RS51254B - Derivati diamino biotina i njihovi konjugati sa makrocikličnim helatirajućim sredstvima - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Pronalazak koji je ovde opisan odnosi se na modifikovane biotine korisne za pripremu konjugata sa radionuklidima za primenu u humanoj i životinjskoj dijagnostici i terapiji, naročito za dijagnozu i lečenje patoloških stanja kao što su tumori.

OSNOVA PRONALASKA

[0002]Terapija tumora većinom se izvodi preko primene supstanci koje su usmerene na uništavanje ćelija kancera. Ovo se može postići sa citotoksičnim supstancama, koje moraju da prodru u tumorske ćelije u cilju ispoljavanja njihovog potpunog efekta, ili tretmanom tumorskih ćelija zračenjem dovoljne energije da ubije ćelije. U oba slučaja glavni problem je dopremiti supstancu na selektivan način do ciljnih ćelija, tako da se izbegne moguće oštećenje okolnih zdravih ćelija. U slučaju radiofarmaceutika, tj. supstanci koje nose radioaktivne delove, problem selektivnog dopremanja aktivnog dela (to jest, radioaktivnog dela) do tumorskog ciljnog mesta, izbegavajući što je više moguće difuziju radionuklida u telu ili interakciju sa zdravim ćelijama koje okružuju tumor, ističe se kao naročito značajno.

[0003]Za razmatranje svih obuhvaćenih problema i rešenja koja su do danas predložena, čitalac se upućuje na SAD Patente 5,283,342, 5,608,060 i 5,955,605, dodeljene NeoRx Corporation.

[0004]U ovim dokumentima, razmatran je problem, pored ostalog, otpornosti molekula koji nosi radionuklid na telesni metabolizam. Tačnije, slučaj koji je najpažljivije ispitivan je molekul biotina, koji je jedan od prvih izbora za primenu radionuklida na tumorske ćelije, zahvaljujući njegovoj dobro poznatoj interakciji sa avidinima. Biotin je vezan za radionuklid-helatirujući deo, npr. molekul tetra-azaciklododekantetra-sirćetne kiseline [DOTA], preko linkera. Jedan od glavnih problema vezanih za upotrebu biotin-DOTA konjugata je otpornost kompleksa koji sadrži molekul biotina, kao povezanog sa radionuklidom preko linkera, na biotinidaze, enzime koji razlazu peptidnu vezu prisutnu u kompleksu. Ova peptidna veza potiče od spajanja helatirajućeg sredstva i biotina.

[0005]Među njegovim mnogim poželjnim karakteristikama, ovaj kompleks mora biti eliminisan iz tela brzo i efikasno i mora biti dovoljno mali (molekulska težina < 1000) da bi se omogućila laka raspodela u vanćelijskoj tečnosti gde će se vezati za ćelije tumora. Pored toga, on mora pokazati dokazanu stabilnostin vivosamo sa minimalnim unosom od strane ne-tumorskih ćelija i brzi (bubrežni) klirens i ne srne biti metabolizovan.

[0006]Pored toga, helatirajuća grupa mora biti takva da se ne oslobađain vivo,na taj način oslobađajući potencijalno toksična jedinjenja unutar tela. Stručnjacima iz date oblasti poznat je problem oslobađanja radionuklida od strane helatirajućeg sredstva, uključujući metalne jone koji su u potpunosti strani za telo, kojima može biti data radioaktivnost različitih tipova i čak visoko energetsko zračenje, koje je prema tome veoma štetno.

[0007]U prethodnoj patentnoj prijavi od istog prijavioca (WO 02/066075) naša grupa je objavila sintezu novog biotin-DOTA konjugata zajedno sa studijama vezivanja, stabilnosti i afiniteta izvedenim na ovom novom derivatu. Novost novog konjugata bila je u tome što je karboksilna grupa amida redukovana do metilenske grupe na taj način stvarajući N-aminoheksil biotinamido derivat (r-BHD) u kome je amid transformisan u sekundarni amin bez uticaja na dužinu bočnog lanca biotina uključenog u Av/Sav vezivanje. DOTA ligand, u ovom jedinjenju, direktno je vezan za amino grupu redukovanog biotin-heksametilendiamin derivata preko jednog od četiri N-sirćetnih bočnih lanaca.

[0008]Pored toga, sintetička fleksibilnost r-BHD omogućava stvaranje različitih novih derivata biotina na primer sa dva DOTA helatora konjugovana za bočni lanac biotina sa ciljem povećanja efikasnosti ciljane terapije radionuklidom, isporukom veće doze zračenja do tumora.

[0009]SAD Patentna prijava 2004/0241172, Axworthy Donald B. et al., opisuje derivate biotina koji ugrađuju dve DOTA grupe, preko specifičnih linkera, koji su direktno vezani, preko benzil grupe, za jezgro DOTA molekula. Ova modifikacija DOTA grupe mogla bi da smanji sposobnost vezivanja helatirajuće grupe.

[0010]U cilju poboljšanja odnosa zračenja/doze, dizajnirali smo i sintetisali novu klasu derivata biotina.

OPIS PRONALASKA

[0011]Glavni cilj predstavljenog pronalaska je obezbediti nove derivate biotina koji ispunjavaju potrebu za visokim odnosom zračenja/doze.

[0012]Naročito, pronalazak se nalazi u novoj klasi derivata biotina koji nose dve helatirajuće grupe po molekulu biotina.

[0013]Na ovaj način primenom iste molarne količine derivata biotina, radioaktivnost koja stiže do ćelija tumora je udvostručena.

[0014]Jedan od ciljeva pronalaska koji su ovde opisani je prema tome jedinjenje formule (I) kao što sledi:

u kome:

AjeCH2 ili CO;

B je H, CHO ili COOH; uz uslov da:

kada je A jednako CH2, Q je -(CH2)n- grupa, u kojoj je n ceo broj od 4 do 12, u kom slučaju je R odsutan; kada je A jednako CO, Q je izabran iz grupe koju čine -(CH2)a-CH(R-)-(CH2)b-, gde su a i b, nezavisno, celi brojevi od 0 do n-1 i R je definisan kao u daljem tekstu;

W je C1-C12alkilen ili C2-Ci2alkenilen linearni lanac ili funkcionalizovani polietilen glikol; ili Cć-Cjoaromatični ostatak; ili glikofuranozni ostatak; ili W, sam ili zajedno sa atomom azota koji nosi -(CH2)C-NHR' i -(CH2VNHR" lance, je heterociklična grupa sa 5 ili 6 članova koji sadže jedan ili više heteroatoma izabranih od O, N, S;

kada je W aromatični ostatak, heterociklična grupa ili šećerna grupa, tada je atom azota koji nosi -(CH2)C-NHR' i -(CH2)d-NHR" lance izborno odsutan i -

(CH2)C-NHR' i -(CH2)d-NHR" lanci su direktno i nezavisno vezani za atome ugljenika ili azota aromatičnih i heterocikličnih prstenova ili za atome kiseonika glikofuranoznog ostatka;

c i d nezavisno su celi brojevi od 3 do 10;

R' i R" su, nezavisno, -A, gde je -A makrociklus formule (II):

gde su Y isti ili različiti i izabrani su iz grupe koju čine vodonik, linearni ili granati Ci-C4alkil, -(CH2)m-COOH, gde je m ceo broj od 1 do 3;

X je vodonik, ili -CH2-U grupa, gde je U izabran iz grupe koju čine metil, etil, p-aminofenil, ili X je -(CHJ)0-Z grupa, gde jeo ceo broj od 1 do 5, J je vodonik, metil ili etil, Z je heterociklična grupa sa 5 ili 6 članova koja sadrži jedan ili više heteroatoma izabranih od O, N-Ri, Rije atom vodonika ili linearna ili granata C,-C4alkil grupa, i S; ili Z je izabran od -NH2, -NH-C(=NH-)-NH2, ili -S-R2gde je R2linearna ili granata C1-C4alkil grupa;

p je ceo broj 2 ili 3;

R je izabran iz grupe koju čine linearni ili granati C1-C4alkil, cikloalkil, heterociklus ili -(CH2)q-T, gde je T izabran iz grupe koju čine S-CH3, -OH ili - COOH,iqje 0, 1 ili 2.

[0015]Linearna ili granata C1-C4alkil grupa označava metil, etil, propil, izopropil, n-butil, sek-butil, izo-butil ili terbutil.

[0016]Heterociklus sa 5 ili 6 članova je aromatičan ili ne-aromatičan heterociklus koji ima u prstenu najmanje heteroatom izabran od O, N-Ri, ili S, kao što su, na primer, 2-, 3- ili 4-piridil ili 2-, 4- ili 5-imidazolil.

[0017]Smanjenje sposobnosti vezivanja helatirajuće grupe. Prva grupa poželjnih jedinjenja prema pronalasku sastoji se od jedinjenja formule (I) gde je A jednako CH2, B je H, Q je -(CH2)„-, gde je n ceo broj od 4 do 8, poželjno 6, c i d su istovremeno 3 ili 6, R' i R" su - A gde je Y uvek -CH2-COOH; X je vodonik, i p je 2.

[0018]Sledeći cilj pronalaska koji je ovde opisan sastoji se od jedinjenja formule (1) sa radioaktivnim izotopima za dijagnostičku i/ili terapeutsku upotrebu. Primeri ovih izotopa su: Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111,1-123,1-125, 1-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153; Lu-177 i Au-198.

[0019]Prva grupa poželjnih kompleksa prema pronalasku su oni gde, u jedinjenjima formule (I), A je CH2, B je H, Q je -(CH2)n-, gde je n ceo broj od 4 do 8, poželjno 6, c i d su zajedno 3 ili 6, R' i R" su -A, gde je Y uvek -CH2-COOH; X je vodonik, p je 2 i radioaktivni izotop je Y-90.

[0020]Sledeći ciljevi ovde opisanog pronalaska su postupci za pripremu jedinjenja formule (I) i njihovih kompleksa sa radiofarmaceuticima.

[0021]Sledeći ciljevi ovde opisanog pronalaska su farmaceutske i/ili dijagnostičke kompozicije koje sadrže jedinjenja formule (I) i njihove komplekse kao što je naznačeno u prethodnom tekstu.

[0022]Drugi ciljevi ovde opisanog pronalaska su upotreba jedinjenja formule (I) i njihovih kompleksa sa radioaktivnim izotopima kao lekovima ili dijagnostičkim sredstvima, naročito za pripremu lekova koji su korisni u lečenju ili dijagnozi tumora.

[0023]Ovi i drugi ciljevi vezani za ovde opisani pronalazak biće detaljno ilustrovani u delu koji sledi, takođe pomoću eksperimentalnih primera.

[0024]Jedinjenja prema ovde opisanom pronalasku mogu biti pripremljena prema sledećoj šemi, uključujući sledeće korake: a) formiranje amidne veze između karboksil grupe biotina i primarne amino grupe iz H2N-Q-NH2diamina, pri čemu je druga primarna amino grupa

pogodno supstituisana, na primer, sa Boe grupom, ako je neophodno; ili,

alternativno, spajanje bi se moglo izvesti sa a-a-NH2grupom a,co-diamino kiseline (tj. Lys), budući daje co-amino grupa pogodno supstituisana; b) deprotekciju primarne amino grupe; c) redukciju amidne grupe do amina, ako je A jednako CH2grupa; d) spajanje amina sa N-zaštićenim N,N-bis-supstituisanim glicin aminima

formule (III) koji mogu biti

pripremljeni pomoću postupaka koji su poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike;

gde su V i L pogodne zaštitne grupe i c i d su opsegu nezavisno od 3 do 10;

e) konjugaciju sa željenim helatirajućim sredstvom -A formule (II).

[0025]Biotin je komercijalni proizvod, kao i aminokiselina Lys. H2N-Q-NH2diamini

su dostupni na tržištu i mogu biti u svakom slučaju pripremljeni u nekoliko koraka primenom poznatih postupaka.

[0026]Zaštita primarnih amino grupa lako se postiže primenom pogodnih zaštitnih grupa, kao što su, na primer, Boe ili Fmoc, i koje se u svakom slučaju mogu naći među onima objavljenim u literaturi (videti na primer: T.W. Greene, P.G.M. Wuts, "Protective groups in organic svnthesis", 3rd Ed., J. Wiley & Sons, Inc., New York, 1999; Handbook of Reagents for Organic Synthesis, "Oxidizing and Reducing Agents", Edited by S.D. Burke and R.L. Danheiser, J. Wiley & Sons, Inc., New York, 1999).

[0027]Alternativno, jedinjenje formule (I), ako je A jednako CO grupa, može biti pripremljeno prema prethodno navedenoj šemi bez koraka c.

[0028]Aktivacija -COOH grupe biotina može se postići prema poznatim postupcima peptidne sinteze (P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, "Chemical Approaches to the Svnthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, Boca Raton, New York, 1997); ako je spajanje izvedeno sa a,co-diamino kiselinom (tj. Lys), reakcija se može izvesti pričvršćavanjem aminokiselina na pogodnoj smoli, praćenjem postupaka koji su poznati u tehnici sinteze peptida čvrste faze.

[0029]Konjugacija jedinjenja prema pronalasku sa radioaktivnim izotopom da bi se proizveli kompleksi obuhvaćeni kontekstom ovde opisanog pronalaska, izvedena je primenom poznatih tradicionalnih postupaka u datoj oblasti tehnike, kao što je opisano, na primer, u Paganelli, Chinol et al. European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No 4; April 1999; 348-357.

[0030]Jedno od poželjnih jedinjenja prema pronalasku je ono u kome je A CH2grupa, Q je -(CH2)n-, gde je n poželjno 6, c = d su 3 ili 6, R' = R" su -A gde je m jednako 1, Y je uvek -CH2-COOH; X je vodonik, p je 2 (DOTA helatirajuće sredstvo).

[0031]Postupak za pripremu ovog poželjnog jedinjenja sadrži sledeće korake: a) formiranje amidne veze između karboksil grupe biotina i primarne amino grupe heksametilendiamina, pogodno zaštićene, na primer sa Boe grupom, ako je neophodno; b) deprotekciju amino grupe heksametilendiamina; c) redukciju amidne grupe do amino grupe; d) konjugaciju sa aminom formule (III) gde jec = d = 3ili6,V = Lsu Fmoc zaštitne grupe; e) deprotekciju dobij enog amina;

f) konjugaciju sa helatorom -A.

[0032]Korak a) u postupku prema ovde opisanom pronalasku sastoji se u formiranju

amidne veze između karboksil grupe biotina i primarne amino grupe heksametilendiamina-Boc. Biotin je tretiran sa HATU da bi se formirao ekstremno aktivan estarin situkoji reaguje sa amino grupom heksametilendiamina-Boc da bi se formirao relevantni amid. Ovaj mehanizam aktivacije, koji je korišćen pre svega za peptidnu sintezu u čvrstoj fazi, zahteva

bazni medijum. Da bi se sprečila reakcija baze sa aktivnim estrom, koriste se tercijarne organske baze kao što su diizopropiletilamin (DIPEA) ili N-metilmorfolin (NMM). Zaštita jedne od dve amino grupe heksametilendiamina sa Boe (ter-butiloksikarbonilom) neophodna je za sprečavanje vezivanja biotina za oba kraja diamino lanca. Krajnji proizvod je izolovan iz reakcionog medijuma posle isparavanja rastvarača (DMF) i taloženja sa vodom. Proizvod, rekristalizovan sa propanolom, okarakterisan je pomoću 'H-NMR, elementarne analize i ESI-MS. Prinos reakcije je oko 88%.

[0033]U koraku b), biotinil-heksametilendiamin-Boc je rastvoren u smeši AcOEt/HCl, približno 3 M, da bi se odvojila Boe grupa. Posle uklanjanja smeše rastvarača, proizvod je liofilizovan da bi se potpuno eliminisala HC1. Uzorak je prečišćen rekristalizacijom sa vodenim rastvorom na baznoj pH i okarakterisan pomoću 1 H-NMR i

TLC.

[0034]U koraku c), redukcija amidne grupe izvedena je sa BH3THF. S obzirom na to da je redukciono sredstvo ekstremno reaktivno, postupak se mora izvesti u anhidrovanim uslovima. Početni proizvod je držan pod vakuumom pre reakcije i zatim rastvoren u anhidrovanom THF (destilovan sa natrijumom i benzofenonom). Reakciona smeša je refluksovana u atmosferi azota do potpune redukcije amidne grupe (kao što je praćeno pomoću 'H-NMR spektra). Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, reakciona smeša je tretirana vodenim rastvorom HC1. Posle liofilizacije kiselog rastvora, proizvod je prečišćen rekristalizacijom iz vodenog rastvora na baznoj pH vrednosti i zatim pomoću reverzno-fazne hromatografije na koloni. Analiza proizvoda izvedena je pomoću analitičke TLC koja je otkrila njegovu čistoću. Prinos reakcije je približno 55%.

[0035]Korak d) je dao reakciju konjugacije redukovanog biotinil-heksametilendiamina sa zaštićenim aminom (III), aktivacijom sa HATU/NMM sistemom u NMP kao rastvaraču.

[0036] U koraku e), Fmoc grupe su uklonjene primenom baze piperidina.

[0037]Korak f) dao je spajanje dve DOTA grupe, što je izvedeno sa specifičnim reagensima za formiranje amidnih veza u vodenom medijumu: l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC) i sulfo-NHS. DOTA (4 mol ekvivalenata u odnosu na derivat biotina) je rastvoren u vodi i podešen do pH vrednosti pogodne za aktivaciju uglavnom jedne od četiri karboksilne grupe (G. Sabatino, M. Chinol, G. Paganelli, S. Papi, M. Chelli, G. Leone, A. M. Papini, A. DeLuca and M. Ginanneschi, J. Med. Chem. 2003, 46, 3170-3173). Na ovaj način, možemo smanjiti verovatnoću dobijanja sporednih proizvoda. U bazni rastvor dodati su sulfo-NHS i na kraju EDC. Posle formiranja aktivnog estrain situ,dodat je N,N-bis-alkilamino glicin derivat redukovanog biotinil-heksametilendiamina, uz proveru da li je pH vrednost rastvora ostala oko 7.5. Pred-prečišćavanje sirovog proizvoda izvedeno je pomoću SPE (ekstrakcija čvrste faze) i prečišćavanje je izvedeno pomoću polu-preparativne RP-HPLC.

[0038]Ciljevi ovde opisanog pronalaska su farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koje sadrže kao aktivni sastojak najmanje jedinjenje formule (I), takođe u obliku kompleksa sa radioaktivnim izotopom ili, u slučaju navedenog jedinjenja formule (I), zajedno sa drugim aktivnim sastojcima koji su korisni u lečenju bolesti naznačenih u ovde opisanom pronalasku, npr. drugim proizvodima koji poseduju antikanceroznu aktivnost; takođe u odvojenim oblicima doze ili u oblicima pogodnim za kombinovanu terapiju. Aktivni sastojak prema pronalasku biće u obliku smeše zajedno sa pogodnim nosačima i/ili inertnim puniocima koji se obično koriste u farmaceutskoj tehnologiji, kao što su, na primer, oni opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", poslednje izdanje. Kompozicije prema pronalasku sadržaće terapeutski efikasnu količinu aktivnog sastojka. Doze će biti određene od strane stručnjaka iz date oblasti, npr. od strane lekara, prema tipu bolesti koja se leči i stanja pacijenta, ili istovremeno sa primenom drugih aktivnih sastojaka.

[0039]Primeri farmaceutskih kompozicija su oni koji omogućavaju parenteralnu ili lokalno-regionalnu primenu. Farmaceutske kompozicije pogodne za ovu namenu su rastvori, suspenzije, ili liofilizovani oblici za rekonstituciju u vreme primene.

[0040]Oblici pogodni za industrijsku primenu pronalaska su kompleti za radioterapiju kancera, kao što je, na primer, opisano u Evropskom patentu 0 496 074, u radu koji su objavili Paganelli, Chinol et al. objavljenom u časopisu European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No 4; April 1999; 348-357, u SAD Patentu 5,968,405 i u relevantnoj literaturi.

[0041]Sledeći cilj ovde opisanog pronalaska je komplet za lečenje ili dijagnozu tumora pomoću radioaktivnosti,naznačen timešto najmanje jedna od komponenti navedenog kompleta sadrži jedinjenje formule (I) ili jedan od njegovih kompleksa sa pogodnim radioaktivnim izotopom.

[0042]Jedinjenja prema pronalasku su korisna za pripremu terapeutskih i/ili dijagnostičkih sredstava za lečenje i dijagnozu tumora.

[0043]Jedinjenja prema pronalasku, posle vezivanja sa radioaktivnim izotopima za dijagnostičku i/ili terapeutsku primenu (kao što je objašnjeno ranije), korisna su za radioaktivno obeležene preparate avidin koloida za različite medicinske primene.

[0044]Na primer, ona se mogu koristiti u postupcima za lečenje tumora sa radiofarmaceuticima protiv kancera, kao što su, na primer, oni opisani u evropskom patentu 0 496 074, u radu koji su objavili Paganelli, Chinol et al. koji je objavljen u časopisu European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No 4; April 1999; 348-357, u SAD Patentu 5,968,405 i u relevantnoj literaturi.

[0045]Sledeći primer dalje ilustruje pronalazak.

PRIMER

Priprema BisDOTA- Cj - jedinjenja4

[0046]Priprema jedinjenja 4 izvedena je praćenjem koraka koji su ovde navedeni.

Sinteza redukovanog biotinamidoheksilamina ( r- BHD) - jedinjenja1

[0047]Detaljan sintetički postupak i fizičko-hemijske osobine jedinjenja 1 objavljene su u radu koji su dali G. Sabatino, M. Chinol, G. Paganelli, S. Papi, M. Chelli, G.Leone, A. M. Papini, A. De Luca, and M. Ginanneschi, J. Med. Chem., 2003, 46, 3170-3173. NMR spektri proizvoda koji je ovde objavljen beleženi su u DMSO-dćrastvoru na Varian 400. N,N-6w[3-(Fmoc-amino)propil]glicin iz primera kupljen je iz Fluka (Switzerland) kao kalijum sulfatna so.

Sinteza r- BHD konjugata sa N, N- bisr( 3- amino) propil1glicinom - Jedinjenje2

[0048]HATU (66.5 mg, 0.175 mmol, 0.7 mol ekv.) u NMP (0.5 mL) dodati su u rastvor N,N-bis[3-(Fmoc-amino)propil]glicin kalijum sulfata (115.5 mg, 0.15 mmol, 0.6 mol ekv.) i NMM (33.05 uL, 0.3 mmol, 1.2 mol ekv.) u NMP (1 mL). Ovaj rastvor je ukapavanjem dodavan 5 min. u suspenziju r-BHD (Jedinjenje1)(100 mg, 0.25 mmol) u NMP (5 mL) koja sadrži NMM (27.5 [ ih, 0.25 mmol, 1 mol ekv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi i reakcija je praćena pomoću RP-HPLC (eluent: od 30% do 100% B u 20 mim; tR= 13.4 min). Posle 2.5 časa, jedinjenje 1 (57.7 mg, 0.08 mmol, 0.3 mol ekv.) ponovo je dodato u reakcionu smešu. Posle 2.5 časa, reakcija je zaustavljena i rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Žuto-narandžasto ulje je suspendovano u vodi na 0°C uz mešanje čime se dobija beli talog koji je prečišćen pomoću RP-CC (LiChroprep RP-8, 40-63 um; 170 x 20 mm; eluent: CH3CN/H20/HC1 = 50:50:0.1, 1 mL/min) dajući jedinjenje 2 (130 mg; 55% prinos). Fmoc-zaštićeni bis-amino derivat (jedinjenje 2) izgleda da je čist što je utvrđeno pomoću T.L.C. (CH3CN/H2O/HCI = 50:50:0.1). 'H NMR (200 MHz, DMSO): 5 9.63 (br s, IH), 8.64 (br s, 3H), 7.87 (d, 4H), 7.65 (d, 4H), 7.43-7.27 (m, 8H), 6.41 (d, 2H), 4.31-4.14 (m, 8H), 3.85 (s, 2H), 3.14-3.03 (m, 11H), 2.82-2.76 (m, 4H), 2.6 (d, 2H), 1.76-1.25 (m, 20H) ESI-MS (m/e): izračunato [M + H]<+>944.5, zabeleženo 944.5.

[0049]Fmoc-zaštićeni bis-amino derivat (jedinjenje 2) (88 mg, 0.09 mmol) rastvoren je u DMF koji sadrži 25% piperidina (5 mL). Rastvor je održavan uz mešanje na sobnoj temperaturi 6 časova, uz praćenje reakcije pomoću RP-HPLC (od 30 do 100% B u 20 min; tR= 16.7 min). Reakciona smeša je zatim isparavana pod sniženim pritiskom i sirovo ulje je rastvoreno u minimalnoj količini MeOH i istaloženo sa Et20. Sakupljena čvrsta supstanca je dva puta isprana etrom, rastvorena u vodi i liofilizovana, čime se dobija beli proizvod koji je prečišćen pomoću SPE (ekstrakcija čvrste faze; LiChroprep RP-18, 25-40 um; 170 x 20 mm; eluent: H20 100%-MeOH od 4 do 100%). Eluirane frakcije su sakupljene i liofilizovane dajući bis-amin (jedinjenje 3) kome je uklonjena zaštitna grupa (30 mg, 75% prinos). 'H NMR (200 MHz, CDCI3): 5 8.12 (br s, 2H), 6.45 (s, 2H), 4.26 (m, IH), 4.12 (m, IH), 3.59-2.95 (m, 7H), 2.95-2.70 (m, 12H), 2.50 (d, 2H), 1.80-1.20 (m, 20H) ESI-MS (m/e): izračunato [M + H]<+>443.6, zabeleženo 443.1.

Koniugaciia jedinjenja 3 sa aktiviranim DOTA za dobiianie BisDOTA- Cj jedinjenja4

[0050]Sulfo-NHS (26 mg, 0.12 mmol) dodat je u rastvor DOTA0.31H2O (49.2 mg, 0.12 mmol) u H20 (0.750 mL). pH vrednost je zatim podešena do 6.5 sa 0.1 M NaOH i rastvor EDC (23 mg, 0.12 mmol) u H20 (0.5 mL) dodavanje ukapavanjem na 0°C.

[0051]Reakciona smeša je mešana na 0°C u trajanju od 30 min i zatim je ukapavanjem dodavan rastvor jedinjenja 3 (15 mg, 0.03 mmol) u H20 (0.750 mL), na pH 7.8, tokom 5 min.

[0052]Reakcija je proveravana pomoću RP-HPLC (od 5 do 100% B za 30 min; tR= 16.4 min).

[0053]Posle 2 časa reakciona smeša je liofilizovana i sirovo jedinjenje je pred-prečišćeno pomoću SPE (ekstrakcija čvrste faze; LiChroprep RP-18, 25-40 um; 15 x 65 mm; eluenti: a) H20; b) 4% MeOH u H20; c) 100% MeOH. HPLC test ekstrahovanih frakcija pokazao je daje jedinjenje 4 uglavnom u frakciji c. Metanolski rastvor je isparavan i proizvod je prečišćen pomoću RP-HPLC (od 5 do 30% B za 30 min: tR= 16.4 min) čime se dobija čisti Bis-DOTA (jedinjenje 4) (15 mg, 24% prinos) kao bela čvrsta supstanca.

ESI-MS: m/e izračunato [M + H]<+>1272.7, zabeleženo 1272.7; [M - H]<+>1270.7, zabeleženo 1270.9. Anal. (C56HioiNi5Oi6S-6TFA-5H20) C, H, N.

[0054]Testovi obeležavanja, radiohemijske čistoće i stabilnosti seruma izvedeni su sa jedinjenjem ilustrovanim u prethodno navedenom primeru.

[0055]Testovi obeležavanja izvedeni su primenom 2 mg/mL MilliQ vodenih rastvora BisDOTA-C3. 1.0 mM natrijum acetatni pufer (pH 5.0) je dodat u BisDOTA-C3, kojima je zatim dodat radioaktivni izotopski rastvor (MCI3, M=<111>In,<90>Y,<177>Lu) na specifičnoj radioaktivnosti od 1 mCi/7.2 ug. Konačno su ovi rastvori inkubirani na 95°C u trajanju od 30 min.

[0056]U cilju određivanja radiohemijske čistoće (RCP), korišćena je silika gel Instant hromatografija na tankom sloju (ITLC-SG). Alikvota radioaktivno obeležene smeše dodata je u molarni višak Avidina i DTP A, zatim je kap obeležena na ITLC trakama i razvijena sa fiziološkim rastvorom. Traka je analizirana pomoću Radio-TLC aparata; u ovom sistemu, kompleks formiran pomoću BisDOTA-C3i Avidina ostaje na početku, dok je nevezani radioaktivni metal formirao kompleks sa DTPA i on se kreće sa frontom rastvarača. Tipično dobijene RCP vrednosti bile su >96%.

[0057]Testovi stabilnosti su izvedeni sa i bez askorbinske kiseline (AA) kao akceptorom radikala. Jednake količine obeleženih molekula su inkubirane na 37°C sa 4-strukom zapreminom fiziološkog rastvora ili AA rastvora (4 mg/mL u 1.0 M natrij um acetatnom puferu, pH 5.0). Studije stabilnosti su izvedene posle 24 i 48 časova i RCPs su izračunavani korišćenjem ITLC-SG postupka kao što je opisano u prethodnom tekstu. Rezultati su pokazali da su u prisustvu AA, radioaktivno obeleženi M-BisDOTA-C3bili stabilni na radiolizu do 48 časova.

Claims (11)

1. Jedinjenje formule (I): naznačeno time što: A je CH2 ili CO; B je H, CHO ili COOH; uz uslov da: kada je A jednako CH2, Q je -(CH2)„- grupa, u kojoj je n ceo broj od 4 do 12, u kom slučaju je R odsutan; kada je A jednako CO, Q je izabran iz grupe koju čine -(CH2)a-CH(R-)-(CH2)t>-, gde su a i b, nezavisno, celi brojevi od 0 do n-1 i R je defmisan kao u daljem tekstu; W je C1-C12alkilen ili C2-Ci2alkenilen linearni lanac ili funkcionalizovani polietilen glikol; ili Cć-Cioaromatični ostatak; ili glikofuranozni ostatak; ili W, sam ili zajedno sa atomom azota koji nosi -(CH2)C-NHR' i -(CH2)d-NHR" lance, je heterociklična grupa sa 5 ili 6 članova koji sadže jedan ili više heteroatoma izabranih od O, N, S; kada je W aromatični ostatak, heterociklična grupa ili šećerna grupa, atom azota koji nosi -(CH2)C-NHR' i -(CH2)d-NHR" lance je izborno odsutan i -(CH2)C-NHR' i -(CH2)d-NHR" lanci su direktno i nezavisno vezani za atome ugljenika ili azota aromatičnih i heterocikličnih prstenova ili za atome kiseonika glikofuranoznog ostatka; c i d nezavisno su celi brojevi od 3 do 10; R' i R" su, nezavisno, -A, gde je -A makrociklus formule (II): gde su Y isti ili različiti i izabrani su iz grupe koju čine vodonik, linearni ili granati C1-C4 alkil, -(CH2)m-COOH, gde je m ceo broj od 1 do 3; X je vodonik, ili -CH2-U grupa, gde je U izabran iz grupe koju čine metil, etil, p-aminofenil, ili X je -(CHJ)0-Z grupa, gde je o ceo broj od 1 do 5, J je vodonik, metil ili etil, Z je heterociklična grupa sa 5 ili 6 članova koja sadrži jedan ili više heteroatoma izabranih od O, N-Ri, Rije atom vodonika ili linearna ili granata C1-C4alkil grupa, i S; ili Z je izabran od -NH2, -NH-C(=NH-)-NH2, ili -S-R2gde je R2linearna ili granata C1-C4alkil grupa; p je ceo broj 2 ili 3; R je izabran iz grupe koju čine linearni ili granati C1-C4alkil, cikloalkil, heterociklus ili -(CH2)q-T, gde je T izabran iz grupe koju čine S-CH3, -OH ili - COOH, i q je 0, 1 ili 2.

2. Jedinjenje formule (I) prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je nezavisno A jednako CH2, B je H, Q je -(CH2)n-, gde je n ceo broj od 4 do 8, poželjno 6, c i d su istovremeno 3 ili 6, R' i R" su -A, gde je Y uvek -CH2-COOH; X je vodonik, i p je 2.

3. Kompleks jedinjenja formule (I) prema patentnim zahtevima 1 ili 2 sa radioaktivnim izotopom.

4. Kompleks prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je radioaktivni izotop izabran iz grupe koju čine Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111,1-123, 1-125, 1-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, 1-131, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153, Lu-177 i Au-198.

5. Kompleks prema patentnim zahtevima 3 ili 4, naznačen time što je Q jednako - (CH2)n-, nje ceo broj od 4 do 8, poželjno 6, Y je -CH2-COOH i radioaktivni izotop je Y-90.

6. Farmaceutska i/ili dijagnostička kompozicija naznačena time što sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, u smeši sa pogodnim nosačima i/ili inertnim puniocima.

7. Primena jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za pripremu leka koji je koristan u lečenju tumora.

8. Farmaceutska i/ili dijagnostička kompozicija naznačena time što sadrži kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 3, 4 ili 5 u smeši sa pogodnim nosačima i/ili inertnim puniocima.

9. Kompleks prema jednom od patentnih zahteva 3, 4 ili 5 za primenu kao radiofarmaceutik protiv kancera.

10. Komplet za radioterapiju ili dijagnozu tumora,naznačen time štonajmanje jedna od komponenti navedenog kompleta sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili kompleks prema patentnom zahtevu 3.

11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za primenu u lečenju tumora.