RS57004B1 - Novi derivat analoga insulina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak daje novi derivat analoga humanog insulina, koristan za lečenje dijabetesa.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Insulin je polipeptidni hormon koji izlučuju β-ćelije pankreasa. Insulin se sastoji od dva polipeptidna lanca označena kao A i B lanci koji su vezani zajedno sa dva inter-lančana disulfidna mosta. Kod humanog, svinjskog i goveđeg insulina, A i B lanci sadrže 21 i 30 aminokiselinskih ostataka, respektivno. Međutim, od vrste do vrste, postoje varijacije između aminokiselinskih ostataka prisutnih na različitim položajima u dva lanca. Široko rasprostranjena upotreba genetičkog inženjeringa je omogućila pripremu analoga prirodnih insulina razmenom, delecijom i adicijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Insulin je korišćen za lečenje dijabetesa i bolesti povezanih sa njim ili koje su njegov rezultat.

[0003] Decenijama, preparati insulina sa različitim trajanjem dejstva su razvijani i postavljani na tržište i opšti primeri takvih preparata su preparati insulina sa dugotrajnim dejstvom, preparati insulina sa srednjim dejstvom i preparati insulina sa brzim dejstvom. Mnogi pacijenti primaju 2-4 injekcije na dan, svake nedelje, svakog meseca i svake godine, izborno decencijama. Do danas nisu odobreni nikakvi bazalni proizvodi insulina za primenu ređe od dnevne subkutane injekcije. Nelagodnost velikog broja dnevnih injekcija se može, na primer, smanjiti upotrebom derivata insulina koji imaju ekstremno dugo trajanje dejstva.

[0004] Različite patentne prijave uključujući WO 2010/049488 i WO 2011/161125 navode mogućnost primene derivata insulina sa dugim intervalima. WO 2009/115469 se odnosi na određene acilovane insuline stabilizovane proteazom u kojima je najmanje jedna hidrofobna aminokiselina supstituisana sa hidrofilnim aminokiselinama.

[0005] Bilo bi veoma poželjno za pacijente sa dijabetesom, ako bi bili dostupni bazalni preparati insulina za primenu približno jednom nedeljno.

CILJEVI PRONALASKA

[0006] Cilj ovog pronalaska je definisan u patentnim zahtevima. Jedan aspekt je da se prevaziđe ili poboljša najmanje jedan od nedostataka stanja tehnike, ili da se obezbedi korisna alternativa.

[0007] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina sa dugim farmakokinetičkim (u daljem tekstu PK) profilima, npr. tako da će subkutani tretman jednom nedeljno ili ređe biti zadovoljavajući tretman dijabetičkog pacijenta kod koga postoji potreba za bazalnim insulinskim tretmanom.

[0008] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina sa dugim PK profilima, npr. PK profilima koji su duži od PK profila humanog insulina, posle subkutane primene. S tim u vezi, PK profil može biti određen kao što je objašnjeno u Primerima 5 i 6 ovde.

[0009] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju visoku rastvorljivost u vodenom medijumu koji izborno sadrži cink, npr. rastvorljivost koja je viša od rastvorljivosti humanog insulina. S tim u vezi, rastvorljivost može biti određena kao što je objašnjeno u Primeru 7 ovde.

[0010] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji su rastvorljivi u vodenom medijumu koji sadrži cink, kao što je najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina, kada je meren posle čuvanja najmanje 4 nedelje na 37°C ili niže posle pripreme. S tim u vezi, rastvorljivost može npr. biti određena kao što je objašnjeno u Primeru 7 ovde.

[0011] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji su rastvorljivi u vodenom medijumu koji sadrži cink, kao što je najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina, kada je meren u roku od 24-48 časova posle pripreme. S tim u vezi, rastvorljivost može npr. biti određena kao što je objašnjeno u Primeru 7 ovde.

[0012] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju dobru rastvorljivost prema enzimima, npr. proteolitičkim enzimima, npr. proteolitičkim enizimima prisutnim u ljudskom želudcu, npr. pepsin, himotripsin i karboksipeptidaza A. S tim u vezi, stabilnost prema enzimima može biti određena kao što je objašnjeno u Primeru 1 u WO 2008/034881.

[0013] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju dobru stabilnost, naročito hemijsku stabilnost i fizičku stabilnost, prilikom čuvanja, npr. čuvanja na 5°C i na 30°C, u trajanju od npr. 2 godine i 2 nedelje, respektivno. S tim u vezi, hemijska stabilnost može biti određena kao što je objašnjeno u Primerima 9 i 10 ovde i fizička stabilnost može biti određena kao što je objašnjeno u Primerima 9 i 10 ovde.

[0014] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji mogu efikasno biti primenjivani oralno, npr. jednom dnevno, na dijabetičke pacijente. Takođe, ili alternativno, ovaj pronalazak se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju visoku oralnu biodostupnost.

[0015] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju snižene dnevne fluktuacije, npr. varijacije između koncentracija u plazmi (Cmaxi Cmin) posle, npr. subkutane primene od jednom nedeljno.

[0016] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju sniženi uticaj na varijaciju iz dana u dan u biodostupnosti posle oralne primene.

[0017] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju visoku potenciju, tj. izazivaju veliki odgovor na niskoj koncentraciji leka, (aktivnost leka izražena prema količini potrebnoj za proizvodnju efekta datog intenziteta).

[0018] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji se veoma dobro vezuju za receptor insulina. S tim u vezi, afinitet receptora insulina može biti određen kao što je objašnjeno u Primeru 2 ovde.

[0019] Sledeći aspekt se odnosi na obezbeđivanje derivata insulina koji imaju niski afinitet za receptor insulina. S tim u vezi, afinitet receptora insulina može biti određen kao što je objašnjeno u Primeru 2 ovde.

DEFINICIJE

[0020] Termin "dijabetes" ili "dijabetes melitus" obuhvata dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, gestacioni dijabetes (u toku trudnoće) i druga stanja koja izazivaju hiperglikemiju. Ovaj termin je korišćen za metabolički poremećaj u kome pankreas proizvodi nedovoljne količine insulina, ili u kome ćelije tela ne uspevaju da na odgovarajući način odgovore na insulin na taj način sprečavajući da ćelije apsorbuju glukozu. Kao rezultat, glukoza se koncentriše u krvi.

[0021] Dijabetes tipa 1, takođe označen kao insulin-zavisni dijabetes melitus (IDDM) i juvenilni dijabetes, je uzrokovan uništavanjem B-ćelija, što obično dovodi do apsolutne deficijencije insulina. Dijabetes tipa 2, takođe poznat kao ne-insulin-zavisni dijabetes melitus (NIDDM) i adultni dijabetes, je povezan sa predominantnom insulinskom rezistencijom i na taj način relativna deficijencija insulina i/ili predominantan defekt sekrecije insulina sa insulinskom rezistencijom.

[0022] Ovde, imenovanje insulina je izvedeno prema sledećim principima: Nazivi su dati kao mutacije i modifikacije (acilacije) u odnosu na humani insulin. Za imenovanje acil grupe, imenovanje je izvedeno prema IUPAC nomenklaturi i u drugim slučajevima kao peptidna nomenklatura. Na primer, imjenovanje acil grupe:

može na primer biti imenovana kao "ejkozandioil-γGlu-OEG-OEG", "ejkozandioil-γGlu-2xOEG" ili, "ejkozandioil-gGlu-2xOEG" ili "19-karboksinonadekanoil-γGlu-OEG-OEG", gde je OEG je kratka oznaka za aminokiselinu NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H, [2-(2-aminoetoksi)etoksi]sirćetnu kiselinu i γGlu (i gGlu) je kratka oznaka za aminokiselinu gama glutaminsku kiselinu u L-konfiguraciji. Alternativno, acil grupa može biti imenovana prema IUPAC nomenklaturi (OpenEye, IUPAC stil). Prema ovoj nomenklaturi, gore navedenoj acil grupi prema pronalasku je dodeljen sledeći naziv: [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]-etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil].

[0023] Na primer, insulin iz Primera 1 (sa sekvencom/strukturom datom u daljem tekstu) je imenovan kao "A14E, B16E, B25H, B29K(NεEjkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin" da bi se naznačilo da je aminokiselina na položaju A14, Y u humanom insulinu, mutirana u E, aminokiselina na položaju B16, Y u humanom insulinu, je mutirana u E, aminokiselina na položaju B25, F u humanom insulinu, je mutirana u H, aminokiselina na položaju B29, K kao u humanom insulinu, je modifikovana acilacijom na epsilon azotu u lizinskom ostatku B29, označen kao N<ε>, ostatkom ejkozandioil-gGlu-2xOEG, i deletirana je aminokiselina na položaju B30, T u humanom insulinu.

[0024] Zvezdica u formuli u daljem tekstu označava da je dotični ostatak različit (tj. mutiran) u poređenju sa humanim insulinom.

[0025] Alternativno, insulini prema pronalasku mogu biti imenovani prema IUPAC nomenklaturi (OpenEye, IUPAC stil). Prema ovoj nomenklaturi, insulinu iz Primera 1 (tj. jedinjenju 1) je dodeljen sledeći naziv: N{Epsilon-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]-etoksi]acetil]amino]etoksi] etoksi]acetil]-[GluA14,GluB16,HisB25],des-ThrB30-Insulin(humani).

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0026] Ovaj pronalazak se odnosi na derivat analoga insulina, tj. A14E, B16E, B25H, B29K(N(eps)ejkozandioilgGlu-2xOEG), desB30 humani insulin (jedinjenje 1).

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

[0027] Iznenađujuće je nađeno da A14E, B16E, B25H, B29K(N(eps)ejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin ispunjava gore navedene ciljeve do dovoljnog stepena. Na primer, subkutani tretman sa jedinjenjem 1 jednom nedeljno ili ređe će biti zadovoljavajući tretman za dijabtičkog pacijenta kod koga postoji potreba za tretmanom bazalnim insulinom. Pored toga, jedinjenje 1 ima visoku rastvorljivost u vodenom medijumu koji izborno sadrži cink. U jednom aspektu, jedinjenje 1 ima rastvorljivost koja je veća od rastvorljivosti humanog insulina.

[0028] U jednom aspektu, jedinjenje 1 je rastvorljivo u vodenom medijumu koji sadrži cink kao što je najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 6 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 7 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 8 jona cinka po heksameru insulina ili najmanje 9 jona cinka po heksameru insulina, pri čemu je rastvorljivost merena posle čuvanja najmanje 4 nedelje na 37°C ili niže posle pripreme.

[0029] U jednom aspektu pronalaska, jedinjenje 1 je rastvorljivo u vodenom medijumu koji sadrži cink kao što je najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 6 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 7 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 8 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 9 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 10 jona cinka po heksameru insulina, najmanje 11 jona cinka po heksameru insulina ili najmanje 12 jona cinka po heksameru insulina, pri čemu se rastvorljivost meri u roku od 24-48 časova posle pripreme.

[0030] U jednom aspektu, rastvorljivost je određena kao što je objašnjeno u Primeru 7 ovde.

[0031] Farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje 1 mogu biti pripremljene na način koji je poznat per se, tj., upotrebom ekscipijenasa koji se obično koriste u sličnim kompozicijama insulina.

[0032] Injektabilne farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje 1 mogu biti pripremljene upotrebom uobičajenih tehnika farmaceutske industrije koje obuhvataju rastvaranje i mešanje sastojaka na odgovarajući način da bi se dobio željeni krajnji proizvod. Na taj način, prema jednom postupku, jedinjenje 1 je rastvoreno u količini vode koja je donekle manja od krajnje zapremine farmaceutske kompozicije koja se priprema. Izotonično sredstvo, konzervans i pufer se dodaju prema potrebi i pH vrednost rastvora je podešena, ako je neophodno, upotrebom kiseline, na primer, hlorovodonične kiseline, ili baze, na primer, vodenog rastvora natrijum hidroksida, prema potrebi. Konačno, zapremina rastvora je podešena vodom da bi se dobila željena koncentracija sastojaka.

[0033] Tačnije, preparat insulina prema ovom pronalasku, na primer rastvor, može biti pripremljen rastvaranjem jedinjenja 1 u vodenom medijumu u slabo kiselim uslovima. Vodeni medijum je npr. napravljen izotoničnim dodavanjem sredstva za podešavanje toničnosti. Pored toga, vodeni medijum može da sadrži npr. pufere, konzervanse i jone cinka. pH vrednost rastvora je podešena prema neutralnosti bez dolaženja preblizu izoelektrične tačke jedinjenja ovog pronalaska u cilju izbegavanja potencijalnog taloženja. pH vrednost kranjeg preparata insulina zavisi od koncentracije jona cinka, i koncentracije jedinjenja ovog pronalaska. Preparat insulina je napravljen sterilnim, na primer, sterilnom filtracijom.

[0034] Farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više ekscipijenasa.

[0035] Termin "ekscipijens" široko se odnosi na bilo koju komponentu osim aktivnog terapeutskog sastojka (sastojaka). Ekscipijens može biti inertna supstranca, neaktivna supstanca i/ili ne medicinski aktivna supstanca.

[0036] Ekscipijens može da služi različitim svrhama u zavisnosti od farmaceutske kompozicije, npr. kao nosač, vehikulum, razblaživač, pomoćno sredstvo za tabelatiranje i/ili za poboljšanje primene, i/ili apsorpcije aktivne supstance. Primeri ekscipijenasa obuhvataju, ali bez ograničenja na, razblaživače, pufere, konzervanse, sredstva za regulaciju toničnosti (takođe poznata kao tonična sredstva ili izotonična sredstva), helatirajuća sredstva, surfaktante, inhibitore protezae, sredstva za vlaženje, emulgatore, antioksidanse, sredstva za dopunjavanje, jone metala, uljane vehikulume, proteine i/ili cviterjone i stablizatore.

[0037] Farmaceutska kompozicija farmaceutski aktivnih sasstojaka sa različitim ekscipijensima je poznata u stanju tehnike, videti npr. Remington: The Science i Practice of Pharmacy (npr.19th edition (1995), i bilo koja kasnija izdanja).

[0038] Kompozicije insulina se primenjuju na pacijente na način poznat per se, npr. prema opštem znanju o pacijentu u kombinaciji sa opštim znanjem lekara. Ovaj pronalazak je najbolje korišćen kada je pogodno pacijentu. Prema tome, specifični intervali primene biće istraženi za svakog pacijenta gde se doze primenjuju manje od dnevno. Krajnji režim upotrebe na taj način zavisi od sposobnosti proizvoda i od dispozicije i preferencije pacijenta. Ovo je posledica činjenice da efekat bilo kog proizvoda insulina zavisi od potrebe pojedinačnog pacijenta za insulinom i osetljivosti na farmakodinamičke aktivnosti navedenog insulina i konačno takođe preferenci pacijenta u datoj situaciji. Ovi uslovi mogu da se menjaju tokom vremena, kako prema dužim periodima (godine) i iz dana u dan. Optimalni nivo doze za svakog pacijenta zavisiće od različitih faktora uključujući starost, telesnu težinu, fizičku aktivnost i ishranu pacijenta, od moguće kombinacije sa drugim lekovima, i od težine stanja koje se leči. Preporučeno je da režim doziranja može biti određen za svakog pojedinačnog pacijenta od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike na sličan način kao za poznate kompozicije insulina, međutim uzimajući u razmatranje predmetne navode koji se odnose na intervale doziranja.

[0039] Za pogodnost pacijenta, pretpostavlja se da oni preferiraju da vremenski interval (kašnjenje) od primene jedinjenja 1 do sledeće primene jedinjenja 1 ima istu dužinu, ili približno istu dužinu, brojanu u broju dana. Čak se može očekivati da će pacijenti preferirati da se primena jedinjenja 1 odigrava jednom nedeljno, tj., istog dana u nedelji, npr. svake nedelje. Ovo će biti primena jedinjenja 1 svakog 7-og dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za neke pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog 6-og dana ili približno svakog 6-og dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za druge pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog 5-og dana ili približno svakog 5-og dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za druge pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog 4-og dana ili približno svakog 4-og dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Čak drugi pacijenti mogu naći da je povoljno primenjivati jedinjenje 1 dva puta nedeljno, npr. sa intervalom od oko 3-4 dana između svake primene u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za neke pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog 3-eg dana ili približno svakog 3-eg dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za druge pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog drugog dana ili približno svakog drugog dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Za neke pacijente, može biti poželjno primenjivati jedinjenje 1 svakog 8-og dana ili približno svakog 8-og dana i ne češće u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu. Čak drugi pacijenti mogu da ne primenjuju jedinjenje 1 sa vremenskim intervalom tačno iste dužine (brojanim u danima), nedelju za nedeljom, mesec za mesecom ili godinu za godinom. Neki pacijenti mogu da primenjuju jedinjenje 1 nekada u vremenskom intervalu od svakog 6-og do svakog 8-og dana u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu i ne češće. Drugi pacijenti mogu da primenjuju jedinjenje 1 nekada u vremenskom intervalu od svakog 5-og do svakog 7-og dana u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu i ne češće. Čak drugi pacijenti mogu da primenjuju jedinjenje 1 nekada u vremenskom intervalu od svakog 4-og do svakog 8-og dana u proseku izračunatom za vremenski period od 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu i ne češće. Vremenski intervali navedeni ovde trebalo bi da se shvate kao prosečni vremenski intervali unutar vremenskih perioda od više nedelja, meseci ili godina. Ovde, namenjeno je da termin "dan" pokriva 24 časa (tj., dan i noć) i, i radi lakoće, broj časova koji se ne deli sa 24 trebalo bi da se zaokruži do celog broja dana. Stoga, npr.30 časova odgovara 1 danu i 40 časova što odgovara 2 dana. Gore navedene primene su parenteralne.

[0040] Pacijenti mogu imati dnevnu potrebu za bazalnim insulinom od iznad oko 0.2 IU/kg telesne težine/dan i ispod oko 1 IU/kg telesne težine/dan i, pored toga, pacijenti mogu imati ukupnu (tj., bazalnu plus prandijalnu) dnevnu potrebu za insulinom od iznad oko 1 IU/kg telesne težine/dan. Međutim, ovi opsezi mogu da variraju značajno od pacijenta do pacijenta i mogu za nekoliko pacijenata biti donekle izvan opsega navedenih ovde.

[0041] Bolesti i stanja koja su primarna ciljna mesta ovog pronalaska su dijabetes melitus (tip 1 ili 2) ili druga stanja okarakterisana hiperglikemijom, ali takođe metaboličke bolesti i stanja generalno gde metabolički efekti insulina imaju kliničku relevantnost ili su od interesa, kao što je pre-dijabetes, smanjena tolerancija glukoze, metabolički sindrom, gojaznost, kaheksija, in vivo gubitak/smrt beta-ćelija, prekomerni appetit i inflamacija. Svi ovi tipovi stanja su poznati ili se veruje da imaju koristi od stabilnog metaboličkog stanja kod subjekta koji ima bolest ili stanje. Na bilo kojoj stopi, svaki terapeutski režim gde je uključena primena insulina može biti modifikovan implementacijom sadašnjih navoda, što znači da će takve terapije obuhvatati primenu insulina sa produženim profilom delovanja prema navodima koji su ovde dati.

[0042] Jedinjenje 1 može biti primenjivano parenteralno na pacijente kod kojih postoji potreba za takvim tretmanom. Parenteralna primena može biti izvedena subkutanom, intramuskularnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, izborno šprica nalik olovci.

Alternativno, parenteralna primena može biti izevdena pomoću infuzione pumpe. Dodatne opcije su primena kompozicije insulina oralno, nazalno ili pulmonalno, poželjno u farmaceutskim kompozicijama, praškovima ili tečnostima, specifično dizajniranim za dotičnu svrhu.

[0043] Alternativno, jedinjenje 1 može biti primenjivano oralno na pacijente kod kojih postoji potreba za takvim tretmanom. Oralna primena može biti izvedena oralnom primenom čvrstih, polu-čvrstih ili tečnih farmaceutskih kompozicija.

POŽELJNE KARAKTERISTIKE OVOG PRONALASKA

[0044] Da sumirano i dopunimo gore navedene izjave, karakteristike i klauzule ovog pronalaska su kao što sledi:

1. A14E, B16E, B25H, B29K(N(eps)ejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin (jedinjenje 1).

2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje 1.

3. Jedinjenje 1 za upotrebu kao lek.

4. Jedinjenje 1 za upotrebu u pripremi farmaceutske kompozicije za lečenje ili prevenciju dijabetesa.

5. Jedinjenje 1 za upotrebu u pripremi farmaceutske kompozicije za lečenje ili prevenciju dijabetesa tipa 1 i/ili tipa 2.

6. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano na istog pacijenta svakog 2-og dana ili ređe i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

7. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 3-eg dana ili ređe, i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

8. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano dva puta nedeljno ili ređe, i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

9. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 4-og dana ili ređe, i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

1

10. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 5-og dana ili ređe, i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

11. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 6-og dana ili ređe i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

12. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano jednom nedeljno ili ređe i, u proseku, u toku vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godinu, navedeno jedinjenje nije primenjivano češće na istog pacijenta.

13. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 8-og dana ili češće.

14. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 9-og dana ili češće.

15. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 10-og dana ili češće.

16. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 11-og dana ili češće.

17. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 12-og dana ili češće.

18. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 14-og dana ili češće.

19. Jedinjenje 1 za upotrebu u lečenju dijabetesa, pri čemu je jedinjenje primenjivano svakog 21-og dana ili češće.

20. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 6-19, pri čemu trenutni ili ponavljani tretman traje više od 1 meseca.

21. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 6-19, pri čemu trenutni ili ponavljani tretman traje više od 2 meseca.

22. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 6-19, pri čemu trenutni ili ponavljani tretman traje više od 3 meseca.

23. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 6-19, pri čemu trenutni ili ponavljani tretman traje više od 1 godine (jedne godine).

24. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 2-23, pri čemu je jedinjenje primenjeno parenteralno, poželjno subkutano, intramuskularno ili intravenski.

25. Jedinjenje 1 prema bilo kojoj od klauzula 2-23, pri čemu je jedinjenje primenjeno oralno.

26. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1.

27. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina. 28. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 6 jona cinka po heksameru insulina. 29. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 7 jona cinka po heksameru insulina. 30. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 8 jona cinka po heksameru insulina. 31. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 9 jona cinka po heksameru insulina. 32. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 10 jona cinka po heksameru insulina. 33. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 11 jona cinka po heksameru insulina. 34. Vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje 1 i najmanje 12 jona cinka po heksameru insulina. 35. Vodeni rastvor prema bilo kojoj od klauzula 47-55, pri čemu je pH u opsegu od 7 do 8. 36. Vodeni rastvor prema bilo kojoj od klauzula 47-55, pri čemu je pH oko 7.4.

37. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje 1, i jedan ili više ekscipijenasa.

38. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje 1, i jedan ili više ekscipijenasa izabranih iz grupe koja se sastoj od razblaživača, pufera, konzervansa, sredstava za regulaciju toničnosti helatirajućih sredstava, surfaktanata, inhibitora proteaze, sredstava za vlaženje, emulgatora, antioksidanata, sredstava za dopunjavanje, jona metala, uljanih vehikuluma, proteina i/ili cviterjona i stablizatora.

39. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 4.5 jona cinka po heksameru insulina.

40. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina.

41. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 6 jona cinka po heksameru insulina.

42. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 7 jona cinka po heksameru insulina.

43. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 8 jona cinka po heksameru insulina.

44. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 9 jona cinka po heksameru insulina.

45. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 10 jona cinka po heksameru insulina.

46. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 11 jona cinka po heksameru insulina.

47. Farmaceutska kompozicija prema klauzuli 59, koja sadrži najmanje 12 jona cinka po heksameru insulina.

48. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 59-68, pri čemu je pH u opsegu od 7 do 8.

49. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 59-68, pri čemu je pH oko 7.4. 50. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 59-68, koja je u obliku vodenog rastvora.

51. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 59-68, koja je u obliku tabelate.

52. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 59-68, koja je u obliku čvrstog, polučvrstog ili tečnog preparata, sadržanog u kapsuli kao što je mekana ili tvrda kapsula. 53. Bilo koji novi proizvod, aparat, postupak ili upotreba definisani karakteristikom ili patentnim zahtevom i/ili kombinacijom kiarakteristika i/ili patentnih zahteva koji su ovde opisani.

PRIMERI

[0045] Pronalazak je dalje ilustrovan u vezi sa sledećim primerima, koji nisu određeni da budu na bilo koji način budu ograničavajući za obim pronalaska kao što je naveden u patentnim zahtevima.

[0046] Ovde su korišćene sledeće skraćenice:

βAla je beta-alanil; Fmoc je 9-fluorenilmetiloksi-karbonil; Aoc je 8-aminoooktanska kiselina;

tBu je terc-butil; γGlu (gGlu) je gama L-glutamil;

DCM je dihlorometan; DγGlu (DgGlu) je gama D-glutamil; DIC je diizopropilkarbodiimid;

DIPEA = DIEA je N,N-diizopropiletilamin; HCl je hlorovodonična kiselina;

HOAc je sirćetna kiselina;

DMF je N,N-dimetilformamid; HOBt je 1-hidroksibenzotriazol;

DMSO je dimetil sulfoksid; NMP je N-metilpirolidon;

EtOAc je etil acetat; MeCN je acetonitril;

OEG je [2-(2-aminoetoksi)etoksi]etilkarbonil; TFA je trifluorosirćetna kiselina;

THF je tetrahidrofuran;

1

Su je sukcinimidil-1-il = 2,5-diokso-pirolidin-1-il; TNBS je 2,4,6-trinitrobenzen-sulfonska kiselina;

OSu je sukcinimidil-1-iloski = 2,5-dioksopirolidin-1-iloksi;

TRIS je tris(hidroksimetil)-aminometan; i

RPC je reverzno fazna hromatografija; TSTU je O-(N-sukcinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborat RT je sobna temperatura.

[0047] Sledeći primeri i opšti postupci se odnose na intermedijerna jedinjenja i krajnje proizvode identifikovane u specifikaciji i u sintetičkim šemama. Priprema jedinjenja prema pronalasku je opisana detaljno upotrebom sledećih primera, ali opisane hemijske reakcije su navedene prema njihovoj opštoj primenljivosti za pripremu jedinjenja prema pronalasku. Povremeno, reakcija ne mora biti primenljiva kao što je opisano na svako jedinjenje uključeno unutar navedenog opisa pronalaska. Jedinjenja za koja se ovo javlja biće lako prepoznata od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. U ovim slučajevima, reakcije mogu biti uspešno izvedene uobičajenim modifikacijama poznatim stručnjacima iz date oblasti tehnike, što se odvija, preko odgovarajuće zaštite interferirajućih grupa, promenom u druge uobičajene reagense ili rutinskom modifikacijom reakcionih uslova. Alternativno, druge reakcije navedene ovde ili inače uobičajene biće primenljive za pripremu odgovarajućih jedinjenja prema pronalasku. U svim preparativnim postupcima, svi početni materijali su poznati ili se mogu lako pripremiti od poznatih početnih materijala. Sve temperature su navedene u stepenima Celzijusa i osim ukoliko je drugačije naznačeno, svi delovi i procenti su prema težini kada se odnose na prinose i svi delovi su prema zapremini kada se odnose na rastvarače i eluente.

[0048] Konstrukcija vektora, ekspresija kvasca, obrada i prečišćavanje analoga insulina mogu se izvesti upotrebom standardnih tehnika koje stručnjak iz date oblasti tehnike lako prepoznaje. Jedan neograničavajući primer pripreme analoga insulina opisan je prethodno (Glendorf T, Sørensen AR, Nishimura E, Pettersson I, & Kjeldsen T: Importance of the Solvent-Exposed Residues of the Insulin B Chain α-Helix for Receptor Binding; Biochemistry 2008 47 4743-4751). Ukratko, mutacije su uvedene u vektore koji kodiraju insulin upotrebom preklapajuće ekstenzione PCR. Analozi insulina su eksprimirani kao fuzioni proteini slični proinsulinu, sa Ala-Ala-Lys mini C-peptidom u Saccharomyces cerevisiae soju MT663. Jednolanačni prekursori su enzimatski prevedeni u dvolančane desB30 analoge upotrebom A.

lyticus endoproteaze. Potpuna konverzija u dvolančane desB30 analoge je potvrđena pomoću MALDI-TOF MS, i njegova čistoća je merena pomoću RP-HPLC na kiseloj i neutralnoj pH.

[0049] Jedinjenje prema pronalasku može biti prečišćeno korišćenjem jednog ili više sledećih postupaka koji su tipični u stanju tehnike. Ovi postupci mogu – ako je potrebno – biti modifikovani u vezi sa gradijentima, pH, solima, koncentracijama, protokom, kolonama i tako dalje. U zavisnosti od faktora kao što je profil nečistoće, rastvorljivost dotičnog derivata insulina i tako dalje, ove modifikacije stručnjak iz date oblasti tehnike može lako i pripremiti.

[0050] Posle kisele HPLC ili odsoljavanja, jedinjenja su izolovana liofilizacijom čistih frakcija. Posle neutralne HPLC ili anjonske izmenjivačke hromatografije, jedinjenja su odsoljena, istaložena na izoelektričnoj pH, ili prečišćena pomoću kisele HPLC.

Tipični postupci prečišćavanja

[0051] HPLC sistem je Gilson sistem koji se sastoji od sledećeg: Model 215 Liquid upravljača, Model 322-H2 pumpe i Model 155 UV deketora. Detekcija je tipično na 210 nm i 280 nm. kta Purifier FPLC sistem (Amersham Biosciences) se sastoji od sledećeg: Model P-900 pumpe, Model UV-900 UV detektora, Model pH/C-900 detektora pH i provodljivosti, Model Frac-950 sakupljač frakcija. UV detekcija je tipično na 214 nm, 254 nm i 276 nm. Äkta Explorer Air FPLC sistem (Amersham BioGE Health Caresciences) se sastoji od sledećeg: Model P-900 pumpe, Model UV-900 UV detektora, Model pH/C-900 detektora i pH i provodljivosti, Model Frac-950 sakupljača frakcija. UV detekcija je tipično na 214 nm, 254 nm i 276 nm.

Kisela HPLC

Kolona: Phenomenex, Gemini, 5μ, C18, 110 Å, 250x30 cm

Protok: 20 mL/min

Eluent: A: 0.1 % TFA u vodi,

B: 0.1% TFA u CH3CN

Gradijent: 0-7.5 min: 10% B

7.5-87.5 min: 10% B do 60% B

87.5-92.5 min: 60% B

92.5-97.5 min: 60% B do 100% B

Neutralna HPLC

1

Kolona: Phenomenex, Gemini, C18, 5μm 250 x 30.00 mm, 110 Å

Protok: 20 mL/min

Eluent: A: 20% CH3CN u vodenom 10mM TRIS 15mM (NH4)SO4pH = 7.3

B: 80% CH3CN, 20% voda

Gradijent: 0-7.5 min: 0% B

7.5-52.5 min: 0% B do 60% B

52.5-57.5 min: 60% B

57.5-58 min: 60% B do 100% B

58-60 min: 100% B

60-63 min: 10% B

Anjonsko izmenjivačka hromatografija

Kolona: 150 mL (2.6x28cm) Poros 50HQ

Protok: 25 mL/min

Eluent: A pufer: 15 mM TRIS, 50 mM amonijumacetat u 50% etanolu, pH 7.5 (1.6 mS/cm) B pufer: 15 mM TRIS, 500 mM amonijumacetat u 50% etanolu, pH 7.5 (14 mS/cm) Gradijent: 0-80% B preko 20CV

Sinteza čvrste faze

19-((S)-1-karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)etoksi]etilkarbamoil}metoksi) etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanska kiselina;

(Alternativni naziv: Ejkozandioil-gGlu-OEG-OEGOSu)

[0052] 19-((S)-1-karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)-etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanska kiselina može biti sintetisana na čvrstoj podlozi upotrebom postupaka dobro poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike sinteze čvrste faze peptida. Ovaj postupak npr. sadrži vezivanje Fmoc zaštićene aminokiseline za polistiren 2-hlorotritilhlorid smolu. Vezivanje može, npr. biti postignuto upotrebom slobodne N-zaštićene aminokiseline u prisustvu tercijarnog amina, kao što je trietil amin ili N,N-diizopropiletilamin (videti reference u daljem tekstu). C-terminalni kraj (koji je vezan za smolu) ove aminokiseline je na kraju sintetičke sekvence koja je spojena sa matičnim insulinima. Posle vezivanja Fmoc aminokiselne za smolu, Fmoc grupa je

1

deprotektovana upotrebom, npr. sekundarnih amina, kao što je piperidin ili dietil amin, praćeno spajanjem druge (ili iste) Fmoc zaštićene aminokiseline i deprotekcijom. Sintetička sekvenca je završena spajanjem mono-terc-butil zaštićene masne (α, ω) dikiseline, naime mono-terc-butil estra ejkozandioinske kiseline. Cepanje jedinjenja od smole je postignuto upotrebom razblažene kiseline kao što je 0.5-5% TFA/DCM (trifluorosirćetna kiselina u dihlorometanu), sirćetna kiselina (npr.10% u DCM, ili HOAc/triflouroetanol/DCM 1:1:8), ili heksafluoroizopropanol u DCM (videti npr. "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dörwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5; "Peptides: Chemistry i Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3; i "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG; i reference koje su tu citirane). Ovo osigurava da terc-butil estar prisutan u jedinjenju kao zaštitne grupe karboksilne kiseline nije deprotektovan. Konačno, C-terminalna karboksi grupa (oslobođena od smole) je aktivirana, npr. kao N-hidroksisukcinimid estar (OSu) i korišćena direktno ili posle prečišćavanja kao kuplujući reagens, ili posle deprotekcije u vezivanju za A14E, B16E, B25H, desB30 humani insulin.

[0053] Alternativno, acilacioni reagensi 19-((S)-1-karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}-propilkarbamoil)nonadekancska kiselina mogu biti pripremljeni sintezom faze rastvora:

Mono-terc-butil zaštićena masna dikiselina, mono-terc-butil estar ejkozandionske kiseline, je aktiviran, npr. kao OSu-estar kao što je opisano u daljem tekstu ili kao bilo koji drugi aktivirani estar poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike, kao što je HOBtili HOAt-estar. Ovaj aktivni estar je spojen sa α-terc-butil estrom glutaminske kiseline u pogodnom rastvaraču kao što je THF, DMF, NMP (ili smeša rastvarača) u prisustvu pogodne baze, kao što je DIPEA ili trietilamin. Intermedijer je izolovan, npr. pomoću ekstraktivnih postupaka ili pomoću hromatografskih postupaka. Rezultujući intermedijer je ponovo podvrgnut aktivaciji (kao što je opisano u prethodnom tekstu) i kuplovanju sa OEG-OEG ([2-(2-{2-[2-(2-Amino-etoksi)-etoksi]-acetilamino}-etoksi)-etoksi]-sirćetnom kiselinom) kao što je prethodno opisano praćeno sa aktivacijom sa TSTU da bi se dobio acilacioni reagens 19-((S)-1-karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1- iloksikarbonil-metoksi)etoksi]etilkarbamoil}metoksi) etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)-nonadekanska kiselina.

[0054] Acilacioni reagens pripremljen prethodno opisanim postupcima može biti terc-butil de-protektovan nakon aktivacije kao OSu estar. Ovo se može uraditi TFA tretmanom OSu-

1

aktiviranog terc-butil protektovanog acilacionog reagensa. Nakon acilacije A14E,B16E,B25H,desB30 humanog insulina, dobijen je rezultujući nezaštićeni acilovani A14E,B16E,B25H,desB30 humani insulin, npr. kao što je opisano u Primeru 1.

[0055] Ukoliko reagens pripremljen bilo kojim od prethodnih postupaka nije terc-butil deprotektovan nakon aktivacije kao OSu estar, acilacija A14E,B16E,B25H,desB30 humanog insulina daje odogvarajući terc-butil zaštićeni acilovani A14E,B16E,B25H,desB30 humani insulin. Da bi se dobio nezaštićeni acilovani A14E,B16E,B25H,desB30 humani insulin, zaštićeni insulin treba da bude de-protektovan. Ovo se može uraditi tretmanom sa TFA da bi se dobio nezaštićeni acilovani A14E,B16E,B25H,desB30 humani insulin.

[0056] Alternativno, acilacioni reagens se može sintetisati u rastvoru korišćenjem benzil protekcije grupa karboksilne kiseline kao što je ilustrovano u nastavku.

19-((S)-1-Karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1- iloksikarbonilmetoksi)etoksi]-etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanska kiselina;

(Alternativno ime: Ejkozandioil-gGlu-OEG-OEG-OSu)

LCMS Postupak (LCMS)

[0057] Waters Micromass ZQ maseni spektometar je korišćen za identifikaciju mase uzorka nakon eluiranja iz Waters Alliance HT HPLC sistema.

Eluenti: A: 0.1 % Trifluorosirćetna kiselina u vodi

B: 0.1% Trifluorosirćetna kiselina u acetonitrilu

Kolona: Phenomenex, Jupiter C450 X 4.60 mm, id: 5 μm

Gradijent: 10%-90% B tokom 7.5 min na 1.0 mL/min

Kolona: Phenomenex, Jupiter 5μ C4300Å 50 x 4.60 mm

LC postupak: 10-90% B 10min: A: 0.1% CH3CN B: CH3CN:

0-7.5 min: 10-90% B

7.5-8.5 min: 90-10% B

8.5-9.5 min 10% B

Protok: 1 mL/min

9.5 - 10.00 min 10% B

Protok: 0.1 mL/min

1

terc-butil estar N-hidroksisukcinimid estar ejkozandionske kiseline

[0058]

[0059] Mono-terc-butil estar ejkozandionske kiseline (5 g, 12.54 mmol) i TSTU (4.53g, 15.05 mmol) pomešani su u THF (50 mL), DIPEA (2.62 mL) je dodat i rezultujuća mutna smeša je mešana na RT 2č, zatim je dodat DMF (30 mL) što je rezultovalo u bistrom rastvoru koji je dodatno mešan preko noći. Rezultujuća smeša je uparena skoro do sušenja i ostatak je pomešan sa hladnim acetonitrilom što je rezultovalo u precipitaciji taloga. Ovo je zatim otfiltrirano i osušeno in vacuo preko noći, dajući 6.01 g (97%) terc-butil estra N-hidroksisukcinimid estra ejkozandionske kiseline.

[0060] MS (elektrosprej): m/z: 440 (M-56 (tBu)).

1-terc-butil estar (S)-2-(19-terc-Butoksi karbonilnonadekanoilamino)pentandionske kiseline [0061]

[0062] terc-butil estar 2,5-diokso-pirolidin-1-il estar ejkozandionske kiseline (6.01g, 12.124 mmol) rastvoren je u THF (150 mL) i pomešan sa suspenzijom H-Glu-OtBu (2.71 g, 13.33 mmol) u DMF/voda (1/1, 40 mL). Ovo je rezultovalo u želatinoznom rastvoru koji je zagrevan da bi se dobio bistri rastvor koji je mešan na sobnoj temperaturi RT 3 časa. Zatim je rastvor uparen, dodato je 100 mL vode i smeša je zagrevana do 60°C što je rezultovalo u rastvoru koji je kristalizovao po hlađenju. Precipitat je rekristalizovan iz acetonitrila i kristali su sušeni u vakuumu. Prinos 6.82 g (96%).

[0063] MS (elektrosprej): m/z 584 (M+1).

1-terc-butil estar 5-(2,5- dioksopirolidin-1-il) estar (S)-2-(19-terc-Butoksi karbonilnonadekanoilamino)pentandionske kiseline

1

[0065] 1-terc-butil estar (S)-2-(19-terc-butoksi karbonilnonadekanoilamino)pentandionske kiseline (6.52g, 11.17 mmol) rastvoren je u THF (100 mL), DIPEA (2.14 mL) je dodat nakon čega je dodat rastvor TSTU (3.70 g, 12.29 mmol) u acetonitrilu (25 mL). Smeša je mešana preko noći na RT, zatim je uparena, što je rezultovalo u braonkastom ostatku koji je rekristalizovan iz acetonitrila. Nakon hlađenja preko noći na 5°C formiran je prašak . Ovo je rastvoreno u THF i osušeno sa MgSO4, filtrirano i upareno do sušenja da bi se dobilo 6.17 g (81%) jedinjenja iz naslova.

[0066] MS (elektrosprej): m/z: 681 (M+1).

terc-butil estar 19-{(S)-1-terc-butoksi karbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksietoksi)etilkarbamoil]-metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}nonadekanske kiseline;

(Alternativno ime: tBu-Ejkozandioil-gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OH)

[0067]

[0068] Rastvoru 1-terc-butil estra 5-(2,5- dioksopirolidin-1-il) estra 2-(19-terc-butoksi karbonilnonadekanoilamino)pentandionske kiseline (2.50 g) i [2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]sirćetne kiseline (alternativno ime: H-OEG-OEG-OH)(1.47 g) u etanolu (40 mL) dodat je DIPEA (1.26 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim koncentrovana u vacuo. Ostatku je dodat vodeni rastvor 0.1 N HCl (150 mL) i etil acetata (200 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (100 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa vodom i fiziološkim rastvorom, osušeni

2

(magnezijum sulfat) i koncentrovani in vacuo da bi se dobilo ulje, koje je po stajanju kristalizovano.

[0069] Prinos 96% (3.1 g). LCMS: Teoretska masa: 874.2. Pronađeno: 874.49.

terc-butil estar 19-((S)-1-terc-Butoksi karbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)-etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanske kiseline;

(Alternativno ime: tBu-Ejkozandioil-gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OSu)

[0070]

[0071] Rastvoru terc-butil estra 19-{(S)-1-terc-Butoksi karbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksietoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}nonadekanske kiseline (3.1 g) u acetonitrilu (50 mL) dodat je TSTU (1.39 g) i DIPEA (0.91 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim je koncentrovana in vacuo. Ostatku je dodat vodeni rastvor 0.1 N HCl (100 mL) i etil acetat (200 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (50 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa vodom i fiziološkim rastvorom, osušeni (magnezijum sulfat) i koncentrovani in vacuo da bi se dobilo ulje.

[0072] Prinos 99% (3.4 g). LCMS: Teoretska masa: 971.2 Pronađeno: 971.8.

19-((S)-1-Karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)no nadekanska kiselina;

(Alternativno ime: Ejkozandioil-gGlu-OEG-OEG-OSu)

[0073]

[0074] terc-butil estar 19-((S)-1-terc-Butoksi karbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)-etoksi]etilkarbamoil}-metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanska kiselina (3.4 g) mešana je u TFA (75 mL) 45 min i zatim koncentrovana in vacuo. Ostatak je ko-koncentrovan sa toluenom 3 puta da bi se dobila čvrsta supstanca. Ostatak je kristalizovan u 2-propanolu i filtriran da bi se dobilo belo kristalno jedinjenje.

[0075] Prinos 80% (2.4 g). LCMS: Teoretska masa: 859.03 Pronađeno: 859.44.

[0076] Za acilaciju lizinskog ostatka na položaju B29 (na epsilon položaju) A14E, B16E, B25H, desB30 humanog insulina, acilacija je poželjno izvedena na alkalnoj pH (npr. na pH 10, 10.5, ili 11). Ovo je ilustrovano ovde u Primeru 1.

Primer 1

N{Epsilon-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoil

amino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[GluA14,GluB16,HisB25],des-ThrB30-Insulin(humani);

(Alternativno ime: A14E, B16E, B25H, B29K(Nεejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin; Jedinjenje 1)

[0077]

[0078] A14E, B16E, B25H, desB30 humani insulin (3.0 g, 0.53 mmol) rastvoren je u 150 mM vodenog rastvora Na2CO3(40 mL) i dodato je 5 mL THF. pH vrednost je podešena na 11.0 sa 1M vodenim rastvorom NaOH. Uz snažno mešanje, 19-((S)-1-karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1- iloksikarbonilmetoksi)etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]-etilkarbamoil}propilkarbamoil)nonadekanska kiselina (641 mg, 0.75 mmol, pripremljena kao što je prethodno opisano) rastvorena je u smeši 1.5 mL THF i 1.5 mL DMF tokom jednog minuta. Tokom dodavanja, pH je održavana konstantnom na 10.5-11 dodavanjem 1N vodenog rastvora NaOH. Smeša je mešana jedan čas.

[0079] pH vrednost je podešena na 7.5 sa 1M HCl i 50% etanola je dodato do zapremine od 500 mL. pH vrednost je podešena do 7.5. Konduktivnost je merena do 1.6 mS/Cm.

[0080] Prečišćavanje je izvedeno anjon-izmenjivačkom hromatografijom na Äkta Explorer:

Kolona: 150 mL (2.6x28 cm) Poros 50HQ

A pufer: 15 mM TRIS, 50 mM amonijum acetat u 50% etanol, pH 7.5 (1.6 mS/cm)

B pufer: 15 mM TRIS, 500mM amonijum acetat u 50% etanol, pH 7.5 (14 mS/cm) Gradijent: 0-80%B tokom 20CV

Protok: 25mL/min.

[0081] Pul proizvoda, 700 mL, rastvoren je sa 700 mL 50% etanola i još jednom prečišćen:

Kolona: 150 mL (2.6x28 cm) Poros 50HQ

A pufer: 15 mM TRIS, 50 mM amonijum acetat u 50% etanolu, pH 7.5 (1.6 mS/cm)

B pufer: 15 mM TRIS, 500mM amonijum acetat u 50% etanolu, pH 7.5 (14 mS/cm) Gradijent: 0-100% B tokom 12CV

2

Protok: 25 mL/min.

[0082] Pul proizvoda, 300 mL, je rastvoren u 300 mL vode i odsoljen na C18 koloni:

Kolona: 30x250 mm (Daiso_200_15um_FEFge1304_ODDMS_30x250 mm), CV=177 mL A Pufer: 10% acetonitril u milli-Q vodi 0.1% TFA

B Pufer: 80% acetonitril u milli-Q vodi 0.1% TFA

Gradijent: 25-80%B tokom 20 min.

Protok: 35 mL/min.

[0083] Frakcija proizvoda je osušena zamrzavanjem da bi se dobila TFA so, koja je rastvorena u 50 mL vode plus 10 mL acetonitrila i pH je podešena do 8.0 sa 0.5M vodenim rastvorom NaOH i osušena zamrzavanjem da bi se dobilo 1.25 g (36%) insulina iz naslova.

[0084] LC-MS (elektrosprej): m/z = 1593.1 (M+4)/4. Izračunato: 1594.1.

Primer 2

Afinitet Insulinskog receptora

[0085] Afinitet acilovanih insulin analoga prema ovom opisu za humani insulinski receptor određena je SPA analizom (Scintillation Proximity Assay) analizom sa zarobljavanjem antitela sa mikrotitarskom pločom. SPA-PVT antitelo-vezujuće kuglice, anti-mišji reagens (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017) pomešane su sa 25 mL vezujućeg pufera (100 mM HEPES pH 7.8; 100 mM natrijum hlorid, 10 mM MgSO4, 0.025% Tween-20). Smeša reagenasa za jednu Packard Optiplate (Packard No. 6005190) sastavljena je od 2.4 μl 1:5000 razblaženog prečišćenog rekombinantnog humanog insulinskog receptora (bilo sa ili bez egzona 11), količinom stok rastvora A14Tyr[<125>I]-humani insulin koji odgovara 5000 cpm po 100 μl smeše reagenasa, 12 μl 1:1000 razblaženja F12 antitela, 3 ml SPA-kuglica i vezujućeg pufera do ukupno 12 ml. Ukupno 100 μl smeše reagensa je zatim dodato svakom bunarčiću u Packard Optiplate i serija razblaženja derivata insulina je napravljena u Optiplate od odgovarajućih uzoraka. Uzorci su zatim inkubirani 16 časova uz nežno šejkiranje. Faze su zatim razdvojene centrifugiranjem 1 min i ploče su izbrojane na Topcounter. Podaci vezivanja su fitovani korišćenjem algoritma nelinearne regresije u GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA) i afiniteti su izraženi kao relativni (u procentima (%)) u odnosu na humani insulin.

[0086] Slična analiza je takođe korišćena gde vezujući pufer takođe sadrži 1.5%HSA da bi se imitirali fiziološki uslovi.

Tabela 1

Primer 3

Hidrofobnost derivata insulina prema pronalasku

[0087] Hidrofobnost derivata insulina je određena HPLC reverzne faze pod izokratskim uslovima. Vreme eluiranja derivata insulina poređeno je sa onim kod humanog insulina (ovde označen HI) ili drugog derivata sa poznatom hidrofobnošću pod istim uslovima. Hidrofobnost, k’rel, is izračunato kao: k’relderiv= ((tderiv-t0)/(tref-t0))*k’relref. Korišćenjem HI kao reference: k’relref= k’relHI= 1. Nulto vreme HPLC sistema, t0, određeno je injektiranjem 5 ml 0.1 mM NaNO3.

Uslovi:

[0088]

Kolona: Lichrosorb RP-C18, 5mm, 4 x 250 mm

Pufer A: 0.1 M natrijum fosfat pH 7.3, 10 zapr% CH3CN

Pufer B: 50 vol% CH3CN

Zapremina injekcije: 5 ml

Vreme: Maksimum 60 minuta

[0089] Nakon prolaska inicijalnog gradijenta, izabran je izokratski nivo za prolazak derivata i reference (na primer HI), i vremena eluiranja derivata i reference pod izokratskim uslovima su korišćeni u prethodnoj jednačini da bi se izračunala k’relderiv.

2

Tabela 2

Primer 4

Degradacija analoga insulina korišćenjem enzima lumena duodenuma

[0090] Degradacija analoga insulina korišćenjem enzima lumena duodenuma (pripremljenih filtracijom sadržaja lumena duodenuma) iz SPD pacova. Analiza je izvedena robotom u ploči sa 96 bunarčića (2mL) sa 16 bunarčića dostupnih za analoge insulina i standarde. Analozi insulina ∼15 mM su inkubirani sa enzimima duodenuma u 100 mM Hepes, pH=7.4 na 37°C, uzorci su uzeti nakon 1, 15, 30, 60, 120 i 240 min i reakcija je ugašena dodavanjem TFA. Intaktni analozi insulina u svakoj vremenskoj tački su određeni sa RP-HPLC. Polu-vreme degradacije određeno je eksponencijalnim fitovanjem podataka i normalizovano prema poluvremenu određenom za referentne insuline, A14E, B25H, desB30 humani insulin ili humani insulin u svakoj analizi. Količina dodatnih enzima za degradaciju je takva da je polu-vreme za degradaciju referentnog insulina između 60 minuta i 180 minuta. Rezultat je dat kao poluvreme degradacije za analog insulina u duodenumu pacova podeljeno sa polu-vremenom degradacije referentnog insulina iz istog eksperimenta (relativna stopa degradacije).

Tabela 3

Primer 5

Intravenski PK pacova

[0091] Anestezirani pacovi su dozirani intravenski (i.v.) sa analozima insulina u različitim dozama i koncentracija test jedinjenja u plazmi je merena korišćenjem imunoanaliza ili

2

masene spektrometrije na određenim intervalima 4 časa ili više nakon doze. Farmakokinetički parametri su nakon toga izračunati korišćenjem WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA).

[0092] Korišćeni su neizgladnjivani mužjaci Wistar pacova (Taconic) težine oko 200 grama. Telesna težina je merena i pacovi su nakon toga anestezirani sa Hypnorm/Dormicum (svako jedinjenje je zasebno razblaženo 1:1 u sterilnoj vodi i zatim pomešano; sveže pripremljeno na dan eksperimenta). Anestezija je inicirana sa 2 mL/kg Hypnorm/Doricum smešom sc nakon čega su primenjene dve doze za održavanje od 1 mL/kg sc u 30 minutnim intervalima, i dve doze za održavanje od 1 mL/kg sc sa 45 minutnim intevalima. Ukoliko je neophodno da bi se pacovi održali blago anestezirani tokom dalje doze (doza) obezbeđeno je 1-2 mL/kg sc. Merenje težine i inicijalna anestezija je izvedena u prostoriji u kojoj su držani pacovi da bi se izbegao stres po životinje njihovim pomeranjem iz jedne u drugu sobu.

Tabela 4

Primer 6

Intravenski farmakokinetički (PK) profili psa

[0093] Cilj ovog protokola je da se dobiju farmakokinetički (PK) podaci iz profila koncentracije-vremena u plazmi različitih analoga insulina nakon intravenske primene na bigl pse, i da se izračunaju relevantni farmakokinetički parametri za analoge.

[0094] Životinje su imale slobodan pristup pijaćoj vodi odgovarajućeg kvaliteta. Životinje su merene svakog dana doziranja. Svaka test supstanca je data 3 životinjama. Uzeta je u obzir dobrobit pojedinačnih životinja u odnosu na broj i stepen procedura koje su izvođene na svakoj životinji. Kompletni profil koncentracija-vreme u plazmi je dobijen od svake životinje. Tokom uzimanja uzoraka krvi, psi su stavljeni na sto i fiksirani od strane tehničara za životinje koji je sedeo pored. Ova procedura je trenirana tokom aklimatizacionog perioda. Uzorci krvi, 0.5 mL, sakupljeni su u EDTA epruvete prema sledećem rasporedu:

2

Predoza (-10, 0), i 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 480, 600, 720, 960, 1440, 1920, 2880, 4320, 5760, 7200, 8640, 10080 minuta.

[0095] Tokom perioda učestalog uzorkovanja, uzorci krvi su uzeti preko Venflon katetera iz cefaličnih vena koje su držane otvorene sa fiziološkim rastvorom sa heparinom. Drugi uzorci krvi su uzeti iz jugularne vene.

[0096] Uzorci krvi su držani na ledu maks. 20 minuta pre centrifugiranja na 4°C 4 minuta na 1,300 g.

[0097] Plazma je odmah preneta u dve micronic epruvete, 80 ml svaku od svakog uzorka krvi i stavljena prema pregradi. Plazma je uskaldištena na -20°C do analize.

[0098] Profili koncentracija-vreme u plazmi su analizirani ne-kompartmentalnom farmakokinetičkom analizom korišćenjem WinNonlin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA).

[0099] Izračunavanja su izvedena korišćenjem pojedinačnih vrednosti koncentracija-vreme od svake životinje.

Tabela 5

Primer 7

Inicijalna rastvorljivost Jedinjenja 1 i Jedinjenje A za poređenje u prisustvu cinka

[0100] Jedinjenje 1 i Jedinjenje A za poređenje (tj. N{Epsilon-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-amino]etoksi]etoksi]acetil]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-Insulin(humani);

Alternativno ime: A14E, B16H, B25H,B29K(Nεejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin, respektivno, rastvoreni su u milli-Q vodi na pH vrednosti od oko 8. Dodati su fenol, krezol, cink acetat (Zn), natrijum hlorid i glicerol u pomenutom redosledu što rezultuje u finalnoj farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži: 4.2-5 mM insulina, 1.6% glicerol, 25 mM

2

fenol, 25 mM krezol, pH 7.4 i koncentraciju cinka i natrijum hlorida navedenu u tabeli u nastavku. Farmaceutske kompozicije su uskladištene 24 časa na 22°C i centrifugirane na 15,000 x g 15 minuta. 100 ml supernatanta je preneto u HPLC vijalice i koncentracija je određena korišćenjem kisele gelfiltracije kao što je opisano u Eur. Pharm. NovoRapid. Količina rastvorljivog insulina je određena u procentima početne koncentracije. Preciznost merenja je bila /- 2%.

Tabela 6

2

Zaključak

[0101] Jedinjenje za poređenje, u kompoziciji bez NaCl, rastvorljivo je pod uslovima testa u prisustvu do 12.5 molekula cinka po heksameru. Jedinjenje A za poređenje, u kompoziciji sa 20 mM NaCl, rastvorljivo je pod uslovima testa u prisustvu do 10.5 molekula cinka/heksameru.

[0102] Jedinjenje 1 je rastvorljivo u kompoziciji bez NaCl pod uslovima testa do oko 15.3 molekula cinka po heksameru insulina. Jedinjenje 2 je rastvorljivo sa 20 mM NaCl pod uslovima testa do oko 14.5 molekula cinka po heksameru insulina.

Primer 8

Inicijalna rastvorljivost humanog insulina u prisustvu cinka

[0103] Humani insulin je rastvoren u u milli-Q vodi na pH vrednosti od oko 8. Dodati su fenol, krezol, cink acetat (Zn), natrijum hlorid i glicerol u pomenutom redosledu što je rezultovalo u finalnoj formulaciji koja sadrži: 4.2-5 mM insulina 1.6% glicerol, 25 mM fenol, 25 mM krezol, pH, 7.4 i cink i koncentraciju natrijum hlorida navedenu u tabeli u nastavku. Formulacije su uskladištene 24 časa na 22°C i zatim centrifugirane na 15000 x g 15 min. 100 ml supernatanta je preneto u HPLC vijalice i koncentracija je određena korišćenjem kisele gel filtracije opisane u Eur. Pharm. NovoRapid. Količina rastvorljivog insulina je određena u procentu početne koncentracije.

[0104] Preciznost merenja je /- 2%.

Tabela 7

Zaključak

[0105] Humani insulin je rastvorljiv u formulacijama koje sadrže do 6 Zn/insulin heksameru kada formulacija sadrži NaCl i do 4 Zn/insulin heksameru kada formulacija skoro ne sadrži NaCl.

Primer 9

Hemijska i fizička stabilnost kao funkcija sadržaja cinka i natrijum hlorida

[0106] Cilj ovog eksperimenta bio je da se izmeri hemijska i fizička stabilnost formulacija unutar cink/heksamer okvira određenog sa SEC eksperimentima. Dodatno da se testira da li je prisustvo natrijum hlorida uticalo na hemijsku i/ili fizičku stabilnost.

Formulacije

[0107] Formulacije su sadržale: 3.6 mM Jedinjenja 1, 25 mM fenola, 25 mM krezola, pH 7.4. Cink i natrijum hlorid kao što je naznačeno u nastavku.

Tabela 8

1

[0108] Formulacija je pripremljena kao što sledi:

Prašak Jedinjenja 1 je rastvoren u milli-Q vodi u stok rastvoru u približno dvostrukoj količini finalne koncentracije u formulaciji. Dodati su fenol, krezol, cink acetat, natrijum hlorid i glicerol u pomenutom redosledu. Rezultujući rastvor imao je pH oko 7.8 i podešen je na pH 7.4 korišćenjem 0.2 N HCl, što je rezultovalo u finalnom povećanju koncentracije hlorida od 1.45 mM hlorida.

[0109] Formulacija je sterilno filtrirana i napunjena u 3 ml kertridže sa stoperima.

[0110] Fizička stabilnost je merena kao što sledi:

Tendencija fibrilacije je merena u testu sa Tioflavinom T (THT). Potencijalno taloženje koje je dovodilo do vidljivog formiranja čestica mereneo je kao potencijalno povećanje turbidnosti. Formiranje čestica ispod 2 μm mereno je dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS). Formiranje čestica iznad 2 μm mereno je sa Micro Flow Imaging (MFI).

[0111] Hemijska stabilnost je merena kao povećanje u česticama velike molekulske težine (HMWP) u procentima i smanjenje čistoće kao što je mereno reverzno faznom UPLC.

Tendencija fibrilacije u Tioflavin T testu

[0112] Koncentracija Jedinjenja 1 određena je prema postupku opisanom u WO 2013/153000.

2

Tabela 9

Stabilnost Jedinjenja 1 u stanju mirovanja testirano sa DLS

[0113] Fizička stabilnost Jedinjenja 1 formulisana sa različitim koncentracijama NaCl i Znacetata uskladištenog na 4°C, 37°C i 45°C testirana je sa dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS).

Postupak

[0114] Svaki uzorak je meren u tripletima na DynaPro čitaču ploča na 25°C beleženjem 20 snimaka od 10 sekundi; podaci su zabeleženi kao srednja vrednost tri merenja. Uzorci nisu podvrgnuti filtriranju, već su centrifugirani na 15 000 x g 20 min da bi se uklonili samo najveći flokulati i agregati, koji bi inače blokirali merenje. Dodatno, korišćeno je parafinsko ulje za zatvaranje bunarčića DLS mikrotitarske ploče umesto češće korišćene plastične folije.

10 ael Tab

[0115] Srednja vrednost veličine oligomera proteina određena sa DLS u opsegu je od 3.8 nm (za formulacije sa 5,8 Zn/insulinskom heksameru, 20mM NaCl, na 37°C, nakon 2 nedelje) do 5.95 nm (za formulacije sa 10,5 Zn/insulinskom heksameru, 75 mM NaCl, na 4°C, nakon 2 nedelje). za uzorke uskladištene na 4°C hidrodinamički prečnik se smanjio 1% u proseku dok se povećao 1 i 4% za uzorke uskladištene na 37 i 45°C, respektivno. Dodatno, sve zabeležene autokorelacione funkcije bile su kompatibilne sa unimodalnom distribucijom čestica, ukazujući na usku distribuciju veličine bez bilo kojih velikih agregata.

Zaključak

[0116] Iako su različiti uslovi formulacije pokazali uočljivo različite prosečne veličine oligomera, promena tokom vremena bila je izuzetno mala ukoliko je uopšte bila prisutna, i sve su formulacije izgledale fizički stabilno na 4°C, 37°C kao i na 45°C unutar perioda testiranja od 8 nedelja. Agregati se nisu formirali tokom ovog perioda.

Merenje čestica iznad 2 μm korišćenjem MFI

[0117] Formulacije su analizirane u odnosu na formiranje sub-vidljivih čestica u mikrometarskom opsegu korišćenjem Micro Flow Imaging (MFI™). Broj čestica je generalno bio nizak, i veliki deo čestica je imao tamni sferični izgled očekivan za kapi silikonskog ulja. Međutim, velike prozračne pahuljičaste čestice pojavile su se u formulacijama koje sadrže 10.5 Zn/heksamer i 150mM ili 75mM nakon 2 nedelje inkubacije na 45°C i 8 nedelja na 37°C, respektivno.

Tabela 11

Tabela 12

Zaključak o fizičkoj stabilnosti

[0118] Fizička stabilnost je merena kao vreme kašnjenja u ThT testu kao funkcija cink/heksamer povećanja sa povećavanjem sadržaja cinka od 5.8 do 8.1 Zn/insulin heksamera. Promena prosečne veličine oligomera merene sa DLS nije registrovala promenu u veličini oligomera i formiranje agregata u bilo kojoj od formulacija. Merenje čestica kao što je određeno sa MFI pokazalo je povećanje u formiranju čestica u formulacijama koje su sadržale 10.5 Zn/heksamer i 75 mM NaCl.

[0119] Fizička stabilnost je stoga bila optimalna u formulacijama koje sadrže iznad 5.8 i ispod 10.5 Zn/insulin heksamera.

Hemijska stabilnost

[0120] HMWP formiranje je mereno korišćenjem gelfiltracione kolone u eluentu bez sirćetne kiseline kao što je opisano u WO 2013/153000. HMWP za uzorke uskladištene na 4°C oduzeta je od HMPW za uzorke uskladištene na 30°C ili 37°C.

Tabela 13

Zaključak

[0121] Formulacije koje sadrže 5.8 Zn/ insulin heksameru imaju više HMWP razvoja od formulacija koje sadrže 8.1 Zn/ insulin heksameru ili više.

Gubitak čistoće

[0122] Gubitak u čistoći je meren u odnosu na početak. Čistoća merena reverzno faznom hromatografijom za uzorke uskladištene na 4°C bila je oduzeta čistoća merena za uzorke uskladištene na 30°C ili 37°C. Korišćen je postupak UPLC čistoće malo modifikovan u odnosu na postupak opisan u WO 2013/153000. U predmetnom slučaju korišćena je kolona Waters CSH, C18 koja u ovom slučaju poboljšava razdvajanje i broj injekcija na kolonu pre nego što mora da se promeni.

Tabela 14

Zaključak

[0123] Formulacije koje sadrže 5.8 Zn/insulin heksameru imaju najvišu degradaciju. Formulacije koje sadrže 8.1 Zn/insulin heksameru ili više imaju nižu degradaciju. Hemijska stabilnost je stoga optimalna u formulacijama sa 8.1.cink/heksameru ili više. Stabilnost je veća u formulacijama koje sadrže 75 mM NaCl nego u formulacijama koje sadrže 20 mM NaCl.

Primer 10

[0124] Cilj ovog eksperimenta bio je da se istraži oligomerizacija ekskluzionom hromatografijom u funkciji sadržaja NaCl u formulaciji koja sadrži Jedinjenje A za poređenje (tj. N{Epsilon-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-Insulin(humani); Alternativno ime: A14E, B16H, B25H, B29K(Nεejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin na 4.2 mM insulina i fiksni cink/insulin heksamer. Dodatno, cilj je bio da se meri fizička i hemijska stabilnost.

Formulacija

[0125] Jedinjenje A je rastvoreno u milli-Q vodi na pH vrednosti od oko 8. Dodati su fenol, krezol, cink acetat (Zn) i glicerol u pomenutom redosledu što je rezultovalo u finalnoj formulaciji koja sadrži: 4.5 Zn/ 6 insulina, 25 mM fenol, 25 mM krezol, pH 7.4 koncentracija insulina od 4.2 mM i natrijum hlorid (NaCl), cink acetat i glicerol kao što je navedeno u tabeli u nastavku.

[0126] Fizička stabilnost je procenjena merenjem

1. Tendencije fibrilacije. Merena Tioflavin T testom. Tendencija fibrilacije je merena u Tioflavin T (THT) testu kao vreme kašnjenja do fibrilacije. THT test je meren kao što je opisano na sveže pripremljenim uzorcima; i

2. Poluprečnici oligomera u nm i formiranje agregata ispod 4 μm sa dinamičkim rasipanjem svetlosti.

[0127] Hemijska stabilnost formulacija je merenja kao povećanje u povećanju proteina velike molekulske težine (HMWP) u nečistoćama povezanim sa insulinom nakon skladištenja u trajanju od četiri nedelje (4n) na 37°C u relativnom odnosu na količinu HMWP nakon skladištenja na 4°C.

[0128] HMWP je meren sa HMWP Postupkom 2 kao što je opisano u WO 2013/153000.

[0129] Formiranje nečistoća povezanih sa insulinom kao što su deamidaciona jedinjenja mereno je korišćenjem reverzno fazne hromatografije (UPLC).

[0130] Količina monomera je merena u filtraciji sa nativnim gelom korišćenjem Postupka 2 kao što opisano u WO 2013/153000 u eluentu bez fenola.

Tabela 15

Zaključak

[0131] Količina monomera Jedinjenja A smanjuje se u funkciji koncentracije natrijum hlorida sa velikim efektom dodavanja od samo do 50 mM NaCl. Hemijska degradacija merena kao formiranje HMWP i formiranje nečistoća je nisko u svim formulacijama uprkos sadržaja monomera. THT vremena kašnjenja se povećavaju sa sadržajem cinka i natrijum hlorida.

4

Tabela 16

Tabela 17

Zaključak

[0132] Hidrodinamički poluprečnik se povećava sa povećanjem koncentracije soli. Koncentracija Zn ima minorni uticaj na veličinu izuzev na 7 Zn po insulinskom heksameru. Bez značajnog efekta temperature inkubacije na veličinu oligomera i fizičku stabilnost.

4

4

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. A14E, B16E, B25H, B29K(N(eps)-Ejkozandioil-gGlu-2xOEG), desB30 humani insulin.

2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu kao medikament.

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu kao medikament za tretman dijabetesa.

4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu u tretmanu dijabetesa, naznačeno time da je jedinjenje primenjeno na istog pacijenta svakog drugog dana, ili ređe, i, u proseku, tokom vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godine, pomenuto jedinjenje nije primenjeno češće na istog pacijenta.

5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu u tretmanu dijabetesa, naznačeno time da je jedinjenje primenjeno dva puta nedeljno, ili ređe, i, u proseku, tokom vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godine, pomenuto jedinjenje nije primenjeno češće na istog pacijenta.

6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu u tretmanu dijabetesa, naznačeno time da je jedinjenje primenjeno jednom nedeljno, ili ređe, i, u proseku, tokom vremenskog perioda od najmanje 1 meseca, 6 meseci ili 1 godine, pomenuto jedinjenje nije primenjeno češće na istog pacijenta.

7. Vodeni rasstvor koji sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1.

8. Vodeni rastvor prema patentnom zahtevu 7, koji sadrži najmanje 5 jona cinka po heksameru insulina.

9. Vodeni rastvor prema bilo kom od patentnih zahteva 7-8, gde pH je u opsegu od 7 do 8.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema patentnom zahetvu 1, i jedan ili više ekscipijenasa.

4

11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, koja sadrži najmanje 4.5 jona cinka po heksameru insulina.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5

4