RS56879B1

RS56879B1 - Bispecifične molekule koje vezuju antigen za aktiviranje t ćelija

Info

Publication number: RS56879B1
Application number: RS20180170A
Authority: RS
Inventors: Oliver Ast; Peter Bruenker; Tanja Fauti; Anne Freimoser-Grundschober; Christiane Neumann; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Pablo Umana
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2018-04-30
Also published as: US20240425616A1; CA2837975C; US20250043028A1; EP3321286A1; JP2017029156A; EA030147B1; JP7175291B2; SI2748201T1; MY169358A; CL2014000126A1; LT2748201T; IL268886B; EP3892640A1; KR101963923B1; ZA201309742B; TW201321413A; IL229765A0; CO6811817A2; EP2748201A1; BR112014003769A8

Description

OPIS

Oblast na koju se pronalazak odnosi

Ovaj pronalazak se uglavnom odnosi na bispecifične molekule koje vezuju antigen za aktiviranje T ćelija. Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takve bispecifične molekule koje vezuju antigen, na postupke za proizvodnju bispecifičnih molekula koji vezuju antigen prema pronalasku i na bispecifične molekule koje vezuju antigen za upotrebu u lečenju bolesti.

Pozadina

Selektivno uništenje pojedinačne ćelije ili specifičnog tipa ćelija je često poželjno u različitim kliničkim postavkama. Na primer, primarni cilj je terapija raka kako bi se specifično uništile tumorske ćelije, ostavljajući zdrave ćelije i tkiva netaknute i neoštećene.

Atraktivan način postizanja ovoga je indukovanje imunskog odgovora na tumor, stvaranje ćelija imunog efektora kao što su ćelije prirodne ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL) koji napadaju i uništavaju tumorske ćelije. CTL-i predstavljaju najmoćnije efektorske ćelije imunog sistema, ali se ne mogu aktivirati pomoću efektorskog mehanizma posredovanog Fc domenom konvencionalnih terapijskih antitela.

U tom pogledu, bispecifična antitela dizajnirana da se vezuju sa jednom „rukom“ na površinski antigen na ciljnim ćelijama, a sa drugom „rukom“ na aktivirajuću, invarijantnu komponentu kompleksa T ćelijskog receptora (TCR), postala su interesantna u poslednjih nekoliko godina. Istovremeno vezivanje takvog antitela sa oba cilja primoravaće privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, uzrokujući aktivaciju bilo koje citotoksične T ćelije i naknadne lize ciljne ćelije. Stoga, imunski odgovor se preusmerava u ciljne ćelije i nezavisan je od predstavljanja peptidnih antigena ciljne ćelije ili specifičnosti T ćelije koja bi bila relevantna za normalna MHC ograničena aktivacija CTL-ova. U tom kontekstu od presudnog je značaja da se CTL-i aktiviraju samo kada ciljna ćelija predstavlja bispecifično antitelo za njih, tj. podrazumeva se imunološka sinapsa. Posebno su poželjna bispecifična antitela koja ne zahtevaju predkondicioniranje limfocita ili ko-stimulaciju kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija.

Izrađeno je nekoliko formata bispecifičnih antitela i ispitana njihova pogodnost za imunoterapiju posredovanu T ćelijama. Iz ovoga, takozvani molekuli BiTE (bispecifični pokretač T ćelija) bili su vrlo dobro okarakterisani i već su pokazali određena očekivanja na klinici (pregledano u Nagorsen i Bauerle, Ekp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). BiTE su tandemski scFv molekuli pri čemu su dva scFv molekula fuzionisana sa fleksibilnom spojnicom. Dalji bispecifični formati koji se procenjuju za angažovanje T ćelija uključuju dijatela (Holliger i sar., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) i njihove derivate, kao što su tandem dijatela (Kipriyanov i sar., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)). Noviji razvoj predstavljaju takozvani molekuli DART (dupla promena cilja afiniteta), koji se zasnivaju na formatu dijatela, ali imaju C-terminalni disulfidni most za dodatnu stabilizaciju (Moore i sar., Blood 117, 4542-51 (2011) ). Takozvani triomabovi, koji su celokupni hibridni IgG molekuli miša/pacova, a koji se trenutno procenjuju u kliničkim ispitivanjima, predstavljaju veći format (pregledano u Seimetz i sar., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).

Raznolikost formata koji se razvijaju pokazuju veliki potencijal koji se pripisuje preusmeravanju T ćelija i aktivaciji u imunoterapiji. Pogodan zadatak generisanja bispecifičnih antitela, međutim, ni u kom slučaju nije trivijalan, već podrazumijeva niz izazova koji moraju biti ispunjeni u vezi sa efikasnošću, toksičnošću, primjenljivošću i produktivnošću antitela.

Mali konstrukti kao što su, na primer, BiTE molekuli – dok su u stanju efikasno da zamene efektore i ciljne ćelije, – imaju veoma kratak poluživot u serumu koji zahteva da se kontinuirano infundiraju pacijentima. IgG-formati, sa druge strane, – dok imaju veliku korist od dugog poluživota, – pate od toksičnosti povezane sa prirodnim efektorskim funkcijama svojstvenih IgG molekulima. Njihov imunogeni potencijal čini još jednu nepovoljnu osobinu bispecifičnih antitela sličnih IgG-u, posebno ne-humanim formama, za uspešan terapijski razvoj. Najzad, veliki izazov u opštem razvoju bispecifičnih antitela je proizvodnja bispecifičnih konstrukata antitela na klinički dovoljnoj količini i čistoći, usled pogrešnog uparivanja teških i lakih lanaca različitih specifičnosti nakon ko-ekspresije, što smanjuje prinos pravilno sastavljenog konstrukta i rezultira u nefunkcionalnim nusproduktima iz kojih se teško može odvojiti željeno bispecifično antitelo.

S obzirom na poteškoće i nedostatke povezane sa trenutno dostupnim bispecifičnim antitelima za imunoterapiju posredovanu T ćelijama, ostaje potreba za novim, poboljšanim formatima takvih molekula. Ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule koje vezuju antigen dizajnirane za aktivaciju T ćelija i preusmeravanje koje kombinuju dobru efikasnost i produktivnost uz nisku toksičnost i povoljne farmakokinetičke osobine.

Sažetak pronalaska

U prvom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje T-ćelijski aktivni bispecifični molekul koji vezuje antigen koji obuhvata prvi i drugi vezujući deo antigena, od kojih je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za aktivni T-ćelijski antigen, a drugi Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za ciljani ćelijski antigen i Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje; pri čemu je prvi vezujući deo antigena prebačeni Fab molekul gde se zamenjuje varijabilni ili konstantni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca; pri čemu su prvi i drugi vezujući deo antigena fuzionisani jedni sa drugim, po izboru peptidnom spojnicom; i gde T-ćelijski aktivni bispecifični molekul za vezivanje antigena ne sadrži više od jednog vezujućeg dela antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za aktivni T ćelijski antigen (tj. bispecifični T molekul za vezivanje antigena koji se aktivira T monovalentnim vezivanjem za aktivni T ćelijski antigen).

Prema pronalasku, prvi i drugi vezujući delovi antigena T-ćelijskog bispecifičnog molekula za vezivanje antigena su fuzionisani jedni sa drugim, po izboru peptidnom spojnicom. U jednoj realizaciji, drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. U drugoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena. U još jednoj realizaciji, drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu lakog Fab lanca za N-terminus lakog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. U realizacijama pri čemu je (i) drugi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena ili (ii) prvi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena, dodatno lakom Fab lancu prvog vezujućeg dela antigena i lakog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena mogu biti fuzionisani jedni sa drugima, po izboru peptidnom spojnicom.

U jednoj realizaciji, pri čemu je (i) prvi vezujući deo antigena vezan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena ili (ii) drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu lakog Fab lanca za N-terminus lakog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, drugi vezujući deo antigena T-ćelijskog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U još jednoj realizaciji, pri čemu je drugi vezujući deo antigena vezan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

U određenim relizacijama, T-ćelijski aktivni bispecifični molekul za vezivanje antigena sadrži treći deo koji se vezuje za antigen koji predstavlja Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije. U jednoj takvoj realizaciji, treći vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U određenoj realizaciji, drugi i treći vezujući deo antigena T-ćelijskog aktivnog molekula za vezivanje antigena se spajaju na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, i prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena. U drugoj realizaciji, prvi i treći vezujući deo antigena molekula za vezivanje antigena koje aktiviraju T-ćelije se spajaju na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, i drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. Komponente molekula vezujućeg bispecifičnog antigena koji aktiviraju T ćelije mogu biti fuzionisani direktno ili preko odgovarajućih peptidnih spojnica. U jednoj realizaciji, pri čemu se drugi i treći vezujući deo antigena molekula za vezivanje antigena koji aktiviraju T ćelije, spajaju na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, drugi i treći vezujući deo antigena i Fc domen su deo molekula imunoglobulina. U određenoj realizaciji, molekul imunoglobulina je IgG klasa imunoglobulina.

U određenoj realizaciji, Fc domen je IgG Fc domena. U specifičnoj realizaciji, Fc domen je IgG1Fc domena. U drugoj specifičnoj realizaciji, Fc domen je4Fc domen. U određenim realizacijama, Fc domen je ljudski Fc domen.

U određenim realizacijama, domen Fc sadrži modifikaciju koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena. U takvoj specifičnoj realizaciji, aminokiselinski ostatak u domenu CH3prve podjedinice Fc domena je zamenjen sa ostacima aminokiselina koji imaju veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar domena CH3prve podjedinice koja se može pozicionirati u šupljini unutar domena CH3druge podjedinice, a amino kiselinski ostatak u CH3domenu druge podjedinice Fc domena zamjenjuje se sa amino kiselinskim ostacima koji imaju manji volumen bočnog lanca, čime stvaraju šupljinu unutar CH3domena druge podjedinice u okviru koje je moguće pozicioniranje u domenu CH3prve podjedinice.

U određenoj realizaciji, domen Fc pokazuje smanjen vezujući afinitet na Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa domaćim IgG1Fc domenom. U jednoj realizaciji, domen Fc sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koja smanjuje vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. U jednoj realizaciji, jedna ili više supstitucija aminokiselina u domenu Fc koja smanjuje vezivanje za Fc receptor i ili efektorsku funkciju je na jednoj ili više pozicija izabrana iz grupe L234, L235 i P329 (EU numerisanje). U određenim realizacijama, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju pri čemu su navedene supstitucije aminokiselina L234A, L235A i P329G.

U jednoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednoj realizaciji, efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

U određenoj realizaciji, antigen za aktiviranje T ćelija je CD3. U jednoj realizaciji, antigen ciljne ćelije je izabran iz grupe koju čine: Čondroitin sulfat proteoglikan povezan melanomom (MCSP), epidermalni receptor faktora rasta(EGFR), karcinoembrionski antigen (CEA), protein za aktiviranje fibroblasta (FAP), CD19, CD20 i CD33.

Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T-ćelija iz pronalaska.

U drugom aspektu je dat postupak za proizvodnju bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, koji obuhvata korake a) kultivacije ćelija domaćina koje sadrže izolovani polinukleotid iz pronalaska, ili vektor koji sadrži izolovani polinukleotid pronalaska, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije i b) obnavljanje bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije.

Pronalazak dalje daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifični molekul za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Pronalaskom su takođe obuhvaćeni postupci korišćenja bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji aktivira T- ćelije i farmaceutske kompozicije pronalaska. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije ili farmaceutski preparat pronalaska za upotrebu kao lek. U jednom aspektu obezbeđen je bispecifični molekul za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije ili farmaceutski preparat prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno. U specifičnoj realizaciji, ta bolest je rak.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bispecifični molekul za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije ili farmaceutski preparat pronalaska za upotrebu u postupku induciranja lize ciljne ćelije kod pojedinca, koji obuhvata kontaktiranje ciljne ćelije sa bispecifičnim molekulom za vezivanje antigena koji aktivira T-ćelije iz pronalazka u prisustvu T ćelije, pri čemu je ciljna ćelija tumorska ćelija.

Kratak opis slika

SLIKA 1. Primerne konfiguracije bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji aktiviraju T-ćelije opisane ovde. Ilustracija (A) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“, i (B) „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ molekula. U molekulu „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ laki lanac T-ćelije koja cilja Fab se fiksira sa teškim lancem spojnicom, dok molekul „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ ima spojnicu u Fab koji cilja tumor. (C) Ilustracija molekula „2+1 IgG scFab“. (D) Ilustracija molekula „1+1 IgG scFab“. (E) Ilustracija molekula „1+1 IgG Crossfab“. (F) Ilustracija molekula „2+1 IgG Crossfab“. (G) Ilustracija molekula „2+1 IgG Crossfab“ sa alternativnim poretkom Crossfab i Fab komponenti („obrnuto“). (H) Ilustracija molekula „1+1 IgG Crossfab spajanje lakog (LC) lanca“. (I) Ilustracija molekula „1+1 CrossMab“. (J) Ilustracija molekula „2+1 IgG Crossfab, spojeni laki lanac“. (K) Ilustracija molekula „1+1 IgG Crossfab, spojeni laki lanac“. (L) Ilustracija molekula „2+1 IgG Crossfab, obrnuti spojeni laki lanac“. (M) Ilustracija molekula „1+1 IgG Crossfab, obrnuti spojeni laki lanac“. Crna tačka: opciona modifikacija u Fc domenu koja promoviše heterodimerizaciju.

SLIKA 2. SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 1, 3, 5), nesmanjeni (A) i smanjeni (B), i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-MCSP/antihuCD3) (pogledajte SEQ ID NO.7, 9, 11), nesmanjeni (C) i smanjeni (D).

SLIKA 3. Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.1, 3, 5) (A) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.7, 9, 11) (B).

SLIKA 4. SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (anti-EGFR/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.43, 45, 57), nesmanjeni (A) i smanjeni (B), i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-EGFR/antihuCD3) (pogledajte SEQ ID NO.11, 49, 51), nesmanjeni (C) i smanjeni (D).

SLIKA 5. Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (anti-EGFR/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.43, 45, 47) (A) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-EGFR/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.11, 49, 51) (B).

SLIKA 6. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-FAP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 11, 51, 55), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (anti-FAP/anti-huCD3).

SLIKA 7. SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) (A) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 21, 23), nesmanjeni (traka 2) i smanjeni (traka 3); (B) „2+1 IgG scFab, LALA“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19), nesmanjeni (traka 2) i smanjeni (traka 3); (C) „2+1 IgG scFab, wt“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 13, 15), nesmanjeni (lane 2) i smanjeni (traka 3); i (D) „2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 25, 27), nesmanjeni (traka 2) i smanjeni (traka 3).

SLIKA 8. Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) (A) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.

5, 21, 23); (B) „2+1 IgG scFab, LALA” (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19); (C) „2+1 IgG scFab, wt“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 13, 15); i (D) „2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.5, 25, 27).

SLIKA 9. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-EGFR/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 45, 47, 53), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-EGFR/anti-huCD3).

SLIKA 10. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-FAP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.57, 59, 61), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 200 10/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „2+1 IgG scFab, P329G LALA“ (anti-FAP/anti-huCD3).

SLIKA 11. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Tris-acetat (A) ili 4-12% Bis/Tris (B), NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „1+1 IgG Crossfab, Fc(rupa) P329G LALA / Fc(čvor) wt“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 29, 31, 33), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 20010/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „1+1 IgG Crossfab, Fc(rupa) P329G LALA / Fc(ćvor) wt“ (anti-MCSP/anti-huCD3).

SLIKA 12. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 200 10/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-huCD3).

SLIKA 13. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-cyCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 35, 37), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 200 10/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-cyCD3).

SLIKA 14. (A, B) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (anti-CEA/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.33, 63, 65, 67), nesmanjeni (A) i smanjeni (B). (C) Hromatografija isključivanja analitičke veličine (Superdex 200 10/300 GL GE Zdravstvena zaštita; 2 mM MOPS pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 µg ubrizganog uzorka) „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (anti-CEA/anti-huCD3).

SLIKA 15. (A) Termička stabilnost „(scFv)2-Fc“ i „(dsscFv)2-Fc“ (anti-MCSP (LC007)/anti-huCD3 (V9)). Rasipanje dinamičke svetlosti, mereno na temperaturnoj rampi od 25-75 °C pri 0,05 °C/min. Crna kriva: „(scFv)2-Fc“; siva kriva: „(dsscFv)2-Fc“. (B) Termička stabilnost „2+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 21, 23) i „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33). Rasipanje dinamičke svetlosti, mereno na temperaturnoj rampi od 25-75 °C pri 0,05 °C/min. Crna kriva: „2+1 IgG scFab“; siva kriva: „2+1 IgG Crossfab“.

SLIKA 16. Postavka biakor testa za (A) određivanje interakcije različitih mutiranih Fc sa humanim FcγRIIIa i za (B) simultano vezivanje bespecnih konstrukata T-ćelija sa ciljem tumora i humanim CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(čvor)–Avi/Fc(rupa).

SLIKA 17. Simultano vezivanje bispecifičnih konstrukata T-ćelija na D3 domen humanog MCSP i humani CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(čvor)–Avi/Fc(rupa). (A) „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33), (B) „2+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 21, 23).

SLIKA 18. Simultano vezivanje bispecifičnih konstrukata T-ćelija na humani EGFR i humani CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(čvor)–Avi/Fc(rupa). (A) „2+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.45, 47, 53), (B) „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.43, 45, 47), (C) „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.11, 49, 51), i (D) „1+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.47, 53, 213).

SLIKA 19. Vezivanje „(scFv)2“ molekula (50 nM) za CD3 izražen na Jurkat ćelijama (A), ili za MCSP na Colo-38 ćelijama (B) mereno FACS-om. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije u poređenju sa neobrađenim ćelijama i ćelijama obojenim samo sa sekundarnim antitelom.

SLIKA 20. Vezivanje „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 17, 19) konstrukta (50 nM) na CD3 izražen na Jurkat ćelijama (A), ili na MCSP ma Colo-38 ćelijama (B) mereno FACS-om. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije u poređenju sa ćelijama tretiranim referentnim anti-CD3 IgG (kao što je naznačeno), neobrađenim ćelijama i ćelijama koje su obojane samo sekundarnim antitelom.

SLIKA 21. Vezivanje „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO. 1, 3, 5) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.7, 9, 11) konstrukata (50 nM) na CD3 izražen na Jurkat ćelijaka (A), ili na MCSP na Colo-38 ćelijama (B) mereno FACS-om. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije u poređenju sa ćelijama tretiranim referentnim anti-CD3 ili anti-MCSP IgG (kao što je naznačeno), neobrađenim ćelijama i ćelijama koje su obojane samo sekundarnim antitelom.

SLIKA 22. Vezivanje zavisno od doze „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.

5, 17, 19) bispecificnog konstrukta i odgovarajućeg anti-MCSP IgG na MCSP na Colo-38 ćelijama kao što je mereno FACS-om.

SLIKA 23. Nivo površinske ekspresije različitih aktivacionih markera na humanim T ćelijama nakon inkubacije sa 1 nM of „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) ili „(scFv)2“ CD3-MCSP bispecifičnim konstruktom u prisustvu ili odsustvu Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija, kako je navedeno (E:T odnos PBMC-ova do tumorskih ćelija = 10:1). Prikazan je nivo ekspresije ranog aktivacionog markera CD69 (A) ili kasnog aktivacionog markera CD25 na CD8<+>T ćelijama (B) nakon 15 ili 24 časa inkubacije.

SLIKA 24. Nivo površinske ekspresije kasnog aktivacionih markera CD25 na humanim T ćelijama nakon inkubacije sa 1 nM of „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) ili „(scFv)2“ CD3-MCSP bispecifičnim konstruktom u prisustvu ili odsustvu Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija, kako je navedeno (E:T odnos = 5:1). Prikazan je nivo ekspresije ranog aktivacionog markera CD69 na CD4<+>T ćelijama (A) ili kasnog aktivacionog markera CD25 na CD4<+>T ćelijama (B) nakon 5 časova inkubacije.

SLIKA 25. Nivo površinske ekspresije markera kasnog aktiviranja CD25 na cinomolgus CD8<+>T ćelijama iz dve različite životinje (cino Nestor, cino Nobu) nakon 43 sata inkubacije sa naznačenim koncentracijama bispecifičnog konstrukta „2 1 IgG Crossfab“ (ciljanje na cinomolgus CD3 i humani MCSP, pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 35, 37), u prisustvu ili odsustvu ciljnih ćelija tumora MV-3 koji eksprimiraju humani MCSP (E:T odnos = 3:1). Kao kontrole korišćeni su referentni IgG (anti-cinomolgus CD3 IgG, anti-humani MCSP IgG) ili nefiziološki stimulus PHA-M.

SLIKA 26. IFN-γ nivoi, koji se sekretuju od humanih pan T ćelija koje su aktivirane 18,5 sati pomoću bispecifičnog konstrukta „2 1 IgG scFab, LALA“ CD3-MCSP (pogledajte SEQ ID NO. 5, 17, 19) u prisustvu U87MG ćelije tumora (E:T odnos = 5:1). Kao kontrole, primenjeni su odgovarajući anti-CD3 i anti-MCSP IgG.

SLIKA 27. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) MDA-MB-435 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1) i aktiviranja od 20 sati različitim koncentracijama „2 1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 21, 23), „2 1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) i „scFv)2“ bispecifične molekule i odgovarajućih IgG-a.

SLIKA 28. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) MDA-MB-435 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1) i aktiviranja od 20 sati različitim koncentracijama bispecifičnih konstrukta i odgovarajućih IgGs. „2+1 IgG scFab“ konstruiše razlike u svom Fc domenu (koji ima ili Fc domen divljeg tipa (pogledajte SEQ ID NO.

5, 13, 15), ili Fc domenu mutiranom da ukine funkciju (NK) efektorske ćelije: Upoređeni su konstrukti P329G LALA (pogledajte SEQ ID NO. 5, 21, 23), P329G LALA N297D (pogledajte SEQ ID NO.5, 25, 27)) i „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33).

SLIKA 29. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) Colo-38 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretirano sa CD3-MCSP bispecifičnim „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) konstruktom, „(scFv)2“ molekulom ili odgovarajućim IgG-ima za 18,5 sati.

SLIKA 30. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) Colo-38 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretirano sa CD3-MCSP bispecifičnim „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) konstruktom, „(scFv)2“ molekulom ili odgovarajućim IgG-ima za 18 sati.

SLIKA 31. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) MDA-MB-435 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1) i aktivacije od 23,5 sati sa različitim koncentracijama CD3-MCSP bispecifičnog „2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) konstrukta, „(scFv)2“ molekula ili odgovarajućeg IgG-a.

SLIKA 32. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) Colo-38 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1) i aktiviranja od 19 sati različitim koncentracijama CD3-MCSP bispecifičnog „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.1, 3, 5), „1 1 IgG scFab, obostrano sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO 7, 9, 11) i „(scFv)2“ bispecifičnim molekulima i odgovarajućih IgG-a.

SLIKA 33. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) Colo-38 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretirano sa CD3-MCSP bispecifičnim „1+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 21, 213) konstruktom, ili„(scFv)2“ molekulom za 20 sati.

SLIKA 34. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) MDA-MB-435 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1) i aktiviranja od 21 sati različitim koncentracijama bispecifičnih konstrukta i odgovarajućih IgGs. CD3-MCSP bispecifični „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33) i „1+1 IgG Crossfab“ (see SEQ ID NOs 5, 29, 31, 33) konstrukti, „(scFv)2“ molekuli i odgovarajući IgG.

SLIKA 35. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) različitih ciljnih ćelija (MCSP-pozitivne Colo-38 ciljane tumorske ćelije, mezenhimalne matične ćelije izvedene iz koštane srži ili masnog tkiva ili periciti iz placente, kako je navedeno) indukovano aktivacijom humanih T ćelija za 135 ng/ml ili 1,35 ng/ml bispecifičnog CD3-MCSP konstrukta „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33) (E:T odnos = 25:1).

SLIKA 36. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) Colo-38 ciljanih tumorskih ćelija, mereno posle inkubacije preko noći od 21 sat, nakon ko-kultivacije sa PBMC-om i različitim bispecifičnim CD3-MCSP konstruktima („2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) i „(scFv)2“) ili glikogenerisani anti-MCSP IgG (GlycoMab). Odnos efektora na ciljani ćelijski odnos bio je fiksiran na 25:1 (A), ili je varirao kako je prikazano (B). PBMC-ovi su izolovani iz sveže krvi (A) ili iz Buffi Coat (sloja istaloženih leukocita i trombocita) (B).

SLIKA 37. Vremenski zavisni citotoksični efekat konstrukta „2+1 IgG Crossfab“, koji cilja na cinomolgus CD3 i humani MCSP (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 35, 37). Prikazano je LDH oslobađanje iz humanih MCSP-ekspresivnih MV-3 ćelija na ko-kultivaciji sa primarnim cinomolgus PBMC-ovima (E:T odnos = 3:1) tokom 24 sata ili 43 sata. Kao kontrole, korišćeni su referentni IgG (anti-cino CD3 IgG i anti-humani MCSP IgG) u istoj molarnosti. PHA-M je služio kao kontrola za (nefiziološku) aktivaciju T ćelija.

SLIKA 38. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) huMCSP-pozitivnih MV-3 melanomskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretiranih sa različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „(scFv)2“) za ~26 sati.

SLIKA 39. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) EGFR-pozitivnih LS-174T tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretiranih sa različitim CD3-EGFR bispecifičnim konstruktima („2+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.45, 47, 53), „1+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.47, 53, 213) i „(scFv)2“) ili referentne IgG-e za 18 sati.

SLIKA 40. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) EGFR-pozitivnih LS-174T tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretiranih sa različitim CD3-EGFR bispecifičnim konstruktima („1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.43, 45, 47), „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO. 11, 49, 51), „1+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO. 47, 53, 213) i „(scFv)2“) ili referentne IgG-e za 21 sat.

SLIKA 41. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) EGFR-pozitivnih LS-174T tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (A) ili humanim naivnim T ćelijama (B), tretiranih sa različitim CD3-EGFR bispecifičnim konstruktima („1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.43, 45, 47), „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.11, 49, 51) i „(scFv)2“) ili referentne IgG-e za 16 sati. Odnos efektora sa ciljanim ćelijama bio je 5:1.

SLIKA 42. Uništenje (kao što je mereno LDH oslobađanjem) FAP-pozitivnih GM05389 fibroblasta nakon ko-kultivacije sa humanim pan T ćelijama (E:T odnos = 5:1), tretiranih sa različitim CD3-FAP bispecifičnim konstruktima („1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (pogledajte SEQ ID NO.11, 51, 55), „1+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.57, 61, 213), „2+1 IgG scFab“ (pogledajte SEQ ID NO.57, 59, 61) i „(scFv)2“) za ~18 sati.

SLIKA 43. Procena citometrijske analize nivoa ekspresije CD107a/b, kao i koncentracije perforina u CD8<+>T ćelijama koje su tretirane različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima („2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) i „(scFv)2“) ili odgovarajući kontrolni IgG u prisustvu (A) ili odsustvu (B) ciljnih ćelija za 6 sati. Humane pan T ćelije su inkubirane sa 9,43 nM različitih molekula u prisustvu ili odsustvu Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija u razmeri efektora i cilja od 5:1. Monensin je dodat nakon prvog sata inkubacije kako bi se povećao intracelularni nivo proteina sprečavanjem transport proteina. Kapije su postavljene na svim CD107a/b pozitivnim, perforin pozitivnim ili dvostrukim pozitivnim ćelijama, kako je prikazano.

SLIKA 44. Relativna proliferacija CD8<+>(A) ili CD4<+>(B) humanih T ćelija nakon inkubacije sa 1 nM različitih CD3-MCSP bispecifičnih konstrukata („2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 17, 19) ili „(scFv)2“) ili odgovarajućeg kontrolnog IgG-a u prisustvu ili odsustvu Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija kod odnosa efektora i ciljnih ćelija od 5:1. CFSE-označene humane pan T ćelije su karakterisane putem FACS-a. Relativni nivo proliferacije određen je postavljanjem kapije oko ćelija koje nisu proliferujuće i korišćenjem broja ćelija ove kapije u odnosu na ukupan broj izmerenih ćelija kao referenca.

SLIKA 45. Nivoi različitih citokina izmereni u supernatantu humanih PBMC-ova nakon tretmana sa 1 nM različitih CD3-MCSP bispecifičnih konstruktiva („2+1 IgG scFab, LALA“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19) or „(scFv)2“) ili odgovarajućih kontrolnih igG-ova u prisustvu (A) ili odsustvu (B) Colo-38 tumorskih ćelija za 24 sata. Odnos efektora sa ciljanim ćelijama bio je 10:1.

SLIKA 46. Nivoi različitih citokina izmereni u supernatantu humanih PBMC-ova nakon tretmana sa 1 nM različitih CD3-MCSP bispecifičnih konstruktiva („2+1 IgG scFab“, „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) ili „(scFv)2“) ili odgovarajućih kontrolnih igG-ova u prisustvu (A) ili odsustvu (B) Colo-38 tumorskih ćelija za 24 sata. Među bispecifičnim konstruktima različiti su „konstruktivi 2+1 IgG scFab“ koji imaju ili Fc domen divljeg tipa (pogledajte SEQ ID NO. 5, 13, 15) ili Fc domenu mutiranom da ukine funkciju NK efektorskih ćelija (LALA (pogledajte SEQ ID NO.5, 17, 19), P329G LALA (pogledajte SEQ ID NO.5, 2, 23) i P329G LALA N297D (pogledajte SEQ ID NO.5, 25, 27)).

SLIKA 47. CE-SDS analize. Elektroferogram prikazan kao SDS STRANICA od 2+1 IgG Crossfab, povezani laki lanac (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 179). (traka 1: smanjena, traka 2: nije smanjena).

SLIKA 48. Hromatografija za isključivanje analitičke veličine 2+1 IgG Crossfab, povezani laki lanac (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 179) (krajnji proizvod). Ubrizgano je 20 µg uzorka.

SLIKA 49. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) MCSP-pozitivnih MV-3 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretirani različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima tokom ~44 sata („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, povezani LC“(pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179)). Humani PBMC-i su izolovani iz sveže krvi zdravih dobrovoljaca.

SLIKA 50. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) MCSP-pozitivnih Colo-38 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretirani različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima tokom ~22 sata („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, povezani LC“(pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179)). Humani PBMC-i su izolovani iz sveže krvi zdravih dobrovoljaca.

SLIKA 51. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) MCSP-pozitivnih Colo-38 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretirani različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima tokom ~22 sata („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, povezani LC“(pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179)). Humani PBMC-i su izolovani iz sveže krvi zdravih dobrovoljaca.

SLIKA 52. Uništenje (mereno LDH oslobađanjem) MCSP-pozitivnih WM266-4 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretirani različitim CD3-MCSP bispecifičnim konstruktima tokom ~22 sata („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, povezani LC“(pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179)).

Humani PBMC-i su izolovani iz sveže krvi zdravih dobrovoljaca.

SLIKA 53. Nivo površinske ekspresije početnog aktivacionog markera CD69 (A) i kasnog aktivacionog markera CD25 (B) na humanim CD8<+>T ćelijama nakon 22 časa inkubacije sa 10 nM, 80 pM ili 3 pM različitih CD3-MCSP bispecifičnih konstrukata („2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, povezani LC“ (pogledajte SEQ ID NO.

3, 5, 29, 179)) u prisustvu ili odsustvu humanih MCSP- ekspresnih Colo-38 tumorskih ciljanih ćelija (E:T odnos = 10:1).

SLIKA 54. CE-SDS analize. (A) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 1+1 IgG Crossfab; VL/VH razmena (LC007/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 29, 33, 181): a) nesmanjeno, b) smanjeno. (B) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 1+1 CrossMab; CL/CH1 razmena (LC007/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 183, 185): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (C) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab, obrnuto; CL/CH1 razmena (LC007/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 183, 187): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (D) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab; VL/VH razmena (M4-3 ML2/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 33, 189, 191, 193): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (E) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab; CL/CH1 razmena (M4-3 ML2/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 183, 189, 193, 195): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (F) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab, obrnuto; CL/CH1 razmena (CH1A1A/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 65, 67, 183, 197): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (G) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab; CL/CH1 razmena (M4-3 ML2/H2C) (pogledajte SEQ ID NO. 189, 193, 199, 201): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (H) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od 2+1 IgG Crossfab, obrnuto; CL/CH1 razmena (431/26/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 183, 203, 205, 207): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (I) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od „2+1 IgG Crossfab, spajanje lakog lanca“ (CH1A1A/V9) (pogledajte SEQ ID NO. 183, 209, 211, 213): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (J) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 215, 217), nesmanjeni (levo) i smanjeni (desno). (K) Elektroferogram prikazan kao SDS-STRANICA od „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (anti-MCSP/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 215, 219): a) smanjeno, b) nesmanjeno. (L) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassiestained) „1+1 IgG Crossfab“ (anti-CD33/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.33, 213, 221, 223), smanjeni (levo) i nesmanjeni (desno). (M) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-CD33/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO. 33, 221, 223, 225), smanjeni (levo) i nesmanjeni (desno). (N) SDS STRANICA (4-12% Bis/Tris, NuPage Invitrogen, Coomassie-stained) „2+1 IgG Crossfab“ (anti-CD20/anti-huCD3) (pogledajte SEQ ID NO.33, 227, 229, 231), nesmanjeni.

SLIKA 55. Vezivanje bispecifičnih konstrukata (CEA/CD3 „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (VL/VH)“ (pogledajte SEQ ID NO.33, 63, 65, 67) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuti (CL / CH1)“ 2 (pogledajte SEQ ID NO. 65, 67, 183, 197)) humanom CD3, izraženom Jurkat ćelijama (A), ili humanom CEA, izraženom LS-174T ćelijama (B), kao što je određeno FACS-om. Kao kontrola, ekvivalentna maksimalna koncentracija referentnih IgG-a i pozadinsko obojenje zbog obeleženog sekundarnog antitela (koziji anti-humani FITC-konjugovani AffiniPure F (ab ') 2 fragment, Fcy fragment-specific, Jackson Immuno Research Lab # 109 -096-098).

SLIKA 56. Vezivanje bispecifičnih konstrukata (MCSP/CD3 „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 183, 187)) na humani CD3, izražen Jurkat ćelijama (A) ili humani MCSP, izražen WM266-4 tumorskim ćelijama (B), kao što je određeno FACS-om.

SLIKA 57. Vezivanje „1+1 IgG Crossfab, spajanje lakog lanca“ (pogledajte SEQ ID NO.

183, 209, 211, 213) sa humanim CD3, izraženim Jurkat ćelijama (A), ili humanim CEA, izraženim LS-174T ćelijama (B), kao što je određeno FACS-om.

SLIKA 58. Vezivanje „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 215, 217) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 215, 219) konstrukata na humani CD3, izražen Jurkat ćelijama (A) ili humanog MCSP, izraženog WM266-4 tumorskim ćelijama (B), kao što je određeno FACS-om.

SLIKA 59. Nivo površinske ekspresije početnog aktivacionog markera CD69 (A) ili kasnog aktivacionog markera CD25 (B) na humanim CD4<+>ili CD8<+>T ćelijama nakon 24 časa inkubacije sa naznačenim koncentracijama CD3/MCSP „1+1 CrossMab“ (pogledajte SEQ ID NO.

5, 23, 183, 185), „1+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 29, 33, 181) i „2+1 IgG Crossfab“ (videti SEK ID NOs 3, 5, 29, 33) konstrukata Analiza je izvedena u prisustvu ili odsustvu MV-3 ciljnih ćelija, kako je navedeno.

SLIKA 60. Nivo površinske ekspresije početnog aktivacionog markera CD25 na CD4<+>ili CD8<+>T ćelijama iz dva različita cinomolgus majmuna (A i B) u prisustvu ili odsustvu huMCSPpozitivnih MV-3 tumorskih ćelija na ko-kultivaciji cinomolgus PBMC-ova (E:T odnos = 3:1, normalizovano na CD3<+>brojeve), tretiranih sa „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 215, 217) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuti“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 215, 219) u trajanju od ~41 sata.

SLIKA 61. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) MKN-45 (A) ili LS-174T (B) tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranje za 28 sati različitim koncentracijama „2+1 IgG Crossfab, obrnuti (VL/VH)“ (pogledajte SEQ ID NO.

33, 63, 65, 67) u odnosu na „2+1 IgG Crossfab, obrnuti (CL/CH1)“ (pogledajte SEQ ID NO.65, 67, 183, 197) konstrukt.

SLIKA 62. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) WM266-4 tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranje za 26 sati različitim koncentracijama „2+1 IgG Crossfab (VL/VH)“ (pogledajte SEQ ID NO. 33, 189, 191, 193) u odnosu na „2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)“ (pogledajte SEQ ID NO.183, 189, 193, 195) konstrukt.

SLIKA 63. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) MV-3 tumorskih ćelija nakon kokultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranje za 27 sati različitim koncentracijama „2+1 IgG Crossfab (VH/VL)“ (pogledajte SEQ ID NO. 33, 189, 191, 193) u odnosu na „2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)“ (pogledajte SEQ ID NO. 183, 189, 193, 195) konstruktata.

SLIKA 64. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) humanih MCSP-pozitivnih WM266-4 (A) ili MV-3 (B) tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranje za 21 sati različitim koncentracijama „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33), „1+1 CrossMab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 183, 185), i „1+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 29, 33, 181), kao što je naznačeno.

SLIKA 65. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) MKN-45 (A) ili LS-174T (B) tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranja za 28 sati različitim koncentracijama „1+1 IgG Crossfab, LC spajanje“ (pogledajte SEQ ID NO.183, 209, 211, 213).

SLIKA 66. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) MC38-huCEA tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1) i aktiviranja za 24 sati različitim koncentracijama „1+1 IgG Crossfab, LC spajanje“ (pogledajte SEQ ID NO. 183, 209, 211, 213) nasuprot neuspešnoj referenci „2 1 IgG Crossfab“.

SLIKA 67. Uništavanje (mereno LDH oslobađanjem) humanih MCSP-pozitivnih MV-3 (A) ili WM266-4 (B) tumorskih ćelija nakon ko-kultivacije sa humanim PBMC-ima (E:T odnos = 10:1), tretiranih sa „2+1 IgG Crossfab (V9)“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (V9)“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 183, 187), „2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 215, 217) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (anti-CD3)“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 215, 219) konstruktima.

Detaljan opis

Definicije

Termini se ovde koriste isto kao što se koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.

Kako se ovde koristi, termin „molekul koji vezuje antigen“ se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri molekula koji vezuju antigen su imunoglobulini i derivati, npr. njihovi fragmenti.

Termin „bispecifičan“ znači da je molekul koji vezuje antigen sposoban da se specifično vezuje za najmanje dve različite antigenske determinante. Tipično, bispecifični molekul koji vezuje antigen sadrži dva mesta za vezivanje antigena, od kojih je svaki specifičan za različite antigene. U određenim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen može da istovremeno spoji dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante izražene na dve različite ćelije.

Termin „valentan“, kako se ovde koristi, označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja antigena u molekulu koji vezuje antigen. Kao takav, termin „monovalentno vezivanje za antigen“ označava prisustvo jednog (i ne više od jednog) mesta za vezivanje antigena specifično za antigen u molekulu koji vezuje antigen.

„Mesto za vezivanje antigena“ odnosi se na mesto, tj. jedan ili više amino kiselinskih ostataka molekula koji vezuje antigen koji obezbeđuje interakciju sa antigenom. Na primer, mesto za vezivanje antigena antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). Nativni molekul imunoglobulina obično ima dva mesta za vezivanje antigena, Fab molekula obično ima jedinstveno mesto za vezivanje antigena.

Kako se ovde koristi, pojam „vezujući deo antigena“ odnosi se na polipeptidni molekul koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena je u mogućnosti da usmeri entitet na koji je vezan (npr. drugi vezujući deo antigena) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stomu tumora koji nosi antigenu determinantu. U još jednoj realizaciji, vezujući deo antigena je u mogućnosti da aktivira signalizaciju kroz svoj ciljani antigen, na primer antigen kompleksa receptora T ćelija. Vezujući delovi antigena uključuju antitela i njihove fragmente kao što je definisano u nastavku. Posebni vezujući delovi antigena uključuju domen antitela koji vezuje antigen, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim realizacijama, vezujući delovi antigena mogu da sadrže regione konstantnih antitela kako je dalje definisano ovde i poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: α, δ, ε, γ, or µ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa: κ i λ.

Kao što je ovde korišćeno, termin „antigenska determinanta“ je sinonim za „antigen“ i „epitop“ i odnosi se na mesto (npr. susedni deo amino kiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona ne-susednih amino kiselina) na polipeptidnoj makromolekuli na koju se vezuje vezujući deo antigena, formirajući vezujući kompleks antigena. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodnih u serumu krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde nazivaju antigeni (npr. MCSP, FAP, CEA, EGFR, CD33, CD3) mogu biti bilo koji prirodni oblik proteina iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. U određenoj realizaciji, antigen je ljudski protein. Tamo gde se navodi određeni protein, termin obuhvata „ukupnu dužinu“, neobrađen protein kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata varijante koje se prirodno pojavljuju u proteinu, npr. splajsovane varijante ili alelne varijante. Primeri ljudskih proteina korisnih kao antigeni uključuju, ali se ne ograničavaju na: Hondroitin sulfat proteoglikan povezan melanomom (MCSP), poznat i kao hondroitin sulfat proteoglikan 4 (UniProt br. Q6UVK1 (verzija 70), NCBI RefSek br. NP_001888.2); protein za aktivaciju fibroblasta (FAP), takođe poznat kao sepraza (Uni Prot br. Q12884, Q86Z29, Q99998, NCBI pristup br. NP_004451); karcinoembrionski antigen (CEA), takođe poznat kao molekul adhezije ćelija povezan sa karcinoembrionskim antigenom 5 (UniProt br. P06731 (verzija 119), NCBI RefSek br. NP_004354.2); CD33, takođe poznat kao gp67 ili Siglec-3 (UniProt br. P20138, NCBI pristup br. NP_001076087, NP_001171079); epidermalni receptor faktora rasta (EGFR), takođe poznat kao ErbB-1 ili Her1 (UniProt br. P0053, NCBI pristup br. NP_958439, NP_958440), i CD3, a posebno epsilon podjedinica CD3 (pogledajte UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 265 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, SEQ ID NO: 266 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). U određenim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva vezuje se za epitop antigena za aktiviranje T ćelija ili antigena ciljne ćelije koji je konzerviran između antigena za aktiviranje T ćelija ili ciljnog antigena iz različitih vrsta.

Pod „specifičnim vezivanjem“ podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može biti diskriminisano od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost vezujućeg dela antigena da se veže na specifičnu antigensku determinantu može se izmeriti ili pomoću enzimskog vezivanja imunosorbentnog testa (ELISA) ili pomoću drugih tehnika poznatih u struci, npr. (Liljeblad i sar., Glico J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnih testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) . U jednoj realizaciji, stepen vezivanja vezujućeg dela antigena na nepovezani protein je manji od oko 10% vezivanja vezujućeg dela antigena prema merenju, na primer, SPR. U određenim realizacijama, vezujući deo antigena koji se vezuje za antigen, ili molekul koji vezuje antigen koji sadrži taj vezujući antigen, ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤0,1 nM, ≤0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. ligand). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „vezujući afinitet“ odnosi se na inherentni afinitet vezivanja koji odražava interakciju od 1:1 između članova vezujućeg para (npr. vezujući deo antigena i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X za svog partnera Y može se generalno predstaviti konstantom disociacije (KD), što je odnos konstante disociacije i pridruživanja (koffi kon,). Prema tome, ekvivalentne afinitete mogu sadržati različite konstante brzina, sve dok odnos konstanta brzine ostaje isti. Afinitet se može meriti dobro poznatim metodama u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Posebna metoda za merenje afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).

„Redukovano vezivanje“, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer putem SPR-a. Za razjašnjenje, termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičke metode), tj. potpunog ukidanja interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje“ odnosi se na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.

„Antigen koji aktivira T ćelije“, kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja se izražava na površini T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, koji je sposoban da indukuje aktivaciju T ćelija nakon interakcije sa molekulom koji vezuje antigen. Konkretno, interakcija molekula koji vezuje antigena sa antigenom koji aktivira T ćelije može izazvati aktivaciju T ćelija aktiviranjem signalne kaskade kompleksa receptora T ćelija. U određenoj realizaciji, antigen za aktiviranje T ćelija je CD3.

„Aktivacija T ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, naročito citotoksičnog T limfocita, izabranog od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja molekula citotoksičnog efektora, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Molekuli koji vezuju antigene za aktiviranje T ćelija koji su ovde opisani, mogu da indukuju aktiviranje T ćelija. Pogodni testovi za merenje aktivacije T ćelija koji su poznati u struci su ovde opisani.

„Antigen ciljne ćelije“ kako se ovde koristi odnosi se na antigensku determinantu predstavljenu na površini ciljne ćelije, na primer ćeliji u tumoru kao što je ćelija raka ili ćelijastrome tumora .

Kao što se ovde koriste, termini „prvi“ i „drugi“ u odnosu na vezujući antigen itd. koriste se za pogodnost da razlikuju kada postoji više od jedne grupe svakog tipa. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da daje određeni red ili orijentaciju bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija osim ako je to eksplicitno navedeno.

„Fab molekula“ odnosi se na protein koji se sastoji od VH i CH1domena teškog lanca („teškog Fab lanca“) i VL i CL domena lakog lanca („laki Fab lanac“) imunoglobulina.

Pod pojmom „fuzionisan“ podrazumeva se da su komponente (npr. Fab molekula i podjedinica Fc domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih spojnica.

Kako se ovde koristi, pojam „samostalni lanac“ odnosi se na molekul koji sadrži aminokiselinske monomere linearno vezane peptidnim vezama. U određenim rešenjima jedna od komponenti vezivanja antigena je molekul samostalnog jedne lanca, tj. molekula Fab-a pri čemu su laki Fab lanac i teški Fab lanac povezani peptidnom spojnicom da bi se formirao jedan peptidni lanac. U određenoj takvoj realizaciji, C-terminus lakog Fab lanca povezan je za N-terminus teškog Fab lanca u Fab molekul samostalnog lanca.

„Prenosna“ Fab molekula (pod nazivom „Crossfab“) označava Fab molekulu pri čemu se razmjenjuju ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog Fab lanca, tj. prenosna Fab molekula sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca i konstantnog regiona teškog lanca i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca. Za razjašnjenje, u prenosnoj Fab molekuli pri čemu su varijabilni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca zamenjeni, peptidni lanac koji sadrži konstantni region teškog lanca ovde se naziva kao „teški lanac“ prenosne Fab molekule. Nasuprot tome, u prenosnoj Fab molekuli pri čemu su konstantni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca zamenjeni, peptidni lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca ovde se naziva kao „teški lanac“ prenosne Fab molekule.

Termin „molekul imunoglobulina“ odnosi se na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva laka lanca i dva teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2i CH3), koji se takođe naziva konstantnim regionom teškog lanca. Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe naziva konstantnim regionom lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može se dodeliti jednom od pet tipova, koji se nazivaju α (IgA), d (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili µ (IgM), od kojih se neke mogu dalje podeliti na podtipove , na primer γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (k) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovih konstantnih domena. Imunoglobulin u suštini se sastoji od dva Fab molekula i Fc domena, povezanih preko regiona zgloba imunoglobulina.

Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost koja vezuje antigen.

„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom. Za pregled određenih fragmenata antitela, pogledajte Hudson i sar., Nat Med 9, 129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, pogledajte npr. Plückthun,u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.

113, Rosenburg i Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994); takođe pogledajte WO 93/16185; i SAD patente br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u SAD patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigenvezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar., Nat Med 9, 129-134 (2003); i Hollinger i sar., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana u Hudson i sar., Nat Med 9, 129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. SAD patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

Termin „domen koji vezuje antigen“ odnosi se na deo antitela koji obuhvata područje koje se specifično vezuje i komplementarni je deo ili je celi antigen. Domen za vezivanje antigena može se obezbediti, na primer, jednim ili više varijabilnih domena antitela (takođe nazvanih varijabilnih regiona antitela). Naročito, domen koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

Termin „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koje je uključeno u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Pogledajte npr. Kindt i sar., Kuby Immunology, 6<th>ed., W.H. Freeman i Co., strana 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti.

Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, nativna četvorolančana antitela uključuju šest HVR-a, tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). HVR-ovi generalno uključuju ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili „regiona koji određuju komplementarnost“ (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR-ovi generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) takođe se nazivaju „regioni koji određuju komplementarnost“ (CDR), ovi termini se ovde koriste izmenjivo u odnosu na delove varijabilnog regiona koji formiraju regione koji vezuju antigen. Ovaj region opisali su Kabat i sar., U.S. Dept, of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) i Chothia i sar., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se porede jedni sa drugima. Bez obzira na to, primena bilo koje definicije koja se odnosi na CDR antitela ili njegove varijante je namijenjena da bude unutar područja definisanog i upotrebljenog termina. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakom od gore navedenih citata su prikazani ispod u tabeli 1 kao poređenje. Tačni brojevi ostataka koji obuhvataju određeni CDR će se razlikovati u zavisnosti od redosleda i veličine CDR-a. Stručnjaci u struci mogu rutinski odrediti koji ostaci sadrže određene CDR-e s obzirom na aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona antitela.

TABELA 1. CDR definicije<1>

<1>Brojanje svih definicija CDR-a u tabeli 1 je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje je iznio Kabat i sar. (pogledajte ispod).

<2>„AbM“ sa malim slovom „b“ kao što je korišćeno u tabeli 1 odnosi se na CDR-ove kao što je definisano pomoću softvera za modeliranje antitela molekulaOxford Molecular „AbM“.

Kabat i sar. takođe definišu sistem numeracije za varijabilne regione sekvence koji se primjenjuje na bilo koje antitelo. Jedna uobičajena veština u struci može nedvosmisleno dodeliti ovaj sistem „numeracija Kabata“ u bilo koje varijabilno područje, bez oslanjanja na bilo koji eksperimentalni podatak izvan same sekvence. Kao što je ovde korišćeno, „numeracija Kabata“ odnosi se na sistem numeracije koji je postavio Kabat i sar., američki odsek za zdravlje i ljudske usluge, „Sekvenca proteina imunološkog interesa“ (1983). Osim ako nije drugačije naznačeno, upućivanja na numerisanje specifičnih pozicija amino kiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su u skladu sa Kabat sistemom numeracije.

Polipeptidne sekvence popisa sekvence (tj. SEQ ID NO.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 itd.) nisu numerisane prema Kabatovom numeričkom sistemu. Međutim, u veštini jedne osobe iz struke je da konvertuje numerisanje sekvenci iz redosleda sekvence na numeraciju Kabata.

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

„Klasa“ antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, a neki od njih mogu se dalje podeliti na podklase (izotipe), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, β, d, ε, γ, odnosno µ.

Termin „Fc domen“ ili „Fc region“ ovde se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca IgG mogu malo da variraju, Fc region za teški lanac IgG obično se definiše da se proteže od Cys226 ili od Pro230 do karboksil-terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može ali ne mora biti prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imunologiju), 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. „Podjedinica“ Fc domena koja se ovde koristi odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobnog za stabilno samoudruživanje. Na primer, podjedinica IgG Fc domena sadrži IgG CH2i konstantni domen IgG CH3.

„Modifikacija koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena“ je manipulacija osnovom peptida ili post-translacijska modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom da bi se formirao homodimer. Asocijacija koja promoviše modifikacije, kao što je ovde korišćena, posebno uključuje odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje se udružuju (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedne drugima kako bi se promovisalo udruživanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, udruženje koje promoviše modifikacije može promeniti strukturu ili naelektrisati jednu ili obe podjedinice Fc domena kako bi njihovo udruživanje bilo sterilno ili elektrostatično povoljno. Tako se pojavljuje (hetero) dimerizacija između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja bi mogla biti neidentična u smislu da dodatne komponente fuzionisane sa svakom od podjedinica (npr. vezujući delovi antigena) nisu isti. U nekim realizacijama udruženje koje promoviše modifikaciju sadrži mutaciju aminokiselina u domenu Fc, konkretno supstituciju aminokiselina. U konkretnoj realizaciji,udruženje koje promoviše modifikaciju sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, posebno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.

Termin „efektorske funkcije“ ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisna od dopune (CDC), vezivanje Fc receptora, ćelijsko posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), sekrecija citokina, uzimanje antigena od imunog kompleksa ćelija koje predstavljaju antigen, smanjenje receptora ćelijske površine (npr. B ćelijski receptor) i aktivacija B ćelija.

Kao što se ovde koriste, pojmovi „inžinjer, inženjering, inženjering“ smatra se da uključuju svaku manipulaciju osnovom peptida ili post-translacijske modifikacije prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering uključuje modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog šablona ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.

Izraz „mutacija aminokiselina“, kako se ovde koristi, podrazumijeva da obuhvata zamjene aminokiselina, delecije, insertije i modifikacije. Bilo koja kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se napraviti da dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećana povezanost sa drugim peptidom. Delecije aminokiselinskih sekvenci i umetanja uključuju amino- i/ili karboksi-terminske delecije i umetanje aminokiselina. Posebne mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina. U svrhu izmene, npr. karakteristike vezivanja Fc regiona, ne-konzervativne supstitucije amino kiselina, tj. zamene jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva, posebno su poželjne. Zamene aminokiselina uključuju zamenu aminokiselinama koje nisu prirodne ili prirodnim proizvodima aminokiselina od dvadeset standardnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Mutacije aminokiselina mogu se generisati korišćenjem genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetske metode mogu obuhvatiti mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, sintezu gena i slično. Smatra se da su takođe korisne metode izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim metodama, osim genetičkog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz proline na poziciji 329 Fc domena na glicin može biti označena kao 329G, G329, G329, P329G, ili Pro329Gly.

Kao što se ovde koristi, izraz „polipeptid“ odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji je linearno povezan amidnim vezama (takođe poznatim kao peptidne veze). Pojam „polipeptid“ odnosi se na bilo koji lanac dve ili više aminokiselina, a ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „amino kiselinski lanac“ ili bilo koji drugi izraz koji se koristi za pozivanje na lanac dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida“, i izraz „polipeptid“ se može koristiti umesto, ili naizmenično sa bilo kojim od ovih izraza. Izraz „polipeptid“ takođe ima za cilj da se odnosi na proizvode post-ekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili modifikacije sa ne-prirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije neophodno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu. Polipeptid koji je ovde opisan može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1.000 ili više, ili 2.000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definiranu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju preklopljeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija, nazivaju se neobrađeni.

„Izolovanim“ polipeptidom ili varijantom ili njegovim derivatom namijenjen je polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može ukloniti iz svog domaćeg ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini izraženi u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu ovog prikazivanja, kao i prirodni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni odgovarajućom tehnikom.

„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD-a), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti sekvence aminokiseline date sekvence aminokiseline A sa datom sekvencom aminokiseline B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiseline prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.

Termin „polinukleotid“ se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukat, npr. kurirska RNK (mRNK), virusno izvedena RNK, ili plazmidna DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestera ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA). Termin „molekul nukleinske kiseline“ odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. DNK ili RNK fragmenti, prisutni u polinukleotidu.

„Izolovanim“ molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom namijenjen je molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svoje prirodne sredine. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid koji se nalazi u vektoru smatra se izolovanim u svrhe ovog prikazivanja. Dodatni primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćinima ili prečišćenim (delimično ili u suštini) polinukleotidima u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje polinukleotidni molekul sadržan u ćelijama koje obično sadrže polinukleotidni molekul, ali polinukleotidni molekul je prisutan ekstrahromosomalno ili na hromozomskom mestu koje se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani RNK molekuli uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK koji su ovde obelodanjeni, kao i pozitivne i negativne oblike i dvostruke oblike. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline opisane ovde dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina može biti ili može obuhvatiti regulatorni element kao što je promotor, mesto za vezivanje ribozoma ili terminator transkripcije.

Nukleinska kiselina ili polinukleotid koji ima najmanje nukleotidnu sekvencu, na primer, 95% „identičan“ referentnoj nukleotidnoj sekvenci koja je ovde obelodanjena, namerava se da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim što polinukleotidna sekvenca može obuhvatiti do pet tačaka mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, kako bi dobili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja je barem 95% identična referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci se može izbrisati ili zameniti drugim nukleotidom ili nizom nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci što se može ubaciti u referentnu sekvencu. Ove promene referentne sekvence mogu se pojaviti na položajima terminala 5’ ili 3’ referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između onih položaja terminala, koji su pojedinačno podeljeni između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Kao praktična stvar, ako je bilo koja određena polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci koja je ovde prikazana može se konvencionalno odrediti korišćenjem poznatog računarskog programa, kao što je prethodno razmatrano za polipeptide (npr. ALIGN-2).

Termin „ekspresiona kaseta“ odnosi se na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifovanih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljnoj ćeliji. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresijske kasete ekspresionog vektora uključuje, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribira i promotor. U određenim realizacijama, ekspresiona kaseta koja je ovde prikazana, sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigene koji vezuju molekule koji su ovde prikazani ili njihove fragmente.

Termin „vektor“ ili „vektor ekspresije“ je sinonim za „konstrukciju ekspresije“ i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljnu ćeliju. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Vektor ekspresije koji je ovde opisan sadrži ekspresionu kasetu. Vektori ekspresije omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Jednom kada je vektor ekspresije unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili proteina koji je kodiran genom proizvodi se pomoću mašine za transfikaciju i/ili translaciju ćelije. U jednoj realizaciji, ekspresioni vektor koji je ovde prikazan, sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične molekule koji vezuju antigen koji su ovde prikazani ili njihove fragmente.

Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koji tip ćelijskog sistema koji se može koristiti za generisanje bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji su ovde prikazani. Ćelije domaćini uključuju kultivisane ćelije, npr. kultivisane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, ćelije SP2/0, ćelije YO mieloma, ćelije mieloma P3X63 miševa, PER ćelije, ćelije PER.C6 ili ćelije hibridoma, ćelije kvasca, ćelije insekata i biljne ćelije, da imenujemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se čine unutar transgene životinje, transgene biljke ili kultivisanih biljnih ili životinjskih tkiva.

„Aktivacioni Fc receptor“ je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela izaziva signalne događaje koji stimulišu ćeliju koja nosi receptor da izvodi efektorske funkcije. Humani aktivacioni Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD 16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), i FcαRI (CD89).

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do lizi ciljanih ćelija obloženih antitelom imuno efektorskim ćelijama. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže region Fc specifično vezuju, uglavnom preko proteina koji je N-terminal regionu Fc. Kako se ovde koristi, termin „smanjen ADCC“ je definisan kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, u datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, pomoću mehanizma ADCC definisanog iznad i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potreban da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, mehanizmom ADCC-a. Smanjenje ADCC-a je relativno u odnosu na ADCC posredovan istim antitelom proizvedenim od strane iste vrste ćelija domaćina, koristeći iste standardne metode proizvodnje, prečišćavanja, formulacije i skladištenja (koje su poznate stručnjacima), ali koje nisu projektovane. Na primer, smanjenje ADCC-a posredovano antitelom koje sadrži u svom Fc domenu supstituciju aminokiselina koja smanjuje ADCC, je relativno u odnosu na ADCC posredovan istim antitelom bez ove supstitucije aminokiselina u domenu Fc. Pogodni testovi za merenje ADCC-a su dobro poznati u struci (pogledajte npr. PCT publikaciju br. WO 2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO 2012/130831).

„Efikasna količina“ agensa odnosi se na količinu koja je neophodna da bi nastala fiziološka promena u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.

„Efikasna količina“ agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina sredstva na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizira ili sprečava negativne efekte bolesti.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Naročito, pojedinac ili ispitanik je čovek.

Termin „farmaceutska formulacija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje“ (i gramatičke varijacije, kao što je „leči“, „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija se koriste za odlaganje razvoja bolesti ili za usporavanje progresije bolesti.

Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

Detaljan opis realizacija

Ovde je dat bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži prvi i drugi vezujući deo antigena, od kojih je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za antigen koji aktivira T ćelije, a drugi je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljnih ćelija, i Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje;

pri čemu je prvi vezujući deo antigena

(a) molekul Fab-a sa jednim lancem, pri čemu su laki Fab lanac i teški Fab lanac povezani sa peptidnom spojnicom, ili

(b) prenos Fab molekula u kome se razmjenjuju varijabla ili konstantni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca.

Formati bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija Komponente molekula bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija mogu biti fuzionisane jedne sa drugima u različitim konfiguracijama. Primerne konfiguracije su prikazane na slici 1.

U nekim realizacijama, drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

U takvoj određenoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena. U takvoj specifičnoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u suštini se sastoji od prvog i drugog vezujućeg dela antigena, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, a po izboru jedan ili više peptidnih spojnica, pri čemu se prvi vezujući deo antigen spaja na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena, a drugi vezujući deo antigena vezan je na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U još specifičnijoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je Fab molekul sa jednim lancem. Alternativno, u određenoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosna Fab molekula. Po izboru, ako je prvi vezujući deo antigena prenosna Fab molekula, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena mogu dodatno biti fuzionisani jedni sa drugima.

U takvoj alternativnoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvoj specifičnoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sastoji se od prvog i drugog vezujućeg dela antigena, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, a po izboru jednu ili više peptidnih spojnica, pri čemu su prvi i drugi vezujući deo antigena fuzionisani na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena. U još specifičnijoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je Fab molekul sa jednim lancem. Alternativno, u određenoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosna Fab molekula.

U još jednoj takvoj realizaciji, drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu lakog Fab lanca za N-terminus lakog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. U takvoj specifičnoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u suštini se sastoji od prvog i drugog vezujućeg dela antigena, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, a po izboru jedan ili više peptidnih spojnica, pri čemu se prvi vezujući deo antigen spaja na N-terminusu lakog Fab lanca do C-terminusa lakog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena, a drugi vezujući deo antigena vezan je na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U još specifičnijoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosni Fab molekul.

U drugim realizacijama, prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

U takvoj određenoj takvoj realizaciji, drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. U takvoj specifičnoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u suštini se sastoji od prvog i drugog vezujućeg dela antigena, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, a po izboru jedna ili više peptidnih spojnica, pri čemu se drugi vezujući deo antigen spaja na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, a prvi vezujući deo antigena vezan je na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U još specifičnijoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosni Fab molekul. Po izboru, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena mogu dodatno biti fuzionisani jedni sa drugima.

Posebno u ovim realizacijama, prvi vezujući deo antigena je sposoban za specifično vezivanje antigena za aktiviranje T ćelija. U drugim realizacijama, prvi vezujući deo antigena je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.

Delovi za vezivanje antigena mogu se spojiti sa Fc domenom ili jedni sa drugima direktno ili peptidnom spojnicom, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, obično oko 2-20 amino kiselina. Peptidne spojnice su poznati u struci i opisani su ovde. Pogodni, ne-imunogene peptidne spojnice uključuju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)npeptidne spojnice, „n“ je generalno broj između 1 i 10, obično između 2 i 4. Posebno pogodna peptidna spojnica za fuzionisanje lakog Fab lanca prvog i drugog vezujućeg dela antigena je (G4S)2. Primerna peptidna spojnica pogodna za povezivanje teških Fab lanaca prvog i drugog vezujućeg dela antigena je EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 150 i 151). Pored toga, spojnice mogu sadržati (deo) imunoglobulinskog zglobnog regiona. Naročito gde je vezujući deo antigena fuzionisan za N-terminus podjedinice Fc domena, može se spojiti preko regiona šarke imunoglobulina ili njegovog dela, sa ili bez dodatnom peptidnom spojnicom.

Bispecifični molekul za vezivanje antigena za aktivaciju T ćelija sa jednim vezujućim delom antigena sposobnim za specifično vezivanje za ciljne ćelije antigena (na primer kao što je prikazano na slikama 1A, 1B, 1D, 1E, 1H, 1I, 1K ili 1M) je korisan, naročito u slučajevima u kojima se očekuje internalizacija ciljnog ćelijskog antigena nakon vezivanja vezujućeg dela antigena. U takvim slučajevima prisustvo više od jednog vezujućeg dela antigena specifičnog za ciljne ćelije antigena može poboljšati internalizaciju antigena ciljne ćelije, čime se smanjuje njegova dostupnost.

Međutim, u mnogim drugim slučajevima biće poželjno imati bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži dva ili više vezujućih ćelija antigena specifičnih za ciljne ćelije antigena (pogledajte primere prikazane na slikama 1C, 1F, 1G, 1J ili 1L ), na primer, optimizuje ciljanje na ciljnu lokaciju ili da omogući ukrštanje ciljnih ćelija antigena.

Shodno tome, u izvesnim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan, dalje sadrži treći vezujući antigen Fab molekul koji je sposoban za specifično vezivanje za ciljani ćelijski antigen. U jednoj realizaciji, treći vezujući deo antigena je sposoban za specifično vezivanje za isti antigen ciljne ćelije kao prvi ili drugi vezujući deo antigena. U određenoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je sposoban za specifično vezivanje za antigen koji aktivira T ćelije, a drugi i treći vezujući deo antigena sposobni su za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.

U jednoj realizaciji, treći vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena. U određenoj realizaciji, drugi i treći vezujući deo antigena se spajaju na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, i prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena. U jednoj sličnoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je Fab molekul sa jednim lancem. U određenoj takvoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosni Fab molekul. Po izboru, ako je prvi vezujući deo antigena prenosna Fab molekula, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena mogu dodatno biti fuzionisani jedni sa drugima. Drugi i treći deo za vezivanje antigena mogu biti fuzionisani sa Fc domenom direktno ili peptidnom spojnicom. U određenoj realizaciji, drugi i treći deo za vezivanje antigena su fuzionisani sa Fc domenom preko oblasti imunoglobulinske šarke. U specifičnoj realizaciji, region imunoglobulnog zgloba je humani region IgG1zgloba. U jednoj realizaciji, drugi i treći vezujući deo antigena i Fc domen su deo molekula imunoglobulina. U određenoj realizaciji, molekul imunoglobulina je IgG klasa imunoglobulina. U još specifičnijoj realizaciji, imunoglobulin je imunoglobulin podklase IgG1. U još jednoj realizaciji, imunoglobulin je imunoglobulin podklase IgG4. U još specifičnijoj realizaciji, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim realizacijama, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u suštini se sastoji od molekula imunoglobulina koji je sposoban za specifično vezivanje za ciljani ćelijski antigen, a vezujući deo antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen koji aktivira T ćelije gde je vezujući deo antigena molekula sa jednim Fab lancem ili molekula sa prenosnim Fab, posebno unakrsnim Fab molekulom, fuzionisanog na N-terminusu jednog od teških lanaca imunoglobulina, po izboru peptidnom spojnicom.

U alternativnoj realizaciji, prvi i treći vezujući deo antigena se spajaju na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, i drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. U specifičnoj takvoj realizaciji, bispecifični molekul za vezivanje antigena koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg vezujućeg dela antigena, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, a po izboru jednu ili više peptidnih spojnica, pri čemu drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, a prvi vezujući deo antigena vezan je na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve podjedinice Fc domena, a pri čemu je treći vezujući deo antigena vezan na C-terminusu teškog lanca Fab za N-terminus druge podjedinice Fc domena. U posebnoj sličnoj realizaciji, prvi vezujući deo antigena je prenosni Fab molekul. Po izboru, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena mogu dodatno biti fuzionisani jedni sa drugima.

U nekim od bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji aktivira T ćelije koji su ovde prikazani, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena fuzionisani su jedni sa drugima, po izboru peptidnom spojnicom. U zavisnosti od konfiguracije prvog i drugog vezujućeg dela antigena, laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena može biti fuzionisan na svom C-terminusu za N-terminus lakog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena, ili laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena može biti fuzionisan na svom C-terminusu za N-terminus lakog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena. Spajanje Fab lakih lanaca prvog i drugog vezivnog dela antigena dalje smanjuje pogrešno uparivanje neuparenih teških i lakih Fab lanaca, a takođe smanjuje i broj plazmida potrebnih za ekspresiju nekih bispecifičnih molekula koje vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani.

U određenim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kome prvi laki Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi-terminalne peptidne veze sa peptidnom spojnicom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL-CL-linker-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4)), a polipeptid gde drugi teški Fab lanac deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U nekim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži drugi polipeptid lakog Fab lanca (VL-CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

U nekim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kome prvi laki Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi-terminalne peptidne veze sa peptidnom spojnicom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL-CL-linker-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U jednoj od ovih realizacija, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži drugi polipeptid lakog Fab lanca (VL-CL). Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u skladu sa ovim realizacijama može dalje da sadrži (i) polipeptid podjedinice Fc domena (CH2-CH3(-CH4)) ili (ii) polipeptid gde treći teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) i trećim polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

U određenim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kojem varijabilni region prvog lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom teškog Fab lanca (tj. prenosnog teškog Fab lanca, pri čemu se varijabilna grupa regiona teškog lanca zamenjuje varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa podjedinicom Fc domena (VL-CH1-CH2-CH2(-CH4)), a polipeptid u kome drugi teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U nekim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa stalnim regionom lakog Fab lanca (VH-CL) i polipeptidom lakog Fab lanca (VL- CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

U alternativnim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kojem varijabilni region prvog teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom lakog Fab lanca (tj. prenosnog teškog Fab lanca, pri čemu se varijabilna grupa regiona teškog lanca zamenjuje konstantnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa podjedinicom Fc domena (VL-CH1-CH2-CH2(-CH4)), a polipeptid u kome drugi teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U nekim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa stalnim regionom teškog Fab lanca (VL-CH1) i polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

U nekim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kojem varijabilni region prvog lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom teškog Fab lanca (tj. prenosnog teškog Fab lanca, pri čemu varijabilna grupa regiona teškog lanca zamenjuje varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U drugim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid u kojem varijabilni region prvog teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom lakog Fab lanca (tj. prenosnog teškog Fab lanca, pri čemu se konstantna grupa regiona teškog lanca zamenjuje varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). U još nekim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija obuhvata polipeptid gde drugi teški Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa varijabilnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom teškog Fab lanca (tj. prenosnim teškim Fab lancem, pri čemu varijabilni region teškog lanca zamjenjuje varijabilni region lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-VL -CH1-CH2-CH3(-CH4)). U drugim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija obuhvata polipeptid gde drugi teški Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa prvim varijabilnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom lakog Fab lanca (tj. prenosnim teškim Fab lancem, pri čemu konstantni region teškog lanca zamjenjuje konstantni region lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4)).

U nekim od ovih realizacija bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži polipeptid prenosnog lakog Fab lanca, gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa stalnim regionom lakog Fab lanca (VH-CL) i polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U drugim realizacijama bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži polipeptid prenosnog lakog Fab lanca, gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa stalnim regionom teškog Fab lanca (VL-CH1) i polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U još nekim od ovih realizacija, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija dalje sadrži polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CH1-VL-CL), polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog Fab lanca (VH-CL-VL-CL), polipeptid gde polipeptid lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca (VL-CL-VL-CH1) ili polipeptid gde polipeptid lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa promenljivim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca (VL-CL-VH-CL).

Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u skladu sa ovim realizacijama može dalje da sadrži (i) polipeptid podjedinice Fc domena (CH2-CH3(-CH4)) ili (ii) polipeptid gde treći teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) i trećim polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid gde drugi laki Fab lanac deli peptidnu karboksi-terminalnu vezu sa prvom varijabilnom regijom lakog Fab lanca, koja zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom teškog Fab lanca (tj. prenosnog lakog Fab lanca, pri čemu je konstantni region lakog lanca zamenjen konstantnim regionom teškog lanca) (VL-CL-VL-CH1), polipeptida u kojem drugi teški Fab lanac deli karboksi-terminal peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) i polipeptidom u kojem varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom lakog Fab lanca (VH-CL). U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptid gde drugi laki Fab lanac deli peptidnu karboksi-terminalnu vezu sa prvom varijabilnom regijom teškog Fab lanca, koja zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom lakog Fab lanca (tj. prenosnog lakog Fab lanca, pri čemu je varijabilni region lakog lanca zamenjen varijabilnim regionom teškog lanca) (VL-CL-VH-CL), polipeptida u kojem drugi teški Fab lanac deli karboksi-terminal peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) i polipeptidom u kojem varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim konstantnim regionom teškog Fab lanca (VH-CL). Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u skladu sa ovim realizacijama može dalje da sadrži (i) polipeptid podjedinice Fc domena (CH2-CH3(-CH4)) ili (ii) polipeptid gde treći teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) i trećim polipeptidom lakog Fab lanca (VL-CL). U određenim realizacijama polipeptidi su kovalentno povezani, npr. sa disulfidnom vezom.

Prema bilo kom od gore navedenih realizacija, komponente bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija (npr. vezujući deo antigena, Fc domen) mogu biti fuzionisane direktno ili preko različitih spojnica, posebno peptidnih spojnica koje sadrže jednu ili više aminokiselina, obično oko 2-20 amino kiselina, koje su ovde opisane ili su poznate u struci. Pogodni, ne-imunogene peptidne spojnice uključuju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)npeptidne spojnice, gde je n generalno broj između 1 i 10, obično između 2 i 4.

Fc domen

Fc domen bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sastoji se od par polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, od kojih svaka podjedinica sadrži konstantne domene teškog lanca CH2i CH3IgG. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedna sa drugom. U jednoj realizaciji, ovde opisani bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži ne više od jednog Fc domena.

U jednoj realizaciji, Fc domen bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija je IgG Fc domen. U određenoj realizaciji, Fc domen je IgG1Fc domen. U drugoj realizaciji, Fc domen je IgG4Fc domen. U specifičnijoj realizaciji Fc domen je IgG4Fc domen koji sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji S228 (EU numerisanje), naročito zamena aminokiselina S228P. Ova supstitucija aminokiselina smanjuje in vivo izmenu Fab ruke IgC4antitela (pogledajte Stubenrauch i sar., Metabolizam i dispozicija lekova 38, 84-91 (2010)). U daljoj konkretnoj realizaciji, Fc domen je čovek. Primerna sekvenca humanog IgG1Fc regiona je data u SEQ ID NO: 149.

Modifikacije Fc domena koje promovišu heterodimerizaciju

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde opisani, obuhvataju različite grupe vezujućih delova antigena, fuzionisanih na jednu ili drugu od dve podjedinice Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena obično sastavljene u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna ko-ekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšao prinos i čistoća bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija u rekombinantnoj proizvodnji, biće poželjno uvesti modifikaciju koja promoviše asocijaciju željenih polipeptida u Fc domen bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija .

Prema tome, u konkretnim realizacijama Fc domen bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde prikazan, sadrži modifikaciju koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena. Sajt najsnažnije proteinske interakcije između dve podjedinice humanog IgG Fc domena nalazi se u CH3domenu Fc domena. Prema tome, u jednoj realizaciji pomenuta modifikacija je u CH3domenu Fc domena.

U specifičnoj realizaciji, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „čvor u rupi“, koja sadrži modifikaciju „čvora“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupe“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.

Tehnologija „čvor u rupi“ je opisana npr. u SAD 5,731,168; SAD 7,695,936; Ridgway i sar., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Generalno, postupak podrazumeva uvođenje protuberance („čvora“) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupe“) u interfejsu drugog polipeptida, tako da se izbočina može postaviti u šupljinu tako da promoviše formiranje heterodimera i sprečava nastanak homodimera. Protuberance se konstruišu zamenom malih aminokiselinskih bočnih lanaca iz interfejsa prvog polipeptida sa većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Kompenzacijske šupljine identične ili slične veličine protuberancama stvorene su u interfejsu drugog polipeptida zamenom velikih lanaca aminokiselina sa manjim (npr. alaninom ili treoninom).

Shodno tome, u određenoj realizaciji, u domenu CH3prve podjedinice Fc domena bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, amino kiselinski ostatak se zamjenjuje sa ostacima aminokiselina koji imaju veći volumen bočnog lanca, čime stvaraju izbočinu unutar domena CH3prve podjedinice koja se može postaviti u šupljinu unutar domena CH3druge podjedinice, a u domenu CH3druge podjedinice Fc domena amino kiselinski ostatak zamjenjuje se sa amino kiselinskim ostacima koji imaju manji volumen bočnog lanca, čime se generiše šupljina unutar CH3domena druge podjedinice u okviru koji je pozicionabilan u odnosu na CH3domen prve podjedinice.

Protuberancija i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. putem mutageneze specifične za mesto ili sintezom peptida.

U specifičnoj realizaciji, u CH3domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 je zamenjen ostatkom triptofana (T366W), a u domenu CH3druge podjedinice Fc domena ostatak tirozina na poziciji 407 je zamenjen ostatkom valina (Y407V). U jednoj realizaciji, u drugoj podjedinici Fc domena dodatni ostatak treonina na poziciji 366 se menja sa ostatkom serina (T366S), a ostatak leucina na poziciji 368 zamenjen je ostankom alanina (L368A).

U još jednoj realizaciji, u prvoj podjedinici Fc domena dodatni ostatak serina na poziciji 354 se menja sa ostatkom cisteina (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena dodatni ostatak tirozina na poziciji 349 se menja sa ostatkom cisteina (Y349C). Uvođenje ova dva ostatka cisteina rezultuje stvaranjem disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, dalje stabilizacijom dimera (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

U određenoj realizaciji, vezujući deo antigena koji se može vezati za antigen koji aktivira T ćelije je fuzionisan (po izboru preko vezujućeg dela antigena sposobnog za vezivanje antigena ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju „čvora“). Bez želje da se vezuje teorijski, spajanje vezujućeg dela antigena koji može da se vezuje za antigen koji aktivira T ćelije na podskupinu koja sadrži čvor Fc domena će (dalje) umanjiti generisanje molekula koji vezuju antigene koji sadrže dva dela za vezivanje antigena za aktiviranje T ćelija (sterični sukob dva polipeptida koji sadrže čvor).

U alternativnoj realizaciji, promovisana asocijacija za promenu prve i druge podjedinice Fc domena obuhvata elektrostatičke efekte koji upravljaju elektrostatskim modifikacijama, npr. kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Uopšteno govoreći, ovaj metod uključuje zamenu jednog ili više amino kiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena pohranjenim aminokiselinskim ostacima tako da formacija homodimera postaje elektrostatički nepovoljna ali heterodimerizacija elektrostatički povoljna.

Modifikacije Fc domena smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju

Fc domen daje poverljive povoljne farmakokinetičke osobine bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija, uključujući dugotrajni poluživot u serumu koji doprinosi dobijanju akumulacije u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije krvi u tkiva. U isto vreme, međutim, može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore umesto na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, ko-aktivacija Fc receptorskih puteva signalizacije može dovesti do otpuštanja citokina koji, u kombinaciji sa aktivacijskim svojstvima T ćelija i dugim poluživotom molekula koji vezuju antigen, dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata nakon sistemske primene. Aktivacija imunih ćelija (sa Fc receptorima), osim T ćelija, može čak smanjiti efikasnost bispecifičng molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija zbog potencijalnog uništavanja T ćelija, npr. NK ćelijama.

Prema tome, u konkretnim realizacijama Fc domen bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani, pokazuje redukovani afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa domaćim IgG1Fc domenom. U jednoj ovakvoj realizaciji, Fc domen (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10% i najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja prema Fc receptoru, u poređenju sa domaćim IgG1Fc domenom (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži prirodni IgG1Fc domen) i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10% i najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa domaćim IgG1domenom Fc domena (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži prirodni IgG1Fc domen). U jednoj realizaciji, domen Fc domena (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži navedeni Fc domen) se u suštini ne vezuje za Fc receptor i/ili indukuje efektorsku funkciju. U određenoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednoj realizaciji, Fc receptor je ljudski Fc receptor. U jednoj realizaciji, Fc receptor je aktivni Fc receptor. U specifičnoj realizaciji Fc receptor je aktivni ljudski Fcγ receptor, konkretnije ljudski FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, posebno ljudski FcγRIIIa. U jednoj realizaciji efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupa CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnoj realizaciji, efektorska funkcija je ADCC. U jednoj realizaciji, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan vezujući afinitet na neonatalni Fc receptor (FcRn), u poređenju sa domaćim IgG1Fc domenom. Suštinski slično vezivanje za FcRn se postiže kada Fc domen (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje više od oko 70%, posebno više od oko 80%, više od oko 90% afiniteta vezivanja domaćeg IgG1Fc domena (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži domaći IgG1Fc domen) do FcRn.

U određenim realizacijama, domen Fc je inženjerovan da ima smanjen vezujući afinitet na Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa ne-inženjerovanim Fc domenom. U određenim realizacijama, Fc domen bispecifične molekule koja vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Obično, jedna ili više aminokiselinskih mutacija je prisutna u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednoj realizaciji, mutacija amino kiselina smanjuje afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor. U jednoj realizaciji, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor za najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U rešenjima gde postoji više od jedne aminokiseline mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor za najmanje 10-puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži inženjerovani Fc domen ima manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% vezivnog afiniteta prema Fc receptoru u poređenju sa bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji vezuje antigen koji sadrži neinženjerovani Fc domen. U određenoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim realizacijama, Fc receptor je ljudski Fc receptor. U nekim realizacijama, Fc receptor je aktivni Fc receptor. U specifičnoj realizaciji, Fc receptor je aktivni ljudski Fcγ receptor, konkretnije ljudski FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, posebno ljudski FcγRIIIa. Poželjno, vezivanje za svaki od ovih receptora je smanjeno. U nekim realizacijama, takođe je smanjen afinitet vezivanja za komplementnu komponentu, posebno afiniteta vezivanja za C1q. U jednoj realizaciji, afinitet vezivanja na neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, odnosno očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena prema navedenom receptoru, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja neinženjeranog oblika Fc domena (ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži navedeni ne-inženjerovani oblik Fc domena) do FcRn. Fc domen ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde opisani koji sadrže pomenuti Fc domen, mogu pokazati više od oko 80% i čak više od oko 90% takvog afiniteta. U određenim realizacijama, Fc domen bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija je inženjerovan da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa ne-inženjerovanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može uključiti, ali nije ograničena na, jedno ili više od sledećih: smanjenu citotoksičnost zavisno od komplementa (CDC), smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjene ćelijske fagocitoze (ADCP) zavisno od antitela, redukovanu sekrecija citokina, redukovano uzimanje antigena od imunog kompleksa ćelija koje predstavljaju antigen, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenje direktne signalizacije indukujuće apoptoze, smanjeno ukrštanje antitela vezana za cilj, smanjivanje sazrevanja dendritičnih ćelija ili smanjenje pripremanja T ćelija. U jednoj realizaciji, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupa smanjenih CDC, smanjenih ADCC, smanjenih ADCP i sekrecije citokina. U konkretnoj realizaciji, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednoj realizaciji, smanjena ADCC je manji od 20% ADCC-a indukovanog ne-inženjerovanim Fc domenom (ili bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži ne-inženjerovani Fc domen).

U jednoj realizaciji, mutacija aminokiselina koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptorsku i/ili efektorsku funkciju je supstitucija aminokiselina. U jednoj realizaciji Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe E233, L234, L235, N297, P331 i P329. U specifičnijoj realizaciji, domen Fc sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe L234, L235 i P329. U nekim realizacijama, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen je IgG1Fc domena, posebno humani IgG1Fc domen. U jednoj realizaciji, domen Fc sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329. U specifičnijoj realizaciji, supstitucija aminokiselina je P329A ili P329G, naročito P329G. U jednoj realizaciji Fc domen sadrži supstituciju aminokiselina na poziciji P329 i dodatnu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz E233, L234, L235, N297 i P331. U specifičnijoj realizaciji, dalja aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U specifičnim realizacijama, domen Fc sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235. U specifičnim realizacijama, domen Fc sadrži aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G („P329G LALA“). U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen je IgG1Fc domena, posebno humani IgG1Fc domen. Kombinacija aminokiselinskih supstitucija „P329G LALA“ gotovo u potpunosti ukida vezivanje Fcγ receptora na humani IgG1Fc domen, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831. WO 2012/130831 takođe opisuje metode za izradu takvih mutantnih Fc domena i postupaka za određivanje njegovih svojstava kao što su vezivanje Fc receptora ili efektorske funkcije.

IgG4antitela pokazuju smanjeni vezujući afinitet na Fc receptore i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Prema tome, u nekim realizacijama Fc domen bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je WO ovde opisan je IgG4Fc domen, posebno humani IgG4Fc domen. U jednoj realizaciji, IgG4Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije na položaju S228, konkretno supstituciju amino kiseline S228P. Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednoj realizaciji IgG4Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju L235, konkretno supstituciju amino kiseline L235E. U drugoj realizaciji, IgG4Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju P329, konkretno supstituciju amino kiseline P329G. U konkretnoj realizaciji, IgG4Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, konkretno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G. Takvi mutanti IgG4Fc domena i njihova vezivanja Fcγ receptora su opisani u publikaciji PCT br. WO 2012/130831.

U određenoj realizaciji Fc domena koja pokazuje redukovani vezujući afinitet na Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa domaćim IgG1Fc domenom, je humani IgG1Fc domen koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i po izboru P329G, ili humani IgG4Fc domen koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i po izboru P329G.

U nekim realizacijama eliminisana je N-glikozilacija Fc domena. U jednoj ovakvoj realizaciji, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na položaju N297, naročito supstituciju aminokiselina koja zamenjuje asparagin pomoću alanina (N297A) ili asparaginske kiseline (N297D).

Osim Fc domena opisanih ovde gore i u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenom Fc receptorskom vezom i/ili efektorskom funkcijom takođe uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (SAD patent br. 6,737,056) . Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više mesta aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvanog "DANA" Fc mutanta sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (SAD Patent br.7,332,581).

Mutantni Fc domeni mogu biti pripremljene uklanjanjem aminokiseline, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetske metode mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR-a, sinteze gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi npr. sekvenciranjem.

Vezivanje na Fc receptore može se lako odrediti npr. putem ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE zdravstvena zaštita) i Fc receptori koje je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Pogodan takav vezujući test je opisan ovde. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje ćelija koji sadrže Fc domen za Fc receptore mogu se proceniti korišćenjem ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su humane NK ćelije koje eksprimiraju receptor FcγIIIa.

Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži Fc domen, može se izmeriti metodama poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC-a. Drugi primeri in vitro analiza za procenu aktivnosti ADCC-a molekula od interesa su opisani u SAD patentu br.5,500,362; Hellstrom i sar. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom i sar., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); SAD patentu br.5,821,337; Bruggemann i sar., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivne metode (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju („CellTechnology, Inc.“ Mauntin Vju, Kalifornija; i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti („Promega“, Medison, Viskonsin). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što su one otkrivene u Clynes i sar., Proc Natl Acad Sci SAD 95, 652-656 (1998).

U nekim realizacijama, vezivanje Fc domena na komponentu komplementa, konkretno na C1q, je smanjeno. Shodno tome, u nekim realizacijama u kojima je Fc domen dizajniran da ima smanjenu efektorsku funkciju, navedena redukovana efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q može se izvesti da bi se utvrdilo da li je bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sposoban da vezuje C1q i time ima CDC aktivnost. Pogledajte npr. C1q i C3c ELISA vezivanje u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa može se izvršiti CDC test (pogledajte, na primer, Gazzano-Santoro i sar., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg i sar., Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Vezujući delovi antigena

Molekul koji vezuje antigen otkriven ovde je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva vezujuća dela antigena koja mogu da se specifično vezuju za dve različite antigene determinante. Prema sadašnjem otkriću, komponente za vezivanje antigena su Fab molekule (tj. vezujući domeni antigena sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region). U jednoj realizaciji, Fab molekuli su ljudski. U drugoj realizaciji, Fab molekuli su humanizovani. U još jednoj realizaciji rečeno je da Fab molekule sadrže konstantne regione ljudskog teškog i lakog lanca.

Najmanje jedan od vezujućih delova antigena je molekul jednolančanog Fab molekula ili prenosnog Fab molekula. Takve modifikacije sprečavaju pogrešno uparivanje teških i lakih lanaca iz različitih Fab molekula, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom jednolančanom Fab molekulu korisnog za bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde prikazan, C-terminus lakog Fab lanca je povezan sa N-terminusom teškog Fab lanca peptidnom spojnicom. Peptidna spojnica omogućava raspoređivanje teškog i lakog Fab lanca da bi se formirao funkcionalni deo za vezivanje antigena. Peptidne spojnice pogodne za povezivanje teškog i lakog Fab lanca uključuju, na primer, (G4S)6-GG (SEQ ID NO: 152) ili (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG (SEQ ID NO: 153). U određenom prenosnom Fab molekulu korisnom za bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva, konstantni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca su razmenjeni. U još jednom prenosnom Fab molekulu korisnom za bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva, varijabilni regioni lakog Fab lanca i teškog Fab lanca su razmenjeni.

U određenoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sposoban je za simultano vezivanje za antigen ciljnih ćelija, posebno antigen tumorskih ćelija i antigen za aktiviranje T ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija može da unakrsno povezuje T ćeliju i ciljnu ćeliju istovremenim vezivanjem za antigen ciljne ćelije i antigen za aktiviranje T ćelija. U još specifičnijoj realizaciji, takvo istovremeno vezivanje rezultira u lizi ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. U jednoj realizaciji, takvo istovremeno vezivanje rezultira aktivacijom T ćelije. U drugim realizacijama, takva istovremena vezivanja rezultiraju u ćelijskom odgovoru T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, izabranog iz grupe: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja molekula citotoksičnog efektora, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. U jednoj realizaciji, vezivanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija na antigen za aktiviranje T ćelija bez istovremenog vezivanja za antigen ciljne ćelije ne rezultira aktivacijom T ćelija.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sposoban je da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije u ciljnu ćeliju. U određenoj realizaciji, pomenuto preusmjeravanje je nezavisno od predstavljanja peptidnih antigena posredovanih MHC ciljnom ćelijom i/ili od specifičnosti T ćelije.

Naročito, T ćelija prema bilo kojoj od realizacija ovde prikazanih je citotoksična T ćelija. U nekim realizacijama T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, posebno CD8<+>T ćelija.

Vezujući delovi antigena za aktiviranje T ćelija

Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji se može vezati za antigen za aktiviranje T ćelija (takođe ovde označen kao „vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija“). U konkretnoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži ne više od jednog vezujućeg dela antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen za aktiviranje T ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija obezbeđuje monovalentno vezivanje za antigen za aktiviranje T ćelija. Vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija može biti konvencionalni Fab molekul ili modifikovani Fab molekul, tj. molekul sa jednim lancem ili prenosni Fab. U realizacijama gde postoji više od jednog vezujućeg dela antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za ciljani ćelijski antigen koji se sastoji od bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, vezujući deo antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen koji aktivira T ćelije poželjno je modifikovan Fab molekul.

U određenoj realizaciji antigen koji aktivira T ćelije je CD3, naročito ljudski CD3 (SEQ ID NO: 265) ili cinomolgus CD3 (SEQ ID NO: 266), naročito ljudski CD3. U određenoj realizaciji vezujući deo antigena koji aktivira T ćelije je unakrsno-reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) humani i cinomolgus CD3. U nekim realizacijama, antigen koji aktivira T ćelije je epsilonska podjedinica CD3.

U jednoj realizaciji vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija može se takmičiti sa monoklonskim antitelom H2C (opisanim u PCT publikaciji br. WO2008/119567) za vezivanje epitopa CD3. U još jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija se može takmičiti sa monoklonskim antitelom V9 (opisanim u Rodrigues i sar., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) i SAD patentu br. 6,054,297) za vezivanje epitopa CD3 . U još jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija može se takmičiti sa monoklonskim antitelom FN18 (opisanim u Nooij i sar., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)) za vezivanje epitopa CD3. U određenoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija može se takmičiti sa monoklonskim antitelom SP34 (opisanim u Pessano i sar., EMBO J 4, 337-340 (1985)) za vezivanje epitopa CD3. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija se vezuje za isti epitop CD3 kao monoklonsko antitelo SP34. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 163, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 165, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 167, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 171, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 173 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 175. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 169 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 177 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U konkretnoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 249, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 251, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 253, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 257, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 259 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 261. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija se može takmičiti za vezivanje epitopa CD3 sa vezujućim delom antigena koji obuhvata CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 249, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 251, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 253, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 257, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 259 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 261. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija se vezuje za isti epitop CD3 sa vezujućim delom antigena koji obuhvata CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 249, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 251, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 253, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 257, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 259 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 261. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 255 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 263 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija može se takmičiti za vezivanje epitopa CD3 sa vezujućim delom antigena koji obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 255 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 263. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija se vezuje za isti epitop CD3 sa vezujućim delom antigena koji obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 255 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 263. U sledećoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži humanizovanu verziju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 255 i humanizovanu verziju sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 263. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena za aktiviranje T ćelija sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 249, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 251, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 253, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 257, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 259, CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 261 i sekvenci varijabilnog regiona ljudskog teškog i lakog lanca.

Vezujući deo antigena ciljne ćelije

Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji se može vezati za antigen ciljane ćelije (takođe ovde označen kao „vezujući deo antigena ciljane ćelije“). U određenim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži dva vezujuća dela antigena koja su sposobna da se vezuju za antigen ciljne ćelije. U određenoj takvoj realizaciji, svaki od ovih vezujućih delova antigena se specifično vezuje za istu antigensku determinantu. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži imunoglobulinski molekul sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži ne više od dva vezujuća dela antigena koji mogu da se vezuju za antigen ciljne ćelije. Vezujući deo antigena ciljne ćelije je uglavnom Fab molekul koji se vezuje za specifičnu antigensku determinantu i sposoban je da usmeri bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija na ciljnu lokaciju, na primer, specifičnom tipu tumorske ćelije koja nosi antigensku determinantu.

U određenim realizacijama, vezujući deo antigena ciljne ćelije je usmeren na antigen koji je povezan sa patološkim uslovima, kao što je antigen predstavljen na ćeliji tumora ili na ćeliji inficiranoj virusom. Pogodni antigeni su površinski antigeni ćelije, na primer, ali ne ograničavajući se na receptore ćelijske površine. U konkretnim realizacijama, antigen je humani antigen. U specifičnoj realizaciji, antigen ciljne ćelije je izabran iz grupe proteina za aktiviranje fibroblasta (FAP), proteoglikana hondroitin sulfata povezanog sa melanomom (MCSP), receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), karcinoembrionog antigena (CEA), CD19, CD20 i CD33.

U konkretnim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji je specifičan za proteoglikan hondroitin sulfat povezan sa melanomom (MCSP). U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za bakteriju, obuhvata najmanje jedan, tipično dva ili više vezujućih delova antigena, koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom LC007 (pogledajte SEQ ID NO.75 i 83 i publikaciju evropske patentne prijave br. EP 2748195) za vezivanje za epitop MCSP-a. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 69, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 71, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 73, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 77, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 79 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 81. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 75 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 83 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U konkretnim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za bakteriju, obuhvata najmanje jedan, tipično dva ili više vezujućih delova antigena, koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom LCM4-3 ML2 (pogledajte SEQ ID NO. 239 i 247 i publikaciju evropske patentne prijave br. EP 2748195) za vezivanje za epitop MCSP-a. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP se vezuje za isti epitop MCSP-a kao monoklonsko antitelo M4-3 ML2. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 233, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 235, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 237, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 241, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 243 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 245. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%, posebno oko 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 239 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%, posebno oko 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 247 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca verovatnoće sazrevanja afiniteta monoklonskih antitela M4-3 ML2. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za MCSP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 239 sa jednim, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam, posebno dva, tri, četiri ili pet, aminokiselinskih supstitucija; i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEK I BR: 247 sa jednim, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam, naročito dva, tri, četiri ili pet, aminokiselinskih supstitucija. Bilo koji aminokiselinski ostatak unutar sekvenci varijabilnog regiona može biti supstituisan sa drugom aminokiselinom, uključujući ostatke aminokiselina unutar CDR regija, pod uslovom da se očuva vezivanje za MCSP, posebno humani MCSP. Poželjne varijante su one koji imaju afinitet vezivanja za MCSP najmanje jednak (ili jači) sa vezujućim afinitetom vezujućeg dela antigena koji sadrži nesupstituirane sekvence varijabilnog regiona.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U daljoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 9 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 11 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 13, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 15 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 17, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 19 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 23 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 25, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 27 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 29, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 31, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 29, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 35, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 37 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 39, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 29, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 179 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 29, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 181 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 23, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 185 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 23, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 187 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 189, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 191 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 193 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 189, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 193 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 195 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 189, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 193, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 199 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 201 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 23, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 215 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 217 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 23, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 215 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 219 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U specifičnoj realizaciji bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202,SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218 i SEQ ID NO: 220.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji je specifičan za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR). U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan, tipično dva ili više vezujučih delova antigena koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom GA201 za vezivanje za epitop EGFR. Pogledajte PCT publikaciju WO 2006/082515. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za EGFR sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 85, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 87, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 89, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 93, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 95 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 97. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za EGFR sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 91 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 99 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 43, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 45 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 47 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U daljoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 49, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 51 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 11 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 53, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 45 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 47 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U specifičnoj realizaciji bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 i SEQ ID NO: 12.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji je specifičan za aktivacijski protein fibroblasta (FAP). U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan, tipično dva ili više vezujučih delova antigena koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom 3F2 za vezivanje za epitop FAP. Pogledajte PCT publikaciju WO 2012/020006. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za FAP sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 101, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 103, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 105, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 109, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 111 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 113. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za FAP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 107 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 115 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U još jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 55, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 51 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 11 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U daljoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 57, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 59 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 61 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U specifičnoj realizaciji bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 12.

U konkretnim realizacijama, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji je specifičan za karcinoembrionski antigen (CEA). U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan, tipično dva ili više vezujućih delova antigena koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom BV431/26 (opisanim u evropskom patentu br. EP 160897 i Bosslet i sar., Int J Cancer 36, 75-84 (1985)) za vezivanje na epitopu CEA. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za bakteriju, obuhvata najmanje jedan, tipično dva ili više vezujućih delova antigena, koji mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom CH1A1A (pogledajte SEQ ID NO. 123 i 131) za vezivanje za epitop CEA-a. Pogledajte PCT publikaciju br. WO 2011/023787. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CEA se vezuje za isti epitop CEA -a kao monoklonsko antitelo CH1A1A. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CEA sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 117, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 119, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 121, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 125, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 127 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 129. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CEA sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%, posebno oko 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 123 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%, posebno oko 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 131 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CEA sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca verovatnoće sazrevanja afiniteta monoklonskih antitela CH1A1A. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CEA sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 123 sa jednim, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam, posebno dva, tri, četiri ili pet, aminokiselinskih supstitucija; i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEK I BR: 131 sa jednim, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam, naročito dva, tri, četiri ili pet, aminokiselinskih supstitucija. Bilo koji aminokiselinski ostatak unutar sekvenci varijabilnog regiona može biti supstituisan sa drugom aminokiselinom, uključujući ostatke aminokiselina unutar CDR regija, pod uslovom da se očuva vezanje za CEA, posebno humani CEA. Poželjne varijante su one koji imaju afinitet vezivanja za CEA najmanje jednak (ili jači) sa vezujućim afinitetom vezujućeg dela antigena koji sadrži nesupstituirane sekvence varijabilnog regiona.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 63, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 65, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 67 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 65, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 67, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 197 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 203, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 205 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 207 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 183, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 209, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 211 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 213 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U specifičnoj realizaciji bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 i SEQ ID NO: 214.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži najmanje jedan vezujući deo antigena koji je specifičan za CD33. U jednoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CD33 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 133, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 135, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 137, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 141, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 143 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 145. U daljoj realizaciji, vezujući deo antigena koji je specifičan za CD33 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 139 i sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 147 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 213, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 221 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 223 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednoj realizaciji, bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 221, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 223 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 225 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U specifičnoj realizaciji bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224 i SEQ ID NO: 226.

Polinukleotidi

Dalje navedeni ovde su izolovani polinukleotidi koji kodiraju bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija kako je ovde opisano ili njegov fragment.

Polinukleotidi opisani ovde uključuju one koji su bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama navedenim u SEQ ID NO.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 i 264, uključujući funkcionalne fragmente ili njihove varijante.

Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija mogu se izraziti kao pojedinačni polinukleotid koji kodira celokupni bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotida koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani sa polinukleotidima koji su ko-eksprimirani mogu se udružiti kroz, na primer, disulfidne veze ili druga sredstva za formiranje funkcionalnog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija. Na primer, deo lakog lanca vezujućeg dela antigena može biti kodiran odvojenim polinukleotidom od dela bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži deo teškog lanca vezujućeg dela antigena, Fc domena podjedinica i po izboru (deo) drugog vezujućeg dela antigena. Kada su ko-eksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca da bi se formiralo vezujući deo antigena. U drugom primeru, deo bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se sastoji od jedne od dve podjedinica Fc domena i po izboru (deo) jednog ili više vezujućih delova antigena, može biti kodiran zasebnim polinukleotidom iz dela bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i po izboru (deo) vezujućeg dela antigena. Kad su ko-eksprimirani, podjedinice Fc domena će se udružiti da bi formirale Fc domen.

U određenim realizacijama, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira fragment bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži prvi i drugi vezujući deo antigena, i Fc domen koji se sastoji od dve podjedinice, pri čemu je prvi vezujući deo antigena Fab molekul sa jednim lancem. U jednoj realizaciji, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira prvi vezujući deo antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid u kojem Fab molekul sa jednim lancem deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj realizaciji, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira teški lanac drugog vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde teški Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi terminala sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj realizaciji , izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira prvi vezujući deo antigena, teški lanac drugog vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid u kojem Fab molekul sa jednim lancem deli peptidnu karboksi terminalnu vezu sa teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena.

U određenim realizacijama, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira fragment bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži prvi i drugi vezujući deo antigena, i Fc domen koji se sastoji od dve podjedinice, pri čemu je prvi vezujući deo antigena prenosni Fab molekul. U jednoj realizaciji, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira teški lanac prvog vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli peptidnu vezu karboksi terminala sa konstantnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj specifičnoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli peptidnu vezu karboksi terminala sa konstantnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj realizaciji, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira teški lanac drugog vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde teški Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi terminala sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj realizaciji, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira teški lanac prvog vezujućeg dela antigena, teški lanac drugog vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim Fab lancem, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena. U još jednoj specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde teški Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena.

U daljim realizacijama, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira teški lanac trećeg vezujućeg dela antigena i podjedinicu Fc domena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde teški Fab lanac deli peptidnu vezu karboksi terminala sa podjedinicom Fc domena.

U daljim realizacijama, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira laki lanac vezujućeg dela antigena. U nekim realizacijama, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca. U drugim realizacijama, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca. U još nekim realizacijama, izolovani polinukleotid koji je ovde opisan, kodira laki lanac prvog vezujućeg dela antigena i lakog lanca drugog vezujućeg dela antigena. U specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region teškog Fab lanca deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa lakim Fab lancem. U drugoj specifičnoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde laki Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa konstantnim regionom lakog Fab lanca. U još jednoj specifičnijoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde varijabilni region lakog Fab lanca deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog Fab lanca, koji zauzvrat deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa lakim Fab lancem. U još jednoj specifičnoj realizaciji, izolovani polinukleotid kodira polipeptid gde laki Fab lanac deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog Fab lanca, koji zauzvrat deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa konstantnim regionom teškog Fab lanca.

U još jednoj realizaciji, ovo otkrće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 i 263. U još jednoj realizaciji, ovo otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija ili njegov fragment, gde polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 i 231. U još jednoj realizaciji, ovo otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 ili 264. U još jednoj realizaciji, ovo otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleotidne kiseline prikazanoj u SEQ ID NO.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 or 264. U još jednoj realizaciji, ovo otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci aminokiselina u SEQ ID NO.75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 or 263. U još jednoj realizaciji, ovo otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 or 231. Sadašnje otkriće obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu promenljivog regiona SEQ ID NO 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 ili 263 sa konzervativnim supstitucijama amino kiselina. Otkriće obuhvata i izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 ili 231 sa konzervativnim aminokiselinskim supstancama.

U određenim realizacijama, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim realizacijama, ovde opisani polinukleotid je RNK, na primer, u obliku prenosne RNK (mRNK). RNK koja je ovde otkrivena može biti jednolančana ili dvolančana.

Rekombinantne metode

Ovde otkriveni bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija se može dobiti, na primer, putem sinteze peptida čvrste supstance (npr. sinteze čvrste faze Merifilda) ili rekombinantne proizvodnje. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija (fragment), na primer, kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćinu. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednoj realizaciji se daje vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida koji su ovde prikazani. Metode koje su dobro poznate stručnjacima mogu se koristiti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija (fragmenta) zajedno sa odgovarajućim transkriptnim/translacionim kontrolnim signalima. Ovi postupci uključuju in vitro rekombinantne DNK tehnike, sintetičke tehnike i in vivo rekombinacije/genetske rekombinacije. Pogledajte, na primer, tehnike opisane u Maniatis i sar., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel i sar., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates i Wiley Interscience, N.Y (1989). Vektor ekspresije može biti deo plazmida, virusa ili može biti fragment nukleinske kiseline. Vektor ekspresije obuhvata ekspresionu kasetu u koju je polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija (fragment) (tj. region kodiranja) kloniran u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim kontrolnim elementima transkripcije ili prevođenja. Kao što se ovde koristi, „kodirajuća oblast“ je deo nukleinske kiseline koja se sastoji od kodona prevedenih u aminokiseline. Iako „kodon zaustavljanja“ (TAG, TGA ili TAA) nije preveden u aminokiselinu, može se smatrati delom regiona kodiranja ako je prisutan, ali bilo koja bočna sekvenca, na primer promoteri, mesta za vezivanje ribozoma, transkripcijski terminatori, introni, 5' i 3' neprevedeni regioni i slično, nisu deo regiona kodiranja. Dva ili više kodirajućih regiona mogu biti prisutni u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr. na jednom vektoru, ili u zasebnim polinukleotidnim konstruktima, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Osim toga, bilo koji vektor može sadržati jedinstveni region za kodiranje ili može sadržavati dva ili više regiona za kodiranje, npr. ovde opisani vektor može kodirati jedan ili više polipeptida koji su post- ili ko-translatorno odvojeni u konačnih proteina putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, ovde opisani vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu kodirati heterologne kodirajuće regione, ili fuzionisane i neutvrđene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija (fragment) koji je ovde opisan, njegovu varijantu ili derivat. Heterologni regioni kodiranja uključuju bez ograničenja specijalizovane elemente ili motive, kao što je sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operativna veza je kada je region za kodiranje za proizvod gena, npr. polipeptid, povezan sa jednim ili više regulatornih sekvenci tako da je izraz ekspresije proizvoda gena pod uticajem ili kontrolom regulatorne sekvence(a). Dva fragmenta DNK (kao što su region za kodiranje polipeptida i pridruženi promotor) su „operativno povezani“ ako indukcija promoterske funkcije dovodi do transkripcije mRNK koja kodira željeni proizvod gena i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne ometa sposobnost regulatornih sekvenci ekspresije da usmjerava ekspresiju proizvoda gena ili ometa mogućnost transkribiranja DNK šablona. Prema tome, promoterski region bi bio operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je promoter sposoban da izvrši transkripciju te nukleinske kiseline. Promoter može biti promoter specifičan za ćelije koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u unapred određenim ćelijama. Drugi elementi kontrole transkripcije, pored promotera, na primer poboljšači, operateri, represori i signali zaključivanja transkripcije, mogu se operativno povezati sa polinukleotidom za direktnu transkripciju ćelija. Pogodni promoteri i drugi regioni kontrole transkripcije su ovde prikazani. Različiti regioni kontrole transkripcije su poznati stručnjacima. Oni uključuju, bez ograničenja, regione kontrole transkripcije, koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali bez ograničenja, segmenti promotera i pojačivača iz citomegalovirusa (npr. neposredni promoter u kombinaciji sa intron-A), simian virus 40 (npr. rani promoter) i retrovirusi (kao što je npr. virus rous sarcoma). Ostali regioni kontrole transkripcije uključuju one koji se dobijaju od gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog šoka, hormon rasta goveda i jaboglobin kunića, kao i druge sekvence koje mogu kontrolisati ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije uključuju promotore i poboljšače specifične za tkivo, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilne tetracikline promotera). Slično tome, različiti elementi kontrole prevoda su poznati stručnjacima iz struke. Ovo uključuje, ali se ne ograničava na sajtove vezivanja ribozoma, inicijacije za prevođenje i završetak prevoda i elemente izvedene iz virusnih sistema (naročito unutrašnjeg mesta za unos ribozoma ili IRES, koji se takođe naziva CITE sekvencom). Kaseta za ekspresiju može uključivati i druge osobine kao što su poreklo replikacije i/ili elementi integracije hromozoma, kao što su ponavljanja retrovirusnih dugih terminala (LTR) ili adeno-pridružena virusna (AAV) ponavljanja inverznih terminala (ITR).

Obuhvaćeni regioni polinukleotida i nukleinske kiseline koji su ovde prikazani mogu biti povezani sa dodatnim regionima kodiranja koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranog sa polinukleotidom koji je ovde prikazan. Na primer, ako je potrebna sekrecija bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, DNK koja kodira signalnu sekvencu može se postaviti uzvodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan ili njegov fragment. Prema signalnoj hipotezi, proteini koje ćelija sisara luči imaju signalni peptid ili sekretornu lidersku sekvencu koja se odvaja od zrelog proteina kada se inicira rastući proteinski lanac preko grubog endoplazmatičnog retikuluma. Stručnjaci u struci su svesni da polipeptidi koje ćelija kičmenjaka luči uglavnom imaju signalni peptid fuzionisan sa N-terminusom polipeptida koji se odvaja od prevedenog polipeptida kako bi se proizvela sekretirana ili „zrela“ forma polipeptida. U određenim realizacijama, koristi se prirodni signalni peptid, npr. imunoglobulin teškog lanca ili signalni peptid lakog lanca ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost usmeravanja sekrecije polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, može se koristiti heterologni sisarski signalni peptid, ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, sekvenca lidera divlje vrste može biti supstituisana sa liderskom sekvencom aktivatora plazminogena čovekovog tkiva (TPA) ili β -glukuronidaze miša. Primeri aminokiseline i polinukleotidne sekvence sekretornih signalnih peptida date su u SEQ ID NO.154-162.

DNK koja kodira kratku proteinsku sekvencu koja bi se mogla koristiti za olakšanje kasnijeg prečišćavanja (npr. oznaka histidina) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćeija, može biti uključena unutar ili na krajevima bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćeija (fragmenta) koji kodira polinukleotid.

U daljoj realizaciji, obezbeđuje se ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više polinukleotida opisanih ovde. U određenim realizacijama je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više vektora koji su ovde prikazani. Polinukleotidi i vektori mogu inkorporirati bilo koju od osobina, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano ovde u odnosu na polinukleotide i vektore. U jednom takvom obliku, ćelija domaćin sadrži (na primer, transformisana ili transfektovana sa) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira (deo) bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde prikazan. Kako se ovde koristi, termin „ćelija domaćin“ odnosi se na bilo koju vrstu ćelijskog sistema koji se može konstruisati da bi generisao bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, koji je ovde otkriven ili njegovi fragmenti. Ćelije domaćini koje su pogodne za replikaciju i za podršku ekspresiji bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija su dobro poznate u struci. Takve ćelije mogu biti transfektovane ili transdukovane prema odgovarajućem vektoru ekspresije, a velike količine vektorskih ćelija mogu se uzgajati za semenje velikih fermentera za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za kliničke primene. Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariotske mikroorganizme, kao što su E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata ili slično. Na primer, polipeptidi mogu biti proizvedeni u bakterijama posebno kada glikozilacija nije potrebna. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora polipeptida, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do proizvodnje polipeptida sa delimičnim ili potpunim humanim glikozilacionim obrascem. Pogledajte Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li i sar., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za eksprimiranje (glikozilovanog) polipeptida, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. SAD patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih linija ćelija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana SV40 (COS-7); ljudska embriona linija bubrega (293 ili 293T ćelije kao što je opisano, npr. u Graham i sar., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelija bubrega bebe od hrčka (BHK), sertolijim ćelija miša (TM4 ćelije opisane, u Matheru, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), ćelije karcinoma ljudske materice (HELA), ćelije bubrega pasa (MDCK), ćelije jetre bizon pacova (BRL 3A), ljudske ćelije pluća (V138), ljudske ćelije jetre (Hep G2), ćelija tumora miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što je opisano npr. u Mather i sar., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije sisarskih ćelija uključuju ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mieloma kao što su YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini uključuju kultivisane ćelije, npr. kultivisane ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, ćelije bakterija i biljne ćelije, da imenujemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u životinjskoj transgeni, biljnoj transgeni ili kultivisanom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je ćelija kineskog hrčka (CHO), ćelija ljudskog embrionalnog bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija).

Standardne tehnologije su poznate u struci da eksprimiraju strane gene u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži ili teški ili laki lanac vezujućeg domena antigena kao što je antitelo, mogu biti inženjerovane tako da takođe izraze i druge lance antitela tako da je izraženi proizvod antitelo koje ima i teški i laki lanac.

U jednoj realizaciji se daje postupak stvaranja bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, kao što je ovde opisano, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, kako je ovde predviđeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija i obnavljanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija iz ćelije domaćina (ili medijuma za kultivisanje ćelija domaćina).

Komponente bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija genetski su fuzionisani jedni sa drugima. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija se može dizajnirati tako da se njegove komponente spoje direktno jedne sa drugima ili indirektno kroz linkersku sekvencu. Sastav i dužina veziva mogu se odrediti u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u struci i mogu se testirati na efikasnost. Primeri linkerskih sekvenci između različitih komponenti bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija nalaze se u sekvencama koje su ovde navedene. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da uključe mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente spajanja ako je potrebno, na primer endopeptidazna prepoznata sekvenca.

U izvesnim realizacijama, jedna ili više vezujućih delova antigena bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrže najmanje varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo i da budu izvedeni iz prirodnih ili neprirodnih antitela i njihovih fragmenata. Metode za proizvodnju poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznate u struci (pogledajte npr. Harlow i Lane, „Antibodies, a laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja sejavljaju neprirodno mogu se konstruisati korišćenjem sinteze čvrste faze-peptida, mogu se dobiti rekombinantno (npr. kako je opisano u SAD patentu br.4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, putem skrininga kombinatornih biblioteka koje sadrže varijabilne teške lance i varijabilne lake lance (pogledajte npr. SAD patent br.5,969,108 to McCafferty).

Bilo koja životinjska vrsta antitela, fragmenta antitela, domena za vezivanje antigena ili varijabilnog regiona se može koristiti u bispecifičnom molekulu koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde prikazan. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, domeni vezivanja antigena ili varijabilni regioni korisni ovde mogu biti mišjeg, primatskog ili ljudskog porekla. Ako je bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija namenjen za ljudsku upotrebu, može se koristiti himerni oblik antitela gde su konstantni regioni antitela od čoveka. Humanizovani ili potpuno ljudski oblik antitela se takođe može pripremiti u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u struci (pogledajte npr. SAD patent br. 5,565,332 to Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama koje obuhvataju, ali se ne ograničavaju na: (a) graftovanje nehumanih (npr. donatorsko antitelo) CDR-a na okvir humanih (npr. primaoca antitela) konstantnih regiona sa ili bez zadržavanja kritičnih okvira ostataka (npr. koji su važni za zadržavanje dobrog afiniteta vezivanja antigena ili funkcija antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili a-CDR, ostaci kritični za interakciju antitela i antigena) na okvir humanih konstatntih regiona, ili (c) presađivanje čitavih nehumanih varijabilnih domena, ali „pokrivajući“ ih sa sličnim humanim delom, zamenom površinskih ostataka. Pregledana su humanizirana antitela i metode njihove izrade, npr. u Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann i sar., Nature 332, 323-329 (1988); Queen i sar., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); SAD patent br.5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Jones i sar., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison i sar., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen i sar., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri i sar., Methods 36, 25-34 (2005) (opisivanje SDR (a-CDR) graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opisivanje „obnavljanja površine“); Dall’Acqua i sar., Methods 36, 43-60 (2005) (opisivanje „FR mešanja“); i Osbourn i sar., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka i sar., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opisivanje pristup „vođenog izbora“ FR mešanju). Ljudska antitela i ljudski varijabilni regioni mogu se proizvoditi koristeći različite tehnike poznate u struci. Ljudska antitela se generalno opisuju u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo i budu izvedeni iz ljudskih monoklonskih antitela napravljenih metodom hibridoma (pogledajte npr. Tehnike proizvodnje i primene monoklonalnih antitela, str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Ljudska antitela i ljudski varijabilni regioni takođe se mogu pripremiti davanjem imunogena transgenskoj životinji koja je modifikovana da bi proizvela netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenske izazove (pogledajte npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005) Ljudska antitela i ljudski varijabilni regioni takođe mogu biti generisani izolovanjem Fv klona varijabilnih regijskih sekvenci izabranih iz biblioteka za prikazivanje faga zasnovanih na ljudima (pogledajte npr. Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien i sar., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i McCafferty i sar., Nature 348, 552-554; Clackson i sar., Nature 352, 624-628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, ili kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata, ili kao Fab fragmenata.

U određenim realizacijama, vezujući delovi antitela su angažovana da imaju poboljšan afinitet vezivanja prema, na primer, postupcima koji su objavljeni u SAD patentu br. Appl. Publ. Br. 2004/0132066. Sposobnost otkrivenog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija da se veže na specifičnu antigensku determinantu može se izmeriti ili pomoću enzimskog vezivanja imunosorbentnog testa (ELISA) ili pomoću drugih tehnika poznatih u struci, npr. površinska plazmonska rezonantna tehnika (analizirana u sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, i sar., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnih testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Testiranje takmičenja se može koristiti za identifikaciju antitela, fragmenta antitela, domena vezivanja antigena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom za vezivanje na određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 za vezivanje na CD3. U određenim realizacijama, takvo konkurentno antitelo se vezuje za isti epitop (na primer, linearni ili konformacioni epitop) koji je povezan sa referentnim antitelom. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) „Epitope Mapping Protocols“, u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primernom takmičenju, imobilizovani antigen (npr. CD3) se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo koje se vezuje za antigen (npr. V9 antitelo) i drugo neoznačeno antitelo koje se testira zbog njegove sposobnosti da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje na antigen. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima dozvoljenim za vezivanje prvog antitela na antigen, uklanja se višak nevezanog antitela, a količina etikete povezane sa imobilizovanim antigenom se meri. Ako je količinaetikete povezane sa imobilizovanim antigenom znatno smanjena u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje na to da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje na antigen. Pogledajte Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Bispecifične molekule koje vezuju antigen za aktiviranje T ćelija pripremljene kao što je ovde opisano, mogu se prečišćavati tehnikom poznatom u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, hromatografija za jonsku izmenu, elektroforeza gela, afinitetna hromatografija, hromatografija za isključivanje veličine i slično. Stvarni uslovi koji se koriste za prečišćavanje određenog proteina će delom zavisiti od faktora kao što su neto naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće očigledni onima koji su stručni u struci. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom može se koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen na koji se vezuje bispecifični molekuli koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija. Na primer, za afinitetno hromatografsko prečiščavanje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani, može se koristiti matrica sa proteinima A ili protein G. Sekvencijalni protein A ili G afinitetne hromatografije i hromatografija za isključivanje veličine mogu se koristiti za izolaciju bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u suštini kao što je opisano u primerima. Čistoća bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija može se odrediti bilo kojom od različitih poznatih analitičkih postupaka uključujući elektroforezu gela, tečnu hromatografiju visokog pritiska i slično. Na primer, fuzioni proteini teškog lanca su se pokazali da su izraženi kao što je opisano u primerima, netaknuti i pravilno sastavljeni, kao što je pokazano smanjenjem SDS-STRANICE (pogledajte npr. sliku 2). Tri grupe se rešavaju na otprilike Mr 25.000, Mr 50.000 i Mr 75.000, što odgovara predviđenim molekulskim težinama lakog lanca bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, teškog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/lakog lanca.

Testovi

Bispecifične molekule koje vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koje su navedene ovde, mogu biti identifikovane, prikazane ili karakterizovane za njihove fizičke/hemijske osobine i/ili biološke aktivnosti različitim analizama poznatim u struci.

Testovi afiniteta

Afinitet bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za Fc receptor ili ciljani antigen može se odrediti u skladu sa metodima navedenim u primerima, površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE zdravstvena zaštita) i receptore ili ciljane proteine kao što je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za različite receptore ili ciljane antigene mogu se proceniti pomoću ćelijskih linija koje izražavaju određeni receptor ili ciljani antigen, na primer putem protočne citometrije (FACS). Specifična ilustrativna i primerna izvedba za merenje afiniteta vezivanja opisana je u daljem tekstu i u primerima u nastavku.

Prema jednoj realizaciji, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE zdravstvena zaštita) na 25 °C.

Da bi se analizirala interakcija između Fc-dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc-receptor je zarobljen anti-Penta His antitelom (Qiagen) imobilizovanim na CM5 čipovima i koriste se bispecifični konstrukti kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi od karboksimetilovanog dekstrana (CM5, GE zdravstvena zaštita) aktivirani su pomoću N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu proizvođača. Anti Penta-His antitelo je razblaženo sa 10 mM natrijum acetata, pH 5,0, do 40 µg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minut, da se dobije oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, injektovano je 1 M etanolamina da bi se blokirale neizreagovale grupe. Nakon toga, Fc-receptor se uzima za 60 s na 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (opseg od 500 nM do 4000 nM) se injektiraju u HBS-EP (GE zdravstvena zaštita, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% površinski aktivno P20, pH 7,4) na 25 °C pri protoku od 30 µl/min za 120 s.

Da bi se utvrdio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti se uzimaju antihumanim Fab specifičnim antitelom (GE zdravstvena zaštita) koje je imobilisano na aktiviranoj CM5-senzorskoj površini čipa, kako je opisano za anti Penta-His antitelo. Konačna količina vezanih proteina je oko 12000 RU. Bispecifični konstrukti se uzimaju za 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni prolaze kroz ćelije protoka za 180 s u opsegu koncentracija od 250 do 1000 nM sa protokom od 30 µl/min. Disocijacija se prati na 180 s.

Razlike u refrakcionom indeksu su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Reakcija stabilnog stanja korišćena je za izvođenje konstante disociacije KDpomoću nelinearne krive vezivanja Langmuirove vezivne izoterme. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® softver za procenu verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnotežne disocijacije (KD) izračunava se kao odnos koff/kon. Pogledajte, npr. Chen i sar., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Testovi aktivnosti

Biološka aktivnost bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani može se meriti različitim testovima kao što je opisano u primerima. Biološke aktivnosti mogu, na primer, uključivati indukciju proliferacije T ćelija, indukciju signala u T ćelijama, indukciju ekspresije markera aktivacije u T ćelijama, indukciju sekretiranja citokina od T ćelija, indukciju lizi ciljnih ćelija, kao kod tumorskih ćelija, i indukciju tumorske regresije i/ili poboljšanja preživljavanja.

Kompozicije, formulacije i načini primene

U daljem aspektu, ovde su navedeni farmaceutski preparati koji sadrže bilo koju od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde navedeni, npr. za upotrebu u bilo kojoj od dole navedenih terapeutskih postupaka. U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde navedeni i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugoj realizaciji, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde navedeni i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo, npr. kako je opisano u nastavku.

Dalje je dat postupak za proizvodnju bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan u obliku pogodnim za in vivo primenu, postupak koji sadrži (a) dobijanje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija kao što je ovde otkriveno, i (b) formuliranje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu se formulira preparat za aktiviranje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija za in vivo administraciju.

Farmaceutski preparati opisani ovde sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izrazi „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivi“ odnose se na molekularne entitete i sastojke koji su generalno netoksični za primaoce u primijenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne proizvode negativnu, alergičnu ili drugu neugodnu reakciju kada se daju životinjama, kao što je, na primer, čovek. Priprema farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija i po izboru, dodatni aktivni sastojak biće poznat stručnjacima u struci u svetlu sadašnjeg otkrića, kao što je prikazano u Remingtonovoj farmaceutskoj nauci, 18. izd. Štamparija „Mack“, 1990. Štaviše, za životinjsku (npr. ljudsku) administraciju, podrazumeva se da preparati treba da zadovoljavaju sterilnost, pirogenost, opšte standarde sigurnosti i čistoće, kako to zahteva FDA zavod za biološke standarde ili odgovarajuća vlast u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizirane formulacije ili vodeni rastvori. Kao što se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidante, konzervanse (npr. antibakterijska sredstva, antifungalne agense), izotonična sredstva, sredstva za odlaganje apsorpcije, soli, konzervansi, antioksidanti, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijente, agense za dezintegraciju, sredstva za podmazivanje, sredstva za aromatizaciju, boje, materijali kao i njihova kombinacija, kao što bi bilo poznato stručnjaku (pogledajte na primer, Remingtonovu farmaceutsku nauku, 18. izd. Štamparija „Mack“, 1990, pp. 1289-1329). Osim u slučaju da neki konvencionalni nosač nije kompatibilan sa aktivnim sastojkom, razmatra se njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim preparatima.

Sastav može sadržati različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li se ona primenjuje u čvrstom, tečnom ili aerosolnom obliku i da li je potrebno da bude sterilan za ovakve načine primene kao injekcije. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde opisani (i bilo koji dodatni terapeutski agens) mogu biti administrirani intravenozno, intradermalno, intraarterijsko, intraperitonealno, intralezionalno, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intrasplenično, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intrareteralno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, subkutano, subkonjunktivno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilično, intraokularno, oralno, lokalno, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacijom aerosola), injektiranjem, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, kateterom, putem lavaže, u kremama, u lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugom metodom ili bilo kojom kombinacijom, kao što bi bilo poznato stručnjaku u struci (pogledajte na primer, Remingtonovu farmaceutsku nauku, 18. izd. Štamparija „Mack“) Parenteralna primjena, posebno intravenozna injekcija, se najčešće koristi za davanje molekula polipeptida kao što su ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija.

Parenteralne kompozicije uključuju one dizajnirane za davanje injekcijom, npr. subkutana, intradermalna, intralezijska, intravenozna, intraarterijalna intramuskularna, intratekalna ili intraperitonealna injekcija. Za ubrizgavanje, ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija mogu se formulisati u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Hanksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može sadržati formulatorna sredstva kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija mogu biti u obliku praha za sastavljanje sa odgovarajućim sredstvom, na primer, sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe. Sterilni injektabilni rastvori su pripremljeni inkorporiranjem bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde opisani u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim sastojcima navedenim u nastavku, prema potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Generalno, disperzije se pripremaju uvođenjem različitih sterilizovanih aktivnih sastojaka u sterilno sredstvo koje sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili ostale sastojke. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, suspenzija ili emulzije, poželjne metode pripreme su tehnike vakuumskog sušenja ili zamrzavanja, koje prave aktivni sastojak plus dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilnog-filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum je potrebno puferirati na odgovarajući način, a razblaživač tečnosti prvo treba pretvoriti u izotoničnu pre injekcije sa dovoljnim fiziološkim rastvorom ili glukozom. Sastav mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i zaštičen od kontaminacije mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Biće prihvaćeno da kontaminaciju endotoksina treba održavati na minimalnom bezbednom nivou, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što su fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran ili slično. Po izboru, suspenzija može takođe sadržati pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja kako bi se omogućilo pripremanje visoko koncentrovanih rastvora. Osim toga, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu se pripremiti kao odgovarajuće suspenzije za ubrizgavanje ulja. Pogodni lipofilni rastvarači ili vozila uključuju masna ulja kao što su susamovo ulje ili estri sintetske masne kiseline, kao što su etil klapati ili trigliceridi ili lipozomi.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remingtonovoj farmaceutskoj nauci (18. izd. Štamparija „Mack“, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnim realizacijama, produžena apsorpcija sastojka koji se injektira može se dovesti upotrebom u kompozicijama sredstava koji odlažu apsorpciju, kao što su, na primer, monostearat aluminij, želatin ili njihove kombinacije.

Pored prethodno opisanih kompozicija, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija takođe mogu biti formulisani kao priprema depoa. Takve dugotrajne formulacije mogu se davati implantacijom (na primer, subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija mogu se formulisati odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkom smolom, ili kao oskudno rastvorljivi derivati, na primer, kao umereno rastvorljiva so.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifične molekule koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija mogu biti proizvedene pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, enkapsulacije, zarobljavanja ili liofilizacije. Farmaceutske kompozicije mogu se formulisati na konvencionalan način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenata ili pomoćnih sredstava koji olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija mogu se formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, neutralno ili kao so. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje u značajnoj meri zadržavaju biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. Ovo uključuje kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline ili takve organske kiseline kao št je sirćetna, oksalna, tartarna ili mandelinska kiselina. So formirana sa slobodnim karboksilnim grupama takođe može biti izvedena iz neorganskih baza kao što su npr. natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili željezov hidroksid; ili takve organske baze kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli imaju tendenciju da budu rastvorljivijie u vodenim i drugim protičnim rastvaračima nego odgovarajući oblici slobodne baze.

Terapeutske metode i kompozicije

Bilo koji od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde navedeni, mogu se koristiti u terapeutskim postupcima. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija, kao što je ovde otkriveno, mogu se koristiti kao imunoterapijska sredstva, na primer u lečenju kancera.

Za upotrebu u terapeutskim postupcima, ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija biće formulisani, dozirani i administrirani na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koje u ovom kontekstu treba razmotriti uključuju konkretan poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima.

U jednom aspektu, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija kao što je ovde opsiano za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim realizacijama, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija kao što je ovde otkriveno za upotrebu u postupku lečenja. U jednoj realizaciji, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija, kako je ovde opisano, obezbeđuju se za primenu u lečenju bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno. U određenim realizacijama obezbeđen je bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest koji obuhvata davanje pojedinačne terapeutski efikasne količine bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija. U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj. U određenoj realizaciji, bolest je rak. U određenim realizacijama, postupak dalje obuhvata davanje pojedinačne terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr. sredstva protiv kancera ako je bolest koja se leči rak. U daljim realizacijama, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija, kako je ovde opisano, obezbeđuju se za indukovanje lizi ciljne ćelije, naročito tumorske ćelije. U određenim realizacijama, obezbeđen je bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija za upotrebu u postupku indukovanja lizi ciljne ćelije, naročito tumorske ćelije, pojedinačno obuhvatajući davanje pojedincu efektivnu količinu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji indukuje lizu ciljne ćelije. „Pojedinac“ prema svakom od iznad navedenih realizacija je sisar, poželjno čovek.

U sledećem aspektu, ovde predviđeno je korišćenje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde opisan u proizvodnji ili pripremi leka. U jednoj realizaciji, lek je za lečenje bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku za lečenje bolesti koji uključuje davanje pojedincu, koji ima bolest, terapeutski efikasnu količinu leka. U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj. U određenoj realizaciji, bolest je rak. U jednoj realizaciji, postupak dalje obuhvata davanje pojedinačne terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr. sredstva protiv kancera ako je bolest koja se leči rak. U daljoj realizaciji, lek je za indukovanje lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. U još jednoj realizaciji, lek je namenjen upotrebi u postupku indukovanja lize ciljne ćelije, naročito tumorske ćelije, koja pojedinačno obuhvata davanje pojedincu efektivnu količinu leka da indukuje lizu ciljne ćelije. „Pojedinac“ prema bilo kom od iznad navedenih realizacija je sisar, poželjno čovek.

U sledećem aspektu, predviđen je postupak za lečenje bolesti. U jednoj realizaciji, postupak obuhvata davanje terapeutski efikasnu količinu bispecifičnog molekula koji vezuje antitelo za aktiviranje T ćelija, kao što je ovde otkriveno, pojedincu koji ima takvu bolest. U jednoj realizaciji, kompozicija koja sadrži bispecifični molekul koji vezuje antitelo za aktiviranje T ćelija, se daje pomenutom pojedincu u farmaceutski prihvatljivoj formi. U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj. U određenoj realizaciji, bolest je rak. U određenim realizacijama, postupak dalje obuhvata davanje pojedinačne terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr. sredstva protiv kancera ako je bolest koja se leči rak. „Pojedinac“ prema bilo kom od iznad navedenih realizacija je sisar, poželjno čovek.

U sledećem aspektu, ovde je naveden postupak za indukovanje lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. U jednoj realizaciji, postupak obuhvata kontaktiranje ciljne ćelije sa bispecifičnim molekulom koji vezuje antitelo za aktiviranje T ćelija kako je ovde otkriveno, u prisustvu T ćelije, posebno citotoksične T ćelije. U daljem aspektu, obezbeđuje se postupak indukovanja lize ciljane ćelije, posebno tumorske ćelije kod pojedinca. U jednoj ovakvoj realizaciji, postupak obuhvata davanje pojedincu efektivnu količinu bispecifičnog molekula koji vezuje antitelo za aktiviranje T ćelija kako bi se indukovala liza ciljane ćelije. U jednoj realizaciji, „pojedinac“ je čovek.

U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj, naročito rak. Neograničavajući primeri raka uključuju rak bešike, rak mozga, rak glave i vrata, rak pankreasa, rak pluća, rak dojke, rak jajnika, rak materice, rak grlića materice, rak endometrijuma, rak jednjaka, rak debelog creva, kolorektalni rak, rak rektuma, rak želuca, rak prostate, rak krvi, rak kože, rak skvamoznih ćelija, rak kostiju i rak bubrega. Ostali poremećaji proliferacije čelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnog molekula koji vezuje antitelo za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva, ali se ne ograničavaju na neoplazme locirane u: abdomenu, kostima, dojki, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (nadbubrežnim, paratiroidnim, hipofizi, testisima, jajnicima, timusu, štitnoj žlezdi), oku, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, torakalnoj regiji i urogenitalnom sistemu. Uključeni su i pre-kancerozni uslovi ili lezije i metastaze raka. U određenim realizacijama, kancer se bira iz grupe koju čine rak bubrežnih ćelija, rak kože, rak pluća, kolorektalni rak, rak dojke, rak mozga, rak glave i vrata. Vešti poznavalac lako prepoznaje da u mnogim slučajevima bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija ne može izlečiti, ali može imati delimičnu korist. U nekim realizacijama, fiziološka promena koja ima neku korist takođe se smatra terapeutski korisnom. Prema tome, u nekim realizacijama, količina bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji pruža fiziološku promenu smatra se „efikasnom količinom“ ili „terapeutski efektivnom količinom“. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome je potrebno lečenje je obično sisar, konkretnije čovek.

U nekim realizacijama, efikasna količina aktivnog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva, se daje u ćeliju. U drugim realizacijama, terapeutski efikasna količina bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji se ovde otkriva, daje se pojedincu za lečenje bolesti.

Za sprečavanje ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji je ovde otkriven (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih sredstava) zavisiće od vrste bolesti koja će se tretirati, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, u prethodnim ili istovremenim terapeutskim intervencijama, kliničke istorije pacijenta i reakcija na bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija i diskrecije lekara koji prisustvuje. Stručnjak koji je odgovoran za administraciju će u svakom slučaju odrediti koncentraciju aktivnih sastojaka u sastavu i odgovarajuću dozu(e) za pojedinačni subjekt. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija se adekvatno daje pacijentu jednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg – 10 mg/kg) bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija može biti početna kandidatna doza za davanje pacijentu, tokom jedne ili više zasebnih administracija, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedna primerna doza bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija bi bila u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim neograničavajućim primerima, doza može takođe da sadrži od oko 1 mikrogram/kg telesne težine, oko 5 mikrograma/kg telesne težine, oko 10 mikrograma/kg telesne težine, oko 50 mikrograma/kg telesne težine, oko 100 mikrograma/kg oko 200 mikrograma/kg telesne težine, oko 500 mikrograma/kg telesne težine, oko 1 miligram/kg telesne težine, oko 5 miligrama/kg telesne težine, oko 10 miligrama/kg telesne težine, oko 50 miligrama/kg telesne težine, oko 100 miligrama/kg telesne težine, oko 200 miligrama/kg telesne težine, oko 350 miligrama/kg telesne težine, oko 500 miligrama/kg telesne težine, do oko 1000 mg/kg telesne težine ili više po administraciji i bilo koji opseg koji se može izvesti na njoj. U neograničavajućim primerima opsega koji se može izvesti iz brojeva koji su ovde navedeni, opseg od oko 5 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 5 mikrograma/kg telesne težine do oko 500 miligrama/kg telesne težine, itd. može se primenjivati, na osnovu gore navedenih brojeva. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent prima od oko dva do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija, koji su ovde otkriveni, generalno se koriste u količini koja je efikasna za postizanje namene. Za upotrebu za lečenje ili prevenciju stanja bolesti, bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani, ili njihove farmaceutske kompozicije, se administriraju ili primenjuju u terapeutski efikasnoj količini. Određivanje terapeutski efikasne količine je u okviru sposobnosti stručnjaka u struci, posebno u svetlu detaljnog otkrivanja koje je ovde obezbeđeno.

Za sistemsku primenu, terapeutski efikasna doza se na početku može proceniti in vitro testovima, kao što su testovi ćelijske kultivacije. Tada se doza može formulisati u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg kruženja koncentracije koji uključuje IC50kao što je određeno u ćelijskoj kultivaciji. Takve informacije mogu se koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi.

Početne doze se takođe mogu proceniti iz in vivo podataka, npr. životinjskih modela, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Onaj ko je stručan u struci može lako da optimizuje administraciju ljudima na osnovu podataka o životinjama.

Količina doziranja i interval se mogu individualno prilagođavati kako bi se obezbedili nivoi plazme bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su dovoljni da održe terapeutski efekat. Uobičajene doze pacijenta za davanje injekcijom se kreću od oko 0,1 do 50 mg/kg/dan, obično od oko 0,5 do 1 mg/kg/dan. Terapeutski efikasni nivoi plazme se mogu postići davanjem višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, pomoću HPLC-a.

U slučajevima lokalne administracije ili selektivnog uzimanja, efektivna lokalna koncentracija bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija ne sme biti povezana sa koncentracijom u plazmi. Onaj ko je stručan u struci moći će da optimizuje terapeutski efikasne lokalne doze bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Terapeutski efikasna doza bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija opisanih ovde će generalno obezbediti terapeutsku korist bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija se mogu odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama. Analize ćelijske kulture i studije na životinjama mogu se koristiti za određivanje LD50(doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efikasna za 50%). Odnos doza između toksičnih i terapijskih efekata je terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednoj realizaciji, ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija pokazuju visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz analiza ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se koristiti u formulisanju različitih doziranja pogodnih za upotrebu kod ljudi. Doziranje je poželjno unutar opsega cirkulirajućih koncentracija koje uključuju ED50sa malo ili bez toksičnosti Doziranje se može razlikovati unutar ovog opsega u zavisnosti od različitih faktora, npr. korišćenog doziranog oblika, korišćenog načina administracije, stanja subjekta i slično. Tačnu formulaciju, način primene i doziranje može izabrati pojedinačni lekar s obzirom na stanje pacijenta (pogledajte npr. Fingl i sar., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p.1).

Lekar koji prisustvuje tretiranju pacijenata bispecifičnim molekulima koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde otkriveni, bi trebalo da zna kako i kada završiti, prekinuti ili prilagoditi primenu zbog toksičnosti, disfunkcije organa i slično. Nasuprot tome, lekar koji prisustvuje tome takođe bi trebao da zna da prilagodi tretman na višim nivoima ako klinički odgovor nije adekvatan (što isključuje toksičnost). Veličina administrirane doze u upravljanju poremećaja od interesa će se razlikovati od težine stanja koje treba tretirati, načina primene i slično. Ozbiljnost stanja može, na primer, biti procenjena, delimično, standardnim metodama prognostičke procene. Nadalje, doza i možda frekvencija doze takođe će se razlikovati u zavisnosti od starosti, telesne težine i reakcije individualnog pacijenta.

Ostali agensi i tretmani

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija opisani ovde mogu se davati u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava u terapiji. Na primer, ovde opisani bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija može se primeniti zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim agensom. Termin „terapeutski agens“ obuhvata bilo koji agens koji se daje za lečenje simptoma ili oboljenja kod pojedinca koji zahteva takav tretman. Takvo dodatno terapeutsko sredstvo može sadržati bilo koji aktivni sastojak pogodan za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno onima sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču jedni na druge negativno. U određenim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je imunomodulatorni agens, citostatički agens, inhibitor adhezije ćelija, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava osetljivost ćelija apoptotskim induktorima. U konkretnoj realizaciji, dodatni terapeutski agens je sredstvo protiv karcinoma, na primer poremećaja mikrotubule, antimetabolita, inhibitora topoizomeraze, DNK interkalatora, sredstva alkilovanja, hormonske terapije, inhibitora kinaze, antagonista receptora, aktivatora tumorske ćelijske apoptoze ili antiangiogenog agensa.

Takvi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, vrste poremećaja ili tretmana i drugih faktora koji su gore opisani. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija obično se koriste u istim dozama i sa načinima za administriranje kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doza opisanih ovde ili u bilo kojoj dozi i bilo kom načinu administracije koji su empirijski/klinički određeni da bude odgovarajući.

Ovakve kombinovane terapije koje su gore navedene obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu ili odvojenu kompoziciju) i odvojeno primanje, u kom slučaju, primena bispecifičnog molekula koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija otkrivenog ovde može se pojaviti pre, istovremeno i/ili nakon primena dodatnog terapeutskog sredstva i/ili adjuvanta. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen za aktiviranje T ćelija koji su ovde prikazani mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa terapijom zračenjem.

Proizvodi izrade

U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod izrade koji sadrži materijale korisne za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor, ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u sastavu je bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija, kao što je ovde otkriveno. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Osim toga, proizvod izrade može da sadrži (a) prvi kontejner sa sadržajem u njemu, pri čemu sastav sadrži bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija kako je ovde otkriveno; i (b) drugi kontejner sa sadržajem u njemu, pri čemu kompozicija sadrži dalje citotoksično ili na drugi način terapeutsko sredstvo. Proizvod izrade u ovoj realizaciji može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Primeri

Ovde su opisani i sledeći primeri postupaka i kompozicija. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opisa koje su gore dati.

Opšti postupci

Rekombinantne DNK tehnike

Standardni postupci su korišćeni za manipulaciju DNK kako je opisano u Sambrook i sar., Molecular cloning: Laboratorijski priručnik; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molekularni biološki reagensi su korišćeni prema uputstvima proizvođača. Opšte informacije o nukleotidnim sekvencama lakog i teškog lanca humanih imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. i sar., (1991) Sekvence proteina imunološkog interesa, 5. izd., NIH publikacija br.91-3242.

DNK sekvenciranje

DNK sekvence su određene dvostrukim sekvenciranjem.

Sinteza gena

Željeni segmenti gena, gde se to zahteva, su ili generisani pomoću PCR-a koristeći odgovarajuće šablone ili su sintetizovani od strane Geneart AG (Regensburg, Nemačka) od sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda automatizovanom sintezom gena. U slučajevima kada nije dostupna nijedna tačna genska sekvenca, oligonukleotidni prajmeri su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa, a geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koji potiču iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena koji su bili obeleženi jedinstvenim mestima cepanja za ograničavanje endonukleaze klonirani su u standardne vektore za kloniranje/sekvenciranje. Plazmidna DNK je prečišćena od transformisanih bakterija i koncentracija određena UV-spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranih genskih fragmenata potvrđena je sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa odgovarajućim mestima restrikcije kako bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće vektore ekspresije. Svi konstruktori su dizajnirani sa 5'-krajnjom DNK sekvencom koja kodira glavni peptid koji cilja proteine za sekreciju u eukariotskim ćelijama. SEQ ID NO.154-162 daju primerne glavne peptide i polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju.

Izolacija primarnih ljudskih pan T ćelija iz PBMC-ova

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene centrifugiranjem pomoću gradijenta gustine Histopaque iz obogaćenih preparata limfocita (buffy coats) dobijenih iz lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi od zdravih ljudskih donora. Ukratko, krv je razblažena sterilnim PBS-om i pažljivo slojevana preko Histopaque gradienta (Sigma, H8889). Posle centrifugiranja 30 minuta na 450 x g na sobnoj temperaturi (isključena kočnica), deo plazme iznad PBMC-a koji sadrži interfazu je odbačen. PBMC-i su premešteni u nove Falcon cevi od 50 ml, a cevi su ispunjene PBS-om do ukupne zapremine od 50 ml. Smeša je centrifugirana na sobnoj temperaturi 10 minuta na 400 x g (uključena kočnica). Supernatant je odbačen i PBMC pelet je ispran dva puta sa sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja na 4 °C tokom 10 minuta na 350 x g). Dobijena PBMC populacija se automatski prebrojava (ViCell) i skladišti u medijumu RPMI1640, koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru sve dok se test ne pokrene.

Obogaćivanje T ćelija iz PBMC-a obavljeno je pomoću kompleta za izolaciju pan T Cell II (Miltenyi Biotec # 130-091-156), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelijske pelete su razblažene u 40 µl hladnog pufera na 10 miliona ćelija (PBS sa 0,5% BSA, 2 mM EDTA, sterilisani i filtrirani) i inkubirani sa 10 µl koktelom biotin-antitela na 10 miliona ćelija tokom 10 min na 4 °C. Dodato je 30 µl hladnog pufera i 20 µl anti-biotinskih magnetnih zrna na 10 miliona ćelija, a smeša je inkubirana još 15 min na 4 °C. Ćelije su isprane dodavanjem 10-20x trenutne zapremine i naknadnog koraka centrifugiranja na 300 x g tokom 10 min. Do 100 miliona ćelija je ponovo resuspendirano u 500 µl pufera. Magnetno izdvajanje neoznačenih ljudskih pan T ćelija obavljeno je korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec # 130-042-401) prema uputstvima proizvođača. Rezultirajuća populacija T ćelija automatski je prebrojana (ViCell) i uskladištena u AIM-V medijumu na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru do početka testiranja (ne duže od 24 h).

Izolacija primarnih ljudskih naivnih T ćelija iz PBMC-a

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene centrifugiranjem pomoću gradijenta gustine Histopaque iz obogaćenih preparata limfocita (buffy coats) dobijenih iz lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi od zdravih ljudskih donora. Obogaćivanje T-ćelija iz PBMC-a obavljeno je korišćenjem opreme za izolaciju naivne CD8<+>T ćelije (Miltenyi Biotec # 130-093-244), u skladu sa uputstvima proizvođača, ali preskakanjem poslednjeg koraka izolacije CD8<+>T ćelija (takođe pogledajte opis za izolaciju primarnih ljudskih pan T ćelija).

Izolacija mišjih T ćelija od splenocita

Slezine su izolovani iz C57BL/6 miševa, prebačeni u GentleMACS C-epruvetu (Myltenii Biotech # 130-093-237) koja sadrži MACS pufer (PBS 0,5% BSA 2 mM EDTA) i disocirani su sa GentleMACS disociatorom kako bi dobili ćelijske suspenzije u skladu sa uputstvima proizvođača. Suspenzija ćelije je propuštena kroz filter pre separacije kako bi se uklonile preostale nerazdružene čestice tkiva. Posle centrifugiranja na 400 x g tokom 4 min na 4 °C, ACK pufer za lizu je dodat u lize crvenih krvnih ćelija (inkubacija od 5 min. na sobnoj temperaturi). Preostale ćelije su dva puta isprane MACS puferom, prebrojane i iskorišćene za izolaciju mišijih pan T ćelija. Negativan (magnetni) izbor izvršen je pomoću opreme za izolaciju pan T ćelija koju proizvodi kompanija „Miltenyi Biotec“ (# 130-090-861), slijedeći uputstva proizvođača. Rezultirajuća populacija T ćelija je automatski prebrojana (ViCell) i odmah se koristi za dalje testove.

Izolacija primarnih cinomolgus PBMC-ova iz heparinizovane krvi

Mononulkearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene centrifugiranjem gustine iz sveže krvi od donatora zdravih cinomolgusa, i to: Heparizovana krv je razblažena 1:3 sa sterilnim PBS-om, a limfoprep medijum (Axon Lab # 1114545) je razređen do 90% sa sterilnim PBS-om. Dve količine razblažene krvi su slojevane preko jedne zapremine gradijenta razređene gustine, a PBMC frakcija je odvojena centrifugiranjem 30 min na 520 x g, bez pauze, na sobnoj temperaturi. PBMC opseg je prebačen u svežu Falcon tubu od 50 ml i ispran sterilnim PBS centrifugiranjem tokom 10 min na 400 x g na 4 °C. Jednostavno centrifugiranje sa niskim brzinama izvršeno je da se uklone trombociti (15 min na 150 c g, 4 °C), a rezultujuća PBMC populacija je automatski prebrojena (ViCell) i odmah se koristi za dalje testove.

Ciljne ćelije

Za procenu bispecifičnih molekula za vezivanje antigena za MCSP ciljane su sledeće linije tumorskih ćelija: ćelijska linija ljudskog melanoma WM266-4 (ATCC # CRL-1676), izvedena iz metastatskog mesta malignog melanoma i izražava visok nivo ljudskog MCSP-a; i ljudsku ćelijsku liniju melanoma MV-3 (poklon od medicinskog centra „Radboud University Nijmegen“), izražavajući srednje nivoe ljudskog MCSP-a.

Za procenu bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji ciljaju CEA korišćene su sledeće linije tumorskih ćelija: ljudska ćelijska linija raka želuca MKN45 (DSMZ # ACC 409), izražavajući veoma visoke nivoe CEA; ljudska ćelijska linija debelog creva bele žene sa adenokarcinomom LS-174T (ECACC # 87060401), izražavajući srednje i niske nivoe ljudskog CEA; ljudska ćelijska linija raka epitelioidnog pankreasa Panc-1 (ATCC # CRL-1469), izražavajući (vrlo) niske nivoe ljudskog CEA; i ćelijska linija karcinoma debelog creva miševa MC38-huCEA, koja je bila inženjerovana tokom postupka kako bi se stabilno izražavao ljudski CEA.

Pored toga, ćelijska linija ljudskih T ćelija, Jurkat (ATCC # TIB-152), korišćena je za procenu vezivanja različitih bispecifičnih konstrukta na ljudski CD3 na ćelijama.

Primer 1

Priprema, prečišćavanje i karakterizacija bispecifičnih molekula koji vezuju antigen Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca bile su subklonirane u okviru sa konstantnim teškim lancem ili konstantnim lakim lancem koji je prethodno ubačen u odgovarajući vektor sisara primaoca. Izražavanje antitela vodio je MPSV promoter, a sintetička polyA signalna sekvenca se nalazi na 3' kraju CDS-a. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekuli su proizvedeni ko-transfektovanjem HEK293 EBNA ćelija sa vektorima ekspresije sisara. Izuzetno rastuće HEK293 EBNA ćelije transfektovane su pomoću postupka kalcijum fosfata. Alternativno, HEK293 EBNA ćelije rastu u suspenziji gde su transfektovane koristeći polietilenimin (PEI). Za pripremu „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom/obrnuto sa jednom rukom“ konstrukata, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1 („vektor teškog lanca“: „vektor lakog lanca“: „vektor teškog lanca-scFab“). Za pripremu „2+1 IgG scFab“ konstrukata, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1 („vektor teškog lanca“: „vektor lakog lanca“: „vektor teškog lanca-scFab“). Za pripremu „1+1 IgG Crossfab“ konstrukta, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 („drugi vektor teškog lanca“: „prvi vektor lakog lanca“: „vektor lakog lanca Crossfab“: „prvi vektor teškog lanca-Crossfab teškog lanca“). Za pripremu „2+1 IgG Crossfab“ konstrukta, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 („drugi vektor teškog lanca“: „vektor lakog lanca“: „prvi vektor teškog lanca-Crossfab teškog lanca“: „vektor lakog lanca Crossfab“. Za pripremu „2+1 IgG Crossfab, spojeni laki lanac“ konstrukta, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 („vektor teškog lanca“: „vektor lakog lanca“: „vektor teškog lanca (CrossFab-Fab-Fc)“: „vektor spojenog lakog lanca“). Za pripremu „1+1 CrossMab“ konstrukta, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 („prvi vektor teškog lanca“: „drugi vektor teškog lanca“: „prvi vektor lakog lanca“: „drugi vektor lakog lanca“). Za pripremu „1+1 IgG Crossfab, spajanje lakog lanca“ konstrukta, ćelije su transfektovane sa odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 („prvi vektor teškog lanca“: „drugi vektor teškog lanca“: „vektor lakog lanca Crossfab“: „drugi vektor lakog lanca“).

Za transfekciju korišćenjem kalcijum fosfata, ćelije su uzgajane kao adherentne monoslojne kulture u T-bočici pomoću DMEM kulture medija dopunjene sa 10 % (v/v) FCS i transfektovane kada su bile konfluentne između 50 i 80%. Za transfekciju bočice T150, 15 miliona ćelija je posejano 24 sata pre transfekcije u 25 ml DMEM kulture medija dopunjene sa FCS (na 10 % v/v final), a ćelije su postavljene na 37 °C u inkubatoru sa 5 % CO2atmosfera preko noći. Za svaku T150 bočicu koja se transfektuje, rastvor DNK, CaCl2i vode je pripremljen mešanjem 94 µg ukupne plazmidne vektorske DNK podeljene u odgovarajućem odnosu i vode do završne zapremine od 469 µl i 469 µl rastvora 1 M CaCl2. Ovom rastvoru dodato je 938 µl 50 mM HEPES-a, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4rastvora na pH 7,05, odmah pomešano 10 s i ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi 20 s. Suspenzija je razblažena sa 10 ml DMEM-a dodatim sa 2 % (v/v) FCS-a i dodata u T150 umesto postojećeg medija. Zatim je dodato dodatnih 13 ml transfekcionog medija. Ćelije su inkubirane na 37 °C, 5 % CO2tokom otprilike 17 do 20 sati, a zatim je medijum zamenjen sa 25 ml DMEM, 10 % FCS. Srednji uslovljeni medijum za kulturu je skupljan približno 7 dana posle medijske razmene centrifugiranjem 15 min. na 210 x g, sterilno filtriran (0,22 • m filter), dopunjen natrijum azidom do konačne koncentracije od 0,01 % (v/v) i zadržan na 4 °C.

Za transfekciju ćelije se kultivišu u suspenziji u medijumu za kulturu CD CHO bez seruma koristeći polietilenimin (PEI) HEK293 EBNA. Za proizvodnju u bočici od 500 ml, 400 miliona HEK293 EBNA ćelija je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 min. na 210 x g, a supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medija. Vektori ekspresije su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 µg DNK. Posle dodavanja 540 µl PEI, smeša je vorteksovana 15 s, a zatim je inkubirana 10 min. na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa DNK/PEI rastvorom, prenesen u bočicu od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru sa atmosferom od 5 % CO2. Posle inkubacionog vremena dodato je 160 ml F17 medija i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Jednog dana nakon transfekcije dodato je 1 mM valproinske kiseline i 7% feed 1 (Lonza). Nakon 7 dana kultivacije, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem 15 min. na 210 x g, rastvor je sterilisano filtriran (0,22 µm filter), dopunjen sa natrijum azidom do konačne koncentracije od 0,01% v/v i zadržan na 4 °C. Izlučeni proteini su prečišćeni od supernatanta ćelijske kultivacije pomoću afinitetne hromatografije proteina A, praćene korakom hromatografije za isključivanje veličine.

Za afinitetnu hromatografiju supernatant je natovaren na kolonu HiTrap proteina A HP (CV = 5 ml, GE zdravstvena zaštita), izjednačen sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5 ili 40 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen pranjem sa najmanje 10 volumena kolone od 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida pH 7,5, praćeno dodatnim korakom pranja korišćenjem šest volumena kolone 10 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida pH 5,45. Zatim, kolona je isprana sa 20 ml 10 mM MES, 100 mM natrijum hlorida, pH 5,0, a ciljni protein je eluiran u šest volumena kolona 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Alternativno, ciljni protein se eluira korišćenjem gradijenta preko 20 volumena kolone od 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 7,5 do 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 2,5. Rastvor proteina je neutralisan dodavanjem 1/10 0,5 M natrijum fosfata, pH 8. Ciljni protein se koncentriše i filtrira pre postavljanja na koloni HiLoad Superdex 200 (GE zdravstvena zaštita) u ravnoteži sa 25 mM kalijum fosfata, 125 mM natrijum hlorida, 100 mM rastvora glicina pH 6,7. Za prečišćavanje 1+1 IgG Crossfab-a, kolona je bila uravnotežena sa 20 mM histidina, 140 mM rastvora natrijum hlorida pH 6,0.

Koncentracija proteina uzoraka prečišćenih proteina određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, korišćenjem molarnog koeficijenta ekstinkcije izračunatog na osnovu aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska težina bispecifičnih konstrukta su analizirani SDS-STRANICOM u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva (5 mM 1,4-ditiotreitol) i obojenjem koristećiCoomassie (SimpleBlue™ SafeStain iz kompanije „Invitrogen“), upotrebom NuPAGE® Pre-Cast gel sistema („Invitrogen“, SAD) u skladu sa uputstvima proizvođača (4-12% tris-acetat gela ili 4-12% bis-tris). Alternativno, čistoća i molekulska težina molekula analizirani su analizom CE-SDS u prisustvu i odsustvu redukujućeg sredstva, koristeći Caliper LabChip GXII sistem („Caliper Lifescience“) u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukupan sadržaj uzoraka proteina analiziran je pomoću kolone hromatografije za analizu veličine Superdex 20010/300GL (GE zdravstvena zaštita) u 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0,02% (v/v) NaN3, pH 7,3 pufera na 25 °C. Alternativno, ukupni sadržaj uzoraka antitela analiziran je pomoću kolone isključivanja analitičke veličine TSKgel G3000 SV XL („Tosoh“) u 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidroklorida, 0,02% (v/v) NaN3, pH 6,7 punog pufera na 25 °C.

Na slikama 2-14 prikazani su rezultati SDS STRANICE i hromatografije za isključivanje analitičke veličine, a tabela 2A prikazuje prinose, sadržaj agregata posle proteina A i konačni sadržaj monomera u preparatima različitih bispecifičnih konstrukata.

Slika 47 prikazuje rezultat CE-SDS analize anti-CD3/anti-MCSP bispecifičnog konstrukta „2 1 IgG Crossfab, spojeni laki lanac“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29 i 179). Za analizu se koristi 2 µg uzorka. Na slici 48 prikazan je rezultat hromatografije isključene analitičke veličine završnog proizvoda (ubrizgan uzorak od 20 µg).

Slika 54 prikazuje rezultate analize CE-SDS i SDS STRANICE različitih konstrukcija, a tabela 2A pokazuje prinose, sadržaj agregata nakon proteina A i konačni sadržaj monomera u preparatima različitih bispecifičnih konstrukta.

TABELA 2A. Prinosi, sadržaj agregata nakon proteina A i konačni sadržaj monomera.

Kao kontrole, bispecifični molekuli koji vezuju antigen su generisani u već poznatom tandemu scFv formata („(scFv)2“) i spajanjem tandema scFv u Fc domen („(scFv)2Fc“). Molekuli su proizvedeni u HEK293-EBNA ćelijama i prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije proteina A praćene hromatografskim korakom za isključivanje veličine na isti način kao što je gore opisano. Zbog velikog formiranja agregata, neki od uzoraka morali su biti dalje prečišćeni primenom eluiranih i koncentrovanih uzoraka iz kolone HiLoad Superdex 200 (GE zdravstvena zaštita) na kolonu Superdex 10/300 GL (GE zdravstvena zaštita) uravnoteženu sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, pH 6,7, kako bi se dobio protein sa visokim sadržajem monomera. Kasnije, koncentracija proteina, čistoća, molekulska težina i sadržaj agregata su određeni kao što je gore opisano.

Prinosi, sadržaj agregata nakon prvog koraka prečišćavanja i konačni sadržaj monomera za kontrolne molekule prikazan je u tabeli 2B. Upoređivanje sadržaja agregata nakon prvog koraka prečišćavanja (protein A) ukazuje na superiornu stabilnost IgG Crossfab i IgG scFab konstrukata u poređenju sa „(scFv)2-Fc“ i pomoću disulfidnog mosta stabilizovanim „(dsscFv)2-Fc“ molekulima.

TABELA 2B. Prinosi, sadržaj agregata nakon proteina A i konačni sadržaj monomera.

Termička stabilnost proteina praćena je dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS). 30 • g uzorka filtriranih proteina sa koncentracijom proteina od 1 mg/ml je dodat u duplikat za Dynapro čitač ploča („Wyatt Technology Corporation“, SAD). Temperatura je nameštena od 25 do 75 °C na 0,05 °C/min, pri čemu se sakuplja opseg i ukupan intenzitet rasipanja. Rezultati su prikazani na slici 15 i tabeli 2C. Za molekul „(scFv) 2-Fc“ (antiMCSP/anti huCD3) su primećene dve tačke agregacije, na 49 °C i 68 °C. Konstrukcija „(dsscFv) 2-Fc“ ima povećanu temperaturu agregacije (57 °C) kao rezultat uvedenog disulfidnog mosta (slika 15A, tabela 2C). Konstrukti „2+1 IgG scFab“ i „2+1 IgG Crossfab“ se sabiraju na temperaturama većim od 60 °C, pokazujući njihovu superiornu toplotnu stabilnost u poređenju sa „(scFv)2-Fc“ i „( dsscFv)2-Fc“ formatima (slika 15B, tabela 2C).

TABELA 2C. Termička stabilnost određena dinamičkim rasipanjem svetlosti.

Primer 2

Analiza Fc receptora i vezivanja ciljanog antigena sa površinskom plazmonskom rezonancom

Način

Svi eksperimenti sa površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) se izvode na Biacore T100 na 25 °C sa HBS-EP kao aktivnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20, Biacore, Frajburg/Nemačka ).

Analiza FcR vezivanja različitih Fc-varijanti

Postavka testa je prikazana na slici 16A. Za analizu interakcije različitih Fc-varijanti sa ljudskim FcγRIIIa-V158 i mišijim FcγRIV obavlja se direktno spajanje oko 6.500 rezonantnih jedinica (RU) anti-Penta His antitela (Qiagen) na CM5 čipu na pH 5,0 pomoću standardne opreme za spajanje amina (Biacore, Frajburg/Nemačka). HuFcγRIIIa-V158-K6H6 i muFcγRIV-aviHisbiotin su snimani 60 s na 4 i 10 nM, respektivno.

Konstrukti sa različitim Fc-mutacijama prolaze kroz ćelije protoka za 120 s u koncentraciji od 1000 nM sa protokom od 30 µl/min. Disocijacija se nadgleda 220 s. Razlike u refrakcionom indeksu se koriguju tako što se oduzima odgovor dobijen u referentnoj ćeliji protoka. Ovde Fc varijante prolaze kroz površinu sa imobilizovanim anti-Penta His antitelom, ali na koji je HBS-EP injektiran umjesto HuFcγRIIIa-V158-K6H6 ili muFcγRIV-aviHis-biotin. Afinitet za ljudski FcγRIIIa-V158 i mišiji FcγRIV je određen za Fc divljeg tipa koji koristi opseg koncentracije od 500 – 4000 nM.

Reakcija stabilnog stanja korišćena je za izvođenje konstante disocijacije KDpomoću nelinearne krive vezivanja Langmuirove vezivne izoterme. Kinetičke konstante su izvedene korišćenjem Biacore T100 softvera za procenu (vAA, Biacore AB, Upsala/Švedska), kako bi se uklopile jednačine za vezivanje 1:1 Langmuira pomoću numeričke integracije.

Rezultat

Interakcija Fc varijanti sa ljudskim FcγRIIIa i mišijim FcγRIV kontrolisana je površinskom plazmonskom rezonancom. Vezivanje za zarobljenih huFcγRIIIa-V158-K6H6 i muFcγRIV-aviHis-biotin je značajno smanjeno za sve analizirane Fc mutante u odnosu na konstrukt sa Fc domenom divljeg tipa (wt).

Fc mutanti sa najnižim vezivanjem za ljudski Fcγ-receptor su bili P329G L234A L235A (LALA) i P329G LALA N297D. Sama LALA mutacija nije bila dovoljna da ukine vezivanje za huFcγRIIIa-V158-K6H6. Fc varijanta koja nosi samo LALA mutaciju imala je rezidualni vezujući afinitet za ljudski FcγRIIIa od 2100 nM, dok se wt Fc vezivao za ljudski FcγRIIIa receptor sa afinitetom od 600 nM (tabela 3). Obe KDvrednosti dobijene su sa modelom vezivanja od 1:1, koristeći jedinstvenu koncentraciju.

Afinitet za ljudski FcγRIIIa-V158 i mišji FcγRIV se može analizirati samo za wt Fc. KDvrednosti su navedene u tabeli 3. Vezivanje na mišji RIV je skoro potpuno eliminisano za sve analizirane Fc mutante.

TABELA 3. Afinitet Fc-varijanti za ljudski FcγRIIIa-V158 i mišiji FcγRIV.

* određeno koristeći jednu koncentraciju (1000 nM)

Analiza istovremenog vezivanja za tumorski antigen i CD3

Analiza istovremenog vezivanja bispecifičnih konstrukata T ćelija na tumorski antigen i humani CD3e izvedena je direktnim spajanjem 1650 rezonantnih jedinica (RU) biotinilovanog D3 domena MCSP na senzorskom čipu SA koristeći standardnu proceduru spajanja. Ljudski EGFR je bio imobilizovan korišćenjem standardne procedure amino spajanja. 8000 RU je imobilisano na CM5 senzorskom čipu na pH 5,5. Postavka testa je prikazana na slici 16B.

Različite bispecifične konstrukcije T-ćelija su zarobljene tokom 60 s na 200 nM. Ljudski CD3γ(G4S)5CD3e–AcTev–Fc(čvor)–Avi/Fc(rupa) je naknadno prošao u koncentraciji od 2000 nM i protoku od 40 µl/min tokom 60 s. Razlike u refrakcionom indeksu su korigovane tako što su oduzeti odgovori dobijeni na referentnoj ćeliji protoka gde je rekombinantni CD3e naleteo na površinu sa imobilizovanim D3 domenom MCSP ili EGFR bez zarobljenih bispecifičnih konstrukata T-ćelija.

Rezultat

Istovremeno vezivanje za tumorski antigen i ljudski CD3e analizirano je površinskom plazmonskom rezonancom (slika 17, slika 18). Svi konstrukti su mogli istovremeno da vezuju tumorski antigen i CD3. Za većinu konstrukata, nivo vezivanja (RU) nakon injekcije ljudskog CD3e bio je veći od nivoa vezivanja postignutog nakon injektiranja samog konstrukta koji odražava da su i tumorski antigen i humani CD3e vezani za konstrukt.

Primer 3

Vezivanje bispecifičnih konstrukata sa odgovarajućim ciljnim antigenom na ćelijama Vezivanje različitih bispecifičnih konstrukta na CD3 na Jurkat ćelijama (ATCC #TIB-152) i odgovarajućeg tumorskog antigena na ciljnim ćelijama, određeno putem FACS-a. Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane i proverene za održivost.0,15 – 0,2 miliona ćelija po bunarčiću (u PBS-u koji sadrži 0,1% BSA, 90 µl) su pokrivene na ploči sa okruglim dnom i 96 bunarčića i inkubirane sa naznačenom koncentracijom bispecifičnih konstrukata i odgovarajućih IgG kontrola (10 µl) tokom 30 min na 4°C. Za bolje poređenje, svi konstrukti i IgG kontrole su normalizovani na istu molarnost. Nakon inkubacije, ćelije su centrifugirane (5 min, 350 x g), isprane sa 150 µl PBS-a koji sadrži 0,1% BSA, resuspendovane i inkubirane još 30 min. na 4 °C sa 12 µl/bunarčić FITC-a ili PE konjugovanog sekundarnog antitela. Vezani konstrukti su otkrivene pomoću FACSCantoII (softver FACS Diva). Molekul „(scFv)2“ otkriven je pomoću FITC-konjugovanog anti-His antitela (Lucerna, # RHIS-45F-Z). Za sve druge molekule, korišćen je AffiniPure F(ab’)2 konjugovan FITC-om ili PE-om fragmentni kozji anti-ljudski IgG Fcγ specifičan fragment (Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098/radni rastvor 1:20 ili #109-116-170/radni rastvor 1:80, respektivno). Ćelije su isprane dodavanjem 120 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0.1% BSA i centrifugiranjem na 350 x g tokom 5 min. Drugi korak pranja je izveden sa 150 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA. Osim ako nije drugačije naznačeno, ćelije su fiksirane sa 100 µl/bunarčić puferom za fiksiranje (BD #554655) tokom 15 min. na 4 °C u mraku, centrifugirane 6 min na 400 x g i držane u 200 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA dok uzorci nisu izmereni pomoću FACS CantoII.

EC50 vrednosti izračunate su pomoću softvera GraphPad Prism. U prvom eksperimentu, različiti bispecifični konstrukti koji su usmereni na ljudski MCSP i ljudski CD3 analizirani su protočnom citometrijom za vezivanje za ljudski CD3 izražen na ćelijama Jurkata, ljudskim T ćelijama leukemije ili ljudskom MCSP-u na Colo-38 ljudskim ćelijama melanoma.

Rezultati su prikazani na slici 19-21, koji pokazuju srednji intenzitet fluorescencije ćelija koje su inkubirane sa bispecifičnim molekulom, kontrolnim IgG-om, samo sekundarnim antitelom ili nisu obrađene.

Kao što je prikazano na slici 19, za oba vezujuća dela antigena „(scFv)2“, tj. CD3 (slika 191A) i MCSP (slika 19B), primećen je jasan vezujući signal u poređenju sa kontrolnim uzorcima.

Molekul „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 17, 19) pokazuje dobro vezivanje za huMCSP na Colo-38 ćelijama (slika 20A). CD3 deo vezuje CD3 nešto bolje od referentnog anti-ljudskog CD3 IgG-a (slika 20B).

Kao što je prikazano na slici 21A, dva „1+1“ konstrukta pokazuju uporedive signale vezivanja za ljudski CD3 na ćelijama. Referentni anti-ljudski CD3 IgG daje malo slabiji signal. Pored toga, oba ispitivana konstrukta („1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (SEQ ID NO.1, 3, 5) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (SEQ ID NO. 7, 9, 11 )) pokazuju uporedivo vezivanje za ljudski MCSP na ćelijama (slika 21B). Signal vezivanja dobijen referentnim antiljudskim MCSP IgG-om je neznatno slabiji.

U drugom eksperimentu, prečišćeni bispecifični konstrukt „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.

5, 17, 19) i odgovarajući anti-ljudski MCSP IgG analizirani su protočnom citometrijom za vezivanje zavisno od doze prema humanom MCSP-u na Colo-38 ljudskim melanomskim ćelijama, da bi se utvrdilo da li se bispecificni konstrukt vezuje za MCSP preko jedne ili obe njegove „ruke“. Kao što je prikazano na slici 22, konstrukt „2 1 IgG scFab“ pokazuje isti obrazac vezivanja kao i MCG IgG.

U još jednom eksperimentu, procenjeno je vezivanje bispecifičnog konstrukta CD3/CEA „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ sa VL/VH (pogledajte SEQ ID NO. 33, 63, 65, 67) ili CL/CH1 razmenu (pogledajte SEQ ID NO. 66, 67, 183, 197) u Crossfab fragmentu na ljudskom CD3, izraženom Jurkat ćelijama, ili ljudskom CEA, izraženom LS-174T ćelijama. Kao kontrola, procenjeni su ekvivalentna maksimalna koncentracija odgovarajućih IgG-a i pozadinsko obojenje zbog obeleženog sekundarnog antitela (koziji anti-humani FITC-konjugovani AffiniPure F (ab ') 2 fragment, Fcγ fragment-specific, Jackson Immuno Research Lab # 109 -096-098). Kao što je ilustrovano na slici 55, oba konstrukta pokazuju dobro vezivanje za CEA, kao i za ljudski CD3 na ćelijama. Izračunate EC50 vrednosti bile su 4,6 i 3,9 nM (CD3) i 9,3 i 6,7 nM (CEA) za konstrukte „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (VL/VH)“ i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (CL/CH1)“.

U drugom eksperimentu, procenjeno je vezivanje CD3/MCSP „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 183, 187) konstrukata za humani CD3, izražen Jurkat ćelijama, ili ljudski MCSP, izražen WM266-4 ćelijama. Slika 56 pokazuje da, iako je vezivanje oba konstrukta na MCSP na ćelijama bilo sasvim dobro, vezivanje „obrnutog“ konstrukta na CD3 je smanjeno u poređenju sa drugim konstruktom. Izračunate EC50 vrednosti bile su 6,1 i 1,66 nM (CD3) i 0,57 i 0,95 nM (MCSP) za konstrukte „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ i „2+1 IgG Crossfab“.

U daljem eksperimentu, određeno je vezivanje konstrukta „1+1 IgG Crossfab, spajanje lakog lanca (LC)“ (SEQ ID NO.183, 209, 211, 213) sa ljudskim CD3, izraženim Jurkat ćelijama, i ljudskim CEA, izraženim LS-174T ćelijama. Kao kontrola, procenjene su ekvivalentna maksimalna koncentracija odgovarajućih anti-CD3 i anti-CEAIgG-a i pozadinsko obojenje zbog obeleženog sekundarnog antitela (koziji anti-humani FITC-konjugovani AffiniPure F (ab ') 2 fragment, Fcγ fragment-specific, Jackson Immuno Research Lab # 109 -096-098). Kao što je prikazano na slici 57, čini se da je vezivanje „1+1 IgG Crossfab, LC spajanje“ na CEA značajno smanjeno, dok je vezivanje za CD3 barem uporedivo sa referentnim IgG-om.

U konačnom eksperimentu, određeno je vezivanje konstrukta „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO.5, 23, 215, 217) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (SEQ ID NO.5, 23, 215, 219) sa ljudskim CD3, izraženim Jurkat ćelijama, i sa ljudskim MCSP, izraženim WM266-4 tumorskim ćelijama. Kao što je prikazano na slici 58, vezivanje za ljudski CD3 je smanjeno za „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ u poređenju sa drugim konstruktom, ali vezivanje za ljudski MCSP je bilo sasvim dobro. Izračunate EC50 vrednosti bile su 10,3 i 32,0 nM (CD3) i 3,1 i 3,4 nM (MCSP) za konstrukte „2+1 IgG Crossfab“ i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“.

Primer 4

FACS analiza markera površinske aktivacije na primarnim ljudskim T ćelijama nakon angažovanja bispecifičnih konstrukata

Prečišćeni bispecifični huMCSP-huCD3-ciljani „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 17, 19) i „(scFv)2“ molekuli su testirani pomoću protočne citometrije za njihov potencijal da unaprede regulator markera za ranu površinsku aktivaciju CD69, ili markera za kasnu površinsku aktivaciju CD25 na CD8<+>T ćelijama u prisustvu ljudskih MCSP-izražavajućih tumorskih ćelija.

Ukratko, MCSP-pozitivne Colo-38 ćelije su sakupljene sa puferom za uklanjanje ćelija, prebrojene i proverene za održivost. Ćelije su prilagođene na 0,3 x 10<6>(održive) ćelije po ml u AIM-V medijumu, 100 µl ove suspenzije ćelija po bunarčiću je pipetovano na ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića (kako je naznačeno). 50 µl (razređenog) bispecifičnog konstrukta dodato je u bunarčiće sa ćelijama da bi se dobila konačna koncentracija od 1 nM. Ljudske PBMC efektorske ćelije su izolovane iz sveže krvi zdravog donatora i prilagođene na 6 x 10<6>(održive) ćelije po ml u AIM-V medijumu. 50 µl ove suspenzije ćelija je dodato po bunarčiću testne ploče (pogledaj u prethodnom tekstu) kako bi se dobio konačni E:T odnos od 10:1. Da bi se analiziralo da li bispecifični konstrukti mogu da aktiviraju T ćelije isključivo u prisustvu ciljnih ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen huMCSP, uključeni su bunarčići koji sadrže 1 nM odgovarajućih bispecifičnih molekula, kao i PBMC, ali bez ciljnih ćelija. Nakon inkubacije od 15 h (CD69) ili 24 h (CD25) na 37 °C, 5% CO2, ćelije su centrifugirane (5 min, 350 x g) i isprane dva puta sa 150 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (mišji IgG1, k; klon HIT8a; BD #555635), CD69 (mišji IgG1; klon L78; BD #340560) i CD25 (mišji IgG1,k; klon M-A251; BD #555434) je obavljeno na 4 °C u trajanju od 30 min. prema predlozima dobavljača. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA i fiksirane 15 min. na 4 °C, koristeći pufer za fiksiranje od 100 µl/bunarčić (BD# 554655). Nakon centrifugiranja, uzorci su ponovo suspendovani u 200 µl/bunarčić PBS-a sa 0,1% BSA i analizirani pomoću FACS CantoII mašine (softver FACS Diva).

Slika 23 prikazuje nivo ekspresije ranog aktivacionog markera CD69 (A) ili kasnog aktivacionog markera CD25 na CD8<+>T ćelijama (B) nakon 15 sati ili 24 sati inkubacije. Oba konstrukta podstiču regulaciju oba aktivacionog markera isključivo u prisustvu ciljnih ćelija. Izgleda da je molekula „(scFv)2“ u ovom testu nešto aktivnija nego konstrukt „2+1 IgG scFab“.

Prečišćeni bispecifični huMCSP-huCD3-ciljani „2+1 IgG scFab“ i „(scFv) 2“ molekuli su dodatno testirani protočnom citometrijom zbog njihovog potencijala da unaprede regulaciju kasnog aktivacijskog markera CD25 na CD8<+>T ćelijama ili CD4<+>T ćelijama u prisustvu tumorskih ćelija koje ekspresuju ljudski MCSP. Eksperimentalni postupci su opisani u prethodnom tekstu, koristeći ljudske pan T efektorske ćelije sa odnosom E:T od 5:1 i inkubacionim vremenom od pet dana.

Slika 24 pokazuje da oba konstrukta indukuju regulaciju CD25 isključivo u prisustvu ciljnih ćelija na CD8<+>(A) kao i na CD4<+>(B) T ćelijama. Izgleda da konstrukt „2+1 IgG scFab“ indukuje manje unapređenje regulacije CD25 u ovom testu, u poređenju sa „(scFv)2“ molekulom. Generalno, regulacija CD25 je izraženija na CD8<+>nego na CD4<+>T ćelijama.

U drugom eksperimentu, analiziran je prečišćeni „2+1 IgG Crossfab“ koji cilja cinomolgus CD3 i ljudski MCSP (SEQ ID NO.3, 5, 35, 37) zbog njegovog potencijala da unapredi regulaciju markera za aktivaciju CD25 na CD8<+>T ćelijama u prisustvu ciljanih ćelija tumora. Ukratko, ljudske MCSP-ekspresivne MV-3 tumorske ciljne ćelije su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u DMEM-u sa 2% FCS-a i 1% GlutaMax-a. 30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, a odgovarajuće razblaženje antitela je dodato u navedenim koncentracijama (slika 25). Bispecifični konstrukt i različite IgG kontrole podešene su na istu molarnost. Cinomolgus PBMC efektorske ćelije, izolovane iz krvi dve zdrave životinje, dodato je da se dobije konačni odnos E:T od 3:1. Posle inkubacije 43 h na 37 °C, 5% CO2, ćelije su centrifugirane na 350 x g tokom 5 min. i isprane dva puta sa PBS-om, koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (Miltenyi Biotech #130-080-601) i CD25 (BD #557138) obavljeno je u skladu sa predlozima dobavljača. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA i fiksirane 15 min. na 4 °C, koristeći pufer za fiksiranje od 100 µl/bunarčić (BD #554655). Nakon centrifugiranja, uzorci su ponovo suspendovani u 200 µl/bunarčić PBS-a sa 0,1% BSA i analizirani pomoću FACS CantoII mašine (softver FACS Diva).

Kao što je prikazano na slici 25, bispecifični konstrukt indukuje zavisnu regulaciju CD25 na CD8<+>T ćelijama samo u prisustvu ciljanih ćelija. Anti cino CD3 IgG (klon FN-18) takodje je u stanju da indukuje regulaciju CD25 na CD8<+>T ćelijama, bez unakrsnog povezivanja (pogledajte podatke dobijene sa cino nestorom). Ne postoji hiperaktivacija cino T ćelija sa maksimalnom koncentracijom bispecifičnog konstrukta (u odsustvu ciljnih ćelija).

U drugom eksperimentu, CD3-MCSP „2+1 IgG Crossfab, povezani laki lanac“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179) je poređen sa CD3-MCSP „2 1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) zbog svog potencijala za unapređenje regulacije ranog aktivacionog markera CD69 ili kasnog aktivacionog markera CD25 na CD8<+>T ćelijama u prisustvu tumorskih ciljnih ćelija. Primarni ljudski PBMC-i (izolovani kao što je gore opisano) su inkubirani sa naznačenim koncentracijama bispecifičnih konstrukata najmanje 22 h u prisustvu ili odsustvu MCZ-pozitivnih ciljanih Colo38 ćelija. Ukratko, 0,3 miliona primarnih ljudskih PBMC-a je pokriveno po bunarčiću ploče sa ravnim dnom i 96 bunarčića, koje sadrže MCSP-pozitivne ciljne ćelije (ili medijum).

Završni odnos efektora sa ciljanim ćelijama (E:T) bio je 10:1. Ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom bispecifičnih konstrukata i kontrola za naznačene vreme inkubacije na 37 °C, sa 5% CO2. Efektorske ćelije su obojene za CD8, CD69 ili CD25 i analizirane pomoću mašine FACS CantoII.

Na slici 53 prikazan je rezultat ovog eksperimenta. Nije utvrđena značajna razlika u odnosu na CD69 (A) ili CD25 unapređenje regulacije (B) između dva 2+1 IgG Crossfab molekula (sa ili bez povezanog lakog lanca).

U još jednom eksperimentu, CD3/MCSP „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33) i „1+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 29, 33, 181) konstrukti su upoređeni sa konstruktom „1+1 CrossMab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 183, 185) zbog njihovog potencijala da unaprede regulaciju CD69 ili CD25 na CD4<+>ili CD8<+>T ćelijama u prisustvu tumorskih ciljnih ćelija. Analiza je izvedena kao što je prethodno opisano, u prisustvu odsustva ljudskog MCSP-a koji eksprimira MV-3 tumorske ćelije, sa inkubacijskim vremenom od 24 h.

Kao što je prikazano na slici 59, konstrukti „1+1 IgG Crossfab“ i „2+1 IgG Crossfab“ indukovali su izrazitije unapređenje regulacije aktivacionih markera od molekula „1+1 CrossMab“.

U konačnom eksperimentu, konstrukti CD3/MCSP „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 215, 217) i „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ (pogledajte SEQ ID NO.5, 23, 215, 219) su procenjeni zbog njihovog potencijala da unaprede regulaciju CD25 na CD4<+>ili CD8<+>T ćelijama od dva različita cinomolgus majmuna u prisustvu tumorskih ciljnih ćelija. Analiza je izvedena kao što je prethodno opisano, u prisustvu odsustva ljudskog MCSP-a koji eksprimira MV-3 tumorske ćelije, sa odnosom E:T od 3:1 i vremenom inkubacije od oko 41 h.

Kao što je prikazano na slici 60, oba konstrukta su uspeli da unaprede regulaciju CD25 na CD4<+>i CD8<+>T ćelijama zavisno od koncentracije, bez značajne razlike između dva formata. Kontrolni uzorci bez antitela i bez ciljnih ćelija dali su uporediv signal uzorcima sa antitelima, ali bez ciljeva (nije prikazano).

Primer 5

Interferon-γ lučenje nakon aktivacije ljudskih pan T ćelija sa CD3 bispecificnim konstruktima

Pročišćeni „2 1 IgG scFab“ koji tretira ljudski MCSP i ljudski CD3 (SEQ ID NO.5, 17, 19) analiziran je zbog njegovog potencijala da indukuje aktivaciju T ćelija u prisustvu ljudskih MCSP pozitivnih U-87MG ćelija, mereno oslobađanjem ljudskog interferona (IFN)-γ u supernatant. Kao kontrole korišćeni su anti-ljudski MCSP i anti-ljudski CD3 IgG, prilagođeni istom molaritetu. Ukratko, huMCSP-ekspresioni U-87MG glioblastom astrocitoma ciljne ćelije (ECACC 89081402) se sakupljaju sa puferom za disocijaciju ćelija, peru i ponovo se suspenduju u AIM-V medijumu (Invitrogen #12055-091).20 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploči sa okruglim dnom i 96 bunarčića, i odgovarajuće razblaženje antitela je dodato da se dobije konačna koncentracija od 1 nM. Ljudske T efektorske ćelije, izolovane iz Buffi Coat-a, dodate su kako bi se dobio konačni odnos E:T od 5:1. Posle inkubacije preko noći od 18,5 sati na 37 °C, sa 5% CO2, ploča za testiranje je centrifugirana 5 min. na 350 x g, a supernatant je premešten u svežu ploču sa 96 bunarčića. Ljudski IFN-γ nivoi u supernatantu su mereni pomoću ELISA, prema uputstvima proizvođača (BD OptEIA ljudski IFN-γ ELISA Komplet II od kompanije Becton Dickinson, #550612).

Kao što je prikazano na slici 26, referentni IgG ne pokazuju slabu indukciju IFN-γ sekrecije, dok konstrukt „2+1 IgG scFab“ može aktivirati ljudske T ćelije da luče IFN-γ.

Primer 6

Preusmerena citotoksičnost T ćelija posredovana unakrsno vezanim bispecifičnim konstruktima usmerenim na CD3 na T ćelijama i MCSP ili EGFR na tumorskim ćelijama (LDH test oslobađanja)

U prvom nizu eksperimenata, bispecifični konstrukti koji su ciljali na CD3 i MCSP analizirani su zbog njihovog potencijala da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ciljnim ćelijama tumora nakon ukrštanja konstrukta putem vezivanja ćelija vezivanja antigena na njihove odgovarajuće ciljne antigene na ćelijama (slike 27-38).

U jednom eksperimentu prečišćeni su konstrukti „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 21, 23) i „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) koji ciljaju na ljudski CD3 i ljudski MCSP, i upoređeni su odgovarajući „(scFv)2“ molekuli. Ukratko, MDA-MB-435 ciljane ćelije melanoma koje izražavaju huMCSP su sakupljeni sa puferom za disocijaciju ćelija, oprani i ponovo suspendovani u AIM-V medijumu (Invitrogen # 12055-091). 30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, a odgovarajuće razblaženje konstrukta je dodato u navedenoj koncentraciji. Svi konstrukti i odgovarajući kontrolni IgG su prilagođeni istoj molarnosti. Ljudske pan efektorske T ćelije su dodate da bi se dobio konačni odnos E:T od 5:1. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju ljudskih pan T ćelija korišćeno je 1 µg/ml PHA-M (Sigma # L8902, mešavina izolektina izolovanih iz Phaseolus vulgaris). Za normalizaciju, maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) je određena inkubacijom ciljnih ćelija konačnom koncentracijom od 1% Tritona X-100. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije ko-inkubirane sa efektorskim ćelijama, ali bez ikakvog konstrukta ili antitela. Nakon inkubacije preko noći od 20 sati na 37 °C, sa 5% CO2, LDH oslobađanje apoptoznih/nekrotičnih ciljnih ćelija u supernatant je mereno pomoću kompleta za LDH detekciju (Roche Applied Science, #11644793 001), prema uputstvima proizvođača.

Kao što je prikazano na slici 27, oba „2+1“ konstrukta indukuju apoptozu u ciljnim ćelijama uporedivim sa „(scFv)2“ molekulom.

Dalje, poređeni su prečišćeni konstrukti „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO.3, 5, 29, 33) i „2+1 IgG scFab“ koji se razlikuju u njihovom Fc domenu, kao i molekula „(scFv)2“. Različite mutacije u Fc domenu (L234A L235A (LALA), P329G i/ili N297D, kako je navedeno) smanjuju ili ukidaju funkciju efektorske ćelije (NK) indukovane konstruktima koji sadrže Fc domen divljeg tipa (wt). Eksperimentalne procedure su bile kako je opisano u prethodnom tekstu.

Slika 28 pokazuje da svi konstrukti indukuju apoptozu u ciljanim ćelijama uporedivim sa "(scFv)2“ molekulom.

Na slici 29 prikazan je rezultat poređenja prečišćenog konstrukta „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 17, 19) i molekula „(scFv)2“ za njihov potencijal da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ciljnim ćelijama tumora. Eksperimentalni postupci su sprovedeni kako je opisano u prethodnom tekstu, koristeći huMCSP-ekspresiju humanog melanoma Colo-38 ciljne ćelije u odnosu E:T od 5:1 i inkubacijom preko 18,5 sati u toku noći. Kao što je prikazano na slici, konstrukcija „2+1 IgG scFab“ pokazuje uporedivu citotoksičnu aktivnost sa molekulom „(scFv)2".

Slično tome, slika 30 pokazuje rezultat poređenja prečišćenog konstrukta „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 17, 19) i molekula „(scFv)2“, koristeći huMCSP-ekspresiju humanog melanoma Colo-38 ciljne ćelije u odnosu E:T od 5:1 i vremenom inkubacije od 18 h. Kao što je prikazano na slici, konstrukcija „2+1 IgG scFab“ pokazuje uporedivu citotoksičnu aktivnost sa molekulom (scFv)2.

Slika 31 pokazuje rezultat poređenja prečišćenog konstrukta „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 5, 17, 19) i molekula „(scFv)2“, koristeći huMCSP-ekspresiju humanog melanoma MDA-MB-435 ciljne ćelije u odnosu E:T od 5:1 i inkubacijom preko noći od 23,5 h. Kao što je prikazano na slici, konstrukt indukuje apoptozu u ciljanim ćelijama uporedivo sa molekulom „(scFv)2“.

Konstrukt „2+1 IgG scFab“ pokazuje smanjenu efikasnost u najvišim koncentracijama.

Pored toga, različiti bispecifični konstrukti koji su monovalentni za obe mete, ljudski CD3 i ljudski MCSP, kao i odgovarajući molekul „(scFv)2“ analizirani su za njihov potencijal da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama. Na slici 32 prikazani su rezultati za konstrukte „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (SEQ ID NO.1, 3, 5) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (SEQ ID NO.7, 9, 11), koristeći huMCSP-ekspresiju humanog melanoma Colo-38 ciljne ćelije sa odnosom E:T od 5:1 i inkubacijom od 19 h. Kao što je prikazano na slici, oba „1+1“ konstrukta su manje aktivna od molekula „(scFv)2“, sa molekulom „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ koji je superiorniji od „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ molekula u ovom testu.

Slika 33 prikazuje rezultate za konstrukt „1+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 5, 21, 213), koristeći huMCSP-ekspresiju humanog melanoma Colo-38 ciljne ćelije sa odnosom E:T od 5:1 i inkubacijom od 20 h. Kao što je prikazano na slici, konstrukt „1+1 IgG scFab“ je manje citotoksičan od „(scFv) 2“ molekula .

U sledećem eksperimentu prečišćeni konstrukti „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO.3, 5, 29, 33), „1+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO. 5, 29, 31, 33) i „(scFv)2“ molekul su analizirani zbog njihovog potencijala za indukovanje apoptoze posredovane T ćelijama u ciljanim ćelijama tumora nakon ukrštanja konstrukta vezivanjem oba ciljna antigena, CD3 i MCSP, na ćelijama. Korišćena je huMCSP-ekspresija MDA-MB-435 ljudskih ćelija melanoma sa odnosom E:T od 5:1 i inkubacijom od 20 h. Rezultati su prikazani na slici 34. Konstrukt „2+1 IgG Crossfab“ indukuje apoptozu u ciljanim ćelijama uporedo sa „(scFv)2“ molekulom. Poređenje mono i bivalentnih formata „IgG Crossfab“ jasno pokazuje da je bivalentni mnogo jači.

U još jednom eksperimentu, prečišćen konstrukt „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) analiziran je za njegov potencijal da indukuje apoptozu posredovanu T ćelijama u različitim (tumorskim) ciljnim ćelijama. Ukratko, MCPO-pozitivne Colo-38 ciljne ćelije tumora, mezenhimalne matične ćelije (izvedene iz koštane srži, Lonza #PT-2501 ili masno tkivo, Invitrogen # R7788-115) ili periciti (iz placente, PromoCell #C-12980) su, kao što je navedeno, sakupljeni puferom za disocijaciju ćelija, oprani i ponovo suspendovani u AIM-V medijumu (Invitrogen # 12055-091).30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, a odgovarajuće razblaženje antitela je dodato u navedenim koncentracijama. Ljudske PBMC efektorske ćelije, izolovane iz sveže krvi zdravog donatora dodate su da se dobije konačni odnos E:T od 25:1. Nakon inkubacije od 4 h na 37 °C, sa 5% CO2, LDH oslobađanje apoptotskih/nekrotičnih ciljnih ćelija u supernatantu je mereno pomoću kompleta za LDH detekciju (Roche Applied Science, #11644 793 001), prema uputstvima proizvođača.

Kao što je prikazano na slici 35, značajna citotoksičnost posredovana T-ćelijama mogla se posmatrati samo sa Colo-38 ćelijama. Ovaj rezultat je u skladu sa Colo-38 ćelijama koje izražavaju značajne nivoe MCSP-a, dok mezenhimalne matične ćelije i periciti izražavaju MCSP samo vrlo slabo.

Pročišćeni „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 5, 17, 19) konstrukt i „(scFv)2“ molekul su takođe upoređeni sa glikointriniranim anti-ljudskim MCSP IgG antitelima, koja imaju smanjeni procenat fucosilovanog N-glikana u svom Fc domenu (MCSP GlicoMab). Za ovaj eksperiment korišćena je huMCSP-ekspresija Colo-38 ljudskih ciljanih ćelija melanoma i ljudske PBMC efektorne ćelije, bilo kod fiksnog odnosa E:T od 25:1 (slika 36A), ili sa različitim odnosom E:T od 20:1 do 1:10 (slika 36B). Različiti molekuli su korišćeni u koncentracijama navedenim na slici 36A, ili u fiksnoj koncentraciji od 1667 pM (slika 36B). Čitanje je obavljeno nakon 21 h inkubacije. Kao što je prikazano na slici 36 A i B, oba bispecificna konstrukta pokazuju veći potencijal nego MSCP GlicoMab.

U drugom eksperimentu analiziran je prečišćeni „2+1 IgG Crossfab“ koji cilja na cinomolgus CD3 i ljudski MCSP (SEQ ID NO.3, 5, 35, 37). Ukratko, ljudske MCSP-ekspresivne MV-3 tumorske ciljne ćelije su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u DMEM-u sa 2% FCS-a i 1% GlutaMax-a. 30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta ili referentnog IgG-a u navedenim koncentracijama. Bispecifični konstrukt i različite IgG kontrole podešene su na istu molarnost. Cinomolgus PBMC efektorske ćelije, izolovane iz krvi zdravog cinomolgusa, dodato je da se dobije konačni odnos E:T od 3:1. Nakon inkubacije od 24 h ili 43 h na 37 °C, sa 5% CO2, LDH oslobađanje apoptoznih/nekrotičnih ciljnih ćelija u supernatant je mereno pomoću kompleta za LDH detekciju (Roche Applied Science, # 11644793 001), u skladu sa uputstvima proizvođača.

Kao što je prikazano na slici 37, bispecifični konstrukt indukuje LDH-oslobađanje zavisno od koncentracije od ciljnih ćelija. Efekat je jači nakon 43 h nego nakon 24 h. Anti-cinoCD3 IgG (klon FN-18) takođe može da indukuje LDH oslobađanje ciljnih ćelija bez unakrsne veze.

Slika 38 prikazuje rezultat poređenja prečišćenog konstrukta „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „(scFv)2“ molekula, korišćenjem ćelijske linije ljudskog melanoma (MV-3) koja izražava MCSP kao ciljne ćelije i ljudskog PBMC-a kao efektorske ćelije sa odnosom E:T od 10:1 i inkubacijom od 26 h. Kao što je prikazano na slici, konstrukcija „2+1 IgG Crossfab“ je snažnija što se tiče EC50 nego „(scFv)2“ molekula.

U drugoj seriji eksperimenata, bispecifični konstrukti koji ciljaju na CD3 i EGFR analizirani su za njihov potencijal da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ciljanim ćelijama tumora nakon ukrštanja konstrukta putem vezivanja delova antigena na njihove odgovarajuće ciljne antigene na ćelijama (slike 39-41).

U jednom eksperimentu prečišćeni su konstrukti „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 45, 47, 53) i „1+1 IgG scFab“ (SEK ID NOs 47, 53, 213) koji ciljaju na CD3 i EGFR, i odgovarajući „(scFv)2“ molekul. Ukratko, ljudski EGFR-ekspresivne LS-174T tumorske ciljne ćelije su sakupljene sa tripsinom, isprane i ponovo suspendovane u AIM-V medijumu (Invitrogen #12055-091). 30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, a odgovarajuće razblaženje antitela je dodato u navedenim koncentracijama. Svi konstrukti i kontrole su prilagođene istoj molarnosti. Ljudske pan efektorske T ćelije su dodate da bi se dobio konačni odnos E:T od 5:1. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju ljudskih pan T ćelija korišćena je 1 µg/ml PHA-M (Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) je određena inkubacijom ciljnih ćelija konačnom koncentracijom od 1% Tritona X-100. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije ko-inkubirane sa efektorskim ćelijama, ali bez ikakvog konstrukta ili antitela. Nakon inkubacije preko noći od 18 sati na 37 °C, sa 5% CO2, LDH oslobađanje apoptoznih/nekrotičnih ciljnih ćelija u supernatant je mereno pomoću kompleta za LDH detekciju (Roche Applied Science, #11644 793 001), prema uputstvima proizvođača.

Kao što je prikazano na slici 39, konstrukt „2+1 IgG scFab“ pokazuje uporedivu citotoksičnu aktivnost sa molekulom „(scFv)2“, dok je konstrukt „1+1 IgG scFab“ manje aktivan.

U drugom eksperimentu, upoređeni su pročišćeni konstrukti „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (SEQ ID NO.43, 45, 47), „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ (SEQ ID NO.11, 49, 51), „1+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.47, 53, 213) i molekula „(scFv)2“. Eksperimentalni uslovi su bili kako je gore opisano, osim inkubacije koja je bila 21 h.

Kao što je prikazano na slici 40, konstrukt „1+1 IgG scFab“ pokazuje nešto nižu citotoksičnu aktivnost od molekula „(scFv)2“ u ovom testu. Oba „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom (obrnuto)“ konstrukta su očigledno manje aktivni od molekula „(scFv)2“.

U još jednom eksperimentu, upoređeni su pročišćeni konsrukti „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom“ (SEQ ID NO. 43, 45, 47) i „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom" (SEQ ID NO.11, 49, 51 ) i molekul „(scFv)2“. Vreme inkubacije u ovom eksperimentu iznosilo je 16 h, a rezultat je prikazan na slici 41. Inkubirani sa ljudskim pan T ćelijama, oba konstrukta „1+1 IgG scFab, sa jednom rukom (obrnuto)“ su manje aktivni od molekula „(scFv)2“, ali pokazuju koncentraciono oslobađanje LDH-a iz ciljnih ćelija (slika 41A ). Nakon ko-kultivacije tumorskih ćelija LS-174T sa naivnim T-ćelijama izolovanim iz PBMC-ova, konstrukti su imali samo bazalnu aktivnost –od kojih je najaktivniji molekul „(scFv)2“ (slika 41B).

U sledećem eksperimentu, analizirani su prečišćeni konstrukti „1+1 IgG scFab, jednoobrazni obrnuti“ (SEQ ID NO.11, 51, 55), „1+1 IgG scFab“ (57, 61, 213) i „2+1 IgG scFab“ (57, 59, 61) koji su imali za cilj CD3 i Fibroblast aktivacioni proteinu (FAP), i odgovarajući „(scFv)2“ molekul, zbog njihvog potencijala da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ljudskim FAP-ekspresivnim fibrloblast GM05389 ćelijama nakon ukrštanja konstrukta vezivanjem oba ciljna dela na njihove odgovarajuće ciljne antigene na ćelijama. Ukratko, ljudske GM05389 ciljne ćelije su sakupljene tripsinom dan ranije, oprane i ponovo suspendovane u AIM-V medijumu (Invitrogen #12055-091). 30 000 ćelija po bunarčiću u je pokriveno na ploči sa okruglim dnom i 96 bunarčića i inkubirano tokom noći na 37 °C, sa 5% CO2, kako bi se ćelijama omogućio oporavak i pridržavanje. Sledećeg dana, ćelije su centrifugirame, supernatant je odbačen i dodat je sveži medij, kao i odgovarajuće razblaženje konstrukta ili referentnih IgG-ova, u navedenim koncentracijama. Svi konstrukti i kontrole su prilagođene istoj molarnosti. Ljudske pan efektorske T ćelije su dodate da bi se dobio konačni odnos E:T od 5:1. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju ljudskih pan T ćelija korišćena je 5 µg/ml PHA-M (Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) je određena inkubacijom ciljnih ćelija konačnom koncentracijom od 1% Tritona X-100. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama, ali bez ikakvog konstrukta ili antitela. Nakon dodatne inkubacije preko noći od 18 sati na 37 °C, sa 5% CO2, LDH oslobađanje apoptoznih/nekrotičnih ciljnih ćelija u supernatant je mereno pomoću kompleta za LDH detekciju (Roche Applied Science, #11 644 793 001), prema uputstvima proizvođača.

Kao što je prikazano na slici 42, konstrukt „2+1 IgG scFab“ pokazuje uporedivu citotoksičnu aktivnost sa molekulom „(scFv)2“ u smislu vrednosti EC50. Konstrukt „1+1 IgG scFab, obrnuto sa jednom rukom“ je manje aktivan od drugih konstrukata u ovom testu.

U drugom setu eksperimenata, CD3/MCSP „2+1 IgG Crossfab, povezani laki lanac“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 179) upoređivan je sa CD3/MCSP „2 1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO.3, 5, 29, 33). Ukratko, ciljne ćelije (ljudske Colo-38 ćelije, ljudske MV-3 ili WM266-4 melanoma ćelije) su skupljene puferom za disocijaciju ćelija na dan testiranja (ili sa tripsinom jedan dan pre početka testa), oprane i ponovo suspendovane u odgovarajući medijum ćelijske kulture (RPMI1640, uključujući 2% FCS i 1% glutamaks). 20 000 - 30 000 ćelija po bunarčiću u je pokriveno pločom sa ravnim dnom i 96 bunarčića, a dodato je odgovarajuće razblaženje antitela kako je naznačeno (triplikati). Dodati su PBMC-i kao efektorske ćelije kako bi se dobilo konačni odnos efektora-ciljane ćelije (E:T) od 10:1. Svi konstrukti i kontrole prilagođeni su istoj molarnosti, inkubaciono vreme je bilo 22 h. Otkrivanje otpuštanja i normalizacije LDH-a vršeno je kao što je gore opisano.

Slika 49 do 52 prikazuje rezultat četiri testa izvedenih sa MV-3 ćelijama melanoma (slika 49), Colo-38 ćelijama (slika 50 i 51) ili WM266-4 ćelijama (Slika 52). Kao što je prikazano na slici 49, konstrukt sa povezanim lakim lancem je bio manje snažan u poređenju sa onim bez povezanog lakog lanca u testu sa MV-3 ćelijama kao ciljnim ćelijama. Kao što je prikazano na slikama 50 i 51, konstrukt sa povezanim lakim lancem je bio jači u odnosu na onaj bez povezanog lakog lanca u testovima sa visokom MCSP ekspresijom Colo-38 ćelija kao ciljnih ćelija. Konačno, kao što je prikazano na slici 52, nije postojala značajna razlika između dva konstrukta kada je MCSP visoko izražen kod upotrebe M266-4 kao ciljnih ćelija.

U drugom eksperimentu, upoređena su dva konstrukta „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ koji ciljaju na CEA, gde je Crosstab fragment u V regionima (VL/VH, pogledajte SEQ ID NO.33, 63, 65, 67) ili C regionima (CL/CH1, pogledajte SEQ ID NO.65, 67, 183, 197). Analiza je izvedena kao što je gore opisano, koristeći ljudski PBMC kao efektorske ćelije i ciljne ćelije koje izražavaju CEA. Ciljne ćelije (MKN-45 ili LS-174T tumorske ćelije) su skupljene sa tripsin-EDTA (LuBiosciences #25300-096), isprane i ponovo suspendovane u RPMI1640 (Invitrogen #42404042), uključujući 1% glutamaksa (LuBiosciences #35050087) i 2% FCS.30 000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića, bispecifični konstrukti su dodati u navedenim koncentracijama. Svi konstrukti i kontrole su prilagođene istoj molarnosti. Dodate su ljudske PBMC efektorske ćelije kako bi se dobio konačni odnos E:T od 10:1, vreme inkubacije je bilo 28 h. EC50 vrednosti izračunate su pomoću softvera GraphPad Prism 5.

Kao što je prikazano na slici 61, konstrukt sa CL/CH1 razmenom pokazuje nešto bolju aktivnost na obe ciljne ćelijske linije od konstrukta sa VL/VH razmenom. Izračunate EC50 vrednosti bile su 115 i 243 pM na MKN-45 ćelijama, a 673 i 955 pM na LS-174T ćelijama, za konstrukt sa CL/CH1 razmenom i VL/VH razmenom, respektivno.

Slično tome, zamenjena su dva konstrukta „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ koji ciljaju na MCSP, gde je Crosstab fragment u V regionima (VL/VH, pogledajte SEQ ID NO. 33, 189, 191, 193) ili C regionima (CL/CH1, pogledajte SEQ ID NO.183, 189, 193, 195). Analiza je izvedena kao što je gore opisano, koristeći ljudske PBMC kao efektorske ćelije i ciljne ćelije koje izražavaju MCSP. Ciljne ćelije (WM266-4) su sakupljene puferom za ćelijsko razdvajanje (LuBiosciences #13151014), oprane i ponovo suspendovane u RPMI1640 (Invitrogen #42404042), uključujući 1% glutamaksa (LuBiosciences #35050087) i 2% FCS.30000 ćelija po bunarčiću je pokriveno u ploču sa okruglim dnom i 96 bunarčića i kontakti su dodati u navedenim koncentracijama. Svi konstrukti i kontrole su prilagođene istoj molarnosti. Dodate su ljudske PBMC efektorske ćelije kako bi se dobio konačni odnos E:T od 10:1, vreme inkubacije je bilo 26 h. EC50 vrednosti izračunate su pomoću softvera GraphPad Prism 5.

Kao što je prikazano na slici 62, dva konstrukta pokazuju uporedivu aktivnost, konstrukt sa CL/CH1 razmenom koja ima nešto nižu EC50 vrednost (12,9 pM za konstrukt sa CL/CH1 razmenom, u poređenju sa 16,8 pM za konstrukt sa VL/VH razmenom).

Slika 63 prikazuje rezultat sličnog testa, izvedenog sa ljudskim MV-3 ciljnim ćelijama koje izražavaju MCSP. Opet, oba konstrukta pokazuju uporedivu aktivnost, konstrukt sa CL/CH1 razmenom koja ima nešto nižu EC50 vrednost (približno 11,7 pM za konstrukt sa CL/CH1 razmenom, u poređenju sa približno 82,2 pM za konstrukt sa VL/VH razmenom). Precizne EC50 vrednosti nisu mogle da se izračunaju, jer krive uništenja nisu dosegle visoravan pri visokim koncentracijama jedinjenja.

U daljem eksperimentu, upoređeni su konstrukti CD3/MCSP „2+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 3, 5, 29, 33) i „1+1 IgG Crossfab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 29, 33, 181) sa CD3/MCSP „1+1 CrossMab“ (pogledajte SEQ ID NO. 5, 23, 183, 185). Analiza je izvedena kako je gore opisano, koristeći ljudske PBMC kao efektorske ćelije i WM266-4 ili MV-3 ciljne ćelije (E:T odnos = 10:1) i inkubaciono vreme od 21 h.

Kao što je prikazano na slici 64, konstrukt „2+1 IgG Crossfab“ je najjači molekul u ovom testu, praćen konstruktima „1+1 IgG Crossfab“ i „1+1 CrossMab“. Ovaj rang je još izraženiji kod MV-3 ćelija, izražavajući srednje nivoe MCSP-a, u poređenju sa visokim MCSP izražavanjem WM266-4 ćelije. Izračunate EC50 vrednosti na MV-3 ćelijama bile su 9,2, 40,9 i 88,4 pM, na WM266-4 ćelijama 33,1, 28,4 i 53,9 pM, za „2+1 IgG Crossfab“, „1+1 IgG Crossfab“ i „1+1 CrossMab“.

U daljem eksperimentu testirane su različite koncentracije konstrukta „1+1 IgG Crossfab LC spajanje“ (SEQ ID NO.183, 209, 211, 213), koristeći tumorske ćelije MKN-45 ili LS-174T i ljudske PBMC efektorske ćelije uz odnos E:T od 10:1 i vreme inkubacije od 28 sati. Kao što je prikazano na slici 65, konstrukt „1+1 IgG Crossfab LC spajanje“ indukovao je apoptozu u MKN-45 ciljnim ćelijama sa izračunatom EC50 od 213 pM, dok je izračunat EC501,56 nM sa LS-174T ćelijama, pokazujući uticaj različitih nivoa ekspresije tumorskih antigena na potenciju bispecifičnih konstrukta u određenom vremenskom periodu.

U još jednom eksperimentu konstrukt „1+1 IgG Crossfab LC spajanje“ (SEQ ID NO.183, 209, 211, 213) upoređivan je sa ne-ciljanim molekulom „2+1 IgG Crossfab“. MC38-huCEA tumorske ćelije i ljudski PBMC (E:T odnos = 10:1) i inkubaciono vreme od 24 časa. Kao što je prikazano na slici 66, konstrukt „1+1 IgG Crossfab LC spajanje“ je indukovao apoptozu ciljnih ćelija zavisno od koncentracije, sa izračunatom EC50 vrednošću od približno 3,2 nM. Za razliku od toga, konstrukt „2+1 IgG Crossfab“ koji nije ciljan je pokazao unštenje ciljanih ćelija posredovanih T ćelijama samo sa najvećom koncentracijom.

U završnom eksperimentu, upoređeni su konstrukti „2+1 IgG Crossfab (V9)“ (SEQ ID NO.

3, 5, 29, 33), „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (V9)“ (SEQ ID NO: 5, 23, 183, 187), „2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)“ (SEQ ID NO.5, 23, 215, 217), „2+1 IgG Crossfab, obrnuto (anti-CD3)“ (SEQ ID NO.

5, 23, 215, 219), korišćenjem ljudskih MCSP-pozitivnih MV-3 ili WM266-4 tumorskih ćelija i humanih PBMC-ova (E:T odnos = 10:1), i inkubacionim vremenom od oko 24 sata. Kao što je prikazano na slici 67, izgleda da je uništenje konstrukata „2+1 IgG Crossfab, obrnuto“ posredovano T-ćelijama nešto brže ili barem jednako onome kojeg izazivaju konstrukti „2 1 IgG Crossfabt“ za oba CD3 veziva. Izračunate EC50 vrednosti bile su sledeće:

Primer 7

CD107a/b test

Prečišćeni konstrukt „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 5, 17, 19) i molekul „(scFv)2“, koji oba ciljaju na ljudski MCSP i ljudski CD3, testirani su protočnom citometrijom za njihov potencijal da unaprede regulaciju CD 107a i intracelularne nivoe perforina u prisustvu ili odsustvu ljudskih MCSP-ekspresionih tumorskih ćelija.

Ukratko, prvog dana, 30000 Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija po bunarčiću je poslagano u ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom i inkubirano preko noći na 37 °C, sa 5% CO2, kako bi se čvrsto zadržalo. Primarne ljudske pan T ćelije su izolovane 1. ili 2. dan od Buffy Coat-a, kako je opisano.

Drugog dana dodato je 0,15 miliona efektorskih ćelija po bunarčiću da bi se dobio konačni odnos E:T od 5:1. Dodata su FITC-konjugovana CD107a/b antitela, kao i različiti bispecifični konstrukti i kontrole. Različiti bispecifični molekuli i antitela prilagođeni su istim molaritetima kako bi se dobila konačna koncentracija od 9,43 nM. Posle koraka inkubacije u trajanju od 1 h na 37 °C, sa 5% CO2, dodat je monensin da inhibira sekreciju, ali i neutrališe pH unutar endozoma i lizozoma. Posle dodatnog vremena inkubacije u trajanju od 5 h, ćelije su obojene na 4 °C tokom 30 min. za površinsku CD8 ekspresiju. Ćelije su isprane puferom za bojenje (PBS/ 0,1% BSA), fiksirane i permeabilizirane 20 min koristeći BD Cytofix / Cytoperm Plus Komplet sa BD Golgi Stop (BD Biosciences # 554715). Ćelije su isprane dva puta korišćenjem 1 x BD perm/Pufera za pranje, a intracelularno bojenje za perforin je izvršeno na 4°C tokom 30 min. Posle završnog pranja sa 1 x BD perm/puferom za pranje, ćelije su resuspendovane u PBS / 0,1% BSA i analizirane na FACS CantoII (sva antitela su kupljena od BD Biosciences ili BioLegend).

Kapije su postavljene ili na svim CD107a / b pozitivnim, perforin pozitivnim ili dvostrukim pozitivnim ćelijama, kako je naznačeno (Slika 43). Konstrukt „2+1 IgG scFab“ bio je u mogućnosti da aktivira T ćelije i reguliše nivo CD107a / b i intracelularne nivoe perforina samo u prisustvu ciljnih ćelija (slika 43A), dok molekul „(scFv)2“ pokazuje (slabu) indukciju aktivacije T ćelija takođe u odsustvu ciljnih ćelija (slika 43B). Bivalentni referentni anti-CD3 IgG rezultira u nižim nivoima aktivacije u poređenju sa molekulom „(scFv)2“ ili drugim bispecifičnim konstruktom.

Primer 8

Analiza proliferacije

Prečišćeni „2+1 IgG scFab“ (SEQ ID NO. 5, 17, 19) i „(scFv)2“ molekuli, koji ciljaju na ljudski CD3 i ljudski MCSP, testirani su protočnom citometrijom za njihov potencijal da indukuju proliferaciju CD8<+>ili CD4<+>T ćelije u prisustvu i odsustvu ljudskih MCSP-ekspresionih tumorskih ćelija.

Ukratko, sveže izolovane ljudske pan T ćelije su prilagođene na 1 milion ćelija po ml u toplom PBS-u i obojene sa 1 µM CFSE na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Zapremina bojenja je udvostručena dodatkom RPMI1640 medija, koji sadrži 10% FCS i 1% GlutaMax-a. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi još 20 min, ćelije su isprane tri puta sa prethodno zagrejanim medijumom da bi se uklonio preostali CFSE. MCSP-pozitivne Colo-38 ćelije su sakupljene puferom za uklanjanje ćelija, prebrojane i proverene za održivost. Ćelije su prilagođene na 0,2 x 10<6>(održive) ćelije po ml u AIM-V medijumu, 100 µl ove suspenzije ćelija je pipetirano po bunarčiću u ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (kako je navedeno). 50 µl (razblaženih) bispecifičnih konstrukata dodato je u bunarčiće koji sadrže ćelije da bi se dobila konačna koncentracija od 1 nM. CFSE obojene ljudske pan T ćelije efektora prilagođene su na 2 x 10<6>(održive) ćelije po ml u AIM-V medijumu. 50 µl ove suspenzije ćelije je dodato po bunarčiću testne ploče (pogledaj u prethodnom tekstu) kako bi se dobio konačni E:T odnos od 5:1. Da bi se analiziralo da li bispecifični konstrukti mogu aktivirati T ćelije samo u prisustvu ciljnih ćelija, izražavajući tumorski antigen huMCSP, uključeni su i bunarčići koji sadrže 1 nM odgovarajućih bispecifičnih molekula, kao i PBMC, ali bez ciljnih ćelija. Nakon inkubacije u trajanju od pet dana na 37 °C, sa 5% CO2, ćelije su centrifugirane (5 min, 350 x g) i isprane dvaput sa 150 µl/bunarčić PBSa, uključujući 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (mišji IgG1,k; klon HIT8a, BD # 555635), CD4 (IgG1miša,k; klon RPA-T4, BD # 560649) ili CD25 (mišji IgG1,k; klon M-A251; BD # 555434) izvršeno je na temperaturi od 4 °C u trajanju od 30 min, prema predlozima dobavljača. Ćelije su isprane dvaput sa 150 µl/bunarčić PBS-a koji sadrži 0,1% BSA, resuspendovane u 200 µl/bunarčić PBS-a sa 0,1% BSA, i analizirane pomoću mašine FACS CantoII (softver FACS Diva). Relativni nivo proliferacije određen je postavljanjem kapije oko ćelija koje nisu proliferujuće i korišćenjem broja ćelija ove kapije u odnosu na ukupan broj izmerenih ćelija kao referenca.

Slika 44 pokazuje da svi konstrukti indukuju proliferaciju CD8<+>T ćelija (A) ili CD4<+>T ćelija (B) samo u prisustvu ciljnih ćelija, uporedno sa molekulom „(scFv)2“. Generalno, aktivirane CD8<+>T ćelije proliferišu više od aktiviranih CD4<+>T ćelija u ovom testu.

Primer 9

Ispitivanje sprovođenja citokina

Pročišćeni konstrukt „2 1 IgG scFab“ (SEQ ID NO.5, 17, 19) i molekul „(scFv)2“, koji su ciljali ljudsku MCSP i ljudsku CD3, analizirani su zbog njihove sposobnosti da indukuju T-ćelijski posredovano de novo lučenje citokina u prisustvu ili odsustvu ćelija ciljanih tumora.

Ukratko, ljudski PBMC bili su izolovani od Buffy Coats-a, a 0,3 miliona ćelija je pokriveno po bunarčićima u ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Ciljne ćelije tumora Colo-38, koje izražavaju ljudski MCSP, dodate su da bi se dobio konačni E: T-odnos od 10: 1. Bispecifični konstrukti i IgG kontrole dodate su u konačnoj koncentraciji od 1 nM i ćelije su inkubirane tokom 24 h na 37 °C, sa 5% CO2. Sledećeg dana, ćelije su centrifugirane 5 min. na 350 x g, a supernatant je prebačen u novu ploču sa 96 dubokih bunarčića za narednu analizu. CBA analiza je obavljena u skladu sa uputstvima proizvođača za FACS CantoII, koristeći opremu za ljudski Th1/Th2 citokin II (BD #551809).

Slika 45 prikazuje nivoe različitih citokina izmerenih u supernatantu. U prisustvu ciljnih ćelija, glavni citokin koji se sekretira nakon aktivacije T ćelija je IFN-γ. Molekul „(scFv)2“ indukuje nešto viši nivo IFN-γ-a od konstrukcije „2+1 IgG scFab“. Ista tendencija može se naći kod ljudskog TNF-a, ali ukupni nivoi ovog citokina bili su znatno niži u odnosu na IFN-γ. Nije bilo značajnog lučenja Th2 citokina (IL-10 i IL-4) nakon aktivacije T ćelija u prisustvu (ili odsustvu) ciljnih ćelija. U odsustvu ciljnih ćelija Colo-38, primećena je samo vrlo slaba indukcija TNF sekrecije, što je najviša kod uzoraka tretiranih sa molekulom „(scFv)2“.

U drugom eksperimentu analizirani su sledeći prečišćeni bispecifični konstrukti koji ciljaju ljudski MCSP i ljudski CD3: konstrukt „2+1 IgG Crossfab“ (SEQ ID NO.3, 5, 29, 33), molekula „(scFv)2“ kao i različiti „2+1 IgG scFab“ molekuli koji sadrže ili divlji ili mutirani (LALA, P329G i / ili N297D, kao što je naznačeno) domen Fc. Ukratko, 280 µl cele krvi zdravog donatora pokriveno pločom sa 96 dubokih bunarčića. 30 000 Colo-38 tumorskih ciljnih ćelija, koje izražavaju ljudski MCSP, kao i različiti bispecifični konstrukti i IgG kontrole dodati su na konačnu koncentraciju 1 nM. Ćelije su inkubirane tokom 24 h na 37 °C, sa 5% CO2i zatim centrifugirane 5 min. na 350 x g. Supernatant je prebačen u novu ploču sa 96 dubokih bunarčića za kasniju analizu. CBA analiza je izvedena u skladu sa uputstvima proizvođača za FACS CantoII, koristeći kombinaciju sljedećih CBA Flex setova: ljudski granzim B (BD #560304), ljudski IFN-γ Flex set (BD #558269), ljudski TNF Flex set (BD #558273), ljudski IL-10 Flex set (BD #558274), ljudski IL-6 Flex set (BD #558276), ljudski IL-4 Flex set (BD #558272), ljudski IL-2 Flex set (BD #558270 ).

Slika 46 prikazuje nivoe različitih citokina izmerenih u supernatantu. Glavni citokin koji je sekretiran u prisustvu Colo-38 tumorskih ćelija bio je IL-6, praćen IFN-γ. Pored toga, nivoi granzyma B se značajno povećavaju nakon aktivacije T ćelija u prisustvu ciljnih ćelija. Generalno, molekul „(scFv)2“ je indukovao veće nivoe sekrecije citokina u prisustvu ciljnih ćelija (slika 46, A i B). Nije bilo značajnog lučenja Th2 citokina (IL-10 i IL-4) nakon aktivacije T ćelija u prisustvu (ili odsustvu) ciljnih ćelija.

U ovom testu došlo je do slabog lučenja IFN-γ, indukovane različitim konstruktima „2+1 IgG scFab“, čak i u odsustvu ciljnih ćelija (slika 46, C i D). U ovim uslovima, između konstrukata „2+1 IgG scFab“ nije mogla da se primeti značajna razlika sa divljim ili mutiranim Fc domenom.

LISTA SEKVENCI

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija koji sadrži vezujući deo prvog i drugog antigena, od kojih je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za aktivirajući T ćelijski antigen, a drugi od kojih je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za ciljani ćelijski antigen i Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje;

pri čemu je vezujući deo prvog antigena prenosni Fab molekul u kome se razmenjuju varijabilna ili konstantna područja lakog Fab lanca i teškog Fab lanca; pri čemu je vezujući deo prvog i drugog antigena fuzionisan jedan sa drugim, po izboru peptidnom spojnicom; i

pri čemu bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija sadrži ne više od jednog vezujućeg dela antigena sposobnog za specifično vezivanje za aktivirajući T ćelijski antigen.

2. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema zahtevu 1, pri čemu je drugi vezujući antigen fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, pri čemu su po izboru

i) laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena fuzionisani jedan sa drugim, po izboru preko peptidnog spojnice; i/ili

ii) prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

3. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema zahtevu 1, pri čemu je prvi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminus teškog Fab lanca za N-terminu teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena, pri čemu su po izboru

i) laki Fab lanac prvog vezujućeg dela antigena i laki Fab lanac drugog vezujućeg dela antigena fuzionisan jedan sa drugim, po izboru preko peptidnog spojnice; i/ili

ii) pri čemu je drugi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

4. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema zahtevu 1, pri čemu je drugi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu lakog Fab lanca za N-terminus lakog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena, i pri čemu je po izboru drugi vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena.

5. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji sadrži treći vezujući deo antigena za koji je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, pri čemu je po izboru treći vezujući deo antigena fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus prve ili druge podjedinice Fc domena, i pri čemu se po izboru

i) drugi i treći vezujući deo antigena fuzionišu na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, a prvi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca drugog vezujućeg dela antigena; ili ii) prvi i treći vezujući deo antigena su fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus jedne od podjedinica Fc domena, a drugi vezujući deo antigena je fuzionisan na C-terminusu teškog Fab lanca za N-terminus teškog Fab lanca prvog vezujućeg dela antigena.

6. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu

i) bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija je kao što je definisano u zahtevu 5 (i) i pri čemu je drugi i treći deo za vezivanje antigena i Fc domena deo molekula imunoglobulina, posebno imunoglobulina IgG klase;

ii) domen Fc je IgG, posebno IgG1ili IgG4, Fc domen;

iii) domen Fc je ljudski Fc domen; i/ili

v) Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena, pri čemu je po izboru u domenu CH3prve podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostacima koji imaju veći volumen bočnog lanca, čime se generiše protuberancija unutar CH3domena prve podjedinice koja se može postaviti u šupljinu unutar CH3domena druge podjedinice, a u domenu CH3druge podjedinice Fc domena ostatak amino kiseline je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3domena druge podjedinice u okviru koje se može postaviti protuberancija CH3domena prve podjedinice.

7. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu

i) Fc domen pokazuje smanjen vezujući afinitet na Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa prirodnim IgG1Fc domenom;

ii) domen Fc sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koja smanjuju vezivanje za Fc receptor i / ili efektorsku funkciju;

iii) domen Fc sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koja smanjuju vezivanje za Fc receptor i / ili efektorsku funkciju, pri čemu je navedena jedna ili više supstitucija aminokiselina na jednoj ili više pozicija odabrana iz grupa L234, L235 i P329 (Brojanje u EU); i / ili

(iv) svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i / ili efektorsku funkciju, pri čemu su navedene supstitucije aminokiselina L234A, L235A i P329G (EU brojanje).

8. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema zahtevu 7, pri čemu

i) Fc receptor je Fcγ receptor; ili

ii) efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

9. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu

i) aktivni T ćelijski antigen je CD3; i / ili

i) ciljani ćelijski antigen je izabran iz grupe koju čine: Melanomom-vezani hondroitinsulfat proteoglikanin (MCSP), Epidermalni receptor faktora rasta (EGFR), CD19, CD20, CD33, Karcinoembrionski antigen (CEA) i Fibroblast aktivacijski protein (FAP).

10. Izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

11. Postupak za proizvodnju bispecifičnog vezujućeg molekula antigena za aktivaciju T ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koji obuhvata korake a) kultivacije ćelije domaćina koja sadrži izolovani polinukleotid iz zahteva 10 ili vektor koji sadrži izolovani polinukleotid iz zahteva 10, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog vezujućeg molekula antigena koji aktivira T ćelije i b) obnavljanje bispecifičnog vezujućeg molekula antigena koji aktivira T ćelije.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Bispecifični molekul koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 9 ili farmaceutski sastav prema zahtevu 12

i) za upotrebu kao lek;

ii) za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno;

iii) za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno, pri čemu je bolest rak; ili

iv) za upotrebu u postupku indukcije lize ciljne ćelije kod pojedinca, koji obuhvata kontaktiranje ciljne ćelije sa bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen za aktiviranje T ćelija u prisustvu T ćelije, pri čemu je ciljna ćelija tumorska ćelija.