RS51250B - Modifikovani hekson protein adenovirusa i njegova upotreba - Google Patents

Modifikovani hekson protein adenovirusa i njegova upotreba

Info

Publication number
RS51250B
RS51250B RSP-2010/0181A RSP20100181A RS51250B RS 51250 B RS51250 B RS 51250B RS P20100181 A RSP20100181 A RS P20100181A RS 51250 B RS51250 B RS 51250B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
adenovirus
acid sequence
adenoviral
protein
Prior art date
Application number
RSP-2010/0181A
Other languages
English (en)
Inventor
Soumitra Roy
James M. Wilson
Original Assignee
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Publication of RS51250B publication Critical patent/RS51250B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Adenovirus koji ima kapsid koji obuhvata modifikovani adenovirusni protein hekson, pomenuti modifikovani adenovirusni protein hekson obuhvata deleciju bar u hipervarijabilnom regionu adenovirusnog proteina heksona koji je odabran od hipervarijabilnog regiona 1 i hipervarijabilnog regiona 4 i egzogenu amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata imunogenu amino kiselinsku sekvencu koja je ubačena u pomenuti hipervarijabilni region 1 i/ili pomenuti hipervarijabilni region 4, pod uslovom da pomenuta egzogena amino kiselinska sekvenca je drugačija od adenovirusne sekvence.Prijava sadrži još 21 patentni zahtev.

Description

OBLASTPRONALASKA
[001] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane hekson proteine adenovirusa koji su korisni za imunogene režime.
[002] Adenovirus je virus sa dvolančanom DNK i veličinom genoma od 36 kilobaza (kb), koji je u širokoj upotrebi u primenama transfera gena zahvaljujući svojoj osobini da postiže visok transfer gena u različitim ciljnim tkivima i da ima veliki transgeni kapacitet. Konvencionalno, El geni adenovirusa se izbacuju (deletiraju) i zamenjuju sa transgenim kasetama koje se sastoje od odabranog promotora, cDNK sekvence gena od interesa i poliA signala, što rezultuje u rekombinantnom virusu koji je defektan za replikaciju.
[003] Adenovirusi imaju karakterističnu morfologiju sa ikozaedralnim kapsidom koji se sastoji od tri glavna proteina, heksona (II), penton baze (III) i "knobbed fibre» (IV), zajedno sa mnogobrojnim drugim malim proteinima, VI, VIII, IX lila i Iva2 [W.C. Russell, J. Gen Virol., 81:2573-2604 (Nov 2000)]. Genom virusa je linearna dvolančana DNK sa terminalnim proteinom koji je kovalentno povezan sa 5' terminusom, koji poseduje invertovane terminalne ponovke (inverted terminal repeats, ITRs). Virsna DNK je blisko povezana sa visoko baznim proteinom VII i malim peptidom koji je nazvan mu. Još jedan protein, V, je upakovan sa ovim DNK-protein kompleksom i obezbeđuje strukturnu vezu sa kapsidom preko proteina VI. Virus takođe poseduje proteazu koju kodira virus, i koja je neophodna za obradu nekih od strukturnih proteina da bi se napravio zreli infektivni virus.
[004] Ovde je opisana upotreba adenovirusa za davanje gena i režime vakcinisanja. Rekombinantni adenovirusi opisani su za davnje molekula do domaćinskih ćelija. Videti US
Patent 6,083,716, u kome je opisan genom dve adenovirusa iz šimpanzi, Cl i C68 (Pan9). Videti takođe, International Patent Publication No. WO 02/33645, u kome su opisani vektori konstruisani od genoma adenovirusa šimpanze Sad22/Pan5, Pan6, Pan7, kao i simijanskih adenovirusa SVI, SV25 i SV39; i Međunarodna objava patenta br. WO 04/16614, u kome su opisan hibridni adenovirusni vektori i vektori konstruisani od simijanskog adenovirusa SA18.
[005] Mnogobrojne modifikacije adenovirusa su bile ranije predložene. Ove modifikacije uključuju insercije u adenovirusni protein vlakna [Curiel, D.T., Ann N Y Acad Sci., 886:158-71 (1999)]; insercije u penton protein za ciljanje (targeting) [Einfeld, D.A. et al., J Virol. 73:9130-6) (1999)]; insercije u adenovirusni protein IX za ciljanje [Dmitriev, LP. et al.,
(2002) J Virol. 76:6893-9 (2002)]; i modifikacije adenovirusnog heksona za ciljanje [Vigne,
E. et al., J Virol. 73:_5156-61 (1999); US objavljena patentna prijava br. US2003143209 od strane Latta, Martine, et al.] kao i za inserciju antigenog epitopa.
[006] Još detaljnije, insercija stranih peptida u hekson protein humanog adenovirusa serotipa 2 (HAdV-2) je objavljena od strane Crompton et al., [(1994) J Gen Virol. 75:133-9 (1994)]. Sa osvrtom na strukturu HAdV-2 koja je objavljena od strane Roberts et al. [Roberts et al,
(1986), Science. 232:1148-51], autori su zamenili 17 amino kiselina u HAdV-2 heksonu (281-297) sa 17 amino kiselinskim peptidom koji nosi prethodne determinante. Region u okviru heksona gde je izvršena substitucija je označen sada kao DE1 petlja između elementa beta ploče p7i p8[Rux JJ, et al„ (2003) J Virol. 77:9553-66].
[007] Rad Crompton et al. (1994) je bio reprodukovan od strane Vigne et al., koji je gore citiran, u humanom adenovirusu serotipa 5 (HAdV-5) koji pripada istoj serološkoj podgrupi kao HAdV-2 i sa kojim je blisko povezan. Još detaljnije, Vigne et al., su ubacili peptide u hekson HAdV-5 na poziciju identičnu onoj koju su koristili Campton et al. (na osnovu proteinskog poravnanja HAdV-2 heksona i HAdV-5 heksona). Vigne et al. su zamenili 14 HAdV-5 ostataka heksona (269-281) sa peptidom iz poliovirusa kao i sa Ugandom koji cilja integrin.
[008] Hipervarijabilni regioni adenovirusnog heksona opisani su kao regioni u kojima se sekvence između serotipova značajno razlikuju (Crawford-Miksza and Schnurr DP. Analvsis of 15 adenovirus hekson proteins reveals the location and structure of seven hvpervariable regions containing serotvpe-specific residues J. Virol. 1996 70:1836-44; Rux et al., 2003).
[009] WO 2005/026337 opisuje adenovirusni vektor u kome je obezbeđen tropizam ka Car ćelijama i koji se koristio za transfer gena. Vektor obuhvata najmanje jednu slabo pričvršćenu površinu kapsidnog proteina i heterologi peptid zajedno sa jedinicom (W/R) XiX2D. Vektor se koristi za tretiranje raka, oboljenja mišića i mukoviscidoze.
[010] Ono što je potrebno su alternativne metode za dostavljanje molekula do ćelija domaćina.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0011] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje adenovirus koji ima kapsid sa modifikovanim hekson proteinom, pomenuti modifikovani hekson protein sadrži deleciju u makar jednom hipervarijabilnom regionu adenovirusnog hekson proteina koji je odabran iz grupe hipervarijabilni region 1 i/ili hipervatijabilni region 4 i egzogenu amino kiselinsku sekvencu koja sadrži imunogenu amino kiselinsku sekvencu koja je ubačena u pomenuti hipervarijabilni region, pod uslovom da pomenuta egzogena amino kiselinska sekvenca je druga u odnosu na adenovirusnu sekvencu.
[0012] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za promenu antigene specifičnosti adenovirusnog vektora, postupak koji obuhvata korak obczbeđivanja adenovirusa kao što je gore opisano, modifikovani hekson protein adenovirusa pomenutog adenovirusa koji sadrži ciljnu sekvencu koja je ubačena u deleciju u okviru hipervarijabilnog regiona.
[0013] Pronalazak omogućava da se pojača imuni odgovor na imunogeni molekul koji je dostavljen od strane adenovirusnog vektora tako što se subjektu obezbedi adenovirus koji ima kapsid sa modifikovanim adenovirusnim hekson proteinom, kao što je gore opisano, gde pomenuti adenovirus dalje poseduje molekul nukleinske kiseline koji kodira imunogeni molekul koji je upakovan u kapsid.
[0014] U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje 'self-priming' imunogenu kompoziciju (koja sadrži elemente za prvu i ponovljenu imunizaciju) koja sadrži: adenovirus koji obuhvata kapsid koji se sastoji od modifikovanog hekson proteina adenovirusa, kao što je gore opisano, gde pomenuta egzogena amino kiselinska sekvenca je prva amino kiselinska sekvenca; gde pomenuti adenovirus dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugu imunogenu amino kiselinsku sekvencu.
[0015] Drugi aspekti i prednosti pronalaska postaće očigledni na osnovu detaljnog opisa pronalaska koji sledi.
KRATKI OPIS SLIKA
[0016] Slika 1 predstavlja plazmidnu mapu za pNEBAsc, koja je dobijena subkloniranjem genoma humanog adenovirusa tipa 5 (HAdV-5) koji nosi kodirajući region za hekson u plasmid pNEB 193 (kupljen od New England Biolabs). Slika 2A predstavlja plazmidnu mapu (p) SRAd5eGFP, koja je molekularni klon HAdV-5 vektora sa deletiranim El i E3 i koji sadrži nativni adenovirusni hekson i kao marker ima gen za zeleni fluorescentni protein.
Slika 2B predstavlja mapu pH5sCD4eGFP, koji je plazmidni molekulski klon koji sadrži HAdV-5 okosnicu i mutirani hekson koji sadrži CD4 epitop iz "spike" proteina SARS koronavirusa.
Slika 2C predstavlja mapu pH5sCD8eGFP, koji predstavlja plazmidni molekulski klon koji sadrži HAdV-5 genom sa deletiranim El, i E3 i mutirani hekson koji sadrži CD8 epitop iz "spike" proteina SARS koronavirusa.
Slika 2D predstavlja mapu pH5-2F5eGFP, koji predstavlja plazmidni molekulski klon koji sadrži HAdV-5 genom sa deletiranim El, i E3 i mutirani hekson koji ne sadrži insert.
Slika 2E predstavlja mapu pH5-hexBspeEI, koji predstavlja plazmidni molekulski klon koji sadrži HAdV-5 genom sa deletiranim El, i E3 i mutirani hekson koji ne sadrži insert.
Slika 3 je poravnanje dela hekson proteina adenovirusa koji sadrži hipervarijabilne regione (HVR) 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 za simian adenovirus SAdV-23 (po staroj nomenklaturi Pan6 ili C6); SAdV-22 (po staroj nomenklaturi SAdV22/Pan5 ili C5); SAdV-24 (po staroj nomenklaturi Pan7 ili C7); i SAdV-25 (po staroj nomenklaturi C68). Lokacija HVR je prikazana za ove sekvence, gde su prikazani brojevi koji se odnose na sekvence. Za SAdV-23, fragment je amino kiselina 131 do 495 iz SEQ ID NO:3; za SAdV-22, fragment je amino kiselina 131 do 486 iz SEQ ID NO:4; za SAd24, fragment je amino kiselina 131 do 485 iz SEQ ID NO:5; za SAd25, fragment je amino kiselina 131 do 486 iz SEQ ID NO:6; za hAd5 fragment je amino kiselina 131 do 509 iz SEQ ID NO:2.
DETELJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje modifikovan protein hekson adenovirusa. Ovakav modifikovani hekson protein adenovirusa ima parcijalnu ili kompletnu deleciju u makar jednom hipervarijabilnom regionu odabranom od HVR1 i HVR4. Modifikovani protein hekson može da ima jedan ili više nezavisno insertovanih odabranih egzogenih molekula. U jednom ostvarenju, egzogeni molekul je ubačen najmanje u mesto delecije u okviru hipervarijabilnog regiona 1 ili hipervarijabilnog regiona 4, pri čemu je uslov da taj egzogeni molekul nije dobijen iz adenovirusa. Alternativno, modifikovanom proteinu heksonu može da nedostaje bilo kakav insert u regionu specificirane delecije.
[0018] Modifikovan protein hekson adenovirusa može se koristiti za dobijanje adenovirusnog kapsida i/ili infektivne adenovirusne partikule. Zato, modifikovani adenovirusni kapsid koji se ovde koristi odnosi se na adenovirusni kapsid koji sadrži modifikovani adenovirusni protein hekson kao što je ovde opisano.
[0019] U jednom ostvarenju, modifikovani kapsid adenovirusa iz pronalaska može da bude prazan, to jest može da mu nedostaje viralni genom i/ili ne sadrži ekspresionu kasetu. Ovako modifikovani adenovirusni kapsid može biti formulisan u kompoziciji za dostavljanje proteinske forme. Alternativno, ovako modifikovani adenovirusni kapsid može biti formulisan u kompoziciju za dostavljanje sa pogodnim vektorom za ekspresiju u domaćinskoj ćeliji.
[020] U drugom ostvarenju, modifikovani adenovirusni kapsid se produkuje u formi adenovirusne partikule koja ima modifikovan adenovirusni kapsid koji u sebi ima upakovan jedan ili više heterolognih molekula za dostavljanje ćeliji. Osim ako nije drugačije specificirano, modifikovani adenovirusni vektori kako se ovde koriste odnose se na ovakve adenovirusne partikule.
[021] Hipervarijabilni region 1 (HVR1) i hipervarijabilni region 4 (HVR4) identifikovani su u podgrupi C humanih adenovirusa. Strukture ovih regiona nisu definisane, kao što su definisane strukture drugih hipervarijabilnih regiona u genimima adenovirusa podgrupe C, to jest, HVR1, HVR3, HVR5 HVR6 i HVR7. Protein hekson humanog adenovirusa serotipa 2 je reprodukovan u SEQ ID NO: radi olakšanja. Protein hekson humanog adenovirusa serotipa 5 je reprodukovan u okviru SEQ ID NO: 2 radi olakšanja.
[0022] Bez namere da se vežu striktno za teoriju, pronalazači veruju da modifikovani heskson proteini iz adenovirusa iz ovog pronalaska imaju prednost jer HVR regioni heksona veoma variraju kako u dužini tako i u sekvenci kada se upoprede različiti adenovirusi, i tako obezbeđuju fleksibilan konstrukt koji je tolerantan na insercije različitih molekula različitih dužina. Zato, pronalazak obezbeđuje voma fleksibilni konstrukt koji dopušta inserciju različitih homologih molekula koji su korisni u ciljanju i za pojačanje imunih odgovora.
[0023] Izraz "funkcionalan" odnosi se na proizvod (na primer protein ili peptid) koji pokazuje svoju prirodnu (nativnu) funkciju, iako ne mora da je pokazuje na istom nivou kao nativni proizvod. Izraz "funkcionalno" takođe se može odnositi na gen koji kodira proizvod i pomoću koga se željeni proizvod može eksprimirati. Izraz "funkcionalna delecija" odnosi se na deleciju koja uništava sposobnost proizvoda da izvede svoju nativnu funkciju.
[0024] Kao što se ovde koristi, delecije koje su ovde opisane za HVR mogu da uključe eliminaciju kompletne ili dela amino kiselinske sekvence da bi se HVR napravio u okviru hekson proteina. Na primer, za HVR koji ima 45 amino kiselina (na primer, HVR1 od Ad2 ili Ad5) može da se napravi delecija amino kiselina od 1 do 45, na primer, može da se napravi od 1 do 5, najmanje 10, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, ili više amino kiselina. U jednom ostvarenju, najmanje jedna amino kisleina sa N-terminusa i najmanje jedna amino kiselina sa C-terminusa nativnog hipervarijabilnog regiona se zadržava.
[0025] Kao što se koristi u okviru ove specifikacije i patentnih zahteva, izrazi "obuhvata" i "sadrži" i njihive varijante, uključujući, "obuhvata ", "onaj koji obuhvata ", " sadrži" i " onaj koji sadrži" između ostalih varijanti, uključuje i druge komponente, elemente, cele brojeve, korake i slično. Izraz "sastoji se od" ili "onaj koji se sastoji od" isključuje druge komponente, elemente, cele brojeve, korake i slično.
[0026] U jednom ostvarenju, modifikovani adenovirus poseduje kapsid koji sadrži deleciju u okviru HVR1 i/ili HVR4. U drugom ostvarenju, modifikovani adenovirus ima kapsid koji sadrži modifikaciju u jednom ili oba ova regiona i takođe i u okviru drugog odabranog HVR, na primer, HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 ili HVR7.
[0027] Hipervarijabilni region 1 nalazi se u okviru ostataka 139 do 167 ili ostataka 147 do 162 proteina heksona u HAdV-5 [SEQ ID NO: 2] i HAdV-2 [SEQ ID NO: 1], na osnovu obeležavanja brojevima kod HAdV-2 [SEQ ID NO: 1, R. J. Roberts et al, A consensus sequence for the adenovirus-2 genome, p. 1-51, in W. Doefler (ed.) Adenovirus DNA. Martinus Nijhoff Publishing, Boston]. Hipervarijabilni region 4 nalazi se u okviru ostataka 22 do 271 hekson proteina HAdV-2, na osnovu iste šeme obeležavanja brojevima. Videti na primer Slika 3 koja je primer poravnanja u okviru HVR lokacije drugih adenovirusa u odnosu na sopstveno obeležavanje brojevima. Priprema ovakvih poravnanja je poznata onima iz ove oblasti.
[0028] Na osnovu ove informacije, stručnjak iz ove oblasti može već sada da odredi odgovarajuće hipervarijabilne regione pomoću poravnanja različitih sekvenci za hekson iz različitih adenovirusa, uključujući one iz različitih serotipova u okviru humanih adenovirusa podgrupe C ili onih serotipova van podgrupe C adenovirusa. Videti na primer, Crawford-Miksza and Scnurr, koji su gore citirani, i Rux JJ et al (2003) gore citirani, za ilustraciju poređenja sekvenci nekoliko adenovirusa i lokacije njihovih hipervarijabilnih regiona. Druge pogodne sekvence adenovirusa mogu se odmah odabrati iz drugih humanih i ne-humanih sekvenci koje su opisane.
[0029] Kao što je ovde opisano, poravnanja se izvode pomoću bilo kojih od mnogobrojnih porgrama za poravnanje sekvenci (Multiple Sequence Alignment Programs) koji su besplatni ili komercijalno dostupni, kao što je, "Clustal W", koji je dostupan preko mrežnog servera na internetu. Alternativno, Vector NTI alati se takođe mogu koristiti. Postoji takođe mnogo algoritmova koji su poznati u nauci i koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidne sekvence, uključujući one koji se već nalaze u okviru opisanih programa. Kao još jedan primer, polinukleotidne sekvence se mogu porediti pomoću Fasta, programa u GCG verzija 6.1. Fasta obezbeđuje poravnanja i procente identičnosti sekvenci regiona koji se najbolje preklapaju između zadate sekvence i onih koje su dobijene u pretrazi. Na primer, procenat identičnosti između sekvenci nukleinskih kiselina može se utvrditi pomoću Fasta kada se uključe njegovi podrezumevajući (default) parametri (veličina reci 6 i NOPAM faktor za "scoring" matriks), kao što je obezbeđeno u GCG verziji 6.1. Slični programi su dostupni za izvođenje poređenja amino kiselina. Uopšteno, ovi programi se koriste pri njihovim podrazumevajućim (default) podešavanjima, iako stručnjaci iz oblasti mogu da promene ove parameter, ako je potrebno. Alternativno, stručnjak iz oblasti može da koristi drugi algoritam ili kompjuterski program koji obezbeđuje najmanje nivo identičnosti ili poređenje koje je obezbeđeno od strane referentnih algoritama i programa.
[0030] Pogodni adenovirusi dostupni su u kolekciji American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, US (ATCC), iz različitih akademskih ili komercijalnih izvora, ili se željeni regioni mogu sintetisati korišćenjem poznatih tehnika, a kao referenca se koristi sekvenca objavljena u literature ili dostupna iz baza podataka (na primer GenBank, itd). Primeri pogodnih adenovirusa uključuju, bez limitacija, humane adenovirus serotipove 2 [sekvenca objavlejna u R. J. Roberts et al, A consensus sequence for the adenovirus-2 genome, p. 1-51, in W. Doerfler (ed.) Adenovirus DNA. Martinus Nijhoff Publishing, Boston., tip 3, tip 4 [sekvence za HAdV-4 genom objavljene u S. Jacobs et al, J Gen Virol 85
(2004), 3361-3366, prijavljene u GenBank/EMBL/DDBJ accession number AY487947], tip 5 [sekvenca objavljena u R. Kinlock et al, 1984. Adenovirus hexon: sequence comparison of subgroup C serotvpes 2 and 5. J. Biol. Chem. 259: 6431-6436], AVI i AV 6 [P. Pring-Akerblom and T. Adrian, 1993, Res. Virol, 144: 117-121], 7, 12 [sekvenca objavljena u J. Sprengel et al, J Virol, 68:379-389 (1994)], 40 [sekvenca objavljena u C I Toogood et al, J Gen Virol, 70: 3203-3214 (1989)] i dalje uključuje bilo koji od trenutno identifikovanih humanih tipova [videti na primer, Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication", in VIROLOGY, 2d ed., pp. 1679-1721 (1990)] koji se mogu gajiti u željenoj ćeliji. Slični adenovirusi za koje je poznato da inficiraju ne-humane primate (na primer, šimpanze, rezus majmune, makake, i druge simijan vrste) ili druge ne-humane sisare i koji rastu u željenoj ćeliji mogu se upotrebiti u vektorskim konstruktima iz ovog pronalaska. Ovakvi serotipovi uključuju, bez ograničenja, adenovirus šimpanze SAd22/Pan5 [VR-591], SAd23/Pan6 [VR-592], SAd24/Pan7 [VR-593 i SAd25/C68 [Pan9 GenBank accession no. AF394196) i US Patent No. 6,083,716]; i simijan adenoviruse uključujući bez ograničenja, SVI [VR-195]; SV25 [SV-201]; SV35; SV15; SV-34; SV-36; SV-37; i adenovirus babuna [VR-275], između ostalih. Sekvence SAđ22/Pan5 (takođe obeležen kao C5), SAd23/Pan6 (takođe obeležen kao C6), SAd24/Pan7 (takođe obeležen kao C7), SVI, SV25 i SV39 opisani su ranije, [WO 03/046124, objavljeno 5. Juna 2003, takođe objavljeno kao US-2005-0069866-A1, 231. Mart.2005].
[0031] Videt takođe Međunarodnu objavu patentne prijave br. WO 04/16614 koja opisuje hibridne adenovirusne vektore i vektore konstruisane od simijanskog adenovirusa SA18. Ove sekvence hekson proteina iz SAd22/Pan5 [SEQ ID NO: 4], SAd23/Pan6 [SEQ ID NO: 3], SAd24/Pan7 [SEQ ID NO: 5], SVI [SEQ ID NO: 10], SV25 [SEQ ID NO: 7], SV39 [SEQ ID NO: 8], SA18 [SEQ ID NO: 9] ovde su reprodukovani. Međutim, stručnjak iz ove oblasti razumeće da se regioni dobijeni iz drugih adenovirusnih sojeva koji se mogu porediti mogu već sada odabrati i koristiti u ovom pronalasku na mestu ovih serotipova (ili u kombinaciji sa njima).
[0032] Koristeći ove tehnike, hipervarijabilni regioni u drugim adenovirusnim sekvencama koji su analogni HVR1 i/ili HVR4 u adenovirusnoj podgrupi C takođe mogu biti identifikovani. Modifikovani adenovirusni heksoni iz pronalaska sadrže pored ovih modifikacija, modifikacije jednog ili vide drugih hipervarijabonih (HVR) regiona.
[0033] U jednom ostvarenju, funkcionalana delecija je napravljena u selektovanom HVR i tu nije ubačen nijedan molekul. Ovo može biti poželjno iz više razloga, na primer, da se smesti veliki insert u drugi HVR ili negde drugo u kapsidu. Ovako funkcionalno deletirani hekson protein adenovirusa može se koristiti za proizvodnju adenovirusne partikule kao i za druge potrebe.
[0034] U drugom ostvarenju modifikovani hekson protein adenovirusa sadrži egzogeni molekul insertovan u deleciju u okviru HVR regiona. Ovakav egzogeni molekul može biti koristan za promenu targeta modifikovanog adenovirusnog hekson proteina (ili kapsiada koji sadrži isti u formi viralne partikule ili prazan), da bi se promenila imunogenost modifikovanog adenovirusnog kapsida, i/ili da se indukuje imuni odgovor na egzogenu amino kiselinsku sekvencu ili imunološki unakrsno reaktivni molekul.
[0035] U jednom ostvarenju, egzogeni molekul ubačen u adenovirusni hekson protein je egzogena amino kiselinska sekvenca dužine od najmanje dva, najmanje četiri, najmanje osam, najmanje deset, najmanje petnaest, najmanje dvadeset, najmanje dvadeset i pet, ili više amino kiselinskih ostataka ili duža, kompletna sekvenca koja nije pronađena u okviru funkcionalne ekvivalentne pozicije u amino kiseinskoj sekvenci divljeg soja adenovirusa, ili još tačnije u divljoj formi viralne komponente proteina koji treba da se konstruiše. U određenim ostvarenjima, egzogena amino kiselinska sekvenca može takođe biti ne-nativna u smislu da se ne nalazi kao takva u prirodi, to jest, onaj polipeptid koji je sintetički ili veštački dizajniran ili pripremljen. Biće jasno da, u konteksu molekula nukleinske kiseline koji kodira hekson protein, egzogeni molekul može biti u formi nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira željenu amino kiselinsku sekvencu.
[0036] U jednom ostvarenju, egzogeni molekul je amino kiselinska koja je korisna za ciljanje. Kao što se ovde koristi, "sekvenca za ciljanje" je specifična amino kiselinska sekvenca koja deluje kao signal da se usmeri modifikovani adenovirus. Zato, u jednom ostvarenju, adenovirusni kapsid može biti modifikovan da se veže za željenu ciljnu ćeliju za koju se nativni (divlji soj) virusa iz koga je on izveden ne može vezati, ili može biti modifikovan da ima restriktivniju specifičnost vezivanja nego divlji soj virusa, drugim rečima da se veže samo za selektovan ili određenu grupu ili tip ciljnih ćelija u odnosu na širu populaciju ciljnih ćelijskih tipova za koje se vezuje divlji soj vezuje. U drugoj alternativi, adenovirus zadržava neku sposobnost da se veže za svoj originalni target i dodatni target obezbeđen je egzogenom amino kiselinskom sekvencom. Tropizam virusa je tako promenjen. Zato, pod izrazom "promenjen tropizam" misli se da modifikovani virus pokazuje specifičnost vezivanja za target ćeliju (ciljnu ćeliju) koja je promenjena, ili drugačija u odnosu na onu od virusa divljeg soja od koga je on izveden.
[037] Primeri korisnih egzogenih molekula mogu da uključe, na primer, pozitivno naelektrisane amino kiseline (na primer, lizinske ostatke ili cisteinske ostatke) citokine kao interferone i interleukine; limfokine; membranske receptore kao receptore koje prepoznaju patogeni organizmi (virusi, bakterije ili paraziti), poželjno HIV virus (humani imunodeficijentni virus); koagulacioni faktori kao faktor VIII i faktor IX; distrofine; insulin; proteine koji učestvuju direktni ili indirektno u ćelijskim jonskim kanalima, kao CFTR protein (transmembranski regulator konduktivnosti cistične fibroze); antisens RNK ili proteine sposobne da inhibiraju aktivnost proteina koga proizvodi patogeni gen koji je prisutan u genomu patogenog organizma, ili proteine (ili gene koji ih kodiraju) sposobne da inhibiraju aktivnost ćelisjkih gena čija je ekspresija deregulisana, na primer onkogen; protein koji inhibira enzimsku aktivnost, kao cd-antitripsin ili inhibitor viralne protease, na primer; varijante patogenih proteina koji su mutirani tako da kvare njihovu biološku funkciju, kao na primer, trans-dominantne varijante tat proteina HIV virusa koje su sposobne da kompetiraju sa prirodnim proteinom za vezivanje za ciljnu sekvencu, i tako spreče aktivaciju HlV-a. antigene epitope u cilju povećanja ćelijskog imuniteta domaćina; proteine glavnog kompleksa za histokompatibilnost klase I i II, kao i proteine koji su induceri ovih gena; antitela; gene koji kodiraju imunotoksine; faktore rasta ili hormone rasta; ćelijske receptore i njihove ligande; tumor supresore; proteine uključene u kardiovaskularnu bolest uključujući, ali bez ograničenja, onkogene; faktore rasta uključujući, ali bez ograničenja na njih, faktor rasta fibroblasta (FGF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), i nervni faktor rasta (NGF); e-nos, tumor supresorske gene uključujući, ali bez ograičenja, Rb (retinoblastoma) gen; lipoprotein lipazu; superoksid dismutazu (SOD); katalazu; kiseonik i čistače slobodnih radikala; apolipoproteine; i pai-1 (inhibitor aktivatora plazminogena 1); ćelijske enzime ili one proizvedene od strane patogenih organizama; gene samoubice; hormone, T ćelijske receptore (epitope, epitope antitela, antitela i ligande identifikovane iz različitih proteinskih bibilioteka).
[0038] U jednom ostvarenju, ligand za površinski ćelijski receptor je egzogeni molekul. Primeri pogodnihh liganda uključuju na primer, antitela, ili fragmente antitela ili derivate, jednolančana atitela (ScFv), jedno domenska antitela, i minimalnu jedinicu za prepoznavanje antitela kao što su regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) Fv fragmenata. Ovakva amino kiselinske sekvenca može se dobiti ili izvesti iz antigen vezujućeg mesta ili antigen vezujućih ili prepoznavajućih regiona antitela, i takvo antitelo može biti priridno ili sintetičko.
[0039] U drugom ostvarenju, viralni protein je egzogeni molekul. Na primer, HSV-1 TK enzim ima veći afinitet u odnosu na ćelijski TK enzim za određene nukleozidne analoge (kao aciklovir ili ganciklovir).
[0040] U još jednom ostvarenju, egzogeni molekul je imunogen. "Imunogeni" molekuli mogu da obuhvate one koji indukuju ćelijske immune odgovore, odgovor anitelima, ili oba. Vakcinalni molekuli uključuju one koji indukuju imuni odgovor za zaštitu od dalje infekcije sa patogenom i/ili štite od simptoma bolesti ili drugih stanja. Antigen se odnosi na molekul koji je sposoban da indukuje humoralni (antitelima) imuni odgovor.
[0041] Tipično, imunogeni molekuli indukuju specifičan imuni odgovor na specifičan virus, organizam (na primer, bakteriju, gljivu, kvasac) ili druge izvore (na primer tumor) ili na unakrsno reaktivan organizam ili izvor. Međutim, u određenim ostvarenjima može biti poželjno da se koriste imunogeni molekuli koji indukuju nespecifičan imunomodulatorni odgovor, na primer, pojačavanjem ('boosting') imunog odgovora. Na primer, ovakav molekul bi mogao da se koristi kao osnovni ('prime') u režimu vakcine ili kao adjuvant, u zavisnosti od toga da li se dostavlja pre ili zajedno sa molekulom protiv koga se želi izazvati imuni odgovor.
[042] Pogodni imunogeni uključuju na primer, T-ćelijski epitop (na primer CD4 ili CD8 epitope), epitop antitela, ili peptid, polipeptid, enzim ili drugi fragment dobijen od bakterije, gljive, kvasca i/ili virusa. Pogodni izvori imuno gena uključuju, između ostalih, proizvode imunogenih transgena koji su ovde opisani. Još drugi imunogeni biće očigledni sručnjacima iz ove oblasti.
[0043] Zato, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje modifikovan adenovirusni hekson protein, koji je modifikovan tako da sadrži jedan ili više egzogenih molekula. Tamo gde se koristi više od jednog egzogenog molekula, molekuli mogu biti isti. U drugom ostvarenju, egzogeni molekuli se mogu razlikovati. Na primer, modifikovani adenovirusni protein hekson može da sadrži egzogeni molekul u jednom regionu koji modifikuje prirodno targetovanje i egzogeni molekul u drugom regionu koji modifikuje prirodno neutralizujuće epitope i/ili indukuje imuni odgovor. U drugom primeru, modifikovani adenovirusni heskon protein može da sadrži više od jednog egzogenom imunogena. Mnoge druge kombinacije pogodnih egzogenih molekula koji se mogu odabrati nezavisno, biće očigledna onima koji se bave ovom oblašću. Ko što će biti odmah očigledno onima iz ove oblasti, određeni molekuli mogu funkcionisati i kao ciljajući (targeting) molekuli i kao imunogeni.
[0044] Tehnike za pripremu ovakvih egzogenih molekula (na primer, amino kiselinskih sekvenci) i njihovo unošenje u virus ili viralne komponente dobro su poznat u nauci i naširoko su opisane u literature. Zato, na primer, tehnike molekularne biologije ili genetičkog inžinjerstva su već dostupne, da bi se pripremile ili konstruisale genetske sekvence sposobne da budu eksprimirane kao modifikovan virus ili viralna komponenta, na osnovu ovog pronalaska. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji kodira protein viralne komponente može biti tako modifikovan da mu je ubačena nukleotidna sekvenca koja kodira egzogenu amino kiselinsku sekvencu, na primer, kodira fuzioni protein koji obuhvata ceo ili deo adenovirusnog proteina i egzogenu amino kiselinsku sekvencu.
[0045] Može biti pogodno ili neophodno da se bilo kakav ovakav dodatni ili eskterni motiv ili osobina inkorporiraju u virus u smislu linker sekvence. Ovakve tehnike za konstruisanje za inkorporaciju DNK ili amino kiselinskih sekvenci preko vezivanja za linker sekvencu poznate su u nauci i predstavljaju rutinu za one koji se bave genetičkim inžinjerstvom.
[0046] U drugom ostvarenju, pronalazak koristi modifikovani adenovirusni kapsid koji sadrži egzogeni molekul za proizvodnju infektivne adenovirusne partikule, koja može da sadrži ekspresionu kasetu koja nosi željeni molekul. Pogodno, molekul koji nosi eskpresiona kaseta kodira produkt koristan za indukciju imunog odgovora na produkt ili molekul koji je unakrsno reaktivan na njega.
[0047] U jednom primeru, ovo ostvarenje dozvoljava da adenovirusni modifikovani kapsid funkcioniše kao adjuvant za molekul koji dostavlja ekpresionoa kaseta. U drugom primeru, ostvarenje dozvoljava modifikovanom adenovirusnom kapsidu da funkcioniše kao "self-priming" konstrukt za molekul koji dostavlja ekspresiona kaseta.
[0048] U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovan adenovirusni kapsid.
[0049] Kao što se ovde koristi, modifikovani adenovirusni kapsid odnosi se na adenovirusni kapsid koji sadrži adenovirusni protein hekson koji je modifikovan kao štp je ovde opisano. Dodatno, modifikovan adenovirusni kaprid može da sadrži druge modifikacije. Ovakve druge modifikacije mogu da uključe druge modifikacije u okviru hekson proteina, ili u okviru drugih proteina kapsida, na primer proteina vlakna (fiber protein) ili pentona. Na primer, modifikovani adenovirusni hekson može dalje da sadrži hekson proteine koji su promenjeni kao što je opisano u US patent br. 5,922,315. U ovoj metodi, najmanje jedan region petlje adenovirusnog heksona je promenjen sa najmanje jednim regionom petlje adenovirusa drugog serotipa. Takođe su opisane druge pogodne modifikacije [US Published Patent Application No. 20040171807, objavljeno 2. Septembra 2004]. Alternativno ili dodatno, modifikovani kapsid može biti povezan sa drugim molekulom na primer lipidom, fuzionim proteinom.
[0050] U jednom aspektu kompozicije iz ovog pronalaska uključuju modifikovane adenovirusne vektore. Osim ako nije specificirano drugačije, modifikovani adenovirusni vektor kao što se ovde koristi, odnosi se na adenovirusnu partikulu koja ima modifikovani adenovirusni kapsid i koji ima upakovanu u kapsid ekspresionu kasetu koja dostavlja jedan ili više heterologih molekula do ćelija. Adenovirusne komponente koje se koriste u adenovirusnom vektoru mogu se dobiti ili izvesti iz različitih adenovirusa, kao onih opisanih ovde i onih koji su dostupni onima koji se bave ovom oblašću. Pošto adenovirusni genom sadrži otvorene okvire čitanja na oba lanca (oba smera), na mnogim mestima ovde poziva se na 5' i 3' krajeve različitih regiona da bi se izbegla zabuna između specifičnih otvorenih okvira čitanja i regiona gena. Zato, kada se poziva na "levi" ili "desni" kraj adenovirusnog genoma, ova referenca se odnosi na krajeve adenovirusnog genoma koji je veličine otprilike 36 kb i to kada se predstavi u šematskoj formi što je uobičajeno za ovu oblast [videti na primer, Horv/itz, "Adenoviridae and Their Replication, in VIROLOGY, 2d ed., pp. 1679-1721 (1990)]. Zato, kao što se ovde koristi, "levi terminalni kraj" adenovirusnog genoma odnosi se na deo adenovirusnog genoma koji kada se genom predstavi šematski u linearnoj formi, nalazi se na ekstremno levom kraju šeme. Tipično, levi kraj se odnosi na deo genoma koji počinje na mapi na 0 jedinici i proteže se na desno i uključuje najmanje 5' terminalne ivertovane ponovke (ITR) i isključuje interne regione genoma koji kodiraju strukturne gene. Kao što se ovde koristi, "desni terminalni kraj" adenovirusnog genoma odnosi se na deo adenovirusnog genoma koji kada se genom predstavi šematski u linearnoj formi, nalazi se na ekstremno desnom kraju šeme. Tipično, desni kraj adenovirusnog genoma se odnosi na deo genoma koji se završava na mapi na 36 jedinici i proteže se na levo i uključuje najmanje 3' ITR-ove i isključuje interne regione genoma koji kodiraju strukturne gene.
[0051] Pod izrazom "minigen" podrazumeva se kombinacija odabranih heterolognih gena i drugih regulatornih elemenata koji su neophodni da se obavi translacija, transkripcija i/ili ekspresija genskih produkata u domaćinskoj ćeliji.
[0052] Tipično, adenovirusni vektor dizajniran je tako da je minigen lociran u molekulu nukleinske kiseline koji sadrži druge adenovirusne sekvence u regionu koji je nativan za odabrani adenovirusni genom. Minigen može biti insertovan na mesto koje predstavlja delimično ili u potpunosti izbačen (deletiran) adenovirusni gen. Na primer, minigen može biti lociran na takvo mesto kao što je mesto funkcionalne delecije El ili funkcionale E3 delecije, između ostalih koji mogu biti odabrani. Izraz "funkcionalno izbačen (deletiran)" ili "funkcionalna delecija" znači da je dovoljna količina regiona gena je uklonjena ili na neki drugi način oštećena, na primer, putem mutacije ili modifikacije, tako da region gena više nije u mogućnosti da proizvede funkcionalni product genske ekspresije. Ako je potrebno, ceo region gena može da se ukloni. Druga pogodna mesta za oštećenje gena ili deleciju diskutovani su na drugim mestima u prijavi.
[0053] Na primer, produkcioni vektor koji je koristan za pravljenje rekombinantnog virusa, vektor može da sadrži minigen na ili 5' kraju adenovirusnog genoma ili na 3' kraju adenovirusnog genoma, ili na oba 5' i 3' kraja adenovirusnog genoma. 5' kraj adenovirusnog genoma sadrži 5' cis-elemente koji su neophodni za pakovanje i replikaciju; to jest, 5' sekvence za invertovane terminalne ponovke (ITR) (koje funkcionišu kao početak replikacije) i nativne 5' domene za pojačanje pakovanja (packaging enhancer domains) (koji sadrže sekvence neophodne za pakovanje linearnog Ad genoma i elemente za pojačavanje El promotoa). 3' kraj adenovirusnog genoma uključuje 3' cis-elemente (uključujući ITR-ove) koji su neophodni za pakovanje i inkapsidaciju (pakovanje u kapsid). Pogodno, rekombinantni adenovirus sadrži oba i 5' i 3' adenovirusne cis-elemente i minigen je lociran između 5' i 3' adenovirusnih sekvenci. Bilo koji adenovirusni vektor iz pronalaska može takođe da sadrži dodatne adenovirusne sekvence.
[0054] Sekvenca virusa, pomoćni virusi, ako je potrebno i rekombinantne virusne partikule i druge komponente vektora i sekvence koje se koriste u konstrukciji vektora koji u ovde opisani dobijeni su na način koji je opisan gore u tekstu. DNK sekvence adenovirusnih sekvenci koriste se za konstruisanje vektora i ćelijskih linija korisnih za pripremu ovakvih vektora.
[0055] Modifikacije sekvenci nukleinskih kiselina koje formiraju vektor iz ovog pronalaska, uključujući delecije sekvenci, insercije, i druge mutacije mogu biti generisane upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije i spadaju u oblast ovog pronalaska.
[0056] Postupci koji su upotrebljene za selekciju transgena, kloniranje u konstrukciju "minigena" i njegovi inserciju (ubacivanje) u virusni vektor su izvodljivi za one koji se bave ovom oblašću uz uputsva koja su ovde obezbeđena.
[0057] Transgen je nukleinsko kiselinska sekvenca, heterologna vektorskoj sekvenci koja okružuje transgen, koja kodira polipeptid, protein, ili drugi product od interesa. Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline je operativno povezana za regulatorne komponente na način koji dozvoljava transkripciju transgena, njegovi translaciju, i/ili ekspresiju u domaćinskoj ćeliji. Kompozicija transgene sekvence zaviviće od upotrebe rezultujućeg vektora. Na primer, jedan tip transgene sekvence uključuje reporter sekvencu, koja nakon ekspresije proizvodi detektabilni signal. Ovakva reporter sekvenca uključuje bez ograničenja DNK sekvence koje kodiraju P-laktamazu, P-galaktozidazu (LacZ), alkalnu fosfatazu, timidin kinazu, zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), luciferazu, proteine vezane za membranu, na primer, CD2, CD4, CD8, hemaglutininski protein influence, i druge koji su poznati u ovoj oblasti, za koje postoje visoko afinitetna antitela koja se vezuju za njih, ili koja mogu biti proizvedena na konvencionalne načine, i fuzione proteine koji sadrže protein vezan za membranu koji je na odgovarajući način fuzionisan za tag domen antigena od na primer, hemaglutinin ili Myc. Ove kodiraj uće sekvence kada se povezu sa regulatornim elementima koji omogućavaju njihovu ekspresiju, obezbeđuju signale koji se mogu detektovati na konvencionalni način, uključujući enzimatske , radiografske, kolorimetrijske, fluorescentne ili druge spektrografske analizama, test sortiranja florescentski aktiviranih ćelija ("fluorescent actvating cell sorting") i imunološke testove, uključujući test imunoabsorbcije povezane sa enzimom (ELISA), radioimuno test (RIA) i imunohistohemiju. Na primer, tamo gde je sekvenca markera LacZ gen, prisustvo vektora koji nosi signal detektuje se testom za beta-galaktozidaznu aktivnost.
[0058] Kada je transgen GFP ili luciferaza, vektor koji nosi signal može biti izmeren vizuleno na osnovu produkcije boje ili svetlosti u luminometru. Međutim, poželjno je da je transgen ne-markerska sekvenca koja kodira proizvod koji je koristan u biologiji i medicini kao što je protein, peptid, RNK, enzim, ili katalitička RNK. Poželjni molekul RNK uključuje tRNK, dsRNK, ribozomalnu RNK, katalitičku RNK i antisens RNK. Jedan primer korisne RNK sekvence je sekvenca koja "gasi" ekspresiju ciljne nukleinsko kiselinske sekvence kod tretirane životinje.
[0059] Transgen može da se koristi za tertman, kao terapeutik za rak ili vakcina, za indukciju imunog odgovora, i/ili potrebe profilaktičke vakcine. Kao što se ovde koristi, indukcija imunog odgovora odnosi se na sposobnost molekula (na primer produkta gena) da indukuje T ćeliju i/ili humoralni imuni odgovor na molekul. Pronalazak dalje uključuje upotrebu više transgena. U određenim situacijama različiti transgeni mogu se koristiti da kodiraju pojedinačnu subjedinicu proteina, ili da kodiraju različite peptide ili proteine. Ovo je poželjno kada je veličina DNK koja kodira proteinsku subjedinicu velika na primer, za immunoglobulin, hormon rasta izveden iz trombocita, ili distrofinski protein. Da bi ćelija proizvodila protein od više subjedinica, ćelija se inficira sa rekombinantnim virusom koji sadrži svaku od različitih subjedinica. Alternativno, različite subjedinice proteina mogu biti kodirane od strane istog transgena. U ovom slučaju, pojedinačni transgen uključuje DNK koja kodira svaku od subjedinica, pri čemu je DNK za svaku subjedinicu odvojena unutrašnjim mestom za ulazak ribozoma (internal ribosome entry site, IRES). Ovo je poželjno kada je veličina DNK koja kodira svaku od subjedinica mala, na primer, ukupna veličina DNK koja kodira subjedinice i IRES je manja od pet kilobaza. Kao alternativa za IRES, DNK može biti odvojena sa sekvencom koja kodra 2A peptid, koji sam sebe seče u toku post-translacionog događaja. Videti na primer, M.L. Donnelly, et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Jan 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8_(11):_864-873 (June 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001). Ovaj 2A petid je značajno manji nego IRES što ga čini pogodnim za upotrebu kada je prostor limitirajući fakor. Međutim, odabrani transgen može da kodira bilo koji biološki aktivan proizvod ili druge proizvode na primer, proizvode požejne za studiju.
[0060] Poželjni transgeni mogu se odmah izabrati od strane osobe koja se bavi ovom oblašću. Odabir transgena ne smatra se limitirajućim za ovaj pronalazak.
2. Regulatorni elementi
[061] Kao dodatak glavnim elementima koji su gore identifikovani za minigen, vektor takođe uključuje konvencionalne kontrolne elemente koji su neophodni i koji su povezani operatvno za tarnsgen na način koji omogućava njegovi transkripciju, translaciju i/ili ekspresiju u ćeliji koja je transfektovana sa plazmidnim vektorom ili inficirana sa virusom koji je proizveden ovim pronalaskom. Kao što se ovde koristi, "operativno povezane" sekvence uključuju obe i ekspresione kontrolne sekvence koje se nastavljaju na gen od interesa kao i ekspresione kontrolne sekvence koje delujutransili na razdaljini i kontrolišu gen od interesa.
[0062] Ekspresione kontrolne sekvence uključuju odgovarajuće sekvence za inicijaciju transkripcije, terminaciju, promotor i pojačivač (enhancer); efikasne signale za obradu RNK kao signale za obradu (splicing) i poliadenilaciju (poliA); sekvence koje stabilišu citoplazmatsku iRNK; sekvence koje pojačavaju efikanost translacije (to jest, Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje povećavaju stabilnost proteina; i kada je potrebno, sekvence koje pojačavaju sekreciju kodiranog proizvoda. Veliki broj ekspresionih kontrolnih sekvenci, uključujući promotore koji su nativni, konstitutivni, regulisani i/ili tkivno specifični, priznati su u ovoj oblasti nauke i mogu se upotrebiti.
[0063] Primeri konstitutivnih promotora uključuju, bez ograničenja, retrovirusni Raus sarkoma virus (RSV) LTR promotor (opcionalno sa RSV pojačivačem), citomegalovirusni promotor (opcionalno sa CMV pojačivačem) [videti, na primer, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], SV40 promotor, promotor dihidrofolat reduktaze, (3-aktinski promotor, promotor fosfoglicerol kinaze (PGK), i EF1 a promotor [Invitrogen].
[0064] Promotori koji se mogu regulisati omogućavaju kontrolu genske ekspresije i mogu biti indukovani, aktovirani, reprimirani ili "isključeni" obezbeđivanjem egzogenih jedinjenja, sredinskih faktora kao stoje temperatura, ili prisustvo specifičnih fizioloških stanja na primer, akutna faza, posebno stanje diferencijacije ćelije, ili samo u ćelijama kojima se odvija replikacija. Promotori koji se regulišu i sistemi koji se regulišu dostupni su iz različitih komercijalnih izvora, uključujući bez ograničenja, Invitrogen, Clontech i Ariad. Mnogi drugi sistemi opisani su i mogu se domah odabrati od strane stručnjaka iz oblasti. Na primer, inducibilni promotori uključuju cinkom inducibilni promotor metalotionena (MT) ovce, i promotor mišijeg "mammarv" tumora virusa (MMTV) koji se indukuje dekstrametazonom (Dex). Drugi sistemi koji se mogu regulisati uključuju promotorski sistem T7 polimeraze [WO 98/10088]; ekdizonski insektski promotor [No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], sistem koji se može reprimirati tetraciklinom [Gossen et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], sistem koji se može indukovati tetraciklinom [Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), videti takođe Harvey et al, Curr. Opin.Chem. Biol., 2:512-518 (1998)]. Drugi sistemi uključuju FK506 dimer, VP16 ili p65 korišćenjem kastradiol, difenol, murisleron, RU486-inducibilni sistem [Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) and Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] i rapamicin-inducibilni sistem [Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]. Efektivnost nekih promotora koji se mogu regulisati povećava se tokom vremena. U takvim slučajevima može se povećati efektivnost željenog sistema putem insercije većeg broja promotora u tandemu, na primer, TetR vezan za TetR pomoću IRES. Alternativno, može da se sačeka 3 dana pre nego što se uradi skrining za željenu funkciju. Može se povećati ekspresija željenih proteina poznatim sredstvima da bi se povećala efektivnost sistema. Na primer, upotrebom Woodcuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element, WRPE (posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa krtice).
[0065] U drugom ostvarenju, koristiće se nativni promotor za transgen. Nativni promotor može biti poželjan ako željena ekspresija transgena mora da bude regulisana privremeno ili razvojno, ili na tkivno specifičan način, ili kao odgovor na specifične transgene stimuluse. U daljem ostvarenju mogu se takođe koristiti drugi nativni kontrolni elementi, kao pojačivački elementi, mesta za poliadenilaciju ili Kozakove konsenzus sekvence da bi se nadomestila nativna ekspresija.
[0066] Jedno ostvarenje transgena uključuje transgen operativno vezan za tkivno specifičan promotor. Na primer, ako se želi ekspresija u skeletnom mišiću, treba da se koristi promotor koji je aktivan u mišiću. Ovi uključuju promotore iz gena koji kodiraju skeletni P-aktin, laki lanac 2A miozina, distrofin, keratin kinazu mišića, kao i sintetičke promotore koji se aktiviraju više nego promotori koji se prirodno mogu naći (videti Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Primeri promotora koji su tkivno specifični poznati su za jetru (albumin, Mivatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); hepatitis B virus "ćore" promotor, Sandig et al., Gene Ther., 3:002-9 (1996); alfa-fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), koštani osteokalcin (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); koštani sialoprotein (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), limfocite (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); teški lanac imunoglobulina; lanac T ćelijskog receptora), neuronski, kao promotor neuron specifične enolaze (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), gen za laki lanac neurofilamenta (Piccioli et al., Proc.Natl. Acad Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), i neuron specifični vgf gen (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), između ostalih.
[0067] Opcionalno, vektori koji nose transgene koji kodiraju terapeutski korisne ili imunogene proizvode mogu takođe da uključe selektivne markere ili reporter geni mogu uključiti imeđu ostalog, sekvence koje kodiraju rezistenciju na geneticin, higromicin ili purimicin. Ovakvi selektivni reporteri ili marker geni (poželjno je da su locirani van viralnog genoma ali se pakuju u viralnu partikulu) mogu se koristiti da signaliziraju prosustvo plazmida u bakterijskim ćelijama, kao što je amipicilinska rezistencija. Druge komponente vektora mogu uključiti početak replikacijc. Selekcija ovih i drugih promotora i vektorkih elemenata je konvencionalna i mnoge ove sekvence su dostupne [videti na primer Sambrook et al, i reference koje su tu citirane]. Ovi vektori se generišu pomoću tehnika i sekvenci koje su ovde obezbeđene, u konjunkciji sa tehnikakma koje su poznate u oblast ii onima stručnim u njoj.
[0068] Ovakve tehnike uključuju konvencionalne tehnike kloniranja cDNK kao one opisane u tekstu [Sambrook et al, Molecular Cloning: a Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour, NY], upotrebu preklapaj ućih oligonukleeotidnih sekvenci adenovirusnih genoma, lančanu reakciju polimeraze (PCR), i bilo koju pogodnu metodu koja obezbežuje željenu nukleotidnu sekvencu.
Proizvodnja modifikovane adenovirusne partikule
[0069] Minimalno, modifikovani adenovirusni vektor koji nosi ekspresionu kasetu koja sadrži adenovirusne cis-elemente neophodne za replikaciju i inkapsidaciju viriona, gde cis-elementi oivičavaju heterologni gen. To znači da vektor sadrži adenovirusne 5' sekvence inverovanih terminalnih ponovake (ITR) koji deluju uciskoji funkcionišu kao početak replikacije, nativne 5' domene za pakovanje/pojačavanje (koji sadrže sekvence neophodne za pakovanje linearnog Ad genoma i pojačivačke elemente za El promotor), heterologe molekule, i 5' ITR sekvence. Videti na primer, tehnike opisane za pripremu "minimalnog" humanog Ad vektora u US Patent 6,203,975, koje se mogu već sada adaptirati za rekombinantni simijanski adenovirus. Opcionalno, modifikovani (na primer rekombinantni) adenovirusi sadrže više od jedne minimalne adenovirusne sekvence koja je gore definisana.
[0070] U jednom ostvarenju, adenoviirusima su funkcionalno izbačeni (deletirani) Ela ili Elb geni, i opcionalno nose druge mutacije, na primer, temperaturno senzitivne mutacije ili delecije u drugim genima. U drugim ostvarenjima poželjno je da se zadrži intaktan Ela i/ili Elb region u rekombinantnom adenovirusu. Ovakav intaktan El region može biti lociran u svojoj nativnoj lokaciji u adenovirusnom genomu ili biti na mestu delecije u nativnom adenovirusnom genomu (na primer, u E3 regionu).
[0071] Pri konskruisanju korisnih adenovirusnih vektora za dostavu gena humanim (ili drugim sisarskim) ćelijama, u vektorima se može koristiti širok dijapazon adenovirusnih skevenci nukleinskih kiselina. Na primer, ceo ili deo adenovirusnog odloženog ranog gena E3 može biti eliminisan iz adenovirusne sekvence koja formira deo rekombinantnog virusa. Smatra se da je funkcija E3 irelevantna za funkciju i proizvodnju rekombinantne virusne partikule. Modifikovani adenovirusni vektori mogu takođe biti konstruisani sa delecijom makar ORF6 regiona E4 gena; i još poželjnije zbog redundancije u funkciji ovog regiona, čitavog E4 regiona. Još jedan vektor iz ovog pronalaska sadrži deleciju u okviru odloženog ranog gena E2a. Delecija se takođe može uvesti u bilo koji od kasnih gena LI do L5 adenovirusnog genoma. Slično, delecije u okviru intermedijarnih gena IX i IVa2mogu biti korisne za neke potrebe. Druge delecije mogu se napraviti u drugim strukturnim ili ne-strukturnim adenovirusnim genima. Delecije o kojima je gore u tekstu diskutovano mogu se koristiti pojedinačno, to jest adenovirusna sekvenca za upotrebu u ovom pronalasku može da sadrži delecije samo u jednom regionu. Alternativno, delecije celokupih gena ili njihovih delova koje efektivno uništavaju njihovu biološku aktivnost mogu se koristiti u bilo kojoj kombinaciji. Na primer, u jednom egzempalrnom vektoru, adenovirusna sekvenca može da ima delecije u okviru El gena i E4 gena, ili u okviru El, E2a i E3 gena, ili u okviru El i E3 gena ili u okviru El, E2a i E4 gena, sa ili bez delecije E3, i tako dalje. Kao što je gore diskutovano, ovakve delecije mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim mutacijama kao što su temperaturno senzitivne mutacije, da bi se postigao željeni rezultat.
[0072] Adenovirusni vektor kome nedostaje bilo koji esencijalni deo adenovirusne sekvence (na primer, Ela, Elb, E2a, E2b, E4 ORF6, LI, L2, L3, L4, i L5) može se gajiti u prisustvu produkata adenovirusnih gena koji nedostaju, a koji su neophodni za viralnu infektivnost i propagaciju adenovirusne partikule. Ove pomoćne funkcije mogu se obezbediti kultivisanjem adenovirusnog vektora u prisusutvu jednog ili više pomoćnih konstrukta (na primer, plazmida ili virusa) ili domaćinskih ćelija za pakovanje. Videti na primer, tehnike koje su opisane za pripremu "minimalnog" humanog Ad vektora u International Patent Application W096/13597, objavljen 9. Maja 1996.
[0073] Bez obzira na to da li modofikovani adenovirus sadrži samo minimalne Ad sekvence, ili celokupni Ad genom sa samo funkcionalnim delecijama u El i/ili E3 regionima, u jednom ostvarenju, modifikovani virus sadrži kapsid dobijen iz humanog ili simianskog adenovirusa. Alternativno, u drugim ostvarenjima, pseudotipovi adenovirusa mogu se koristiti u metodama ovog pronalaska. Ovakvi pseudotipovi adenovirusa koriste proteine edenovirusnog kapsida u koji je upakovan molekul nukleinske kiseline koji nosi adenovirusne sekvence iz različitih izvora adenovirusa u odnosu na onaj izvor originalnod adenovirusnog kapsida. Ovi adenovirusi mogu se proizvesti pomoću metoda koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti nauke.
Pomoćni (helper) virusi
[0074] Zato, u zavisnosti od sadržaja adenovirusnog gena u viralnim vektorima koji se koriste da nose minigen, pomoćni adenovirus ili ne-replikujući virusni fragment mogu biti potrebni da bi se obezbedila dovoljna sekvenca gena simijanskog adenovirusa koja je neophodna da proizvede infektivnu rekombinantnu virusnu partikulu koja sadtži minigen. Korisni pomoćni virusi sadrže odabrane sekvence adenovirusnog gena koje nisu prisutne u adenovirusnom vektorskom konstruktu i/ili nisu eksprimirane od strane ćelijske linije za pakovanje u kojima je vektor transfektovan. U jednom ostvarenju, pomoćni virus je defektan u replikaciji i sadrži različite adenovirusne gene kao dodatak gore opisanim sekvencama. Ovakav pomoćni virus se poželjno koristi u kombinaciji sa El-ćelijskom linijom za eksresiju.
[0075] Pomoćni virusi mogu takođe da se formiraju u poli-katjonske konjugate kao što je opiano od strane Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1. April, 1994). Pomoćni virus može opcionalno da sadrži drugi reporter minigen. Veliki broj ovakvih reporter gena poznat je u ovoj oblasti nauke. Prisustvo reporter gena u pomoćnom virusu koji je različit od transgena na adenovirusnom vektoru omogućava da oba i Ad vector i pomoćni virus mogu nezavisno da se posmatraju. Drugi reporter se koristi da bi se omogućila separacija između rezultirajućeg rekombinantnog virusa i pomoćnog virusa nakon prečišćavanja.
Ćelijske linije za komplementaciju
[0076] Da bi se generisao modifikovani adenovirus (Ad) koji nosi deleciju u bilo kom od gore opisanih gena, funkcija izbačenog (deletiranog) regiona gena, ako je esencijalna za replikaciju i infektovnost virusa, mora da se obezbedi rekombinantnom virusu preko pomoćnog virusa ili ćelijske linije, to jest, preko želijske linije za komplementaciju ili pakovanje. Pod različitim okolnostima, ćelijska linija koja eksprimira humani El može biti iskorišćena da transkomplementira Ad vector. Ovo je od posebne prednosti, jer usled raznolikosti između Ad sekvencki iz pronalaska i humanih AdEl sekvenci koji se nalaze u sadašnjim ćelijama za pakovanje, upotreba sadašnjih ćelija koje nose humani El sprečava generisanje replikaciono kompetemtnih adenovirusa tokom replikacije i procesa proizvodnje. Međutim, pod određenim okolnostima, bilo bi poželjno da se koristi ćelijska linija koja eksprimira El genski produkt koja može da se koristi za proizvodnju adenovirusa sa izbačenim (deletiranim) El. Ovakve ćelijske linije su već opisane. Videti na primer, US Patent No 6,083,716.
[0077] Ako je poželjno, mogu se koristiti sekvence koje su ovde obezbeđene da bi se generisala ćelijska linija za pakovanje ili ćelijska linija koja eksprimira, minimalno, adenovirusni El gen iz pogodnog roditeljskog izvora, ili iz transkomplementarnog adenovirusnog izvora, pod transkripcionom kontrolom promotora za ekspresiju odabrane roditeljske ćelisjke linije. Konstitutivni promotor ili onaj koji može da se reguliše mogu se koristiti za ove potrebe. Primeri ovakvih promotora opisani su detlajno u drugim delovima ove specifikacije. Roditeljska ćelija je odabrana za generisanje nove ćelijske linije koja eksprimira bilo koji željeni AdSAd22/Pan5, Pan6, Pan7, SVI, SV25 ili Sv39 gen. Bez ograničenja, ovakva roditeljska ćelija može biti HeLa [ATCC Accession No. CCL 2], A549 [ATCC Accession No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [na primer Detroit 510, CCL 72] i WI-38 [CCL 75]ćelije, između ostalih. Ove ćelijske linije dostupne su u kolekciji American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Druge pogodne roditeljske ćelijjske linije mogu se dobiti iz drugih izvora.
[0078] Ovakve El eksprimirajuće ćelijske linije korisne su za generisanje adenovirusnih vektora sa izbačenim (deletiranim) El. Dodatno, ili alternativno, pronalazak obezbeđuje ćelijske linije koje eksprimiraju jedan ili više simijanskih adenovirusnih proizvoda na primer, Ela, Elb, E2a, i/ili E4 ORF6, mogu biti konstruisane upotrebom suštinksi istih procedura kaqo za upotrebu u generisanju rekombinantnih simijanskih viralnih vectora. Ovakve ćelijske linije mogu se koristiti za transkomplementaciju adenovirusnih vektora kojima su izbačeni (deletirani) esencijalni geni koji kodiraju ove proizvode, ili obezbeđuju pomoćne funkcije neophodne za pakovanje virusa koji su zavisni od pomoćnih virusa (na primer, adeno-povezanih virusa). Priprema domaćinske ćelije na osnovu ovog pronalaska uključuje tehnike kao što je sklapanje odabranih DNK sekvenci. Ovo sklapanje može da prati upotreba konvencionalnih tehnika. Ove tehnike uključuju kloniranje cDNK kao i genomsko kloniranje, koji su dobro poznati i opisani u Sambrook et al, koji je citiran gore u tekstu, upotrebu preklapajućih oligonukleotidnih sekvenci adenovirusnog genoma, kombinovano sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR), sintetičkim metodama, i bilo kojom pogodnom metodom koja obezbeđuje željenu nukleotidnu sekvencu.
[0079] U još jednoj alternativi, esencijalni adenovirusni genski proizvodi obezbeđeni utransod strane adenoviralnog vektora i/ili pomoćnog virusa. Na taj način, pogodna domaćinska ćelija mode se odabrati iz bilo kog biološkog organizma, uključujući prokariotske (na primer bakterijske) ćelije, i eukariotske ćelije, uključujući insektske ćelije, ćelije kvasca i sisarske ćelije. Posebno poželjne domaćinske ćelije odabrane su od bilo koje od sisarske vrste, uključujući, bez ograničenja, ćelije kao što su A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK293 ćelije ili PERC6 (obe eksprimiraju funkcionalni adenoviralni El [Fallaux et al, (1998), Hum Gen Ther, 9:1909-1917], Saos, C2C12, L ćelije, HT1080, HepG2 i ćelije primarnih fibroblasta, hepatocita i mioblasta izvedene iz sisara uključujući čoveka, majmuna, pacov, zeca i hrčka. Odabir sisarskih vrsta koje obezbeđuju ćelije nije limitirajući za ovaj pronalazak; niti je tip sisarske ćelije, to jest ćelija fibroblasta, hepatocita, ćelija tumora itd.
3. Sastavljanje virusne partikule i transfekcija ćelijske linije
[0080] Generalno, kada se putem transfekcije dotavlja vector koji obuhvata minigen, vektor se dostavlja u količini otprilike od oko 5 ug do oko 100 \ ig DNK, i poželjno oko 10 p.g do oko 50 (ig DNK do oko 1 x IO<4>ćelija do oko 1 x 10<13>ćelija, i poželjno oko 10<5>ćelija. Međutim, relativne količine vektorske DNK za domaćina mogu da se podese, uzimajući u obzir faktore kao stoje odabrani vektor, metod dostave i domaćinske ćelije koje su odbrane.
[0081] Vektor može biti bilo koji vektor poznat u oblasti ili koji je ovde otkriven, uključujući golu DNK, plazmid, fag, transpozon, kozmidi, epizomi, virusi, itd. Unošenje vektora u domaćinsku ćeliju može se postići na bilo koji način poznat u ovoj oblasti ili koji je ovde opisan, uključujući transfekciju, i infekciju. Jedan ili više adenovirusnih gena mogu se stabilno integrisati u genom domaćinske ćelije, stabilno eksprimirati kao epizomi, ili se mogu prolazno eksprimirati. Produkti gena mogu svi biti prolazno eksprimirani, na epizomu ili stabilno integrisani, ili neki od genskih produkata mogu biti stabilno eksprimirani dok su ostali prolazno eksprimirani. Dalje, promotori za svaki od adenovirusnih gena mogu biti odabrani nezavisno od konstitutivnog promotora, inducibilnog promotora ili nativnog adenovirusnog promotora. Promotori mogu biti regulisani specifičnim fiziološkim stanjem organizma ili ćelije (to jest, stanjem diferencijacije, ili replikacije ili stanjem mirovanja ćelije tj. kada se ne deli) ili na primer, egzogeno dodatim faktorima.
[0082] Unošenje molekula (kao plazmida ili virusa) u domaćinsku ćeliju može se postići upotrebom tehnika koje su poznate stručnjacima iz ove oblast i koje su ovde opisane u opisu. U poželjnom ostvarenju, standardne tehnike transfekcije se koriste, na primer, CaP04transfekcija ili elektroporacija.
[0083] Sastavljanje odabranih DNK sekvenci adenovirusa (kao i transgena i drugih vektorskih elemenata) u različite intermedijerne plazmide, i upotreba plazmida i vektora da bi se proizvela rekombinantna virusna partikula postiže se korišćenjem konvencionalnih tehnika. Ovakve tehnike uključuju konvencionalne tehnike kloniranja cDNK kao one opisane u tekstu [Sambrook et al, gore u tekstu citiran], upotrebu preklapajućih oligonukleotidnih sekvenci adenovirusnih genoma, lančanu reakciju polimeraze (PCR), i bilo koje pogodne metode koja obezbeđuje željenu nukleotidnu sekvencu. Koriste se standardne tehnike transfekcije i ko-transfekcije, na primer tehnika CaP04precipitacije. Druge konvencionalne metode koje se koriste uključuju homologu rekombinaciju virusnih genoma, pravljenje plaka virusa metodom prelivanja na agaru, metode za merenje generisanja signala, i slične.
[0084] Na primer, nakon konstrukcije i sastavljanja željenog vektora koji sadrži minigen, vektor se transfektujein vitrou prisustvu pomoćnog virusa u ćelijsku liniju za pakovanje. Homologa rekombinacija odigrava se između sekvenci pomoćnog vektora i vektora, što omogućava da se tarnsgene adenovirusne sekvence u vektoru replikuju i pakuju u virusne kapside, što rezultuje u stvaranju rekombinantne virusne partikule. Sadašnji metod za proizvodnju ovakvih virusnih partikula bazira se na transfekciji. Međutim, pronalazak nije ograničen ovim postupcima.
[0085] Rezultujući rekombinantni modifikovani adenovirusi korisni su sa prebacivanje selektovanog transgena u odabranu ćeliju.
Upotreba modifikovanog adenovirusnih vektora
[086] Modifikovani adenovirusni vektori iz pronalaska korisni su za transfer gena u ljudski ili veterinarski subjekat (uključujući ne-humane primate, ne-simijanske primate, i druge sisare)in vitro, ex vivoiin vivo.
[0087] U jednom ostvarenju, modifikovani adenovirusni vektori kojisu ovde opisani mogu se koristiti kao ekspresioni vektori za proizvodnju produkata koji su kodirani od strane heterologih genain vitro.Na primer, pogodna ćelijska linija je inficirana ili transfektovana sa modifikovanim adenovirusima i kultivisana na konvencionalan način, dopuštajući da modifikovani adenovirus eksprimira genski produkt sa promotora. Genski produkt može da se dobije iz medijuma za gajenje pomoću poznatih konvencionalnih metoda za izolaciju proteina i oporavak iz kulture.
[0088] U drugom ostavrenju, modifikovani adenovirusni vektor iz pronalaska obezbeđuje sredstvo za efikasan transfer gena koje može da distavi odabrani transgen do odabrane domaćinske ćelijein vivoiliex vivo.Na primer, modifikovani virusni vektori iz pronalaska mogu se koristiti za dostavljanje teraputskih ili imunogenih molekula, kao što je dole opisano. U jednom ostvarenju, terapeutski režim ili režim vakcinisanja uključiće ponavljanje dostavljanja rekombinantnih virusnih vektora. Ovakvi režimi tipično uključuju dostavu serije virusnih vektora u kojima su virusni kapsidi promenjeni. Virusni kapsidi mogu biti promenjeni za svaku sledeću dostavu, ili nakon preselektovanog broja dostava određenog serotipa kapsida (na primer, jedan, dva, tri, četiri ili više). Zato, režim može da uključi dostavu Ad sa prvim kapsidom, dostavu sa Ad sa drugim kapsidom, i dostavu sa trećim kapsidom. U drugim ostvarenjima, može biti selektovan onaj režim koji koristi samo modifikovane Ad kapside iz prinalaska, u kombinaciji jednih i drugih, ili u kombinaciji sa drugim Ad serotipovima, što će biti očigledno onima koji su stručnjaci za ovu oblast. Opcionalno, ovakav režim može da uključi dostavu Ad sa kapsidima adenovirusa iz ne-humanih primata, humane adenoviruse, ili veštačke (na primer, himerne) serotipove kao koji su ovde opisani. Svaka faza režima može da uključi dostavljanje serije injekcija (ili drugih puteva dostave) sa pojedinačnim kapsidom odreženog Ad serotipa nakon čega slede serije sa Ad kapsidom drugog serotipa. Alternativno, modifikovani Ad vektori iz pronalaska mogu se koristiti u režimima koji uključuju druge sisteme za dostavu koji nisu posredovani adenovirusom, uključujući druge virusne sisteme, ne-virusne sisteme za dostavu, protein, peptide, i druge biološki aktivne moelkule.
[0089] Odeljci koji slede fokusiraće se na egzemplarne molekule koji se mogu dostaviti preko modifikovanih adenovirusnih kapsida (na primer u proteinskoj formi) ili modifikovanih adenovirusnih vektora iz pronalaka.
[0090] U jednom ostvarenju modifikovani Ad vektori koji su ovde opisani dostavljaju se ljudima na osnovu objavljenih metoda za gensku terapiju. Virusni vektor iz pronalaska koji nosi selektovani transgen može da se dostavi pacijentu, poželjno rastvoren u biološki kompatibilnom rastvoru ili farmaceutski prihvatljivom sredstvu za dostavu. Pogodno sredstvo za dostavu uključuje sterilni fiziološki rastvor. Drugi vodeni i ne-vodeni izotonični sterilni rastvori za injeciranje i vodene i ne-vodene sterilne suspenizje poznate kao farmaceutski prihvatjivi nosači dobro su poznati onima koji su stručni u ovoj oblast i mogu se upoterbiti za ovu svrhu.
[0091] Modifikovani adenovirusni vektori dostavljaju se u dovoljnim količinama da bi se obezbedio željeni fiziološki efekat. Konvencionalni i farmaceutski prihvatljivi putevi dostavljanja ukjlučuju ali nisu njima limitirani, direktnu dostavu do retine i druge intraokularne puteve dostave, direktnu dostavu do jetre, inhalaciju, intranazalne, intravenozne, intramuskularne, intratrahealne, potkožne, intradermalne, rektalne, oralne, intraokularne, intrakohlearne, i druge parenteralne puteve dostave. Put za dostavu može biti kombinovan, ako je poželjno ili podešen u zavisnosti od transgena ili stanja. Put za dostavu će primarno zavisiti od prirode stanja koje se tretira.
[0092] Doze viralnog vektora zavisiće od stanja koje se tretira, godina, telesne težine i zdravlja pacijenta, i zato može da varira između pacijenata. Na primer, terapeutski efektivna doza za ćoveka ili veterinarska doza virusnog vektora generalno je u opsegu od oko 100 uL do oko 100 mL nosača koji sadrži koncentracije od oko 1 x IO6 do oko 1 x 10<15>partikula, oko 1 x 10<11>do oko 1 x 10<13>partikula, ili oko 1 x IO<9>do oko 1 x IO<12>partikula virusa. Opseg doza zavisiće od veličine životinje i puta za dostavljanje. Na primer, pogodna humana ili veterinarska doza (za životinju od oko 80 kg) za intramuskularno injektiranje je u opsegu od oko 1 x IO<9>do oko 5 x IO12 partikula po mL, za pojedinačno mesto. Opcionalno, dostava se može se izvršiti na više mesta. U drugom primeru, pogodna humana ili veterinarska doza može biti u opsegu 1 x 10<11>do oko 1 x 10b partikula za oralnu formulaciju. Stručnjak iz oblasti može da podesi doze, u zavisnosti od puta dostave, i terapeutske primene ili primene injekciranjem za rekombinantni vektor koji se koristi. Nivoi ekspresije transgena, ili imunogena, nivo antitela koja cirkulišu, mogu se posmatrati da bi se odredila frekvenca doziranja dostave. Naravno stručnjacima iz oblasti biće odmah očigledne druge metode za određivanje vremena frekvence dostave.
1. Terapeutski molekuli
[0093] U jednom aspektu, modifikovani adenovirusni hekson proteini mogu da sadrže inserte jednog ili više terapeutskih transgena, u cilju olakšavanja ciljanja i/ili za upotrebu u terapeutskom režimu kao što je ovde opisano. U drugom aspektu, modifikovani adenovirusni vektori iz pronalaska mogu da nose u sebi upakovan jedan ili više transgena.
[0094] Korisni terapeutski proizvodi kodirani transgenom uključuju hormone i faktore rasta i diferencijacije uključujući, bez ograničenja, insulin, glukagon, hormon rasta (GH), paratiroidni hormon (PTH), oslobađajući faktor hormona rasta (GRF), stimulušući faktor folikula (FSH), lutenizirajući hormon (LH), humani horionski gonadotropin (hCG), vaskularni endotelijalni hormon rasta (VEGF), angiopoetine, angiostatine, stimulurajući faktor granulocitnih kolonija (GCSF), eritropoetin (EPO), faktor rasta vezivnog tkiva (CTFG), bazični hormon rasta fibroblasta (bFGF), kiseli faktor rasta fibroblasta (aFGF), epidermalni faktor rasta (EGF), transformirajući faktor rasta a (TGF a), faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), insulinski faktor rasta I i II (IGF-I i IGF-II)), i bilo koji od superfamilije transfromišučćih faktora rasta, uključujući TGF, aktivine, inhibine, i bilo koji od koštanih morfogenih proteina (BMP) BMPs 1-15, bilo koji od familije faktora rasta heregulin/neureuglin/ARAI/neu faktora diferencijacije (NDF), nervni faktor rasta (NGF), neutrofični faktor izveden iz mozga (BDNF), neutrofini NT-3 i NT-4/5, cilijarni neutrofični fsktor (CNTF), neutrofični faktor izveden iz želijske linije glije, neurturin, agrin, bilo koji od familije semaforina/kolapsina, netrin-1 i netrin-2, faktor rasta hepatocita (HGF), efrini, nogini, "sonic hedgehog" i tirozin hidroksilaze.
[0095] Drugi korisni transgeni proizvodi uključuju proteine koji regulišu imuni svstem, uključujući, bez ograničenja, citokine i limfokine kao što je trombopoetin (TPO), interleukine (IL) IL-1 do IL-25 (uključujući, na primer, IL-2, IL-4, 11-12 i IL-18), monocitni protein hemoatraktant, faktor inhibicije leukemije, stimulišući faktor garnulocitnih-makrofagnih kolonija, Fas ligand, faktor nekroz tumora i , interferone, faktor stem ćelija, flk-2/flt3 liganđ. Genski produkti proizvedeni od strane imunog sistema takođe su korisni za pronalazak. Ovi uključuju, bez ograničenja, imunoglobuline IgG, IgM, IgA, i IgE, himerne imunoglobuline, humanizovana antitela, jednolančana antitela, T ćelijske receptore, himerne T ćelijske receptore, MHC molekule klase I i II, kao i konstruisane imunoglobuline i MHC molekule. Korisni genski produkti takođe obuhvataju komplementarne regulatorne proteine kao komplementarne regulatorne proteine, membranski proteini kofaktora (MCP), faktor ubrzavanja raspada (DAF), CR1, CF2, i CD59. Dalje, korisni genski pordukti uključuju bilo koji od receptora za hormone, faktore rasta, citokine, limfokine, regulatorne proteine, i proteine imunog sistema. Pronalazak obuhvata receptore za regulaciju holesterola, uključujući receptor za lipoprotein male gustine (LDL), receptor za lipoprotein velike gustine (HDL), receptor za lipoprotein veoma male gustine (VLDL), proteine korisne u regulaciji lipida, uključujući na primer, apolipoprotein (apo) A i njegove izoforme (na primer ApoAI), ApoE i njegove izoforme uključujući E2, E3 i E4), SRBI, ABC1, i "scavanger" receptor. Pronalazak takođe obuhvata genske produkte kao što su članovi superfamilije steroidnih hormonskih receptora uključujući glukokortikoidne receptore i estrogenske receptore, receptore vitamina D i druge nuklearne receptore. Dodatno, korisni genski produlti uključuju transkripcione faktore kao jun, fos, max, mad, faktor odgovora na serum (SRF), Ap-1, AP2, myb, MyoD i miogenin, proteini koji sadrža ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SPI, CCAAT-box vezujući proteini, faktor regulacije interferona (IRF-1), Wilms tumor protein, ETS vezujući protein, STATA, proteini koji sadrže GATA-box, na primer, GATA-3, i "forkhead" familija "winged" heliks proteina.
[0096] Drugi korisni genski proizvodi uključuju karbamoil sintetazu i, ornitin transkarbamilazu, arginosukcinat sintetazu, arginosukcinat liazu, arginazu, fumarilacetacetat hidrolazu, fenilalanin hidroksilazu, alfa-1 antitripsin, glukozo-6-fosfatazu, porfobilinogen deaminazu, cistation beta-sintazu, dekarboksilazu keto kiseline sa razgranatim lanacima, albumin, izovaleril-coA dehidrogenazu, propionil CoA karboksilazu, metil malonil CoA mutazu, glutaril CoA dehidrogenazu, insulin, beta-glukozidazu, piruvat karboksilat, hepatičnu fosforilazu, fosforilazu kinaze, glicin dekarboksilazu, H-portein, T-protein, sekvencu transmembranskog regulatora cistične fibroze (CFTR), i sekvencu cDNK distrofina. Drugi korisni geni uključuju one korisne za tretiranje hemofilije A (na primer, Faktor VIII i njegove varijante, uključujući laki lanac i teški lanac heterodimera, opcionalno operativno vezani preko čvora), i faktor VII sa izbačenim (deletiranim) B domenom, videti US Patent Nos. 6,200,560 i 6,221,349) one korisne za tertiranje hemofilije B (na primer Faktor IX).
[0097] Još drugi korisni genski produkti uključuju ne-prirodne polipeptide kao himerne ili hibridne polipeptide koji imaju ne-prirodne amino kiselinske sekvence koje sadrže insercije, delecije ili amino kiselinske zamnene (supstitucije). Na primer, konstruisani jednolančani imunoglovulini mogu biti korisni kod različitih imunokompromitujućih pacijenata. Drugi tipovi ne-prirodnih genskih sekvenci uključuju antisens molekule i katalitičke nukleinske kiseline, kao što su ribozomi, koji bi mogli da se koriste za redukciju prekomernu ciljnu ekspresiju.
[0098] Redukcija i/ili modifikacija ekspresije gena posebno je poželjna za tretiranje hiperproliferativnih stanja koja karakterišu hiperproliferativne ćelije kao što su kanceri i psorijaze. Ciljni (target) polipeptidi uključuju one polipeptide koji se proizvode isključivo ili na višim nivoima u hiperproliferativnim ćelijama kada se uporede sa normalnim ćelijama. Ciljni antigeni uključuju polipeptide kodirane od strane onkogena kao što je myb, myc, fyn, i gen za translokaciju bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk i EGRF. Pored proizvoda onkogena kao target antigena, ciljni polipeptidi za anti-kancerne tretmane i zaštitne režime uključuju varijabilne regione antitela koje prizvode limfome B ćelija i varijabilne regione receptora T ćelija T ćelisjkih limfoma koji, u nekim ostvarenjima takođe se koriste kao cilnji antigeni za autoimmune bolesti. Drugi polipeptidi povezani sa tumorima mogu se koristiti kao ciljni polipeptidi kao polipeptidi koji se mogu naći pri višim nivoima u ćelijama tumora uključujući polipeptid koga prepoznaje monoklonalno antitelo 17-1A i folat vezujući polipeptidi.
[0099] Drugi pogodni terapeutski polipeptidi i proteini uključuju one koji mogu biti korisni za tretiranje individua koje pate od autoimunih bolesti i poremećaja putem obezbeđivanja širokog zaštitnog imunog odgovora protiv targeta koji su povezani autoimunošću uključujući ćelijske receptore i ćelije koje proizvode antitela usmerena na sebe. Autoimune bolesti posredovane T ćelijama uključuju reumatoidni artritis (RA), multiple sklerozu (MS), Sjorgensov sindrom, sarkodiozu, diabetes melitis zavistan od insulina (IDDM), autoimuni tireoiditis, reaktivni artritis, ankilozni spondilitis, sklerodermu, polimiozitis, dermatomiozitis, psoriazu, vaskulitis, Wegnerov granulomatozis, Kronovu bolest i ulcerativni kolitis. Svaku od ovih bolesti karakterišu T ćelijski receptori (TCR) koji se vezuju za endogene antigene i iniciraju inflaminatornu kaskadu koja je povezana sa autoimunim bolestima.
[0100] Modifikovani adenovirusni vektori iz pronalaska posebno su pogodni za terapeutske režime u kojima višestruke dostave željenih transgena koje su posredovane adenovirusom, na primer, u režimima koji uključuju ponovnu dostavu iztog transgena ili u kombinovanim režimima koji uključuju dostavu drugih transgena. Ovakvi režimi mogu da uključe dostavu željenog modifikovanog adenovirusnog vektora iz pronalaska, u kome se serotip virusnog vektora dostavljen u prvoj dostavi razlikuje od serotipa virusnog vektora koji je upotrebljen u jednoj ili više naknadnih dostava. Na primer, terapeutski režim uključuje dostavu modifikovanog adenovirusa i ponovljenu dostavu sa jednim ili više modifikovanih adenovirusa istog ili različitog serotipa. U drugom primeru, terapeutski režim uključuje dostavu adenovirusnog vektora nakon čega nastupa ponovna dostava sa modifikovanim adenovirusnim vektorom iz pronalaska koji se razlikuje od serotipa onog adenovirusnog vektora koji je prvi dostavljen, i opcionalno sledi dalja dostava sa drugim vektorom koji je isti ili poželjno različit od serotipa vektora iz prethodnih koraka dostave. Ovi režimi nisu limitirajući za dostavu adenovirusnih vektora koji su konstruktovani pomoću himernih serotipova iz pronalaska. Takođe, ovi režimi mogu odmah da koriste vektore drugih adenovirusnih serotipova (bilo modifikovani ili ne), koji mogu biti veštački, od humanih ili ne-humanih primata, ili iz drugih sisarskih izvora, u kombinaciji sa jednim ili više himernih vektora iz pronalaska. Primeri ovakvih serotipova diskutovani su na drugim mestima u dokumentu. Dalje, ovi teraputski režimi mogu da uključe ili simultanu ili sekvencijalnu dostavu modifikovanih adenovirusnih vektora iz pronalaska u kombinaciji sa ne-adenovirusnim vektorima, ne-viralnim vektorima, i/ili u kombinaciji sa različitim drugim terapeutski korisnim jedinjenjima ili molekulima. Ovaj pronalazak nije ograničen ovim terapeutskim režimima, a mnogi će biti očigledni stručnjacima iz ove oblasti.
2. Davanje imunogenih transgena
[0101] Kao stoje ranije opisano, modifikovani adenovirusni protein hekson sam po sebi može biti modifikovan da sadrži odabrani peptid, polipeptid ili protein koji indukuje imuni odgovor na odabrani imunogen. Ovako modifikovan adenovirusni heskon protein sam može biti upotrebljen da se generiše adenovirusni kapsid koji sam po sebi je koristan za ciljanje, kao adjuvant, i/ili za indukovanje specifičnog imunog odgovora. U daljem ostvarenju, ovako modifikovani adenovirusni kapsid koristi se za generisanje virusne partikule u kojoj je upakovana pogodna ekspresiona kaseta ili minigen.
[0102] Zato, u jednom ostvarenju, modifikovan adenovirusni vektor iz pronalaska dalje sadrži u okviru adenovirusnog kapsida, upakovan transgen koji kodira peptid, polipeptid ili protein koji indukuje imuni odgovor na odabrani imunogen. Ovako modifikovani adenovirusi iz ovog pronalaska mogu da obezbede 'self-priming' efekat, efekat adjuvanta i/ili mogu biti izuzetno efikasni u indukciji citolitičnih T-ćelija i/ili antitela na insertovanom(im) heterolognomi(im) proteinu(ima) koje eksprimira vektor.
[0103] Adenovirusi iz pronalaska mogu se takođe koristiti kao imunogene kompozicije. Rekombinantni adenovirusi mogu se koristiti kao profilaktičke ili terapeutske vakcine protiv bilo kog patogena za koji je antigen(i) koji je krucijalan za indukciju imunog odgovora i koji može da ograniči širenje patogena, za koji je identifikovan i za koji je dostupna cDNK.
[0104] Ovakva kompozicija za vakcinu (ili druge imunogene kompozicije) su formulisane u pogodnom sredstvu za dostavu kao što je opisano gore u tekstu. Generalno, doze za imunogene kompozicije su u opsegu koji je gore defmisan za terapeutske kompozicije. Nivoi imuniteta odabranih gena mogu se posmatrati da bi se odredila potreba, ako postoji za pojačavanjem. Nakon procene titra antitela u serumu, opcionalne imunizacije za pojačanje imunog odgovora ('booster immunization') mogu biti potrebne.
[0105] Opcionalno, kompozicija vakcine iz pronalaska može biti formulisana da sadrži druge komponente, uključujući na primer, adjuvante, stabilizatore, pH podešivače, prezervative i slične. Ovakve komponente dobro su poznate u nauci onima koji se bave vakcinama. Primeri pogodnih adjuvanata uključuju bez ograničenja, lipozome, stipsu, monofosforil lipid A, i bilo koji biološki aktivan faktor kao citokini, interleukin, hemokin, Ugandi, i njihove optimalne kombinacije. Neki od ovih biološki aktivnih faktora može biti eksprimiranin vivo,na primer preko plazmida ili virusnog vektora. Na primer, ovakav adjuvant može da se dostavi sa prvom ("priming") DNK vakcinom koja kodira antigen da bi se pojačao antigen specifični imuni odgovor u odnosu na imuni odgovor koji se generiše nakon prvog vakcinisanja ("priming") sa DNK vakcinom koja kodira samo antigen.
[0106] Ovi adenovirusi se dostavljaju u "imunogenoj količini" koja je količina adenovirusa koja je efektivna na putu dostave putem transfekcije željenih ćelija i obezbeđuje dovoljne nivoe ekspresije odabranog gena da bi se indukovao imuni odgovor. Tamo gde je obezbeđen protektivni imunitet, adenovirusi se smatraju da su kompozicije vakcine korisne za sprečavanje infekcije i/ili bolesti koja se vratila.
[0107] Na primer, imunogeni mogu biti odabrani iz različitih familija virusa. Primer poželjne familije virusa protiv koga je poželjan imuni odgovor, uključuje familiju pikorna virusa, koja uključuje rodove rinovirusa, koji su odgovorni za otprilike 50% slučajeva obične prehlade; rodove enterovirusa, koji uključuju polio viruse, koksaki virues, eho viruse, i humane enteroviruse kao što je hepatitis A virus; i rodove aftovirusa, koji su odgovorni za bolest slinavku i šap, primarno ne-humanih životinja. U okviru virusne familije pikorna virusa, ciljni antigeni uključuju VP1, VP2, VP3, VP4 i VPG. Još jedna virusna familija uključuje familiju kalci virusa, koja obuhvata Norwalk grupu virusa, koji su bitni uzročni agensi epidemijskog agstroenteritisa. Još jedna virusna familija poželjna za upoterbu u ciljanju antigena za indukciju imunih odgovora u ljudima i ne-humanim životinjama je familija toga virusa, koja uključuje rodove alfavirusa, koja uključuje Sindbis viruse, Ross-River virus, i venecuelanski, istočni & zapadni konjski encefalitis, rubi virus, uključujući rubeola virus. Familija flaviviridae uključuje sledeće viruse, danga, žutu groznicu, Japanski encefalitis, St. Louis encefalitis i encefalitis koji se prenosi buvom. Drugi ciljni antigeni mogu se generisati iz familije hepatitis C ili korona virusa, koji uključuju mnogobrojne ne-humane viruse kao što je infektivni virus bronhitisa (živina), prenosivi gastroenterišni virus svinja (svinja), svinjski hemaglutinatin encefalomijelitis virus (svinja), virus mačijeg infektivnog peritonitisa (mačkw), mačiji enterični korona virus (mačka), pseći korona virus (pas), i humani respiratorni korona virusi, koji mogu da izazovu običnu prehladu i/ili ne-A, B ili C hepatitis. Dodatno, humani korona virusi uključuju pretpostavljeni agens uzročnik iznenadnog akutnog respiratornog sindroma (SARS). U okviru familije korona virusa, ciljni antigeni uključuju El, (takođe nazvan M ili protein matriksa), E2 (takođe nazvan S ili "spike" protein), E3 (takođe nazvan HE ili hemaglutinin-elteroza), glikoprotein (nisu prisutni kod svih korona virusa), ili N (nukleokapsid). Još drugi antogeni mogu biti ciljani protiv familije rabdo virusa, koja uključuje rodove vezikulo virusa (na primer, vezikularni stomatitis virus), i opšti lizavirus (na primer besnilo). U okviru familije rabdo virusa, pogodni antigeni mogu biti izvedeni iz G proteina ili N proteina. Familija filoviridae, koja uključuje viruse hemoralgične groznice kao Mraburški i ebola viruse, može biti pogodan izvor antigena. Familija paramikso virusa uključuje parainfluenca virus tipa 1, parainfluenca virus tipa 3, goveđi parainfiuenca virus tipa 3, rubula virus (virus zauški), parainfluenca virus tipa 2, parainfluenca virus tipa 4, virus Nevvcastle oboljenja (pilići), "rinderpest", virus morbila, koji uključuje male boginje i pseći distemper, i pneumo virus, koji uključuje respiratorni sincicijalni virus. Virus influence je klasifikovan u okviru familije ortomikso virusa i pogodan je izvor antigena (na primer, HA protein, NI protein). Familija bunja virusa uključuje rodove bunja virusa (Kalifornijski encephalitis, La Crosse), flebo virus (Rift Vallev Fever), hanta virus (puremela je virus hemahaginske groznice), nairovirus (Nairobi bolest ovaca) i različite neobeležene bunga viruse. Familija arana virusa obezbeđuje izvor antigena protiv LCM i virusa Lasa groznice. Familija reovirusa uključuje rodove reovirusa, rotavirusa (koji izazivaju akutni gastroenteritis kod dece) orbi viruse, i kulti viruse (Colorado Tick fever, buvlja groznica iz Kolorada), Lebombo (ljudi), konjski encefalitis, plavi jezik. Familija retrovirusa uključuje okorivirinal podfamiliju koja obuhvata one humane i veterinarske bolesti kao virus mačije leukemije, HTLVI i HTLVII, lentivirinal (FIV), virus konjske infektivne anemije, simijanski virus imunodeficijencije (SIV), mačiji virus imunodeficijencije (FIV), virus konjske infektivne anemije, i spumavirinal). Među lentivirusima, mnogi pogodni antigeni su opisani i mogu se odmah odabrati.
[0108] Primeri pogodnih HIV i SIV antigena uključuju, bez ograničenja gag, pol, Vif, vpx, VPR, Env, Tat, Nef, i Rev proteine, kao i različite njihove fragmenta. Na primer, pogodni fragmenti Env proteina mogu da uključe bilo koju od svojih subjedinica kao gp 120, gp 160, gp41, ili njihove manje fragmente, na primer, najmanje 8 amino kiselina u dužinu. Slično, fragmenti tat proteina mogu biti odabrani [videti US Patent 5,891,994 i US Patent 6,193,981]. Videti takođe HIV i SIV proteine koji su opisani u D.H. Barouch et al., J. Virol., 75(5):2462-2467 (Mart 2001), i R.R. Amara et al., Science, 292:69-74 (6. April 2001). U drugom primeru, HIV i/ili SIV imunogeni proteini ili peptidi mogu se koristiti da se naprave fuzioni proteini ili drugi imunogeni molekuli. Videti, na primer, HIV-1 Tat i/ili Nef fuzione proteine i režime imunizacije opisane u WO 01/54719, objavljeno 2. Avgusta 2001 i WO 99/16884, objavljeno 8. Aprila 1999. Pronalazak nije ograničen sa HIV i/ili SIV imunogenim proteinima ili peptidima koji su ovde opisani. Dodatno, različite modifikacije ovih proteina su opisane ili se mogu odmah napraviti od strane stručnjaka iz oblasti. Videti na primer modifikovani gag protein koji je opisanu US patent 5,972,596. Dalje, bilo koji željeni HIV i/ili SIV imunogen može se dostaviti sam ili u kombinaciji. Ovakve kombinacije uključuju ekspresionu formu pojedinačnog vektora ili više vektora. Opcionalno, druga kombinacija može da uključi dostavu jednog ili više eksprimiranih imunogena sa dostavom jednog ili više imunogena u obliku proteina. Ovakve kombinacije diskutovane su detaljnije u tekstu koji sledi. Familija papovirusa uključuje podfamlije polioma virusa (BKU i JCU virusi) i podfamliju papiloma virusa (povezani sa kancerima i malignim progresijama papiloma. Familija adenovirusa uključuje viruse (EX, AD7, ARD, O.B.) koji izazivaju respiratorna obolenja i/ili enteritis. Familija parvovirus uključuje familije mačijeg parvovirusa (mačiji enteritis), mačiji panleukopenija virus, pseći parvovirus, i svinjski parvovirus. Familija herpes virusa uključuje podfamiliju alphaherpesvirinae, koja obuhvata rodove genera simplexvirus (HSVI, HSVII), varicellovirus (pseudo besnilo, varicella zoster) i podfamiliju betaherpesvirinae, koja uključuje rodove cvtomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) i podfamiliju gammaherpesvirinae, koja uključuje rod lymphocryptovirus, EBV (Burkitts limfom), infektivni rinotraheitis, Marek's disease virus, i radinovirus. Familija pox virusa uključuje podfamiliju chordopoxvirinae, koja obuhvata rod orthopoxvirus (Variola (velike boginje) i Vaccinia (kravlje boginje)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, i podfamiliju entornopoxvirinae. Familija hepadna virusa uključuje virus Hepatitis B. Jedan neklasifikovani virus koji može da bude pogodan izvor antigena je Hepatitis delta virus. I dalje, drugi viralni izvori mogu da uključe ptičiji infektivni "bursal disease" virus i svinjski virus respiratornog i reproduktivnog sindroma. Familija alfa virusa uključuje konjski "arteritis" virus i različite Encephalitis viruse.
[0110] Virusi iz ovog pronalska mogu takođe da nose imunogene koji su korisni za imunizaciju humanih ili ne-humanih životinja protiv drugih patogena uključujući bakterije, gljive, parazitske mikroorganizme ili višećelijske parasite koji inficiraju humane i ne-humane kičmenjake, ili formiraju želije raka ili ćelije tumora. Primeri bakterijskih patogena uključuju Gram pozitivne koke uključujući pneumokoke; stafilokoke; i streptokoke. Patogene Gram negativne koke uključuju meningokoke; gonokoke. Patogene enterične Gram negativni bacili uključuju enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobakterije i eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (koja uzrokuje "chancroid"); brucella; Franisella tularensis (koja izaziva tularemijul); yersinia (pasteurelia); streptobacillus moniliformisi spirillum; Gram pozitivni bacilli uključuju vrste listeria monocvtogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (djfterija); kolera; B. anthracis (antraks); donovanozis (granuloma inguinale); i bartonelozis. Oboljenja uzrokovana patogenim anaerobnim bakterijama uključuju, tetanus; botulizam; druge klostridije; tuberkulozu; lepru; i druge mikobakterije. Patogene spirohete izazivaju bolesti koje uključuju sifilis; trepanematoze; frambezija (yaws), pintu i endemski sifilis; i leptospiroze. Druge infekcije izazvane višim patogenim bakterijama i patogenim gljivama uključuju aktinomikoze; nokardioza; kriptokokoza, blastomikoza, histoplazmoza i kokcidiomikoza; kandidiaze, aspergiloze, i mukomikoze; sporotrihoze; parakokcidiomikoza, petrielidoza, torulopsoza, micetoma i hromomikoza; i dermatofitiza.lnfekcije izazvane rikecijama uključuju tifusnu groznicu, "Rocky Mountain spotted " groznicu, Q groznicu i Rickettsialpox. Primeri infekcija izazvani mikoplazmama i hlamidijama uključuju: upalu pluća izazvanu rikecijom, venerični limfogranulom; psitakozu; i perinatalne infekcije izazvane hlamidijom. Patogeni eukarioti obuhvataju patogene protozoe i crevne gliste i infekcije tako uključuju: amebijaze; malariju; leišmanijaze; tripanozomijaze; toksoplazmoze; Pneumocystiscarinii; Trichans; Toxoplasma gondii; "babesiosis"; gijardijaze; trihinoze; filarijaze; šistostomijaze; nematode; trematodes ili pljosnati crvi; i cestode (pantljičare) infekcije. Mnogi od ovih organizama i/ili toksina koje oni proizvode identifikovani su od strane centra za kontrolu bolesti - Centers for Disease Control [(CDC), Department of Heath and Human Services, USA], kao agensi koji imaju potencijal za upotrebu u biološkom napadu. Na primer, neki drugi biološki agensi uključuju, Bacillus anthracis (anthraks), Clostridium botulinum i njegov toksin (botulizam), Yersinia pestis (kuga), variola major (velike boginje), Francisellatularensis (tularemija), hemoralgične groznice izazvane virusom [filo virusi (na primer, Ebola, Marburg], i arena virusi [e.g., Lassa, Machupo]), svi oni su trenutno kalsifikovani kao kategorija A agenasa; Coxiella burnetti (Q groznica); Brucella species (bruceloza), Burkholderia mallei ("glanders", sakagija), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis i njegov toksin (ricin toksin), Clostridium perfringens i njegov toksin (epsilon toxin), Staphylococcus vrste i njihovi toksini (enterotoksnB), Chlamydia psittaci (psitakoza), pretnja za bezbednost vode (na primer, Vibrio cholerae, Crvtosporidium parvum), tifusna groznica (Richettsia powazekii), i viralni encefalitis (alfa virusi, e.g., Venecuelanski konjski encefalitis; istočni konjski encefalitis; zapadni konjski encefalitis); svi oni su trenutno klasifikovani kao B kategorija agensa; i Nipan virus i hanta virusi koji su ternutno klasifikovani kao C kategorija agensa. Dodatno, drugi organizmi koji su tako klasifikovani ili su klasifikovani na drugi način, mogu biti identifikovani i/ili upotrebljeni za ovakve potrebe u budućnosti. Biće odmah razumljivo da viralni vektori i konstrukti koji su ovde opisani su korisni za dostavu antigena iz ovih organizama, virusa, njihoovuh toksina ili drugih dodatnih produkata, koji će sprečiti i/ili tretirani infekciju ili druge loše reakcije sa tim biološkim agensima.
3. Postupci davanja
[0112] Terapeutski nivoi, ili novoi imunosti, odabranih gena mogu se posmatrati da bi se odredila potreba, ako postoji, za pojačivačima immune reakcije (busteri-boosters). Nakon procene CD8+T ćelijskog odgovora, ili opcionalno, titara antitela, u serumu, opcionalno može biti potrebna buster imunizacija. Opcionalno, adenovirusni vektori iz pronalaska mogu se dostaviti u pojedinačnoj dostavi ili u okviru različitih kombinacija režima, na primer, u kombinciji sa režimom ili tokom tretmana koji uključuje druge aktivne sastojke ili u režimu izazivanja primarnog i udarnog imunog odgovora ('prime-boosting'). Veliki broj različitih ovakvih režima opisano je u nauci i može se odmah odabrati. Na primer, 'prime-boost' režimi mogu uključiti dostavljanje vekora koji se bazira na DNK (na primer plazmid) da bi se izazvala prva reakcija (prime) imunog sistema na drugi ili sledeći, buster, dostava sa tradicionalnim antigenom, kao što je protein ili rekombinantni virus koji nosi sekvencu koja kodira ovakav antigen. Videti na primer, Međunarodnu objavu patenta br. WO 00/11140, publikovan 2. Marta 2000. Alternativno, režim imunizcije može uključiti dostavljanje modifikovanog adenovirusnog vektora iz pronalaska da bi se pojačao imuni odgovor na vektor (ili viralni ili baziran na DNK)) koji nosi antigen, ili protein. U još jednoj alternativi, režim imunizacije uključuje dostavu proteina nakon čega sledi buster sa vektorom koji kodira antigen.
[0113] U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje metod za prvu imunizaciju ("priming") i pojačavanje immune reakcije ("boosting") imunog odgovora na odabran antigen u okviru režima koji uključuje dostavu modifikovanog adenovisrunog vektora iz pronalaska. Ovakav režim može da uključi dostavu plazmidnog DNK vektora koji nosi odabrani imunogen i/ili ekspresiju multiproteina sa "prime" i/ili "boost" sredstva za dostavu. Videti, an primer, R.R. Amara Science, 292:69-74 (6. April 2001) koji opisuje multiproteinski režim za ekspresiju proteinskih subjedinica koje su korisne za generisanje imunog odgovora protiv HIV i SIV. Na primer, "prime" može da dostavi Gag, Pol, Vif, VPX i Env, Tat, i Rev sa jednog transkripta ili sa više transkripta. Alternativno, SIV Gag, Pol i HIV-1 Env dostavlja se kao jedan konstrukt. I dalje drugi režimi su opisani u Međunarodnoj objavi patenta br. WO 99/16884 i WO 01/54719.
[0114] Međutim, "prime-boost" režimi nisu ograničeni na imunizaciju sa HIV ili za dostavu ovih antigena. Na primer, prva imunizacija (priming) može da uključi dostavu sa prvim vektorom nakon čega sledi pojačavanje imunog odgovora sa drugim vektorom, ili sa kompozicijom koja sadrži sam antigen u proteinskoj formi. U jednom primeru, "prime-boosting" režim može da obezbedi protektivni imuno odgovor na virus, bakteriju ili drugi organizam iz koga je izveden antigen. U drugom poželjnom ostvarenju, "prime-boost" režim obezbeđuje terapeutski efekat koji se može izmeriti upotrebom konvencionalnih testa za detekciju prisustva stanja za koje je terapija i davana.
[0115] Kompozicija za prvu imunološku reakciju ('priming composition') može se dostaviti na različita mesta u telu na dozno zavistan način, koji zavisi od antigena za koji je željeni imuni odgovor ciljan. Pronalazak nije limitiran na količinu ilisitus(pozicija) injekcije(a) ili na farmaceutski nosač. Bolje da režim može da uključi "priming" i/ili "boosting" korak, svaki od njih može da uključi jednu dozu ili dozu koja se daje jednom na sat, dan, nedeljno ili mesečno ili godišnje. Kao primer, sisari mogu da prime jednu ili dve doze koje sadrže između oko 10 \ ig do oko 50 u.g plazmida u nosaču. Željena količina DNK kompozicije je u opsegu između oko 1 p.g do oko 10,000 u.g DNK vektora. Doze mogu da variraju od oko 1 (4,g do oko 1000 \ ig DNK po kg telesne težine subjekta. Količina ili mesto dostave je poželjno selektovano na osnovu identiteta i stanja sisara.
[0116] Jedinica doze vektora pogodna za dostavu antigena sisaru ovde je opisana. Vektor se priprema za dostavu tako što se suspenduje ili rastvori u farmaceutski prihvatljivom ili fiziološki prihvatljivom nosaču kao što je izotonični fiziološki rastvor; izotonični rastvor soli ili druge formulacije koje će biti očigledne stručnjacima iz oblasti u takvim dostavama. Kompozicije iz pronalska mogu se dostaviti sisaru na osnovu puteva koji su gore opisani, u formulaciji sa odloženim oslobađanjem koristeći biodegradabilan biokompatibilan polimer, ili dostavom na mesto (on-site) pomoću micela, gelova ili lipozoma. Opcionalno, "priming" korak iz ovog pronalaska takođe uključuje dostavu sa kompozicijom za "priming", pogodnu količinu adjuvanta kao što je ovde definisano.
[0117] Poželjno, "boosting" (pojačivač imunološkog odgovora) kompozicija dostavlja se oko 2 do oko 27 nedelja nakon dostave prve kompozicije (priming) sisarskom subjektu. Dostava kompozicije za pojačavanje postiže se upotrebom efektivne količine kompozicije za pojačavanje koja sdarži ili je sposobna da dostavi isti antigen kao onaj kada se dostavlja "priming" (prva) DNK vakcina. Kompozicija za pojačavanje imunog odgovora može biti sastavljena od rekombinantnog viralnog vektora koji je izveden iz istog virusnog izvora (na primer, adenovirusne sekvence iz pronalaska) ili iz drugog izvora. Alternativno, "kompozicija za pojačanje imunog odgovora" može biti kompozicija koja sadrži isti antigen kao onaj kodiran u prvoj (priming) DNK vakcini, ali u formi proteina ili peptida, čija kompozicija indukuje imuni odgovor u domaćinu. U drugom ostvarenju, kompozicija za pojačanje imunog odgovora sadrži DNK sekvencu koja kodira antigen pod kontrolom regulatorne sekvence koja usmerava njegovu ekspresiju u sisarskoj ćeliji, na primer, vektore kao poznate bakterijske ili virusne vektore. Primarni zahtevi za kompozicija za pojačanje imunog odgovora (boosting composition) su ti da antigen iz kompozicije je isti antigen, ili unakrsno reaktivan antigen kao onaj kodiran u kompoziciji za prvu imunizaciju (priming composition).
[0118] U drugom ostvarenju, modifikovani virusni vektori iz pronalaska takođe su podobni za upotrebu u različitim terapeutskim režimima kao i režimima imunizacije. Ovakvi režimi mogu da uključe dostavu adenovirusnih vektora iz pronalaska simultano ili sekvencijalno sa Ad vektorima sazličitog serotipa kapsida, režima u kojima adenovirusni vectori iz pronalaska se dostavljaju simultano ili sekvencijalno sa ne-Ad vektorima, režimima u kojima adenovirusni vektori iz pronalaska se dostavljaju simultano ili sekvencijalno sa proteinima, peptidima, i/ili drugim biološki korisnim terapeutskim ili imunogenim jedinjenjima. Ovakve upotrebe biće odmah očigledne stručnjacima iz oblasti.
[0119] Zato ovaj pronalazak obezbeđuje imunogene kompozicije za upotrebu u različitim tretmanima i režimima vakcinisanja koji obuhvataju modifikovani adenovirusni protein hekson iz pronalaska. U jednom ostvarenju, modifikovani adenovirusni protein hekson može se dostaviti subjektu u formi praznog modifikovanog adenovirusnog kapsida (to jest, adenovirusni kapsid koji sdarži modifikovani protein hekson koji nema u sebi upakovane minigene za dostavljanje za ciljnu ćeliju). U drugom ostvarenju, vektor koji eksprimira hekson u ciljnoj ćeliji može da se koristi. U još jednom ostvarenju, modifikovana adenovirusna partikula koja nosi minigen dostavlja se subjektu.
[0120] Ovako modifikovana adenovirusna partikula može da sadrži u svom modifikovanom kapidu ciljnu sekvencu. Međutim, ovako modifikovana virusna partikula može da fromira bazu za "self-priming" imunogenu kompoziciju. Ovakva "self-priming" kompozicija može se pripremiti kada je egzogena amino kiselinska u adenovirusnom kapsidu imunogen, i kada kapsid ima takođe upakovan u sebi sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunogen. Kao što je ovde opisano, imunogen u kapsidnom porteinu i imunogen koji se nalazi u okviru molekula koji je upakovan u kapsid mogu biti isti, mogu uključiti imuni odgovor na isti virus ili organizam. U drugom ostvarnju, "self-priming" adenovirusna partikula iz pronalaska može da sadrži u okviru svog kapsida imunogen koji indukuje ne-specifičan imuni odgovor i u sebi ima upakovan pomenuti drugu imunogen koji indukuje specifičan ili unakrsno reaktivan imuni odgovor na odabrani tip ćelije, molekul ili organizma.
Primeri
[0121] Primeri koji slede su ilustrativni, i nisu ograničavajući za pronalazak i ona ilustrovana ostvarenja.
[0122] Pronalazači su demonstrirali da se vijabilni adenovirusni mutant može generisati i ti da sadrži deleciju od 25 amino kiselina (ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK, SEQ ID NO: 11) u okviru heksona (HVR1 region kao što je definosao Rux, et al, (2003) koji je gore citiran.
[0123] Pronalazači su demonstrirali da egzogeni segment DNK koji kodira željenu peptidnu peptidnu sekvencu (u ovom primeru peptidnu sekvencu - EQELLELDKWASLW, SEQ ID NO: 12 - koja odgovara delu proteina omotača HlV-a za koju je prijavljeno da nosi HIV neutralizacioni epitop) može se ubaciti na mesto delecije. Primer 1: Inserciona mutageneza HAdV 5 heksona
[0124] Koraci u procesu kloniranja koji se preduzeti da se mutira DNK sekvenca heksona da bi ona kodirala sekvencu stranog peptida bili su sledeći.
[0125] AscI fragment iz AdV-5 genoma koji nosi region koji kodira hekson je subkloniran u plazmid pNEB193 (kupljen od Nevv England Biolabs) da bi se kreirao pNEBAsc (videti SI. 1).
[0126] PCR (lančana reakcija polimeraze) mutageneza se izvodi na heksonu da bi se kreiralo novo Spel mesto na mestu insercije. Detalji PCR mutageneze da bi se kreiralo Spel mesto su sledeći.
[0127] PCR matrica za reakcije 1 i 2 je pNEBAsc (Ad5 AscI fragment koji sadrži heksonski region kloniran u plazmid pNEB193). Produkti reakcije 1 i 2 su kombinovani i upotrebljeni kao matrica za reakciju 3. PCR enzim koji je korišćen je bio Tgo polimeraza. Smena ciklusa za sve tri reakcije bila je sledeća: 94° - 30 sek., 45° - 60 sek., 72°-60 sek., 40 puta.
[0128] Za Reakciju 1, prajmeri "5hexl" (GACCGCCGTTGTTGTAACCC, SEQ IDNO: 13) i
"It rev" (GTTGTCATCGTCCACTAGTCCCTCTTCTTCTAGGTTTATTTCAAG, SEQ ID
NO: 14) upotrebljeni su za umnožavanje fragmenta od 713 bp.
[0129] Za Reakciju 2, prajmeri "rt fwd" (GGACTAGTGGACGATGACAACGAAGACGA, SEQ ID NO: 15) i "rt rev" (ATGGTTTCATTGGGGTAGTC, SEQ ID NO: 16) upotrebljeni su za umnožavanje fragmenta od 259 bpp.
[0130] Za reakciju 3, fragmenti koji su dobijeni u Reakciji 1 i Reakciji 2 su spojeni zajedno pomoću prajmera "5hexl" i "rt rev" što je rezultovalo u stvaranju produkta od 951 bp. Spojeni produkt od 951 bp isečen je sa BlpI; dobijeni fragment od 518 bp je upotrebljen za zamenu nativnog BlpI fragmenta od pNEBAsc da bi se dobio pNEBAscSpe. Ovaj insert GGACTAGTG [nt 1 - 9 od SEQ ID NO: 15] (kodira amino kiseline GLV) koji sadrži Spel mesto između EEE i DDD (između ak # 149 i 150) u heksonskoj amino kiselinskoj sekvenci.
[0131] Sientetički DNK fragmenti koji kodiraju željene peptidne sekvence ubačene su u Spel mesto. Detalji ove procedure bili su sledeći.
[0132] Nakon međusobnog vezivanja (annealing) oligomera "CD4 top"
(CTAGGCTGCTACGGCGTGAGCGCCACCAAGCTGGGG. SEQ ID NO: 18) i "CD4 bot"
(CTAGCCCCAGCTTGGTGGCGCTCACGCCGTAGCAGC, SEQ ID NO: 19), Balb/c
misiji CD4 epitop iz "spike" proteina SARS korona virusa je ubačen u Spel mesto od pNEBAscSpe da bi se dobio pNEBAscSpe-spikeCD4. Ovo postavlja GLGCYGVSATKLGLV (SEQ ID NO: 20) između EEE i DDD (između ak # 149 i 150) od heksona.
[0133] Da bi se ubacio misiji Balb/c misiji CD8 epitope iz "spike" proteina" od SARS korona virusa, oligomeri "CD8 top" (CTAGGGACCAGCACCGGCAACTACAACTACAAGTACC
GCTACCTGCGCCACGGC AAGCTGCGCCCCGGG, SEQ ID NO: 21) i "CD8 bot"
(CTAGCCCGGGGCGCAGCTTGCCGTGGCGCAGGTAGCGGTACTTGTAGTTGTAGT
TGCCGGTGCTGGTCC, SEQ ID NO: 22) su međusobno povezani (annealed) i ubačeni u Spel mesto u pNEBAscSpe da bi se dobio pNEBAscSpe-spikeCD8. Na ovaj način se amino kiselinska sekvenca GLGTSTGNYNYKYRYLRHGKLRPGLV (SEQ ID NO: 23) postavlja između EEE i DDD (između ak # 149 i 150) heksona.
[0134] Plazmid koji sadrži nativni hekson, molekularni klon El i E3 izbačeni (deletirani) HAdV-5 vektor (pSRAd5eGFP) je zamenjen sa onima koji sadrže hekson sa ubačenim stranim sekvencama da bi se kreirao novi plasmidni molekularni klonovi (pH5sCD4 i pH5sCD8,) koji nose mutirani hekson.
[0135] Mutaganeza pomoću PCR-a (lančana reakcija polimeraze) je urađena na heksonu da bi se dobilo novo restrikciono mesto za BspEI enzim site na mstu insercije. Detalji PCR mutageneze za stvarnje BspEI mesta bili su sledeći.
[0136] pNEBAsc (Ad5 AscI fragment koji sadrži heksonski region kloniran u plasmidu pNEB 193) je bio matrica za reakcije 1 i 2. Proizvodi Reakcija 1 i 2 su kombinovani i korišćeni za matrice za reakciju 3.
[0137] Phusion™ high-fidelity PCR kit kupljen od NEB i korišćen je po preporuci proizvođača. Smena ciklusa za sve tri reakcije bila je sledeća: 98° - 5 sek., 55° - 15 sek., 72°-60 sek., 25 puta.
[0138] Za Reakciju 1, korišćeni su prajmeri 1 "5hexl" (GACCGCCGTTGTTGTAACCC,
SEQ ID NO: 24) i BspSOErev (CGTGAGTTCCGGAAGTAGCAGCTTCATCCCATTCG,
SEQ ID NO: 25) za amplifikaciju fragmenta od 678 bp. Za Reakciju 2, korišćeni su prajmeri
BspSOEfVvd (TGCTACTTCCGGAACTCACGTATTTGGGCAGGCG, SEQ ID NO: 26) i
5hex4 (GGAAGAAGGTGGCGTAAAGG, SEQ ID NO: 27) za amplifikaciju fragmenta od 1379 bp.
[0139] Za Reakciju 3, fragmenti dobijeni u Reakcji 1 i Reakciji2 su spojeni međusobno pomoću prajmera 5hexl i 5hex4 i 2037 bp product sečen je sa Rsrll+Avrll; dobijeni fragment od 1908 bp je ligiran u pNEBAsc/Rsrll+Avrll da bi se dobio pNEBAseBspEI. Ovim se izbacuje (deletira) 75 bp koji kodira ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK [SEQ ID NO: 11] i inserti TCCGGA (nt 71-3 of SEQ ID NO: 27 koji kodira SG) koji sadrži BspEI restrikciono mesto u sekvenci heksona.
[0140] Sintetički DNK fragmenti koji kodiraju željene peptidne sekvence su ubačene u Bspel mesto. Detalji procedure su bili sledeći. Da bi se ubacio region. HIV 2F5 epitopa u pNEBAseBspEI, oligomeri '2F5 top'
(CCGGCGAGCAGGAGCTGCTGGAGCTGGACAAGTGGGCCAGCCTGTGGT, SEQ ID NO: 28) i '2F5 bot' (CCGGACCACAGGCTGGCCCACTTGTCCAGCTCCAGCAGCTCCT
GCTCG, SEQ ID NO: 17) su povezani (annealed) i ubačeni u BspEI mesto da bi se dobio plazmid pNEBAsc 2F5. Na ovaj način se amino kiselinska sekvenca ALEiNLEEEDDDNBDEVDEQAEQQK (SEQ ID NO: 11) stavlja na mesto delecije od 25 amino kiselina koja je gore izvedena.
[0141] Nativni plazmidni molekularni klon koji sadrži nativni hekson protein, El i E3 izbačenog (deletiranog) HAdV-5 vektora (pSRAd5eGFP) zamenjen je sa onima koji sadrže hekson sa izbačenim (deletiranim) ili ubačenim stranim sekvencama, da bi se dobili novi plazmidni molekularni klonovi (pH5hexBspeI i pH5 2F5, respectivelv) koji nose mutirani hekson.
[0142] Infektivni rekombinantni HAdV-5 vektor je generisan sa mutiranim heksonom putem transfekcije novog plazmidnog molekularnog klona koji nosi mutirani hekson (linearizovan sa Pad) u HEK 293 ćelije.
[0143] Ovaj novi HAdV-5 vektor koji sadrži modifikovani hekson protein može imati različite primene kao što je ovde opisno.
[0144] Dok je pronalazak opisan sa referencom na posebno poželjno ostvarenje, biće dobro da se modifikacije mogu izvršiti u okviru obima koje obuhvataju patentni zahtevi.

Claims (22)

1. Adenovirus koji ima kapsid koji obuhvata modifikovani adenovirusni protein hekson, pomenuti modifikovani adenovirusni protein hekson obuhvata deleciju bar u hipervarijabilnom regionu adenovirusnog proteina heksona koji je odabran od hipervarijabilnog regiona 1 i hipervarijabilnog regiona 4 i egzogenu amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata imunogenu amino kiselinsku sekvencu koja je ubačena u pomenuti hipervarijabilni region 1 i/ili pomenuti hipervarijabilni region 4, pod uslovom da pomenuta egzogena amino kiselinska sekvenca je drugačija od adenovirusne sekvence.
2. Adenovirus prema patentnom zahtevu 1, gde pomenuti protein hekson obuhvata više od jedne delecije i/ili parcijalne delecije.
3. Adenovirus prema patentnom zahtevu 1 i 2, gde delecija obuhvata najmanje 25 amino kiselina nativnog hipervarijabilnog regiona.
4. Adenovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je zadržana najmanje jedna amino kiselina sa N-terminusa i najmanje jedna amino kiselina sa C-terminusa iz nativnog hipervarijabilnog regiona.
5. Adenovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4. gde pomenuti modifikovani adenovirusni protein hekson obuhvata više od jedne egzogene amino kiselinske sekvence koja je u njega ubačena.
6. Adenovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde egzogena amino kiselinska sekvenca obuhvata 5 do 45 amino kiselinskih ostataka u okviru svoje dužine, ili oko 25 amino kiselina u dužini.
7. Adenovirus prema patentnim zahtevima 5 ili 6, gde egzogena amino kiselinska sekvenca obuhvata sekvencu za ciljanje (targeting sequence).
8. Adenovirus prema patentnom zahtevu 7, gde je sekvenca za ciljanje odabrana iz grupe koja se sastoji od liganda za ćelijski receptor i epitopa za antitelo ili njegov fragment.
9. Adenovirus prema patentnom zahtevu 8, gde je pomenuta sekvenca za ciljanje odabrana iz grupe koja se sastoji bi-specifičnog antitela, 'anti-fiber knob" Fab, i anti-receptorskog antitela.
10. Adenovirus prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde je pomenuta imunogena amino kiselinska sekvenca izabrana iz grupe koju čine T-ćelijski epitop, epitop antitela i antigen iz HIV proteina.
11. Adenovirus prema patentnom zahtevu 10, gde je pomenuti T-ćelijski epitop, epitop za neutralizaciju.
12. Adenovirus prema patentnom zahtevu 10, gde je amino kiselinska sekvenca iz HIV proteina odabrana od tat proteina ili proteina omotača.
13. Adenovirus prema patentnom zahtevu 12, gde je egzogena amino kiselinska sekvenca EQELLELDKWASLW, SEQ ID NO: 12.
14. Postupak za promenu specifičnosti adenovirusnog vektora, a pomenuti postupak obuhvata korak obezbeđivanja adenovirusa prema patentnom zahtevu 1, modifikovani adenovirusni hekson protein pomenutog adenovirusa koji sadrži sekvencu za ciljanje koja je ubačena u okviru delecije u hipervarijabilni region.
15. Postupak prema patentnom zahtevu 14, gde je pozitivno naelektrisana amino kiselinska sekvenca ubačena u mesto delecije.
16. Upotreba adenovirusa prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 u postupku pripreme leka.
17. Imunogena kompozicija koja obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač i kompoziciju na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 1 do 13.
18. "Self-priming" imunogena kompozicija koja obuhvata: adenovirus koji ima kapsid koji obuhvata modifikovani adenovirusni protein hekson prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuta amino kiselinska sekvenca prva imunogena amino kiselinska sekvenca; gde pomenuti adenovirus dalje obuhvata nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira drugu imunogenu amino kiselinsku sekvencu.
19. "Self-priming" imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 18, gde su prva imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca i pomenuta druga imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca iste.
20. "Self-priming" imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 18, što se prva imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca i pomenuta druga imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca razlikuju i indukuju imuni odgovor na isti virus ili organizam.
21. "Self-priming" imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 18, gde se prva imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca indukuje ne-specifičan imuni odgovor i pomenuta druga imunogena ili antigena amino kiselinska sekvenca indukuje imuni odgovor na virus ili organizam.
22. Upotreba "self-priming" imunogene kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 18 do 21 u pripremi leka.
RSP-2010/0181A 2006-04-28 2007-04-27 Modifikovani hekson protein adenovirusa i njegova upotreba RS51250B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79607806P 2006-04-28 2006-04-28
PCT/US2007/010347 WO2008010864A2 (en) 2006-04-28 2007-04-27 Modified adenovirus hexon protein and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS51250B true RS51250B (sr) 2010-12-31

Family

ID=38957245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2010/0181A RS51250B (sr) 2006-04-28 2007-04-27 Modifikovani hekson protein adenovirusa i njegova upotreba

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20090074810A1 (sr)
EP (1) EP2012822B1 (sr)
JP (1) JP5889514B2 (sr)
CN (1) CN101437538A (sr)
AT (1) ATE455558T1 (sr)
CY (1) CY1110002T1 (sr)
DE (1) DE602007004470D1 (sr)
DK (1) DK2012822T3 (sr)
ES (1) ES2341501T3 (sr)
HR (1) HRP20100228T1 (sr)
PL (1) PL2012822T3 (sr)
PT (1) PT2012822E (sr)
RS (1) RS51250B (sr)
SI (1) SI2012822T1 (sr)
WO (1) WO2008010864A2 (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE530672T1 (de) * 2001-06-22 2011-11-15 Univ Pennsylvania Rekombinante adenoviren mit affen-adenovirus proteinen und verwendung davon.
HU230364B1 (hu) * 2001-11-21 2016-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
CA2567741A1 (en) 2004-05-25 2006-03-30 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
EP2018156B1 (en) 2006-04-07 2010-03-17 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
EP3128010A1 (en) 2007-11-28 2017-02-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily e adenoviruses sadv-30 and uses thereof
CN102131920B (zh) 2007-11-28 2013-11-06 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴亚家族C腺病毒SAdV-40、-31和-34及其应用
HRP20170395T1 (hr) 2007-11-28 2017-05-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Podporodice adenovirusa b majmuna sadv-28, 27,-29,-32,-33, i -35 i njihove primjene
EP2325298B1 (en) 2008-03-04 2016-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SIMIAN ADENOVIRUSES SAdV-36, -42.1, -42.2, AND -44 AND USES THEREOF
ES2552688T3 (es) 2008-10-31 2015-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus de simio con proteínas de la cápside hexónica de SAdV-46 y usos del mismo
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
CA2762203A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Soumitra Roy Simian adenovirus 41 and uses thereof
RU2012107702A (ru) 2009-07-31 2013-09-10 Пэксвэкс, Инк. Векторы на основе аденовирусов
CN102844329B (zh) 2010-04-14 2016-01-20 财团法人牧岩生命工学研究所 分离自猿腺病毒血清型19的六邻体、其高变区和使用其的嵌合型腺病毒
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
JP2014527072A (ja) 2011-09-09 2014-10-09 バイオメド リアルティー， エル．ピー． ウイルスタンパク質の集合を制御するための方法および組成物
CN103242433B (zh) * 2012-02-14 2016-12-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种腺病毒非结构蛋白免疫原、其抗体及应用
MX358019B (es) 2012-05-18 2018-08-02 Univ Pennsylvania Adenovirus de simio de la subfamilia e a1302, a1320, a1331 y a1337 y sus usos.
WO2014078688A2 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and use thereof
US9222142B2 (en) * 2013-01-15 2015-12-29 The Regents Of The University Of California Adenoviruses and their use
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
CA2928908C (en) 2013-11-01 2021-01-12 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
CN103865923B (zh) * 2014-01-28 2017-04-26 中国人民解放军第三0二医院 流感病毒为载体的HAdV嵌合疫苗的制备及其应用
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP3198009B1 (en) 2014-09-24 2021-09-08 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic tumor viruses and methods of use
CN112553229A (zh) 2014-11-05 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
MX2017006217A (es) 2014-11-14 2018-05-02 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016146894A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Tilt Biotherapeutics Oy Oncolytic adenoviruses coding for bi-specific antibodies and methods and uses related thereto
BR112018016986A2 (pt) * 2016-02-23 2019-02-05 Immune Design Corp preparações de vetor retroviral multigenômico e métodos e sistemas para preparação e uso das mesmas
EP3390428B1 (en) 2016-02-23 2019-09-25 Salk Institute for Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
AU2017267665C1 (en) 2016-05-18 2023-10-05 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics, Inc. composições e métodos de tratamento da doença de huntington
AU2017313917B2 (en) 2016-08-18 2023-12-21 The Regents Of The University Of California CRISPR-Cas genome engineering via a modular AAV delivery system
WO2018044933A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
JP7794421B2 (ja) 2016-12-12 2026-01-06 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 腫瘍を標的にする合成アデノウイルスおよびその使用
CN106754760A (zh) * 2017-01-20 2017-05-31 华南农业大学 一种嵌合ibdv中和表位的重组人3型腺病毒的制备方法和应用
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN111132626B (zh) 2017-07-17 2024-01-30 沃雅戈治疗公司 轨迹阵列引导系统
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3723771A4 (en) * 2017-12-11 2022-04-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and uses thereof
BR112020019942A2 (pt) 2018-04-09 2021-01-26 Salk Institute For Biological Studies composições de adenovírus oncolítico com propriedades de replicação aprimoradas
AU2019268330A1 (en) 2018-05-15 2020-11-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Parkinson's disease
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
EP3927833A4 (en) * 2019-02-21 2022-11-30 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. ONCOLYTIC ADENOVIRAL VECTOR AND METHODS OF USE
EP3812465A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-28 Universität Ulm Adenovirus comprising a modified adenovirus hexon protein

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6465253B1 (en) * 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US6211160B1 (en) * 1996-09-06 2001-04-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for tolerizing a mammalian patient to administration of gene therapy virus vectors
AU4255397A (en) * 1996-09-06 1998-03-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Chimpanzee adenovirus vectors
JP2002523105A (ja) * 1998-08-27 2002-07-30 アバンテイス・フアルマ・エス・アー 異種遺伝子の運搬用の標的化アデノウイルスベクター
US6955808B2 (en) * 1999-09-24 2005-10-18 Uab Research Foundation Capsid-modified recombinant adenovirus and methods of use
HU230364B1 (hu) * 2001-11-21 2016-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
EP1388541A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Pyrrolopyrazines as kinase inhibitors
US7291498B2 (en) * 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
JP4754480B2 (ja) * 2003-06-20 2011-08-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア キメラアデノウイルスの作成法およびそのようなキメラアデノウイルスの使用
US7144712B2 (en) * 2003-07-30 2006-12-05 Vaccine Research Institute Of San Diego Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
FR2860004A1 (fr) * 2003-09-18 2005-03-25 Roussy Inst Gustave Nouveau vecteur adenoviral pour l'infection de cellules deficientes ou depourvues en recepteurs car

Also Published As

Publication number Publication date
JP5889514B2 (ja) 2016-03-22
CY1110002T1 (el) 2015-01-14
WO2008010864A2 (en) 2008-01-24
ATE455558T1 (de) 2010-02-15
US20090074810A1 (en) 2009-03-19
DE602007004470D1 (de) 2010-03-11
PT2012822E (pt) 2010-04-27
CN101437538A (zh) 2009-05-20
DK2012822T3 (da) 2010-05-25
WO2008010864A3 (en) 2008-05-02
PL2012822T3 (pl) 2010-06-30
ES2341501T3 (es) 2010-06-21
JP2009535032A (ja) 2009-10-01
HRP20100228T1 (hr) 2010-07-31
EP2012822B1 (en) 2010-01-20
US20170096646A1 (en) 2017-04-06
SI2012822T1 (sl) 2010-06-30
EP2012822A2 (en) 2009-01-14
US20160102295A1 (en) 2016-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2012822B1 (en) Modified adenovirus hexon protein and uses thereof
EP1409748B1 (en) Recombinant Adenoviruses comprising simian adenovirus proteins and uses thereof.
EP1636370B1 (en) Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US10501757B2 (en) Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50, and uses thereof
US10149873B2 (en) Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309, A1316 and A1322 and uses thereof
US7291498B2 (en) Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US10113182B2 (en) Subfamily E simian adenoviruses A1302, A1320, A1331 and A1337 and uses thereof
JP5661476B2 (ja) サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途
JP5758124B2 (ja) サルサブファミリーＣアデノウイルスＳＡｄＶ−４０、−３１および−３４ならびにそれらの用途
AU2005238527B2 (en) Polyvalent viral vectors and a system for production thereof