RS51523B - Rana dijagnoza konformacionih bolesti - Google Patents

Abstract

Postupak za dijagnozu ili detekciju konformacijske bolesti koja se odlikuje konformacijskim prelaskom osnovnog proteina između nepatogenog i patogenog konformera da konformacijski prelaz može da se propagira iz patogenog konformera do nepatogenog konformera testiranjem markera pomenute bolesti u uzorku, gde taj postupak obuhvata:(i) kontakt navedenog uzorka sa određenom količinom nepatogenog konformera(ii) razlaganje svih eventualnih agregata koji su se mogli stvoriti tokom koraka (i); i(iii) određivanje prisustva i/ili količine navedenog patogenog konformera u uzorku, gde je taj patogeni konformer marker prisustva pomenute bolesti,naznačen time, da korak (i) obuhvata korak (ia) inkubacije navedenog uzorka/nepatogenog konformera, a koraci (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se obavi korak (iii).Prijava sadrži još 5 nezavisnih i 8 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dijagnostikovanje ili otkrivanje konformacionih bolesti određivanjem markera (t.j. patogenog konformera) takvih bolesti u uzorku, tako da taj postupak obuhvata ciklični sistem amplifikacije u cilju povećanja nivoa tog patogenog konformera. Pre svih, u ove konformacione bolesti spadaju prionske encefalopatije.

STANJE TEHNIKE

Konformacione bolesti su grupa poremećaja koje su naizgled međusobno nepovezane, ali koje imaju upadljivu zajedničku sličnost u kliničkoj slici koja oslikava njihov zajednički molekulski mehanizam započinjanja samo-udruživanja, posle čega slede naslage u tkivima i njihovo oštećenje.

Strukturni interes je posledica činjenice da ove različite bolesti, svaka za sebe potiču od aberantne konformacione tranzicije u jednom osnovnom proteinu, što karakteristično dovodi do agregacije proteina i naslaga u tkivima. Medicinski, prezentacija ovih konformacionih bolesti oslikava ovaj molekularni mehanizam, koji tipično ima spor i podmukli početak kada do tranzicije dolazi u normalnoj belančevini, ali je iznenadniji početak kada se javlja u nestabilnoj varijanti proteina. Dva primera od posebnog značaja za takve konformacione bolesti su prenosive spongiformne encefalopatije i Alchajmerova demencija, što je bolest koja preti da ugrozi celokupne sisteme zdravstvene zaštite u razvijenom svetu (za pregled vidi Carrelll i sar. 1997).

Prenosive spongiformne encefalopatije (PSE) su poznate i kao prionske bolesti, i to je jedna grupa neurodegenerativnih bolersti koja napada ljude i životinje. Krojcfeld-Jakobova bolest (CJB), kuru, Gerstman-Štrojsler-Šenkerova bolest (GSS) i fatalna familirajna insomnija (nesanica) (FFI) kod ljudi kaoscrapie(virusno oboljenje ovaca koje izaziva paralizu) i bovina spongiformna encefalopatija (BSE) kod životinja su samo neke od PSE bolesti (Prusiner, 1991).

Iako su ove bolesti relativno retke kod ljudi, opasnost od prenošenja BSE na ljude preko lanca ishrane skrenula je pažnju ljudi koji se bave javnim zdravstvom i naučne javnosti (Cousens i sar. 1997, Bruse i sar. 1997).

Ove bolesti se odlikuju izuzetno dugim periodom inkubacije, posle čega sledi kratak, i uvek fatalni ishod (Roos i sar. 1973). Za sada nemamo nikakvu terapiju.

Ključna odlika ove bolesti jeste stvaranje abnormalno oblikovanog proteina koji se zove PrP<Sc>, koji je post-translaciono modifikovana verzija normalnog proteina koji se naziva PrP<c>(Cohen i Prusiner, 1998). Nisu otkrivene hemijske razlike kojima bi se mogla napraviti razlika između PrP izoforma (Stahl i sar. 1993), a izgleda da konverzija uključuje konformacione promene kojima se a-helikalni sadržaj normalnih proteina smanjuje dok se količina (3-nabrane ploče povećava (Pan i sar. 1993). Strukturne promene su praćene alteracijama u biohemijskim svojstvima: PrP je rastvorljiv u ne-denaturišućim deterdžentima, PrP<Sc>je nerastvorljiv. PrP<c>se lako razgrađuje proteazom, dok je PrP<Sc>delimično rezistentan, što dovodi do stvaranje fragmenta koji je poznat pod imenom "PrPres" na N-završetku (Baldvvin i sar. 1995; Cohen i Prusiner, 1998), "PrP 27-30" (27 - 30 kDa) ili "PK-rezistentnog" (proteinaza K rezistentnog) oblika.

U ovom trenutku još nema tačne dijagnoze za PTE (Izveštaj SZO, 1998, Budka i sar. 1995; Weber i sar. 1997). Pokušaji da se razvije dijagnostički test za prionske bolesti otežani su očiglednim odsustvom imunog odgovora na PrP<Sc>. Klinička dijagnoza CJB se trenutno zasniva na kombinaciji subakutne progresivne demencije (manje od dve godine), mioklonusa i multifokalne neurološke disfunkcije, što je praćeno karakterističnim periodičnim elektroencefalogramom (EEG) (Izveštaj SZO, 1998, Weber i sar. 1997). Međutim , jedna varijanta CJB (vCJB), većina jatrogenih formi CJB i do 40% sporadičnih slučajeva nemaju EEG abnormalnosti (Steinhoff i sar. 1996). U prošeku, tačnost kliničke dijagnoze je oko 60% za CJB i visoko varijabilna za druge bolesti vezane za prione. Klinička dijagnoza je tačnija samo u poznom stadijumu bolesti kada se već razviju jasni simptomi (Weber i sar. 1997).

Genetska analiza je korisna za nasledne prionske bolesti, ali na njih otpada samo 15% slučajeva. Neiroimidžing je koristan samo da se isključe druga stanja brzo progresivne demencije usled strukturnih lezija mozga (Weber i sar. 1997). Nalazi koji se dobijaju vizualizacijom mozga kompjuterizovanom tomografijom (CT) i magnetnom rezonancom (MRI) uglavnom zavise od stadijuma bolesti. CT je daleko manje osetljiv postupak i u ranoj fazi se atrofija ne može detektovati u 80% slučajeva (Galkvez i Cartier, 1983). Hiperintenzivni signali MRI su otkriveni u bazalnim ganglijama uz atrofiju (Onofrji i sar. 1993). Kao i promene primećene na CT ove promene ni na koji način nisu specifične.

Noviji podaci su identifikovali nekoliko neuronalnih, astrocitnih i glijalnih proteina koji su povišeni kod obolelih od CJB (Jimi i sar,. 1992). Protein S-100, neuron specifični izoenzim i ubikvitin su signifikantno povišeni u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) u ranoj fazi bolesti gde se koncentracija smanjuje tokom evolucije bolesti (Jimi i sar,. 1992). Marker neuronalne smrti, protein 14-3-3, predložen je kao specifični i senzitivni test za sporadičnu CJB (Hsich i sar. 1996). Međutim, on nije koristan za dijagnozu vCJB, a još je manje specifičan kod genetskih formi. Budući da protein 14-3-3- može da bude prisutan u CSF pacijenata i sa drugim stanjima, SZO ne preporučuje ovaj test kao opšti skrining za CJB i rezerviše se samo za potvrdu kliničke dijagnoze (Izveštaj SZO, 1998).

Kombinacijom kliničkih podataka i biohemijskih markera postiže se veći uspeh u dijagnostikovanju. Međutim, po radnoj dijagnozi koja se trenutno koristi u Evropskom pregledu za CJB, definitivna dijagnoza se postavlja samo neuropatološkim pregledom i detekcijom PrP<Sc>bilo imunohistohemijski, histoblot ili Western blot testovima (Weber i sar. 1997; Budkai sar. 1995).

Stvaranje PrPScnije samo najverovatniji uzročnik bolesti, već i najpoznatiji marker. Otkrivanje PrP<Sc>u tkivima i ćelijama koreliše u mnogome sa bolešću i sa prisustvom infektivnosti TSE, a tretmani koji inaktiviraju ili eliminišu TSE infektivnost eliminišu i sam<p>r<pSc>(<p>rjusiner?1991). Identifikacija PrP<Sc>u humanim ili životinjskim tkivima smatra se ključnim za postavljanje dijagnoze TSE (Izveštaj SZO, 1998). Jedno važno ograničenje ovog pristupa jeste osetljivost jer su količine PrP<Sc>visoke (dovoljne za detekciju konvencionalnim postupcima) samo u CNS i u poznim stadijumima bolesti. Međutim, pokazano je da u ranijim stadijumima bolesti, postoji generalizovana distribucija PrP<Sc>(u manjim količinama), posebno u limforetikularnom sistemu (Aguzzi, 1997). I stvarno, prisustvo PrP<Sc>zabeleženo je u palatinom tonzilarnom tkivu i apendiksu dobijenim iz pacijenata sa vCJB (Hill i sar. 1997). Iako se ne zna koliko rano tokom evolucije bolesti tkivo tonzila ili apendiksa mogu da se koriste za dijagnozu vCJB, pokazano je da kod ovaca generalno osetljivih nascrapie,PrP<Sc>bi mogao da se detektuje u tonzilarnom tkivo presimptomatski i rano tokom perioda inkubacije. Međutim, PrPScnije otkriven u ovim tkivima, barem ne u slučajevima sporadične CJB ili GSS (Kavvashima i sar. 1997).

Normalni protein se izražava u belim krvnim zrncima i trombocitima, pa je moguće da neke krvne ćelije možda sadrže PrP<Sc>kod napadnutih pojedinaca (Aguzzi, 1997). Ovo dovodi do mogućnosti razvoja krvnih testova za CJB, ali bi za ovo bio potreban test s daleko većim stepenom osetljivosti od onih kojima trenutno raspolažemo.

Postavljena je hipoteza da do replikacije priona dolazi kada PrP<Sc>u inficiranom inokulumu uđe u interakciju specifično sa domaćinovim PrP<Sc>, katalizujući svoju konverziju u patogenu formu ovog proteina (Cohen i sar. 1994). Ovaj proces traje od mnogo meseci do godina da bi se dostigla koncentracija PrP<Sc>dovoljna da se pokrenu klinički simptomi.

Izgleda da je infektivna jedinica PrP<Sc>jedna oligometrijska struktura bogata P-nabranom pločom, koja konvertuje normalni protein integrišući ga u rastući agregat (Slika 1): Ova konverzija jein vitropodražavana mešanje prečišćenog PrP<c>sa pedesetostrukim molarnim viškom prethodno denaturisanog PrP<Sc>(Kosicko i sar. 1994).

In vitrosistemi konverzije koji su do danas opisani imaju nisku efikasnost, jer iziskuju višak PrP<Sc>, pa nisu pogodni za dijagnostičke namene jer ne mogu da prate nemerljive količine markera. Razlog za nisku efikasnost jeste i to što broj PrP<Sc>oligomera (konvertujućih jedinica) ostaje fiksiran tokom celog trajanja testa. Konvertujuće jedinice sekvencijalno rastu na krajevima, i kao rezultat ovoga one postaju veće, ali se njihov broj ne uvećava (Slika 1).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Mi smo sada otkrili postupak za dijagnozu ili detekciju konformacionih bolesti, gde je bolest naznačena konformacionom tranzicijom osnovnog proteina između nepatogenog i patogenog konformera, procenjujući marker navedene bolesti u samom uzorku, što ovaj postupak obuhvata. (i) kontaktiranje navedenog uzorka s količinom nepatogenog konformera;

(ii) razbijanje svih agregata koji se eventualno oforme tokom ove faze (9), i

(iii) određivanje prisustva i/ili količine navedenog patogenog konformera u uzorku.

Generalno, patogeni konformer će biti marker prisustva navedene bolesti.

Po mogućstvu, faza (i) obuhvata fazu (ia) gde se inkubira pomenuti uzorak/nepatogeni konformer.

U skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska, faze (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se pređe na fazu (iii). Još bolje, ovi ciklusi se ponavljaju 5-40 puta, a najbolje 5-20 puta.

Konformacione bolesti koje treba otkriti ili dijagnostikovati su one koje se odlikuju konformacionom tranzicijom osnovnog proteina. Ovaj "osnovni protein" je onaj protein koji je u stanju da usvoji nepatogenu konformaciju i patogenu konformaciju. Jedan primer takvog proteina jeste prionski protein PrP. Drugi primer takvog proteina je onaj uključen u Alchajmerovu bolest, t.j. -amiloidni protein.

Konformacione bolesti koje treba otkriti ili dijagnostikovati su po mogućstvu prenosive konformacione bolesti kao stoje TSE (kako je definisano u polju pronalaska).

U slučaju dijagnostikovanja TSE i u skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska, marker bolesti,kao i patogeni konformer je PrP<Sc>, dok je ne<p>atogeni konformer proteina koji nas zanima PrP<c>.

Količina nepatogenog konformera koja se koristi u fazi (i) (i opciono u fazi (ib)) generalno će biti poznata količina, iako ovo ne mora da bude slučaj ako samo želimo da utvrdimo prisustvo ili odsustvo patogenog konformera.

Po mogućstvu, količina nepatogenog konformera koja se koristi u fazi (i) (i opciono u fazi (ib)) generalno će biti prekomerna. Generalno, inicijalni odnos nepatogenog konformera i patogenog konformera (ako je prisutan u uzorku) biće preko 100:1, po mogućstvu veći od 1000:1, a najbolje veći od 100000:1.

U daljem preporučenom obliku ovog pronalaska, nepatogeni konformer u fazi (i) je prisutan u homogenatu mozga zdravog lica i/ili može se dodati u njega pre sprovođenja faze (i); u ovom slučaju, prema tome, homogenat mozga koji sadrži (po mogućstvu poznati) višak ne-patogenog konformera dodaje se tokom faze (i). Po mogućstvu, homogenat mozga zdravog ispitanika dolazi od iste vrste kao i uzorak koji se analizira (na pr. homogenat mozga čoveka za analizu humanog uzorka, homogenat mozga pacova ako će se analizirati uzorak pacova). Po mogućstvu, nepatogeni konformer je prisutan u specifičnoj frakciji homogenata mozga, na primer u lipidnim raftovima iz homogenata mozga. Priprema takvih frakcija opisana je kod Sargiacorno M. i sar. 1993.

Tako se ovaj pronalazak dalje odnosi na postupak ili test koji je ovde opisan tako da se tkivo ili tkivna frakcija dodaje u nepatogeni konformer u fazi (i). Po mogućstvu, ovo tkivo je moždano tkivo, ili homogenat odnosno frakcija dobijeni iz njega, zdravog ispitanika (odnosno onoga kod koga nepatogeni konformer nije prisutan).

Zabeleženo je (Kocisko i sar. 1994) da se manje glikolizoirane forme PrP<c>preferencijalno konvertuju u PrP<Sc>oblike. Pre svega, PrP<c>koji je tretiran fosfatidil inozitol specifičnom fosfolipazom C rutinski je efikasnije konvertovan u patogenu formu od kompletnog, glikoliziranijeg PrP . Dodatni oblik ovog pronalaska, prema tome, odnosi se na postupak ili test koji je ovde opisan gde je ne-patogeni konformer PrP<c>koji ima redukovane nivoe glikozilacije (pre svega glikozilacije povezane za N) u poređenju sa divljim tipom PrP<c>.

Po mogućstvu, PrP<c>je tretiran u cilju uklanjanja izvesne, ili značajne količine glikozilacije pre nego što se koristi kao nepatogeni konformer u postupcima i testovima koji su ovde opisani; i još bolje, nepatogeni konformer je PrP koji je esencijalno neglikoliziran.

U slučaju dijagnoze TSE, koji su prisutni agregati patogene forme u uzorku, tokom faze (i) oni će indukovati tranziciju iz PrP<c>—»PrP<Sc>i tokom faze (ii) takvi agregati će se razbiti u manje, i dalje infektivne jedinice od kojih će svaka biti u stanju da indukuje konverziju drugih PrP . Ova vrsta postupka se ovde naziva "cikličnom amplifikacijom" i prikazana je na Slici 2. Ovaj sistem ima za posledicu eksponencijalni rast količine PrP<Sc>koja je na kraju prisutna u uzorku koja se lako može otkriti. U skladu sa daljim preporučenim oblikom ovog pronalaska, tako je moguće da se izračuna količina PrP<Sc>koja je inicijalno prisutna u uzorku počevši od poznate količine PrP<c>, određujući količinu PrP<Sc>koja je prisutna u uzorku na kraju testa i uzimajući u obzir broj obavljenih ciklusa.

Ako, međutim, u uzorku nema PrP<Sc>(ni kao takvog, niti u obliku agregata), nijedan PrP<c>molekul se neće konvertovati u PrP<Sc>i na kraju testa marker će biti potpuno odsutan (neće biti patogenih konformera u uzorku).

Pokazano je da infektivna jedinica je PrPSc jedan oligomer bogat (3-nabranom pločom koji može da konvertuje normalni protein integrišući ga u rastući agregat, gde on stiče svojstva povezana s abnormalnom formom (rezistencija na proteinazu i nerastvorljivost)

(Jarrett i Lansburv, Jr., 1993; Caughev i sar. 1997). Po inkubaciji dve forme PrP, oligomerne vrste povećavaju svoju veličinu regrutovanjem i transformisanjem molekula PrP . Ovaj proces je niske efikasnosti, jer zavisi od fiksnog broja oligomera koji raste na krajevima. Broj konvertujućih jedinica se ne povećava tokom reakcije kada samo postaju veće. Pretpostavlja se daje ovaj proces ono što se dešava kod životinja ili u telu čoveka po infekciji; poznato je da ovaj proces traje mesecima, pa čak i po nekoliko godina. U ovom pronalasku opisujemo postupak razbijanja oligomera na manje, od kojih je svaki sposoban da konvertuje PrP .

Prema tome, ovaj sistem ima direktnu primenu na dijagnostikovanje konformacionih bolesti, a pre svega prenosivih konformacionih bolesti, kao što su TSE tako što se amplifikuju inače nemerljive količine PrP<Sc>u različitim tkivima i biološkim tečnostima. Ovaj sistem može da omogući ranu identifikaciju ljudi koji su izloženi riziku a razviju TSE u može biti veoma koristan za biohemijsko praćenje terapijskih jedinjenja za TSE tokom kliničkih ispitivanja.

U skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska uzorak koji će se analizo vati podvrgava se "pred-tretmanskoj" fazi, koja ima za cilj da "selektivno koncentriše" uzorak patogenog konformera koji treba detektovati. U slučaju TSE, zabeleženo je da su i PrP<c>i PrP<Sc>l<o>cirani u specijalnom regionu membrane plazme koja je rezistentna na tretman blažim deterdžentom (kao što je ledeno-hladni Triton X-100) zbog relativno visokog sadržaja holesterola i glikosfingolipida (M. Vey i sar. 1996). Ovi membranski domeni se nazivaju lipidnim raftovima ili membranama rezistentnim na deterdžente (DRM) ili kaveolarnim domenima (CLDs) i sadrže puno signalnih proteina, receptora i proteina ukotvljenih u GPL Potvrdili smo da je 100% PrP<c>u mozgu vezano za ovu frakciju koja sadrži <2% ukupnih proteina (vidi Primer 6 i Sliku 7). Na taj način, jednostavna faza izolacije lipidnog rafta iz uzorka omogućava dramatično obogaćivanje PrP<c->om. Slični rezultati dobijen i su i Aplikantom u izolaciji lipidnih raftova iz homogenata ovaca obolelih odscrapie,kod kojih je PrP<Sc>izolovan iz raftova.

Tako, jedan oblik ovog pronalaska uključuje fazu naznačenu time da se uzorak koji će se analizo vati podvrgava pred-tretmanskoj fazi za selektivnu koncentraciju patogenog konformera u uzorku. Po mogućstvu, ovaj patogeni konformer je PrP<Sc>, a pred-tretman podrazumeva ekstrakciju iz uzorka frakcije koja nije rastvorljiva u blagim deterdžentima.

Faza (i) i (ia) se po mogućstvu obavlja u fiziološkim uslovima (pH, temperatura i jonski naboj) i, još bolje, u ovaj rastvor se dodaju inhibitori proteaze i deterdženti. Zaključak će se izabrati na taj način da se omogući svakom patogenom konformeru, ako je prsutan u uzorku, da konvertuje nepatogeni konformer u patogeni konformer i na taj način stvori agregat ili oligomer patogenih konformera. Odgovarajući fiziološki uslovi će biti odmah očigledni onima koji su stručnjaci za ovu oblast.

Trajanje inkubacije će biti onoliko koliko dozvoljava da deo ili znatni deo nepatogenog konformera bude konvertovan u patogeni konformer, pod pretpostavkom da uzorak sadrži deo patogenog konformera. Ovo vreme će lako odrediti stručnjaci za ovu oblast. Po mogućstvu, svaka inkubacija će trajati između 1 minuta i 4 sata, najbolje 30 minuta do 1 sata, i posebno bi bilo najbolje da to traje oko 60 minuta.

Inkubaciona faza (ia) može da obuhvati i dalju fazu (ib) koja obuhvata dodatak dodatnih količina nepatogenog konformera.

Mogu se koristiti različiti postupci za razbijanje agregata tokom faze (ii) postupka u ovom pronalasku. Ovde spadaju; tretman rastvaračima (kao što su natriuum dodecil sulfat, dimetilsulfoksid, acetonitril, gcanidin, urea, trifluoroetanol, razblažena trifluorosirćetna kiselina, razblažena mravlja kiselina, itd.), modifikacija fiziko-hemijskih osobina rastvora kao što je pH, temperatura, jonska snaga, dielektrična konstanta, i fizičkog postupka, kao što su sonikacija, lasersko zračenje, zamrzavanje/topljenje, Francuska presa, inkubacija autoklavom, visoki pritisak, mešanje, blaga homogenizacija, druge vrste zračenja, itd. Sonikacija je, po ovom pronalasku, najbolji postupak.

Razbijanje agregata može da se sprovede tokom vremena tokom se razbija neki, celokupni ili signifikantni deo agregata koji su se oformili tokom faze (ii). Nije neophodno za sve da se agregati potpuno razbiju ni u jednoj fazi razbijanja. Na ovaj način, broj konvertujućih jedinica se povećava u svakoj fazi dezintegracije.

Trajanje dezintegracija će brzo odrediti stručnjaci za ovu oblast i ono može da zavisi od postupka dezintegracije koja se koristi. Po mogućstvu, dezintegracija se sprovodi u trajanju od 1 sekunde do 60 minuta, najbolje 5 sekundi do 30 minuta, ili još bolje 5 sekundi do 10 minuta. Ako se razgradnja sprovodi sonikacijom, najbolje je da sonikacija traje 5 sekundi do 5 minuta ili još bolje 5 do 30 sekundi.

U prošlosti je sonikacija korišćena kao deo nekoliko postupaka da se purifikuje PrP s ciljem da se pojača rastvorljivost velikih agregata, ali do sada nikada nije opisano da amplifikuje in vitro konverziju PrP.

Korišćenje tradicionalnog sonikatora s jednom sondom nameće problem za istovremeno rukovanje velikim brojem uzoraka, kao što će to iziskivati dijagnostički testovi. Na tržištu postoje sonikatori u formatu za ploču sa 96 udubljenja koja obezbeđuje sonikaciju za sva udubljenja istovremeno i može se programirati za automatski rad. Ovi sonikatori mogu lako da se adaptiraju za upotrebu u dijagnostičkim postupcima za ovaj pronalazak.

Prema tome, jedan oblik ovog pronalaska odnosi se na korišćenje sonikatora za više udubljenja u fazi (ii).

Otkrivanje novokonvertovanog patogenog konformera, na pr. PrP<Sc>, (iii) po proceduri ciklične amplifikacije opisane u fazama (i) i (ii) može da se sprovede u skladu sa ma kojom od poznatih postupaka. Specifična detekcija PrP<Sc>obično se (ali ne uvek, vidi dole) obavlja prvo u fazi separacije dva PrP izoforma (normalni protein i patogeni protein). Separacija se obavlja na bazi specifičnih biohemijskih svojstava PrP<Sc>koje ih razlikuju od većine normalnih proteina u telu, odnosno: PrP<Sc>je delimično rezistentan na tretman proteazom i nije rastvorljiv čak ni u prisustvu ne-denaturisanih deterdženata. Prema tome, prva faza posle postupka amplifikacije je obično uklanjanje ih separacija PrP u uzorku, bilo tretmanom proteazama ili centrifugiranjem da bi se odvojili rastvorljivi (PrP<c>) od nerastvorljivih (PrP<Sc>) proteina. Posle toga, detekcija PrP<Sc>može da se radi ma kojom od sledećih postupaka,inter

alia:

A) Imunobloting po SDS-PAGE. Ovo se obavlja rutinskim postupkom koji je dobro poznat stručnjacima i korišćenjem nekih od brojnih komercijalno dostupnih anti-PrP

antitela.

B) Elisa test. Detekcija čvrste faze može da se uradi bilo jednostavnim testom u kome se uzorak stavlja na ploču a količina PrP<Sc>se potom određuje korišćenjem anti-PrP antitela ili još bolje sendvič Elise gde se ploča prvo oblaže jednim anti-PrP antitelom koji specifično vezuje PrP iz uzorka, koji se konačno otkriva korišćenjem drugog anti-PrP antitela. Obe forme Elise mogu da se koriste i sa obeleženim (radioaktivno, fluorescein , biotin, itd.) anti-PrP antitelioma da se dodato poveća osetljivost

detekcije.

C) Radioaktivni testovi. Normalni PrP<c>koji se koristi kao supstrat za postupak amplifikacije može da se radioaktivno obeleži (3H, 14C, 35S, 1251, itd.) pre početka postupka i po uklanjanju nekonvertovanog PrP<c>, radioaktivnost novokonvertovanog PrP<Sc>može da se kvantifikuje. Ovaj postupak je više kvantitativan i ne oslanja se na

korišćenje antitela.

D) Fluorescencija. Normalni PrP<c>koji se koristi kao supstrat za postupak amplifikacije može da se obeleži fluorescentnim probama pre početka postupka i po uklanjanju nekonvertovanog PrP<c>, fluorescencija novokonvertovanog PrP<Sc>može da se kvantifikuje. Moguće je da test fluorescencije ne mora da iziskuje uklanjanje nekovertovanog PrP<c>, jer fluorescentna svojstva PrP<c>i PrP<Sc>mogu da se razlikuju

zbog jasne konformacije dva izoforma.

E) Agregacijski testovi. Poznato je da PrP<Sc>(a ne PrP<c>) može da se agregira stvarajući amiloidne fibrile štapićaste strukture. Prema tome, detekcija PrP<Sc>može da se obavi korišćenjem postupaka koji se koriste za kvantifikaciju formiranja ova dva tipa agregata, uključujući elektronsku mikroskopiju, prebojavanje specifičnim bojama (Kongo crvena, Tioflavin S i T, itd.) i turbidimetrijskim testovima. Agregacijski testovi iziskuju fazu separacije dva izoforma, jer je poznato da se normalni PrPC ne

agregira.

F) Strukturalni testovi. Najvažnija razlika između normalnih i patogenih PrP jeste njihova sekundarna i tercijarna struktura. Prema tome, postupci koji omogućavaju strukturnu evaluaciju proteina mogu da se koriste, uključujući NMR, cirkularni dihroizam, Furijeovu transformisano infracrvenu spektroskopiju, Ramanovu spektroskopiju, intrinzičku fluorescenciju, aposrpciju UV, itd.

Najšire korišćeno monoklonsko antiteli PrP jeste "3F4" (Kascak i sar. 1987), što je jedno monoklonsko antitelo koje se dobija od miša koji je imunizovan sa 236K PrPres (proteaza-rezistentnim konformerom) zamorca. Ovo antitelo može da prepoznaje i nepatogeni konformer zamorca i čoveka , ali ne i iz moga goveda, miša, pacova, ovce ili zeca; takođe je u stanju da vezuje humani patogeni konformer, ali tek po denaturaciji proteina.

Ovakva antitela mogu da se obeleže da omoguće laku detekciju markera. Na primer, neki naučnici (Safar i sar. 1998) koriste vremenska merenja fluorescencije europijumom obeleženog 3F4 antitela.

Gore opisani postupci detekcije mogu da se koriste za detekciju drugih patogenih konformera, na primer patogenih oblika beta-amiloidnog proteina,mutatis mutandis.

U alternativnom obliku nepatogeni konformer koji se dodaje u višku može da se obeleži i otkrije tako da količine neagregiranog konformera na kraju testa omoguće određivanje količine patogenog konformera koji je inicijalno prisutan u uzorku.

U skladu sa drugim alternativnim oblikom, patogeni konformer (marker) (može direktno da se otkrije antitelom upravljenim protiv njega.

Sire govoreći, obeleživač ili sredina za obeležavanje može da se dodaje u patogeni konformer, u nepatogeni konformer ili u antitelo usmereno protiv jednog od konformera zavisno od vrste testa koji se radi.

Drugi predmet pronalaska jeste test za marker konformacione bolesti koji se odlikuje konformacionom tranzicijom osnovnog proteina između nepatogenog konformera i patogenog konformera, u okviru uzorka, gde takav test obuhvata sledeće faze: (i) kontakt pomenutog uzorka sa količinom nepatogenog konformera, (ii) razbijanje agregata koji se eventualno oforme tokom faze (i) i (iii) određivanje prisustva o/ili količina pomenutog patogenog konformera u uzorku. Generalno govoreći, patogeni konformer će biti marker prisustva pomenute bolesti.

Po mogućstvu, faza (i) obuhvata fazu (ia) inkubirajući pomenuti uzorak/ nepatogeni konformer.

U skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska, faze (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se sprovede faza (iii). Još bolje, ovi ciklusi se ponavljaju između 5 i 40 puta, a najbolje 5 do 20 puta.

Dalji cilj ovog pronalaska jeste dijagnostički komplet koji se koristi u navedenom testu, koji obuhvata količinu nepatogenog konformera, i opciono dodatno jednu ploču za mikrotitraciju i jedan sonikator za više udubljenja na ploči.

Korišćenjem postupka ovog pronalaska, moguće je da se detektuje 1 do 10 fg patogenog konformera inicijalno prisutnog u uzorku što odgovara količini od 3 do 30 x IO"20 mola.

Uzorak će generalno biti jedan biološki uzorak ili tkivo, i svaki takav biološki uzorak ili tkivo može da se analizira postupkom ovog pronalaska. U slučaju da se radi o tkivu, test i postupku ovog pronalaska mogu da se sprovedu na homogenatima ili direktno naex vivouzorcima. Postupci i testovi će generalno da se sprovode naex vivoiliin vitrouzorcima. Po mogućstvu, uzorak je biološka tečnost, kao što je krv, limfa, urin ili mleko; moždano tkivo, kičmena moždina, tonzilarno tkivo ili appendiks; uzorak dobijen iz krvi kao što su "duhovi" krvnih ćelija ili "buffy coat" preparati (frakcije mononukleara) ; ili preparati membrane plazme kao što su lipidni raftovi, membrane rezistentne na deterdžent ili kaveolarni domeni. Uzorak može, alternativno, da se sastoji od jedinjenja (pre svega proteina) koji se dobija iz humanog ili životinjskog izvora, kao što je hormon rasta, ili tkivni ekstrakt, kao što je ekstrakt hipofize. Ovakav sastav uzoraka može da se kontaminira patogenim konformerom.

Uzorak može da obuhvati i neku namirnicu ili piće, ili deo namirnice ili pića (bilo namenjeno upotrebi od strane ljudi ili od strane životinja) da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo patogenog konformera u tom proizvodu ili piću.

Po mogućstvu, nepatogeni konformer koji se dodaje u fazi (i) biće od iste vrste kao i uzorak. Na primer, može se dobiti iz zdravog (t.j. nepatogernog) oblika (na pr. tkiva) biološkog uzorka koji će se testirati. Alternativno, nepatogeni konformer može da se proizvede sintetički ili rekombinanto korišćenjem načina poznatih u struci.

Međutim, jasno je da nepatogeni konformer ne mora da bude ni u čistoj ni u supstancijalno čistoj formi. U većini slučajeva, nepatogeni konformer će biti u obliku tkivnog homogenata ili njegove frakcije koja sadrži relevantni nepatogeni konformer. U preporučene primere spadaju homogenati mozga i frakcije dobijene iz njega, na pr. lipidni raftovi.

Po mogućstvu, uzorak i/ili nepatogeni konformer će biti humanog porekla ili od domaće životinje, na pr. krave, ovce, koze ili mačke.

Drugi predmet ovog pronalaska jeste da se obezbedi postupak za identifikaciju jedinjenja koje modulira konformacionu tranziciju osnovnog poteina između nepatogenog konformera i patogenog konformera, uključujući: (i) kontakt sa jednom količinom nepatogenog konformera s jednom količinom patogenog konformera u prisustvu ili odsustvu navedenog jedinjenja,

(ii) razbijanje agregata koji se eventualno stvore tokom faze (i),

(iii) određivanje količine patogenog konformera u prisustvu ili odsustvu navedenog jedinjenja.

Po želji, faza (i) može da obuhvati fazu (ia) inkubiranja pomenutog uzorka/ nepatogenog konformera, i cikluse koji se obavljaju između faza (ia) i (ii) kako je gore opisano za postupke i testove ovog pronalaska,mutatis mutandis.

Ako je količina patogenog konformera merena u prisustvu jedinjenja veća nego stoje izmerena u njegovom odsustvu, to znači da je to jedinjenje faktor koji "katalizuje" konformacionu tranziciju; ako je takva količina manja, to znači da je ovo jedinjenje faktor koji inhibira takvu tranziciju.

Po gore pomenutom postupku "identifikacija" treba da se tumači tako da znači "skrining" serije jedinjenja.

"Obeležavanje" ili" obeležavajuća sredina " može da podrazumeva ma koje jedinjenje koje se koristi kao sredstvo za detekciju jednog proteina. Ovo "obeležavanje" ili " obeležavajuća sredina " mogu da se pripoje za taj protein jonskom ili kovalentnom inerakcijom, vezivanjem vodonika, elektrostatskom interakcijom ili interkalacijom. U primere obeležavanja ili obeležavajućih sredina spadaju, ali ovo nije iscrpna lista, konjugati fluorescentne boje, biotin, digoksigenin, radionukleotidi, hemilimunescentne supstance, anzimi i receptori, kao što je detekcija obeleženog proteina fluorescencijom, konjugacija za sretptavidin i/ili avidin, kvantifikacija radioaktivnosti ili hemiluminescencije, katalitička i/ili ligand-receptoprska interakcija. Po mogućstvu, odabira se fluorescentno ili fosforescentno obeležavanje.

Izraz "konformacione bolesti" odnosi se na onu grupu poremećaja koji nastaju iz propagacije ili aberantne konformacione tranzicije osnovnog proteina, što dovodi do agregacije proteina i naslaga u tkivima. Ovakve bolesti mogu da se prenose indukovanom konformacionom promenom, propagacijom iz patogenog konformera do svog normalnog ili nepatogenog konformera i u ovom slučaju nazivaju se "prenosive konformacione bolesti". U primere ovakve vrste bolesti spadaju prionske encefalopatije, uključujući goveđu (bovinu) spongiformnu encefalopatiju (BSE) i njen humani ekvivalnet Krojcfeld-Jakobovu bolest (CJB) kod kojih je osnovni protein PrP.

Izraz "sporadična CJB" koji se označava kao sCJB odnosi se na najčešću manifestaciju Krojcfeld-Jakobove bolesti (CJB). Ova bolest nastaje spontano kod lica prosečne starosti oko 60 godina i to po stopi od 1 na milion lica godišnje širom planete.

Izraz "Jatrogena CJB" ili skraćeno "iCJB" odnosi se na bolest koja je posledica slučajne infekcije ljudi humanim prionima. Najznačajniji primer ove slučajne infekcije dece humanim prionima iz kontaminiranih preparata humanog hormona rasta.

Izraz "familijalna CJB" ili skraćeno "fCJB" odnosi se na oblik CJB koji se retko javlja u porodicama i neizostavno je uzrokovan mutacijama humanog prionskog proteinskog gena. Ova bolest je posledica autosomno domionantnog poremećaja. Članovi porodice koji naslede mutacije podležu CBJ.

Izraz "Gerštman-Strasler-Šenkerova bolest" ili skraćeno "GSS" odnosi se na oblik nasledne humane prionske bolesti. Ova bolest nastaje od autosomno dominantnog poremećaja. Članovi porodice koji naslede mutacije podležu GSS.

"Izraz "prion" će označavati prenosivu česticu za koju se zna da uzrokuje grupu takvih prenosivih konformacionih bolesti (spongiformnih encefalopatija) kod ljudi i životinja. Izraz "prion" je rezultat sažimanja dve reči "protein" i "infekcija" i čestice koje on obuhvata su uglavnom, ili isključivo molekuli PrP<Sc>.

Prioni se razlikuju od bakterija, virusa i viroida. U poznate prione spadaju oni koji inficiraju životinje izazivajući bolestscrapie,prenosivu, degenerativnu bolest nervnog sistema ovaca i koza, kao i goveđe spongiformne encefalopatije (BSE) ili bolest ludih krava i mačje spongiformne encefalopatije kod mačaka. Poznate su četiri prionske bolesti koje napadaju ljude. To su (l)kuru, (2) Krojcfelad-Jakobova bolest (CJB), (3) Gerštman-Strasler-Šenkerova bolest (GSS), i (4) fatalna familijalna insomnija (FFI). U smislu ovog teksta izraz prion se koristi za sve vrste priona koji uzrokuju ma koju od ovih bolesti ili drugih kod životinja i pre svega kod ljudi i domaćih poljoprivrednih životinja.

Izraz "PrP gen" i "prionski proteinski gen" koriste se ovde alternativno da se opiše genetski materijal koji izražava prionske proteine i polimorfizam i mutacije kao što su one koje su ovde navedene pod podnaslovom "Patogene mutacije i polimorfizmi". PrP gen može da potekne iz svake životinje, uključujući i "domaću" i "test" životinju koje se ovde opisuju i svaki njihov polimorfizasm i mutaciju, gde se prepoznaje da ovi izrazi uključuju i druge PrP gene koje tek treba otkriti.

Izraz "PrP gen" odnosi se uglavnom na svaki gen svake vrste koja enkodira ma koju formu PrP aminokiselinskih sekvenci uključujući i svaki prionski protein. Neke uobičajene sekvence PrP opisane su kod Garniel i sar. 1992 što je ovde uključeno pozivanjem na otkrivanje i opis tih sekvenci. Ovde se koriste sledeće skraćenice:

CNS - centralni nervni sistem,

BSE - goveđa spongiformna encefalopatija,

CJB - Krojcfelad-Jakobova bolest,

GSS - Gerštman-Strasler-Šenkerova bolest,

FFI - fatalna familijalna insomnija,

PrP - prionski protein,

PrP<c>- normalni, nepatogeni konformer PrP

PrP<Sc>- patogeni ili "scrapie" izoform PrP (koji je i marker prionskih bolesti)

Pato<g>ene mutacije i polimorfizmi

Postoji čitav niz poznatih patogenih mutacija u humanom PrP genu. Dalje, postoje i poznati polimorfizmi u ljudskim, ovčijim i goveđim PrP genima.

Ovde dajemo nepotpunu listu takvih mutacija i polimorfizama:

Normalna sekvenca amino kiselina, koja nastaje u ogromnoj većini pojedinaca, naziva se divljim tipom PrP sekvence. Ova sekvenca divljeg tipa podložna je nekim karakterističnim polimorfnim varijacijama. U slučaju humanog PrP, dve polimorfne amino kiseline nastaju na ostatcima 129 (Met/Val) i 219 (GluLvs). Ovčiji PrP ima dva amino kiselinska polimorfizna na ostacima 171 i 136, dok goveđi PrP ima pet ili šest ponovaka osam amino kiselinskih motivskih sekvenci u amino terminalnomn regionu zrelog prionskog proteina. Iako nijedan od ovih polimorfizama sam po sebi nije patogen, izgleda da oni ipak utiču na prionske bolesti. Od ovih normalnih varijacija priona divljeg tipa proteina, identifikovane su neke mutacije humanog PrP gena koji menjaju bilo specifični aminokiselinski ostatak PrP ili broj oktaponovaka čime se razlikuju od nasleđenih prionskih bolesti kod ljudi.

Da bi se obezbedilo dodatno značenje gore navedenoj tabeli koja pokazuje mutacije i polimorfizme, možemo se pozvati na objavljene sekvence PrP gena. Na primer, Gabriel i sar. su 1999 otkrili i objavili PrP gen pileta, goveda, ovce, pacova i miša. Sekvenca za sirijskog zamorca objavljena je u radu Basleta i sar. 1986. Goldman i sar. 1990 su objavili PrP gen ovce, a isti Goldman i sar. su 1991 objavili sekvencu za goveda. Sekvencu za pileći PrP gen prvi put su objavili Harris i sar. 1991. Sekvecnu PrP gena za vizona prvi put su objavili Kretzschmar i sar. 1992. Humani PrP gen otkrili su Kretzschmar i sar. 1986. PrP gen za miša objavljen je u radu Locht i sar. 1986. PrP genska sekvenca za ovcu objavljena je u radu Westaway i sar. 1994. Sve ove publikacije su ovde uključene pozivanjem na njih kao literaturnih jedinica da otkriju i opišu PrP gen i sekvence PrP amino kiselina.

Ovaj pronalazak daje i postupak za otkrivanje prisustva patogene forme prionskog proteina u uzorku (po mogućstvu uzorak krvi ili mozga) obuhvatajući:

(i) kontakt sa uzorkom s jednom količinom nepatogenog prionskog proteina,

(ia) inkubacija uzorka /nepatogenog prionskog proteina,

(ii) razbijanje agregata svih agregata oformljenih u fazi (ia),

ponavljanje faza (ia) - (ii) dva ili više puta, i onda

(iii) određivanje prisustva i/ili količine patogenog prionskog proteina u uzorku.

Dalji oblik ovog pronalaska obezbeđuje postupak za dijagnostikovanje CJB kod pacijenata, za šta je potrebno da se uzme uzorak od pacijenta (po mogućstvu uzorak krvi ili mozga),

(i) kontakt sa s jednom količinom PrP<c>proteina,

(ia) inkubacija uzorka / PrP<c>proteina,

(ii) razbijanje agregata svih agregata oformljenih u fazi (ia),

ponavljanje faza (ia) - (ii) dva ili više puta, i onda

(iii) određivanje prisustva i/ili količine PrP<Sc>u uzorku.

Ovaj pronalazak takođe nudi postupak za otkrivanje prisustva patogene forme beta-amiloidnog proteina u uzorku (po mogućstvu uzorak krvi ili mozga), uključujući:

(i) kontakt uzorka sa s jednom količinom nepatogenog beta-amiloidnog proteina,

(ia) inkubacija uzorka / nepatogenog beta-amiloidnog proteina,

(ii) razbijanje agregata svih agregata oformljenih u fazi (ia),

ponavljanje faza (ia) - (ii) dva ili više puta, i onda

(iii) određivanje prisustva i/ili količine patogenog beta-amiloidnog proteina u uzorku.

Dodatni oblik ovog pronalaska daje postupak za dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti kod bolesnika, uključujući:

Uzimanje uzorka (po mogućstvu uzorak krvi ili mozga) od pacijenta,

(i) kontakt uzorka sa s jednom količinom nepatogenog beta-amiloidnog proteina,

(ia) inkubacija uzorka / nepatogenog beta-amiloidnog proteina,

(ii) razbijanje agregata svih agregata oformljenih u fazi (ia),

ponavljanje faza (ia) - (ii) dva ili više puta, i onda

(iii) određivanje prisustva i/ili količine patogenog beta-amiloidnog proteina u uzorku.

I dalje, ovaj pronalazak dalje daje aparat za korišćenje kod gore opisanih postupaka, pre svega aparata koji obuhvata ploču za mikrotitraciju, sonikator za više udubljenja i jednu količinu nepatogenog konformera.

Dodatni oblik ovog pronalaska uključuje postupak za dijagnostičko otkrivanje konformacionih bolesti, koje se odlikuju konformacionom tranzicijom jednog osnovnog proteina između nepatogenog konformera i patogenog konformera tako što se radi test navedene bolesti u uzorku, gde taj postupak uključuje (i) kontakt pomenutog uzorka sa poznatom količinom nepatogenog konformera, (ii) razbijanje agregata koji se eventualno oforme tokom faza (i) i (iii) gde se određuje prisustvo i/ili količina patogenog konformera u uzorku. Po mogućstvu, faze (i) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja između 5 i 40 puta pre sprovođenja faze (iii).

Ovaj pronalazak dalje opisuje test za marker konformacionih bolesti, koji se odlikuje konformacionom tranzicijom osnovnog proteina između nepatogenog konformera i patogenog konformera, u uzorku, gde taj test obuhvata sledeće faze: (i) kontakt pomenutog uzorka sa poznatom količinom nepatogenog konformera, (ii) razbijanje agregata koji se eventualno stvore tokom faze (i) i (iii) određivanje prisustva i/ili količine pomenutog patogenog konformera u uzorku. Po mogućstvu, faze (i) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre prelaska na fazu (iii).

Ovaj pronalazak dalje opisuje postupak za identifikaciju jedinjenja koje modulira konformacionu tranziciju osnovnog proteina između nepatogenog konformera i patogenog konformera, uključujući: (i) kontakt poznate količine nepatogenog konformera sa poznatom količinom patogenog konformera u prisustvu i u odsustvu pomenutog jedinjenja,

(ii) razbijanje agregata koji se eventualno naprave tokom faze (i),

(iii) određivanje količine patogenog konformera u prisustvu i u odsustvu pomenutog jedinjenja.

Ovaj pronalazak je opisan sa pozivom na specifične oblike, ali sadržaj ovog opisa uključuje sve modifikacije i supstitucije, koje može da unese stručnjak za ovu oblast a da pri tome ne izađe iz okvira smisla i namena zahteva.

Ovaj pronalazak će sada biti opisan uz pomoć primera, koji se ni na koji način ne smeju tumačiti kao ograničenje ovog pronalaska. Primeri će biti ilustrovani slikama koje su takođe date u prilogu.

OPISSLIKA

Slika 1. Shematski prikaz konverzije PrP<c>—► PrP<Sc>. Infektivna jedinica PrP<Sc>predstavlja oligomer bogat beta-nabranom pločom koja konvertuje PrP integrišući ga u rastući agregat, gde on dobija svojstva vezana sa PrP<Sc>.

Slika 2. Dijagramski prikaz procedure ciklične amplifikacije. Ovaj sistem se zasniva na ciklusima inkubacije PrP<Sc>u prisustvu viška PrP<c>praćenog ciklusima sonikacije. Tokom perioda inkubacije, oligomerni PrP<Sc>se povećava inkorporisanjem PrP<c>u rastući agregat, dok tokom sonikacije agregati bivaju razbijeni s ciljem da se multiplikuju konvertujuće jedinice. Na slici us prikazana dva ciklusa sonikacije/inkubacije.

Slika 3. Amplifikacija PrP<Sc>cikusom sonikacije. Mala količina homogenata mozga obolelog od scrapie sa sadržajem PrP<Sc>inkubira se s homogenatom mozga zdravog pacova (linija 1, kontrolni eksperiment) ili homogenatom mozga zdravog hrčka (liniej 2 i 3). Ovaj drugi uzorak podeljen je u dve grupe od kojih se jedna podvrgava pet ciklusa inkubacije/sonikacije (linija 3). Polovina gornjih uzoraka naneta je direktno na gel i prebojena na sadržaj ukupnih belančevian Coomasijem (ploča A). Druga polovina se tretira PK i koristi se imunobloting korišćenjem anti-PrP anitela 3F4 (ploča B). Ploča C pokazuje neke kontrole u kojima je homogenat zdravog mozga inkubiran sam (linije 1 i 2) ili u prisustvu razblaženog homogenata mozga obolelog od scrapie (linije 3 i 4). Polovina uzoraka (linije 2 i 4) podvrgava se pet ciklusa inkubacije/sonikacije . Linije 2, 3 i 4 tretirane su proteinazom K.

Slika 4. Osetljivost sistema ciklične amplifikacije. Minimalna koncentracija PrPSc koja može da se koristi za detekciju po amplifikaciji ispitivana je serijskim razblaživanjem homogenata mozga obolelog od scrapie i inkubiranjem sa homogenatom mozga zdravog hrčka sa ciklusima sonikacije ili bez njih. Na ploči A pokazan je kontrolni eksperiment u kome je homogenata mozga hrčka obolelog od scrapie serijski raublaživan sa homogenatom mozga pacova. Ploča B odgovara eksperimentu u kome su serijska razblaženja homogenata mozga hrčka obolelog od scrapie inkubirana sa homogenatom mozga zdravog hrčka i podvrgavana 5 ciklusa inkubacije/sonikacije. Na ploči C prikazana je denzitometrijska evaluacija imunoblotova A i B. Ova razblaženja su urađena uzimajući u obzir mozak kao početni materijal i bila su sledeća: 100 (linija 1), 200 (linija 2), 400 (linija 3), 800 (linija 4), 1600 (linija 5) i 3200 (linija 6).

Slika 5. Odnos između PrPres signala i broja ciklusa amplifikacije. Razblaženi homogenat mozga obolelog od scrapie inkubiran je sa viškom homogenata zdravog mozga hrčka. Uzorci su podvrgavani broju ciklusa od 0, 5, 10, 20 ili 40, a PrPres signal je procenjivan imunoblotom.

Slika 6. Amplifikacija PrP<Sc>u uzorcima krvi. Heparinizovana krv pacova je spajkovana homogenatom mozga obolelog od scrapie da se dobije finalno razblaženje od 10:1. Ova mešavina je inkubirana 15 minuta na RT. Desetostruka serijska razblaženja su napravljena od materijala koji koriste heparinizovanu krv pacova. Uzorci su podvrgavani 11 ciklusa inkubacije/sonikacije i PrPres signal jhe evaluiran imunoblotom.

Slika 7. Prion protein je prisutan u lipidnim raftovima. Lipidni raftovi (koji se nazivaju u frakcijom membrane rezistentnom na deterdžente ili DRB) izolovani su korišćenjem modifikacije prethodno opisanih protokola. Sto mg moždanog tkiva homogenizovano je u 1 ml PBS sa sadržajem 1% triton X-100 i lx komplet koktel inhibitora proteaze (Boehringer). Tkivo je homogenizovano sa 10 prolaza kroz 22G iglu za špric i inkubirano 30 minuta na 4°C u rotacionoj mešalici. Uzorak je razblažen 1:2 u saharozi 60% i stavljen na dno centrifugalne epruvete. 7 ml saharoze 35% pažljivo je stavljeno preko uzorka. 1,5 ml saharoze 15% stavljeno je u sloju na vrh ovog gradijenta. Epruveta je centrifugirana na 150.000 g 18 sati na 4°C. Lipidni raftovi isplivali su na 15% - 35% saharoznu dodirnu površinu (ploča A). Različite frakcije su prikupljene i analizirane prebojavanjem svih poteina srebro nitratom (ploča B) i imunoblotom da e otkrije PrP (ploča C). Da se iz uzorka ukloni saharoza, frakcije lipidnih raftova su izdvojene oprane u PBS i centrifugirane na 280.000 obrta/min 1 sat na 4°C. Ovaj pelet je opran i ponovo suspendovan u PBS sa sadržajem 0,5% triton X-100, 0,5% SDS i inhibitorima proteaze. Svi PrP<c>locirani su u ovoj frakciji.

Slika 8. Faktori koji su potrebni za amplifikaciju nalaze se u lipidnim raftovima. Lipidni raftovi su izolovani iz mozga zdravih hrčaka kako je opisano za Sliku 2 i pomešani sa 700-strukim razblaženjem PrP<Sc>visoko prečišćenog iz mozga hrčka obolelog od scrapie. Uzorci su ili zamrzavani (linija 3) ili amplifikovani 20 sati (linija 4). Linije 1 i 3 predstavljaju iste procedure ali korišćenjem totalnog homogenata mozga za amplifikaciju.

Slika9. Presimptomatsko otkrivanje PrP<Sc>u mozgu hrčka. Hrčci su inokulirani intracerebralno (i.c.) fiziološkim rastvorom (kontrolna grupa) ili lOO.strukim razblaženjem mozga obolelog od scrapie. Svake nedelje četiri hrčka po grupi su žrtvovana i mozgovi su im ekstrahovani i homogenizovani. Polovina ovih uzoraka je odmah zamrznuta (beli stubići), a preostalih pola je podvrgnuto 20 ciklusa inkubacije/sonikacije (crni stubići). Svi uzoraci su tretirani PK i imunoblotom. Intenzitet traka procenjivan je denzitometrijski. Svaki stubić predstavlja prošek uzoraka od 4 životinje. Nije zabeležena detekcije ni u jednom od kontrolnih mozgova, ni sa amplifikacijom, niti bez nje, pa ovi rezultati nisu prikazani na slici. Slika 10. Amplifikacija humanih PrP<Sc>. Ispitivanja su urađena korišćenjem uzoraka mozga 11 potvrđenih slučajeva sporadične CJB kao i porodične CJB i 4 uzrasno odgovarajućih kontrola, gde su spadali pacijenti oboleli od drugih neuroloških bolesti. Mozak je homogenizovan i podvrgnut 20 uzoraka amplifikacije. Na Slici su prikazani Reprezentativni rezultati jedne kontrole (A) i tri različita slučaja sporadične CJB (B) (1,2,3).

Slika 11. Detekcija PrP<Sc>u krvi po pripremi duhova krvnih ćelija . Ćelije "duhovi" iz 0,5 ml heparinizovane krvi dobijene od zdravih (C) i hrčaka oboilelih od scrapie (Sc) pripremljeni su kako je opisano u tekstu. Polovina uzoraka nije podvrgnuta amplifikaciji a druga polovina je mešana s homogenatima normalnih mozgova hrčaka i podvrgavana 20 ciklusa amplifikacije. Svi uzorci su onda tretirani sa PK i analizovani imunoblotom. Na Slici je prikazan jedan reprezentativni eksperiment.

Slika 12. Detekcija PrP<Sc>u krvi po ekstrakciji sarkosila. 0,5 ml heparinizovane krvi dobijene od zdravih (C) i hrčaka obolelih od scrapie (Sc) podvrgnuta je ekstrakciji sarkosila kako je opisano u tekstu. Polovina uzoraka nije podvrgnuta amplifikaciji a druga polovina je mešana s homogentom mozga normalnog hrčka i podvrgnuta 20 ciklusa amplifikacije. Svi uzorci su onda tretirani sa PK i analizovani imunoblotom. Na Slici je prikazan jedan reprezentativni uzorak kontrolnih životinja i dva životinja obolelih od scrapie.

Slika 13. Detekcija PrPSc u krvi po purifikaciji lipidnih raftova. Lipidni raftovi su ekstrahovani kako je prikazano u tekstu iz 0,5 ml heparinizovane krvi koja dobijene od zdravih (C) i hrčaka obolelih od scrapie (Sc). Polovina uzoraka nije bila podvrgnuta amplifikaciji, a druga polovina je mešana s homogentom mozga normalnog hrčka i podvrgnuta 20 ciklusa amplifikacije. Svi uzorci su onda tretirani sa PK i analizovani imunoblotom. Na Slici je prikazan jedan reprezentativni uzorak kontrolnih životinja i dva životinja obolelih od scrapie.

Slika 14. Detekcija PrPSc u krvi po pripremi frakcije mononukleara.Frakcije mononukleara frakcija krvi odvojena je centrifugiranjem iz 0,5 ml heparinizovane krvi koja dobijene od zdravih (C) i hrčaka obolelih od scrapie (Sc). Polovina uzoraka nije bila podvrgnuta amplifikaciji, a druga polovina je mešana s homogentom mozga normalnog hrčka i podvrgnuta 20 ciklusa amplifikacije. Svi uzorci su onda tretirani sa PK i analizovani imunoblotom. Na Slici je prikazan jedan reprezentativni uzorak kontrolnih životinja i dva životinja obolelih od scrapie.

PRIMERI

Primer 1.

Amplifikaciia PK rezistentnih PrP cikličnom konverzijom in vitro

Homogenat mozga ekstrahovanog iz hrčka obolelog od scrapie razblaživan je dok signal PrP<Sc>nije postao jedva merljiv imunoblotom po tretmanu proteinazom K (PK) (Slika 3B, linija 1). Tretman PK radi se rutinski na terenu da se napravi razlika između normalnih i abnormalnih formi PrP, koje se razlikuju po osetljivosti na razgradnju<p>roteaza (PrP<Sc>je delimično rezistentan, a PrP se razgrađuje) (Prusiner, 1991). Oblik PrP koji je rezistentan na PK tretman od sada ćemo nazivati PrPres. Inkubacija uzorka razblaženog homogenata mozga obolelog od scrapie sa homogenatom mozga zdravog hrčka sa sadržajem viška PrP<c>dovodi do povećanja signala PrPres (Slika 3B, linija 2).

Ovo govori da inkubacija dva homogenata mozga dovodi do konverzije PrPc u PrPSc. Kada su uzorci inkubirani pod istim uslovima, ali podvrgnuti pet ciklusa inkubacije/sonikacije, količina PrPres dramatično je povećana (Slika 3B, linija 3). Denzitometrijska analiza imunoblota govori da je signal PrPres povećan 84-ostruko cikličnom amplifikacijom u poređenju sa signalom PrPres prisutnom u razblaženom homogenatu mozga obolelog od scrapie (linija 1).

Ova konverzija zavisi od prisustva PrP<Sc>jer nikakav PrPre nije primećen kada je homogenat mozga normalnog hrčka inkubiran sam pod istim uslovima bilo sa sonikacijom ili bez nje (Slika 3C, linja 2). Da bi se isključili artefakti transfera, ukupne belančevine nanete na gel održavane su na konstanti (Slika 3A) dodavanjem homogenat mozga pacova u razblaženi uzorak oboleo od scrapie, koristeći činjenicu da se pacovski PrP ne otkriva antitelom koje se koristi za imunoblot.

PRIMER 2

Osetliivost otkrivanja cikličnom amplifikaciiom

Da bi se procenila minimalna koncentracija PrP<Sc>koja može da se koristi za detekciju po amplifikaciji, homogenat mozga obolelog od scrapie serijski je razblaživan direktno u homogenatu mozga normalnog hrčka. Bez inkubacije, signal PrPres smanjuje se progresivno sve dok ne postane potpuno nemerljiv pri 800-strukom razblaženju (Slika 4A, C). Za razliku od slučaja kada se isto razblaženje inkubira s homogenatom mozga normalnog hrčka i podvrgava 5 ciklusa inkubacije/sonikacije, granica detekcije PrPres smanjena je dramatično. I stvarno, jasan signal se dobijao čak i na 3200-strukom razblaženju (Slika 4B, C).

PRIMER 3

Eksponencijalni rast PrPres s brojem ciklusa

Da bi se proučilo da li intenzitet PrPres signala po cikličnoj amplifikaciji zavisi od broja obavljenih ciklusa inkubacije/sonikacije, razblaženi homogenat mozga obolelog od scrapie inkubiran je s viškom homogenata mozga normalnog hrčka. Ovi uzorci su podvrgnuti broju ciklusa od 0, 5, 10, 20 ili 40, a PrPres signal je procenjivan imunoblotom. Nivoi PrPres rasli su eksponencijalno s brojem ciklusa inkubacije/sonikacije (Slika 5). Ovaj rezultat govori da povećani broj ciklusa može da dodatno još smanji nivo detekcije.

PRIMER 4

Eksperiment sonikacije u uzorcima krvi pražnjenje sa PrP<Sc>

Heparinizovana krv pacova spajkovana homogenatom mozga hrčka obolelog od scrapie da se dobije finalno razblaženje od 10:1. Ova mešavina je inkubirana 15 minuta na

RT.

Desetostruka serijska razblaženja su napravljena od ovog materijala korišćenjem heparinizovane krvi pacova. 50 ul svakog razblaženja centrifugirano je na 3000 obrta/min 10 minuta. Plazma je separirana od pelete. 10 ul plazme pomešano je u 50 ul homogenatu mozga zdravog hrčka sa supstratom PrP<c>za reakciju konverzije. Uzorci su podvrgnuti 1 ciklusa inkubacije/sonikacije. Kao kontrola, isti uzorci su mešani sa 50 ul homogenata mozga zdravog hrčka i čuvano na -20°C do testiranja. 10 ul kontrolnih uzoraka po sonikaciji digestirano je proteinazom K, separirano SDS-PAGE i analzizirano Westen-blot postupkom, pa je otkriven PrP<Sc>kako je to opisano u odeljku pod naslovom "Postupci".

Ovi rezultati su zabeleženi na Slici 6. Ovi rezultati pokazuju jasan porast detekcije proteina po postupku amplifikacije, što je posebno evidentno pri nižim koncentracijama PrP<Sc>

(na primer razblaženje 1280). Ako poredimo ovakve rezultate sa onima koji su dobijeni na inficiranom moždanom tkivu, imamo potvrdu da proces amplifikacije deluje slično i u krvi.

PRIMER 5

Visoki učinak ciklične amplifikacije

Korišćenje tradicionalnog sonikatora sa jednom sondom nameće problem za rukovanje većim brojem uzoraka odjednom, kako to traže dijangostički testovi. Mi smo adaptirali sistem ciklične amplifikacije na sonikaror za ploču za mikrotitraciju sa 96 udubljenja (Misonix 431 MP- 20 kHz), koja obezbeđuje sonikaciju za sva ova udubljenja istovremeno i može da se programira za automatski rad. Ovo poboljšanje ne samo da smanjuje vreme obrade, već smanjuje i gubitak materijala kada se poredi sa korišćenjem samo jedne sonde. Unakrsna kontaminacija se eliminiše jer nema direktne intruzije sonde u uzorak. Ovo je posebno važno za rukovanje infektivnim uzorcima i za minimalizaciju lažno pozitivnih rezultata. Dvadeset ciklusa jednočasovne inkubacije praćenih soničnim pulsevima od 15 sec ili 30 sec dali su značajnu amplifikaciju signala PrPres, slično onome što je prethodno primećeno korišćenjem tradicionalnog sonikatora.

PRIMER 6.

Faktori koji su neophodni za amplifikaciju su u frakciji membrane rezistentnoj na deterdžente

Subćelijska lokacija tamo gde se odvija PrP konerzija tokom patogeneze bolesti još nije utvrđena. Međutim utvrđeno je da su i PrP<c>i PrP<Sc>locirani u specijalnom regionu membrane plazme koji je rezistentan na tretman blagim deterdžentom zbog relativno visokog sadržaja holesterola i glikosfingolipida (Vey i sar. 1996; Harmey i sar. 1995). Ovi membranski domeni nazivaju se lipidnim raftovima ili membranama rezistentnim na deterdžente (DRM) i bogati su signalnim protinima, receptorima i proteinima ukotvljenim u GPL Mi smo potvrdili da je 100% PrPC u mozgu vezano za ovu frakciju, koja sadrži <2% ukupnih proteina (Slika 7). Tako, prosti korak izolacije lipidnog rafta omogućuje dramatično obogaćivanje sadržajem PrP . Slični rezultati dobijeni su i kada su izolovani lipidni raftovi iz homogenata mozga obolelog od scrapie, kod kojih je PrP<Sc>nađen u raftovima.

Da bi se procenilo da li se faktori koji su potrebni da se amplifikuje PrP nalaze u lipidnim raftovima, mi smo ih prečistili iz mozga zdravih životinja i dodali malene količine visoko prečišćenog PrPSc ekstrahovanog iz mozga obolelih životinja. Amplifikacije lipidnih raftova bila je ekvivalentna onoj koja je dobijena s ekstraktom celog mozga (Slika 8), jer je količina PrPres proizvedena po amplifikaciji bila slična u oba stanja. Ovi rezultati govore da se svi elementi koji su potrebni za konverziju PrP i amplifikaciju (uključujući i tzv. "Faktor X"; Telling i sar. 1995) nalaze u ovom specijalizovanom membranskom domenu. Prema tome, identifikacija i izolacija faktora koji su potrebni za PrP konverziju treba da budu mogući dodatnom separacijom proteina iz lipidnih raftova i praćenjem njihove aktivnosti cikličnom amplifikacijom. Uz to, lipidni raftovi predstavljaju moguću zamenu za korišćenje homogenata celog mozga u postupku ciklične amplifikacije kao izvora supstrata PrPC i drugih endogenih faktora za koje se smatra da učestvuju u konverziji.

PRIMER 7

Predsimptomatska dijagnoza kod eksperimentalnih životinja

Da bi se proučavala predsimptomatska dijagnoza kod hrčaka eksperimentalno inficiranih scrapie, proučili smo 88 uzoraka mozga u različitim stadijumima tokom predkliničke faze, od kojih je polovina pripadalo neinficiranim kontrolama. Mozak je uziman svake nedelje (4 po grupi) i podvrgavan 20 ciklusa amplifikacije. Rezultati su pokazali da je ovaj postupak u stanju sa otkrije abnormalni protein u mozgu samo dve nedelje po inokulaciji, daleko pre nego što životinje razviju ma kakve simptome (Slika 9). Bez ciklične amplifikacije, PrP<Sc>je detektovan u mozgu šeste nedelje po infekciji, samo 4 nedelje pre pojave kliničke bolesti. Amplifikacija nije primećena ni kod jedne od kontrolnih životinja koje nisu inficirane bolešću scrapie.

PRIMER 8

Primena ciklične amplifikacije na uzorke mozga čoveka

U cilju analize primene ciklične amplifikacije na humane uzorke mozga ljudi (kadavera) obolelih o Krojcfeld-Jakobove bolesti (CJB), inkubirali smo homogenate mozga nekoliko pacijenata obolelih od CJB (ili normalnih kontrola) homogenatom mozga zdravog čoveka i obavljali postupak ciklične amplifikacije. Rezultati pokazuju da je došlo do signifikantne amplifikacije u uzorcima analiziranih mozgova sporadičnih CJB i ni u jednom od četiri kontrolna uzorka (Slika 10). Zanimljivo je da je amplifiakcija dobijena samo u uzorcima koji su se pokazali infektivnim i na taj način sposobi za konverziju ne-mutiranog PrPC, dok nije bilo uspeha kada mutantni protein nije u stanju sa konvertuje protein divljeg tipa. Ovi podaci podržavaju zaključak da ovaj postupak deluje na ljudskim uzorcima slično kao što je o pokazano i za životinjske uzorke.

PRIMER 9

Dijagnoza u krvi cikličnom amplifikacijom

Ispitivanja infektivnosti govore da barem u eksperimentalnim životinjama PrP<Sc>postoji u krvi životinja u poznoj fazi (Brown i sar. 2001). Da bi se obavila detekcija PrP<Sc>u krvi postupkom ciklične amplifikacije, mi smo prvo selektivno koncentrisali uzorak u proteinu koji će se detektovati i da bismo eliminisali veliki broj krvnih proteina kao što su albumin ili hemoglobin. Za ove namene efikasnim su se pokazala četiri postupka:

1. Priprema "duhova" krvnih ćelija

Heparinizovana krv hrčka centrifugirana je na 2500 obrtaja/min na 4°C. Frakcije plazme i ćelija su separirane i zamrznute na -80°C do testiranja. 0,5 ml paketa crnih ćelija oprano je 3 puta u 12 - 15 vol svežeg hladnog PBS, pH 7,6. Ove ćelije su ponovo suspendovane u 12 - 15 vol 20 mOsM natrijum fosfatnog pufera pH 7,6 i blago mešane 20 minuta na ledu, zatim centrifugirane na 30,000 obrtaja/min 10 minuta na 4oC. Supertnatant je odbačen, a pelet je opran 3 puta u 20 mOsM natrijum fosfatnomg puferu. Finalni pelet je ponovo suspendiovan u PSB sa sadržajem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitora proteaze. 15 ul ove suspenzije pomešano je v/v sa 10% homogenatom mozga zdravog hrčka i podvrgnuto 20 ciklusa inkubacije/sonikacije. 20 ul kontrolnih uzoraka podvrgnutih sonikaciji digestirano je proteinazom K, separirano SDS-PAGE i analizirano wester blot postupkom, pa je PrP<Sc>određivan po postupku amplifikacije u uzorcima krvi inficiranih životinja (Slika 11). U uzorcima krvi neinficiranih životinja nema signala amplifikacije. Bez amplifikacije nije moguće detektovati prisustvo PrP<Sc>(Slika 11).

2. Ekstrakcija sarkosilom

Heparinizovana krv hrčka centrifugirana je na 2500 obrtaja/min na 4°C. 0,5 ml paketa krvnih ćelija razblaženo je (v/v) u 20% sarkosila i inkubirano 30 minuta. Uzorak je centrifugiran u Berckman TL100 ultracentrifugi (85000 obrtaja/min) 2 sata na 4°C. Ovaj pelet je opran i ponovo suspendovan u PBS sa sadržajem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitora proteaze. 15 ul ove suspenzije pomešano je v/v sa 10% homogenatom mozga zdravog hrčka i podvrgnuto 20 ciklusa inkubacije/sonikacije. 20 ul kontrolnih uzoraka podvrgnutih sonikaciji digestirano je proteinazom K, separirano SDS-PAGE i analizirano vvester blot postupkom, pa je PrP<Sc>određivan po postupku opisanom u odeljku "Postupci". Rezultati pokazuju otkrivanje PrP<Sc>po postupku amplifikacije u uzorcima krvi inficiranih životinja (Slika 12). U uzorcima krvi neinficiranih životinja nema signala amplifikacije. Bez amplifikacije nije moguće detektovati prisustvo PrP<Sc>(Slika 12).

3. Ekstrakcija lipidnih raftova

Heparinizovana krv hrčka centrifugirana je na 2500 obrtaja/min na 4°C. 0,5 ml paketa krvnih ćelija razblaženo je (v/v) u PBS sa 1% TritonX-100 i inkubirano 30 minuta. Ovaj uzorak je razblažen u odnosu 1:2 u saharozi 60% i stavljen na dno epruvete za centrifugiranje. 7 ml saharoze 35% pažljivo je postavljeno preko ovog uzorka. 1,5 ml saharoze 15% postavljeno je na vrh ovog gradijenta. Uzorak je centrifugiran na 150.000 obrtaja/min 18 sati na 4°C. Lipidni raftovi su dobijeni i oprani u PBS i centrifugirani na 28.000 obrtaja/min 1 sat na 4°C. Ovaj pelet je opran i ponovo suspendovan u PBS sa sadržajem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitora proteaze. 15 ul ove suspenzije pomešano je v/v sa 10% homogenatom mozga zdravog hrčka i podvrgnuto 20 ciklusa inkubacije/sonikacije. 20 ul kontrolnih uzoraka podvrgnutih sonikaciji digestirano je proteinazom K, separirano SDS-PAGE i analizirano vvester blot postupkom, pa je PrP<Sc>određivan po postupku opisanom u odeljku "Postupci". Rezultati pokazuju otkrivanje PrP<Sc>po postupku amplifiakcije u uzorcima krvi inficiranih životinja (Slika 13). U uzorcima krvi neinficiranih životinja nema signala amplifikacije. Bez amplifikacije nije moguće detektovati prisustvo PrP<Sc>(Slika 13).

4. Priprema frakcija mononukleara

Heparinizovana krv hrčka centrifugirana je 10 minuta na 1500 obrtaja/min na 4°C. Frakcije mononukleara su pažljivo dobijene korišćenjem standardne procedure i čuvan na -80°C do upotrebe. Zamrznute frakcije mononukleara je ponovo suspendovan u PBS sa sadržajem 0,5%) Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitora proteaze. 15 ul ove suspenzije pomešano je v/v sa 10%> homogenatom mozga zdravog hrčka i podvrgnuto 20 ciklusa inkubacije/sonikacije. 20 ul kontrolnih uzoraka podvrgnutih sonikaciji digestirano je proteinazom K, separirano SDS-PAGE i analizirano vvestern blot postupkom, pa je PrP<Sc>određivan po postupku opisanom u odeljku "Postupci". Rezultati pokazuju otkrivanje PrP<Sc>po postupku amplifiakcije u uzorcima krvi inficiranih životinja (Slika 14). U uzorcima krvi neinficiranih životinja nema signala amplifikacije. Bez amplifikacije nije moguće detektovati prisustvo PrP<Sc>(Slika 14).

POSTUPCI

Priprema homogenata mozga

Mozgovi sirijskih zlatnih hrčaka zdravih ili inficiranih adaptiranim sojem scrapie 263K dobijeni su po dekapitaciji i odmah zamrznuti na suvom ledu i čuvani na -8O0C do upotrebe. Mozgovi su homogenizovani u PBS i inhibitorima proteaze (Tež./vol) 10%. Deterdženti (0,5% Triton x-100, 0,05% SDS) dodavani su i prečišćeni centrifugiranjem na maloj brzini (10.000 obrtaja/min) 1 minut.

Priprema uzoraka i ciklična amplifikacija

Serijska razblaženja homogenata mozga zaraženog scrapie urađena su direktno a homogenatu mozga. 30 ul ovih razblaženja inkubirani su na 37oC mešanjem. Svaki sat ciklusa sonikacije (5 pulseva po 1 sekund) urađen je korišćenjem mikrosonikatora sa iglom uronjenom u uzorak. Ovi ciklusi su ponavljani nekoliko puta (5 - 20).

Otkrivanje PrP<Sc>

Uzorci su digenstiani proteinazom K 100 ug/mL 90 minuta na 37°C. Reakcija je zaustavljana sa PMSF 50 mM. Uzorci su separirani sa SDS-PAGE (u uslovima denaturacije) i elektroblotirani u nitroceluloznu membranu u CAPS ili tris-glicin transfer pufer sa 10% metanola tokom 40 minuta na 400 mA: Reverzibilno prebojavanje ukupnih proteina obavljeno je pre blokiranja membrane sa 5% obranog mleka. Posle toga, membrana je inkubirana 2 sata monoklonkim antitelom 3F4 (1: 50.000). Četiri pranja sa po 5 ml svako obavljena su sa PBS, 0,3% Tween 20 pre inkubacije ren peroksidazom obeleženim anti-mišjim antitelom (1:5000) 1 sat. Posle pranja, reaktivnost membrane je razvijena sa ECL hemiluminescencijskim kompletom (Amersham) u skladu sa uputstvima proizvođača.

Claims (14)

1. Postupak za dijagnozu ili detekciju konformacijske bolesti koja se odlikuje konformacijskim prelaskom osnovnog proteina između nepatogenog i patogenog konformera da konformacijski prelaz može da se propagira iz patogenog konformera do nepatogenog konformera testiranjem markera pomenute bolesti u uzorku, gde taj postupak obuhvata: (i) kontakt navedenog uzorka sa određenom količinom nepatogenog konformera (ii) razlaganje svih eventualnih agregata koji su se mogli stvoriti tokom koraka (i); i (iii) određivanje prisustva i/ili količine navedenog patogenog konformera u uzorku, gde je taj patogeni konformer marker prisustva pomenute bolesti, naznačentime, dakorak (i) obuhvata korak (ia) inkubacije navedenog uzorka/nepatogenog konformera, a koraci (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se obavi korak (iii).

2. Postupak iz zahteva 1, n az n ač ent i m e , da se taj ciklus ponavlja 5 do 40 puta pre nego što se obavi korak (iii).

3. Postupak prema prethodnim zahtevima, naznačen time, da se korak (i) obavlja u fiziološkim uslovima.

4. Postupak prema prethodnim zahtevima,naznačen time, dakoličina nepatogenog konformera u koraku (i) bude prekomerna količina.

5. Postupak prema prethodnim zahtevima,naznačentime, da konformacijska bolest bude prenosiva konformacijska bolest.

6. Postupak prema prethodnim zahtevima, naznačen time, da uzorak koji će se analizirati bude podvrgnut pred-tretmanu za selektivno koncentrisanje patogenog konformera u uzorku.

7. Postupak iz zahteva6, naznačentime, da patogeni konformer bude PrP<Sc>, a pred-tretman ekstrakcija iz uzorka frakcije koja se ne rastvara u blagom deterdžentu.

8. Test za marker konformacijske bolesti,naznačentime, što se odlikuje konformacijskim prelaskom osnovnog proteina između nepatogenog i patogenog konformera, pri čemu se u uzorku može propagirati konformacijski prelaz iz patogenog konformera u nepatogeni konformer, a sastoji se iz sledećih koraka: (i) kontakt navedenog uzorka sa količinom nepatogenog konformera (ii) razlaganje svih eventualnih agregata koji su se mogli stvoriti tokom faze (i); i (iii) određivanje prisustva i/ili količine navedenog patogenog konformera u uzorku, gde je taj patogeni konformer marker prisustva pomenute bolesti, tako da korak (i) obuhvata korak (ia) inkubacije navedenog uzorka/nepatogenog konformera, a koraci (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se obavi korak (iii).

9. Dijagnostički set za upotrebu u testu prema zahtevu 8, naznačen time, što obuhvata poznatu količinu nepatogenog konformera, ploču za mikrotitraciju sa više udubljenja i sonikator za više udubljenja.

10. Postupak za identifikaciju jedinjenja koje modulira konformacijski prelaz osnovnog proteina između nepatogenog i patogenog konformera,naznačen time, štoobuhvata: (i) kontakt jedne količine nepatogenog konformera sa jednom količinom patogenog konformera (1) u prisustvu navedenog jedinjenja i (2) u odsustvu navedenog jedinjenja, (ii) razlaganje svih eventualnih agregata koji su se mogli stvoriti tokom faze (i): i (iii) određivanje količine patogenog konformera (1) u prisustvu navedenog jedinjenja i (2) u odsustvu navedenog jedinjenja; pri čemu korak (i) obuhvata korak (ia) inkubacije navedenog patogenog /nepatogenog konformera, a koraci (ia) i (ii) čine ciklus koji se ponavlja najmanje dva puta pre nego što se obavi korak (iii).

11.Postupak prema prethodnim zahtevima od 1 do 7 ili 10 ili test prema zahtevu8, naznačent i m e , da taj patogeni konformer bude PrP<Sc>, nepatogeni konformer bude PrP<c>, a osnovni protein je prionski protein.

12.Postupak za detekciju prisustva patogenog oblika prionskog proteina u uzorku,naznačentime, koji obuhvata (i) kontaktiranje uzorka sa određenom količinom nepatogenog prionskog proteina (ia) inkubacija uzorka/nepatogenog prionskog proteina (ii) razlaganje svakog agregata koji se formira tokom koraka (ia), ponavljanje koraka (ia)- (ii) dva ili više puta, i potom (iii) određivanje prisustva i/ili količine patogenog prionskog proteina u uzorku.

13.Postupak za detekciju prisustva patogenog oblika (3-amiloidnog proteina u uzorku, naznačen time, koja obuhvata: (i) kontakt uzorka sa jednom količinom nepatogenog (3-amiloidnog proteina, (ia) inkubacija uzorka/nepatogenog (3-amiloidnog proteina (ii) razlaganje svakog agregata koji se formira tokom koraka (ia), ponavljanje koraka (ia)- (ii) dva ili više puta, i potom (iii) određivanje prisustva i/ili količine patogenog 3-amiloidnog proteina u uzorku.

14.Uređaj za upotrebu u postupku prema zahtevima 1 do 7 ili 10 ili u testu prema zahtevu 8,naznačen time, što sesastoji od mikrotitarske ploče, sonikatora za više udubljenja i određene količine nepatogenog konformera.