RS56302B1 - Generisanje vezujućih molekula - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Sposobnost sisarskog imunog odgovora da generiše veliki i raznovrstan repertoar antitela kao odgovor na antigen je korišćena za opseg primena u dijagnostici, terapiji i osnovnom istraživanju. Naročito, monoklonska antitela, proizvodi jednog klona B ćelije, široko su korišćeni zbog njihove dobro definisane specifičnosti i lakoće proizvodnje. Tipično, monoklonska antitela ili genetička informacija koja kodira monoklonska antitela sa željenim specifičnostima su dobijeni iz B ćelija životinja ili ljudi koji su imunizovani sa antigenom ili inficirani patogenom. Alternativno, monoklonska antitela mogu biti dobijena pomoću jednog od nekoliko postupaka na bazi rekombinantne-DNK za konstrukciju i skrining biblioteka antitela ili fragmenata antitela eksprimiranih na površini bakteriofaga ili eukariotskih ćelija, ili iz in silica pristupa.

[0002] Monoklonska antitela nalaze rastuću upotrebu u ljudskoj terapiji za lečenje različitih bolesti, uključujući na primer hronične inflamatorne bolesti i kancer. Imunogenost ksenogenih monoklonskih antitela ograničava njihovu upotrebu u terapiji ljudske bolesti. Izlaganje pacijenata ksenogenim antitelima često rezultira u štetnim efektima ili može dovesti do neutralizacije i klirensa primenjenog antitela, na taj način smanjujući njegovu farmakološku efikasnost (Clark, 2000). Primena humanizovanih ili potpuno humanih monoklonskih antitela na pacijente obično smanjuje gore navedene komplikacije, naročito kada aminokiselinske sekvence antitela ne sadrže epitope koji stimulišu T ćelije. Antitela kodirana od strane nemutiranih, V genskih segmenata teškog i lakog lanca humane klicine linije koji sadrže CDR3 regione bez T ćelijskih epitopa predstavljaju krajnje primere proteinskih lekova sa niskom imunogenošću (Ruuls et al., 2008; Harding et al., 2010). Tako, za terapeutske primene, monoklonska antitela su poželjno potpuno humana, ne-mutirana i sadrže nekoliko ili ne sadrže T ćelijske epitope za sprečavanje formiranja antitela protiv leka.

[0003] B ćelije iz krvi ili limfoidnih organa ljudi su korišćene kao izvor terapeutskih monoklonskih antitela. Od otkrića tehnologije hibridoma za imortalizaciju mišjih B ćelija (Kohler et al., 1975) i razumevanja da se ova tehnologija ne bi mogla jednostavno da se replicira upotrebom humanih B ćelija, razvijeno je nekoliko alternativnih postupaka za generisanje humanih monoklonskih antitela. Takvi postupci obuhvataju transformaciju B ćelija preko infekcije virusom Epstein-Barr (Tragiai et al., 2004), kratkotrajnu aktivaciju i širenje humanih B ćelija stimulacijom sa kombinacijama stimulatornih ćelija, antitela i citokina (Zubler 1987/ Banchereau et al., 1991/Kim et al., 2001/ Good et al., 2006/Ettinger et al., 2005) ili transfer gena posredovan preko retrovirusa (Kwakkenbos et al., 2010), kloniranje V gena antitela iz pojedinačnih humanih B ćelija pomoću PCR-a (Wrammert et al., 2010/Meijer et al., 2006), i identifikaciju i selekciju antigen-specifičnih B ćelija koje izlučuju antitelo pomoću hemolitičkih analiza plakova (Babcook et al., 1996). Tehnike imortalizacije ili aktivacije humane B ćelije su kompatibilne sa samo nekim stadijumima sazrevanja B ćelije i pored toga, zbog njihovih niskih efikasnosti (samo 1-3% od B ćelija) nisu pogodne za efikasno ispitivanje celog repertoara specifičnih antitela generisanih u toku humanog imunog odgovora za antitela sa željenim karakteristikama (Reddy et al., 2011).

[0004] Kloniranje pojedinačne ćelije, postupak u kome su pojedinačne humane B ćelije zasejane u mikrotitarske ploče za analizu, korišćeno je za zaobilaženje niskih efikasnosti povezanih sa postupcima koji zahtevaju aktivaciju i/ili imortalizaciju B ćelije radi dobijanja humanih monoklonskih antitela. U ovom pristupu, RNK iz pojedinačnih B ćelija je korišćena za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (VH, VL) antitela pomoću PCR-a. VH i VL geni su zatim inserirani u pogodne ekspresione vektore za transfekciju u ćelijske linije i kasniju proizvodnju rekombinantnih fragmenata antitela ili IgG pune dužine (Smith et al., 2009/Tiller et al., 2008). Alternativno, amplifikovani VH i VL geni mogu biti direktno korišćeni za in vitro transkripciju i translaciju za generisanje manjih količina antitela dovoljnih za analizu vezivanja, ali ne za procenu funkcionalne aktivnosti (Jiang et. al., 2006). Upotrebom ovih postupaka, proizvodnja rekombinantnih monoklonskih antitela nije ograničena na posebne B ćelijske populacije i ne zavisi od ranije stimulacije ili imortalizacije. Glavni izazov u ovom pristupu je specifična amplifikacija gena antitela pomoću RT-PCR od pojedinačnih ćelija i pojava unakrsne-kontaminacije u toku rukovanja velikim brojem PCR reakcija. Sledeće praktično ograničenje je broj pojedinačnih B ćelija kojim se može rukovati, koji je tipično ograničen na nekoliko hiljada, sprečavajući obimno uzorkovanje celog repertoara antitela generisanog u toku imunog odgovora. Konačno, postupak je ograničen na analizu lako dostupnih humanih B ćelija kao što su one poreklom iz krvi i koštane srži.

[0005] Humana monoklonska antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteka rekombinantnih antitela u laboratoriji, upotrebom jedne od platformi za selekciju koja u suštini imitira in vivo odgovor antitela (Hoogenboom, 2005). Na primer, tehnologije prikaza koriste velike kolekcije kloniranih varijabilnih regiona antitela eksprimiranih na površini fagnih čestica, bakterija, eukariotskih ćelija ili ribozoma za izbor antitela koji se vezuju za antigene od interesa (Ponsel et al., 2011/Clackson et al., 1991/ Boder et al., 1997/ Fuchs et al., 1991/Lee et al., 2007/Chao et al., 2006). VH i VL regioni inserirani u ove sisteme prikaza su kombinovani po slučajnom izboru tako da formiraju kolekcije vezujućih mesta antitela, tj. fragmenata intaktnih IgG antitela, koji zahtevaju ispravno savijanje u 3D strukturu i sklapanje u npr. prokariotskim ćelijama za dobijanje pomoću antigen-vezujućih postupaka. Postupci prikaza ne dozvoljavaju dobijanje antitela iz biblioteka preko funkcionalnog skrininga. U pristupima prikaza, originalno sparivanje teških lakih lanaca je ukinuto i, pored toga, DNK koja kodira antitelo je izgubljena kao rezultat upotrebe restrikcionih enzima u toku postupka kloniranja. Uspeh u dobijanju željenih specifičnosti antitela sa in vitro tehnikama otkrića antitela zavisi ne samo od uspešnog savijanja u 3D strukturu i ekspresije rekombinantnih fragmenata antitela u npr. prokariotskim ćelijama, već takođe od opsega parametara skrininga korišćenih u toku selekcije antitela. Oni obuhvataju prirodu platforme prikaza, koncentraciju antigena, aviditet vezivanja u toku obogaćenja, broj rundi selekcije, i dizajn i raznovrsnost biblioteka antitela (Hoogenboom 2005/Cobaugh et al., 2008/Persson et al., 2006). Na taj način, zahvaljujući eksperimentalnim postupcima, zahtevima vezanim za savijanje u 3D strukturu radi ekspresije fragmenata antitela u prokariotskim ćelijama i parametrima koji utiču na uspeh dobijanja antitela u toku selekcija, sistemi prikaza ne dozvoljavaju obimno duboko sekvenciranje repertoara antitela i ne omogućavaju direktan funkcionalni skrining humanih antitela. Zaista, antigen-specifični fragmenti antitela mogu biti izgubljeni u toku kasnijih rundi selekcije antigena biblioteka fagnog prikaza (Ravn et al., 2010).

[0006] Transgeni miševi koji sadrže kolekcije gena humanih antitela su konstruisani tako da ublažavaju neka od ograničenja povezanih sa upotrebom humanih B ćelija kao početnog materijala za generisanje humanih monoklonskih antitela (Lonberg 2005). Takvi miševi mogu biti imunizovani sa bilo kojim antigenom i njihovi limfoidni organi su lako dostupni za sakupljanje B ćelija. Pošto je transgeni miš imunizovan, monoklonska antitela mogu biti dobijena preko tradicionalnog generisanja hibridoma, pomoću tehnologija prikaza ili upotrebom pristupa koji obuhvataju sakupljanje, zasejavanje i skrining B ćelija, nakon čega sledi izolacija mAb gena i kloniranje u proizvodne ćelijske linije.

[0007] Za generisanje hibridoma, B ćelije iz mišjih limfoidnih organa su sakupljene i fuzionisane sa ćelijama mijeloma da bi se formirale imortalizovane monoklonske ćelijske linije koje izlučuju antitelo. Niska efikasnost ćelijske fuzije u formiranju hibridoma dozvoljava ispitivanje samo frakcije repertoara antitela i ograničena je na B ćelijske populacije koje su podložne fuziji. Ako nije formiran zadovoljavajući hibridom, postaje teško dobiti antitelo protiv izlagajućeg antigena kao što su membranski proteini. Na taj način, povećanje broja hibridoma je krucijalno značajan korak u skriningu repertoara antigen-specifičnih B ćelija iz imunizovanih miševa i dobijanje monoklonskih antitela sa visokim afinitetom, specifičnošću i željenom funkcionalnom aktivnošću (Kato et al., 2011/ Li et. al., 1994; Crowe, 2009). U najefikasnijim fuzionim protokolima koji uključuju pre-stimulaciju B ćelija i elektrofuziju, približno 1 u 1000 B ćelija se uspešno fuzioniše sa ćelijom mijeloma tako da postaje hibridom koji izlučuje antitelo (Kato et. al., 2011). Tehnologija hibridoma i drugi postupci imortalizacije B ćelija ispituju ćelije koje proizvode antitela u pre-plazma B ćelijskim populacijama, naročito u memorijskim B ćelijama, ili u cirkulišućim blastima plazme kratkog veka (Wrammert et al., 2008).

[0008] B ćelije iz imunizovanih transgenih miševa sa genima za humano antitelo mogu biti korišćene za dobijanje kolekcija VH i VL regiona koji su kombinovani po slučajnom izboru tako da se formiraju kombinatorne biblioteke prikaza fragmenata humanog antitela. Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, zahvaljujući eksperimentalnim postupcima, zahtevima za savijanje u 3D strukturu za ekspresiju fragmenata antitela u prokariotskim ćelijama i parametrima koji utiču na uspeh dobijanja antitela u toku selekcija, sistemi prikaza ne dozvoljavaju obimno duboko sekvenciranje repertoara antitela i ne dozvoljavaju direktan funkcionalni skrining humanih monoklonskih antitela. Sekvenciranje visoke propustljivosti je korišćeno za sekvenciranje repertoara antitela poreklom od plazma ćelija koštane srži miševa imunizovanih proteinom (Reddy et al., 2010). Nađeno je da u prečišćenoj populaciji plazma ćelija, repertoari VH i VL su visoko polarizovani sa najčešćim sekvencama koje predstavljaju 1-10% celog repertoara (Reddy et al., 2010). Najčešći VH i VL geni su spareni po slučajnom izboru, eksprimirani kao IgG molekuli i skriningovani za vezivanje za imunizujući antigen. Nedostatak sparivanja po slučajnom izboru je taj što je nađeno da se samo 4 % tako generisanih antitela vezuje za imunizujući antigen. Ova antitela imala su niske afinitete i/ili slabe nivoe ekspresije i agregacija je često beležena. Niska proporcija specifičnih antitela bi mogla biti poboljšana sparivanjem VH i VL gena na bazi njihove relativne učestalosti u kolekciji sekvenci. U tom slučaju, posle rekombinantne ekspresije, nađeno je da se približno 75% antitela vezuje za antigen (Reddy et al., 2010). Nedostatak VH/VL sparivanja prema relativnim učestalostima je taj da kolekcije V-gena dobijenih pomoću sekvenciranja visoke propustljivosti mogu da sadrže VH i VL sekvence koje su prisutne u sličnim učestalostima su poreklom od različitih B ćelijskih klonova i na taj način ne moraju da predstavljaju prirodni par i ne moraju da formiraju funkcionalni molekul antitela. Sparivanje VH i VL regiona na bazi učestalosti je prema tome netačno i može dovesti do generisanja i skrininga mnogih antitela koja imaju neusklađene VH/VL parove koji kodiraju antitela sa niskim afinitetom ili antitela koja se ne vezuju za ciljno mesto od interesa. Zaista, pokazano je da VH/VL sparivanje na bazi relativnih učestalosti proizvodi visoku proporciju antitela sa umerenim do niskim afinitetom (Reddy et al., 2010). Ovo ukazuje na to da sparivanje VH/VL na bazi visoke učestalosti VH i VL gena prisutno u velikim kolekcijama sekvenci nije prediktivno za generisanje visoko afinitetnih antitela. Na taj način, takav pristup proizvodi samo mali broj VH/VL kombinacija koje kodiraju antigen-specifična antitela za koja je generalno nađeno da imaju niske afinitete (Reddy et al., 2010).

[0009] Dodatni nedostatak postupka objavljenog od strane Reddy et al. je taj što se on oslanja na plazma ćelije kao izvor antigen-specifičnih monoklonskih antitela. Plazma ćelije predstavljaju samo malu pod-populaciju ćelija B-linije koje doprinose raznovrsnosti antitela generisanoj u toku imunog odgovora. Kao rezultat, antigen-specifična antitela proizvedena pomoću drugih B ćelijskih populacija u toku imunog odgovora nisu dobijena. Ove populacije obuhvataju kratkovečne plazma ćelije, prelazne B ćelije, B ćelije germinalnog centra i IgM i IgG memorijske B ćelije prisutne u limfoidnim organima. Prilikom poređenja repertoara antitela u ovim različitim B ćelijskim populacijama, zabeležene su značajne promene (Wu, et al., 2010) koje ukazuju na to da je širi repertoar antitela uhvaćen kada je više B ćelijskih populacija uključeno kao izvor za VH/VL u dubokom sekvenciranju.

[0010] Na bazi gore navedenog, može se zaključiti da postoji potreba za generisanjem antitela i pristupima selekcije koji olakšavaju ispitivanje celih repertoara antitela za antitela kodirana originalnim VH/VL parovima sa željenim vezujućim karakteristikama i funkcionalnim aktivnostima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0011]

Slika 1 prikazuje 4 mišja CH1 reverzna prajmera i njihov položaj unutar CH1 regiona je istaknut (1) Mišji CH1rev0; (2) CH1rev1; (3) CH1rev2; (4) CH1rev3.

Slika 2 prikazuje amplifikaciju VH sa „forward“ prajmerom DO_1177 i različitim CH1 reverznim prajmerima. Traka 1: DO_1171; traka 2: DO_1172; traka 3: DO_1173; traka 4: DO_1174; traka 5: negativna kontrola.

Slika 3 je grafikon koji prikazuje pronalazan imuni odgovor protiv Fc dela Fc-EGFR fuzionog proteina posle imunizacije.

Slika 4 prikazuje ErbB2 specifičan titar IgG u serumu kod ErbB2 vakcinisanih miševa.

Slika 5 prikazuje HA specifičan titar IgG u serumu kod HA vakcinisanih miševa.

Slika 6 prikazuje relativan afinitet anti-ErbB2 IgG poliklonskih seruma ErbB2 vakcinisanih miševa kao što je određen pomoću ELISA.

Slika 7 je grafikon koji pokazuje poređenje procenata IgG B ćelija prema ukupnom broju iLN B ćelija po strategiji vakcinacije i po antigenu.

Slika 8 prikazuje nativnu SDS-PAGE analizu proteinom A prečišćenog preparata humanog bispecifičnog antitela sa jednim VL. MW: molekulska težina. Traka 1, anti-tiroglobulin x antifibrinogen bispecifičan.

Slika 9 prikazuje nativnu masenu spektrometrijsku analizu proteinom A prečišćenog humanog bispecifičnog antitela sa jednim VL za fibrinogen i tiroglobulin proizveden ko-transfekcijom HEK293 ćelija. Glavni pik od 144352 Da je heterodimerna bispecifična IgG vrsta (96% od ukupnog IgG), dok su manji pikovi od 144028 Da (3% od ukupnog IgG) i 142638 Da (1% od ukupnog IgG) homodimerne roditeljske IgG vrste.

Slika 10 je grafikon koji prikazuje potenciju EGFR-specifičnih mAb za spašavanje A431 ćelija od EGF-indukovane ćelijske smrti.

REZIME PRONALASKA

[0012] Da rekapituliramo, za selekciju i skrining celog repertoara antitela proizvedenih u toku imunog odgovora neophodno je koristiti tehnike koje omogućavaju efikasno dobijanje antigenom-vođenih, klonalno proširenih B ćelija različitih fenotipa i pod-populacija i/ili genetičke informacije koja kodira odgovarajuća antitela kao originalne VH/VL parove. Predmetni pronalazak daje postupak za efikasno i sveobuhvatno ispitivanje širokog spektra antitela generisanih pomoću B ćelijskih populacija. Poželjno, ove raznovrsne B ćelijske populacije su dobijene od transgenih životinja, npr. miševa, koji sadrže gene za humano antitelo radi olakšavanja imunizacije sa bilo kojim željenim antigenom i generišu antitela za terapeutsku primenu kod ljudi. Ovi transgeni miševi imaju ograničeni repertoar VL, poželjno pojedinačan humani preuređeni VL. Ovaj postupak je nezavistan od postupaka imortalizacije ili inaktivacije B ćelija, olakšava skrining repertoara antitela iz B ćelija dobijenih od uglavnom svih limfoidnih organa i ne zahteva analize pojedinačnih B ćelija. Poželjno, da bi se efikasno duboko sekvencirao ceo repertoar antitela generisan u toku imunog odgovora, B ćelije iz svakog stadijuma diferencijacije i linije i prisutne u relevantnim limfoidnim organima kao što su limfni čvorovi, slezina i krv su analizirani za prisustvo monoklonskih antitela željene specifičnosti i karakeristika kao što su afinitet i funkcionalna aktivnost. Postupak može na taj način da se odnosi na celu populaciju B ćelija u limfoidnim organima ili se fokusira na B ćelijske pod-populacije koje se mogu razlikovati na bazi fenotipskih karakteristika kao što su prelazne B ćelije, memorijske B ćelije, plazma ćelije kratkog veka i slično. Pored toga, postupak omogućava direktan skrining antitela za karakteristike vezivanja kao i funkcionalnu aktivnost u relevantnom formatu antitela koji je reprezentativan za eventualnu primenu u ljudskoj terapiji. Pronalazak dalje obezbeđuje postupke i sredstva za proizvodnju ovih izabranih antitela u željenim formatima kao i ova antitela i njihove upotrebe. Ove upotrebe obuhvataju nizove kao i farmaceutske proizvode.

PRIMERI IZVOĐENJA

[0013] Pronalazak daje postupak prema patentnim zahtevima za proizvodnju definisane populacije vezujućih molekula, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje sledeće korake: a) obezbeđivanje populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL, pri čemu uglavnom sve od navedenih B ćelija nose najmanje jedan VL, b) dobijanje nukleinskih kiselina (RNK ili DNK) iz navedenih B ćelija, c) izborno, amplifikaciju sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina u navedenom uzorku, d) najmanje delimično sekvenciranje svih dobijenih nukleinskih kiselina iz koraka b) ili proizvoda amplifikacije iz koraka c), e) izvođenje analize učestalosti sekvenci iz koraka d), f) selekciju željenih VH sekvenci, g) obezbeđivanje ćelija domaćina sa najmanje jednim vektorom koji sadrži najmanje jednu od željenih VH sekvenci i/ili najmanje jednu VL sekvencu navedenog ograničenog VL repertoara, h) kultivisanje navedenih ćelija domaćina i omogućavanje ekspresije VH i/ili VL polipeptida, i) dobijanje navedenih vezujućih molekula. Alternativno, korak c) i d) mogu biti zamenjeni ili dopunjeni alternativnim koracima c’ i d’: c’) konstrukcija cDNK biblioteke koja je skriningovana za specifične DNK sekvence VH regiona testiranjem sa probom nukleinske kiselinske specifičnom za sekvence VH regiona i d’) najmanje delimično sekvenciranje klonova koji sadrže VH inserte. Tamo gde je naveden VH ili VL, takođe su obuhvaćeni njihovi funkcionalni derivati i/ili fragmenti.

[0014] Termin „dobijanje nukleinskih kiselina" kao što je korišćeno u koraku b) ovde obuhvata bilo koje postupke za dobijanje sekvence nukleotida nukleinskih kiselina koje kodiraju VH sekvence.

[0015] Termin ’definisana populacija vezujućih molekula’ kao što je ovde korišćen označava najmanje dva antitela koja se vezuju za najmanje jedan izabrani antigen ili epitop od interesa. Poželjno, definisana populacija vezujućih molekula sadrži najmanje značajni deo, poželjno najmanje većinu i najpoželjnije uglavnom sve specifične vezujuće molekule usmerene protiv antigena ili epitopa od interesa generisane u toku imunog odgovora. Poželjnije populacija vezujućih molekula sadrži između stotinu i nekoliko hiljada vezujućih molekula, što predstavlja značajan deo jedinstvenih antigen-specifičnih antitela prisutnih u, npr., mišu imunizovanom sa navedenim antigenom. Populacija vezujućih molekula prema predmetnom pronalasku može imati različite specifičnosti i/ili afinitete; tj. može se vezivati za različite epitope izabranog antigena ili se može vezivati za isti epitop sa različitim afinitetima. Termin ’antitelo’ kao što je ovde korišćen označava protein koji sadrži jedan ili više domena koji vezuju epitop na antigenu, gde su takvi domeni poreklom od ili dele homologiju sekvenci sa varijabilnim regionom antitela. Antitela su poznata u stanju tehnike i obuhvataju nekoliko izotipova, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE i IgM. Antitelo prema pronalasku može biti bilo koje od ovih izotipova, ili njihov funkcionalni derivat i/ili fragment. Primeri antitela prema pronalasku obuhvataju antitela pune dužine, fragmente antitela, bispecifična antitela, imunokonjugate i slično. Fragmenti antitela obuhvataju Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2fragmente i slično. Antitela prema pronalasku mogu biti bilo kog porekla, uključujući mišja, više od jednog izvora porekla, tj. himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela. Tamo gde je korišćen termin funkcionalni fragment i/ili derivat u ovoj specifikaciji namera je da označava da je najmanje jedna od funkcija, poželjno karakterizujućih funkcija originalnog molekula zadržana (po vrsti ne neophodno u količini). Vezivanje antitela je definisano prema specifičnosti i afinitetu. Specifičnost određuje koji antigen ili njegov epitop je vezan vezujućim domenom. Afinitet je mera za jačinu vezivanja za određeni antigen ili epitop. Specifično vezivanje je definisano kao vezivanje sa afinitetima (KD) od najmanje 1x10<-5>M, poželjnije 1x10<-7>M, poželjnije više od 1x10<-9>M. Tipično, monoklonska antitela za terapeutsku primenu mogu imati afinitete do 1x10<-10>M ili čak više.

[0016] Termin ’antigen’ kao što je ovde korišćen označava supstancu ili molekul koji, kada je uveden u telo, pokreće proizvodnju antitela od strane imunog sistema. Antigen, pored ostalih, može biti poreklom od patogenih organizama, ćelija tumora ili drugih aberantnih ćelija, od haptena, ili čak od auto-struktura. Na molekularnom nivou, antigen je okarakterisan njegovom sposobnošću da je "vezan" pomoću antigen-vezujućeg mesta antitela. U određenim aspektima predmetnog pronalaska takođe smeše antigena mogu biti smatrane ’antigenom’. Antigen će sadržati najmanje jedan epitop. Termin ’epitop’ kao što je ovde korišćen označava deo antigena koji je prepoznat od strane imunog sistema, specifično od strane antitela, B ćelija ili T ćelija. Iako se obično smatra da su epitopi poreklom od ne-auto proteina, sekvence poreklom od domaćina koje mogu biti prepoznate su takođe klasifikovane kao epitopi/antigeni.

[0017] ’Populacija B ćelija’ kao što je ovde korišćena može biti bilo koja kolekcija B ćelija. B ćelije mogu biti prisutne kao pod-populacija drugih ćelija u uzorku. Ona može biti poreklom od jedne ili više individua iz iste ili različitih vrsta. Termin ’populacija B ćelija’ označava grupu B ćelija dobijenu od najmanje jedne životinje. U poželjnom primeru izvođenja, populacija B ćelija sadrži uglavnom sve B ćelije slezine. U poželjnijem primeru izvođenja, populacija dalje sadrži takođe uglavnom sve B ćelije dobijene iz najmanje jednog limfnog čvora. Populacija B ćelija sadrži B ćelije dobijene iz slezine i/ili najmanje jednog limfnog čvora. U naročito poželjnom primeru izvođenja, populacija B ćelija sadrži uglavnom sve B ćelije dobijene iz jednog ili više limfoidnih organa koji sadrže B ćelije koje su klonalno proširene kao rezultat stimulacije antigenom. Postupci za dobijanje takvih B ćelijskih populacija su poznati u stanju tehnike. Od ove populacije B ćelija, uglavnom sve B ćelije nose najmanje jedan VL. Uglavnom sve B ćelije u populaciji B ćelija eksprimiraju ograničeni repertoar VL. U najpoželjnijem primeru izvođenja, uglavnom sve B ćelije u populaciji B ćelija nose isti VL.

[0018] Termin ’ograničeni repertoar VL’ koji je ovde korišćen označava ograničenu kohortu VL regiona koja podržava generisanje snažnog imunog odgovora posle imunizacije i omogućava efikasno sklapanje originalnih VH/VL parova sa VH regionima identifikovanim preko konstrukcije toplotnih mapa CDR3 teškog lanca. Ograničeni repertoar VL ne sadrži više od 10, poželjnije ne više od 3 ili 2 različita VL regiona, na taj način dalje ogranićavajući broj različitih VH/VL kombinacija i povećavajući učestalost originalnih VH/VL parova. U najpoželjnijem primeru izvođenja, ograničeni repertoar VL ne sadrži više od jednog VL regiona. Prednost jednog VL je ta što sva antitela koja su generisana posle susreta sa antigenom dele isti VL i razlikuju se samo u upotrebi VH. VL je definisan određenom kombinacijom V i J genskih segmenata klicine linije i CDR3 regionom i obuhvata somatski mutirane varijante navedenog VL. Na taj način, populacija B ćelija koje eksprimiraju ograničeni repertoar VL može da označava da je eksprimirano manje od 10, ili 3 ili 2 VL ili najpoželjnije jedan VL. U poželjnom primeru izvođenja, svi VL u ograničenom repertoaru VL su otporni na preuređenja DNK i/ili somatske hipermutacije, poželjno, VL ima sekvencu klicine linije. Poželjna sekvenca klicine linije je varijabilni region lakog lanca koji je često korišćen u humanom repertoaru i ima bolju sposobnost da se sparuje sa mnogim različitim VH regionima, i ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. Najpoželjniji laki lanac klicine linije je 012, poželjno preuređeni kapa laki lanac klicine linije IgVK1-39*01/IGJK1*01 (nomenklatura prema IMGT bazi podataka http://www.imgt.org) ili njegov fragment ili funkcionalni derivat. Takav pojedinačan VL je takođe označen kao zajednički VL, ili zajednički laki lanac. Očigledno, stručnjaci iz date oblasti tehnike će razmeti da se "zajednički" takođe odnosi na funkcionalne ekvivalente lakog lanca čija aminokiselinska sekvenca nije identična. Postoje mnoge varijante navedenog lakog lanca u kojima su prisutne mutacije (delecije, supstitucije, adicije) koje ne utiču materijalno na formiranje funkcionalnih vezujućih regiona. "Zajednički laki lanac" prema pronalasku označava lake lance koji mogu biti identični ili imaju izvesne razlike u aminokiselinskoj sekvenci uz zadržavanje vezujuće specifičnosti antitela. Na primer, moguće je unutar obima definicije opštih lakih lanaca kao što je ovde korišćena, pripremiti ili naći lake lance koji nisu identični, ali i dalje funkcionalno ekvivalenti, npr. uvođenjem i testiranjem konzervativnih aminokiselinskih promena, promena aminokiselina u regionima koji ne doprinose ili samo delimično doprinose vezujućoj specifičnosti kada su spareni sa teškim lancem, i slično. Aspekt predmetnog pronalaska je upotreba jednog VL jednog identičnog lakog lanca koji može da se kombinuje sa različitim teškim lancima tako da formira antitela sa funkcionalnim antigen-vezujućim domenima (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al., 1998, Nissim et al., 1994).

[0019] Termini ’amplifikacija sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina’ i ’(najmanje delimično) sekvenciranje nukleinskih kiselina’ imaju njihova uobičajena značenja u stanju tehnike.

[0020] Termin ’analiza učestalosti’ ima svoje uobičajeno značenje u stanju tehnike. Za detaljnije objašnjenje termina, videti npr. primer 1 predmetnog pronalaska.

[0021] Termin ’željene VH sekvence’ označava one VH sekvence koje, na bazi analize učestalosti, su proizvedene kao odgovor na izlaganje antigenu. Pretpostavlja se da one kodiraju VH regione koje su specifični za navedeni antigen. Tipično, imuni odgovor na antigen kod miša obuhvata aktivaciju oko 100 različitih B ćelijskih klonova (Poulsen et al., J Immunol 2011; 187; 4229-4235). Prema tome, najpoželjnije je izabrati 100 najčešćih klonova. Naročito, izabrano je najmanje 20, poželjno oko 50 čestih klonova.

[0022] ’Ćelije domaćini’ prema pronalasku mogu biti bilo koja ćelija domaćin sposobna da eksprimira rekombinantne DNK molekule, uključujući baktrije, kvasac, biljne ćelije, eukariote, poželjno sisarske ćelije. Naročito kada su poželjni veći formati antitela, bakterijske ćelije nisu pogodne i poželjne su sisarske ćelije. Pogodne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju molekula antitela su poznate u stanju tehnike.

[0023] Aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema pronalasku kao što je opisan u prethodnom tekstu, koji dodatno sadrži uzimanje uzorka navedenih kultivisanih ćelija, pri čemu uzorak sadrži najmanje jedno od navedenih antitela, i podvrgavanje uzoraka najmanje jednoj funkcionalnoj analizi, i izbor najmanje jedne ćelije koja eksprimira vezujući molekul sa željenim karakteristikama.

[0024] ’Funkcionalna analiza’ kao što je ovde korišćena označava test za ustanovljavanje osobina kao što su vezujuća specifičnost, afinitet, neutralizujuća aktivnost, ubijanje ćelija tumora, inhibicija proliferacije ili bilo koja druga željena funkcionalna karakteristika ili aktivnost vezujućeg molekula proizvedenog prema postupcima prema pronalasku. Takve analize su korišćene za rano određivanje da li su dobijena antitela pogodna za željenu namenu. Navedena željena namena može biti dijagnostička i/ili terapeutska primena. U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, postupak prema patentnim zahtevima dodatno sadrži korak sakupljanja supernatanata kultivisanih ćelija, supernatanata koji sadrže navedena antitela, i podvrgavanje supernatanata najmanje jednoj funkcionalnoj analizi. Bez obzira na funkcionalnu analizu kao što je opisana u prethodnom tekstu, predmetni pronalazak takođe sadrži načine za određivanje identiteta antitela, upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike.

[0025] Aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema pronalasku kao što je opisan u prethodnom tekstu, koji dodatno sadrži obezbeđivanje navedene ćelije domaćina sa sredstvima ekspresije navedenog najmanje jednog VH i VL u formatu imunoglobulina. Tipični formati imunoglobulina i molekula sličnih antitelu koji su pogodni za određene namene su dobro poznati u stanju tehnike. Za terapiju ovi molekuli bi tipično bili potpuno humani monoklonski (mono- ili bispecifični, i/ili njihove smeše, tj. Oligoclonics®). Za imadžing ovi molekuli bi tipično bili fragmenti antitela i tako dalje. Željeni formati obuhvataju, ali bez ograničenja na, intaktne imunoglobuline, bispecifične formate kao što su DARTS™, BiTEs™, biscpecifična antitela sa jednim lakim lancem (Merchant et al., 1998) uključujući CH3-inženjeringom dobijene bispecifične kao što su varijante ključ-brava ili naelektrisane konstruisane CH3 varijante, DVD-Ig antitela (Wu et al., 2007), smeše antitela (de Kruif et al., 2009) i slično. U poželjnom aspektu, navedeni željeni format sadrži najmanje jedan molekul imunoglobulina, i/ili najmanje jedno bispecifično antitelo. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, populacija B ćelija koja je obezbeđena za postupak prema patentnim zahtevima je obogaćena za B ćelije koje eksprimiraju receptore imunoglobulina koji se vezuju za antigen. Takvo obogaćenje može da se javi kada B ćelija dođe u dodir sa antigenom (npr. kada je miš imunizovan antigenom) i aktivirana je da se deli tako da generiše klon B ćelija. Cilj predmetnog pronalaska je obezbediti postupak prema patentnim zahtevima koji dodatno obezbeđuje B ćelijske klonove gde navedena kolekcija B ćelijskih klonova sadrži kolekciju VH regiona koji su obogaćeni za VH regione koji kodiraju antitela usmerena na antigen ili epitop od interesa. Takvo obogaćenje VH regiona je poželjno dobijeno imunizacijom miša antigenom. Obogaćenje može, na primer, biti izvedeno uzimanjem samo onih B ćelijskih klonova dobijenih od životinja izloženih antigenu kao početna populacija koja je izabrana preko procesa prepoznavanja antigena, tj. upotrebom postupaka selekcije koji sadrže obloženi ili obeleženi antigen. Tipično, izabrano je 20 najčešćih klonova, poželjno, 50 najčešćih klonova, poželjnije 100 najčešćih klonova; najpoželjnije, izabrano je 200 najčešćih klonova.

[0026] U poželjnom primeru izvođenja, antigen-specifični VH regioni su klonalno srodni. U drugom poželjnom primeru izvođenja, populacija B ćelija je visoko-obogaćena za B ćelije koje eksprimiraju receptore imunoglobulina koji se vezuju za antigen. U ovom slučaju, većina B ćelija koje su obezbeđene biće specifične za antigen, i na taj način, korak amplifikacije svih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju VH regione ne mora biti neophodan i sve izolovane nukleinske kiseline iz navedenih B ćelija mogu biti, najmanje delimično, direktno sekvencirane. Na taj način, aspekt predmetnog pronalaska, je obezbediti postupak prema patentnim zahtevima, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje korak obezbeđivanja populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL repertoar gde navedene B ćelije sadrže kolekciju VH regiona koji je obogaćen za VH regione koji kodiraju antitela usmerena na antigen ili epitop od interesa.

[0027] Aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema pronalasku, gde je navedena populacija B ćelija dobijena od transgenog miša koji nosi ograničeni, poželjno humani, VL repertoar.

[0028] Aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema pronalasku, gde je navedeni miš imunizovan tako da je poželjno indukovana selektivno klonalno širenje B ćelija koje reaguju sa antigenom ili epitopom od interesa.

[0029] Navedeni ograničeni VL repertoar se sastoji od manje od 10, ili 3 ili 2 VL. Najpoželjnije eksprimiran je jedan VL. U poželjnom primeru izvođenja, svi VLs u ograničenom VL repertoaru su otporni na preuređenja DNK i/ili somatske hipermutacije, poželjno, VL ima sekvencu klicine linije. Poželjna sekvenca klicine linije je varijabilni region lakog lanca koja je često korišćena u humanom repertoaru i ima bolju sposobnost da se sparuje sa mnogim različitim VH regionima, i ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. Najpoželjniji laki lanac klicine linije je 012.

[0030] U naročito poželjnom primeru izvođenja, navedeni ograničeni VL repertoar se sastoji od jednog preuređenog humanog VL, poželjno preuređenog kapa lakog lanca klicine linije IgVK1-39*01/IGJK1*01 (nomenklatura prema IMGT bazi podataka http://www.imgt.org) ili njegovog fragmenta ili funkcionalnog derivata.

[0031] ’Protokol imunizacije koji izaziva selektivno širenje B ćelija’ kao što je ovde korišćen označava da su primarne i buster imunizacije označene tako da izazivaju selektivna širenja B ćelija koje proizvode antitela koja se vezuju za antigen ili epitop od interesa. Protokol imunizacije može na primer da koristi različite oblike ili fragmente antigena u toku primarne imunizacije i svake kasnije buster imunizacije. Na primer, antigen može biti eksprimiran na membrani ćelije, rekombinantni protein, rekombinantni protein fuzionisan za drugi protein, domen proteina ili peptida proteina. Protokol imunizacije može da obuhvata upotrebu ađuvansa u toku primarne i/ili buster imunizacija. U poželjnom primeru izvođenja, ađuvans je korišćen u toku primarne imunizacije samo za ograničenje veličine ne-specifičnog širenja prolaznih B ćelija. Prolazne B ćelije su ćelije koje su aktivirane bez koraka vezivanja antigena za receptor antitela eksprimiran na površini B ćelije. Poznato je u stanju tehnike da imunizacija sa Fcfuzionim proteinima na primer, često rezultira u jakom anti-Fc odgovoru gde do oko 70% svih B ćelija reaguju sa Fc delom fuzionog proteina pre nego sa antigenom od interesa. U naročito poželjnom primeru izvođenja, protokol imunizacije je korišćen bez ađuvansa za poželjno širenje B ćelija koje su aktivirane antigenom korišćenim za imunizaciju. Prema tome, aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema patentnim zahtevima, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje korak obezbeđivanja populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL repertoar, pri čemu je navedena populacija B ćelija dobijena od transgenog miša koji nosi ograničeni, poželjno humani, VL repertoar, pri čemu je navedeni miš imunizovan antigenom, tako da je poželjno indukovano selektivno klonalno širenje B ćelija koje reaguju sa antigenom ili epitopom od interesa. Poželjna načina za indukciju selektivnog klonalnog širenja B ćelija je vakcinacija DNK tetovažom. Termin ’vakcinacija DNK tetovaže’ označava invazivnu proceduru koja uključuje čvrstu vibrirajuću iglu napunjenu plazmidnom DNK koja više puta buši kožu, ranjavajući i epidermis i gornji dermis i izazivajući inflamaciju kože nakon koga sledi zarastanje (Bins 2005/Pokorna 2008).

[0032] U transgenim miševima sa genima za humana antitela, veći broj humanih IgH V regiona i/ili veći broj V regiona kapa lakog lanca humanog Ig je uveden u genom životinja (Lonberg 2005). Posle imunizacije, ovi miševi grade antigen-specifičan imuni odgovor koji se razlikuje u upotrebi V regiona teškog i lakog lanca. Očekuje se da, posle imunizacije ovih transgenih miševa antigenom, sekvenciranje visoke propustljivosti, ocenjivanje učestalosti VH i VL gena, konstrukcija toplotnih mapa CDR3 i slučajno ili vođeno preko učestalosti sparivanja VH i VL regiona proizvodi veliku proporciju antitela koja se ne vezuju za antigen ili se vezuju sa niskim afinitetom (Reddy et al., 2010). Prema tome cilj predmetnog pronalaska je upotreba trangenih životinja koje sadrže ograničeni repertoar lakih lanaca humanog imunoglobulina za svrhe imunizacije. Takve transgene životinje koje sadrže ograničeni repertoar humanih lakih lanaca su opisane u WO2009/157771. Poželjno, endogeni kapa laki lanac je funkcionalno utišan kod takvih životinja da bi se minimizovala upotreba mišjih lakih lanaca u antitelima generisanim u takvim miševima. U dodatnom primeru izvođenja, takođe je endogeni lambda laki lanac funkcionalno utišan tako da dodatno smanjuje upotrebu mišjih lakih lanaca u antitelima. U najpoželjnijem primeru izvođenja, transgene životinje koje nose jedan preuređeni humani VL region koji je otporan na somatsku hipermutaciju je korišćen za imunizaciju da bi se generisala antitela u kojima procesi somatske mutacije i klonalnog širenja i selekcije uglavnom deluju na VH regione antitela eksprimirane na membrani B ćelije. Stoga, sekvenciranje visoke propustljivosti i stvaranje toplotnih mapa CDR3 za identifikaciju antigenom-vođenih, klonalno proširenih B ćelija i antitela koje kodiraju može da se fokusira samo na VH regione. Prema tome aspekt predmetnog pronalaska je obezbediti postupak prema patentnim zahtevima, pri čemu navedeni postupak sadrži korak obezbeđivanja populacije B ćelija, pri čemu navedena populacija B ćelija je dobijena od transgene životinje, poželjno miša, koji nosi ograničeni, poželjno humani, VL repertoar, pri čemu je navedena životinja imunizovana antigenom. U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak prema patentnim zahtevima, pri čemu navedeni postupak sadrži korak obezbeđivanja populacije B ćelija, pri čemu je navedena populacija B ćelija dobijena od transgenog miša koji nosi jedan preuređeni humani VL, poželjno humani IGVK1-39 laki lanac (WO2009/157771). Prednost ovog humanog IGVK1-39 lakog lanca klicine linije je njegova predviđena smanjena imunogenost kao posledica odsustva jakih ne-auto DRB1 vezujućih sredstava (WO2009/157771, primer 19). Pored toga, ovaj laki lanac je poznat kao sposoban za sparivanje sa mnogim različitim humanim VH regionima. Preko niza genetičkih mehanizama, repertoar VL antitela koji može biti generisan u životinji je praktično neograničen.

[0033] U jednom aspektu prema pronalasku, postupak prema patentnim zahtevima dodatno sadrži korak obezbeđivanja ćelije domaćina sa sredstvima za ekspresiju najmanje jednog VH i VL u formatu imunoglobulina. Ovo znači da su izabrane VH i VL sekvence eksprimirane zajedno sa drugim sekvencama tako da formati antitela mogu biti eksprimirani unutar ćelije domaćina. U jednom primeru izvođenja, posle selekcije pogodnih VH, smeše antitela su proizvedene pomoću jedne ćelije uvođenjem najmanje 2 različita teška lanca i jednog zajedničkog lakog lanca u ćeliju (WO2004/009618). U sledećem primeru izvođenja, posle selekcije pogodnih VH regiona, najmanje dva različita teška lanca su stvorena inženjeringom tako da je heterodimerizacija teških lanaca favorizovana u odnosu na homodimerizaciju. Alternativno, inženjering je takav da homodimerizacija favorizovana u odnosu na heterodimerizaciju. Primeri takvih inženjeringom dobijenih teških lanaca su na primer konstrukti tipa ispupčenja i udubljenja (ključ i brava) kao što su opisani u WO98/050431, ili naelektrisane-varijante kao što su opisane (Gunasekaran et al., 2010) ili WO2009/089004, ili WO2006/106905.

[0034] Sledeći aspekt pronalaska je obezbediti postupak prema patentnim zahtevima, gde navedena antitela imaju željeni efekat prema funkcionalnoj skrining analizi, pri čemu postupak dodatno sadrži korak uzimanja supernatanata navedenih kultivisanih ćelija, pri čemu supernatanti sadrže navedena antitela, podvrgavanja supernatanata najmanje jednoj funkcionalnoj skrining analizi, i selekcije najmanje jedne ćelije koja eksprimira antitelo sa željenim karakteristikama. Poželjno, navedena ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac koji je sposoban da se sparuje sa navedenim željenim VH, tako da proizvedena antitela sadrže zajedničke lake lance, kao što su opisani u prethodnom tekstu. U specifičnim primerima izvođenja navedeni korak kultivisanja i navedeni korak skrininga postupka je izveden sa najmanje dva klona. Postupak može izborno da obuhvata analizu za merenje nivoa ekspresije antitela koja su proizvedena. Takve analize su dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike, i obuhvataju analize koncentracije proteina, analize specifične za imunoglobulin kao što su ELISA, RIA, i slično.

[0035] Takođe je obezbeđena upotreba najmanje dva antitela koja se mogu dobiti pomoću postupka u pripremi smeša antitela, koja poželjno sadrži bispecifična antitela.

[0036] Sledeći aspekt pronalaska je obezbediti upotrebu najmanje dva antitela koja se mogu dobiti sa postupkom prema pronalasku, u nizu analiza koje sadrže jedan ili više funkcionalnih skrining analiza za bispecifična antitela pri čemu svaka analiza sadrži kultivisane ćelije koje proizvode bispecifično antitelo u supernatantu, pri čemu je prevalenca navedenog bispecifičnog antitela u supernatantu najmanje 90% preovlađujuća od monospecifičnih antitela, i pri čemu je supernatant korišćen za funkcionalnu analizu bispecifičnog antitela.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0037] Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje postupak prema patentnim zahtevima za proizvodnju definisane populacije vezujućih molekula, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje sledeće korake: a) obezbeđivanje populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL repertoar u kome uglavnom sve od navedenih B ćelija nose najmanje jedan VL, b) izolacije nukleinskih kiselina iz navedenih B ćelija, c) amplifikacije sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina u navedenom uzorku, d) najmanje delimično sekvenciranje uglavnom svih proizvoda amplifikacije, e) izvođenje analize učestalosti svih sekvenci iz koraka d), f) izbor željenih VH sekvenci, g) obezbeđivanje ćelije domaćina sa najmanje jednim vektorom koji sadrži najmanje jednu od navedenih željenih VH sekvenci i najmanje jedne VL sekvence navedenog ograničenog VL repertoara, h) kultivisanje navedenih ćelija domaćina i omogućavanje ekspresije VH i VL polipeptida, i) dobijanje navedenih vezujućih molekula. Alternativno, korak c) i d) mogu biti zamenjeni alternativnim koracima c’ i d’: c’) konstrukcija cDNK biblioteke koja je skriningovana za DNK sekvence specifične za VH region putem testiranja sa probom nukleinske ksieline specifičnom za sekvence VH regiona i d’) najmanje delimično sekvenciranje klonova koji sadrže VH inserte. Tamo gde je naveden VH ili VL, takođe su obuhvaćeni njihovi funkcionalni derivati i/ili fragmenti.

[0038] Predmetni pronalazak pored ostalog opisuje postupak za proizvodnju najmanje dva antitela, pri čemu je početna tačka populacija B ćelija koja eksprimira ograničeni repertoar varijabilnih regiona lakog lanca (VL) i raznovrstan repertoar varijabilnih regiona teškog lanca (VH). Repertoar VL regiona može na primer biti ograničen ograničavanjem broja V i J gena dostupnih u toku rekombinacije u transgenoj životinji ili insercijom jednog ili nekoliko prethodno preuređenih VL regiona u genom transgene životinje, smanjenjem ili ukidanjem stope somatskih mutacija koje se javljaju u VL regionu ili kombinacijom ovih strategija (WO2009/157771). VH regioni mogu biti razlikovani putem rekombinacije V, D i J genskih segmenata i stomatske mutacije. Posle imunizacije, kolekcije sekvenci nukleinske kiseline teškog lanca su dobijene od B ćelija u limfoidnim organima transgenih životinja, podvrgnutih sekvenciranju visoke propusnosti i analizirane da bi se rangirali svi jedinstveni teški lanci na osnovu učestalosti i da bi se rangirali HCDR3 na bazi dužine, procenta identičnosti i učestalosti za kontrukciju toplotnih mapa HCDR3. Informacije nukleotidne sekvence korišćene za rangiranje VH regiona prema njihovoj učestalosti u kolekciji i sekvencama koje se često javljaju, za koju se pretpostavlja da predstavlja VH regione eksprimirane u B ćelijama koji su prošli kroz klonalno širenje kao rezultat stimulacije antigenom, su klonirane u ekspresione vektore zajedno sa jednim od VL regiona prisutnih u ograničenom repertoaru. Upotrebom ograničenog VL repertoara, traženje originalnih VH/VL parova je visoko uprošćeno zbog toga što nije potrebno da se informacija VL sekvence dobije, analizira ili rangira iz imunizovane životinje; u slučaju da originalni ograničeni VL repertoar sadrži jedan VL, sve VH/VL kombinacije će predstavljati originalne parove kao što su korišćeni od strane B ćelija in vivo. U slučaju da je originalni ograničeni repertoar VL sadržao nekoliko VL regiona, kombinacija sa rangiranim VH regionima proizvela je samo male kolekcije VH/VL kombinacija koje mogu biti brzo skrinigovane za vezivanje i funkcionalnu aktivnost.

[0039] Ekspresioni vektori koji sarže VH i VL regione su korišćeni za transficiranje ćelija za brzo dobijanje antitela za analize vezivanja i funkcionalni skrining. Različiti formati antitela mogu biti dobijeni upotrebom ekspresionih vektora koji sadrže različite genetičke elemente koji, na primer, vode formiranje fragmenata antitela ili antitela sa različitim izotipovima, bispecifičnih antitela, smeša antitela ili antitela koja su konstruisala varijabilne ili konstantne regione za modifikovane efektorne funkcije ili modifikovani polu-život, ili sadrže dodatna vezujuća mesta, su bez aminokiselinskh sekvenci koje imaju štetan efekat na razvoj, proizvodnju ili formulaciju antitela kao što su glikozilaciona i deamidaciona mesta.

PRIMERI

Primer 1: Duboka analiza sekvence i rangiranje učestalosti VH gena eksprimiranih u B ćelijama slezine miša upotrebom prajmera specifičnih za VH familiju

[0040] Ovaj primer opisuje upotrebu sekvenciranja visoke propustljivosti za dobijanje i analiziranje repertoara VH regiona antitela eksprimiranih u slezini miševa divljeg tipa imunizovanih sa antigenima ErbB2 ili ErbB3. Kako će imunizacija obogatiti B ćelijsku populaciju za klonove usmerene protiv imunogena, predviđeno je da sekvenciranje velikog broja VH transkripata identifikuje ove B ćelijske klonove jer će oni biti prisutni unutar populacije u većim učestalostima. U ovom primeru, približno 25,000 gena VH regiona iz slezine jednog imunizovanog miša je dobijeno sekvenciranjem visoke propustljivosti i rangirano na bazi učestalosti.

[0041] Slezine su sakupljene iz miševa imunizovanih antigenom ErbB2 ili ErbB3 upotrebom DNK tetoviranja (videti primer 6). Suspenzija jedne ćelije je pripremljena prema standardnim tehnikama. B ćelije su izolovane iz ove suspenzije jedne ćelije slezine u postupku MACS od dva koraka upotrebom materijala iz Miltenyi biotec (http://www.miltenyibiotec.com/en/default.aspx). Ukratko, B ćelije slezine su izolovane prvo depletiranjem ne-B ćelija, nakon čega sledi pozitivna selekcija B ćelija. Ne-B ćelije su depletirane obeležavanjem T ćelija, NK ćelija, mijeloidnih ćelija, plazma ćelija i eritrocita sa koktelom biotinilovanih antitela (Tabela 1) i kasnijom inkubacijom sa streptavidin mikrokuglicama. Zatim su ne-B ćelije depletirane iznad LD kolone. Protok, koji sadrži obogaćenu B ćelijsku frakciju, je obeležen magnetnim mikrokuglicama upotrebom FITC konjugovanih anti-lgG1 i IgG2ab antitela (Tabela 1), nakon čega sledi obeležavanje sa anti-FITC mikrokuglicama (Miltenyi Biotec, kat br. 130-048-701). IgG obeležene ćelije su zatim pozitivno izabrane iznad LS kolone (Miltenyi Biotec, kat. br. 130-042-401). MACS postupci su izvedeni prema Kit/Microbead specifičnim uputstvima dobijenim od Miltenyi. Čistoća izolovanih B ćelija je određivana pomoću FACS analize prema standardnim tehnikama upotrebom antitela navedenih u Tabeli 2.

Tabela 1: antitela za obeležavanje ne-B ćelija

Tabela 2: antitela za FACS analizu

[0042] Da bi se ekstrahovale nukleinske kiseline B ćelija, ćelije su lizirane u Trizol LS (Invitrogen). RNK je pripremljena i cDNK je sintetisana prema standardnim tehnikama. Prajmeri dizajnirani za amplifikaciju mišjih VH repertoara su uzeti kao početni materijal i modifikovani su za upotrebu u 454 sekvenciranju visoke propustljivosti dodavanjem 454 prajmerskih sekvenci („forward“ 454 prajmer: CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG; reverzni 454 prajmer: CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG). Kompletne prajmerske sekvence za PCR amplifikaciju mišjih VH repertoara su prikazane u Tabelama 3 i 4.

Tabela 4: Reverzni 454 fuzioni prajmeri, kompletni. Fuzioni deo (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG) je u italiku. Deo specifičan za mišje J segmente je u boldu.

[0043] U PCR-u, četiri reverzna JH prajmera su mešana u istim odnosima pre upotrebe. „Forward“ prajmeri nisu mešani, tako da su izvedene 22 PCR reakcije. Proizvodi PCR reakcije su analizirani na gelu i očekivano je da proizvedu PCR proizvode od 350 do 400 baznih parova u dužinu. Neki PCR proizvodi su mešani na bazi učestalosti VH gena u normalnim repertoarima (Tabela 5, u daljem tekstu). Očekivano je da intenziteti traka na gelu odgovaraju odnosima navedenim u ovoj tabeli i kada je to slučaj, proizvodi PCR-a su mešani za sekvenciranje na bazi zapremina. Tamo gde intenziteti traka na gelu nisu odgovarali odnosima navedenim u Tabeli 5, trake koje su previše ili premalo predstavljene mogu biti podešene. Kako sekvenciranje visoke propustljivosti takođe identifikuje prajmer i PCR reakciju, odnosi uvek mogu biti „podešeni“ posle sekvenciranja i učestalost svakog VH gena po PCR reakciji može biti analizirana.

Tabela 5: Proizvodi PCR-a koji mogu biti pulovani.

[0044] Analiza sekvence je izvedena u cilju rangiranja svih jednistvenih VH gena iz jedne životinje, imunizacije i/ili ćelijske populacije prema učestalosti:

- Sirove sekvence su analizirane da bi se identifikovale one koje kodiraju otvoreni okvir čitanja VH regiona koji najmanje sadrži HCDR3 plus neku susednu okvirnu sekvencu za identifikaciju VH. Poželjno, otvoreni okvir čitanja VH regiona sadrži CDR1 do okvira 4 - Sve sekvence su translatirane u aminokiselinske sekvence

- Sve sekvence su grupisane u klastere na bazi identične HCDR3 proteinske sekvence - Svi klasteri su rangirani na bazi broja VH sekvenci u svakom klasteru

- Poravnanje svih sekvenci u svakom klasteru je napravljeno na bazi proteinskih sekvenci, u kojima su naznačene razlike sa VH klicine linije i JH klicine linije. Sve identične sekvence u poravnanju su ponovo grupisane u klastere.

[0045] Ovo obezbeđuje informacije o najčešćem VH genu unutar CDR3 klastera. Ovaj gen može da ima razlike u poređenju sa klicinom linijom kao rezultat somatske hipermutacije. Ovaj gen je izabran za konstrukciju i ekspresiju sa zajedničkim VL genom

Sekvenciranje visoke propustljivosti je izvedeno upotrebom Roche 454 sekvenciranja na uzorcima iz pojedinačnog imunizovanog miša. Drugi postupci sekvenciranja visoke propustljivosti su dostupni stručnjacima iz date oblasti tehnike i takođe su pogodni za primenu u postupku. Ukupno, 118,546 očitavanja sekvence je korišćeno kao sirovi podaci za prvo identifikovanje sekvenci koje su predstavljale VH regione pune dužine ili njihove delove koji kodiraju najmanje 75 aminokiselina. Za svaku sekvencu unutar ove grupe, okviri 2-4 i sva 3 CDR regiona su identifikovani kao što je opisano (Al-Lazikani et. al., 1997). Sekvence su zatim podvrgnute određenom broju kriterijuma uključujući prisustvo kanonskog cisteinskog ostatka, odsustvo stop kodona i minimalnu dužinu za svaki od CDR regiona. Svi VH regioni koji ispunjavaju ove kriterijume su zatim grupisani u klastere radi identifikacije učestalosti po kojoj je korišćen svaki jedinstveni CDR3, na taj način generišući toplotne mape CD3 teškog lanca. Zatim, svi identični klonovi u svakom CDR3 klasteru su grupisani i poravnati sa VH sekvencom klicine linije. Ova analiza omogućava identifikaciju često korišćenih VH gena u velikim repertoarima. Iako ova analiza može biti izvedena ručno, upotreba algoritma uključujući gornje instrukcije dosta olakšava proces analize (Reddy et al., 2010) Ukupno 18,659 klastera je identifikovano unutar 30,995 zabeleženih VH sekvenci i nađeno je 2,733 klastera koji su imali više od 1 člana. Pored toga, 123 klastera je imalo više od 20 članova. Prvih 40 klastera od njih su prikazani u Tabeli 6. Devet klastera je imalo više od 100 članova. Broj od 30.000 sekvenci je više nego dovoljan jer se mnogi klonovi javljaju samo jednom i eksperimenti imaju za cilj identifikaciju čestih klonova. Ustvari, manje od 30.000 sekvenci bi funkcionisalo prilično dobro. Poravnanja dva najveća klastera pokazala su prisustvo 100% gena klicine linije i varijanti koje sadrže mutacije u VH genu (podaci nisu prikazani).

Tabela 6: Primer klastera identifikovanih pomoću jedinstvenog CDR3.

Primer 2: Duboka analiza sekvenci i rangiranje učestalosti VH gena eksprimiranih u mišjim IgG+ B ćelijama slezine upotrebom jednog seta prajmera

[0046] U ovom primeru, prajmer specifičan za IgG CH1 konstantni region je korišćen za ispitivanje repertoara genskih sekvenci VH eksprimiranih u IgG+ memorijskim B ćelijama u slezini miševa imunizovanih sa ErbB2-Fc fuzionim proteinom. Na 5’ kraju iRNK oligonukleotidni prajmer je vezan sa nizom trostrukog guanina koji je dodat svakoj iRNK pomoću MMLV reverzne transkriptaze. Ovaj 5’ prajmer uvodi prajming mesto na 5’ kraju svih cDNK. Upotrebom ovog pristupa, amplifikacije svih VH regiona eksprimiranih u IgG+ B ćelijama mogu biti izvedene upotrebom 5’ prajmera i CH1 prajmera, sprečavajući potencijalnu sklonost uvedenu upotrebom velikog broja prajmera specifičnih za VH familiju i fokusiranjem analize na populaciju B ćelija koja je izgleda prošla kroz aktivaciju i promenu izotipa kao rezultat stimulacije antigenom. C57BL/6 miševi divljeg tipa su imunizovani intraperitonealno sa ErbB2-Fc proteinom (1129ER, R&D systems) rastvorenim u Titermax Gold ađuvansu (TMG, Sigma Aldrich, T2684) na dane 0, 14 i 28 i sa ErbB2-Fc u PBS na dan 42. Ukupne B ćelije slezine su prečišćene na dan 45 pomoću MACS postupka kao što je detaljno opisano u Primeru 1. Ukupna B ćelijska frakcija slezine od uspešno imunizovanih miševa, kao što je određena pomoću titara antitela u serumu u ELISA, sadržala je 5-10% IgG+ B ćelije. Ovaj materijal je korišćen za optimizaciju PCR uslova.

[0047] Transgeni miševi koji sadrže humani HuVK1-39 laki lanac, kao što su opisani u (WO2009/157771) su imunizovani sa EGFR-Fc fuzionim proteinom (R&D Systems, kat. br.

334-ER) emulgovanim u Titermax Gold ađuvansu (TMG, Sigma Aldrich, T2684) ili, kao kontrola, sa Titermax Gold ađuvansom emulgovanim sa PBS u intervalu od 14 dana. Poslednja grupa je uključena za identifikaciju VH repertoara B ćelija koja odgovara samo ađuvansu. Miševi su tri puta imunizovani sa EGFR-Fc/ađuvantnom emulzijom ili samo ađuvantnom emulzijom na dane 0, 14 i 28. Na dan 35 anti-EGFR titar u serumu je određen pomoću FACS upotrebom standardnih postupaka. Miševi koji su na dan 35 razvili titar u serumu >1/1.000 primili su krajnju intraperitonealnu buster injekciju sa EGFR-Fc proteinom rastvorenim u PBS na dan 42, nakon čega je usledilo sakupljanje slezine na dan 45 za izolaciju B ćelija slezine. B ćelije slezine su izolovane iz ukupne slezine pomoću pozitivne selekcije upotrebom magnetnih kuglica specifičnih za mišji CD19. B ćelijska frakcija slezine je lizirana u Trizol LS da bi se izolovala ukupna RNK.

[0048] Posle izolacije RNK, pripremljena je cDNK (ćelijske populacije iz miševa transgenih za HuVK1-39 laki lanac i lažno imunizovani i kontrolni/test uzorka sa sličnom ćelijskom populacijom) upotrebom MMLV reverzne transkriptaze u prisustvu prajmera mišjeg CH1 rev 0, 1, 2 ili 3 zajedno sa MMLV 454 fw (Tabela 7). Četiri različiti parametra su testirana za identifikaciju onog koji je rezultirao u optimalnim prinosima cDNK i proizvodima PCR-a; MMLV je dizajniran tako da sadrži 3’ GGG niz sličan Clontech prajmerima, delecijom klonirajućih mesta, ali dodavanjem 454 sekvenci (SMARTer™ RACE komplet za amplifikaciju cDNK, kat#634924, Clontech).

[0049] Kao kontrola, cDNK je takođe pripremljena upotrebom standardnog Clontech protokola; SMARTer PCR komplet za sintezu cDNK upotrebom SMARTer II A oligo zajedno sa genski specifičnim CH1 rev 0, 1, 2 ili 3 prajmerima (SMARTer™ RACE komplet za amplifikaciju cDNK, Cat#634924, Clontech). Upotrebom standardnih postupaka, određen je optimalan broj PCR ciklusa i optimalna kombinacija prajmera. Clontech protokol je praćen za PCR uslove.

[0050] Sledeće, materijal iz imunizovanih miševa transgenih za HuVK1-39 laki lanac i lažnoimunizovanih miševa je amplifikovan pod optimalnim uslovima. Poželjno su amplifikacije izvedene sa reverznim prajmerom ushodno od prajmera korišćenog u sintezi cDNK za dobijanje specifičnijeg PCR proizvoda (umreženi PCR). cDNK je klonirana u pJET prema uputstvima proizvođača (CloneJET PCR komplet za kloniranje, Fermentas #K1232) i klonovima Sanger-sekvence 100. Proizvod PCR-a od materijala poreklom od imunizovanih i lažno-imunizovanih životinja je prečišćen i korišćen za 454 sekvenciranje. Podaci su analizirani i korišćeni za kontrukciju toplotnih mapa CDR3 su konstruisani kao što je opisano u primeru 1.

Tabela 7: Prajmeri korišćeni u ovoj studiji. Prajmer MMLV 454 fw se hibridizuje na 5’ kraju iRNK. Položaj CH1 rev prajmera je naznačen na Slici 1.

[0051] Rezultati ovih eksperimenata proizvode toplotne mase CDR3 teškog lanca koje predstavljaju sekvence korišćene od strane B ćelija koje su prošle kroz aktivaciju i promenu izotipa kao rezultat stimulacije antigenom. Sekvence VH regiona prisutne u najčešćim klasterima poreklom od transgenih miševa koji sadrže humani IGVK1-39 laki lanac mogu biti korišćene za kombinovanje sa sekvencom humanog IGVK1-39 lakog lanca do kolekcija humanih monoklonskih antitela obogaćenih za antitela specifičnih za EGFR.

Primer 3: Duboka analiza sekvence i rangiranje učestalosti VH gena eksprimiranih u mišjim IgG+ B ćelijama slezine bez prajmera specifičnih za VH familiju

[0052] Za ovaj primer, cilj je bio optimizovati tehnologiju dubokog sekvenciranja IgG VH gena upotrebom amplifikacija na bazi prajmera koji amplifikuju sve Ig teške lance i na taj način sprečavaju potencijalnu sklonost uvedenu preko prajmera specifičnih za VH familiju.

[0053] Amplifikacija gena VH antitela za generisanje biblioteke fagnog prikaza koristi prajmere koji dodaju restrikciona mesta za kloniranje do VH gena na traženom položaju unutar gena. Ovo zahteva mesta vezivanja prajmera unutar VH gena i prema tome prajmere specifične za VH familiju. U primeru 1 su korišćene takve prajmerske sekvence. Nedostatak upotrebe prajmera VH familije je taj što oni amplifikuju podgrupu svih VH gena u repertoaru.

Kako je korišćena velika kolekcija prajmera i PCR reakcija za amplifikaciju svih gena i PCR proizvodi su mešani nakon toga, ovo će rezultirati u promeni odnosa VH gena originalno prisutnih u uzorcima i prema tome prekomernom/premalom prikazu VH gena u krajnjem sekvenciranom repertoaru. Da bi se prevazišli ovi problemi u ovoj studiji RACE (brza amplifikacija cDNK krajeva) protokol amplifikacije je korišćen u kombinaciji sa IgG1-CH1 specifičnim setom prajmera. SMARTer RACE komplet (Clontech; kat # 634923 & # 634924) je korišćen koji spaja 5’ sintetički adaptor za iRNK. SMARTScribe RT enzim proizvodi kopiju RNK transkripta. SMARTScribe RT počinje sintezu cDNK od IgG iRNK na antisens prajmeru koji prepoznaje poznatu sekvencu u IgG iRNK kao što je poli A rep u ovoj studiji.

[0054] Kada SMARTScribe RT enzim dostigne 5’ kraj IgG RNK obrasca on dodaje 3 do 5 ostataka na 3’ kraj prvog lanca cDNK. SMARTer oligo IIA sadrži terminalni niz modifikovanih baza koji se vezuje za ovaj prošireni rep dodat od strane SMARTScribe RT, omogućavajući da oligo služi kao obrazac za RT. Zatim, SMARTScribe RT menja obrasce od iRNK molekula do SMARTer oligo IIA, generišući kompletnu dvolančanu cDNK kopiju originalne RNK sa dodatnom SMARTer sekvencom na kraju. Zatim, za PCR amplifikaciju VH cDNK, primenjeni su oligo koji se vezuju za 5’ SMART sekvencu na jedom kraju cDNK (5 PCR prajmer 454) i IgG-CH1 specifičan prajmer na drugom kraju cDNK (Tabela 8). Na ovaj način VH regioni iz teških lanaca IgG su amplifikovani sa samo jednom kombinacijom prajmera, nezavisno od prajmera specifičnih za VH familiju, i u ovom slučaju prajmer specifičan za CH1 konstantni region IgG je korišćen za ispitivanje repertoara VH genskih sekvenci eksprimiran u IgG+ memorijskim B ćelijama u slezini miševa imunizovanih sa ErbB2-Fc fuzionim proteinom. U najboljem slučaju IgG-CH1 specifičan reverzni prajmer bi trebalo da se vezuje što je bliže moguće VH genu za povećanje verovatnoće da ceo VH gen može biti sekvenciran.

[0055] Uzorci za duboko sekvenciranje su dobijeni iz dva imunizovana ransgena miša koji nose humani huVk1-39 laki lanac; miševi su numerisani kao miš 1145 i miš 1146. Ukratko, transgeni miševi koji sadrže humani HuVK1-39 laki lanac, kao što je opisano u (WO2009/157771) su imunizovani sa EGFR-Fc fuzionim proteinom (R&D Systems, kat. br.

334-ER) emulgovanim u Titermax Gold ađuvansu (TMG, Sigma Aldrich, T2684). Miševi su tri puta imunizovani sa EGFR-Fc/ađuvantnom emulzijom na dane 0, 14 i 28. Na dan 35 anti-EGFR titar u serumu je određen pomoću FACS upotrebom standardnih postupaka. Miševi koji su razvili na dan 35 titar >1/1.000 u serumu primili su krajnju intraperitonealnu buster injekciju sa EGFR-Fc proteinom rastvorenim u PBS na dan 42 nakon čega sledi sakupljanje slezine na dan 45 za izolaciju B ćelija slezine. B ćelije slezine su izolovane iz cele slezine pomoću pozitivne selekcije upotrebom magnetnih kuglica specifičnih za mišji CD19. B ćelijska frakcija slezine je lizirana u Trizol LS da bi se izolovala ukupna RNK prema standardnim postupcima.

[0056] cDNK je sintetisana iz ovih RNK uzoraka upotrebom SMARTer RACE cDNK kompleta za amplifikaciju prema uputstvima proizvođača da bi se došlo do takozvane RACE-Ready cDNK. Ova RACE-ready cDNK je kasnije amplifikovana pomoću PCR-a prema uputstvima proizvođača i SMART specifičan prajmer (Tabela 8) i jedan od nekoliko IgG CH1 specifičnih prajmera su korišćeni za ustanovljavanje koji IgG-CH1 specifičan prajmer najbolje amplifikuje IgG transkript. IgG-CH1 specifični reverzni prajmeri DO_1171 do DO_1174 koji sadrže 3’ 454 sekvence su testirani i kao „forward“ prajmer korišćen je SMART obeleživač specifičan prajmer koji sadrži 5’ Roche 454 sekvencirajući obeleživač (DO_1177) (videti tabelu 8 i Slika 1) (SMARTer™ RACE cDNA komplet za amplifikaciju, kat# 634923 & 634924, Clontech). PCR režim koji je korišćen je prikazan u Tabeli 9.

Tabela 8: Prajmeri koji su korišćeni u ovoj studiji. Položaj CH1 rev prajmera je naznačen na Slici 1.

Tabela 9. PCR režim.

[0057] Rezultati PCR-a prikazani na Slici 2 pokazuju da DO_1171 nije dao proizvod PCR-a, dok su druga tri svi dali čest proizvod PCR-a, videti Sliku 2. Zaključeno je da je DO_1172 najbolja opcija za amplifikaciju VH regiona, s obzirom na to da je prajmer najbliži VH genu i proizvodi u PCR-u jasnu i specifičnu traku.

[0058] PCR je izvođen nekoliko puta na obrascu (Tabela 9) da bi se dobilo dovoljno materijala (500-1000 ng) za duboko sekvenciranje. Da bi se odredila koncentracija DNK posle PCR-a, izvedeno je fluorimetrijsko kvantitativno određivanje DNK. U ovom slučaju, Quant-IT Picogreen dsDNA (Invitrogen P7589) merenja su izvedena upotrebom Biotek Synergy. Proizvod PCR-a od materijala izvedenog od imunizovanih životinja (uzorci 1145 i 1146) je zatim poslet u Eurofins MWG Operon (www.eurofinsdna.com) za sekvenciranje visoke propustljivosti.

[0059] Eurofins je prvo vezao linkere sa barkodom za svaki od dva uzorka. Na ovaj način oba uzorka su mogla biti sekvencirana u jednom segmentu-čipa, na taj način smanjujući troškove. Sa ovim rasporedom Eurofins je dao sekvenciranje sa GS FLX+ tehmologijom gde je dužina očitavanja u proseku 600-700 bp.

[0060] Duboko sekvenciranje je otkrilo više od 50.000 očitavanja po mišu i podaci su analizirani kao što je objašnjeno u primeru 1. Tabela 10 obezbeđuje 25 najvećih klastera iz dva od analiziranih uzoraka.

[0061] Rezultati iz Tabele 10 pokazuju da su različiti VH geni amplifikovani i sekvencirani u postupcima PCR-a i dubokog sekvenciranja. Uzorak 1145 sadrži mnoge klastere unutar 25 najvećih klastera koji koriste J558.66.165 gen. Uzorak 1146 sadrži veliku raznovrsnost VH gena sa 12 različitih VH gena u kojima je svaki prisutan između jednom i četiri puta unutar 25 najvećih klastera. Ovi rezultati sugerišu da postupak omogućava objektivnu amplifikaciju i analizu IgG VH repertoara.

[0062] Da zaključimo, ovi eksperimenti su rezultirali u rangiranju najčešćih VHs koji predstavljaju sekvence korišćene od strane B ćelija koje su prošće kroz aktivaciju i promenu izotipa kao rezultat stimulacije antigenom. Sekvence VH regiona prisutne u najčešćim klasterima poreklom od transgenih miševa koji sadrže humani IGVK1-39 laki lanac mogu biti korišćene za kombinovanje sa sekvencom humanog IGVK1-39 lakog lanca do kolekcija humanih monoklonskih antitela obogaćenih za antitela specifična za EGFR.

Primer 4: Strategije imunizacije za konstrukciju pouzdanih toplotnih mapa CDR3 VH

[0063] Široki niz postupaka imunizacije je dostupan koji koriste različite formate antigena u kombinaciji sa ađuvansom da bi se optimizovao antigen-specifičan imuni odgovor kod životinja. Za rangiranje često korišćenih gena teškog lanca koji optimalno predstavljaju VH regione iz B ćelija koje su proširene kao rezultat stimulacije antigenom od interesa, kritično je da se koriste protokoli imunizacije koji fokusiraju imuni odgovor na navedeni antigen ili čak na epitop navedenog antigena. Na taj način, upotreba antigena fuzionisanih ili spojenih sa proteinima nosačima (kao što su Fc fuzioni proteini ili proteini spojeni sa nosačima kao hemocijanin prilepka, poznati u stanju tehnike) se izbegava ili ograničava na jedan korak u postupku imunizacije kao što je jedna primarna imunizacija ili jedna buster imunizacija. Očekuje se da čak ograničena aktivacija B ćelija preko upotrebe nosača ili fuzionih proteina ili ađuvansa može da pokaže rangirane VH sekvence/HCDR3 toplotne mape, na taj način kontaminirajući analizu. Idealno, imunizacije su na taj način izvedene sa ’esencijalno čistim antigenima’. Predmetni primer pokazuje da pojedinačne ili ponavljane imunizacije sa antigenom fuzionisanim sa Fc-delom zaista rezultiraju u širenju irelevantnih B ćelija, tj. B ćelija koje reaguju sa Fc-delom pre nego sa antigenom od interesa.

[0064] Miševi transgeni sa jednim humanim VL (grupa 1) i miševi divljeg tipa (grupa 2) su imunizovani sa tumorskom ćelijskom linijom A431 koja prekomerno eksprimira EGFR na dane 0 i dan 14 (2x10E6 A431 ćelija u 200 µl PBS), nakon čega sledi ip imunizacija sa Fc-EGFR fuzionim proteinom emulgovanim u Titermax Gold. Na dan 35, serum je sakupljen i testiran u ELISA za prisustvo anti-Fc antitela.

[0065] Kao kontrola, treća grupa miševa koji sadrže i transgene miševe sa jednim humanim VL i miševe divljeg tipa (grupa 3) su imunizovani sa Fc-EGFR fuzionim proteinom samo na dane 0, 14, 28, 42 i 52. Na dan 56, serum je sakupljen i testiran u ELISA za prisustvo anti-Fc antitela.

[0066] Rezultati (Slika 3) pokazuju da čak posle jedne imunizacije sa Fc-EGFR, antitela protiv Fc dela su detektovana u grupama 1 i 2. Iako su nivoi anti-Fc antitela u ove dve grupe bili niži od nivoa anti-Fc kao što je zabeleženo u grupi 3, VH regioni koji kodiraju ova anti-Fc antitela biće nađeni u CDR3 toplotnim mapama, konstruisani kao što je opisano u primeru 1. ako je tako željeno, takva Fc-specifična vezujuća sredstva mogu biti prevaziđena upotrebom esencijalno čistih antigena kao što je u DNK tetovaži ili eliminacijom Fc-specifičnih vezujućih sredstava iz populacije B ćelija pre analize VH sekvence.

Primer 5: DNK vakcinacija putem tetoviranja

[0067] DNK vakcinacija koristi plazmidnu DNK koja kodira proteinski antigen za indukciju imunog odgovora protiv navedenog proteinskog antigena. Nema potrebe za prečišćavanjem proteina za imunizaciju i proteini, uključujući membranske proteine, su eksprimirani u njihovoj prirodnoj konfiguraciji na ćelijskoj membrani (Jechlinger et al., 2006/Quaak, et aI., 2008/Stevenson et aI., 2004).

[0068] U ovom primeru, koristili smo vakcinu DNK tetovaže, invazivni postupak koji uključuje čvrstu vibrirajuću iglu napunjenu plazmidnom DNK koja više puta probija kožu, ranjavajući i epidermis i gornji dermis i izazivajući inflamaciju kože nakon koje sledi zarastanje (Bins 2005/Pokorna 2008). Ovde smo koristili strategije vakcinacije DNK tetovaže za indukciju odgovora antitela kod miševa. Cilj je bio proceniti kvalitet odgovora antitela u odsustvu ili prisustvu ađuvansa. Kao što je opisano u primeru 4, za konstrukciju adekvatnih toplotnih mapa CDR3, poželjno je fokusirati odgovor antitela na antigen od interesa, izbegavajući upotrebu ađuvansa koji izaziva klonalno širenje neželjenih B ćelija.

[0069] Za vakcinaciju tetovažom, korišćeni su plazmidi koji kodiraju humani ErbB2 i plazmidi koji kodiraju hemaglutinin virusa gripa (HA). Tri strategije vakcine DNK tetovažom su testirane za optimizaciju prajminga i bustera imunog odgovora: (A) vakcina sa vektorskom DNK koja kodira ErbB2 ili HA antigen, (B) vakcinacija vektorske DNK koja kodira ErbB2 ili HA zajedno sa ađuvansom ili (C) heterologna prajming-buster vakcinacija sa DNK koja kodira ERbB2 ili HA nakon čega sledi buster sa prečišćenim ErbB2 ili HA proteinom u TM Gold ađuvansu. Pored toga, kontrolna grupa (grupa D) miševa je imunizovana sa prečišćenim ErbB2 ili HA u TM Gold ađuvansu. Da bi se ustanovio optimizovani protokol vakcinacije DNK tetovažom korišćeni su sledeći protokoli imunizacije:

Grupa A (samo DNK): U ovoj grupi, miševi su vakcinisani na dan 0, 3 i 6 sa plazmidnom DNK koja kodira ErbB2 ili HA u odsustvu ađuvansa, nakon čega je usledio buster sa istom DNK posle četiri nedelje. Nije korišćen ađuvans.

Grupa B (DNK genetički ađuvans): Da bi se testiralo da li ađuvans povećava prajming humoralnog imunog odgovora, plazmidna DNK koja kodira TANK-vezujuću kinazu 1 (TBK1) je ko-vakcinisana sa ErbB2 ili HA plazmidnom DNK. Pokazano je da TBK1 deluje kao ađuvans za DNK vakcinaciju upotrebom genskog pištolja (Ishii et al., 2009). Poređenje grupe B sa grupom A otkriće koji uticaj ima genetički ađuvans na generisanje antitela specifičnih za HA ili ErB2. Životinje u grupi B su DNK vakcinisane u istim vremenskim tačkama kao one u grupi A. Da bi se ispitao doprinos genetičkog ađuvansa u prajmingu imunog sistema, plazmidna DNK koja kodira TBK-1 je mešana u odnosu 1:1 sa pVAX1-ErbB2 ili pVAXI-HA i zatim primenjena pomoću DNK tetovaže. U tom cilju miševi su vakcinisani sa 20 µg pTBK-1 i 20 µg pVAX1-ErbB2 ili pVAX1-HA u 10 µl PBS.

Grupa C (DNK protein): U ovoj grupi heterologni prajming-buster protokol sa DNK tetoviranjem praćenim intraperitonealnom buster injekcijom (i.p.) proteina je testiran za ispitivanje da li je krajnji proteinski buster potreban da indukuje antigen-specifičan titar IgG u serumu od > 1/1000 i da li je ovaj buster neophodan za efikasno indukovanje memorijskih B ćelija slezine. I.p. injekcija je direktan put imunizacije za slezinu. Tako, prvo prajmingom imunog sistema sa DNK vakcinacijom ErbB2 ili HA je predstavljen imunom sistemu kao in vivo eksprimirani protein. Zatim, prajmovani imuni sistem je pojačan sa ErbB2 ili HA u ađuvansu preko i.p. injekcionog puta za indukciju sistemske imune reakcije. Poređenje grupe C sa A otkriva uticaj sistemskog bustera na 1) antigenspecifičan titar IgG u serumu i 2) na generisanje kompartmenta memorijske B ćelije slezine. Imunizacija i prvi buster sa pVAXI-ErbB2 ili pVAX1-HA izvedeni su prema šemi opisanoj za grupu A. Zatim su miševi primili buster na dan 28 i dan 42 sa 20 µg proteina u 200 µl emulzije TitermaxGold ađuvansa ili u 200 µl PBS, respektivno, primenjeno preko ip injekcije. Za HA vakcinaciju miševi su injektirani sa 20 µg HA (Meridian life Science Inc, Cat no R01249). Za ErbB2 miševi su injektirani sa 20 mg skraćenog ErbB2 proteina: ekstracelularni domen (ECD, aa23-652) ErbB2 fuzionisan sa FC-rep (R&D systems, kat. br. 1129ER).

Grupa D (protein): U ovoj kontrolnoj grupi miševi su vakcinisani i.p. sa ErbB2 ili HA u ađuvansu. Materijal iz ove grupe je služio kao pozitivna kontrola za analize uzoraka iz grupa A-C. Na dan 0, 14 i 28 miševi su vakcinisani sa 20 µg ErbB2 ili HA u 200 µl emulzije TitermaxGold ađuvansa. Za krajnji buster, miševi su primali 20 µg ErbB2 ili HA rastvoren u 200 µl PBS.

[0070] Titar u serumu i afinitet su određivani posle svakog bustera pomoću ELISA i FACS respektivno upotrebom standardnih protokola (Middendorp et al., 2002). Da bi se ispitalo sazrevanje afiniteta u toku protokola vakcinacije, relativni afinitet poliklonskog antigenspecifičnog-lgG seruma je određen pomoću ELISA. Efikasnost i kvalitet indukcije memorijske B ćelije na kraju svake strategije vakcinacije je ispitivana pomoću FACS u slezini i drenirajući preponski limfni čvor (iLN) kao što je opisano (Middendorp et al., 2002).

[0071] Svi ErbB2 DNk imunizovani miševi razvili su anti-ErbB2 IgG titar u serumu > 10,000 posle dve runde imunizacije (slika 4A-C), što ukazuje na to da su dve runde DNK imunizacije preko tetoviranja dovoljne da indukuju snažan odgovor anti-ErbB2 antitela. Rezultati pokazuju da proteinom imunizovani miševi razvijaju snažan anti-ERbB2 IgG titar u serumu na dan 21 (slika 4D).

[0072] Treća runda imunizacije na dan 28 sa DNK (grupe A1 i B1) rezultirala je u dodatnom povećanju anti-ErbB2 IgG titra u serumu na dan 35 (sedam dana posle treće runde vakcinacije) i dan 45 (krajnja tačka) (slika 4A i 4B). U grupi B1 našli smo da bi ko-primena ErbB2 ekspresionog vektora (grupa A1) zajedno sa DNK-ađuvansom (pBoost3 vektor koji kodira TBK1 protein), pojačala odgovor antitela protiv ErbB2. Poređenje anti-ErbB2 titra u serumu u vremenu pokazalo je da su miševi u grupama A1 i B1 razvili sličan anti-ErbB2 titar u serumu (Slika 4E-G). Ovo je ukazalo na to da za ErbB2 antigen ko-primena pBoost3 vektora nije uspela da pojača poliklonski anti-ErbB2 IgG titar u serumu. Miševi u grupi C1 su prvo primili dve runde imunizacije (dan 0 i 14) sa DNK, nako čega je usledio buster (na dan 28) sa ErbB2-Fc proteinom emulgovanim sa TitermaxGold ađuvansom. Ovaj proteinski buster na dan 28 rezultirao je u snažnom povećanju anti-ErbB2 IgG titra u serumu na dan 35 (posle treće imunizacije na dan 28) i dan 45 (krajnja tačka) (Slika 4C). Na dan 35 titar u serumu grupe C1 (DNK - protein) je bio viši u poređenju sa miševima vakcinisanim samo sa DNK (grupe A1 i B1) i granično niži u poređenju sa miševima imunizovanim samo sa proteinom (grupa D1). Na dan 45 titri u serumu grupa C1 (DNK i protein) i D1 (samo protein) bili su slični.

[0073] Svi miševi koji su imunizovani sa HA antigenom preko četiri strategije vakcinacije razvili su snažan anti-HA IgG titar u serumu na dan 21 (podaci nisu prikazani) i 35 (Slika 5).

Anti-HA IgG titar u serumu između DNK (grupa A2) i DNK ađuvans (grupa B2) strategija bio je sličan. Pored toga, DNK vakcinacija nakon koje je usledio buster sa HA proteinom emulgovanim sa Titermax Gold (grupa C2) ili tri puta imunizovan sa proteinom (grupa 02) dala je viši titar u serumu od vakcine sa samo DNK. Ukratko, sličnosti i razlike između četiri grupe miševa vakcinisanih sa HA antigenom bile su slične sa rezultatima zabeleženim za miševe vakcinisane sa ErbB2 prema titru antigen specifičnog IgG u serumu.

[0074] Da bi se dalje poredile strategije vakcinacije upoređivali smo poliklonski anti-ErbB2 IgG serum na bazi relativnog afiniteta. Relativan afinitet je meren u uzorcima seruma od 45 dana, dobijenim tri dana posle krajnjeg bustera. Relativan afinitet je određen pomoću ELISA inkubacijom na fiksnom razblaženju seruma na titraciji ErbB2 antigena počevši na 0.5 µg/ml. Izabrano fiksno razblaženje seruma je zasnovano na razblaženju seruma na kome su serumi dostigli plato upotrebom fiksne koncentracije ErbB2 antigena u ELISA(0.5 µ/ml). Fiksno razblaženje seruma bilo je 1:1,500 za grupe A1 i B1, i 1:20,000 za grupe C1 i D1. Da bi se uporedile pojedinačne grupe izračunavali smo i stavili na grafikon relativno vezivanje na bazi redukcije apsorbance naspram opsega razblaženja antigena. Za svaku koncentraciju antigena izračunali smo relativno vezivanje, OD od 0.5 µg/ml je podešen na 100%.

[0075] Prvo smo upoređivali DNK vakcinaciju sa (grupa B1) i bez DNK ađuvansa (grupa A1) (Slika 6A). Nije zabeležena razlika u relativnom vezivanju između grupa koje su primale DNK (grupa A1) ili DNK ađuvans (grupa B1). Ovo je ukazalo na to da DNK ađuvans nije pojačao afinitet poliklonskog seruma. Pored toga, da bi se poredio prajming imunog odgovora sa DNK praćen proteinskim busterom upoređivali smo serume DNK-proteina (grupa C1) i proteina (grupa D1) (Slika 6B). Relativno vezivanje je bilo značajno više za grupu C1 nego za grupu D1 (p < 0,001 u koncentracijama antigena 0.0625 i 0.0313 µg/ml). Ovo sugeriše da je relativan afinitet poliklonskog seruma bio u proseku viši za miševe u grupi C1 nego za miševe u grupi D1.

[0076] Izolacija i analiza tkiva iz imunizovanih miševa: Ukupne frakcije slezine i ukupne frakcije preponskog limfnog čvora iz miševa vakcinisanih sa ErbB2 i HA sakupljene su i čuvane u Trizol LS. Drenaža preponskog limfnog čvora iz tetovirane noge je izolovana i čuvana u Trizol LS. Pored toga obogatili smo IgG B ćelijsku grakciju slezine sa MACS iz miševa imunizovanih upotrebom strategije C1 i C2. Konačno smo odredili frakciju IgG+ B ćelija slezine u svim miševima vakcinisanim sa ErbB2 i HA. Za izolaciju IgG+ B ćelija slezine izveli smo MACS prečišćavanje od dva koraka. U prvom koraku izvršili smo depleciju ne-B ćelije upotrebom biotinilovanih antitela specifičnih za ne-B ćelije. U drugom koraku obogatili smo IgG B ćeliej slezine upotrebom anti-lgG1 i anti-lgG2ab specifičnih antitela. Tabela 11 daje prikaz iz kojih miševa su izolovane IgG (IgG1 i IgG2ab) B ćelije slezine. Čistoća izolovanih IgG frakcija je određena pomoću FACS upotrebom antitela specifičnih za B ćeliju i antitela specifičnih za IgG1/lgG2ab. % Ig B ćelija je određen bojenjem frakcije ćelija posle koraka deplecije. Tabela 11 rezimira prinos i čistoću izolovanih IgG+ B ćelijskih frakcija po mišu i antigen korišćen za imunizaciju.

Tabela 11: prinos i čistoća izolovanih IgG+ B ćeijskih frakcija

[0077] Da bi se ispitalo koji protokol daje najbolju indukciju kompartmenta memorijske B ćelije, ispitivali smo veličinu IgG B ćelijskog kompartmenta u slezini i iLN po svakoj strategiji vakcinacije pomoću FACS. Koristili smo koktel anti-IgG1-FITC i anti-IgG2ab-FITC monoklonskih antitela za vizuelizaciju IgG B ćelijske frakcije. Tabela 12 daje prikaz procenata B ćelija unutar ograde limfocita i procente IgG B ćelija unutar B ćelijske frakcije po mišu i tkivu.

Tabela 12: IgG+ B ćelijska frakcija u slezini i limfnom čvoru miševa vakcinisanih sa ErbB2

[0078] Miševi iz grupe C1 (DNK-protein) koji su primili ispravan i.p. buster sa ErbB2-Fc proteinom na dan 28 (miševi 35-37) imali su najveću frakciju IgG+ B ćelija po B ćelijskoj populaciji slezine. Ovo je očekivano jer je i.p. injekcija direktan put antigena do slezine. Procenti IgG+ B ćelija u iLN grupe A1 (DNK) i B1 (DNK ađuvans) su bili u opsegu između 1.8-15.47 sa prosečnom IgG+ B ćelijskom frakcijom od 4.3 i 5.7 za grupu A1 ili B1, respektivno. Zanimljivo, miševi iz grupe A1 i B1 sa najvišom frakcijom IgG+ B ćelija u iLN takođe su sadržali viši procenat IgG+ B ćelija slezine. Analiza procenata IgG B ćelija u iLN miševa vakcinisanih sa HA pokazala je da su ovi miševi imali u proseku slične procente IgG+ B ćelija na sve iLN B ćelije kao što se nalazi u A1 i B1 gupama. Prosečni procenti IgG+ B ćelija u iLN od DNK vakcinisanih (grupa A2) i DNK+ađuvansom vakcinisanih (grupa B2) miševa bili su 5.0 i 3.0, respektivno. Slika 7 daje poređenje procenata IgG B ćelija/iLN B ćelija po strategiji vakcinacije i po antigenu. Ukratko, ovi podaci su pokazali da je drenaža iLN od miševa vakcinisanih samo sa DNK (grupa A) ili miševa vakcinisanih sa DNK+ađuvansom (grupa B) imalo značajnu frakciju IgG+ B ćelija. Miševi koji su primili proteinski buster (grupa C) sadržali su veću IgG+ B ćelijsku populaciju u slezini i iLN.

[0079] Zaključujemo da su miševi koji su vakcinisani sa DNK ili vakcinisani sa DNK i primili buster sa proteinom razvili snažan antigen-specifičan titar IgG u serumu. Relativni afinitet seruma protiv ErbB2 može biti značajno povećan upotrebom protokola imunizacije sa DNK proteinom umesto protokola imunizacije proteinom. Mala varijacija antigen IgG titra u serumu između pojedinačnih miševa vakcinisanih sa DNK pokazuje da je postupak DNK tetoviranja izvođen konzistentno. DNK vakcinacija sa ERbB2 i HA rezultira u snažnom antigen-specifičnom odgovoru antitela.

[0080] Objavljeno je da je ađuvantni efekat plazmidne DNK posredovan preko njegove strukture dvostrukog lanca, koja aktivira Tbkl-zavisne urođene imune puteve prenosa signala u odustvu HRs (Ishii et al., 2008). Prema tome, očekuje se da ko-primena Tbkleksprimirajućeg plazmida dodatno pojačava imunogenost indukovanu DNK vakcinom. U našoj postavci, nismo zabeležili koristan efekat ko-primene pBoost3 vektora koji kodira Tbkl. Ko-primena pBoost3 zajedno sa vektorom koji kodira antigen nije uspela da pruži veći titar u serumu, povećani relativni afinitet ili pojačano formiranje IgG B ćelije.

[0081] FACS analiza je pokazala da drenaža ilN u mišu vakcinisanom sa samo DNK (grupa A i B) sadrži značajnu IgG+ B ćelijsku frakciju. Međutim, broj IgG B ćelija koji imože biti izlovan iz jedne drenaže ilN je veoma ograničen zbog veličine lN. Pored toga, frakcija IgG+ B ćelija u ilN je značajno varirala između pojedinačnih miševa vakcinisanih sa DNK. Ovo bi moglo da bude rezultat varijacije u primeni DNK preko DNK tetoviranja. Zanimljivo, miševi sa visokim procentom ilN IgG+ B ćelija su takođe imali veći procenat IgG+ B ćelija slezine. Sledeća strategija za dobijanje velikog broja IgG+ B ćelija je izvršavanje bustera miševa vakcinisanih sa DNK jednom sa proteinom emulgovanim u TitermaxGold. Miševi koji su vakcinisani sa DNK i proteinom (grupa C) razvili su značajnu IgG+ B ćelijsku frakciju slezine (pored velike ilN IgG+ B ćelijske frakcije). Ako protein nije dostupan za buster imunizacije, buster miševa se može izvesti sa ćelijama koje eksprimiraju antigen ili virususlične čestice koje eksprimiraju antigen. U zaključku, DNK vakcinacija preko DNK tetoviranja je efikasna i snažna strategija vakcinacije za indukciju antigen-specifičnog humoralnog imunog odgovora. Miševi koji su vakcinisani samo sa DNK (grupa A) razvili su detektabilnu IgG+ B ćelijsku frakciju.

Primer 6: Konstrukcija eukariotskih vektora za efikasnu proizvodnju pojedinačnih VL bispecifičnih humanih monoklonskih antitela

[0082] Jedan aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na mogućnost upotrebe informacije sekvence iz analize učestalosti VH gena i/ili HCDR3 toplotnih mapa za generisanje panela antitela u željenom terapeutskom formatu i skrining tih antitela za vezivanje i/ili funkcionalnu aktivnost. Jedan takav format je bispecifičan IgG molekul. Konvencionalni IgG molekuli se sastoje od dva identična teška i dva identična laka lanca. Teški lanci su polipeptidi napravljeni od posebnih domena: VH regiona za prepoznavanje antigena, CH1 domena, zglobnog regiona, CH2 domena i CH3 domena. Sparivanje teških lanaca da bi se formirao homodimer je rezultat visoko afinitetnih interakcija između CH3 domena, gde kovalentno spajanje dva teška lanca rezultira iz formiranja disulfidnog mosta između cisteina u zglobnom regionu teških lanaca.

[0083] CH3 region je korišćen za uvođenje aminokiselinskih supstitucija koje inhibiraju formiranje homodimera (sparivanje teških lanaca sa identičnim CH3 regionom) uz stimulisanje heterodimerizacije (sparivanje 2 različita teška lanca sa komplementarno konstruisanim CH3 regionima). Ovo je rezultiralo u efikasnom formiranju heterodimera posle koekspresije CH3 konstruisanih teških lanaca (Gunasekaran et al., 2010; WO2006/106905; WO2009/089004).

[0084] U ovom primeru, konstruisali smo i testirali ekspresione vektore za efikasnu proizvodnju humanih bispecifičnih antitela sa jednim VL. Ukupna strategija je ta da su genetički konstrukti koji kodiraju 2 različita antitela kotransficirani u jednu ćeliju. Upotrebom komplementarno konstruisanih CH3 regiona za 2 različita teška lanca, formiranje heterodimera (bispecifičnih antitela) je favorizovano u odnosu na formiranje homodimera (monospecifičnih antitela). Prethodno, pokazano je da kombinacija K409D:K392D u CH3 domenu jednog teškog lanca u kombinaciji sa D399’K:E356’K u CH3 domenu drugog lanca (na taj način, takozvani komplementarno konstruisani CH3 regioni) vodi heterodimerizaciju konstantnih regiona humanih teških lanaca u konstruisanom bispecifičnom molekulu (Gunasekaran 2010). Koristili smo isto aminokiselinske parove u CH3 regionima konstrukata koji kodiraju IgG antitela sa jednim VL za ustanovljavanje da li bi ovo rezultiralo u efikasnoj proizvodnji bispecifičnih humanih IgG monoklonskih antitela sa jednim VL preko heterodimerizacije.

[0085] Preuređeni jedan IGVK1-39 VL gen je kloniran u eukariotski ekspresioni vektor koji sadrži humane gama 1 i kapa konstantne regione esencijalno kao što je opisano (Throsby et al., 2008/de Kruif et al., 2009). Vektor MV1201 sadrži DNK koja kodira CH3 domen sa K409D:K392D aminokiselinskim supstitucijama u kombinaciji sa VH regionom koji kodira humano monoklonsko antitelo sa jednim VL specifično za fibrinogen. Vektor MV1200 sadrži DNK koja kodira CH3 domen sa D399’K:E356’K aminokiselinskim supstitucijama u kombinaciji sa VH regionom koji kodira humano monoklonsko antitelo sa jednim VL specifično za tiroblobulin (Gunasekaran et al., 2010/de Kruif et al., 2009).

[0086] MV1201 i MV 1200 su ko-transficirani u HEK293T ćelije i prolazno eksprimirani kao što je opisano (de Kruif et al., 2009). Posle 13 dana, supernatanti su sakupljeni i prečišćeni pomoću protein A afinitetne hromatografije upotrebom standardnih protokola. Protein A-prečišćeni IgG je analiziran pomoću SDS-PAGE pod redukcionim i ne-redukcionim uslovima; bojenje proteina u gelu je izvedeno sa koloidnom plavom. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 8 pod ne-redukcionim SDS-PAGE, detektovana je jedna traka sa molekulskom težinom od 150 kD, koja pokazuje da su sa ovim konstruktima formirani hetero- i/ili homodimeri i nijedan IgG polu molekul koji se sastoji od nesparene kombinacije teškog/lakog lanca. Posle protein A prečišćavanja, masena spektrometrija je korišćena za identifikaciju različitih vrsta IgG proizvedenih pomoću prolazno transficiranih ćelija. Kao što je prikazano na Slici 9, supernatant je sadržao 96% heterodimernog IgG i 3 % i 1% od svakog od roditeljskih monoklonskih antitela. Na taj način, ovi protein A supernatanti mogu biti neposredno korišćeni za skrining vezujuće aktivnosti i/ili funkcionalne analize bispecifičnih antitela.

Primer 7: Generisanje bispecifičnih antitela specifičnih za ErbB1 i ErbB2 tumorske antigene i analiza ubijanja ćelija tumora i inhibicije proliferacije tumorskih ćelija

[0087] Erbb1 i ErbB2 su receptori faktora rasta koji imaju važnu ulogu u razvoju i napredovanju tumora. Kombinacije monoklonskih antitela protiv ErbB1 i ErbB2 pokazale su sinergističke efekte u životinjskim modelima kancera (Larbouret et al., 2007) i prema tome predstavljaju obećavajuće terapeutike za lečenje kancera kod ljudi. U ovom primeru, pokazujemo da, posle imunizacije, humana monoklonska antitela mogu biti dobijena od transgenih miševa sa jednim humanim lakim lancem preko sekvenciranja visoke propustljivosti i stvaranja toplotnih mapa CDR3 i da kombinacije ErbB1 i ErbB2 antitela sa aditivnim i/ili sinergističkim efektom mogu biti brzo identifikovane pomoću in vitro skrininga.

[0088] Transgeni miševi sa jednim humanim lakim lancem su imunizovani sa ErbB2 DNK i proteinom kao što je opisano u primeru 5. Upotrebom istih protokola, sledeća grupa miševa je imunizovana sa ErbB1 DNK i proteinima upotrebom istih postupaka. Za miševe imunizovane sa ErbB1 i ErbB2, slezine su izolovane i VH repertoar IgG+ B ćelija je analiziran pomoću sekvenciranja visoke propustljivosti kao što je opisano u primerima 1 i 2. Posle konstrukcije CDR3 toplotnih mapa, prvih 100 grupa VH sekvence za svakog od ErbB1 i ErbB2 imunizovanih miševa su izabrani za dodatnu analizu. Za sakupljanje ErbB1 i ErbB2 VH sekvenci, VH sekvece reprezentativne za svaki klaster, to je VH gen koji je najčešće prisutan unutar klastera, koji može biti gen klicine linije ili gen koji sadrži mutacije, su klonirane u ekspresionom vektoru koji sadrži jedan lak lanac i CH3 mutaciju; ErbB1 VHs u MV1200 i ErbB2 VHs u MV1201. HEK293 ćelije su prolazno transficirane sa svih 2500 kombinacija (50 puta 50) kloniranih grupa sekvenci ErbB1 i ErbB2 VH upotrebom ekspresionih konstrukata koji vode heterodimerizaciju da bi se formirala ErbB1 x ErbB2 bispecifična antitela kao što je opisano u primeru 6. Posle 13 dana, supernatanti kulture su sakupljeni i prečišćeni upotrebom protein A afinitetne hromatografije. Prečišćeni IgG je korišćen u funkcionalnim analizama ubijanja tumorske ćelije i inhibicije proliferacije tumorske ćelije u stanju tehnike.

[0089] Posle identifikacije ErbB1 x ErbB2 bispecifičnih antitela sa potentnom antitumorskom aktivnošću, kolekcije VH sekvence prisutne u klasterima koje imaju identičan ili sličan CDR3 i koje su korišćene u funkcionalnim bispecifičnim antitelima mogu biti dalje pojednostavljene upotrebom istog pristupa da bi se našli oni VH članovi u kolekciji koji daju najpotentniju anti-tumorsku aktivnost.

Primer 8: Analiza dubokog sekvenciranja i raznovrsnosti HCDR3 iz uzoraka dobijenih iz B ćelija slezine iz ne-imunizovanih naspram imunizovanih miševa

[0090] Da bi se pokazalo da se selektivno širenje klonova identifikovanih pomoću jedinstvenih HCDR3 sekvenci posle imunizacije može analizirati pomoću dubokog sekvenciranja, B ćelije slezine iz ne-imunizovanih i imunizovanih miševa su podvrgnute obogaćenju za B ćelije kao što je opisano u prethodnom tekstu. Nukleinske kiseline su izolovane i, gde je potrebno amplifikovane kao što je opisano u prethodnom tekstu i cDNK je poslata u Eurofins za sekvenciranja visoke propustljivosti.

[0091] Miševi transgeni za huVK1-39 i za minilokus humanog teškog lanca (HC) imunizovani su samo sa proteinom (fuzionisan sa Fc) ili upotrebom alternativnog proteina i ćelijskih imunizacija (sa ćelijama koje eksprimiraju isti antigen na njihovoj površini). cMet i EGFR su korišćeni kao antigeni u ovom primeru (dve životinje po grupi):

Grupa A: cMet-Fc u Titermax Gold ađuvansu (TMG) na dane 0, 14 i 28, i cMet-Fc u PBS na dan 47.

Grupa B: cMet-Fc u TMG na dane 0, 14 i 28, MKN45 ćelije u PBS na dan 49, i cMet-Fc u PBS na dan 64.

Grupa C: EGFR-Fc u TMG na dane 0, 14 i 28, i EGFR-Fc u PBS na dan 54.

Grupa D: EGFR-Fc u TMG na dane 0, 14 i 28, A431 ćelije u PBS na dan 49, i EGFR-Fc u PBS na dan 64.

[0092] Korišćene doze su bile 20 µg proteina u 125 µl TMG, 20 µg proteina u 200 µl PBS i 2x10E6 ćelija u 200 µl PBS. Ne-imunizovani transgeni miševi su oko iste starosti kao imunizovani miševi prilikom žrtvovanja (16 nedelja, tri miša ukupno).

[0093] Slezine su sakupljene iz svih miševa (za imunizovane miševe tri dana posle poslednje imunizacije) i obrađene kao što je opisano u Primeru 2. Da bi mogli da sekvenciramo mnoge različite uzorke u smeši sa sniženim troškovima, obeleživač za identifikaciju materijala (MID) specifičan za svakog miša je dodat na 5’ kraj svakog prajmera korišćenog u PCR amplifikaciji cDNK zajedno sa SMART sekvencom (kao što je detaljno opisano u Primeru 2). Dodavanje MID obeleživača je na taj način omogućilo puling materijala iz nekoliko miševa posle PCR amplifikacije i pre 454-sekvenciranja. Prajmeri za amplifikaciju su na taj način podešeni tako da obuhvataju komplementarne sekvence MID obeleživača (Tabela 3).

[0094] Za ne-imunizovane miševe, suspenzije ćelija slezina su obogaćene za B-ćelije upotrebom anti-CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec, kat. br.130-052-201) i zatim sortirane pomoću protočne citometrije za izolaciju zrelih, antigen-intaktnih B ćelija koje eksprimiraju IgM ili IgD. Ovo je izvedeno sortiranjem za CD19-pozitivne, B220- pozitivne, huVK1-39-pozitivne B ćelije i B ćelije negativne za mišji laki lanac i njihovim razlikovanjem u IgM-pozitivnim ili IgD-pozitivnim ćelijskim frakcijama. U reverznim prajmerima korišćenim za sintezu cDNK, korišćene su sekvence koje vezane za sekvence koje kodiraju IgM ili IgD. Da bi moglo da se izvede pulovano sekvenciranje za različite uzorke, MID obeleživači su korišćeni ovde za identifikaciju materijala iz različitih uzoraka (Tabela 14).

Tabela 13: Prajmeri korišćeni za materijal za duboko sekvenciranje iz imunizovanih miševa (jedan MID obeleživač po mišu).

Tabela 14: Prajmeri korišćeni za materijal za duboko sekvenciranje iz ne-imunizovanih miševa (jedan MID obeleživač po ćelijskoj populaciji po mišu).

[0095] Za analizu rezultata sekvenciranja, algoritmi koji su napravljeni po narudžbini su korišćeni za identifikaciju VH gena i poravnanje HCDR3 regiona. Ukratko, sirovi podaci sekvence su uvezeni u dodeljeni kompjuterski program, koji je translatirao sve nukleotidne sekvence u šest potencijalnih proteinskih okvira čitanja, od kojih je svaki zatim podvrgnut sledećim kriterijumima uzastopnim filtriranja da bi se našli ispravni i kompletni humani VH geni:

- Sekvence kraće od 75 aminokiselina su odbačene jer je ovo smatrano minimalnom dužinom za pozitivnu identifikaciju VH gena.

- Sekvence bez dva kanonska cisteina su odbačene jer su korišćene za identifikaciju VH gena i okvira čitanja.

- Okviri 1 do 4 su traženi na osnovu homologije sa VH genima u bazi podataka. Ako jedan ili više od ovih okvira nije nađen, sekvenca je odbačena.

- CDR1, 2 i 3 su identifikovani na bazi identifikovanih okvirnih regiona. Sekvenca je odbačena kada je stop kodon bio prisutan u jednom ili više od CDRs.

[0096] Sekvence koje ispunjavaju ove kriterijume su klasifikovane kao zabeležene VH sekvence. Sve izabrane VH sekvence su zatim podvrgnute drugom algoritmu za njihovo grupisanje u klastere sa 100% identičnim HCDR3.

[0097] Ovi podaci su rezultirali u označenim VH genima i ovi VH geni su grupisani u klastere na osnovu HCDR3 sekvence. Da bi se analiziralo selektivno širenje HCDR3 regiona u VH genima u imunizovanim naspram ne-imunizovanih miševa, rezultati su prikazani u tabeli i izraženi kao odnos označenih VH regiona u klasterima sa identičnim HCDR3 regionima (Tabela 15). Radi lakše interpretacije, rezultati za posebne B ćelijske frakcije iz neimunizovanih miševa su pulovane tako da bi odnos mogao da biti analiziran za ukupne zrele, antigen-intaktne B ćelije.

Tabela 15: Rezultati dubokog sekvenciranja iz imunizovanih naspram ne-imunizovanih miševa.

[0098] Iz tabele 15 može se lako zapaziti da je broj klastera sa identičnim HCDR3 u neimunizovanim miševima reda veličine obeleženih VH gena, što je reflektovano u odnosima VH/klastera blizu 1.0. Ovo ukazuje na to da kod ovih miševa nije bilo pokretača za selektivno širenje B ćelija koje bi nosile VHs sa određenim HCDR3 regionima, kao što bi se očekivalo u odsustvu imunogenog stimulusa. Nasuprot tome, kod imunizovanih odnos VH regiona u klasterima sa identičnim HCDR3 je, iako varijabilan između pojedinačnih miševa, mnogo viši i odnosi VH/klaster su u opsegu od 3.2 do 20.0. Na taj način, kod imunizovanih miševa velika frakcija HCDR3 sekvenci je prisutna u visokoj frekvenciji u repertoaru verovatno kao rezultat klonalnog širenja antigen-reaktivnih B ćelija kao posledica imunizacije miševa. Ovo ukazuje na to da su VH regioni visoke učestalosti klonovi koji su specifični za antigen od interesa i sugeriše da duboko sekvenciranje ovih VH gena i njihova ekspresija kao Fab ili IgG zajedno sa zajedničkim lakim lancem daće antitela sa specifičnošću za antigen. Podaci koji pokazuju da je ovo zaista slučaj su prikazani u Primeru 9. Funkcionalnost ovih antigen-specifičnih antitela može zatim biti testirana u funkcionalnim analizama.

Primer 9

Duboko sekvenciranje VH repertoara i generisanje HCDR3 toplotne mape od imunizovanih miševa koji eksprimiraju zajednički laki lanac.

[0099] Kao što je jasno iz Primera 8, velika frakcija HCDR3 sekvenci je prisutna u visokoj učestalosti u VH repertoaru imunizovanih miševa koji nose zajednički laki lanac što je suprotno ne-imunizovanim miševima. U predmetnom primeru, repertoar ovih najčešće korišćenih VH gena iz imunizovanih miševa je duboko sekvenciran da bi se našli antigenspecifični vezujući domeni poreklom od teškog lanca koji posle kombinovanja sa zajedničkim lakim lancem daju funkcionalna antitela protiv ciljnog mesta od interesa.

[0100] Materijal iz miševa koji nosi huVK1-39 transgen i huimani HC minilokus posle imunizacije sa cMet ili EGFR (protein-Fc, ili protein-Fc alternativno sa ćelijama koje eksprimiraju odgovarajuće proteine na njihovoj površini; dva miša po strategiji, dakle osam ukupno) je generisan i obrađen kao što je opisano u Primeru 8.

[0101] Duboko sekvenciranje i analiza VH repertoara uključujući grupisanje u klastere na bazi identičnosti HCDR3 otkrila je ukupno 287920 sekvenci koje mogu biti grupisane u 813 jedinstvena klastera. Sve sekvence u klasteru su poreklom od istog VH gena klicine linije. Klasteri koji su sadržali više od 50 VHs (sa identičnim HCDR3 na aminokiselinskom nivou, ali inače različitim VH regionima) su sakupljeni u jednu bazu podataka za repertoare iz svih osam miševa. Ovo je izvedeno s obzirom da je (ograničeno) preklapanje HCDR3 sekvenci zabeleženo između repertoara osam miševa. VH sekvence su zatim rangirane na dužinu HCDR3 i identičnost HCDR3 sekvence. Sledeće, HCDR3 sekvence su dalje grupisane na osnovu verovatnoće jednistvenog VDJ (tj. ako je HCDR3 u različitim klasterima sadržao <2 razlike aminokiselina kada su smatrane delom istog klastera i grupisane su zajedno). Ovaj postupak je izveden ručno u Excel worksheet, ali bi se mogao bolje izvesti na osnovu poravnanja HCDR3 nukleotidne sekvence. Alati za olakšavanje ovoga su u razvoju. Ovo je rezultiralo u ukupno 399 klastera sa istim brojem ukupnih sekvenci. Klasteri su zatim poravnati na osnovu njihove veličine (tj. ukupnog broja sekvenci u klasteru) i izabrano je prvih ∼100 klastera za svako ciljno mesto. Ovo je rezultiralo u ukupno 228 jedinstvenih sekvenci: 134 iz cMet-imunizovanih miševa i 94 iz EGFR-imunizovanih miševa. Konačno da bi se izabrala nukleotidna sekvenca koja će biti ponovo klonirana kao IgG iz svakog klastera, poravnanje VH aminokiselinskih sekvenci za svaki klaster je analizirano i najčešća sekvenca u klasteru je izabrana za ponovno kloniranje.

[0102] Odgovarajuće nukleotidne sekvence su dobijene, modifikovane tako da sadrže restrikciona mesta za kloniranje u ekspresioni vektor i za uklanjanje prekomernih restrikcionih mesta pomoću tihe mutacije i zatim sintetisane prema postupcima koji su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Sintetisani geni su klonirani u velikoj količini u vektor za ekspresiju u formatu humanog IgG1 uljučujući huVK1-39 zajednički laki lanac. Od dobijenih klonova, 400 klonova je izabrano pomoću standardnih postupaka i sekvencirano, i masovno kloniranje je ponovljeno za nedostajuće ili neispravne sekvence do dobijanja >90% 228-repertoara. DNK je dobijena i prolazno transficirana u ćelijsku liniju koja proizvodi antitelo. Postupci korišćeni za modifikaciju sekvenci, sintezu DNK, kloniranje, sekvenciranje i proizvodnju IgG pomoću transfekcije su dobro poznati u stanju tehnike.

[0103] Koncentracija IgG proizvoda je određena upotrebom Octet tehnologije (FortéBIO) prema uputstvima proizvođača za osnovno kvantitativno određivanje sa protein A senzornim čipom sa regeneracijom (FortéBIO, kat. br.18-0004/-5010/-5012/-5013). 228 IgG su zatim podvrgnuti testiranju za antigen-specifično vezivanje pomoću ELISA u koncentraciji od 5 µg/ml. Od testiranih sekvenci, nađeno je da se 16 od 110 (15%) specifično vezuju za cMet i 6 od 88 (7%) za EGFR. Drugi česti klasteri predstavljaju, za veliku većinu, antitela koja su usmerena na Fc deo antigena. Trebalo bi navesti da Fc-rep Fc-fuzionih proteina može biti naročito imunogen (Ling 1987, Immunology, vol 62, part 1, pp 1-6). S obzirom na to da su ove sekvence poreklom od materijala od miševa imunizovanih sa Fc-fuzionim proteinima u ađuvansu, veliki deo humoralnog odgovora biće usmeren na Fc-rep (videti Primer 3 i 4). Vezivanje ćelija koja eksprimiraju antigen na njihovoj površini je bilo izvedeno samo za IgG sa vezujućim domenima poreklom od miševa koji su imunizovani sa proteinom i ćelijama, upotrebom cMet-eksprimirajućih MKN45 ćelija ili EGFR-eksprimirajućih A431 ćelija. Sav IgG iz ćelijski-imunizovanih miševa koji je bojio cMet ili EGFR u ELISA takođe je bojio ćelije koje eksprimiraju odgovarajuće antigene (podaci nisu prikazani). Očekivano je da posle imunizacije sa čistim antigenom kao što je preko DNK tetoviranja, procenat antigenspecifičnih klonova biće dodatno povećan.

[0104] Da bi se funkcionalno okarakterisao EGFR-specifičan IgG, oni su testirani za njihovu potenciju za inhibiciju EGF-indukovane ćelijske smrti A431 ćelija (Gulli et al. 1996, Cell Growth Diff 7, p.173-178). Od 5 testiranih anti-EGFR mAbs, pokazano je da 3 inhibiraju EGF-indukovanu A431 ćelijsku smrt (Slika 10). cMet-specifičan IgG su testirani za funkcionalnost određivanjem njihovog kapaciteta za kompeticiju sa nekoliko reper antitela dobijenih iz (patentne) literature za vezivanje za cMet u vezujućoj kompetitivnoj ELISA. Ukratko, 96-komorne ploče su obložene sa cMet-Fc i zatim inkubirane sa viškom jednog od nekoliko reper označenih antitela. Zatim, dodata su obeležena cMet-specifična vezujuća sredstva, a zatim peroksidazom obeleženo detekciono antitelo koje prepoznaje vezana cMet vezujuća sredstva. Poslednje je detektovano upotrebom TMB kao supstrata. Od 10 testiranih cMet mAbs, pokazano je da su 7 u kompeticiji za vezivanje cMet sa reper označenim antitelima.

[0105] Na taj način, upotrebom postupaka dubokog sekvenciranja može biti identifikovan široki panel raznovrsnih antigen-specifičnih VHs predstavljajući raznovrsnu upotrebu VH, raznovrsni HCDR3, i sazrevanje klonova.

REFERENCE

[0106]

Babcook JS, Leslie KB, Olsen OA, Salmon RA, Schrader JW. A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci USA. 93:7843-8 (1996).

Banchereau, J., de Paoli, P., Valle, A., Garcia, E. & Rousset, F. Long-term human B cell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40. Science 251, 70-72 (1991).

Bins, A.D., et aI., A rapid and patent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med 11:899-904 (2005).

Boder, E.T. & Wittrup, K.D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotech. 15, 553-557 (1997).

Cobaugh, C.W., Almagro, J.C., Pogson, M., Iverson, B. & Georgiou, G. Synthetic antibody libraries focused towards peptide ligands. J. Mol. Biol. 378, 622-633 (2008).

Chao, G. et al. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1, 755-768 (2006).

Al-Lazikani, B., Lesk, A. M. & Chothia, C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 273, 927-948 (1997).

Clackson, T., Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D. & Winter, G. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352, 624-628 (1991).

Clark. Antibody humanization: a case of the ’Emperor’s new clothes’? Immunol Today, 21:397-402 (2000).

Crowe Jr. Recent advances in the study of human antibody responses to influenza virus using optimized human hybridoma approaches. Vaccine 27 (Suppl 6), G47 (2009)

Ettinger et al. IL-21 induces differentiation of human naive and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175, 7867-7879 (2005).

Feldhaus, M.J. et al. Flow-cytometric isolation of human antibodies from a nonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library. Nat. Biotechnol. 21:163-170 (2003).

Fuchs, P., Breitling, F., Dubel, S., Seehaus, T. & Little, M. Targeting recombinant antibodies to the surface of Escherichia-coli-fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. Biotechnology 9:1369-1372 (1991).

Ge X, Mazor Y, Hunicke-Smith SP, Ellington AD, Georgiou G: Rapid construction and characterization of synthetic antibody libraries without DNA amplification. Biotechnol Bioeng 106:347-357 (2010).

Good, K.L., Bryant, V.L. & Tangye, S.G. Kinetics of human B cell behavior and amplification of proliferative responses following stimulation with IL-21. J. Immunol.

177:5236-5247 (2006).

Green, L.L. et al. Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat. Genet. 7:13-21 (1994).

Glanville J, Zhai W, Berka J, Telman D, Huerta G, Mehta GR, Ni I, Mei L, Sundar PD, Day GMR et al.: Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proc Natl Acad Sci USA 106:20216-20221 (2009).

Gunasekaran et al. J. biol. Chem. 285: 19637-46. (2010)

Harding FA, Stickler MM, Razo J, DuBridge RB. The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: residual immunogenicity resides in the CDR regions. MAbs. 2:256-65 (2010).

Harvey, B.R. et al. Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli-expressed libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9193-9198 (2004).

Hoogenboom, H.R. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat. Biotechnol.

23, 1105-1116 (2005).

Ishii, K.J., et aI., TANK-binding kinase-l delineates innate and adaptive immune responses ta DNA vaccines. Nature, 451:725-9 (2008).

Jacob, J., et aI., Activity of DNA vaccines encoding self or heterolagaus Her-2ineu in Her-2 or neu transgenic mice. Cell Immunol. 240:96-106 (2006).

Jacob, 1.B., et aI., Combining human and rat sequences in her-2 DNA vaccines blunts immune talerance and drives antitumor immunity. Cancer Res70:119-28 (2010).

Jechlinger, W., Optimization and delivery of plasmid DNA for vaccination. Expert Rev Vaccines 5: 803-25 (2006).

Jiang X, Suzuki H, Hanai Y, Wada F, Hitomi K, Yamane T, Nakano H. A novel strategy for generation of monoclonal antibodies from single B cells using rt-PCR technique and in vitro expression. Biotechnol Prog. 22:979-88 (2006).

Jin A, Ozawa T, Tajiri K, Obata T, Kondo S, Kinoshita K, Kadowaki S, Takahashi K, Sugiyama T, Kishi H et al.: A rapid and efficient single-cell manipulation method for screening antigen-specific antibody-secreting cells from human peripheral blood. Nat Med 15:1088-1092 (2009).

Kato M, Sasamori E, Chiba T, Hanyu Y. Cell activation by CpG ODN leads to improved electrofusion in hybridoma production. J Immunol Methods. 2011 Aug 22. [Epub ahead of print]

Kim, C.H. et al. Sub specialization of CXCR5+ T cells: B helper activity is focused in a germinal center-localized subset of CXCR5+ T cells. J. Exp. Med. 193: 1373-1381 (2001). Köhler, G. & Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497 (1975).

de Kruif J, Kramer A, Visser T, Clements C, Nijhuis R, Cox F, van der Zande V, Smit R, Pinto D, Throsby M, Logtenberg T. Human immunoglobulin repertoires against tetanus toxoid contain a large and diverse fraction of high-affinity promiscuous V(H) genes. J Mol Biol. 387:548-58 (2009).

Kwakkenbos, M.J. et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptorpositive human memory B cells by genetic programming. Nat. Med. 16: 123-128 (2010). Larbouret C, Robert B, Navarro-Teulon I, Thezenas S, Ladjemi M, Morisseau S, et al. In vivo therapeutic synergism of anti-epidermal growth factor receptor and anti-HER2 monoclonal antibodies against pancreatic carcinomas. Clin Cancer Res. 13:3356-62 (2007).

Lee, C.M.Y., Iorno, N., Sierro, F. & Christ, D. Selection of human antibody fragments by phage display. Nat. Protoc. 2: 3001-3008 (2007).

Li, L.H., Hui, S.W. Characterization of PEG-mediated electrofusion of human erythrocytes. Biophys. J. 67: 2361 (1994).

Ling et al. Immunology 1987, vol 6 part 1, 1-6

Lonberg, N. et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368: 856-859 (1994).

Love, J.C., Ronan, J.L., Grotenbreg, G.M., van der Veen, A.G. & Ploegh, H.L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nat. Biotechnol. 24: 703-707 (2006).

Manz, R.A., Hauser, A.E., Hiepe, F. & Radbruch, A. Maintenance of serum antibody levels. Annu. Rev. Immunol. 23: 367-386 (2005).

Mao H, Graziano JJ, Chase TM, Bentley CA, Bazirgan OA, Reddy NP, Song BD, Smider W. Spatially addressed combinatorial protein libraries for recombinant antibody discovery and optimization. Nat Biotechnol. 28:1195-202 (2010).

Mazor, Y., Blarcom, T.V., Mabry, R., Iverson, B.L. & Georgiou, G. Isolation of engineered, full-length antibodies from libraries expressed in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 25: 563-565 (2007).

Meijer, P.-J. et al. Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing. J. Mol. Biol. 358: 764-772 (2006).

Middendorp, S., G.M. Dingjan, and R.W. Hendriks, Impaired precursor B cell differentiation in Bruton’s tyrosine kinase-deficient mice. J Immunol 168: 2695-703 (2002).

Mohapatra, S. & San Juan, H. Designer monoclonal antibodies as drugs: the state of the art. Exp. Rev. Clin. Immunol. 4: 305-307 (2008).

Ogunniyi AO, Story CM, Papa E, Guillen E, Love JC: Screening individual hybridomas by micro-engraving to discover monoclonal antibodies. Nat Protoc 4:767-782 (2009).

Persson, H., Lantto, J. & Ohlin, M. A focused antibody library for improved hapten recognition. J. Mol. Biol. 357: 607-620 (2006).

Pokorna, D., I. Rubio, and M. Muller, DNA-vaccination via tattooing induces stronger humaral and cellular immune responses than intramuscular delivery supparted by molecular adjuvants. Genet Vaccines Ther. 6: 4 (2008).

Ponsel D, Neugebauer J, Ladetzki-Baehs K, Tissot K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules.

16:3675-700 (2011).

Quark, 5.G., et aI., GMP production of pDfRMA IT for vaccination against melanoma in a phase I clinical trial. Eur J Pharm Biopharm, 70:429-38 (2008).

Ravn U, Gueneau F, Baerlocher L, Osteras M, Desmurs M, Malinge P, Magistrelli G, Farinelli L, Kosco-Vilbois MH, Fischer N: By-passing in vitro screening-next generation sequencing technologies applied to antibody display and in silico candidate selection. Nucleic Acids Res 38:e193 (2010).

Reddy ST, Ge X, Miklos AE, Hughes RA, Kang SH, Hoi KH, Chrysostomou C, Hunicke-Smith SP, Iverson BL, Tucker PW, Ellington AD, Georgiou G. Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variablegene repertoire of plasma cells. Nat Biotechnol. 28:965-9 (2010).

Reddy ST, Georgiou G. Systems analysis of adaptive immunity by utilization of highthroughput technologies. Curr Opin Biotechnol. 4:584-9 (2011).

Ruuls SR, Lammerts van Bueren JJ, van de Winkel JG, Parren PW. Novel human antibody therapeutics: the age of the Umabs. Biotechnol J. 3:1157-71 (2008).

Schaffitzel, C., Hanes, J., Jermutus, L. & Plückthun, A. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J. Immunol. Methods 231: 119-135 (1999).

Schmidlin H, Diehl SA, Blom B. New insights into the regulation of human B-cell differentiation. Trends Immunol. 30:277-85 (2009).

Shapiro-Shelef, M. & Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nat. Rev. Immunol. 5: 230-242 (2005).

Smith K, Garman L, Wrammert J, Zheng N-Y, Capra JD, Ahmed R, Wilson PC: Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4:372-384 (2009.)

Stevenson, F.K., et aI., DNA vaccines to attack cancer. Proc Natl Acad Sci. 1015uppl 2: p.

14646-52 (2004).

Story CM, Papa E, Hu C-CA, Ronan JL, Herlihy K, Ploegh HL, Love JC: Profiling antibody responses by multiparametric analysis of primary B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105:17902-17907 (2008).

Tajiri K, Kishi H, Tokimitsu Y, Kondo S, Ozawa T, Kinoshita K, Jin A, Kadowaki S, Sugiyama T, Muraguchi A: Cellmicroarray analysis of antigen-specific B-cells: single cell analysis of antigen receptor expression and specificity. Cytometry 71:961-967 (2007).

Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H: Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329:112-124 (2008).

Tokimitsu Y, Kishi H, Kondo S, Honda R, Tajiri K, Motoki K, Ozawa T, Kadowaki S, Obata T, Fujiki S et al.: Single lymphocyte analysis with a microwell array chip. Cytometry 71:1003-1010 (2007).

Throsby, M., Geuijen, C., Goudsmit, J., Bakker, A. Q., Korimbocus, J., Kramer, R. A. et al. Isolation and characterization of human monoclonal antibodies from individuals infected with West Nile virus. J. Virol.80, 6982-6992 (2006).

Traggiai, E., Becker, S., Subbarao, K., Kolesnikova, L., Uematsu, Y., Gismondo, M.R., Murphy, B.R., Rappuoli, R., Lanzavecchia, A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871 (2004).

Weeratna, R., Comanita, L., Davis, H.L. CPG ODN allows lower dose of antigen against hepatitis B surface antigen in BALB/c mice. Immunol. Cell Biol. 81: 59 (2003).

Whittington, P.J., et aI., DNA vaccination controls Her-2+ tumors that are refractory to targeted therapies. Cancer Res, 68:7502-11 (2008).

Wrammert, J. et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature 453: 667-671 (2008).

Wu, C., Hua Ying, Grinnell, C., Bryant, S., Miller, R., et. al., Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin Nature Biotechnology 25, 1290 - 1297 (2007).

Yu, X., McGraw, P.A., House, F.S., Crowe Jr., J.E. An optimized electrofusion-based protocol for generating virusspecific human monoclonal antibodies. J. Immunol. Methods 336, 142 (2008).

Zubler RH, Werner-Favre C, Wen L, Sekita K, Straub C. Theoretical and practical aspects of B-cell activation: murine and human systems. Immunol Rev. 99:281-99 (1987).

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju najmanje dva antitela koja se vezuju za izabrani antigen ili epitop od interesa, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje sledeće korake:

a) obezbeđivanje populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL repertoar koji ne sadrži više od 10 različitih VL regiona, pri čemu uglavnom sve od navedenih B ćelija nose najmanje jedan VL, pri čemu je navedena populacija B ćelija dobijena od transgene ne-humane životinje koja nosi ograničeni VL repertoar, pri čemu se navedeni ograničeni VL repertoar sastoji od manje od 10 VL, pri čemu je navedena ne-humana životinja imunizovana sa navedenim antigenom, i pri čemu navedena populacija B ćelija sadrži B ćelije dobijene iz slezine i/ili najmanje jednog limfnog čvora,

b) dobijanje nukleinskih kiselina iz navedenih B ćelija,

c) izborno, amplifikacija sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina u navedenom uzorku,

d) najmanje delimično sekvenciranje uglavnom svih dobijenih nukleinskih kiselina iz koraka b) ili proizvoda amplifikacije iz koraka c),

e) izvođenje analize učestalosti VH sekvenci iz koraka d), koje sadrže CDR3 sekvence teškog lanca,

f) selekciju 20 najčešćih VH sekvenci,

g) obezbeđivanje ćelija domaćina sa najmanje jednim vektorom koji sadrži najmanje jednu od navedenih VH sekvenci i najmanje jednu VL sekvencu navedenog ograničenog VL repertoara,

h) kultivisanje navedenih ćelija domaćina i omogućavanje ekspresije VH i VL polipeptida,

i) dobijanje navedenih antitela.

2. Postupak za proizvodnju najmanje dva antitela koja se vezuju za izabrani antigen ili epitop od interesa, pri čemu navedeni postupak sadrži najmanje sledeće korake:

a) obezbeđivanje populacije B ćelija koje eksprimiraju ograničeni VL repertoar koji ne sadrži više od 10 različitih VL regiona, pri čemu uglavnom sve od navedenih B ćelija nose najmanje jedan VL, pri čemu je navedena populacija B ćelija dobijena iz transgene ne-humane životinje koja nosi ograničeni VL repertoar, pri čemu se navedeni ograničeni VL repertoar sastoji od manje od 10 VL, pri čemu je navedena ne-humana životinja imunizovana sa navedenim antigenom, i pri čemu navedena populacija B ćelija sadrži B ćelije dobijene iz slezine i/ili najmanje jednog limfnog čvora,

b) dobijanje nukleinskih kiselina iz navedenih B ćelija,

c) izborno, amplifikaciju sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina u navedenom uzorku,

d) najmanje delimično sekvenciranje uglavnom svih dobijenih nukleinskih kiselina iz koraka b) ili proizvoda amplifikacije iz koraka c),

e) izvođenje analize učestalosti VH sekvenci iz koraka d), koje sadrže CDR3 sekvence teškog lanca,

f) selekciju 20 najčešćih VH sekvenci,

g) obezbeđivanje ćelija domaćina sa najmanje jednim vektorom koji sadrži najmanje jednu od navedenih VH sekvenci, pri čemu navedene ćelije domaćini sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac koji je sposoban da se sparuje sa navedenim VH,

h) kultivisanje navedenih ćelija domaćina i omogućavanje ekspresije VH i VL polipeptida,

i) dobijanje navedenih antitela.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji dalje sadrži uzimanje uzorka od navedenih kultivisanih ćelija, pri čemu uzorak sadrži najmanje jedno od navedenih antitela, i podvrgavanje uzorka najmanje jednoj funkcionalnoj analizi, i izbor najmanje jedne ćelije koja eksprimira antitelo sa željenom specifičnošću vezivanja, afinitetom, neutralizujućom aktivnošću, aktivnošću ubijanja ćelija tumora i/ili aktivnošću inhibicije proliferacije.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili 3, koji dalje sadrži obezbeđivanje navedenih ćelija domaćina sa sredstvima za ekspresiju navedenog najmanje jednog VH i VL u formatu imunoglobulina.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što navedeni format imunoglobulina sadrži najmanje jedno monospecifično antitelo, i/ili najmanje jedno bispecifično antitelo.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što se navedeni ograničeni VL repertoar sastoji od jednog VL.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što se navedeni ograničeni VL repertoar sastoji od jednog preuređenog humanog VL, poželjno humanog lakog lanca IGKV1-39.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačen time što je navedena populacija B ćelija dobijena iz transgenog miša koji je imunizovan sa antigenom.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je izabrano 50 najčešćih VH sekvenci.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je izabrano 100 najčešćih VH sekvenci.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je izabrano 200 najčešćih VH sekvenci.

12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, koji dodatno sadrži pripremu smeša antitela, poželjno koja sadrži bispecifična antitela.