiti, su vodonik, hidroksi, ravan ili račvast CrCsalkoksi;

njihove Ni-okside, pojedinačne izomere, naročito sin i anti izomere -C(Rn)=N-0(n)Riogrupe, njihove moguće enantiomere, dijastereomere i sa njima povezane smeše, njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove aktivne metabolite.

Jedinjenja formule (IV) su opisana u European Patent Application 99 830124.6, podnetoj 9. marta 1999.

Što se tiče jedinjenja formule (IV) u kojima je n jednako 1, a R10je definisano gore, izuzimajući aroil, ova jedinjenja se mogu dobiti polazeći od kamptotecin 7-aldehida (formula IVa, u kojoj je Rnvodonik), ili kamptotecin 7-keto (formula IVa, u kojoj se Rnrazlikuje od vodonika).

gde su

R7je -C(Rii)=0 grupa, a Rnje definisano u formuli (IV),

R8i Rg su definisani u formuli (IV).

Jedinjenje formule (IVa) reaguje sa jedinjenjem formule (Va) Ri0O-NH2, gde je R10isto kao gore, dajući jedinjenje formule (I) u kome je R7-C(Rn)=N-0-Riogrupa, gde je R-io definisano u formuli (IV), izuzimajući aroil.

Ova reakcija se može voditi konvencionalnim postupcima koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti, a proces se sastoji u normalnom stvaranju oksima. Poželjno je da molski odnos kamptotecin 7-aldehida ili 7-keto prema hidroksilaminu bude u opsegu 1:3 do 3:1. Mogu se koristiti takođe i relevantne soli hidroksilamina. Reakcija se obavlja u prisustvu baze, na primer, organske baze kao što je trietilamin ili diazabiciklononan, koristeći polarne rastvarače, poželjno metanol ili etanol, vodeći reakciju na temperaturi između temperature okoline i temperature ključanja rastvarača, opciono u prisustvu sredstava za dehidrataciju, npr. natrijum- ili magnezijum-sulfata, molekulskih sita. Ukoliko je potrebno, reakcija se može obavljati takođe u prisustvu katalizatora, npr. Lewis-ove kiseline.

Alternativno, gore-pomenuta jedinjenja se mogu dobiti iz oksima kamptotecin 7-aldehida (dobijenog kao što su opisali Sawada et al., uChem. Pharm. Bull.1991, 39, 2574), ili iz 7-ketona ili iz odgovarajućeg 7-acilkamptotecina, reakcijom sa RioX halidom, gde je X poželjno jodid, u polarnom rastvaraču, npr. tetrahidrofuranu ili alkoholima, u prisustvu baze, npr. natrijum-hidrida ili kalijum-karbonata.

Što se tiče jedinjenja formule (IV) u kojima n predstavlja 1, a R10 je aroil, kao što definiše formula (IV), ova jedinjenja se mogu dobiti polazeći od kamptotecin 7-oksima, čije dobijanje je opisano u prethodnom pasusu, sa R10-COCI acilhloridima, u polarnim rastvaračima i u prisustvu baze, poželjno piridina, ili direktno u piridinu, kao što su opisali Cho et al., uJ. Org. Chem.1997, 62, 2230.

Što se tiče jedinjenja formule (IV) u kojima n predstavlja 0, a Rioje definisano gore, izuzimajući aroil, ova jedinjenja se mogu dobiti polazeći od kamptotecin 7-aldehida (formula IVa, Rnje vodonik), ili kamptotecin 7-keto (formula IVa, Rnrazličit od vodonika).

gde je R7-C(Rn)=0 grupa, a Rnje definisano u formuli (IV), dok su R8i R9definisani u formui (IV). Jedinjenje formule (IVa) reaguje sa jedinjenjem formule (Va) R10-NH2, gde je R10definsiano gore, dajući jedinjenja formule (IV) u kojima je R7-C(Rn)=N-Riogrupa, a R10je definisano u formuli (IV), izuzimajući aroil. Ova reakcija se može voditi konvencionalnim postupcima koji su poznati stručnjacima u farmaceutskoj tehnologiji, u procesu koji se sastoji od normalnog stvaranja imina. Poželjno je da molski odnos kamptotecin 7-aldehida ili 7-keto prema iminu bude u opsegu 1:3 do 3:1. Mogu se takođe koristiti relevantne soli amina. Ova reakcija se vodi u prisustvu baze, na primer, neorganske baze, kao

što je kalijum-karbonat, ili organske baze, kao što su trietilamin ili diazabiciklononan, koristeći polarne rastvarače, poželjno metanol ili etanol, i vodeći reakciju na temperaturi koja se kreće od temperature okoline do temperature ključanja rastvarača, opciono u prisustvu sredstva za dehidrataciju, npr. natrijum- ili magnezijum-sulfata, molekulskih sita. Ukoliko je potrebno, ova reakcija se mode takođe voditi u prisustvu katalizatora, npr. Lewis-ove kiseline, kao što su opisali na primer, Moretti i Torre, uSynthesis1970, 141; ili Kobavashi etal., uSynlett.1977, 115).

Kamptotecin 7-aldehid i kamtotecin 7-oksim su opisani u European Patent Application EP 0056692 i u gore citiranom članku, Savvada et al.,Chem. Pharm. Bull.1991, 39, 2574.

Nroksidi jedinjenja formule (IV) se dobijaju u skladu sa poznatim postupcima oksidacije heteroaromatičnog azota, poželjno oksidacijom sa sirćetnom ili trifiuorosirćetnom kiselinom i vodonik-peroksidom, ili reakcijom sa organskim peroksikiselinama (A.Albini i S.Pietra,Heterocyclic N- oxides,CRC, 1991).

U pogledu varijabilnog značenja Rio, koji je prisutan u različitim formulama V regenasa, ovi reagensi su komercijalno pristupačni, ili se mogu dobiti postupcima koji su poznati iz literature, na šta se može osloniti stručnjak u ovoj oblasti, kao na dodatak njegovom ili njenom poznavanju ove tematike.

Farmaceutski prihvatljive soli se dobijaju po konvencionalnim postupcima koji su opisani u literaturi i koji ne zahtevaju dodatno opisivanje.

Primer 8

7- benziloksiiminometilkamptotecin ( CPT 172)

Rastvori se 500 mg (1,33 mmol) 7-formilkamptotecina u 100 mL etanola. Doda se 15 mL piridina i 638 mg (4 mmol) O-benzilhidrksilamin hidrohlorida. Ovaj rastvor se refluksuje 5 h. Rastvarač se ispari pod vakuumom, a tako dobijeni ostatak se prečisti fleš hromatografijom na silikagelu, koristeći smešu 4:6 heksan/etilacetat, kao eluent.

Prinos 65%. Temp. Toplj. 200-205°C (razl.).

Dobijeni proizvod se sastoji od približno 8:2 smeše dva izomera, sin i anti (izomer A: Rf 0,32; izomer B, Rf 0,19, na silikagelu Merck 60 F254; eluent: heksan:etilacetat 3:7).

HPLC: analiza je obavljena na aparatu opremljenom sa kvatemernom pumpom (HP 1050), Rheodvne injektorom (petlja od 20 uL) i detektorom sa diodom (HP 1050), koji vodi program HPLC-ChemStation. Akvizicija spektara je obavljena od 200 do 600 nm, a hromatogrami su registrovani na 360 i 400 nm.

Kolona C18 sa reversniom fazom (Rainin C18; 25*0,4 cm, Varian), korišćena je sa pred-kolonom RP18. Analiza je obavljena eluiranjem sa linearnim gradijentom, polazeći od acetonitrihvoda 30:70, pa do 100% acetonitrila, tokom 20 min, uz protok 1 mL/min. Retenciona vremena su bila: 12,51 min za izomer B i 14,48 min za izomer A.

<1>H NMR (300 MHz; DMSO-d6): 5 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 8m (H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+ -OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A + Ar B+H-14A+H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H-9B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N

A).

Maseni m/z 481 (M<+>100), 374 (30), 330 (70), 300 (30), 273 )20), 243 )20) 91 (34).

Primer 9

7- butoksiiminometilkamptotecin ( CPT 184)

Rastvori se 400 mg (1,06 mmol) 7-formilkamptotecina u 80 mL etanola. Doda se 12 mL piridina i 400 mg (3,18 mmol) O-t-butilhidroksilamin hidrohlorida. Ovaj rastvor se 4 h refluksuje. Rastvarač se ispari pod vakuumom, a ostatak se prečisti fleš hromatografijom na silikagelu, koristeći kao eluent 4:6 smešu heksan/etilacetat.

Dobije se 322 mg (0,72 mmol) žute čvrste supstance. Prinos 68%. Temp. toplj. 250°C (razl.).

Ovaj proizvod se sastoji od približno 8:2 smeše dva izomera, sin i anti (izomer A: Rf 0,31; izomer B: Rf 0,24, silikagel Merck 60 F254; eluent heksan:etilacetat 3:7).

HPLC: analiza se obavljena na aparatu opremljenom sa kvaternernom pumpom (HP 1050), Rheodvne injektorom (petlja od 20 uL) i detektorom sa diodom (HP 1050), koji vodi program HPLC-ChemStation. Akvizicija spektara je obavljena od 200 do 600 nm, a hromatogrami su registrovani na 360 i 400 nm.

Kolona C18 sa reversniom fazom (Rainin C18; 25x0,4 cm, Varian), korišćena je sa pred-kolonom RP18. Analiza je obavljena eluiranjem sa linearnim gradijentom, polazeći od acetonitril.voda 30:70, pa do 100% acetonitrila, tokom 20 min, uz protok 1 mL/min. Retenciona vremena su bila: 12,92 min za izomer B i 14,61 min za izomer A.

<1>H NMR (300 MHz; DMSO-d6): 5 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, t-but-B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H2-19A+H219B), 5,18 (s, H2- 5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A+ -OH B), 7,35 (s, H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69-7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9 B), 8,16-8,27 (m, H-pA+H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).

Maseni m/z 448 (M<+>28), 392 (40 ), 374 (100), 362 (40), 330 (34), 57 (17).

Pobijanje lipozoma

Jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom mogu se koristiti za pripremanje multilamelarnih lipozoma (MLV) i unilamelarnih lipozoma (SUV), oba u obliku suvih prahova i suspenzija u vodenim rastvorima.

Jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom, dobijena kao što je opisano u Primerima 1-7, koriste se za pripremanje lipozoma po sledećoj proceduri. Podesna količina ovog jedinjenja se rastvori u hloroformu; ovaj rastvor se koncentriše na rotacionom uparivaču pod vakuumom do suva, dok se ne dobije film lipida. Ovaj film lipida se suši pod visokim vakuumom, sve dok se ne uklone i poslednji tragovi rastvarača, pa se zatim rastvori u ferc-butilalkoholu, ili sa vodom. Tako dobijeni rastvor se liofilizuje, dajući mek, suvi prah.

Ovi prahovi se hidratišu sa podesnom količinom vodenog rastvora, dajući lipozom korišćenog jedinjenja, koji se zatim kompleksira sa polinukleotidom ili sa željenim lekom.

Drugi postupak pripremanja lipozoma se sastoji u adsorbovanju filma lipida, koji se sastoji od jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom, u rastvaraču, na podesnom inertnom nosaču, kao što je sorbitol, manitol ili drugi farmakološki prihvatljivi ugljeni hidrati. Ova smeša se suši pod vakuumom, dajući čvrstu supstancu koja se može lako i vrlo brzo hidratisati pred upotrebu.

Preparati u obliku suvih prahova imaju prednost što su stabilni u dužim periodima i jednostavni su za upotrebu.

Pored toga, jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom se mogu koristiti za pripremanje lipozoma kompleksiranih sa DNK ili sa željenim lekom, u obliku suvih prahova, u skladu sa sledećom procedurom. Jedinjenje u skladu sa ovim pronalaskom se rastvori u terc-butilalkoholu ili sa vodom; tako dobijeni rastvor se pomeša sa DNK ili željenim lekom, pa se ta smeša liofilizuje, dajući kompleks koji se može definisati kao prolipozom-DNK ili prolipozom-lek, u obliku mekog, suvog praha.

Ovako dobijeni prahovi (prolipozomi) se mogu koristiti za dobijanje farmaceutskih preparata koji se mogu administrirati kao aerosol, ili koji, alternativno, kada se rekonstituišu sa vodom, ili podesnim puferskim rastvorom, mogu da se administriraju parenteralno ili oralno.

Lipozomi kompleksirani sa DNK ili sa lekovima, u čvrstom obliku, mogu se takođe dobiti po postupku adsorpcije filma lipida na inertni nosač, kao što je sorbitol, manitol ili drugi ugljeni hidrati, po postupku koji je opisan gore.

Testiranje stvaranja lipozoma

Stvaranje lipozoma se testira kolorimetrijskom metodom, koristeći boje rastvorne u vodi, u skladu sa sledećom procedurom. Pripremi se vodeni rastvor boje rastvorne u vodi Arsenazo III (mol. masa 776,37 kg/mol; 2,3 mg/mL). Ovaj rastvor se koristi umesto vode za hidratisanje filmova lipida koji se dobije gore-opisanim postupkom. Alikvot suspenzije, koja sadrži lipozom u kome je zarobljena boja, razblaži se 100-struko vodom.

Koriste se 2 mL suspenzije lipozoma za dobijanje prvog čitanja optičke gustine na 660 nm; ovo čitanje se dobija u odnosu na isto tako definisani uzorak kao šlepu probu. U prvi uzorak se doda 200 uL rastvora CaCI2(15 mg/mL; 100 mM) kome se doda 200 uL vode, pa se meri optička gustina na 660 nm u odnosu na šlepu probu. Dobijene vrednosti absorbancije se označe kao čitanje 2. Nastavi se sa dodavanjem uzorku 100 uL rastvora Triton X-100 (5 vol%; 0,26% konačna koncentracija) i slepoj probi 200 pL vode; čitanja optičke gustine na 660 nm su dale vrednost optičke gustine označenu kao čitanje 3. Da bi se izračunao procenat zarobljene boje u lipozomu, koristi se sledeća formula:

% zarobljene boje = (Čitanje 3 - Čitanje 2)* 100 / Čitanje 3

Procenat zarobljene boje daje meru stvaranja lipozoma i u prošeku je 40%; provera veličine lipozoma obavlja se korišćenjem metode rasipanja laserskog zraka sa pozitivnim ishodom.

Primeri dobijanja lipozoma

Pobijanje lipozoma palmitoil L- karnitinhlorid undecilestra ( ST 983) u obliku:

a) liofilizovanih prahova

U balonu od 100 mL rastvori se 65 mg (0,11 mmol) palmitoil L-karnitinhlorid

undecilestra u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se isparava dok se ne stvori film lipida, koji se suši pod vakuumom 3 h. Ovako dobijeni proizvod se rastvori uterc-butilalkoholu, pa se ovaj rastvor brzo ohladi sa tečnim azotom na -70°C i liofilizuje 24 h. Dobije se sunđerast, mek, beli prah.

b) adsorbovanih prahova

Rastvori se 143 mg (0,231 mmol) palmitoil L-karnitinhlorid undecilestra u 10 mL

hloroforma. Ovako dobijeni rastvor se u malim porcijama presipa u balon od 100 mL koji sadrži 750 mg sorbitola. Na kraju dodavanja raznih porcija hloroformskog rastvora, hloroform se brzo ispari. Ovako dobijena čvrsta susptanca se 3 h suši pod vakuumom. Dobije se 893 mg čvrstog proizvoda. Pre upotrebe ovaj proizvod se brzo hidratiše sa podesnom zapreminom vode, da se dobije izotoničan rastvor.

c) suspenzije MLV

U balonu od 100 mL rastvori se 65 mg (0,11 mmol) palmitoil L-karnitinhlorid

undecilestra u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se isparava dok se ne stvori film lipida koji se 3 h suši pod vakuumom. Film lipida se hidratiše 3 h na 30°C sa 10 mL vode, dajući suspenziju MLV. Ova suspenzija MLV, podesno razblažena, kompleksira se sa polinukleotidom ili sa lekom i koristi u biološkim testovima.

e) Suspenzije SUV

U balonu od 100 mL rastvori se 65 mg (0,11 mmol) palmitoil L-karnitinhlorid

undecilestra u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se isparava dok se ne stvori film lipida, koji se 3 h suši pod vakuumom. Ovaj film lipida se hidratiše 3 h na 30°C sa 10 mL, dajući suspenziju MLV. Suspenzija MLV se 10 puta ekstrudira kroz polikarbonatni filter, sa veličnom pora 200 nm. Ovako dobijena unilamelarna

suspenzija lipozoma se kompleksira sa polinukleotidom ili lekom i koristi u biološkim testovima.

0 Testiranje fizičke stabilnosti lipozoma

Fizička stabilnost suspenzije lipozoma se testira pomoću turbidimetrije u periodu od 30 dana. Za svaku suspenziju koja se testira obavi se merenje absobancije na 600 nm u određenim vremenskim intervalima. Srednja vrednost merene absorbancije u vremenu 0 ostaje konstantna za sve testirane formulacije. Razmatrani molekuli daju saglasne vrednosti u razmatranim periodima vremena.

Suspenzije lipozoma MLV i SUV se mogu pripremiti kombinovanjem jedinjenja u skladu sa ovim pronalskom sa helper lipidima, kao što su holesterol, 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilholin (POPC) ili dioleilfosfatidilholin (DOPE).

Ova jedinjenja se kombinuju sa helper lipidima u svrhu dobijanja lipozoma sa stabilnijim membranama. U nastavku, u odeljku koji opisuje pripremanje lipozoma, dat je primer dobijanja u kome se jedinjenje u skladu sa ovim pronalaskom kombinuje sa helper lipidom, kao što je holesterol ili POPC.

Primeri dobijanja lipozoma za oslobađanje leka

Primer 10

Pobijanje taksol- ST 983 lipozoma MLV ( 1:40)

Rastvori se 20 mg (0,0234 mmol) taksola i 556 mg (0,9417 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć vakuum pumpe, doda se 20 mL ferc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 19 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži taksol (1,05 mg) i ST 983 (29,2 mg).

Da bi se dobila konačna suspenzija lipozoma, liofilizovani proizvod se hidratiše u trenutku upotrebe vodom (450 uL) ili drugim slanim rastvorima, pa meša 10 min i ostavi da se odmori 30 min, kako bi se dozvolilo kompletiranje procesa bubrenja (hidratacije). Dobijeni su lipozomi MLV.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata je testirana pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 800 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Testiranje hemijske stabilnosti taksola u preparatu

Hemijska stabilnost taksola je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: uBondpack C-18

Eluent: acetonitril-voda 70:30

Detektor: UV-VIS: 227 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 4,5 min

Koncentracija taksola, određena u odnosu na standard, bila je 2,13 mg/mL. Procenat zarobljenog taksola bio je 98%.

Primer 11

Pobijanje taksol- ST 983 lipozoma SUV

Rastvori se 20 mg (0,0234 mmol) taksola i 556 mg (0,9417 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć vakuum pumpe, doda se 20 mL rerc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 19 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži taksol (1,05 mg) i ST 983 (29,2 mg).

Da bi se dobila konačna suspenzija lipozoma SUV, liofilizovani proizvod, hidratisan sa rastvorom PBS (1 mL), sonikuje se 20 min na 0°C. Filtriranje se obavi kroz filter od 400 nm, kako bi se eliminisali oslobođeni tragovi titanijuma sa ultrazvučne probe ili sonikatora.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 800 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Testiranje hemijske stabilnosti taksola u preparatu

Hemijska stabilnost taksola je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: uBondpack C-18

Eluent: acetonitril-voda 70:30

Detektor: UV-VIS: 227 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 4,5 min

HPLC analiza suspenzije lipozoma SUV dala je iste rezultate kao i odgovarajuća suspenzija lipozoma MLV, a i u ovom slučaju je procenat zarobljenog taksola bio takođe 98%.

HPLC analiza, ponovljena posle 24 h, nije pokazala nove pikove koji se razlikuju od pika taksola, što ukazuje na stabilnost aktivnog sastojka.

Primer 12

Pobijanje taksol- ST 983- holesterol lipozoma ( 1:15)

Ovi tipovi lipozoma se pripremaju sa ciljem dobijanja kompleksa sa stabilnijim membranama.

Rastvori se 6 mg (0,0101 mmol) taksola, 62,2 mg (0,105 mmol) ST 983 i 40 mg holesterola u 10 mL hloroforma. Ovako dobijeni rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja i poslednjih tragova hloroforma pomoću pumpe za visoki vakuum, dodaju se 6,3 mLterc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 5 frakcija koje se odmah smrznu u tečnom azotu na -70°C i liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži taksol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) i holesterol (8 mg).

Da bi se dobila konačna suspenzija lipozoma, liofilizovani proizvod se hidratiše u vreme kada se koristi sa vodom (1000 uL) ili drugim slanim rastvorima, meša 10 min i ostavi da se odmori 30 min, kako bi se omogućilo kompletiranje procesa bubrenja (hidratacija). Dobije se lipozom MLV.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 800 nm, tokom 6 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Primer 13

Pobijanje taksol- ST 772 lipozoma SUV ( 1:70)

Rastvori se 20 mg (0,0234 mmol) taksola i 1485 mg (1,638 mmol) ST 772 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć pumpe za visoki vakuum, doda se 20 mL ferc-butilalkohola u film lipida. Pa bi se dobio bistar rastvor, potrebno je zagrevanje do 60°C. Ovaj rastvor se odmah smrzne u tečnom azotu na -70°C, i liofilizuje 24 h.

Pa bi se dobila konačna suspenzija lipozoma SUV, liofilizovani proizvod, hidratisan sa rastvorom PBS (20 mL), sonikuje se 20 min na 0°C. Filtriranje se obavi kroz filter od 400 nm, kako bi se eliminisali tragovi titanijuma oslobođeni sa ultrazvučne probe ili sonikatora.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 800 nm, tokom 6 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Primer 14

Pobijanje CPT 83- ST 983 lipozoma MLV ( 1:40)

Rastvori se 6,3 mg (0,0168 mmol) SPT 83 (7-karbonitril kamptotecin, opisan u WO 97/31003) i 400 mg (0,667 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma.

Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć vakuum pumpe, doda se 20 mL ferc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 12 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži CPT 83 (0,525 mg) i ST 983 (33,33 mg).

Pa bi se dobila konačna suspenzija lipozoma, liofilizovani proizvod se u vreme upotrebe hidratiše sa vodom (1000 uL) ili drugim slanim rastvorima, pa meša 10 min. Pobiju se lipozomi MLV.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TPC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 800 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Testiranje hemijske stabilnosti CPT 83 u preparatu

Hemijska stabilnost CPT 83 je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: uSupelcosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfatni pufermetanol, 40:60, pH=7,3

Detektor: UV-VIS: 360 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 4,033 min

Koncentracija CP 83, određena u odnosu na standard, bila je 0,502 mg/mL. Procenat zarobljenog CPT 83 bio je 99%.

Primer 15

Pobijanje CPT 83- ST 983 lipozoma SUV ( 1. 40)

Rastvori se 6 mg (0,0168 mmol) CPT 83 i 400 mg (0,667 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć pumpe za visoki vakuum, doda se 26 mL terc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 12 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži CPT 83 (0,515 mg) i ST 983 (33,33 mg).

Da bi se dobila konačna suspenzija lipozoma SUV, liofilizovani proizvod, hidratisan sa vodom (1000 uL), sonikuje se 40 min na 0°C. Filtriranje se obavi kroz filter od 400 nm, kako bi se eliminisali oslobođeni tragovi titanijuma sa ultrazvučne probe ili sonikatora.

Testiranje hemijske stabilnosti CPT 83 u preparatu

Hemijska stabilnost CPT 83 je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfatni pufermetanol 40:60, pH=7,3

Detektor: UV-VIS: 360 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 4,033 min

Koncentracija CPT 83, određena u odnosu na standard, bila je 0,3 mg/mL. Procenat zarobljenog CPT 83 bio je 59%.

HPLC analiza ponovljena posle 24 h nije otkrila druge pikove izuzev pika CPT 83, što ukazuje na stabilnost jedinjenja.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 600 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Primer 16

Pobijanje CPT 184- ST 983 lipozoma MLV ( 1:40)

Rastvori se 7,29 mg (0,0168 mmol) CPT 184 i 400 mg (0,677 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć vakuum pumpe, doda se 26 mL rerc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 12 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži CPT 184 (0,607 mg) i ST 983 (33,3 mg).

Pa bi se dobila konačna suspenzija lipozoma, liofilizovani proizvod se hidratiše u vremenu korišćenja sa vodom (1000 uL) ili drugim slanim rastvorima i meša 10 min. Pobiju se lipozomi MLV.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TPC (Time Prive Curve; krive vreme pobuda) na 600 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

Testiranje hemiiske stabilnosti CPT 184 u preparatu

Hemijska stabilnost CPT 184 je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfatni pufer:metanol, 40:60, pH=7,3

Detektor: UV-VIS: 360 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 25,5 min

Koncentracija CPT 184, određena u odnosu na standard, bila je 0,600 mg/mL. Procenat zarobljenog CPT 184 bio je 90%.

Primer 17

Pripremanje CPT 184- ST 983 lipozoma SUV ( 1:40)

Rastvori se 7,29 mg (0,0168 mmol) CPT 184 i 400 mg (0,677 mmol) ST 983 u 20 mL hloroforma. Ovaj rastvor se koncentriše dok se ne dobije film lipida na površini staklenog balona. Posle uklanjanja poslednjih tragova hloroforma uz pomoć pumpe za visoki vakuum, doda se 26 mL rerc-butilalkohola u film lipida, pa se tako dobijeni rastvor razdeli u 12 frakcija, koje se odmah smrznu tečnim azotom na -70°C, pa se liofilizuju 24 h. Svaka frakcija čvrste supstance sadrži CPT 184 (0,607 mg) i ST 983 (33,3 mg).

Da bi se dobila konačna suspenzija lipozoma SUV, liofilizovani proizvod se hidratiše sa vodom (1000 uL) i sonikuje 40 min na 0°C. Zatim se obavi filtriranje kroz filter od 400 nm da bi se eliminisali tragovi titanijuma oslobođenog sa ultrazvučne probe.

Testiranje hemiiske stabilnosti CPT 184 u preparatu

Hemijska stabilnost CPT 184 je testirana sa HPLC. Hromatografski uslovi su bili kako sledi:

Kolona: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfatni pufer.metanol, 40:60, pH=7,3

Detektor: UV-VIS: 360 nm

Protok: 1 mL/min

Retenciono vreme: 25,5 min

Koncentracija CPT 184, određena u odnosu na standard, bila je 0,36 mg/mL. Procenat zarobljenog CPT 184 bio je 70%.

HPLC analiza, ponovljena posle 24 h, nije pokazala druge pikove izuzev pika CPT 184, što ukazuje na stabilnost aktivnog sastojka.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije, uz registrovanje krive TDC (Time Drive Curve; krive vreme pobuda) na 600 nm, tokom 20 h na 20°C. Opažen je trend konstantnog turbiditeta, bez pojave taloženja, koji je indikativan za stabilnost preparata.

U primerima koji slede lipozomi su pripremani korišćenjem helper lipida i/ili krio-protekcionih agenasa.

Primer 18

Pobijanje CPT 184- ST 983 lipozoma

U balon od 2 L, doda se 100 mL metilhloroforma u 20 mg CPT 184 i 600 mg ST 983, pa se ova smeša lagano zagreva do potpunog rastvaranja. Pobijeni rastvor se koncentriše na rotacionom uparivaču dok se ne dobije film lipida, koji se još 2 h suši pod visokim vakuumom, uz pomoć pumpe. Film lipida se hidratiše sa rastvorom laktoze (6 g/300 mL vode) na 45°C, pa se ostavi da se 2 h meša u rotacionom uparivaču. Ova suspenzija se zatim sonikuje 2 h, a svaki ciklus traje pola sata. Nakon toga, proizvod se filtrira kroz filter od 200 nm i liofilizuje.

Testiranje hemijske stabilnosti CPT 184 u preparatu

Hemijska stabilnost CPT 184 se ustanovljava sa HPLC. Proizvod je bio stabilan tokom 24 h testa.

Testiranje fizičke stabilnosti preparata

Fizička stabilnost preparata se testira pomoću turbidimetrije. Proizvod je bio stabilan tokom 24 h testa. Veličina čestica je takođe bila stabilna (srednja vrednost 100 nm).

Primer 19

Pobijanje CPT 184- ST 983 lipozoma

Za 1 mL lipozomske formulacije (POPC - 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin, 5 mM: ST 983 1,25 mM; CPT 184 0,25 mM i trehaloza 150 mM) korišćena je sledeća procedura: rastvori se 0,11 mg (0,25 umol) CPT 184 u 250 uL etilacetata; rastvori se 3,79 mg (4,89 umol) POPC u 100 uL etanola, i rastvori se 0,74 mg (1,25 umol) ST 983 u 100 uL etanola. Ova tri rastvora se sjedine zajedno, pa se snažno mešaju. Rastvarači se otpare na rotacionom uparivaču, na sobnoj temperaturi, pod 80 mbar. Film lipida se suši 2 h u tami. Film lipida se suspenduje u 1 mL 150 mM rastvora D(+)-trehaloza dihidrata (Fluka, HPLC 99%), steriliše kroz filter od 0,22 nm i snažno meša 2 min. Ova suspenzija se ekstrudira kroz polikarbonatne filtere od 200 nm. Suspenzija ekstrudovanog lipozoma se smrzne u tečnom azotu, pa se 2 noći liofolizuje. Pobije se bela čvrsta supstanca.

Antikancerna aktivnost kompleksa ST 983 lipozom- antikancerni agens

Kao što će se videti niže, ST 983 lipozom pokazuje dominantnu akumulaciju na nivou pluća. Ova karakteristika specifičnosti po mestu promoviše njegovu upotrebu za pulmonarnu karcinogenezu, na modelu glodara roda muridae.

Antikancerni agens koji je korišćen u ovom eksperimentu bio je taksol (taxol).

Pa bi se indukovao tumor in vivo, miševi Balb/c su primili bez anestezije injekcije sa 3*10<5>ćelija pulmonarnog karcinoma glodara roda muridae M 109, u 0,1 mL RPMI-1640 (Sigma), u kvadriceps femorisa desne zadnje šape.

Dest dana posle implantacije tumora, kompleks lipozom-taksol se razblaži slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS, Sigma, P-4417), pa injektira intravenozno, u koncentraciji 2,5 mg/mL ST 983 i 75 ug/mL taksola.

Taksol (paklitaksel INDENA), koji je korišćen kao kontrola, rastvoren je u tečnom nosaču kremofor EL (BASF) u koncentraciji 20 mg/mL, pa je čuvan na +4°C tokom sledeća 24 h, zaštićen od svetla. U vremenu upotrebe, razblaži se slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS; SIGMA) i ista zapremina intravenozno injektira, sa koncentracijom koja je opisana za taksol koga transportuje ST 983 lipozom.

Kremofor je pripremljen razblaživanjem 1:1 sa etilakoholom.

Administriranje se obavlja uzastopno sedam dana, počevši od 10. dana nakon inokulacije tumora. Životinje su držane pod opservacijom do 17 dana nakon inokulacije, pa su žrtvovane cervikalnom dislokacijom, a njihova pluća su izvađena zbog određivanja broja metastaza. Bojenje pluća radi otkrivanja metastaza je obavljeno inkubiranjem pluća 10 dana u 5 mL Bouin-ovog rastvora, koji sadrži 71% rastvora zasićene pikrinske kiseline, 4,8% glacijalne sirćetne kiseline (Merck) i 24% 19% formaldehida (Fluka). Na kraju inkubacionog perioda u Bouin-ovom rastvoru, brojani su brojevi metastaza.

U poređenju sa netretiranim kontrolnim miševima, taksol koji je transportovan pomoću kremofora nije pokazao efekat smanjenja broja pulmonamih metastaza, mada je isti bio manji nego kod netretiranih kontrola, dok je taksol kompleksiran sa ST 983 lipozomom pokazao značajno smanjenje i u broju i u veličini pulmonarnih metastaza.

Statistička analiza podataka u pogledu broja plućnih metastaza je obavljena korišćenjem Mann-Whitney ne-parametarskih testova za nesparene podatke.

Dobijeni rezultati su prikazani u Tabeli 1 niže.

Testovi toksičnosti su urađeni na ćelijama HeLa i M109 u pločama sa 96 bazenčića. Na dan posle zasejavanja, ćelije su tokom sledećih 48 h tretirane sa molekulima koji se testiraju. Ćelije se zatim operu sa PBS i ostave 48 h pod normalnim uslovima rasta. Posle uklanjanja medijuma za rast, ćelije se inkubiraju na ledu sa 16% TCA, tri puta operu vodom, tretiraju 30 min sa sulforhodaminom B (SRB) u 1% sirćtenoj kiselini, operu 3 puta u samoj 1% sirćetnoj kiselini, inkubiraju 20 min u 10 mM TRIS pH 10,5, i konačno, obave se čitanja na 540 nm.

Testovi citotoksičnosti sa CPT 83

Testovi citotoksičnostiin vitrosa CPT 83 obavljeni su sa ciljem vrednovanja citotoksičnosti antikancernog agensa kompleksiranog s lipozomom, kao preliminarne indikacije za efikasnu aktivnost.

Da bi se vrednovala sposobnost lipozoma da transportuje CPT 83in vitrou ćelije M109, koristi se gore opisani test sa sulforhodaminom B.

Pored toga, citotoksičnost CPT 83, rastvorenog u dimetilsulfoksidu (DMSO), vrednovana je takođe u poređenju sa istim molekulom, kompleksiranim sa ST 983 lipozomom.

Kompleks lipozom-CPT 83 je korišćen u testovima citotoksičnosti pri koncentracijama naznačenim u Tabelama 2.1, 2.2 i 2.3, u nastavku, u obe konfiguracije, SUV i MLV. Korišćen je odnos lipozom.CPT 83 40:1.

Srednje vrednosti citotoksičnosti kompleksa ST 983-CPT 83 u obe konfiguracije, SUV i MLV, date u Tabelama 2.1, 2.2 i 2.3 u nastavku, pokazuju da je ST 983 lipozom u stanju da transportuje CPT 83 uglavnom na isti način kao i DMSO, dajući nivoe citotoksičnosti istog reda veličina.

Biološka aktivnost kompleksa ST 983 lipozom- CPT 184

Testirana je biološka aktivnost lipozoma iz Primera 18 (u nastavku se naziva lipozom A) i iz Primera 20 (u nastavku se naziva lipozom B).

Toksičnost kod zdravih miševa

U poređenju sa slobodnim CPT 184, Lipozomi A i B se daju oralno, intravenozno, sa dozom od 1,2 mg/kg, po shemi q4d*4. Ova dva lipozoma nisu imala značajne efekte na telesnu težinu, pluća, slezinu i bubrege. Lipozom B davan intravenozno, a lipozom A oralno, uticali su na težinu timusa slično slobodnom CPT 184. Intravenozni A je imao minimalni efekat. Hematološki parametri nisu pokazivali značajne varijacije nakon 24 h, u slučaju oba lipozoma. Lipozom A, intravenozno, davan u skladu sa shemom qd5, pokazao je toksičnost, u poređenju sa slobodnim CPT 184.

Tropizam pluća usled lipozoma

Lipozomi A i B su pokazivali dominantnu akumulaciju na pulmonarnom nivou. Ovi lipozomi su davani sa 1,2 mg/kg. Slobodan CPT 184 je davan oralno, sa 1,2 mg/kg, u DMSO. Životinje, zdravi miševi, se žrtvuju 24 h nakon poslednjeg administriranja. Izvade se pluća iz tela i smrznu u tečnom azotu. Kada se otope, organi se sakupe i homogenizuju u 0,1% sirćetna kiselina/acetonitrilu 1:5. Homogenati se podele u tri alikvota, a u dva od njih se doda CPT 184 za obnovu računanja. Ova tri uzorka se centrifugi raj u 5 min sa 16.000 g. Sakupe se gornji bistri rastvori i ekstrahuju dihlorometanom. Organska faza se osuši sa Speedvac-om, a ostatak se ponovo rastvori u acetonitrilu, kako bi se dobila količina koja odgovara jednoj životinji u 50 uL, za punjenje HPLC. HPLC se obavlja u koloni VVaters Symmetry C18 3,5um (4,6x7,5mm). Merck-ov fluorimetar je bio detektor za ekscitaciju na 370 nm i emisije na 510 nm. Eluent je bio voda/acetonitril 60:40, izokratičan. Zapremina uzorka bila je 50 uL. Regeneracija CPT 184 bila je oko 70%. Oba lipizoma, A i B, dala su nivo akumulacije za CPT 184 veći od slobodnog CPT 184 u DMSO, kao što pokazuje slika 3.

Oslobađanje gena

Pobijanje kompleksa lipozom- PNK

Lipozom i plazmid DNK se odvojeno podesno razblaže u PBS. Zatim se doda PNK lipozomu, a komleks lipozom-PNK se ostavi približno 30 min na 4°C, da bi se olakšalo stvaranje stabilne interakcije lipozom-PNK.

U eksperimentimain vitro,kao referentni katjonski lipid koristi se 1,2-dioleoiloksi-3-trimetilamonijumpropan (POTAP); 2,5 pg plazmida PNK se koristi na 2x10<5>ćelija HeLa, a koncentracija lipozoma je bila 9 uM.

U eksperimentimain vivo,kao referentni katjonski lipidi korišćeni su i POTAP i [2,3-(dioleoil)propil]trimetilamonijum (POTMA)].

Molski odnosi, definisani u rezultatima, odnose se na nmol-ske koncentracije respektivnih katjonskih lipida, po mg PNK.

U eksperimentima transfekcijein vivo,korišćeno je 25 pg plazmida DNK po životinji.

Plazmid pCMVIuc, korišćen u ovim eksperimentima, sadržao je cPNK gena luciferaze pod transkripcionom kontrolom promotera citomegalovirusa (CMV).

Kvantitativno određivanje aktivnosti luciferaze

Aktivnost proteina luciferaze u ćelijama i tkivima se određuje korišćenjem kompleta Boehringer Mannheim (katal. Broj 1669 893).

Ćelije se tri puta operu u PBS, pa se uklone sa ploča pomoću strugača u pufer za lizu (100 mM kalijum-fosfat, pH 7,8 1 mM ditiotreitol - DTT), pa se podvrgnu trima uzastopnim ciklusima smrzavanje-otkravljivanje. Posle centrifugiranja u Eppendorf-ovim epruvetama od 1,5 mL, gornji bistri sloj rastvora se koriste u testu luminiscencije, ne duže od 5 h posle ekstrakcije proteina. Merenja emisije

luminiscencije se obavljaju koristeći luminometar na 562 nm. Posle prvog smrzavanja u tečnom azotu, nakon čega sledi mrvljenje da bi se dobio prah, tkiva se resuspenduju u puferu za lizu, pa inkubiraju 10-15 min na ledu. Ovi uzorci se zatim centrifugiraju u Eppendorf-ovim epruvetama od 2 mL, a gornji bistri sloj rastvora se testira na aktivnost luciferaze.

Analiza dot- blot

Ekstrahuje se ćelijski DNK procedurom alkalne lize, koju su opisali Sanbrook, Fritsch i Maniatis uMolecular Cloning,1989.

Na najlonskim filterima (Boehringer) preabsorbuje se 5 ug DNK ekstrahovane iz ćelija, koristeći Biorad dot-blot aparat. Ovi filtri se zatim pre-hibridizuju 4 h na 65°C sa rastvorom koji sadrži 0,5 M natrijum-pirofosfat (NaPi), 1 mM EDTA, 7% SDS. Pripremi se uzorak, obeležen sa<32>P(alfa), koristeći plazmid pCMVIuc DNK kao šablon i nasumice pripremljeni komplet Amersham. Filter se 12 h hibridizuje u istom puferu za pre-hibridizaciju, na 42°C, koristeći 1*10<6>CPM/mL. Filter se zatim podvrgne ispiranju 3-10 min na 65°C u puferu koji sadrži 40 nM NaPi, 1% SDS. Obavi se autoradiografska analiza, uz pomoć fosfornog odraza, koristeći fosforne imidže aktivirane beta-radijacijom, koja se očitava i kvantitativno vrednuje uz pomoć fotomultiplikatorskog sistema, povezanog sa programom za analizu imidža. Densitometrija, na dot-blot, obavlja se korišćenjem IP-LabGel programa za analizu imidža.

Testovi transfekcije plazmida DNK

Brojni testovi trasnfekcije plazmida DNK se obavljaju iin vitroiin vivo.

Kao referentni katjonski lipidi koriste se i DOTAP i DOTMA, za koje je kapacitet transfekcije obilato karakterisan i opisan u Abkenet et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1993, 90, 6518. U eksperimentimain vivo,više različitih molskih odnosa katjonskih lipida prema plazmidu DNK je analizirano u svrhu određivanja aktivnosti katjonskih lipida i respektivnih najefikasnijih koncentracija za transfer gena. Sposobnost transfekcije različitih lipozoma se vrednuje iin vitroiin vivokorišćenjem trasporter gena luciferaze koji se sadrži u plazmidu pCMVIuc, čija aktivnost, iskazana relativnim jedinicama luminiscencije (RLU) (opisane ranije), olakšava kvantitativno iskazivanje.

Kao alternativa, efikasnost transfekcije brojnih katjonskih lipozoma se vrednuje pomoću densitometrijske analize (fosforni imidž) uzoraka DNK, ekstrahovanih iz transficiranih ćelija preabsorbovanih na nitroceluloznim filtrima (dot-blot) i hibridizovanih sa markerima plazmida DNK, obeleženim sa<32>P, kao što je ranije opisano.

Testovi trasnfekcijein vivo

Zavisnost efikasnosti transfekcijein vivood molskog odnosa

ST 983 lipozom. DNK

U ovom eksperimentu vrednuje se zavisnost efikasnosti trasnfekcije jetre, pluća i srca od molskog odnosa ST 983 lipozom:plazmid DNK. Testirani su sledeći odnosi nmol lipozoma prema ug DNK: 12:1, 24:1, 36:1 i 48:1.

Grupe od 6 miševa Balb/c, težine približno 20 g, tretiraju se intravenozno sa gore pomenutim količinama kompleksa lipozom-DNK u zapremini od 200 pL PBS, pa se žrtvuju 24 h posle administriranja ovog kompleksa.

Aktivnost luciferaze, ekstrahovane iz tkiva pluća, srca i jetre, utvrdile su dominantno pulmonarnu raspodelu luciferaze, pri svim analiziranim molskim odnosima. Ustvari, približno 99% od ukupno ekstrahovane luciferaze iz ova tri tkiva je locirano u plućima. Dokazano je da je najbolji molski odnos lipozom.DNK od 12:1. Dobijeni rezultati su prikazani u Tabeli 3 niže.

Zavisnost efikasnosti transfekcijein vivood razlika između preparata

SRT 983 lipozoma

Vrednost aktivnosti luciferaze, kao relativne jedinice luminiscencije (RLU), ekstrahovane iz pluća miševa Balb/c, tretiranih intravenozno sa različitim preparatima ST 983 lipozoma, pri molskom odnosu lipozom:DNK 12:1, dati su u Tabeli 4.

Dobijeni podaci, pored demonstriranja da je ST 983 lipozom sposoban da transportuje plazmid DNKIin vivo,sa vrednostima efikasnosti koje su veće nego i/ili uporedne sa onima za DOTMA, takođe pokazuju stepen varijabilnosti između različitih preparata ST 983. Ovo može biti usled brojnih fizičko-hemijskih karakteristika, kao što su veličina lipozomskih vezikula, ili relativne proprocije vezikula u odnosu na unilamelarnu (SUV) ili multilamelarnu strukturu različitih preparata ST 983. U stvari, fizičko-hemijski parametri koji su gore navedeni, obilno su opisali, kao determinante u postizanju optimalnih efikasnostiin vivoiin vitro,R.l. Mahato et al., uGene Therapy1998, 9, 2083.

Zavisnost efikasnosti transfekcijein vivood vremena preinkubacije kompleksa

lipozoma ST 983- DNK

Tabela 5 predstavlja relativne jedinice luminiscencije ekstrakta iz jetre, pluća i srca miševa, tretiranih intravenozno sa ST 983 lipozomom, preinkubiranih sa plazmidom DNK 30 min ili 3 h pre administriranja. Životinje, tretirane sa ST 983 koje su preinkubirane 3 h pre sa DNK, pokazuju približno 5-struki porast aktivnosti luciferaze u plućima i srcu, u poređenju sa onima koje su tretirane istim lipozomom, a preinkubirane su 30 min pre. Ovaj rezultat kazuje da je stvaranje stabilnog kompleksa lipozom-DNK fenomen zavisan od vremena i da igra kritičnu ulogu kao determinanta u efikasnosti transfekcijein vivo.

Transfekciia plazmida DNK u HeLa ćelije sa ST 772 lipozomom

Slike 1 i 2 pokazuju efikasnost transfekcije plazmida DNK sa ST 772 lipozomom u ćelijama HeLa. Za ovu svrhu, obavljena je densitometrijska analiza DNK, ekstrahovanog iz ćelija transficiranih sa ST 272 i sa DOTAP, kao referentnim katjonskim lipidom. Rezultati analize blot daju količine plazmda DNK istog reda veličina kao što se dobijaju sa DOTAP.

Claims (28)

1. Jedinjenje formule (I) naznačeno time, što su n je ceo broj od 1 do 3, R je vodonik ili prav ili račvast alkanoil, sa 2-6 atoma ugljenika; Ri i R2koji mogu biti isti ili različiti, predstavljaju zasićen ili nezasićen acil lanac, sa 3-20 atoma ugljenika; i X" je anjon farmakološki prihvatljive kiseline.

2. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se R bira iz grupe koju čine acetil, propionil, butiril, valeril i izovaleril.

3. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se R1i R2biraju iz grupe koju čine heksanoil, undekanoil, miristoil, palmitoil ili oleoil.

4. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se X" bira iz grupe koju čine hlorid, bromid, jodid, aspartat, kiseli aspartat, citrat, kiseli citrat, tartarat, kiseli tartarat, fosfat, kiseli fosfat, fumarat, kiseli fumarat, glicerofosfat, glukozafosfat, laktat, maleat, kiseli maleat, mukat, orotat, oksalat, kiseli oksalat, sulfat, kiseli sulfat, trihloroacetat, trifluoroacetat, metansulfonat, pamoat i kiseli pamoat.

5. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se bira iz grupe koju čine: estar L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom; estar acetil L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom; estar propionil L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom; estar izobutiril L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom; estar izovaleril L-karnitinbromida sa 2-hidroksiacetil-1,3-dipalmitoilglicerolom estar L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksicetil-glicerolom; estar acetil L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetil-glicerolom; estar propionil L-karnitinbromida sa 1,3-diheksanoil-2-hidroksiacetil-glicerolom.

6. Upotreba jedinjenja prema bilo kome od Zahteva 1 do 5 za dobijanje lipozoma.

7. Lipozom, naznačen time, što je to jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 5.

8. Lipozom prema Zahtevu 7, naznačen time, što sadrži još i lipidne pomagače.

9. Lipozom prema Zahtevu 8, naznačen time, što se dati lipidni pomagač bira iz grupe koju čine holesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin ili dioleil fosfatidilholin.

10. Upotreba lipozoma prema bilo kom od Zahteva 7 do 9, za dobijanje kompozicije koaj je korisna za transport farmakološki aktivnih jedinjenja.

11. Upotreba prema Zahtevu 10, naznačena time, što je farmakološki aktivno jedinjenje, prirodni ili modifikovani plazmid ili polinukleotid.

12. Upotreba prema Zahtevu 11, naznačena time, što je plazmid ili nukleotid koristan u genskoj terapiji.

13. Upotreba prema Zahtevu 11, naznačena time, što plazmid ili nukleotid kodira peptid ili protein koristan kao vakcina.

14. Upotreba prema Zahtevu 10, naznačena time, što je aktivno jedinjenje, lek.

15. Upotreba prema Zahtevu 14, pri čemu se pomenuti lek bira iz grupe koju čine antikancer, antiangiogeni, antivirusni, antibakterijski, antofungalni, antiprozoalni agensi, jedinjenja aktivna u kardiovaskularnom sistemu ili imunogeni peptidi.

16. Upotreba prema Zahtevu 15, naznačena time, što je dati lek antikancer ili antiangiogeni agens.

17. Upotreba prema Zahtevu 16, naznačena time, što se dati antikancerski agens bira iz grupe koju čine taxol ili derivat camtothecin-a.

18. Upotreba prema Zahtevu 17, pri čemu se dati derivat kamtotecina bira iz grupe koju čine 7-karbon i tri I kamptotecin; 7-benziloksiiminometilkamptotecin, i 7-butoksiiminometilkaptotecin.

19. Upotreba lipozoma prema bilo kom od Zahteva 7 do 9, za dobijanje kozmetičke kompozicije.

20. Farmaceutska kompozicija, naznačen time, što sadrži lipozom prema bilo kom od Zahteva 7, 8 ili 9.

21. Kompozicija prema Zahtevu 20, naznačena time, što pomenuti lipozom sadrži farmakološki aktivno jedinjenje.

22. Kompozicija prema Zahtevu 21, naznačena time, što je aktivno jedinjenje, prirodni ili modifikovani plazmid ili polinukleotid.

23. Kompozicija prema Zahtevu 22, naznačena time, što je plazmid ili polinukleotid koristan u genskoj terapiji.

24. Kompozicija prema Zahtevu 22, naznačena time, što plazmid ili polinukleotid kodira peptid ili protein koristan kao vakcina.

25. Kozmetički preparat, naznačen time, što sadrži lipozom prema bilo kom od Zahteva 7 do 9.

26. Kompozicija prema Zahtevu 25, naznačen time, što dati lipozom sadrži supstancu sa kozmetičkom aktivnošću.

27. Kompozicija prema Zahtevu 21, naznačen time, što se pomenuto jedinjenje bira iz grupe koju čine antikancer, antiangiogeni, antivirusni, antibakterijski, antifungalni, antiprozoalni agensi, jedinjenja aktivna u kardiovaskularnom sistemu ili imunogeni peptidi.

28. Kompozicija prema bilo kom od Zahteva 20 do 27, naznačen time, što može da se administrira oralno, parenteralno, intravenozno, intramuskularno, subkutano, transdermalno ili u obliku spreja za nos ili za usta.