RS55610B1 - Derivat morfolino nukleinske kiseline - Google Patents

Derivat morfolino nukleinske kiseline

Info

Publication number
RS55610B1
RS55610B1 RS20170057A RSP20170057A RS55610B1 RS 55610 B1 RS55610 B1 RS 55610B1 RS 20170057 A RS20170057 A RS 20170057A RS P20170057 A RSP20170057 A RS P20170057A RS 55610 B1 RS55610 B1 RS 55610B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
mol
nucleic acid
range
reaction
Prior art date
Application number
RS20170057A
Other languages
English (en)
Inventor
Toshihiro Ueda
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Shinyaku Co Ltd filed Critical Nippon Shinyaku Co Ltd
Publication of RS55610B1 publication Critical patent/RS55610B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Description

[Tehnička oblast]
[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na temu u skladu sa zahtevima.
[Stanje tehnike]
[0002]Monomer morfolino nukleinske kiseline, čija je bazna funkcionalna grupa guanin (u daljem tekstu "G monomer"), sadrži atom kiseonika vezan za atom ugljenika u poziciji 6 guanina. Prema tome, kada se oligomer morfolino nukleinske kiseline sintetiše korišćenjem G monomera, čija hidroksi grupa u poziciji 6- guanina nije zaštićena, odigrava se sporedna reakcija. Na primer, u procesu kondenzacije, hidroksi grupa u poziciji 6- guanina može da reaguje sa aktiviranom pozicijom drugog monomera morfolino nukleinske kiseline, da bi se dobio fosforilovani oblik, koji zatim može da reaguje sa amonijakom, korišćenim u procesu deprotekcije, što rezultuje konverzijom guanina u diaminopurin. Takva sporedna reakcija predstavlja značajan uzrok smanjenja prinosa očekivane supstance.
[0003]U cilju suzbijanja prethodno pomenute sporedne reakcije, AVI BioPharma Inc. je predstavila G monomer, čija je hidroksi grupa, koja se nalazi u poziciji 6- guanina zaštićena pivaloiloksibenzil grupom (POB grupa) (na primer, vidi Patentni dokument 1). Uprkos tome, POB grupa se u toku procesa deprotekcije konvertuje u 4-metilencikloheksa-2,5-dienon, koji se adira na NH grupu oligomera morfolino nukleinske kiseline, pri čemu nastaje sporedni proizvod.
[0004]Patentni Dokument 1, dodatno uključuje opis drugih zaštitnih grupa za hidroksi grupu, koja se nalazi u poziciji 6- guanina. Takve druge grupe, navedene u Patentnom dokumentu 1, uključuju, na primer, 4-nitrofenetil, fenilsulfoniletil i metilsulfoniletil. Ove zaštitne grupe, međutim, prolaze kroz konverziju u toku procesa deprotekcije, do reaktivnih vrsta kao što je 4-nitrostiren, koji se adira na NH grupu morfolina u oligomeru morfolino nukleinske kiseline, pri čemu nastaje sporedni proizvod. Dok je zaštitna grupa tipa silil takođe poznata, zabeleženo je da se ista podvrgava sporednoj reakciji sličnoj onoj kod G monomera, čija hidroksi grupa u 6. poziciji nije zaštićena, jer je nestabilna i sklona je tome da se lako odvaja u uslovima sinteze oligomera morfolino nukleinske kiseline. Pored toga, takođe su poznate zaštitne grupe tipa fenil etarske i karbamatne, ali je u slučaju ovih grupa zabeleženo da uklanjanje zaštitne grupe nije izvedeno do kraja u toku procesa deprotekcije ili da se efikasnost kondenzacije pogoršava u procesu kondenzacije.
[Dokumenti stanja tehnike]
[Patentni dokumenti]
[0005][Patentni dokument 1] WO2009/064471 Al
[Kratak pregled pronalaska]
[Problem koji pronalazak treba da reši]
[0006]Glavni cilj pronalska je da obezbedi novi derivat morfolino nukleinske kiseline, za efikasnu sintezu oligomera morfolino nukleinske kiseline i polazni materijal za ovaj derivat.
[Načini rešavanja Problema]
[0007]Podnosioci prijave su otkrili da je jedinjenje predstavljeno narednom opštom formulom (1)
(u daljem tekstu "jedinjenje pronalaska") ili so istog, je korisno kao polazni materijal za sintezu oligomera morfolino nukleinske kiseline ili kao polazni materijal za dobijanje polaznog materijala za sintezu, tako čineći osnovu ovog pronalaska.
gde R<1>predstavlja vodonik ili grupu predstavljenu narednom opštom formulom (2).
gde<*>predstavlja mesto vezivanja.
R<11>, R<12>, R<13>su isti ili različiti i svaki predstavlja vodonik, alkil ili alkoksi.
R<2>predstavlja grupu predstavljenu narednom opštom formulom (3) ili (4).
gde je<*>definisana kao što je gore opisano.
R<4>predstavlja alkil, arilmetil ili ariloksimetil.
R<5>, R<6>su isti ili različiti i svaki predstavlja alkil.
R<3>predstavlja hidroksi grupu, koja može biti zaštićena sa trialkilsilil ili difenilalkilsilil, ili grupu predstavljenu narednom formulom (5).
u kojoj je<*>definisana kao što je gore opisano.
X predstavlja O ili S.
Y predstavlja dialkilamino ili alkoksi.
Z predstavlja halogeni element.
[0008]Jedinjenje pronalaska ili so istog, su oni koji mogu biti prikazani kao da su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
[0009]U daljem tekstu, detaljno su opisani pojmovi korišćeni u predmetnoj specifikaciji.
[0010]Alkil može uključivati lineranu ili razgranatu alkil grupu, sa 1 do 8 atoma ugljenika. Posebni primeri mogu uključivati metil, etil,/7-propil, izopropil,/7-butil, izobutil, sec-butil,terc-butil,/7-pentil, izopentil,/7-heksil, izoheksil, n-heptil, izoheptil i n-oktil. Među ostalima, poželjna je alkil grupa sa 1 do 6 atoma ugljenika, a još je poželjnija alkil grupa koja sadrži 1 do 3 atoma ugljenika.
[0011]"Alkil" grupa iz "trialkilsilil", "difenilalkilsilil", i dialkilamino" može se predstaviti istim "alkil", kao što je gore navedeno.
[0012]"Aril" grupa iz "arilmetil", "ariloksimetil", i "arilsulfonil" može uključivati aril koja ima 6 do 10 atoma ugljenika. Posebni primeri mogu uključivati fenil, 1-naftil i 2-naftil. Među ostalima, poželjna je fenil.
[0013]Alkoksi može uključivati linearnu ili razgranatu alkoksi grupu sa 1 do 8 atoma ugljenika, kao što su metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi,/7-butoksi, izobutoksi, sec-butoksi,terc-butoksi, n-pentiloksi,/7-heksiloksi, n-heptiloksi, i n-oktiloksi.
[0014]Halogeni element može uključivati fluor, hlor, brom i jod. Među ostalima, poželjan je hlor.
[0015]Acil može uključivati linearnu ili razgranatu alkanoil ili aroil grupu. Primeri alkanoil mogu uključivati formil, acetil, 2-metilacetil, 2,2-dimetilacetil, propionil, butiril, izobutiril, pentanoil, 2,2-dimetilpropionil, i heksanoil. Primeri aroil mogu uključivati benzoil, toluoil i naftoil. Aroil može opciono biti supstituisana u pozicijama na kojima se može izvršiti supstitucija i može biti supstituisana sa alkil(ima).
[0016]Nukleobaza može uključivati adenin, guanin, hipoksantin, citozin, timin, uracil, i modifikovane baze istih. Primeri takvih modifikovanih nukleobaza mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, pseudouracil, 3-metiluracil, dihidrouracil, 5-alkilcitozin( npr.,5-metilcitozin), 5-alkiluracil( npr.,5-etiluracil), 5-halouracil (5-bromouracil), 6-azapirimidin, 6-alkilpirimidin (6-metiluracil), 2-tiouracil, 4-tiouracil, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil)uracil, 5'-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetil aminometiluracil, 1-metiladenin, 1-metilhipoksantin, 2,2-dimetilguanin, 3-metilcitozin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, N<6->metiladenin, 7-metilguanin, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metilkarbonilmetiluracil, 5-metiloksiuracil, 5-metil-2-tiouracil, 2-metiltio-N<6->izopenteniladenin, uracil-5-oksi-sirćetnu kiselinu, 2-tiocitozin, purin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, izoguanin, indol, imidazol, i ksantin.
[0017]Među jedinjenjima pronalaska, poželjna su naredna jedinjenja od (a) do (c) ili njihove soli. (a) N94(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoksi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N2^fenoksiacetil)-06-(2-cijanoetil) guanin, (b) N9- {(2R,6S)-hidroksimetil-4-tritilmorfolin-2-il}-N2-(fenoksiacetil)-06-(2-cijanoetil) guanin, (c) [(2S,6R)-6-{N<2>Kfenoksiacetil)-0<6>K2-cijanoetil)guanin-9-il}-4-tritilmorfolin-2-il]metil dimetilfosforamido hloridat.
[Kratak opis slika]
[0018]Slika 1 predstavlja HPLC hromatogram sirovog oligomera morfolino nukleinske kiseline sintetisanog korišćenjem CE-G monomera (za definiciju, vidi Tabelu 1). Ordinata predstavlja jačinu signala (mAU), dok apscisa predstavlja vreme zadržavanja (u minutima). Slika 2 predstavlja HPLC hromatogram sirovog oligomera morfolino nukleinske kiseline sintetisanog korišćenjem POB-G monomera (za definiciju, vidi Tabelu 1). Ordinata predstavlja jačinu signala (mAU), dok apscisa predstavlja vreme zadržavanja (u minutima). Slika 3 predstavlja maseni spektar sirovog oligomera morfolino nukleinske kiseline sintetisanog korišćenjem CE-G monomera. Ordinata predstavlja intenzitet jona (a.u.), dok apscisa predstavlja odnos mase prema naelektrisanju (m/z). Slika 4 predstavlja maseni spektar sirovog oligomera morfolino nukleinske kiseline, sintetisanog korišćenjem POB-G monomera. Ordinata predstavlja intenzitet jona (a.u.) i apscisa predstavlja odnos mase prema naelektrisanju (m/z).
[Opis primera]
[0019] Primeri predmetnog pronalaska su opisani niže u tekstu.
[0020] U narednom postupku dobijanja, kada polazni materijal sadrži supstituenta, koji utiče na reakciju (na primer, hidroksi, amino, karboksi), reakcija se obično odigrava nakon preliminarne protekcije polaznog materijala odgovarajućom zaštitnom grupom, u skladu sa poznatom metodom. Zaštitna grupa se na kraju može ukloniti bilo kojim poznatim postupkom, kao što je katalitička hidrogenizacija, alkalni tretman, bazni tretman.
Postupak dobijanja jedinjenj a pronalaska
[0021] Jedinjenje pronalaska se može dobiti od poznatog jedinjenj a ili intermedijera koji se lako priprema, na primer postupcima dobijanja 1 do 3, koji su dole prikazani.
Postupak dobijanja 1: Kada je R<3>trialkilsililoksi ili difenilalkilsililoksi
[0022]
gde je R<2>definisano, kao što je gore opisano.
R<7>predstavlja trialkilsilil ili difenilalkilsilil.
R8 predstavlja arilsulfonil koji može biti supstituisan sa 1 do 3 alkila.
R<14>predstavlja grupu predstavljenu prethodno pomenutom Formulom (2).
[0023]Ova reakcija obuhvata reakciju kondenzacije Jedinjenj a (6) sa 2-cijanoetanolom, i stoga može biti izvedena prema metodi poznatojper se.
[0024]Prikladno je da količina 2-cijanoetanola, koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 1 mol do 20 molova za 1 mol Jedinjenja (6), a poželjno u okviru opsega od 1.2 mola do 10 molova za 1 mol Jedinjenja (6). Rastvarač koji se može upotrebiti nije ograničen, naročito dok je inertan prema reakciji i može uključivati, na primer, acetonitril, dihlormetan i N,N-dimetilformamid, kao i njihove mešavine. Dihlormetan je posebno poželjan. "Baza" koja se može upotrebiti u ovom koraku, može uključivati, na primer, N-metilpirolidin i l,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-en, kao i njihove mešavine. Prikladno je da količina baze koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 1 mol do 20 molova za 1 mol Jedinjenja (6), a poželjno je da bude u okviru opsega od 1 mola do 10 molova za 1 mol Jedinjenja (6). Prikladno je da temperatura reakcije bude u okviru opsega od 0°C do 50°C. Dok reakciono vreme može da varira u zavisnosti od upotrebljenog polaznog materijala i temperature reakcije, prikladno je da bude u okviru opsega od 1 časa do 30 časova.
[0025]Jedinjenje (6), kao polazno jedinjenje, se može dobiti prema metodi opisanoj u odeljku za dobijanje Jedinjenja 4 u Primeru 1 u WO2009/064471.
Postupak dobijanja 2: Kada je R<3>hidroksil
[0026]
gde su R<2>,<R7,>i R<14>definisani kao što je gore opisano.
[0027] Ova reakcija obuhvata reakciju uklanjanja R<7>od Jedinjenja (1A), i stoga se može izvesti prema metodi poznatoj per se.
[0028] "Reagens za uklanjanje R<7>", koji se može upotrebiti, može uključivati, na primer, tetrabutilamonijum fluorid, so nekog amina i fluorovodonične kiseline ili mešavinu amina i fluorovodonične kiseline u prikladnom odnosu, u pogodnom rastvaraču.
[0029] Rastvarač koji se može upotrebiti, može uključivati, na primer, tetrahidrofuran (THF), acetonitril, dihlormetan, toluen, dimetil sulfoksid i N,N-dimetilformamid, kao i mešavinu pomenutih rastvarača. Posebno su poželjni THF i dihlormetan.
[0030] Dok količina reagensa za uklanjanje R<7>, koja se može upotrebiti u ovom koraku, može da varira u zavisnosti od vrste Jedinjenja (1A), reagensa za uklanjanje R<7>, koji će se upotrebiti, rastvarača koji će biti upotrebljen, prikladno je da bude u okviru opsega od 1 mol do 10 molova za 1 mol Jedinjenja (1A), a poželjno u okviru opsega od 1.2 mola do 5 molova za 1 mol Jedinjenja (A). Prikladno je da temperatura reakcije bude u okviru opsega od 0°C do 50°C. Dok vreme trajanja reakcije može da varira u zavisnosti od vrste polaznog materijala, temperature reakcije,
prikladno je da bude u okviru opsega od 1 časa to 30 časova.
Postupak dobijanja 3: Kada je R3 grupa predstavljena narednom formulom ( 5)
[0031] gde su X, Y, Z, i<*>definisani kao što je gore opisano.
[C.8]
gde suR2, R<14>, X, Y, i Z definisani kao stoje gore opisano.
[0032]Ova reakcija uključuje reakciju fosforamidovanja jedinjenja (1B), te se tako može izvoditi prema postupcimapoznatim per se.
[0033]Rastvarač koji se može upotrebiti nije ograničen, naročito dok je inertan prema reakciji i može uključivati, na primer, acetonitril, dihlormetan i THF.
[0034]Prikladno je da količina Jedinjenja (9), koja će se upotrebiti u ovom koraku, bude u okviru opsega od 1 mol do 10 molova za 1 mol Jedinjenja (1B), a poželjno u okviru opsega od 1.2 mola do 5 molova za 1 mol Jedinjenja (1B).
[0035]"Aktivirajući agens" koji se može upotrebiti u ovom koraku, može uključivati, na primer, lH-tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 4,5-dihlorimidazol, 4,5-dicijanoimidazol, N-metilimidazol, 4-dimetilaminopiridin. N-metilimidazol je posebno poželjan. Prikladno je da količina "agensa za aktivaciju", koja će biti upotrebljena, bude u okviru opsega od 0.2 mola do 3 mola za 1 mol Jedinjenja (9), a poželjno u okviru opsega od 0.5 mola do 2 mola za 1 mol Jedinjenja (9).
[0036] "Baza" koja se može upotrebiti u ovom koraku, može, na primer, da bude N-etilmorfolin. Pogodno je da količina baze, koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 0.8 mola do 5 molova za 1 mol Jedinjenja (9), a poželjno u okviru opsega od 1 mola do 3 mola za 1 mol Jedinjenja (9). Pogodno je da se temperatura reakcije nalazi u okviru opsega od 0°C do 80°C. Dok reakciono vreme može da varira u zavisnosti od vrste polaznog materijala, temperature reakcije, pogodno je da bude u okviru opsega od 1 časa do 30 časova.
Postupak dobijanja 4: Kada je R<1>vodonik
[0037]
gde su R<2>,<R3,>i R<14>definisani kao što je gore opisano.
[0038] Ova reakcija obuhvata reakciju deprotekcije R14 jedinjenja (1D), pa se stoga može izvoditi prema postupku poznatom per se.
[0039] "Kiselina" koja se može upotrebiti u ovom koraku, odnosno, "reagens za uklanjanje R<14>" može uključivati, na primer, sirćetnu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu ili fosfornu kiselinu. Pogodno je da količina kiseline, koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 1 mol do 1000 molova za 1 mol Jedinjenja (1D), a poželjno u okviru opsega od 10 molova do 100 molova za 1 mol Jedinjenja (1D).
[0040]Rastvarač koji će biti upotrebljen nije ograničen, naročito dokle god je inertan prema reakciji, i može uključivati, na primer, dihlormetan, metanol i vodu.
[0041]Dok vreme trajanja reakcije može da varira u zavisnosti od vrste polaznog materijala, temperature reakcije, prikladno je da bude u okviru opsega od 0.5 časova do 5 časova.
Postupak dobijanja oligomera morfolino nukleinske kiseline
[0042]Poželjni oligomer morfolino nukleinske kiseline je oligomer koji kao gradivnu jedinicu poseduje grupu predstavljenu narednom formulom.
[C 10]
gde Baza predstavlja bazu nukleinske kiseline.
X, i Y su definisani kao stoje gore opisano.
[0043]Oligomer morfolino nukleinske kiseline može se dobiti, na primer, postupkom opisanim u WO1991/009033 ili WO2009/064471. Oligomer morfolino nukleinske kiseline se posebno može dobiti postupkom opisanim u WO2009/064471, ili se može dobiti dole prikazanim postupkom.
[0044]Kao primer oligomera morfolino nukleinske kiseline, može se prikazati jedinjenje predstavljeno narednom formulom (I) (u daljem tekstu oligomer morfolino nukleinske kiseline
(I))-
u kojoj su Baza, X, i Y definisani kao što je gore opisano;
nje ceo broj iz opsega od 1 do 99, a poželjno je da bude ceo broj u okviru opsega od 18 do 28.
[0045]Oligomer morfolino nukleinske kiseline (I) može se dobiti poznatim postupkom, ili se može dobiti izvođenjem postupaka iz dole opisanih koraka.
[0046]Jedinjenja i reagensi koji će se upotrebiti u dole opisanim koracima nisu ograničeni, naročito ukoliko se obično koriste za sintezu oligomera morfolino nukleinskih kiselina.
[0047]Svi dole opisani koraci se mogu izvršiti postupcima u tečnoj fazi ili postupcima u čvrstoj fazi (korišćenjem priručnika ili komercijalno dostupnih automatskih uređaja za sintezu u čvrstoj fazi). Kada se oligomer morfolino nukleinske kiseline dobija postupkom u čvrstoj fazi, tada je postupak u kome se koristi automatski uređaj za sintezu poželjan s obzirom na pojednostavljenje operativnih procedura i tačnost sinteze.
(1) Korak A:
[0048]Korak za dobijanje jedinjenja predstavljenog narednom formulom (III) (u daljem tekstu Jedinjenje (III)), tako što se kiselini dopušta da deluje na Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (II) (u daljem tekstu Jedinjenje (II)).
gde su n, X, i Y definisani kao što je gore opisano;
B<p>nezavisno predstavlja bazu nukleinske kiseline, koja može biti zaštićena;
R<1>predstavlja tritil grupu, monometoksitritil grupu ili dimetoksitritil grupu;
L predstavlja vodonik, acil ili grupu predstavljenu narednom formulom (IV) (u daljem tekstu "Grupa (IV)").
[0049]"Baza nukleinske kiseline" u skladu sa B<p>može uključivati, na primer, "bazu nukleinske kiseline" sličnu Bazi. Pored toga, amino grupa ili hidroksi grupa baze nukleinske kiseline u skladusa B<p>može biti zaštićena.
[0050] Zaštitna grupa takve amino grupe nije ograničena, posebno dokle god se koristi kao zaštitna grupa za nukleinsku kiselinu, a one koje se obično navode kao primeri, mogu uključivati benzoil, 4-metoksibenzoil, acetil, propionil, butilil, izobutilil, fenilacetil, fenoksiacetil, 4-terc-butilfenoksiacetil, 4-izopropilfenoksiacetil, (dimetilamino) metilen. Zaštitna grupa za hidroksi grupu može uključivati, na primer, 2-cijanoetil, 4-nitrofenetil, fenilsulfoniletil, metilsulfoniletil, trimetilsililetil, fenil koja može biti supstituisana u bilo kojoj poziciji podložnoj supstituciji, sa 1 do 5 elektron-privlačnih grupa, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-piolidinilkarbamoil, morfolinokarbamoil, 4-(terc-butilkarboksi)benzil, 4[(dimetilamino)karboksi]benzil, 4-(fenilkarboksi)benzil (npr. vidi WO2009/064471).
[0051]Među pomenutima, 2-cijanoetil je poželjna kao zaštitna grupa za hidroksi grupu u poziciji 6- guanina.
[0052]"Čvrsti nosač" nije ograničen, naročito dokle god se može korisiti u reakciji nukleinske kiseline u čvrstoj fazi i poželjan je onaj koji (i) je slabo rastvorljiv u reagensu koji se može upotrebiti u sintezi derivata morfolino nukleinske kiseline (na primer, dihlormetan, acetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, piridin, anhidrid sirćetne kiseline, lutidin, trifluorsirćetna kiselina), (ii) je hemijski stabilan prema reagensu, koji se može upotrebiti u sintezi derivata morfolino nukleinske kiseline, (iii) se može hemijski modifikovati, (iv) omogućava željeno nanošenje derivata morfolino nukleinske kiseline (v) poseduje dovoljnu jačinu da bi mogao da izdrži visoki pritisak koji se primenjuje tokom tretmana (vi) poseduje konstantni opseg veličine čestica i njihovu raspodelu. Oni koje se obično navode kao primeri, mogu uključivati apsorbujući polistiren (na primer, aminometil polistiren smola umrežena sa 1% dibenzilbenzenom (200-400 dimenzija okca)
(2.4-3.Ommol/g) (proizvedena od strane Tokyo Chemical Industrv Co., Ltd.), aminometilovana polistiren smola HCl [dibenzilbenzen 1%,100~200 dimenzija okca] (proizvedena od strane Peptide Institute Inc.)), neapsorbujući polistiren (na primer, "Primer Support" (proizveden od strane GE Healthcare Ltd.)), polistiren tipa onog koji se vezuje za PEG lanac (na primer, NH2-PEG smola (proizvedena od strane Watanabe Chemical Industries, Lid.), TentaGel smola), porozno staklo (Controlled Pore Glass-CPG) (na primer, proizvod CPG-a), oksalilovano porozno staklo (na primer, vidi, Nucleic Acids Research,Vol. 19,1527(1991) Alul et al.), TentaGel podloga
- aminopolietilen glikol izvedena podloga (na primer, vidi, Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373
(1993) Wright et al.), porozni-polistiren/divinil benzen kopolimer.
[0053]Kao "vezivna grupa", može se upotrebiti bilo koja poznata grupa, koja se obično koristi za vezivanje nukleinskih kiselina ili derivata morfolino nukleinske kiseline, i može uključivati 3-aminopropil, sukcinil, 2,2-dietanolsulfonil i alkilamino dugog lanca (LCAA).
[0054]Ovaj korak se može izvršiti tako što se kiselini dopušta da deluje na Jedinjenje (II).
[0055]"Kiselina" koja se može upotrebiti u ovom koraku može uključivati, na primer, trifluorsirćetnu kiselinu, dihlorsirćetnu kiselinu i trihlorsirćetnu kiselinu. Prikladno je da količina kiseline, koja će biti upotrebljena, bude u okviru opsega od 0.1 mol do 1000 molova za 1 mol Jedinjenja (II), a poželjno u okviru opsega od 1 mol do 100 molova za 1 mol Jedinjenja (II).
[0056]Moguće je takođe, da se upotrebi organski amin, zajedno sa prethodno pomenutom kiselinom. Organski amin nije posebno ograničen i može uključivati, na primer, trietilamin. Prikladno je da količina organskog amina, koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 0.01 mol do 10 molova za 1 mol kiseline, a poželjno u okviru opsega od 0.1 mol do 2 mola za 1 mol kiseline.
[0057]Kada se u ovom koraku koristi so ili mešavina kiseline i organskog amina, ona može uključivati so ili mešavinu trifluorsirćetne kiseline sa trietil aminom, obično mešavinu 2 ekvivalenta trifluorsirćetne kiseline sa 1 ekvivalentom trietilamina.
[0058]Kiselina koja se može upotrebiti u ovom koraku, može se takođe koristiti kada je razblažena sa pogodnim rastvaračem do koncentracije iz opsega od 0.1 do 30%. Rastvarač nije ograničen, posebno dokle god je inertan prema reakciji, i može uključivati dihlormetan, acetonitril, alkohole (etanol, izopropanol, trifluoretanol i slične), vodu ili mešavine pomenutih rastvarača.
[0059]Poželjno je da temperatura prethodno pomenute reakcije bude u okviru opsega od 10°C do 50°C, pogodnije u okviru opsega od 20°C do 40°C, a još poželjnije u okviru opsega od 25°C do 35°C.
[0060]Dok vreme trajanja reakcije može da varira u zavisnosti od vrste kiseline koja će se upotrebiti i temperature reakcije, pogodno je da bude u okviru opsega od 0.1 minuta do 24 časa, a poželjno u okviru opsega od 1 minuta do 5 časova.
[0061]Po završetku ovog procesa, takođe se može dodati baza, ukoliko je potrebno da se kiselina, koja je preostala u sistemu, neutrališe. "Baza" nije posebno ograničena i može uključivati na primer, diizopropilamin. Baza se može upotrebiti razblažena sa pogodnim rastvaračem do koncentracije iz opsega od 0.1% (v/v) do 30% (v/v).
[0062]Rastvarač koji se koristi u ovom koraku, nije ograničen, posebno dokle god je inertan prema reakciji i može uključivati dihlormetan, acetonitril, alkohole (etanol, izopropanol, trifluoretanol i slične), vodu ili njihove smeše. Poželjno je da temperatura reakcije, na primer, bude u okviru opsega od 10°C do 50°C, poželjnije u okviru opsega od 20°C do 40°C, a još poželjnije u okviru opsega od 25°C do 35°C.
[0063]Dok reakciono vreme može da varira u zavisnosti od vrste baze i temperature reakcije, poželjno je da bude u okviru opsega od 1 minuta do 5 sati.
[0064] Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (Ha) (u daljem tekstu Jedinjenje (Ha)), u kojoj je n 1 i L je Grupa (IV) u Jedinjenju (II), se može dobiti dole prikazanim postupkom.
u kojoj su J3P, R<1>, vezivna grupa, i čvrsti nosač definisani kao što je gore opisano.
Korak 1:
[0065] Korak za sintezu Jedinjenja predstavljenog narednom formulom (VI) (u daljem tekstu Jedinjenje (VI)), tako što se agensu za acilovanje dopušta da deluje na Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (V).
u kojoj su B<p>, R<1>, i vezivna grupa definisani kao što je gore opisano;
R<6>predstavlja hidroksi grupu, halogeni element ili amino.
[0066] Ovaj korak se može izvesti u skladu sa poznatom reakcijom uvođenja vezivne grupe, koristeći Jedinjenje (V) kao polazni materijal.
[0067]Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (Via), posebno se može dobiti postupkom poznatim kao reakcija esterifikacije, korišćenjem Jedinjenja (V) i anhidrida sukcinske kiseline.
gde su B<p>, i R' definisani kao što je gore opisano.
Korak 2:
[0068] Korak za sintezu Jedinjenja (Ha), tako što se agensu za kondenzaciju dopušta da deluje na Jedinjenje (VI) i čvrsti nosač.
de su B<p>, R<6>, R<1>, vezivna grupa, i čvrsti nosač definisani kao što je gore opisano.
[0069] Ovaj korak obuhvata reakciju kondenzacije Jedinjenja (VI) u čvrstoj fazi i stoga se može izvoditi u skladu sa postupkom poznatim per se.
[0070] Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (IIa2), u kojoj je n ceo broj iz opsega od 2 do 99 i L je Grupa (IV) u Jedinjenju (II), se može dobiti korišćenjem Jedinjenja (Ha), kao polaznog materijala, i ponavljanjem procesa iz Koraka A i Koraka B željeni broj puta u skladu sa postupkom dobijanja oligomera morfolino nukleinske kiseline, opisanim u predmetnoj specifikaciji.
gde su B<p>, X, Y, R<1>, vezivna grupa, i čvrsti nosač definisani kao što je gore opisano; n' predstavlja ceo broj iz opsega od 1 do 98.
[0071]Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (II b), u kojoj je n 1 i L je vodonik u Jedinjenju (II), se može dobiti na primer postupkom opisanim u WO1991/009033.
gde su B<p>, i R<1>definisani kao što je gore opisano.
[0072]Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (IIb2), u kojoj n predstavlja ceo broj iz opsega od 2 do 99 i L je vodonik u Jedinjenju (U), se može dobiti tako što se Jedinjenje (II b) koristi kao polazni materijal, ponavljanjem procesa iz Koraka A i Koraka B, željeni broj puta, u skladu sa postupkom dobijanja oligomera morfolino nukleinske kiseline opisanim u predmetnoj specifikaciji.
gde su B<p>, n', R<1>, X, i Y definisani kao što je gore opisano.
[0073] Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (IIc), u kojoj je n=l i L je acil u Jedinjenju (II), se može dobiti postupkom poznatim kao reakcija acilovanja Jedinjenja (Ilb).
gde su B<p>, i R<1>definisani kao što je gore opisano;
R<7>predstavlja acil.
[0074] Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (IIc2), u kojoj je n ceo broj iz opsega od 2 do 99 i L je acil u Jedinjenju (II), se može dobiti tako što se Jedinjenje (TTc) koristi kao polazni materijal, i ponavljanjem procesa iz Koraka A i Koraka 3, u skladu sa postupkom dobijanja oligomera morfolino nukleinske kiseline, opisanim u predmetnoj specifikaciji.
gde suB<p>, n', R<1>, R<7>, X, i Y definisani kao što je gore opisano.
(2) Korak B:
[0075J Korak za dobijanje jedinjenja predstavljenog narednom formulom (VII) (u daljem tekstu Jedinjenje (VII)), tako što se monomernom morfolino jedinjenu dopušta da deluje na Jedinjenje (III) u prisustvu baze,
gde su B<p>, L, n, P<1>, X, i Y definisani kako je gore opisano.
[0076]Ovaj korak se može izvesti tako što se monomernom morfolino jedinjenju dopušta da deluje na Jedinjenje (III) u prisustvu baze.
[0077] Monomerno morfolino jedinjenje može uključivati Jedinjenje predstavljeno narednom formulom (VIII).
u kojoj su B<p>, R<1>, X, Y, i Z definisani kao što je gore opisano.
[0078]"Baza" koja se može upotrebiti u ovom koraku, može uključivati diizopropilamin, trietilamin ili N-etilmorfolin. Prikladno je da količina baze koja će se upotrebiti, bude u okviru opsega od 1 mol do 1000 molova za 1 mol Jedinjenja (III), a poželjno je da bude u okviru opsega od 10 molova do 100 molova za 1 mol Jedinjenja (III).
[0079]Monomerno morfolino jedinjenje i baza, koji se mogu upotrebiti u ovom koraku, mogu se razblažiti pogodnim rastvaračem do koncentracija u okviru opsega od 0.1% (v/v) do 30%(v/v). Rastvarač nije ograničen, naročito dokle god je inertan prema reakciji i može uključivati N,N-dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon, DMF, dihlormetan, acetonitril, tetrahidrofuran ili njihovu mešavinu.
[0080]Poželjno je da temperatura reakcije, na primer, bude u okviru opsega od 0°C do 100°C, a još poželjnije u okviru opsega od 10°C do 50°C.
[0081]Dok reakciono vreme može da varira u zavisnosti od vrste baze koja će se upotrebiti i temperature reakcije, prikladno je da bude u okviru opsega od 1 minuta do 48 časova, a poželjno u okviru opsega od 30 minuta do 24 časa.
[0082]Takođe, po završetku ovog procesa, po potrebi se može dodati agens za acilovanje. "Agens za acilovanje" može uključivati anhidrid sirćetne kiseline, acetil hlorid, anhidrid fenoksisirćetne kiseline. Agens za acilovanje može se razblažiti pogodnim rastvaračem do koncentracije iz opsega od 0.1%(v/v) do 30%(v/v). Rastvarač koji će se uporebiti u ovom koraku nije ograničen, naročito dokle god je inertan prema reakciji i može uključivati dihlormetan, acetonitril, alkohole (etanol, izopropanol, trifluoretanol i slični), vodu ili mešavine istih.
[0083]Ukoliko postoji potreba, moguće je da se zajedno sa agensom za acilovanje upotrebi baza, poput piridina, lutidina, kolidina, trietilamina, diizopropiletilamina, N-etilmorfolina. Poželjno je da količina agensa za acilovanje bude u okviru opsega od 0.1 do 10000 ekvivalentnih molova, a još poželjnije od 1 do 1000 ekvivalentnih molova. Prikladno je da količina baze, koja će biti upotrebljena, bude u okviru opsega od 0.1 mol do 100 molova za 1 mol agensa za acilovanje, a poželjno je da bude u okviru opsega od 2 mola do 10 molova za 1 mol agensa za acilovanje.
[0084]Poželjno je da temperatura ove reakcije bude u okviru opsega od 10°C do 50°C, još poželjnije u okviru opsega od 20°C do 40°C, a još više poželjno u okviru opsega od 25°C do 35°C. Dok reakciono vreme može da varira u zavisnosti od vrste agensa za acilovanje koji će se upotrebiti i temperature reakcije, prikladno je da bude u okviru opsega od 0.1 minuta do 24 časa, a poželjno u okviru opsega od 1 minuta do 5 časova.
(3) Korak C:
[0085]Korak za sintezu jedinjenja predstavljenog formulom (IX), tako što se agensu za deprotekciju omogućava da deluje na Jedinjenje (VII), dobijeno u Koraku B, kako bi se odvojila zaštitna grupa.
gde su Baza, B<p>, L, n, R<1>, X, i Y definisani kao što je gore opisano.
[0086]Ovaj korak se može izvršiti tako što se agensu za deprotekciju omogućava da deluje na Jedinjenje (VII).
[00871"Agens za deprotekciju" može uključivati koncentrovani vodeni rastvor amonijaka i metilamin. "Agens za deprotekciju", koji se može upotrebiti u ovom koraku, može se razblažiti, na primer, vodom, metanolom, etanolom, izopropil alkoholom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom, DMF-om, N,N-dimetilimidazolidonom, N-metilpiperidonom ili njihovom mešavinom. Među pomenutima, poželjan je etanol. Prikladno je da količina agensa za deprotekciju, koja će se upotrebiti, na primer bude u okviru opsega od 1 mol do 100000 molova za 1 mol Jedinjenja (VII), a poželjno u okviru opsega od 10 molova do 1000 molova za 1 mol Jedinjenja (VII).
[0088]Prikladno je, na primer, da temperatura reakcije bude u okviru opsega od 15°C do 75°C, a poželjno u okviru opsega od 40°C do 70°C, a još poželjnije u okviru opsega od 50°C do 60°C. Dok vreme trajanja reakcije deprotekcije može da varira u zavisnosti od vrste Jedinjenja (VII), temperature reakcije, prikladno je da bude u okviru opsega od 10 minuta do 30 časova, poželjno u okviru opsega od 30 minuta do 24 časa, a još poželjnije u okviru opsega od 5 časova do 20 časova.
(4) Korak D:
[0089]Korak za sintezu oligomera morfolino nukleinske kiseline (I), tako što se kiselini dopušta da deluje na Jedinjenje (IX) dobijeno u Koraku C.
gde su Baza, n, R<1>, X, i Y definisani kao što je gore opisano.
[0090]Ovaj korak se može izvršiti dodavanjem kiseline Jedinjenju (IX).
[0091]"Kiselina" koja se može upotrebiti u ovom koraku može uključivati, na primer, trihlorsirćetnu kiselinu, dihlorsirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu i hlorovodoničnu kiselinu. Prikladno je da količina kiselina koja će se upotrebiti bude podešena tako da pH rastvora bude u okviru opsega od 0.1 do 4.0, a još je poželjnije u okviru opsega od 1.0 do 3.0. Rastvarač nije ograničen, posebno dokle god je inertan prema reakciji, i može uključivati acetonitril, vodu ili mešavine pomenutih rastvarača.
[0092]Poželjno je da temperatura reakcije bude u okviru opsega od 10°C do 50°C, poželjnije u okviru opsega od 20°C do 40°C, a još više poželjno u rasponu od 25°C do 35°C. Vreme trajanja reakcije deprotekcije može da varira u zavisnosti od vrste Jedinjenja (IX), temperature reakcije, i prikladno je da bude u okviru opsega od 0.1 minuta do 5 časova, poželjno u okviru opsega od 1 minuta do 1 časa, a još poželjnije u okviru opsega od 1 minuta do 30 minuta.
[0093]Oligomer morfolino nukleinske kiseline (I) može se izdvojiti iz reakcione smeše dobijene u ovom koraku, primenom obične separacije i postupaka izolovanja, kao što su ekstrakcija, koncentrovanje, neutralizacija, filtracija, centrifugiranje, rekristalizacija, hromatografija u koloni sa reverznom fazom na Csdo Ci8, katjon-izmenjivačka hromatografija, anjon-izmenjivačka hromatografija, gel filtraciona hromatografija, tečna hromatografija pod visokim pritiskom, dijaliza, ultrafiltracija, koje se mogu izvoditi samostalno ili u kombinaciji, čime se željeni oligomer morfolino nukleinske kiseline (I) izoluje i prečisćava (na primer, vidi WO1991/09033).
[0094]Kada se za prečišćavanje oligomera morfolino nukleinske kiseline (I) primenjuje hromatografija u koloni sa reverznom fazom, rastvarač za eluiranje može uključivati mešavinu 20 mM trietilamin/sirćetna kiselina pufernog rastvora i acetonitrila.
[0095]Kada se za prečišćavanje oligomera morfolino nukleinske kiseline (I) primenjuje jonoizmenjivačka hromatografija, može se, na primer, upotrebiti mešavina IM slanog i 10 mM vodenog rastvora natrijum hidroksida.
[0096]Iako se jedinjenje pronalaska može koristiti direktno, kao monomer za sintezu oligomera morfolino nukleinske kiseline ili kao polazni materijal za sintezu takvog polaznog monomera, može se koristiti i u obliku soli, u skladu sa poznatim postupkom. Na primer, takva so može biti so neorganske kiseline, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, ili so organske kiseline, kao što je sirćetna kiselina, limunska kiselina, tartarna kiselina, maleinska kiselina, sukcinska kiselina, firmama kisleina, p-toluensulfonska kiselina, benzen sulfonska kiselina, metansulfonska kiselina.
[0097]Među jedinjenjima pronalaska ili njihovim solima, može postojati jedinjenje koje ima asimetrične atome ugljenika, pa su odgovarajući optički izomeri i njihove mešavine, takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Optički izomeri mogu se dobiti optičkim razdvajanjem, primenom poznatog postupka, korišćenjem optički aktivne kiseline (tartarna kiselina, dibenzoiltartarna kiselina, bademska kiselina, 10-kamforsulfonska kiselina i slične) iz racemskog oblika dobijenog kao što je gore opisano, korišćenjem baznosti istog, ili se mogu dobiti korišćenjem prethodno pripremljenog optički aktivnog jedinjenja, kao polaznog materijala. Sa druge strane, za dobijanje se može upotrebiti optičko razdvajanje korišćenjem hiralne kolone ili asimetrična sinteza.
[0098]Takođe, kada postoje geometrijski ili tautomerni izomeri jedinjenja pronalaska ili njegove soli, predmetni pronalazak ne obuhvata samo jedan izomer pomenutog jedinjenja, nego i mešavine pomenutih izomera.
[0099]Tako dobij eno jedinjenje pronalaska ili njegova so, se može izdvojiti i prečistiti metodama poznatim per se, kao što su koncentrovanje, konverzija tečne prirode, migracija ka rastvaraču, ekstrakcija pomoću rastvarača, kristalizacija, rekristalizacija, frakciona destilacija i hromatografija.
[PRIMERI]
[0100]U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti detaljnije opisan, pozivajući se na dole prikazane REFERENTNE PRIMERE, PRIMERE, PRTMERE SINTEZE i OGLEDNE PRIMERE, ali se ne smatra daje njima ograničen.
[REFERENTNI PRIMER 1]
N9- {(2R,6S)-6-(Hidroksimetil)morfolin-2-il} -N2-(fenoksiacetil)guanin p-toluen sulfonat
Korak 1: Dobijanje N<2->(fenoksiacetil) guanozina
[0101]Guanozin, 100 g, je sušen na 80°C pod sniženim pritiskom tokom 24 časa. Nakon što je dodato 500 ml piridina (anhidrovanog) i 500 ml dihlormetana (bezvodnog), u smešu je dodato kap po kap 401 ml hlortrimetilsilana u atmosferi argona na 0°C, nakon čega je usledilo mešanje na sobnoj temperaturi, tokom 3 časa. Smeša je ponovo ohlađena u ledu i u nju je dodato, kap po kap, 66.3 g fenoksiacetil hlorida. Smeša je mešana tokom dodatna 3 časa, uz hlađenje ledom. U reakcioni rastvor dodato je 500 ml metanola, i smeša je mešana preko noći, na sobnoj temperaturi. Rastvarač je zatim uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom. Ostatku je dodato 500 ml metanola, i izvršeno je koncentrovanje pod sniženim pritiskom tri puta. Ostatku je dodato 4L vode, i smeša je mešana sat vremena uz hlađenje ledom. Formirani taloži su izdvojeni filtracijom, isprani, redom, vodom i hladnim metanolom a zatim su osušeni, da bi se dobilo 150.2 g predmetnog jedinjenja (uporediti sa: Org. Lett. (2004), Vol. 6, No. 15, 2555-2557).
Korak 2: N<9->{(2R,6S)-5-(hidroksimetil)morfolin-2-il}-N<2->(fenoksiacetil)guanin p-toluen sulfonat
[0102]U 480 ml metanola, suspendovano je 30 g jedinjenja dobijenog u Koraku 1, i u suspenziju je dodato 130 ml 2N hlorovodonične kiseline, uz hlađenje ledom. Zatim je u smešu dodato 56.8 g amonijum tetraborat tetrahidrata i 16.2 g natrijum perjodata, pomenutim redosledom i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 časa. Reakcioni rastvor je ohlađen ledom a nerastvorne materije su uklonjene filtracijom, praćenom ispiranjem sa 100 ml metanola. Filtrat i tečnost za ispiranje su spojeni i smeša je ohlađena ledom. U smešu je dodato 11.52 g 2-pikolin borana. Nakon mešanja u trajanju od 20 minuta, u smešu je polako dodato 54.6 g monohidrata p-toluen sulfonske kiseline, nakon čega je usledilo mešanje na 4°C, preko noći. Taloži su uklonjeni filtracijom, isprani sa 500 ml hladnog metanola i osušeni da bi se dobilo 17.7 g predmetnog jedinjenj a (prinos: 43.3%).
'H NMR (DMSO-d6): 5 9.9-9.2 (2H, br), 8.35 (IH, s), 7.55 (2H, m), 7. 35 (2H, m), 7. 10 (2H, d, J=7.82Hz), 7.00 (3H, m), 5.95 (IH, dd, J=10.64, 2.42Hz), 4.85 (2H, s), 4.00 (IH, m), 3.90-3.60 (2H, m), 3.50-3.20 (5H, m), 2.90 (IH, m), 2.25 (3H, s).
[REFERENTNI PRIMER 2]
Dobijanje 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-l-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobuterne kiseline nanete na aminometil polistiren smolu (proizvedena od strane GE Healthcare, Custom Primer Support Amino 200, 28-9229-46)
[0103]U atmosferi argona, 0.46 g 7V-{l-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-l,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida i 0.15 g 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) suspendovano je u 10 ml dihlormetana, i u suspenziju je dodato 0.12 g anhidrida sukcinske kiseline, nakon čega je usledilo mešanje na sobnoj temperaturi tokom 3 časa. U reakcioni rastvor dodat je 1 ml metanola, i reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Talog je ekstrahovan etil acetatom i 0.5M vodenim rastvorom kalijum dihidrogen fosfata, vodom i slanim rastvorom, pomenutim redosledom. Dobij eni organski sloj se osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan pod sniženim pritiskom.
[0104]Nakon rastvaranja dobijenog taloga u 50 ml piridina (dehidriranog), u rastvor je dodato 0.1 g 4-DMAP i 1.5 g l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida. Zatim je u smešu dodato 5.0 g aminometil polistiren smole (proizvedene od strane GE Healthcare, Custom Primer Support Amino 200, 28-9229-46) i 1.7 ml trietilamina, nakon čega je usledilo mućkanje na sobnoj temperaturi, tokom 6 dana. Po završetku reakcije, smola je uklonjena filtracijom. Dobijena smola je isprana uzastopno, piridinom, metanolom i dihlormetanom, pomenutim redosledom i osušena pod sniženim pritiskom. Dobijenoj smoli dodato je 40 ml tetrahidrofurana (dehidrata), 3 ml anhidrida sirćetne kiseline i 3 ml 2,6-lutidina, i smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 h. Smola je izdvojena filtracijom, isprana uzastopno, piridinom, metanolom i dihlormetanom, pomentim redom i osušena pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 5.0 g proizvoda.
[0105]Količina sadržanog proizvoda je određena pomoću molarne koncentracije tritila po jednom gramu smole, merenjem UV apsorbanse na 409 nm, primenom poznate metode. Sadržaj punjenja smole je bio 46,3 umol/g.
Uslovi UV merenja
[0106]
Uređaj: U-2910 (Hitachi, Ltd.)
Rastvarač: metansulfonska kiselina
Talasna dužina: 265 nm
s Vrednost: 45000
[REFERENTNI PRIMER 3]
Dobijanje 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-l-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobuteme kiseline nanete na Aminometil Polistiren Smolu umreženu sa 1% DVB (proizvedena od strane Tokyo Chemical Industrv Co., Ltd., A1543)
[0107]U atmosferi argona, 30 g 7V-{l-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-l,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida i 9.6 g 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) suspendovano je u 60 ml dimetilformamida, i u suspenziju je dodato 7.86 g anhidrida sukcinske kiseline, nakon čega je usledilo mešanje na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. U reakcionu smešu je dodat IM vodeni rastvor kalijum dihidrogenfosfata i smeša je ekstrahovana pomoću etil acetata. Dobijeni organski sloj je ispran, sukcesivno, IM vodenim rastvorom kalijum dihidrogenfosfata, vodom i slanim rastvorom, pomenutim redosledom. Dobij eni organski sloj je osušen na magnezijum sulfatu i koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 34.0 g proizvoda, u vidu sirovog kristala.
[0108]Nakon rastvaranja 29.5 g sirovog kristala u 300 ml piridina (dehidriranog), u rastvor je dodato 5.1 g 4-DMAP i 20.1 g l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida. Nakon toga, u smešu je dodato 25.0 g Aminometil Polistiren Smole umrežene sa 1% DVB (proizvedena od strane Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A1543) i 24 ml trietilamina, nakon čega je usledilo mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Po završetku reakcije, smola je izdvojena filtracijom. Dobijena smola je isprana, sukcesivno, piridinom, metanolom i dihlormetanom, pomenutim redosledom i osušena pod sniženim pritiskom. Dobijenoj smoli dodato je 300 ml tetrahidrofurana (dehidrata), 30 ml anhidrida sirćetne kiseline i 30 ml 2,6-lutidina, i smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 2.5 časa. Smola je izdvojena filtracijom, isprana sukcesivno piridinom, metanolom i dihlormetanom, pomenutim redosledom i osušena pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 33.2 g proizvoda.
[0109]Količina sadržanog proizvoda je određena pomoću molarne koncentracije tritila po jednom gramu smole, merenjem UV apsorbanse na 409 nm, primenom poznate metode. Sadržaj punjenja smole je bio 292.4 umol/g.
Uslovi UV merenja
[0110]
Uređaj: U-2910 (Hitachi, Ltd.)
Rastvarač: metansulfonska kiselina
Talasna dužina: 265 nm
s Vrednost: 45000
[Primer 1]
[(2S,6R)-6-{N<2->(fenoksiacetil)-0<6->(2-cijanotil)guanin-9-il}-4-tritilmorfolin-2-il]metildimetil fosforamid hloridat
Korak 1:
Sinteza N9- {(2R,6S)-6-hidroksimetil-4-tritilmorfolin-2il} -N2-(fenoksiacetil) guanina
[0111]U 30 ml dihlormetana, suspendovano je 2.0 g N9-{(2R,6S)-6-(hidroksimetil) morfolin-2-il}-N<2->(fenoksiacetil)guanin p-toluensulfonata (REFERENTNI PRIMER 1), i 13.9 g trietilamina i u suspenziju je dodato 18.3 g tritil hlorida uz hlađenje ledom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Reakcioni rastvor je ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, a zatim vodom i osušen preko natrijum sulfata. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Talogu je dodato 40 ml 0.2M natrijum citratnog pufera (pH 3)/metanol (1:4 (v/v)), i smeša je mešana. Nakon toga dodato je 40 ml vode i suspenzija je mešana tokom 1 časa, uz hlađenje ledom. Talog je izdvojen filtracijom. ispran hladnim metanolom i osušen, da bi se dobilo 1.84 g predmetnog jedinjenja (prinos: 82.0%).
Korak 2:
Sinteza N9-[(2R,6S)-5- {(terc-butildimetilsililoksi)metil} -4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoksi acetil) guanina
[0112]U 300 ml dihlormetana, rastvoreno je 38.3 g jedinjenja dobijenog u Koraku 1, i u rastvor je dodato 4.64 g imidazola i 9.47 g t-butildimetilsilil hlorida, pomenutim redosledom, uz hlađenje ledom. Reakcioni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Reakcioni rastvor je ispran 0.2M natrijum citratnim puferom (pH 3), a zatim slanim rastvorom i osušen na magnezijum sulfatu. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 44.1 g predmetnog jedinjenja, u vidu sirovog proizvoda. Korak 3: Sinteza N9-[(2R,6S)-6- {(terc-butildimetilsililoksi)metil} -4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoksi acetil)-0<6->triizopropilbenzen sulfonil guanina
[0113]U 300 ml dihlormetana rastvoreno je 44.1 g jedinjenja dobijenog u Koraku 2, i 0.64 g 4-dimetilaminopiridina, i u rastvor je dodato, uz hlađenje ledom, 29.2 ml trietilamina i 19.0 g triizopropilbenzensulfonil hlorida. Reakcioni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Reakcioni rastvor je ispran IM vodenim rastvorom natrijum dihidrogenfosfata i osušen preko natrijum sulfata. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 60,5 g predmetnog jedinjenja u vidu sirovog proizvoda.
Korak 4:
Dobijanje N<9->[(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoksi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N<2->(fenoksi acetil)-0<6->(2-cijanoetil) guanina
[0114]U 300 ml dihlormetana rastvoreno je 60.5 g jedinjenja dobijenog u Koraku 3, i u rastvor je dodato 54.5 ml N-metilpirolidina, uz hlađenje ledom. Reakcioni rastvor je mešan uz hlađenje ledom tokom jednog časa. Zatim je u rastvor dodato 37.2 g etilen cijanohidrina, i 11.96 g 1,8-diazabiciklo [5.4.0] undek-7-ena i smeša je mešana tokom 2 sata, uz hlađenje ledom. Reakcioni rastvor je ispran IM vodenim rastvorom natrijum dihidrogen fosfata i osušen preko magnezijum sulfata. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobilo 72.4 g predmetnog jedinjenja u vidu sirovog proizvoda.
Korak 5:
Sinteza N<9->[(2R,6S)-6-hidroksimetil-4-tritilmorfolin-2-il]-N<2->(fenoksiacetil)-0<6->(2-cijano etil) guanina
[0115]U 300 ml dihlormetana rastvoreno je 72.4 g jedinjenja dobijenog u Koraku 4, i u rastvor je dodato 21.1 g trietilamin trihidrofluorida. Reakcioni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi, tokom 17 sati. Reakcioni rastvor je sipan u hladni, zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata, kako bi se reakcioni rastvor neutralizovao, a zatim je sloj dihlormetana osušen preko natrijum sulfata. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Talog je prečišćen hromatografijom u koloni sa silika gelom (PSQ100B (proizvedena od strane FUJI SILESIA CHEMICAL LTD. Isto važi i u daljem tekstu.)), da bi se dobilo 14.3 g predmetnog jedinjenja (prinos iz Koraka 2: 39.2%).
Korak 6:
Sinteza [(2S,6R)-6- {N2-(fenoksiacetil)-06-(2-cijanoetil)guanin-9-il} -4-tritilmorfolin-2-il] metildimetilfosforamido hloridata
[0116]U atmosferi argona, 4.03 ml dimetilaminofosforil dihlorida dodato je u 86 ml THF, i u reakcioni rastvor je dodato 3.37 ml N-metilimidazola. Rastvor se promenio u suspenziju. Nakon pet minuta, u suspenziju je dodato 11.86 g sprašenog jedinjenja dobijenog u Koraku 5. Reakciona smeša je mešana tokom 5 minuta. Nakon toga je u smešu dodato, 2.16 ml N-etilmorfolina i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 3 časa.
[0117]Reakcioni rastvor je sipan u vodeni rastvor IM natrijum dihidrogenfosata, hlađenog ledom i ekstrahovan sa 300 ml etil acetata. Organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrjum sulfata. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Talog je prečišćen hromatografijom u koloni sa silika gelom (PSQ100B) da bi se dobilo 9.9 g predmetnog jedinjenja (prinos: 70.7%).
'H-NMR (CDCb): 8 8.85 (IH, bs), 7.85 (IH, d, J=3.45Hz), 7.60-7.00(20H,m), 6.30 (IH, d, J=9.51Hz), 4.90-4.70 (4H, m), 4.60-4.40 (IH, m), 4.20-4.00 (IH, m), 3.50 (IH, d, J=11.28Hz), 3.25 (IH, d, J=10.21Hz), 3.00 (2H, t, J=6.56Hz), 2.65 (6H, dd, J=13.89, 4.1Hz), 1.85-1.55 (2H, m)<31>P-NMR (CDCb): 8 20.7097, 20.3500
[0118]Tabela 1 prikazuje hemijske strukture i skraćenice monomernih morfolino jedinjenja, korišćenih u narednim PRIMERIMA SINTEZE i OGLEDNIM PRIMERIMA.
Primer sinteze 1
Sinteza oligomera morfolino nukleinske kiseline sa narednom stukturom i baznom sekvencom 5'-CAGTGC- 3' korišćenjem CE- G
[0119]
[Korak 1]
[0120]216 mg (10 mmol) 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamid-2-oksopirimidin-l-il)-4-tritilmorfolin -2-il]metoksi}-4-oksobuterne kiseline nanete na aminometilpolistiren smolu (Referentni Primer 2) je prebačeno u kolonu za sintezu, koja je uvedena u automatsku mašinu za sintezu (Oligopilot 10: proizvedena od strane GE healthcare). Preostali potrebni reagensi su pripremljeni i takođe uvedeni u uređaj. Sinteza u čvrstoj fazi je izvedena na 50°C (upotrebom peći za kolonu) u uslovima prikazanim u Tabeli 2.
[0121]Kao rastvor za deblokiranje korišćen je rastvor dihlormetana, koji sadrži 3% (w/v) trihlorsirćetne kiseline. Kao aktivator korišćen je rastvor acetonitrila, koji sadrži 20% (v/v) N,N-diizopropiletilamina i 10% (v/v) tetrahidrofurana. Kao monomerna morfolino jedinjenja korišćenisuA<p>, C<p>, T<p>i CE-G prikazani u Tabeli 1.
[0122]Kao rastvor morfolino monomera, korišćeno je prethodno pomenuto monomerno morfolinio jedinjenje, rastvoreno do koncentracije od 0.13 do 0.15M u tetrahidrofuranu (A<p>, C<p>: 0.14M; T<p>: 0.15M; CE-G: 0.13M).
[Korak 2]
[0123]Oligomer morfolino nukleinske kiseline, nanet na aminometilpolistiren smolu, dobijen u Koraku 1, je uklonjen iz reakcionog suda i sušen pod sniženim pritiskom na sobnoj temperaturi tokom 2 časa ili duže. 10 mg tako osušenog oligomera morfolino nukleinske kiseline, nanetog na aminometilpolistiren smolu je uvedeno u reakcioni sud, u koji je dodat 1 ml 28% vodenog rastvora amonijak/etanol (1/3) i smeša je mešana tokom 15 časova na 55°C. Aminometilpolistiren smola je filtrirana i isprana sa 1.0 ml etanola. Dobijeni filtrat je pomešan sa 10 ml etil etra. Nakon centrifugiranja, uklonjena je tečnost i nakon sušenja pod sniženim pritiskom, očekivana supstanca je dobijena u vidu belog taloga.
MALDI-TOF-MS: Izračunato: 1921.66
Dobijeno: 1917.69
Primer sinteze 2
Sinteza oligomera morfolino nukleinske kiseline sa baznom sekvencom 5'- CAGTGC- 3'
korišćenjem POB- G
[0124]Umesto CE-G monomera korišćen je [(2S,6R)-6-{N'-(fenoksiacetil)-0<6->
(pivaloiloksibenzil)guanin-9-il} -4-tritilmorfolin-2-il]metildimetilfosforamid hlorinat (vidi, WO2009/064471 Al, u daljem tekstu POG-G (vidi Tabelu 1)), i oligomer morfolino nukleinske kiseline sa sekvencom sličnom onoj iz Primera sinteze 1 je dobijen postupcima sličnim onima iz Koraka 1 i Koraka 2 iz Primera sinteze 1.
Primer sinteze 3
Sinteza oligomera morfolino nukleinske kiseline sa baznom sekvencom 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTT- 3'
[0125]6.02 g (1.75 mmol) 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamid-2-oksopirimidin-l-il)-4-tritilmorfolin -2-il]metoksi}-4-oksobuterne kiseline nanete na aminometilpolistiren smolu (Referentni Primer 3) je prebačeno u reakcioni sud, u koji je dodato 90 ml dihlormetana, i koji je ostavljen da stoji 30 minuta. Nakon filtracije, pokrenut je ciklus sinteze prikazan u Tabeli 3. Da bi se dobilo jedinjenje sa pomenutom baznom sekvencom, monomerna morfolino jedinjenja su dodavana u odgovarajućim ciklusima, prema potrebi.
[0126]Kao rastvor za deblokiranje, korišćena je mešavina trifluorsirćetne kiseline (2 ekvivalenta) i trietilamina (1 ekvivalent) rastvorena do 3% (w/v) u rastvoru dihlormetana, koji sadrži 1% (v/v) etanola i 10% (v/v) 2,2,2-trifluoretanola. Kao rastvor za neutralizaciju, korišćen je N,N-diizopropiletilamin rastvoren do 5% (v/v) u rastvoru dihlormetana koji sadrži 25% (v/v) 2-propanola.
[0127]Kao rastvor za kuplovanje A, korišćeno je monomerno morfolino jedinjenje (A<p>, C<p>, T<p>i CE-G) rastvoreno do koncentracije od 0.15M u rastvoru 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, koji sadrži 10%(v/v) N,N-diizopropiletilamina. Kao rastvor za kuplovanje B, korišćen je N,N-diizopropiletilamin rastvoren do koncentracije od 10% (v/v) u l,3-dimetil-2-imidazolidinonu. Kao pokrivajući rastvor, korišćen je dihlormetan koji sadrži 20% (v/v) anhidrida sirćetne kiseline i 30%
(v/v) u njemu rastvorenog 2,6-lutidina.
[0128]Oligomer morfolino nukleinske kiseline nanet na aminometilpolistiren smolu, dobijen kako je gore opisano, je izdvojen iz reakcionog suda i sušen pod sniženim pritiskom na sobnoj temperaturi tokom 2 časa ili duže. Oligomer morfolino nukleinske kiseline nanet na aminometilpolistiren smolu, osušen na taj način, je uveden u reakcioni sud, u koji je dodato 350 ml smeše 28% vodeni amonijak/etanol (1/4) i smeša je mešana tokom 15 časova na 55°C. Aminometilpolistiren smola je filtrirana i isprana sa 150 ml smeše voda/etanol (1/4). Dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni talog je rastvoren u 400 ml smeše rastvora 2CmM sirćetna kiselina-trietilamin pufera (TEAA pufer) i acetonitrila (4/1) i filtrirana kroz filter sa membranom. Dobijeni filtrat je prečišćen pomoću HPLC sa reverznom fazom. Primenjeni uslovi su prikazani u Tabeli 4.
[0129]Svaka frakcija je analizirana i očekivana supstanca je izdvojena i koncentrovana pod sniženim pritiskom, da bi se dobila čvrsta supstanca svetio žute boje. Dobijena čvrsta supstanca je suspendovana u 200 ml lOmM vodenog rastvora fosforne kiseline. U suspenziju je dodato 10 ml 2M vodenog rastvora fosforne kiseline i mešana je tokom 15 minuta. Zatim je takođe dodato 15 ml 2M vodenog rastvora natrijum hidroksida, za neutralizaciju. I nakon toga, dodato je još 20 ml 2M vodenog rastvora natrijum hidroksida, da bi se rastvor alkalizovao. Smeša je zatim filtririrana kroz filter sa membranom (0.22 um) i isprana sa 180 ml 10 mM vodenog rastvora natrijum hidroksida, da bi se dobio vodeni rastvor (400 mL), koji sadrži očekivanu supstancu (5.8 g, prinos: 50%).
EST-TOF-MS Izračunato: 6609.62
Dobijeno: 6609.09
Ogledni Primer 1
Poređenje oligomera morfolino nukleinske kiseline dobijenog tako što je upotrebljeno Jedinjenje
pronalaska ( CE- G) i oligomera morfolino nukleinske kiseline dobijenog korišćenjem jedinjenja iz
stanja tehnike ( POB- G) ( Primer sinteze 2)
( 1) Poređenje čistoće ili prinosa sintetisanih oligomera morfolino nukleinskih kiselina
[0130]Svaki od oligomera morfolino nukleinskih kiselina, nanetih na aminometilpolistiren smole, dobijenih postupcima sličnim Koraku 1 iz Primera sinteze 1 i Koraku 2 iz Primera sinteze 2, je tretiran koncentrovanom mešavinom rastvora vodeni amonijak/etanol i oligomeri morfolino nukleinskih kiselina su odvojeni od čvrstih nosača. Nakon uklanjanja čvrstih nosača filtracijom, filtratu je dodata velika količina etra i podvrgnut je centrifugiranju, tečnost je uklonjena, da bi se dobio sirovi proizvod relevantnog oligomera, u vidu čvrstog taloga. Čvrsti talog je osušen, a zatim rastvoren u vodi (20 mL), od čega je 5 ul izdvojeno i podvrgnuto HPLC analizi, da bi se izmerio sadržaj navedenog oligomera morfolino nukleinske kiseline u relevantnoj sirovoj smeši. Rezultati su respektivno prikazani na HPLC hromatogramima na Slici 1 i Slici 2.
[0131]Uslovi merenja su prikazani dole.
Uslovi merenja:
[0132]
HPLC Instrument
Jedinica za pumpanje: LC-10AT VP (proizvedena od strane Shimadzu Corporation) Detektor: SPD-10AVP (proizveden od strane Shimadzu Corporation)
HPLC kolona sa reverznom fazom XBridge [2.5 mm, cp4.6 mm x 50 mm] (proizvedena od strane Waters)
Temperatura kolone: 60°C
Mobilna faza
Gradijent: Linearni gradijent 20 minuta (Rastvor B: 0 do 40%)
Rastvor A: 50mM puferni rastvor trietilamin - sirćetna kiselina
Rastvor B: Acetonitril
Protok mobilne faze: 0.75 ml/min
Talasna dužina detekcije UV/vidljivog spektrofotometra: 260nm
[0133]Udeo površine (%) i površina ispod pika (mAUsec) označenog oligomera morfolino nukleinske kiseline, sadržanog u sirovoj smeši, dobijeni analizom HPLC hromatograma sa Slike 1 i Slike 2 su prikazani u Tabeli 5.
[0134]Rezultati prikazani u Tabeli 5, ukazuju na to daje udeo površine viši i daje površina ispod pika veća, kada se u sintezi oligomera morfolino nukleinske kiseline koristi CE-G monomer, nego kada se koristi POB-G monomer. Oligomer morfolino nukleinske kiseline, dobijen korišćenjem jedinjenja pronalaska, ima veću čistoću i prinos. Jasno je daje predmetni pronalazak superioran u odnosu na stanje tehnike.
( 2) Poređenje sintetisanih oligomera morfolino nukleinske kiseline pomoću MS analize
[0135]Pomenuti sirovi oligomeri morfolino nukleinske kiseline, dobijeni u gore opisanom Odeljku (1) su ispitivani masenom spektrometrijom (MALDI-TOF-MS; proizveden od strane Autoflex; Bruker Daltonics), da bi se dobili maseni spektri, prikazani respektivno na Slici 3 i Slici 4.
[0136]Kao rezultat, otkriveno je da kada je upotrebljen POB-G monomer (Slika 4), tada je primećen sporedni proizvod, koji nije uočen kada je upotrebljen CE-G monomer (Slika 3). Izmerena vrednost molekulske mase ovog sporednog proizvoda je bila veća za 106 od standardnog pika označenog oligomera morfolino nukleinske kiseline, ukazujući na prisustvo p-hidroksibenzil adukta, koje je navedeno u WO2009/064471.
[0137]Sa druge strane, kada se koristi CE-G monomer, potvrda akrilonitrila nije pronađena, uprkos P-odvajanju CE grupe (Slika 3), što ukazuje na to da CE-G monomer deluje izuzetno u sintezi oligomera morfolino nukleinske kiseline.

Claims (6)

1.Jedinjenje predstavljeno narednom opštom formulom (1) ili njegova so: u kojoj R<1>predstavlja vodonik ili grupu predstavljenu narednom opštom formulom (2): (u kojoj<*>predstavlja mesto vezivanja; R11, R<12>, R<13>koji su isti ili različiti i svaki predstavlja vodonik, alkil ili alkoksi) R<2>predstavlja grupu predstavljenu narednom opštom formulom (3) ili (4): (u kojoj je<*>definisana, kao što je gore opisano; R<4>predstavlja alkil, arilmetil ili ariloksimetil; R<5>, R<6>su isti ili različiti i svaki predstavlja alkil) R<3>predstavlja hidroksi grupu, koja može biti zaštićena trialkilsilil ili difenilalkilsilil grupom, ili grupom predstavljenom narednom opštom formulom (5): (u kojoj je<*>definisana kao što je gore opisano; X predstavlja O ili S; Y predstavlja dialkilamino ili alkoksi; Z predstavlja halogeni element).
2. Jedinjenje ili njegova so, prema zahtevu 1, kod kojeg je X O, Y je dialkilamino, i Z je hlor.
3. Jedinjenje ili njegova so, prema zahtevu 1, kod kojeg je R<3>hidroksi grupa, koja može biti zaštićena sa t-butildimetilsilil ili t-butildifenilsilil.
4. Jedinjenje ili njegova so, prema zahtevu 1, kod kojeg je R<4>fenoksimetil.
5. Jedinjenje ili njegova so, prema zahtevu 1, kod kojeg je R<1>tritil, 4-metoksitritil, 4-metiltritil, 4,4'-dimetiltritil, 4,4'-dimetoksitritil, ili 4,4',4"-trimetiltritil.
6. Jedinjenje izabrano među narednim jedinjenj ima od (1) do (3), ili njegova so: (1) N9-[(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoksi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoksiacetil^ (2-cijanoetil) guanin, (2) N<9->{(2R,6S)-6-hidroksimeti1-4-triti1morfo1in-2-i1}-N<2->(fenoksiaceti1)-0<6->(2-cijanoeti1) guanin, (3) [(2S,6R)-6- {N2-(fenoksiacetil)-06-(2-cijanoetil)guanin-9-il} -4-tritilmorfolin-2-il]metil dimetilfosforamido hloridat.
RS20170057A 2010-09-30 2011-09-29 Derivat morfolino nukleinske kiseline RS55610B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010220865 2010-09-30
PCT/JP2011/072407 WO2012043730A1 (ja) 2010-09-30 2011-09-29 モルホリノ核酸誘導体
EP11829283.8A EP2623507B1 (en) 2010-09-30 2011-09-29 Morpholino nucleic acid derivative

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55610B1 true RS55610B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=45893168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170057A RS55610B1 (sr) 2010-09-30 2011-09-29 Derivat morfolino nukleinske kiseline

Country Status (18)

Country Link
US (1) US8969551B2 (sr)
EP (1) EP2623507B1 (sr)
JP (1) JP5831455B2 (sr)
KR (1) KR101764462B1 (sr)
CN (1) CN103154009B (sr)
CA (1) CA2813183C (sr)
CY (1) CY1118435T1 (sr)
DK (1) DK2623507T3 (sr)
ES (1) ES2607603T3 (sr)
HR (1) HRP20170028T1 (sr)
HU (1) HUE030292T2 (sr)
LT (1) LT2623507T (sr)
PL (1) PL2623507T3 (sr)
PT (1) PT2623507T (sr)
RS (1) RS55610B1 (sr)
SI (1) SI2623507T1 (sr)
SM (2) SMT201700038T1 (sr)
WO (1) WO2012043730A1 (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1766010T3 (pl) 2004-06-28 2011-07-29 Univ Western Australia Antysensowne oligonukleotydy do indukcji pominięcia egzonu i sposoby ich zastosowania
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
CN105779453A (zh) 2008-10-24 2016-07-20 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
BR122023023194A2 (pt) 2009-11-12 2023-12-26 The University Of Western Australia Oligonucleotídeo antissentido, composição e respectivo uso
KR102182663B1 (ko) 2010-05-28 2020-11-25 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
US10017763B2 (en) 2010-09-03 2018-07-10 Sarepta Therapeutics, Inc. dsRNA molecules comprising oligonucleotide analogs having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
JP2015500204A (ja) 2011-11-18 2015-01-05 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 機能的に修飾されたオリゴヌクレオチドおよびそのサブユニット
JP6542662B2 (ja) 2012-03-20 2019-07-10 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドアナログのボロン酸結合体
CN102702265A (zh) * 2012-05-14 2012-10-03 天津特安化学科技有限公司 一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸及方法
EA202090946A3 (ru) 2013-03-14 2021-07-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Композиции, обеспечивающие пропускание экзонов, для лечения мышечной дистрофии
NZ631289A (en) 2013-03-15 2017-08-25 Sarepta Therapeutics Inc Improved compositions for treating muscular dystrophy
EP3015467B1 (en) 2013-05-24 2024-12-04 Ajinomoto Co., Inc. Morpholino oligonucleotide manufacturing method
KR102275504B1 (ko) 2013-09-05 2021-07-09 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 산성 알파-글루코시다제 내 안티센스-유도된 엑손2 포함
CA2948373A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Oregon State University Antisense antibacterial compounds and methods
EP3569252B1 (en) 2014-05-19 2021-12-15 Oregon State University Antisense antibacterial compounds and methods
JP6673211B2 (ja) * 2014-10-14 2020-03-25 味の素株式会社 モルフォリノオリゴヌクレオチドの製造方法
CA3249464A1 (en) * 2014-12-31 2025-11-29 Univ Texas Antisense antibacterial compounds and methods
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
CN114681621B (zh) 2015-05-19 2024-08-06 萨勒普塔医疗公司 肽寡核苷酸缀合物
US10849917B2 (en) 2015-06-01 2020-12-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type VII collagen
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
CN108350005B (zh) * 2015-08-05 2024-02-06 卫材R&D管理有限公司 用于制备均一低聚物的手性试剂
WO2017062835A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
JP2018538302A (ja) * 2015-12-15 2018-12-27 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ペプチドオリゴヌクレオチド複合体
JP7393121B2 (ja) 2015-12-23 2023-12-06 オレゴン ステイト ユニバーシティー アンチセンス抗菌化合物および方法
US10907158B2 (en) 2015-12-23 2021-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Antisense antibacterial compounds and methods
MY200252A (en) 2016-04-18 2023-12-16 Sarepta Therapeutics Inc Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
WO2017190041A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues targeting human lmna
MX383656B (es) 2016-05-24 2025-03-14 Sarepta Therapeutics Inc Procesos para preparar oligómeros de morfolino fosforodiamidato.
CA3024178A1 (en) 2016-05-24 2017-12-14 Sarepta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical composition comprising eteplirsen
US11472824B2 (en) 2016-05-24 2022-10-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
SG10202101830WA (en) 2016-05-24 2021-04-29 Sarepta Therapeutics Inc Processes for preparing oligomers
SG10202101834QA (en) 2016-05-24 2021-04-29 Sarepta Therapeutics Inc Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
IL263044B2 (en) 2016-05-24 2024-06-01 Sarepta Therapeutics Inc Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
CN109152792B (zh) 2016-06-30 2021-09-14 萨勒普塔医疗公司 制备磷酸二酰胺吗啉代寡聚物的方法
WO2018057430A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Synthesis of backbone modified morpholino oligonucleotides and chimeras using phosphoramidite chemistry
CN110536694A (zh) 2017-04-20 2019-12-03 Atyr 医药公司 用于治疗肺部炎症的组合物和方法
MA49986A (fr) 2017-09-25 2020-07-01 Massachusetts Inst Technology Procédés de préparation d'oligomères morpholino phosphorodiamidate par l'intermédiaire d'une synthèse à flux rapide
WO2019079637A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERIC COMPOUNDS
KR102898787B1 (ko) 2018-05-10 2025-12-11 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 올리고 핵산 화합물의 제조 방법
WO2021025899A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer pharmaceutical compositions
EP4059943A4 (en) 2019-11-13 2024-01-31 Nippon Shinyaku Co., Ltd. METHOD FOR PRODUCING OLIGONUCLEIC ACID COMPOUND
JP7689078B2 (ja) 2019-11-13 2025-06-05 日本新薬株式会社 オリゴ核酸化合物の製造方法
WO2022006871A1 (en) * 2020-07-10 2022-01-13 Changzhou Syntheall Pharmaceuticals Co., Ltd. Processes for preparing oligonucleotides
JP7825613B2 (ja) * 2021-04-28 2026-03-06 日本新薬株式会社 オリゴ核酸化合物の製造方法
CA3216839A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
US12378267B2 (en) 2021-06-17 2025-08-05 Entrada Therapeutics, Inc. Synthesis of FMOC-protected morpholino monomers and oligomers
WO2023070086A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Morpholino oligomers for treatment of peripheral myelin protein 22 related diseases
KR20240129006A (ko) * 2021-12-27 2024-08-27 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 올리고 핵산 화합물의 제조 방법
IL315344A (en) * 2022-03-01 2024-10-01 Eisai R&D Man Co Ltd Bis-protected, activated guanine monomers
JP2025509438A (ja) 2022-03-17 2025-04-11 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーコンジュゲート
WO2023205451A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Entrada Therapeutics, Inc. Cyclic peptides for delivering therapeutics
JP2025533454A (ja) 2022-09-21 2025-10-07 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｍｄアンチセンスオリゴヌクレオチド介在性エクソンスキッピング効率

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0962463B1 (en) 1989-12-20 2002-07-10 Antivirals Inc. Uncharged morpholino-based polymers having phosphorus-containing chiral intersubunit linkages
JP2005255530A (ja) 2004-03-09 2005-09-22 Japan Science & Technology Agency ２−チオウリジン誘導体
ES2645410T3 (es) * 2006-05-10 2017-12-05 Sarepta Therapeutics, Inc. Análogos de oligonucleótidos que tienen enlaces intersubunitarios catiónicos
US8076476B2 (en) * 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
DK2207779T3 (da) * 2007-11-15 2014-07-14 Sarepta Therapeutics Inc Fremgangsmåde til syntese af morpholinooligomerer

Also Published As

Publication number Publication date
EP2623507A4 (en) 2014-03-19
US8969551B2 (en) 2015-03-03
CN103154009A (zh) 2013-06-12
CY1118435T1 (el) 2017-06-28
EP2623507A1 (en) 2013-08-07
SMT201700038T1 (it) 2017-03-08
US20130197220A1 (en) 2013-08-01
CA2813183C (en) 2017-09-19
PL2623507T3 (pl) 2017-03-31
JPWO2012043730A1 (ja) 2014-02-24
CA2813183A1 (en) 2012-04-05
CN103154009B (zh) 2015-06-10
DK2623507T3 (da) 2017-01-02
ES2607603T3 (es) 2017-04-03
SMT201700038B (it) 2017-03-08
WO2012043730A1 (ja) 2012-04-05
KR101764462B1 (ko) 2017-08-02
LT2623507T (lt) 2017-01-25
SI2623507T1 (sl) 2017-04-26
HRP20170028T1 (hr) 2017-03-24
HUE030292T2 (en) 2017-04-28
JP5831455B2 (ja) 2015-12-09
KR20130143045A (ko) 2013-12-30
EP2623507B1 (en) 2016-11-02
PT2623507T (pt) 2016-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2623507B1 (en) Morpholino nucleic acid derivative
AU2015266481B2 (en) Dihydropyrimido fused ring derivative as HBV inhibitor
US6028183A (en) Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
US20130123482A1 (en) Nucleotide and/or oligonucleotide and preparation process thereof
US20200291056A1 (en) Acyl-protected l-lna-guanosine l-monomers
EP4039690A1 (en) A substantially diastereomerically pure phosphoramidochloridate, a method and a pharmaceutical composition
JP6853265B2 (ja) 核酸に組み込むための５−（ｎ−保護−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイトの化合物及び合成方法
UA127737C2 (uk) Модифіковані нуклеозидні фосфорамідити
US20170313735A1 (en) Improved Fluorination Process
WO1997035868A1 (en) Urea nucleosides as therapeutic and diagnostic agents
US10160779B2 (en) Synthesis of phosphoramidates
WO1997035868A9 (en) Urea nucleosides as therapeutic and diagnostic agents
JP5137118B2 (ja) ユニバーサル塩基
EP3885351A2 (en) Polymerizable compound, compound, and method for producing boranophosphate oligomer
Kocalka et al. Synthesis of racemic and enantiomeric 3-pyrrolidinyl derivatives of purine and pyrimidine nucleobases
HK40069732A (en) A substantially diastereomerically pure phosphoramidochloridate, a method and a pharmaceutical composition
WO2022256490A2 (en) Improved synthesis of phosphoramidates for the treatment of hepatitis b virus
JP2006052148A (ja) ヌクレオシド誘導体
PL194162B1 (pl) Sposób otrzymywania 2-chloro-2&#39;-dezoksyadenozyny
JPH059182A (ja) 新規なシクロブタン誘導体